ES2234513T3

ES2234513T3 - Metodo de fabricacion de un dispositivo para la realizacion de un ensayo, uso de una membrana en la fabricacion de dicho dispositivo, kit que comprende dicho dispositivo y metodo para la deteccion de un analito usando dicho dispositivo.

Info

Publication number: ES2234513T3
Application number: ES00202824T
Authority: ES
Inventors: Hermanus Johannes Maria Kreuwel; Hendrik Sibolt Van Damme
Original assignee: PamGene BV
Current assignee: PamGene BV
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2018-07-07
Also published as: DK0975427T3; PT1050588E; US6635493B2; DK1050588T3; DE69828083T2; CA2290945C; DE69800595T2; KR20010020283A; AU724382B2; US20020127738A1; ATE284451T1; ES2157669T3; ATE199663T1; JP3208390B2; EP0975427A1; US6225131B1; EP1050588B1; KR100421262B1; US20020102565A1; WO1999002266A1

Abstract

Un método de fabricación de un dispositivo para la realización de un ensayo, en el que dicho dispositivo comprende un sustrato que tiene canales pasantes orientados, abriéndose dichos canales a la superficie para la aplicación de una muestra, estando provistos los canales, en al menos una zona de la superficie para la aplicación de una muestra, de una primera sustancia de unión capaz de unirse a un analito, caracterizado en que el sustrato es una membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente.

Description

Método de fabricación de un dispositivo para la realización de un ensayo, uso de una membrana en la fabricación de dicho dispositivo, kit que comprende dicho dispositivo y método para la detección de un analito usando dicho dispositivo.

La presente invención se refiere a un dispositivo para la realización de un ensayo, en el que dicho dispositivo comprende un sustrato que tiene canales pasantes orientados, abriéndose dichos canales en una superficie para la aplicación de una muestra, estando provistos los canales, en al menos una zona de la superficie para la aplicación de una muestra, de una primera sustancia de unión capaz de unirse a un analito.

Dicho dispositivo se describe en el documento W095/11755 para aplicaciones de "secuenciación por hibridación". El dispositivo comprende un sustrato provisto de canales, estando los canales orientados sustancialmente perpendiculares a la superficie del sustrato. Se describen tres tipos de sustratos. El primer tipo está comprendido por una multitud de fibras de vidrio huecas. Se fabrica apilando fibras de vidrio que tienen un núcleo grabable, proporcionando a la pila extremos planos, puliendo dichos extremos, y grabando los núcleos, normalmente con ácido. El segundo tipo de sustrato se prepara por grabado electroquímico de una pastilla de silicio cristalina. Primero, la posición de los canales, así como su tamaño se definen usando métodos fotolitográficos estándar. Posteriormente los canales orientados se forman electroquímicamente. El tercer tipo de sustrato se prepara por grabado de la vía nuclear de un sustrato inorgánico. Este método, que comprende las etapas de exponer el sustrato a partículas energéticas cargadas y pesadas y grabar por vía húmeda, da como resultado un sustrato con canales dispersados aleatoriamente por la superficie del sustrato. Con mayores densidades de poro y porosidad hay más posibilidad de fusión de canales que muestran una resistencia al flujo reducida con respecto a otros canales no fusionados.

Los tres tipos de sustratos son bastante caros debido a la intensiva labor de los procedimientos de fabricación y/o de las materias primas caras y operaciones poco económicas, tales como aserrado y pulido, y/o al equipo caro. Además, los sustratos se caracterizan por una porosidad relativamente baja de 30% o más. Más ventajosamente se dice que deben alcanzarse porosidades mayores de hasta 80%, pero sólo con densidades de canales relativamente bajas, con la desventaja de que el área superficial efectiva de los canales de una zona particular del sustrato es menor en comparación con un sustrato que tiene una porosidad comparable pero con mayores densidades de canales (y por consiguiente canales más estrechos). Otra desventaja de los sustratos basados en silicio como se describe en el documento WO 95/11755, es que no son transparentes a la luz. Por lo tanto, estos sustratos prohiben el uso ventajoso de sistemas de marcadores ópticos para detectar el analito unido al sustrato. Los sistemas de marcadores ópticos populares se basan, por ejemplo, en reacciones de color inducidas enzimáticamente, en bio- o quimiluminiscencia, o en fotoluminiscencia. En el último caso tanto la luz de excitación como la luz luminiscente emitida deben pasar por el material del sustrato.

