DE2405316C3

DE2405316C3 - Immobilisiertes Enzympräparat

Info

Publication number: DE2405316C3
Application number: DE2405316A
Authority: DE
Inventors: Ralph Allan Horseheads N.Y. Messing (V.St.A.)
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1973-02-16
Filing date: 1974-02-05
Publication date: 1978-04-27
Also published as: FR2218344B1; JPS577713B2; US3850751A; CA1018469A; GB1440702A; BE811132A; DE2405316A1; FR2218344A1; JPS49110887A; DE2405316B2

Description

Die Erfindung betrifft immobilisierte Enzympräparale, bei denen das Enzym an anorganische im wesentlichen kieselsäurefreie Träger gebunden sind.

Die meisten hochmolekularen Enzyme sind wasserlöslich, was ihre Anwendbarkeit als Katalysatoren begrenzt, weil sie mit in Lösung gehen, die Produktreinheit beeinträchtigen und verlorengehen.

Es ist daher versucht worden, sie zu immobilisieren, wasserunlöslich zu machen, z.B. durch Bindung an oder Einschiuli in einem wasserunlöslichen Träger ohne Beeinträchtigung der katalytischen Aktivität auf längere Dauer. Bisher wurden vielfach organische Träger verwendet, z.B. Polyaminostyrolperlen oder Zellulosederivate. Nachteile der organischen Träger sind Quellung, mangelndeSteiflgkeil, geringe Diffusion des Substrats, Mikrobenbefall, geringe Wärmebeständigktit, schwierige Sterilisicrung usf. (vgl. Wectall, in Science, Bd. 166, |l%9|, S. 615). Deshalb wurden nach der Lehre der US-PS 35 56 945 und 35 19538 anorganische Träger vorgeschlagen.

l'ür die nach der Lehre der DT-OS 1944 418. entsprechend US-PS 35 19 538, geforderte kovalente Bindung des En/yms über zwischengeschaltete, einen sili/itinifiinklionellen Teil und einen organischen Teil aufweisenden Silankopplcr wird cm slark kieselsir.irehaltiges Material, insbesondere poröses Glas bevorzugt, wenn auch anderes, nicht sili/iumhaltige Metalloxide ;ils Möglichkeit erwähnt wen.len. ohne jedoch die physikalische Beschaffenheit. Porös lät. Korngröße und dergleichen als kritische Merl· rn.de erkannt /u haben. »Jas gill auch für die weitere Entwicklung auf Jiesenn Gebiet, wobei die spätere US-PS mit ihrt:m Vorschlag einer Bindung Jes Enzyms an eine Triig:r-Substrat-Kombination wiederum die Verwendung \on porösem Cilas ais Trägennaterial bevorzugt, vgl. den Anspruch I, und in je Jem Falle die Bedeutung wesentlicher physikalischer Merkmale nicht behänd*;It.

Zwar erörtert Messing in Enzymologia, Bt). .'W,

S. 12-14 das Verhältnis von Porengröße und Oberflächengröße auf die Quantität adsorbierter Enzyme, beschränkt diese Betrachtung aber auf poröse Glasträger und auf den rein quantitativen Gesichtspunkt der adsorbierten Enzynim engen.
Demgegenüber wurde gefunden, daß kieselsäurehal-

is tige Träger, wie z.B. poröses Glas in alkalischer Umgebung nur eine sehr kurze Lebensdauer haben; das ist umso bedauerlicher, as viele Enzyme bei alkalischen pH-Werten katalytisch besonders wirksam sind. Die Alkalifestigkeit kann durch Überzug mit einem

•o Metalloxid, z.B. Zirkono^id, verbessert werden. Jedoch bedeutet dies einen sveiteren Bearbeitungsschntt und höhere Gestehungskoiten.

Auch ein Überzug von organischen Polymeren wurde bereits vorgeschlagen, US-PS 37 05 084. Auch dies erfordert aber ein aufwendiges Beschichtungsverfahren und führt wiederum die Nachteile organischer Stolfe ein.

Besondere Schwierigkeilen entstehen auch bei dt.n für die großindustrielle Produktionsweise in Durcilaufkolonnen, die eine besonders zuverlässige und dauerhafte Immobilisierung der benötigten Enzyme verlangt.

Es ist daher Aufgabe de: Erfindung, immobilisierte, auch für die Verwendung in großem Umfang, inshe-

.15 sondere Durchlaufkolonni.:n und dergleichen, geeignete Enzympräparate mit guter Lebensdauer, Alkalibeständigkeit sowie verbesserter quantitativer und qualitativer Immobilisierung zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch das Enzympräparat der Erfindung mit einem im Wesentlichen kieselsäurefreien Träger dadurch gelöst, daß das Material em poröser Keramikkörper m t einer durchschnittlichen Korngröße von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchschnittlicher Porendurchmesser wenigstens so groß w e die größte Abmessung de Enzyms, aber kleiner a s 1000 Ä, und daß das Enz>m an die Innenfläche dts porösen Keramikkörper gebunden ist.

Von kritischer Bedeutung ist das Verhältnis von durchschnittlicher Porengrc ße und der Abmessung dts an den Träger zu bindenden Enzyms. Die durchschnit liehe Porengröße soll Beschickung und llalbwertsze t der Lebensdauer möglichst erhöhen und eine leicht: Diffusion des Substrats in dis Trägermaterial und zum gebundenen Enzym gewährleisten. Vorzugsweise wird

Ss das Enzym an kieselsäurefrsies, keramisches Material aus agglomerierten Mctnlloxidpurtikeln wie Aluminium-, Titan- oder Zirkonoxid gebunden. Der Träger kann auch mehrere dieser Metalloxide enthalten. Der Träger muß im wesentlichen frei von Kiesel-

to säure sein, also möglichst kein SiO_-, enthalten. Er besteht aus einem nicht brü jhigcn, keramischen Material mit einer Oberfläche jirölkr als 5 ijm/g und hat einen Durchmesser der durcischnilllichen Porengröße, der wenigstens so groß we die größte Abmessung

