DE3336257A1 - Verfahren zur immobilisierung von enzymen - Google Patents
Verfahren zur immobilisierung von enzymenInfo
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Description
Enzyme, die mit Hilfe von Vernetzungsmiteln immobilisiert
sind, gehören zu den verbreitetsten Formen von immobilisierten Enzymen. Um derartige immobilisierte
Enzyme herzustellen, sind zahlreiche Verfahren entwickelt worden. Bei einem derartigen Verfahren wird
ein Träger zunächst mit dem Vernetzungsmittel aktiviert und dann mit dem Enzym behandelt, welches auf
diese Weise fest mit dem Träger verbunden wird. Eine derartige Aktivierung kann eine Imprägnierung des Trägers
mit einem Polyamin und eine anschließende Behandlung mit einem Überschuß an Gluuaraldehyd umfassen wie
in der US-PS 4 292 199 oder in Biotechnology and Bioengineering,
22, S. 271 - 287 (1980) beschrieben. Eine andere derartige Aktivierung kann ein Beschichten des Trägers
mit einem die Adsorption erleichternden unlöslichen Polymer und die anschließende Adsorption des Enzyms auf
dem Polymer und eine weitere Imroobilisierung durch Vernetzung
in situ umfassen wie in der US-PS 3 705 084 beschrieben. Eine weitere derartige Aktivierung ist in der
US-PS 4 069 106 angegeben: Ein Keratin haltiger Träger
wird aktiviert durch Reduktion des Keratins und Vernetzung
/2
des Enzyms bzw. Bindung des Enzyms daran über S-S-Gruppen.
Eine andere derartige Aktivierung beschreibt die US-PS 3 802 909. Glas wird in Gegenwart eines Proteins
zerbrochen, wodurch frische aktivierte Stellen entstehen, die das Protein binden können. Eine weitere derartige
Aktivierung ist in der US-PS 3 519 538 angegeben. Danach wird Glas nacheinander mit verschiedenen Chemikalien
behandelt um die gewünschten aktiven Stellen zu erzeugen. Ein anderes Verfahren zur Herstellung eines
0 immobilisierten Enzyms ist beschrieben in Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 36, S. 235 24
2, 1969: Das Enzym wird auf kolloidaler Kieselsäure ohne vorherige Aktivierung adsorbiert und dann durch
Vernetzung mit Glutaraldehyd weiter fixiert.
Alle diese oben erwähnten Verfahren sind gekennzeichnet durch eine dünne Schicht der Enzymmoleküle, die direkt
an die aktiven Stellen eines Trägers gebunden sind und dadurch wird die Menge an immobilisiertem Enzym bestimmt
durch die Anzahl der aktiven Stellen.
Ein grundsätzlich anderes Vorgehen besteht darin eine dickere Schicht (Enzym) an die Oberfläche des Trägers
zu binden, wodurch nur ein kleiner Anteil der Enzym-5 moleküle in direktem Kontakt mit dem Träger steht. Bei
dieser Arbeitsweise ist es nicht der Oberflächenbereich
des Trägers, der die Menge an immobilisiertem Enzym bestimmt und dadurch wird es möglich die Menge an gebundenem
Enzym zu optimieren in Abhängigkeit von den Ver-0 fahrensparametern während der Anwendung. Dieses Ziel
ist jedoch schwieriger zu erreichen, da es durch die verhältnismäßig große Menge an Enzym schwierig wird es
während der Immobilisierung festzuhalten. Daher ist bezüglich dieser Arbeitsweise verhältnismäßig wenig
/3
veröffentlicht worden, ungeachtet der offensichtlichen
Vorteile die dadurch erreicht werden könnten. In den CA-PS 1 OH 671 und 1 011 672 ist die Verwendung einer
wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen organischen Lössungsmittels als Vernetzungsmedium beschrieben, wobei
die Konzentration an organischem Lösungsmittel hoch genug gehalten wird, daß das Enzym unlöslich bleibt jedoch
niedrig genug, um bei der Vernetzungs- bzw. Bindungsreaktion nicht zu stören.