El objeto de la presente invención es superar las desventajas anteriores, y proporcionar un sustrato que tenga tanto una alta densidad de canales como una alta porosidad, permitiendo incluso matrices de mayor densidad que comprenden diferentes primeras sustancias de unión por unidad de superficie sobre las que se aplica la muestra. Además, el sustrato es altamente transparente a la luz visible. Más particularmente, el objeto de la presente invención es proporcionar un método para la fabricación de un dispositivo que comprende un sustrato relativamente barato que no requiere el uso de ninguna tecnología de microfabricación típica, y que ofrece un control mejorado frente a la distribución de líquido sobre la superficie del sustrato.

Los objetivos anteriores se logran con un dispositivo en el que el sustrato poroso es una membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente.

Las membranas de óxido metálico que tienen canales pasantes orientados se pueden fabricar de forma económica por grabado electroquímico de una lámina metálica. Los metales considerados son, entre otros, tántalo, titanio, y aluminio, así como aleaciones de dos o más metales y metales y aleaciones dopados. Las membranas de óxido metálico son transparentes, especialmente si están mojadas, y permiten emplear diferentes técnicas ópticas para realizar ensayos. Dichas membranas tienen canales orientados con diámetros bien controlados y propiedades de superficie químicas ventajosas.

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la invención proporciona un método de fabricación de un dispositivo para la realización de un ensayo, en el que dicho dispositivo comprende un sustrato que tiene canales pasantes orientados, abriéndose dichos canales a la superficie para la aplicación de una muestra, estando provistos los canales, en al menos una zona de la superficie para la aplicación de una muestra, de una primera sustancia de unión capaz de unirse a un analito, en el que el sustrato es una membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente.

De acuerdo con una realización preferida, se elige la primera sustancia de unión del grupo que consiste de una sonda de ácido nucleico, un anticuerpo, un antígeno, un receptor, un hapteno, y un ligando para un receptor.

Entre los ensayos en los que el dispositivo de acuerdo con la presente invención se puede usar, se pueden incluir secuenciación por hibridación, inmunoensayos, ensayos de receptor/ligando y similares.

Cuando el dispositivo se usa como una herramienta para obtener información de secuencias de ADN, se proporciona una gran matriz de zonas, comprendiendo cada zona como una primera sustancia de unión una sonda de oligonucleótido de una secuencia de pares de bases diferente. Si una muestra que contiene fragmentos de ADN o ARN con una secuencia (parcialmente) desconocida se pone en contacto con el sustrato, se puede producir un patrón de hibridación específico, a partir de cuyo patrón se puede derivar la información de secuencia del ADN/ARN. Dichos métodos de "secuenciación por hibridación" son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Fodor, S.P.A. et al., (1992), Science, 251, 767-773 y Southern, E.M. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1368-1373).

El dispositivo de acuerdo con la presente invención, también se puede usar para cribar una especie biológica, tal como sangre, de entre un gran número de analitos. La matriz puede constar de zonas que comprenden sondas de oligonucleótido específicas, por ejemplo, para E. coli, S. aureus, S. pneumoniae etc. Una muestra biológica se puede preparar como se describe en el documento EP 0.389.063. Si esta muestra se pone en contacto con el sustrato, el patrón de hibridación resultante se puede leer, por ejemplo, usando una cámara CCD en combinación con un marcador óptico adecuado.

Además del cribado de bacterias, el dispositivo es adecuado para detectar virus, así como para clasificar diferentes subtipos, por ejemplo, virus VIH y VCH, etc. La clasificación de virus puede ser esencial para determinar la potencial resistencia al fármaco. En general, requiere la capacidad de detectar mutaciones puntuales en el virus de ARN.