(κ des zu bindenden I 11/virs. aber kleiner als etw 1 KHK) A ist

Der fuger muH porös sein, bloß lein verteilt.-Metalloxulnartikeln uenime 1 also nicht ohne weitere¹

Ein kritische« Merkp u| ist das Verhältnis der durchschnittlichen Porengi UIe des Trägers und deruröUten Abmessung des Enzym >. Der bevorzugte durchschnittliche Porendurchmesstsr hängt unmittelbar von der größten Abmessung des verwendeten En/yms und in gewissem Umfang auch von der GröUe des in Frage kommenden Substrats ab, falls dieses etwas größer als das En/yn sein sollte. In jedem FaJIe muß es zwar wenigstens so groll wie die größte Abmessung des Enzyms, aber kleiner als 1000 λ sein. Durch geeignete Auswahl aus diesem Bereich können auch Träger mit die Diffusion größerer Substrate gestattender Porengröüi erhalten werden. Das Enzym muß in das innere Po rennetzwerk im Wege der Massendiffusion eindringen können. IstdasSubstratgrößer, z. B. bei proteolytischen Enzymen, so muß die durchschnittliche Porengröl e auch das Substrat eindringen lassen. Die obere Grenze sollte aus zwei Gründen jedoch 1000 Ä nicht iil·ersteigen. Größere Porenweiten verringern die Gesam!oberfläche für die Enzymaufnähme. Zweitens wire der Schutz des Enzyms unter Turbiilenzbedingungei! bei größeren Porcnwcitcn geringer, d. h., es besteht die Gefahr der Ablösung des Enzyms, besonders bei Durchlaufumsetzungen mit größerem Druckabfall Der praktische Bereich für die meisten Enz)me lieyt zwischen 100 und 1000 Ä, vorzugsweise IOO-500 Ä. Die beste durchschnittliche Porengröße hangt abei immer vom jeweiligen Enzym und seinem Substrat al).

Die größte Abmessung eines Enzyms oder seines Substrats kann in beknn lter Weise aus dem Molekülgewicht oder du:-"!; Ausichlußversuche bestimmt werden. Bei sphärischen I nzvmen ist die größte Abmessung etwa der Molek j|durchmesser. Bei länglichen Enzymen ist tlie größte Abmessung die Länge, usw. Die durchschnittliche Porengröße muß in manchen Fällen auch Jas Substrat berücksichtigen. Ist das Substrat kleiner als cias Enzym, so diffundiert das Substrat zum gebundenen Enzym (z.B. Glucose und Sauerstoff zur gebunJencn Glucoseoxidase) meist ohne Schwierigkeit. Is das Substrat dagegen so groß wie oder größer als dis Enzym, so muß die durchschnittliche Porengröß; des Trägers dies berücksichtigen. Soll ein stabilisiertes Papainpräparat z.B. zur Hydrolyse einss Proteins wie Alpha-Casein dienen, so muß das mehrfach größere Alphu-Caseinmolekül (Molekülgewicht 121OCO im Vergleich /u 21000 des Papains) diffundieren lassen. Die durchschnittliche Porengröße muß z. B. das 2- bis 4fache der Größe des Papainmoleküls b !tragen, also wenigstens etwa 100-200 Ä, W'inn da.' Papain zur Hydrolyse von Eiweiß (Mol«:külgewi:ht40000-70000) verwendet werden soll. Dagegen l.ann bei Herstellung von Fructose durch Einwirkung vnn Glucoseisomerase (Molekülgewicht 1803(K), Gräte etwa 100 Ä) auf Glucose die Porengrößfi näher am unteren Ende des angegebenen Bereichs liegsn. Das gleiche gilt z.B. bei Urease (etwa 125 Ä) mil ebenfalls kleinem Substrat. Hei sehr großen Enzymen wie Pyruvatdecarboxylasc mit einem berichteten Molekülgewicht von über I 000000 muß der Träger näher an der Porengröße von 1(KM)A liegen, und auch der kritische Bereich ist entsprechend kleiner. Auch bei Catalase mit einem Molekülgewicht von et>v;i 2.SO(KK) und einer größten Abmessung von etwa I H.! Ä ist der kritische Bereich ctwiis kleiner, liegt also /wischen 1831(KK)A, wobei übrigens (his kleinere S.ihslral (Wasserstoffperoxid) unberücksichtigt bleiben kann.

Die Art der Bindung hängt in bekannter Weise vom beabsichtigten Gebrauch, den Kosten, der technischen Durchführbarkeit, der behaltenen Enzymaktivität, der Zugänglichkeil der Reagenzien usw. ab. s Meist kommen drei Methoden in Frage, nämlich Adsorption z. B. gemäß US-PS 35 56¹MS, chemische Bindung über Silankuppler gemäß US-PS 35 I¹) 538, 36 6') 841 und Adsorption und Verkettung in den Poren gemäß Patentanmeldung P 23 39 805.2 der gleichen Anmelderin. Die Trägeroberlläche muß lediglich freie Oxid- oder Hydroxylgruppen zur Bindung aufweisen, die das Enzym über Adsorption, eventuell auch Verkettung in den Poren oder über chemische Kuppler mit wenigstens einem mit diesen Gruppen umsatzbereiten Teil binden. Alle drei Methoden ,verden hier mit »Bindung« bezeichnet. Sie können auch kombiniert werden. In den weiter unten erläuterten Beispielen wurden die Enzyme nach dem Verfahren der US-PS 35 56 945 adsorbiert.

ίο Von großer Wichtigkeit für Herstellung und Gehrauch des Präparats ist die Korngröße des porösen Kcramikirägers. Lim seine Oberfläche voll auszunutzen, muß das Enzym vor Bindung lief in den porösen Träger eindringen können und nach Bindung des Enzyms gilt dies auch für das Substrat.