Der Hauptnachteil im Zusammenhang mit diesem Verfahren besteht darin, daß es erforderlich ist, große Mengen
organischer Lösungsmittel anzuwenden, wobei die damit verbundene Explosionsgefahr Sicherheitsvorkehrungen erforderlich
macht. Auch ist das auf diese Weise erhaltene Produkt nicht ganz befriedigend im Hinblick auf die
physikalische Stabilität und Aktivität sausbeute vermutlich aufgrund
der verhältnismäßig hohen Konzentration an organischem Lösungsmittel, die erforderlich ist um das Enzym
0 während der Immobilisierung ungelöst zu halten. Ein anderes Verfahren, das sich auf dieses Problem bezieht,
ist in der US-PS 4 116 771 angegeben. In einem begrenzten
Volumen Wasser wird das Enzym mit Glutaraldehyd und einem inerten Protein behandelt, bevor es schnell zu dem
Träger zugesetzt wird, dann ein Gel bilden kann und dann granuliert und endlich getrocknet wird. Der Hauptnachteil
dieses Verfahrens ist die hohe Konzentration an Vernetzungsmittel, die eine Folge der begrenzten
Wassermenge ist. Viele Enzyme sind sehr empfindlich gegenüber hohen Konzentrationen an Vernetzungsmitteln entweder
weil sie inaktiviert werden oder weil sie dadurch während der Endanwendung nicht mehr zugänglich sind
(d. h. ihre freien Bindungsstellen blockiert sind) aufgrund der übermäßigen Vernetzung oder bei dos. Das zeigt.
/4
die Hauptschwierigkeit bei der Anwendung größerer Mengen Enzym auf einem Träger: Um eine ausreichend niedrige Konzentration
an Vernetzungsmittel zu erreichen, sind verhältnismäßig große Mengen an Medium erfordelich, die es
unmöglich machen, das Enzym an der Lösung in dem Medium zu hindern bevor die Vernetzung wirksam wird, während
eine hohe Konzentration an Vernetzungsmittel die das Enzym vor dem Auflösen bewahren kann aus den oben erwähnten
Gründen ungünstig ist.
Ein nochmals vollständig unterschiedliches Vorgehen besteht darin, das wäßrige Medium überhaupt zu vermeiden
und statt dessen eine gasförmige Phase anzuwenden. Diese Arbeitsweise ist beschrieben in The Journal of Society
of Chemical Industry, Bd. 18, S. 16 - 20 (1899) zur Herstellung
von unlöslichen Gelatinefasern und in JP-PS J 57002683 zur Immobilisierung von Enzymen. Dieses Verfahren
erfordert jedoch ein gut wirksames Ventilationssystem und darüber hinaus spezielle Mitte^ um die BiI-
0 dung von unlöslichen Abscheidungen innerhalb dieses Ventilationssystems zu vermeiden. .
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur
Herstellung einer immobilisierten. Enzymzubereitung mit 5 Hilfe eines Vernetzungsmittels zu entwickeln, das einfach
durchführbar sein soll, z. B. ohne die Notwendigkeit spezieller Sicherheitsvorkehrungen.und mit Hilfe
dessen das immobilisierte Enzym mit einer hohen Enzymaktivität und mit guter physikalischer Stabilität erhalten
werden kann.
Es hat sich nun erfindungsgemäß gezeigt, daß es möglich
ist diese Aufgabe durch Verwendung bestimmter Salze in
/5
einer speziellen minimalen Konzentration zu lösen. Obwohl der oben erwähnte Stand der Technik sich nur mit immobilisierten
Enzymzubereitungen auf Trägern befaßt, ist die vorliegenden Erfindung nicht auf solche immobilisierte
Enzymzubereitungen besch.änkt sondern umfaßt auch immobilisierte Enzymzubereitungen ohne Träger.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer immobiliiserten Enzymzubereitung mit Hilfe eines Vernetzüngsmittels,
bei dem die folgenden Bestandteile in einem wäßrigen Medium zusammengebracht werden:
a) eine Enzymzubereitung in fester oder gelöster Form/
b) ein Vernetzungsmittel und
c) ein wasserlösliches Salz, das nicht mit dem Ver-
netzungsmittel reagiert oder das Enzym inaktiviert in einer Konzentration die ausreicht, um zu verhindern,
daß ein nennenswerter Teil des Enzyms sich in der Salzlösung löst oder mit ihr vermischt, während
die Vernetzungsreaktion stattfindet, und das immobilisierte Enzym aus dem Gemisch isoliert wird.
Wenn das fertige immobilisierte Enzym einen Überschuß an Vernetzungsmittel enthält, kann dieses durch Waschen
entfernt werden.
Die Enzymzubereitung kann in fester oder gelöster Form vorliegen, außerdem kann die Enzymzubereitung eine hohe
Reinheit besitzen oder sie kann inerte Zusätze (z. B. Füllstoffe, Verstärkungsmittel, Bindemittel oder Granuliermittel)
enthalten. Die Reihenfolge(in der die Bestandteile
zusammengebracht werden ist beliebig mit der Ausnahme, daß wenn die Enzymzubereitung und das Ver-
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■ — ν ν *.-
netzungsmittel zusammengebracht werden vor dem Zusatz des Salzes, die Enzymausbeute abnimmt wenn die Salzzugabe zu stark verzögert wird.