El dispositivo también es adecuado para llevar a cabo inmunoensayos de tipo sándwich. En este caso, se prefiere usar un segundo anticuerpo para unirse al analito unido, siendo reconocido dicho segundo anticuerpo para cada uno de los analitos por un tercer anticuerpo marcado. Esto se puede lograr si el segundo y tercer anticuerpos derivan de diferentes especies y el tercer anticuerpo se cultiva frente a anticuerpos de otras especies. Así, se evita marcar el segundo anticuerpo para cada analito particular.

El dispositivo también es adecuado para llevar a cabo "barridos de péptidos" como se describe en Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Scí. USA 81:3998-4002 (1984). En este caso las primeras sustancias de unión que se unen a las diferentes zonas del sustrato constituyen diferentes secuencias de aminoácidos. Si el sustrato se pone en contacto con un líquido que contiene un analito particular, se puede producir un modelo de reacción que representa la afinidad específica del analito por las diferentes secuencias de aminoácidos.

Se prefiere que la primera sustancia de unión se una covalentemente al sustrato.

Esto minimiza la pérdida de la primera sustancia de unión del sustrato. La unión covalente de un compuesto orgánico a un óxido metálico es bien conocida en el estado de la técnica, por ejemplo usando el método descrito por Chu. C.W. et al., (J. Adhesion Sci. Technol. 7, pp. 417-433, 1993) y Fadda, M.B. et al. (Biotechnology and Applied Biochemistry, 16, pp. 221-227, 1992).

De acuerdo con una realización preferida la membrana de óxido metálico consta de óxido de aluminio.

Dicha membrana de óxido de aluminio parece que tiene canales pasantes que son hidrófilos en comparación con la superficie de la membrana. Así, ventajosamente, un líquido hidrófilo preferiblemente entra en los canales en lugar de dispersarse por la superficie de la membrana. Por lo tanto, las membranas de óxido de aluminio pueden contener altas densidades de zonas que comprenden diferentes primeras sustancias de unión. Se describen membranas de óxido de aluminio que tienen canales pasantes orientados en Rigby, W.R. et al. (Trans. Inst. Metal Finish., 68(3), p. 95, 1990), y son comercializadas por Anotec Separations Ltd., Oxon, Reino Unido. Estas membranas se han usado para purificar virus, y para almacenar enzimas para fines que involucren sensores, pero no se sugiere nada con respecto a su adecuación como sustratos para llevar a cabo ensayos basados en sondas.

Una realización preferente de la presente invención se refiere a un método para la fabricación de un dispositivo que comprende una membrana que tiene canales pasantes orientados según la invención, en el cual la primera sustancia de unión se sintetiza in situ.

Por ejemplo, usando sólo un número limitado de reactivos, para un dispositivo que comprende un oligonucleótido como la primera sustancia de unión, normalmente cuatro compuestos nucleótidos (dA, dT, dC y dG para ADN, A, U, C, y G para ARN) y reactivos adicionales como agentes de bloqueo y reactivos protectores, pueden emplearse técnicas de síntesis en fase sólida clásicas para proporcionar un sustrato con sólo una o una matriz de una pluralidad de zonas con sondas de oligonucleótido. Los reactivos se pueden aplicar convenientemente en los canales pasantes de una zona particular usando tecnología de chorro de tinta. La tecnología de chorro de tinta permite la deposición precisa de volúmenes definidos de líquido. La síntesis in situ de sondas de oligonucleótidos en un sustrato plano y no poroso, es bien conocida en el estado de la técnica (véase por ejemplo, T.P. Theriault: DNA diagnostic systems based on novel Chem-Jet technologies, IBC Conference on Biochip Array Technologies, Washington DC, 10 de Mayo,
1995).

De acuerdo con una realización preferida, los compuestos nucleótidos se aplican usando atracción electrostática. La atracción electrostática disminuye el riesgo de salpicaduras.

De acuerdo con un método alternativo para fabricar un dispositivo que comprende canales pasantes de acuerdo con la invención, la primera sustancia de unión se aplica en los canales pasantes de una zona particular usando tecnología de chorro de tinta. Esto permite la purificación de la primera sustancia de unión, y por ejemplo en el caso de una sonda de oligonucleótido, la verificación de su secuencia, antes de la aplicación al sustrato.