Die DilTusionsfähigkeit des Enzyms hängt von mehreren Faktoren ab, wie Porengröße und Korngröße des Trägers, pH-Wert und isoeleklrischcr Punkt des Enzyms, sowie Zeit und Temperatur. Als bevorzugter Korngrößenbereich des Trägers wurden 0,074-4,76 mm (4-200 p)csh) gefunden. Größere Partikeln erschweren die Diffusion, so daß die Oberfläche nicht voll genutzt wird, und erfordern beim Durchlaufeine sehr lange Verweilzeit des Substrats. Kleinere

is Partikeln sind nur schwer in der Kolonne zu hallen und verursachen bei dichter Packung einen besonderen Aufwand erfordernden starken Druckabfall. Besonders günstig ist der Bereich 0,177-0,71 mm (25-80 mesh).

Für die Herstellung wird ein poröser, im wesenlliehen kieselsäurefreier Keramikkörper mit entsprechender Porengröße gemahlen und klassiert, wobei vorzugsweise auf möglichst gleichmäßige Porenverteilung geachtet wird. Geeignet sind beispielsweise poröses Aluminium-, Titan- oder Zirkonoxid, einzeln oder in Mischung oder auch andere, wasserunlösliche Metalloxide. Die porösen Körper werden dann mit einem geeigneten Puffer für die anschließende Enzymbindung vorbereitet oder hydratiert, um möglichst viele Oxid- oder Hydroxylgruppen an der Oberfläche zu bilden. Zur Adsorption von 1. ti. Glucoseisomerase auf porösem Aluminiumoxid wird eine Hydratation mit einem Puffer mit mehr als 7 pH bevorzugt. Zur Bindung durch Adsorption wird zunächst der Puffer entfernt, jedoch werden die Partikeln feucht gehalten.

Sodann wird das Enzym mit einer die optimale Adsorption oder optimale Beschickung der verfügbaren Oberfläche gewährleistenden Konzentration zugesetzt. Die Adsorption und Massendiffusion des Enzyms in den Poren kann durch Bewegung beschleunigt

ho werden, l. ti. Umlauf, Rühren, Umkippen, Verwendung eines lluiden Betts und dergleichen. Die erforderliche Dauer der optimalen Adsorption hängt vom Träger der Porengröße. Partikclgrößc. (irößc und Spin der Enzymmoleküle, Temperatur, pll-Wcrl. Bewegung

ds usw. ab, jedoch ist für ausreichende Adsorption und Beschickung mindestens eine halbe Stunde erforderlich, meist l'/'-5Std. Meist sollte der pll-Wcrl so uewahlt werden, daß die Oherlliichcnhidiinii ili?s

Hn/ynis umgekehrt der Oberflächenladung des 1 rägers ist. Nach der Adsorption wird loses Hn/ym abgcvviiti-licn,/. B. mit Wasser, Salzlösung(z. B. 0,5 MNaCI) u.a., die das Präparat nicht beeinträchtigen.

Bei Anwendung kann das Fnzymprä'parat in einer s vcrslöpsclten Durchlaullcolonne, einem ständig gerührten Umsctzungsgelaß, einem fluiden Bett und dergleichen mit der Möglichkeil der Subslrataufgabe zur Inkubation gehallen werden. In den Beispielen wurde dir Fnzymaktivität wiederholt unter statischen und dynamischen Bedingungen untersucht. Bei Prüfung unter dynamischen Bedingungen (entsprechend der gcpllanten Anwendung) wurde die Halbzeit des Enzyms (Verlust der halben Anfangsaktivität) gemessen. Jc länger diese Halbzeit, desto wertvoller ist auch das Fnzym. Die Beispiele zeigen durchweg sein lange Halbzeiten und gute Lagerfähigkeit.

Meist wird kontinuierliches Arbeiten dem abschnittsweiscn gegenüber bevorzugt. Bei Verwendung in einer Kolonne kann mit Hilfe eines Wassermantels eine optimale Inkubationstemperatur und eine die IIaIbwcrls/ciil möglichst verlängernde Temperatur eingehallen werden: z.B. bei Herstellung von Fructose Gliicosc-Substral und Glucoscisomerase ist für beide Gesichtspunkte 60° günstig. Der pH-Bereich und das Ptilfersystem für die Inkubation hängen auch vom jeweiligen Fnzymsystcm ab, z. B. bei Herstellung von Fructose. 7,2-8,2 oder, besonders günstig, 7.4-7.8. In der Regel wird das PulTcrsystcm im Hinblick auf die saure oder alkalische Beschaffenheit des Substrats gewühlt, die durch die Substratlösung selbst und/ oder die Gegenwart verschiedener, zugesetzter aktivierender Ionen verursacht wird, sowie den optimalen pH-Wert des Fnzymsystcms.

In den folgenden Beispielen wurden als Träger für is die angesehenen Fnzymc poröse Keramikkörper verschiedener, kiesclsäurclrcier Metalloxide mit PorcngröUcn von 140-985 A verwendet. Die ParlikclgröBc der Träger lag zwischen etwa 25 und 80 mesh. Die Träger bestanden jeweils aus

AUO, (175 A)

ZrO, (175 A)

TiO. (350 A) (420 A) (820 A) (855 A)

TiO-AU), - (220 A) 4s

Der zuletzt aufgeführte Trägci bestand ;uis44 Gew.-¹', TiO, und 56", AU)₁.