Por las razones antes mencionadas, se prefiere otra vez que la primera sustancia de unión se aplique usando atracción electrostática.

La presente invención también se refiere al uso de una membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente, preferiblemente una membrana de óxido de aluminio, para fabricar cualquiera de los dispositivos antes descritos, por ejemplo para realizar un ensayo basado en una sonda.

De acuerdo con una realización preferida, se ajusta una diferencia de temperatura entre diferentes sitios de la membrana durante la realización del ensayo para crear diferentes condiciones de hibridación en diferentes sitios de la membrana.

El uso, ventajosamente comprende un ensayo de hibridación de ácido nucleico o un ensayo inmunológico. En dicho ensayo, una muestra que comprende un analito se pone en contacto con un dispositivo de acuerdo con la invención. Posteriormente el analito se deja unir a la primera sustancia de unión que está unida al sustrato. Dicha unión se facilita mucho dejando migrar el analito a través del sustrato poroso. La detección de la unión se puede llevar a cabo mediante la adición de una segunda sustancia de unión unida a un marcador, dejando unirse dicha segunda sustancia de unión al complejo de la primera sustancia de unión y el analito, y determinando si el marcador esta presente en la posición en la que se inmovilizó la primera sustancia de unión. Alternativamente, se puede haber proporcionado ya el analito con un marcador, en cuyo caso la unión a la primera sustancia de unión se puede detectar directamente, sin la adición de una segunda sustancia de unión.

Así, la presente invención también se refiere al uso de una membrana de óxido metálico, fabricada electroquímicamente, en la fabricación de un dispositivo como el aquí descrito, para realizar un inmunoensayo o un barrido de péptidos.

La presente invención también se refiere a un kit que comprende cualquiera de los dispositivos antes mencionados, en el que dicho kit adicionalmente comprende un medio de detección para determinar si se ha producido la unión entre la primera sustancia de unión y el analito, donde los medios de detección emplean una reacción enzimática. Preferiblemente, tales medios de detección pueden ser una segunda sustancia de unión provista de un marcador. Preferiblemente, el marcador es capaz de inducir una reacción de color y o capaz de dar bioquimi- o fotoluminiscencia.

La presente invención también se refiere a un método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

a): poner en contacto la muestra con cualquiera de los dispositivos antes descritos, en el que la muestra está continuamente fluyendo de un lado a otro a través de la membrana,

b): dejar que se produzca la unión entre la primera sustancia de unión y el analito,

c): detectar si se ha producido la unión entre la primera sustancia de unión y el analito.

La presente invención también se refiere a un método como el aquí descrito, donde la severidad de la unión del analito se modifica variando la temperatura.

La presente invención también se refiere a un método como el aquí descrito, donde la detección de si la unión ha tenido lugar entre la primera sustancia de unión y el analito se hace a tiempo extra.

En este método el analito puede ser una sonda de ácido nucleicos un anticuerpo, un antígeno, un receptor, un hapteno un ligando para un receptor, y comprende ácido nucleico.

Finalmente, la presente invención se refiere a un método como el aquí descrito, donde el ácido nucleico se deriva del virus de inmunodeficiencia humano.

La presente invención se ilustrará ahora con los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1

Detección simultánea de dos tipos diferentes de VIH-1 amplificado, un ARN de tipo salvaje (WT) y un ARN patrón (Qa), usando una membrana de óxido de aluminio en una célula de flujo.

Analitos

Los fragmentos de WT-ARN y Qa-ARN representan una parte de la región GAG del genoma de VIH-1. Estos fragmentos tienen igual longitud (145 nt) e idénticas secuencias, salvo una región de 21 nt de longitud en la parte central del fragmento. Las secuencias de los fragmentos son:

1

La secuencia de las partes específicas de WT y QA están subrayadas.

En este ejemplo se usaron dos soluciones tamponadas: Un tampón fosfato a pH 7,4 que contenía 8 g/l de NaCl ("tampón de incubación").

Un tampón fosfato a pH 7,4 que contenía 8 g/l de NaCl y Polisorbato al 0,05% (Tween 20), denominado en lo sucesivo "tampón de lavado".

Sustrato

Membrana de óxido de aluminio, 60 pm de grosor, 24 mm de diámetro. Los canales tienen 0,2 \mum de diámetro, la densidad es aproximadamente 18 canales/\mum^{2} ("Anodisc 25", Whatman).

La superficie de la membrana se recubre con estreptavidina sumergiendo la membrana en el tampón de incubación que contenía 2 g/l de estreptavidina, durante 60 min. Posteriormente, las membranas se lavan usando el tampón de lavado y se secan al aire a temperatura ambiente.

Inmovilización de la primera sustancia de unión

Se aplican dos sondas de oligonucleótido, parcialmente complementarias a los fragmentos de WT y QA:

WT-sonda: 5'GAATGGGATAGAGTGCATCCAGTG3' (SEQID. NO. 3)

Qa-sonda: 5'GACAGTGTAGATAGATGACAGTCG3' (SEQID. NO. 4)

ambas con una molécula de biotina acoplada al extremo 5'.

Se aplican manchas puntuales con un diámetro específico usando una punta porosa (alimentador de nailon) como se encuentra en los bolígrafos de "punta fina" comunes (Hauser schreibtechnik GmbH, Gosheim Germany). Mientras la punta alimentadora aplica las manchas en la membrana, su otro extremo está en contacto fluido con un depósito que contiene la solución de sonda (tampón de incubación, concentración de sonda 25 \mumol/1). La transferencia de la solución de sonda a la membrana se controla por la interacción capilar de la membrana y el alimentador: la solución de sonda llena autónomamente los canales que están en contacto físico con la punta alimentadora. En este ejemplo se han usado 2 líneas con 3 manchas de 0,5 mm de diámetro (3 manchas por cada tipo de sonda). La distancia entre manchas individuales era 1 mm. Después de la aplicación de manchas y una fase de incubación de 10 min a temperatura ambiente, el material de sonda no unido se lava usando el tampón de lavado.

En este ejemplo, se prepararon de esta forma 4 sustratos idénticos.

Hibridación

Después, las membranas se introducen en una célula de flujo y se ponen en contacto con el tampón de incubación que contenía los fragmentos de ARN de VIH.

Se han aplicado cuatro series de condiciones de hibridación en 4 experimentos diferentes:

1 volumen de 25 \mul que contiene 1,5*10^{12} moléculas de QA ARN, no fluye

2 volúmenes de 25 pl que contienen 1,5*10^{12} moléculas de WT ARN, no fluye

3 volúmenes de 25 pl que contienen 1,5*10^{12} moléculas de QA ARN, flujo continuo

4 volúmenes de 25 pl que contienen 1,5*10^{12} moléculas de WT ARN, flujo continuo

Con los experimentos 1 y 2 no hay transporte del tampón a través de la membrana.

Con los experimentos 3 y 4, la solución de 25 pl de ARN fluye continuamente a través de la membrana en dos direcciones (atrás y delante) con una velocidad de aproximadamente 25 pl/min.

Para controlar este flujo, se usó un dispensador Hamilton automatizado.

En todos los experimentos la hibridación fue a temperatura ambiente durante 10 min.

Lavado

Después de hibridación, las membranas se lavan usando 5 ml de tampón de lavado.

Marcado y detección

Para la detección, una sonda que es genérica para ARN de VIH (SEQID #5) se deja interaccionar con las membranas. Esta sonda está contenida en el tampón de incubación (40 nmoles/1). En cada experimento se usa un volumen de 75 \mul, sin flujo. Las sondas se marcan con la enzima de peroxidasa de rábano picante (HRP) en una relación 1:1, usando maleimida que contiene reticuladores heterobifuncionales (Hashida, S. et al. (1984). J. Applied Biochem. 56, 56-63). Antes del acoplamiento de HRP, las sondas se tiolaron (Carlsson, J. et al., (1978) Biochem. J. 173, 723-737).