B c i s ρ i e I I sn

(ilucoseisomcrase adsorbiert auf porösem AIiO₁

Cilucoscisonicra.se (größte molekulare Abmessung etwa 4(KlA. Molckülgewiclit 1800(K)/ wurde auf po- ss rösem Aluminiumoxidkörpcrn mit den folgenden physikalischen Merkmalen adsorbiert:

l'orösei Al O₁-I rager

Durchschnittlicher Poren- 175 A

(Itiri'hmesser

l'oieniluichniesset. Minimum 140 A

l'iih'Hiliiii hmcssei. Maximum .VO Λ

l'oiein olumcii O.d em Vg

OIktII.r-Ik 1(1(1 m 7g

IMOHc 1 mesh .'■> (Ό

Das adsorbierte Hnzym bcsland aus roher Glucoseisomerase enthaltend 444 internationale Glucnseisnnieraseeinheilen (IGIH) pro g. Die Fnzymaklivitäl wurde mit einem modifizierten Cyslein-Carbozolverfahrcn bestimmt. Das stabilisierte Präparat wurde folgendermaßen hergestellt: einer Lösung von 28,7 ml 0,1 M Magncsiumacclat wurde 5 g des obigen rohen Glueoscisomcrasepräparats zugesetzt. Die Aufschlämmung wurde 25 Min. bei Zimmertemperatur gerührt und durch Filterpapier filtriert. Der Rückstand aul'dcm Filterpapier wurde mit 14,3 ml 0,1 M Magncsiumacetatlösung und anschließend mit 14,3 ml 0,5 M NaIICO, und 4,3 ml 0,5 M NaIICO, gewaschen. Das Waschprodukt wurde direkt im Filterpapier aufgefangen. Das Gesamtvolumen der f-nzymwaschlösung betrug etwa 50 ml.

500 mg des porösen Aluminiumoxids wurden in eine 50-ml-Kugeinasche gegeben und 10 ml der Glucoseisomeraselösung zugesetzt. Die Flasche wurde an einen: Rotationsverdampfer befestigt, ein Vakuum angelegt und die Flasche in ei>em auf 30-45° gehaltenen Bad 25 Min. tang roiicrt. Sod inn wurden IO weitere ml Glucoseisomcraselösung zugesetzt und die Verdampfung unter den gleichen Bedingungen 35 Min. fortgesetzt. Dies wurde zweimal wiederholt, dann eine abschließende Menge von 7 ml Glucoscisomerasc zugesetzt und bei 45° wcilcrc 70 Min. verdampft. Die Flasche wurde dann übers Wochenende in einen kalten Raum verbracht. Insgesamt 47 ml Glucoscisomcrasclöi-ung waren den porösen Aliiminiumoxidpartikeln zugesetzt worden.

50ml Puffer aus 0,01 M Natriummalcal mit pll 6,8-6,9 und enthaltend 0,(KIl Cobaltchlorid und 0.005 Magnesiumsulfat wurden dem Fnzympräparat zugesetzt und die Probe I Ski. bei Zimmertemperatur extrahiert, dann mit 200 ml Wasser und anschließend IO ml 0,5 M NaCI gewaschen. Die letzte Wäsche wurde über einem Glasfrittcntrichtcr mit 50 ml Wasser durchgeführt. Das Fnzympräparat winde darm in einen .SO-ml-Frlcnmcycr-Kolben gegeben und im Puffer bei Zimmertemperatur gelagert. Wiederholte Proben wurden während 106Tagen entnommen. Der durchschnittliche Wert der Prüfungen betrug 130KiIF pro 500 mg, die Fnzymaktivitälsausbeutc betrug 6%. Der Durchschnittswert wurde durch 20 Prüfungen während der 106 Tage ermittelt, wobei 16 der Prüfungen eine Aktivität von KK)- 150 IGIF pro 5(K) mg (2(K)-300 KiIF pro μ) zeigten. Diese Ergebnisse zeigen eine sehr hohe statische Stabilität bei vergleichsweise starker Fnzynihcschickung. Die zurückbehaltene Fxtraktlösung wurde ebenfalls geprüft; sie enthielt 39.8KiIF! pro ml. also eine Fnzymaklivitätsausbcutc von 90"/,.

Beispiel Il

Zur Prüfung unter dynamischen Bedingungen, die einen besonderen Wert der crfiiuiungsgcmäßen Präparate ausmachen, wurde die Fn/yniwirkung bei der Isomerisation von Glucose zur Fructose unter industriellen Fi.isalzbedingungcn geprüft. Die IructoschcrstcP.ung aus billiger Glucoselösiing ist wegen der doppelten Süßwirkung hei gleichem Kaloriengehalt. Ivu. gleicher Süßwirkung bei halben Kaloriengehalt \on besonderem wirtschaftlichen Interesse

KIg des stabilisierten Glucoscisonierascpräparals vwirden in mil vVasscrkühlmänlcln umgebene Kolonnen tiegelien. Die Kolonnen wurden dureh I hernioslale ,Uli einer i'emneraliir von Ml" ιμΊκιΙιιίι lim·

Ml¹ ige ( dm η se I os ι in;¹ w nid.· Ii ι ndii 11 hpepiimpl. wobei del Diifchsa!.' so emre-.l·¹!!! wurde, dall cmc I riictoseiimwandluii!' \on XO X^ del Iheoielischen errcii hl wurde (iegebenerilalN wurde del Diinhsaiz in hesliulnilen Absätzen herabgesetzt Die A nlailgsdiircllsatzrale war I¹MI ml pm SId Das Piaparat wurde lulgendeimalU'ii hergestelll

llj: del im Beispiel I IuS₁ hiiehencn porösen AInniiiiiiiinoMdkorper winden in einen IOO-ml-( ilas/\ linder gebracht und iinlei Zusal/ um KHImI l'.ll> M Magncsiumai elal und 0.01 M ( ohallacclat mit pH 7.5 \ ot in¹ handeil Del Z \ linde ι winde \ ei stöpsel I und nach Mischen dun h l^:nidrehen in ein 60" uarmcs Had gesetzt Nai h IvMin. I imselziing wurde der Zylinder umgcdiehl um\ die I liissigkcil abgegossen. KIOmI Irisches Magnesium-( Obaitaceiat wurden zugesetzl. duri. Ii I nidrehen des Z) linde is gemischI und 2'/¹Sl(I. bei Zimnierlcnipeialur stehen gelassen.