Después de lavar con 10 ml de tampón de lavado, una solución que contiene 3,3',5,5'-tetrametilbencidina TMB - peróxido de hidrógeno (Organon Teknika, art: 78510), se pone en contacto con las membranas (no fluye).

Resultado

La interpretación de los resultados se hizo con ayuda de la vista. En los experimentos 3 y 4, aparecen manchas azules casi inmediatamente en un sitio donde se espera una reacción específica (las manchas que contienen sondas de WT se vuelven azules usando WT-ARN, y las manchas que contienen sondas de Qa se vuelven azules usando Qa-ARN). Con las manchas que contienen sondas que no son complementarias del ARN en el tampón no se observó color, aunque la zona en la membrana entre las manchas muestra un color ligeramente azul claro después de varios minutos, probablemente debido al lavado insuficiente o a alguna unión no específica. En los experimentos 1 y 2, se obtiene un resultado similar, sin embargo, en estos casos tarda aproximadamente un minuto antes de que las manchas azules se hagan visibles.

Además de la evaluación visual de las manchas durante la reacción de TMB, las manchas de las membranas en los experimentos 3 y 4 se evaluaron usando un densitómetro de imagen (Biorad GS700). Para este fin las membranas se sacaron de las células de flujo (Tabla 1)

TABLA 1

2

Ejemplo 2

Las sondas de oligonucleótidos se acoplaron 30 covalentemente a las membranas Anopore usando 3-aminopropil-trietoxisilano (APS) como un conector entre la alúmina y el oligonucleótido. Para los experimentos se usaron membranas Anodics 25 con un diámetro de 25 mm y un área superficial total de 0,3 m^{2}.

Las membranas se activaron por inmersión en una solución de ácido nítrico (0,4 moles/1) durante 1 hora. Después de aclarar con agua, las membranas se secaron y se sumergieron en una solución al 0,25% (vol/vol) de APS en agua durante 2 horas. Se eliminó el exceso de APS aclarando con agua. Después de secar a 120ºC a presión reducida las membranas se almacenaron. La concentración de grupo amino debida al acoplamiento de las moléculas de APS fue típicamente 2-3 \mumoles/m^{2}.

Antes del acoplamiento, los oligonúcleótidos terminados con grupo amino se activaron por reacción con suberato de disuccinimidilo (DSS, véase por ejemplo, PIERCE BV, Immunotechnology Catalog & Handbook, 1990). El grupo succinimidilo resultante en el extremo del oligonucleótido se usó para el acoplamiento a la membrana activada con APS. Se usó el marcaje con 32P para cuantificar los resultados. El acoplamiento con 500 \mul de solución de oligonucleótido en una membrana Anodisc durante 60 minutos dio como resultado un rendimiento de acoplamiento de 1.10^{-10} mol/m^{2} de oligonucleótido.

Ejemplo 3

Definición de un modelo de matriz en una membrana de Al_{2}O_{3} usando un dispositivo de chorro de tinta. Usando tecnología de chorro de tinta estándar, se pueden generar pequeñas gotas con un diámetro de 20-80 \mum y se pueden colocar en un sustrato con altas velocidades con \mum de resolución. Usando un dispositivo de chorro de tinta (HP 660C) disponible en el comercio en combinación con las membranas de Al_{2}O3, se han obtenido matrices de membranas con una resolución muy alta. La inspección visual con un microscopio (aumento: 400x) muestra manchas perfectamente redondas de aproximadamente 60 \mum de diámetro que tienen bordes muy afilados. No se observaron signos de salpicaduras, como se observaba normalmente cuando se usaban superficies no porosas. Se atribuye la alta resolución de la matriz a la alta porosidad del material junto con el carácter hidrófilo de los canales pasantes.

Ejemplo 4 Realización de un inmunoensayo de tipo sándwich

Detección de una gonadotropina coriónica humana (hCG) con un inmunoensayo de enzima usando una membrana de óxido de aluminio como fase sólida.