Vor der Adsorption wurde eine rolle l.nzymlösung bestehend aus Si)(I KiIL pro ml in 0.6 gc-siiitipicm Amnioniumsullal wie lolgt geieuugl: 40ml der (ilncoseisomeiaselösiing \Mirdeii. 1.4 weitere μ Ammoniunisullal zugesetzt, um das I iizwii auszulallen. Die \ulschl,immung w urde hei Zimmertemperatur 20 Min. L-enihil. und dann bei 2 .10 Min. lang mit Hi(KK) DpM /enirilugierl Die überstehende I lüssigkeil wurde abgegossen uni\ weggewmlcn !2 ml der obigen Magnesium-! iihall.Ketallosiiug winden der Ausladung zugesetzt iind getuhrt Sodann winden .1 ml 0.5 M Natriumhicarhii'ial zugegeben und bis zur A ulinsung gemischt. Die Losung wurde 15 Min in em 60' warmes Had gehrai hl und n,n h I nliiahme 15 Min. bei 2" mit IMKHII pM zenliiliigieit Die klare überstehende Lnz > inIn--ung wurde ahg·, ιό-sei: und die Ausladung wegiiewnilen. Die I nz) mloMinr (2XmIl halle einen pll-W en ".s. IaIIs bei dei Reinigung keine Aktivität verlorenging, so hciiui' die Aktivität der Lösung clw.ι 2.1600 Kill

Zur \dsorplion wurde mn die Magnesium-( oballacet.illösung tiai. h Tmtehien um den porösen AIuii"iiniumo\i(lkörpetu ahgegos-eii und 2XmI Lnzymh'isung m einem Z) linder zugeselzt. Der Zylinder wurde \erstopsel!. diirJ_; I ;n liehen gemischt und in ein Ml warme- Bad ge-et/i Die I nz\me wurden m die Puren dillundieren ιιιι>! mn dem porösen AIu- :iiiniumo\id bei Mi 2 ' Md umsetzen gelassen. Während nie-e^ Zeitraum- v. urde der Zylinder alle ivMin durch I nidrehen gcnu-i. ht. Naeli lontnahme ,tu- dem Bad wurde die \ds"iption Ih.ι Zimmertemperatur durch I'nidrehen und Mischen alle .10 Min. während 2 Std. lurlgc-el/l und über NaJiI bei Z.imirertemperatur dur..ii Stehenlassen zu Lnde gelVihrl. Die Lnzwnio-imi'. wurde abgegoisi i2S.5 ml. pll ~.ίι "die eitere Prüfung ;:ii(liev,iiir! Du- -tabili-.P') !■ :';■.;;■.ira: wurde mit Mi iv_:! destilliertem UH,: ~ ■- - r".; π ι -; mit -ίο ml n.5 M NaCi und ··. u ■''.::;. Magne-iium-i 'ohaMü.. ei.illö-■■ Dr r ν nc Proben :< <n ·■: cIa:· ] n \\a • :■'-.. ' I'τ..ϊLiiijj entivmmc!!

der Iheiiielisi hen lenlspieehend einei I na loseaus heule um etwa 40 I¹V ι \eiiin;u'il wurde. Dn Diiiehl.iul/eil hclrui: iiis^eMiml .'I I ;ιμΐ". Die Koliinin winde dann diiieh \hhiurh del I i'lSiings/'iilnhr aus gelioekiiel. l'roiliiklproben enliiommen und die π μ/Std. cr/eiiule I im tiiscmcmu· μeιncsseιl. Da de Duiehlaiil penodisih \ltiίιιμοΓΐ wurde, so dall eiiu konstante I !mw.inilluimsiatc um X(I X5"„ μι:μ^κ·η war isl die an einem hestiiiimlen Ι;ιμ pro SId. er/eiiül· I ruetosemei^e ein getreuei M.illslab liir die [ n/\ in akliMlal in der Kolonne. Die An'angsbeschn kirn; dei Kolonne belruj». .1X1 Kill, pro μ, die μι^ίΐηιΚ' Ko Imine enthielt IXI(IKiIi:. die über .11 Ί ape 42 2X > I ructose pro Sl(I. e^ahcn. so dall die Halb/eil de· Präparats elwa 42 laj!e ΙκΊπιμ. Der Versuch /eiut eiin hohe Stabilität des I n/ympräparals. der vermutlul aiii der spc/iliselieii Ausk^ung des Ί riijicrs mit eine liir die (ilucoseisonieiase optimalen durehsehnill liehen l'orei\i:roflc beruhl.

Beispiele III und IV

(ilucoseisoiiierase adsoihierl aiii porösem /rO. und IiO-Λ LO;

Die I rai'er hallen die lohnenden liigcnsLli.Hlon.

ni: ge-

u:id i
' pH

	ZrO	A	lid	-M-O
Porendurchmesser.	I"-		2211	A
d u rc hsc h n.		A
Porendurchniesser.	Md		14(1	Λ
Minimum		A
PorcndurchmessLr.	200		"-0(I	A
Ma\imuni
l'orensolumen ir. ccni/g	0.2.		0.5
Obertlache in (\|iu/g	50	Ml	75
ParlikeleröHe in mesh	1% -	Iv-	SO

5(Ηΐηιμ poröses ZrO und /00 mi: IiO-AI-O: ν urden gelrennt mit O.O.vM Magnesiumacetat-0.01 M C oballaceliitlösung. pll 7.5. 60'· w'jIirend 15Mm. iiiid ihiiin bei Zimmertemperatur wahrend .1 Std. vorbehandelt Die Lösung wurde sodami nbucgossen. Den I'riigern w irde ι'I.is nil 1(1"2IdIi-J ri.ich Beispiel il gtrcinigte (ihiLiiseisomeraselosunu lieigegehen. Die Adsorption wurde bei W)^: wlihrend 4 Std. durjhgerührl urd dabei .iile 15 Min. durch I '!'drehen gemischt. i.nd ;ι^!\τ N;r. hl !ihn:· weiter:- Mi-chin weiter adsorbieren gj-'.:--ei"i Die re^lhciie I·;v. mliisuni: wurde dar'ii ab^·.·-

Die stabilisiert.;:! (W j :n- jisomcraseprapani se wurd^ri (iann naciiei'-: :iuie: .'ist nut (!.5 M NaCI-..<" suhl. Γ-.:i ii.i.vM .M;!.i;:ie-ium.₁i.etat-O.(.i] M CribalbccUilln- -■::vj. pH ".^ς t:nd /-iiel/i mit destilliertem W a·--·.·: μ j w asl ;·,·-·η Sic \· ι· γ- ίc^:- : !ϋ] ^e!rennt hei Zimrierie:-.;- ;-L^r.:ijr ;i"i W ,ι--·;' .::i;]"_\-,!hri. Sie wurden ibrn --·..; = -■end i S 1 Lilien .:·.:! (ii.l· ■ - ;'-":n era sea.kl; \ :!,'·! ::c :ri:!i

IaIvIIe

Prüfung bei 60" aiii UImI.il in KiIIVg

1 r.ii'ic iihii'.h-.'. linillll· ·|ι·.· Poreiiiirnlic in Al

parate vwiidi-n ιΙ,ιιίι ν.dnc id M lagen mil ( asein gepriill. Sil· Italien die ΙιιΙιάί Av Xktivil.it:

I ahelle Il Statische Prüfung ln-i .!' ',in! \kli\ilal in ηιμ Pap.sill/g I rager

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2.24

11().- MO, (JJiI Al

9.06
(t.XO
4,X5
1.00

Beispiele VII und VIII

Heide Träger ergaben ein stabiles Kn/ympräparat. IiOi-AIiO₁ /eigle infolge größerer durchschnittlicher Porenweite, größerer Oherlläche und ιτηΙΙι·π·ηι Pnronvolumen eine Starkcrc Besetzung mit .iktivem lin/ym. :< > Alkalischer Bacillus sulililis Protease adsorbiert auf

porösem PiO. und porösem IiOi-ALO,

It e i spi el e V und Vl

l'apain adsorbiert auf porösem IiO und porösem :s TiO,-AI.O_;

/ur Herstellung stabilisierter l'apainpraparate wurden Träger mit den l'olyenden physikalischen l'igenschiil'len verwendet: »o

l'oröse TiO, und IiO,-A I ,O₁-I rauer

Porendurchmesser.	350	220
durchschnittl. (A)
Porendurchmesser,	220	140
Minimum (A)
Innendurchmesser,	400	300
Maximum (A)
Porenvolumen (ccm/g)	0,45	0.5
Oberlläche in t\|m/g	4 H	77
Partikelgröße in mesh	25-60	25 -M)

4" Ahnliche Träger vsie in den vorigen beiden Beispielen wurden Tür die Adsorption des llacillus subtilis verwendet, der ein Molekiilgewichl von 27(XM) und eine giöl.Ue Abmessung von 42 A auTweist. Die lin/ynipriiparate wurden durch Verwendung einer aus IO g alkalischer l'rolease sus| endiert in 50 ml 0, IM PhosphatpulTer, pll 7,K enth; Itentlen Lösung hergestellt. IO ml (2 g Fin/ym) der l'roteaselösung wurden 5(X) mg Proben jede^ Tr.igers (350 A Ti()_, und 220 Λ TiO₂-Al₃O₁) /ugeset/t. Die Adsorption entsprach etwa der Tür die obigen P; painbeispiele.

Die erhaltenen Präparate vurden wie gemali der US-PS 35 56 945 mit Casein (Molekülgewicht 121000) geprüft, jedoch enthielt die Substrallösung OJM PhosphatpulTer und der pll 'letruj; 7.4. Die Proben enthielten weder C'ysteinhydr ichlorid noch AthylendiamintetraessigsäLre. Die Tabelle III enthalt die Prülergehnisse von l5Taaen.

Tabelle III

Statische Prüfung

Aktivität in mg alkalische l'rot:ase/g Träger

Tag

.Ie 500 mg Träger wurden getrennt mit 9 ml 0,5 M NallC'OrLösung während l'/?Std. bei 37° in einem Küttelwasscrhad vorbehandelt. Der Puffer wurde dann abgegossen und die Träger mit destilliertem Wasser gewaschen. IO g Papin (Molckülgcwicht 21 (K)O. größte Abmessung4X A) wurden in 50 ml I).] M Phosphatpulferlösung mit pH 6.95 enthaltend H6 mg Cysieinhydrochlorid und 37 mg Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure suspendiert und auf den betreffenden Trägern adsorbiert. Die erhaltenen Präparate wurden mit Casein (Molekülgewicht 12!00O) nach dem Verfahr.-n der LS-PS 35 56 945 geprüft. Dies geschah im einzelnen folgendermaßen.

lü ml enthaltend 2 g F.n/ym der Papiniösung wurden jedem Träger zugegeben und die Adsorption während 3SuI. bei 37° in einem Sehüttelwasserbad vorgenommen. Die L-nzymlösung wurde dann abgegossen und die Präparate mit destilliertem Wasser gewaschen, anschließend rni; 0,5 M NuC! und riochmais mii destilliertem Wasser nachgewaschen. Sie wurden dann bei Zimmertemperatur in Wasser aufbewahrt. Die Prä-Friuer. diirchschnilll. l'iircngröHe in Λ TiO, (W) Al IiOvAIiO, (220 Al

0	5.47	4,69
5	3.M)	1.57
6	1.17	O.M
Ί	0.67	0.40

Beispiele IX -XlII

LJrease adsorbiert auf Trägern mit verschiedener Porengröße

Stabilisierte l'reaseprä'parate können /um Messen des Harnstickstoffgehalts im Blut verwendet werden, weil Urease Harnstoff selektiv zu meßbaren Mengen NH-, und CO, hydroiisiert. die ihrerseits zum Ilarnstoffgehalt in Beziehung gesetzt werden können. In den folgenden Beispielen wurde urease an verschiedene poröse Keramikkörper mit Poreng^rößen von 140-985 A und durchschnittlichen Porenweiten von