Revestimiento de la membrana

Se revistieron pequeñas zonas de las membranas de óxido de aluminio (redondas con un diámetro de 20 mm) con una solución tamponada (fosfato 0,0127 mol/1 y NaCl 0,140 mol/1 a pH 7,4) que contenía 1 pg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón (OT-hCG-4B) dirigido frente a hCG. La solución se aplicó con pipeta en gotas de 10 pl sobre la membrana o por aplicación de manchas por contacto usando un alimentador de poliéster (Hauser). Después de incubación a 37ºC durante 30 minutos, las membranas están listas para usar.

Incubación

Las muestras positivas eran una mezcla de 50 pl de hCG con una concentración de 2000 UI/1 y 50 pl de anti-hCG de ratón (OT-hCG-3A) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1 4g/m1). Esta mezcla se preincubó durante 15 minutos. En el caso del control negativo, se mezclaron 50 \mul de tampón con 50 pl de solución de conjugado.

Después la mezcla (100 \mul) se aplicó con pipeta sobre las membranas y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Lavado y detección

Las membranas se aclararon exhaustivamente con un tampón de lavado (NaCl 0,131 mol/l, fosfato 0,0127 mol/1 y Polisorbato 20 0,5 ml/1) en un embudo. Finalmente las membranas se pusieron en un vaso de precipitados que contenía un sustrato para HRP basado en 3,3',5,5'-tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno (Organon Teknika). Durante 30 minutos de incubación los resultados se observaron visualmente y con una cámara.

Resultados

Se hicieron visibles manchas azules transparentes en unos pocos minutos cuando las membranas se revistieron con OT-hCG-4B en el caso de las muestras positivas. En las otras partes de las membranas y con el control negativo, sólo se pudo observar un color azul débil de fondo después de una incubación relativamente larga.

Claims

1. Un método de fabricación de un dispositivo para la realización de un ensayo, en el que dicho dispositivo comprende un sustrato que tiene canales pasantes orientados, abriéndose dichos canales a la superficie para la aplicación de una muestra, estando provistos los canales, en al menos una zona de la superficie para la aplicación de una muestra, de una primera sustancia de unión capaz de unirse a un analito, caracterizado en que el sustrato es una membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la primera sustancia de unión se elige del grupo que consiste de una sonda de ácido nucleico, un anticuerpo, un antígeno, un receptor, un hapteno y un ligando para un receptor.

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la primera sustancia de unión se une covalentemente al sustrato.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la membrana de óxido metálico comprende óxido de aluminio.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la primera sustancia de unión se sintetiza in situ.

6. El método según reivindicación 5 en el que dicha síntesis in situ de la primera sustancia de unión es una síntesis en fase sólida.

7. El método según la reivindicación 5 ó 6, en el que se aplica un compuesto para sintetizar la primera sustancia de unión en una zona particular usando tecnología de chorro de tinta.

8. El método según la reivindicación 7, en el que el compuesto se aplica usando atracción electrostática.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la primera sustancia de unión se aplica en una zona particular usando tecnología de chorro de tinta.

10. El método según la reivindicación 9, en el que la primera sustancia de unión se aplica usando atracción electrostática.

11. Uso de una membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente en el método de fabricación de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para realizar un ensayo basado en una sonda.

12. Uso de una membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente en el método de fabricación de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para realizar un inmunoensayo o un barrido de péptidos.

13. Un kit que comprende un dispositivo fabricado según un método como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho kit comprende adicionalmente medios de detección para determinar si se ha producido la unión entre la primera sustancia de unión y el analito, donde los medios de detección emplean una reacción enzimática.

14. Un método para detectar un analito en una muestra que comprende las etapas de:

a): poner en contacto la muestra con un dispositivo fabricado según un método como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la muestra está continuamente fluyendo de un lado a otro a través de la membrana,

b): dejar que se produzca la unión entre la primera sustancia de unión y el analito, y

c): detectar que se ha producido la unión entre la primera sustancia de unión y el analito.

15. El método según reivindicación 14 en el que la severidad de la unión del analito se modifica variando la temperatura.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 en el que la detección de si ha tenido lugar la unión entre la primera sustancia de unión y el analito se realiza a tiempo extra.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el analito comprende ácido nucleico.

18. El método de la reivindicación 17, en el que el ácido nucleico deriva de un virus de inmunodeficiencia humana.