Il

I7S 85S \ gchi nden. ipii den Γ rager mil der optimalen l'orengrölte IVir ( ieses Enzym /u bestimmen. Urease hai ein Molekül^.ewiclil von elwa 1X0000 und eine gröllle \hniessiing ,on elwa 125 Λ als Monomer und elwa 250 \ als Dimer. Da Harnstoff, das SuIi-

slrat Itir Urease. ^:.'i \'erh.dlnis /um I ii/\m sehr klein lsi, kann es hei licslimniung der durchsi hnillliihen l'oreiigröl.te liir ''en I rager aiilS'.i achl hleihen, im (iegensal/ /um l'apainsiihstrat Casein. Die I rager h.itleii die folgenden Physikalischen l'.igcnsrhallcn:

Durchschnidl. l'iirendiirehmesser (A) MiniiiHim l'orendurehmesser (A) Maximum Poren liirelimesser (A) Porenvolumen, o.m/g
Oberfläche, qni/j!
l'arlikelgrölie, nitsh

rurüsi:	I Γ,ιμοΓ	VhO₁-IiO,	no,	lid,	U)
ALO₁	220	350	420	8.SS
175	140	220	300	725
140	300	KK)	5¹H)	985
220	0,5	0.45	0,4	0.22
0,6	77	-IH	.15	9
KH)	2"< 60	25 60	.10 SO
25 60

80

500 mg eines eden dieser Träger wurden durch Schütteln in 11 ml 0,5 M NaIICO, hei 37° während I Std. und 40 Min vorbehandelt. Die NallCO,-Lösung wurde dann abgegossen, leder 500 mg Probe des Trägers wurden 20 ml einer I'/,igen wässerigen Urease- js suspension mit -lOOSumn JrEinheilen (SI;) Ureaseaktivitäl pro g oder HOSI; ρ ο Probe beigegeben. Träger und Ureaselosungen wun en 5 Std. in einem Wasserbad bei 37° geschüttelt inl die Mischung dann bei Zimmertemperatur 22 .S il stehengelassen. Dann «> wurde die Enzym ösung u ij,egossen und die Präparate zuerst mit destilliertem W η scr, dann mit 0,5 M NaCI-Lösung und /ulei/t wied :r mit destilliertem Wasser gewaschen. Sie wurden da in in kleine Kolonnen überführt und bei /in inerten" icratur während eines Zsit- ι⁵ raums von 32 Tagen aul Aktivität geprüft. Die Tabelle mithält die Ergebnis e

labeile IV

Aktivität in SE/g mit Tr gern verschiedener Poran- ·*" grollen

AU),
1175)

( !20)

TiO, (350)

TiC), (420)

TiC₂

-45

0.35
0.22
0,11

0,05

0,Hl

0.59
0 45
0 06
0 05
0.03
0.03
0.(11

1,18 4,36

0,63 0,43 0,33 0,29 0,16 0.11 0.07 0,05

2,32 1,98 1,98 1,56

1,11 0,73 0.47 0,34

2,4(i

I₁T 0,9.', 0,61 0,3(i 0.19 0,0V 0.(Ij

erhellt auch aus den folgenden Iteispielen, in denen zwei verschiedene Enzyme gleichzeitig in den Poren eines Trägers mit kleinerer und eines Trägers mit gröHerer durchschnittlicher Poreiigröl.le als der En/ymgrol.ie adsorbiert wurden. Als Enzyme wurden CiIucoseoxidase und Catalase mit den l'olgen;len Eigenschaften gewählt:

Glucoseoxidase - Molekülgewicht 1500(K). grollte Abmessung 84 A, Catalase, Molekülgewicht 250(KK). gröBle Abmessung 183 A.

Diese beiden Enzyme wurden auf einem porösen Akiminiumoxidträger nach Iteispicl I und einem porösem Titanoxidträger nach Beispiel V nil durchschnittlichen Porendurcliniessern von 175 bzw 350 A adsorbiert. Das Adsorptionsverfahren entsprach dem der oben erwähnten gleichlaufenden Anmeldung

Durch Einwirkung von Gkieoseoxida.se auf Glucose in Gegenwart von Sauerstoff entsteht Glueonsäure und Wasserstoffsuperoxid. Es wird also fortlaufend sauerstoff benötigt, gleichzeitig aber oxidiert das Wasserstoffsuperoxid das Enzym, das dadurch seine Aktivität einbüßt. Dem kann durch gleichzeitige Adsorption von Catalase entgegengewirkt werden, da diese durch Einwirkung aul das Wassers ollsuperoxid Sauerstoff freisetzt. Hei kleineren Poreiigröllen, wie Aluminiumoxid (175 A) bleibt Catalase (IMA) aber ausgeschlossen, und die Tabelle zeigt d e Folgen hiervon im Vergleich zum Träger mit weiterer Porengröl.ie.

Tabelle V

Vergleich der Glucoseoxidase-Aktivitätei; (■ iOU) pro g poröses AIiCJ₅ und TiO*

Wie die Tabelle zeigt, lie-gt die durchschnittliche Porengröße für L! -ease bei etwa 420 A, wenn auch eine kleinere Ein/yrnaktivitii nit Trägern durchschnittlicher PorengroLle ι von l'5 oder 855 Ä erhalten bleibt.

IiV und XV

Die kritische Iied nitung e ner zumindest der En/yn ürötie enisprcchent en durchschnittlichen PorenimH.e Hrütungs- Hoispiel \l\'

till!

Pciröse·. Ü75 A) AIjO-,

18,"

1 I.τ

l(),i

8.5

7 (ι

Ik	S\| ιοί	W
Po	ü;cs
ti·:	:j \i	no j
20	5
36.	1
'(>	1
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16	■>
16.	1

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ΙΊιιΙιγ,ι ■
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I¹IlIlISfS (I^-S \) \| .

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Z 4 UD 3 10

Il

I Vdii I !Ml

'id W

rs

\l MO

.'2.5

.K',2 .VS.¹»

.15.5 .12.5

Die Aktivität winde lueibei durch umsetzen von .1(K)IiIj! l'ioben in cine Duichlatilkolonnc gemessen. I ine Slandaiillösiing mim (ilueose wurde mil einem Durchs:;!.- \:ü) ! !5 ni!/S!d. eiügcüihr!. Die (JIüi.oleiiiheitcii winden indirekt duich peiiodisebe Messung des (iii.ioiisaiiieanleiK heslimml.

Beispiele Wl MX

NVeik-κ· 100 mg l'iäpaiale wurden hergestellt, bestehend aus (ihn iiseoMilase wnu (alalase. adsorbiert aiii porösem I itiinoxiditägcni mil durchschnittlichen l'orcngiöHcn win I'M). 120. Sl'O und 855 A und den !tilgenden I igenschallen

hilu-lk \ I

I¹IiIIiSf I i,ii:iT ho. IMI

ho.

Duichschnitll
porenduii.hmessei (A)
Minimum
l'oienilunhmessci (A)

Maximum
l'orendurL'hmesser (Λ)
l'orenvolumen.
ccni/g

Obeill.iehe. i|in/g
l'aitikelj'inlie.
mesh

.150 420 820 X55

.100 7W) 725

400 5¹KI 875

0.45 0.4 0.2 0.22

48 .15 7 ')

2.^ (id .10- SO 25 -SO 2> 80 D:is .Adsiiiplionsverliihien isl in der j'.k-ii lila
Anmelduii}'. heschriehen.

Die I*r:ipjir;iIo wurden ualuciiil 42 I iijien »ic in den vollseil Keispielcn wiedeihiill gepnill. uohei d.is Si'hstiiil in die Kolonnen aber mil dem luiheren Duiehsal/ \on .W(I ml/Sld i-injieli'ilr! winde Iniolge \ ersti'iiklei Stilist im (<li 11 iision ί ·■ t liici eine i'.eslei|-!iTle (ilucosei)\i(lasi.-akli\i(,^:il zu eiwaiti-n

Iabelie N¹III

Vergleich der (illlcoscoxidaseaklivital pm μ IiO. Träger mil steigenden durchschnittlichen I'oiendurchmcssern

l'rüliini'.s- IiO. I liigi-i. iliiiihsi Im Ι'οιι-μι-ΊμΚι' in Λ
Ιίΐμ

1^(I Λ 42(1 Λ S.'ll \ Sss Λ

0	()(i,()	5(>.4	4.1.')	17.X
	iiG.d	77,7	4.1.V	y)j
8	M)₁O	84.5	Id..¹	40..1
1.1	()().()	84.5	4(,,2	4I..1
42	M)₁O	80.5	40.1	42.0

Wie die I abellc zeigt, isl die hingliislige (iluciiseoxidaseaklivitiit ((iOli/g) allci viei l'räparale auHerordentlich beständig. Dies gilt jüin/ besonders Tür poröse I iliinoxidlriiger mit diiichschnilllichen l'orengröHen von Γι5() A; über einen /citrullin son 42 lagen konnte hier kein Akliv ilätsverlust beobaehlet werden, und das unter Bedingungen mit gesteigertem Durchsatz derSiihs(ratlf">sung(.V)(>ml/Std. gegenüber 145 ml/ Stil), die an sieh eine gröKere lin/yniaHosimg erwarten ließen. Bei grüUercm durchscbnittliclicm l'oienduixhmcsser des Trägers, über 42(1 A. war eine abnehmende lin/ynibesciiickiing /u beobaehlen. die aiii die geringere Oberlläche (7 ') qm/μ) der porösen IiO.-Iräger mit durchsclr iltlichen l'orengröHcn von X20 und X55 Λ zurückgeführt weiden kann, l'iäparatc mil Trägern aus porösem Titanoxid mit diiichschniltlicliem l'orendurchmesMer von 420 A zeigten die sliirksle Beschickung in (i()l-!/g. Ιίιι diesem etwa en!',irechendcr poröser Träger (l'orcndurchmcsser .MKlA Minimum. 590 A Maximum) wird tür ein synergistisches (ilueosc-Oxidase-Catalasesystcm daher bexor/ugl Selbst Präparate mit Trägern einer durchschnittlichen l'orengrölie von 855 Λ (725 Λ Minimum und 4X5 Λ Maximum) waren bemerkenswert beständig, obgleich ü\^r /iihl der (i()I:/g infolge der kleineren Obcrlläebc ucrinuer war.

Claims

Patentansprüc ie:

1. Immobilisiertes Enzympriparat, bei dem das Enzym an ein im wesentlichen kieselsäurefreies anorganisches Material gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dali das Material ein poröser Keramikkörper mit einer durchschnittlichen Korngröße von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchschnittlicher Porendurchmesser wenigstens so groß wie die größte Abmessung des Erzyms, aber kleiner als 1000A, und daß das Enzym an die Innenlläche des porösen Keramikkörpers gebunden ist.

2. Enzympräparat nach Ansp-uch I, dadurch gekennzeichnet, daß derPorendurchmesser 100-1000 Ä, vorzugsweise 100-500 Ä, beträ|;L

3. Enzympräparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Keramikkörper wenigstens teilweise aus Aluminiumoxid, Titanoxid oder Zinkoxid besteht.

4. Enzympräparat nach Anspruch 3, didurch gekennzeichnet, daß die durchschnittliche Korngröße 0,177-0,71 mm beträgt

5. Immobilisiertes Enzympräparat, bei dem das Enzym an ein im wesentlichen kieselsäurefreies anorganisches Material gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Material ein poröser Keramikkörper mit einer durchschnittlichen Korngrüße von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchschnittlicher Porendurchmesser wenigstens so groß wie die größte Abmessung des Enzymsubstrates, aber kleiner als KXX)A ist, und daß das Enzym die Jnnenlläche des porösen Keramikkörpers gebunden ist.