Die oben angegebene Gruppe von Salzen (wobei eine spezielle Gruppe von Salzen für jede Kombination eines speziellen Enzyms und eir.es speziellen Vernetzungsmittels
in Frage kommen kann) umfaßt üblicherweise billige Salze. Selbstverständlich können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ein oder mehrere Enzymzubereitungen ein oder mehrere Vernetzungsmittel und ein oder mehrere Salze
angewandt werden.
Bei einer bevorzugten /arbeitsweise nach der Erfindung
umfaßt die Enzymzubereitung einen Träger. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren auch ohne Träger durchgeführt
werden kann (s. Beispiel 15), ist es üblicherweise bevorzugt einen Träger anzuwenden hauptsächlich durch
die Möglichkeit, die dadurch geboten wird Teilchen mit 0 besseren Fließeigenschaften herzustellen( die geeignet
sind für Festbett-Verfahren. Unabhängig davon, ob das
Enzym fest oder gelöst vorliegt, ist es in diesem Falle eng mit dem Träger verbunden. Im. festen Zustand kann das
Enzym eine Schicht auf dem Träger bilden und in gelö-5 ster Form kann die Enzymlösung in den (porösen) Träger
eindringen.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist die Enzymzubereitung ein Träger, der mit einer Schicht des festen Enzyms überzogen ist. Hierdurch wird
es möglich eine Enzymzubereitung herzustellen mit irgendeinem erwünschten Enzymgehalt innerhalb weiter Grenzen durch Variation der Dicke der Enzymschicht,
/7
Sehr günstig ist es auch, wenn c.ie Enzymzubereitung aus
einem porösen Träger besteht, der mit einer Enzymlösung imprägniert ist. Hierdurch erhält man ein sehr einfaches
Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Enzymzubereitung nach der Erfindung.
Das Vernetzungsmittel ist vorzugsweise Glutaraldehyd.
Glutaraldehyd ist verhältnismäßig billig und von den Gesundheitsbehörden zugelassen. Glutaraldehyd ist auch für
viele Enzyme ein sehr wirksames und doch mildes Vernetzungsmittel .
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß die Konzentration
an Glutaraldehyd in dem wäßrigen Medium zwischen 0,001 und 5 % (Gew./Vol.), vorzugsweise 0,005 bis 1 % (Gew./
Vol.) beträgt. Aus den später· in der Beschreibung angegebenen Beispielen geht hervor, daß die zurückgewonnene
Enzymaktivität abhängt von der Konzentration an Glutaraldehyd und üblicherweise liegt die Glutaraldehydkonzentration,
die einer maximalen Ausbeute an Enzymaktivität entspricht innnerhalb der oben angegebenen
Bereiche. Der Prozentsatz an Glutaraldehyd (Gew./Vol.) wird berechnet entsprechend der folgenden Gleichung.
5 Gewicht des Glutaraldehyds (g)
χ 100
Volumen von (Salzlösung + Glutaraldehyd) (ml)
Das Salz wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Sulfat, Phosphat, citrat, Bicarbonat, Carbonat,
Fluorid, Acetat, Tartrat, Polysulfat, Polyphosphat, Ferrocyanid,
Phenolsulfönat, Sorbat, Ethylsulfat, Chlorid, Nitrat und Succinat von sekundärem, tertiärem oder guaternärem Ammonium
oder einem der Alkalimetalle insbesondere Natrium-
/8
40
JS -
sulfat, Natriumphosphat, Kaliumphosphat und Kaiiumc'itrat.
Dieses Salze sind allgemein billig und können zurückgewonnen werden und eröffnen die Möglichkeit eine immobilisierte Enzymzubereitung mit einer hohen Ausbeute an
Enzymaktivität herzustellen.
Die Salzkonzentration liegt vorzugsweise zwischen 0,1 m
und einer gesättigten Lösung, insbesondere bei etwa 0,5 bis etwa 3 m. Wie aus den später angegebenen Beispielen
hervorgeht ist es möglich eine Glutaraldehydkonzentration und eine Salzmolarität innerhalb der oben angegebenen
Grenzen zu wählen, die zu einer sehr hohen Ausbeute an Enzymaktivität führt.
Das Enzym wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glukoseisomerase, Amy lasen, insbesondere
Amyloglukosidase, Pullulanase, Lactase, Pectinasen, Naringinase, Penicillinacylasen, Inulinasen, Lipasen und
Proteasen.
' ■ So bewahrt die Verwendung der. oben erwähnten Salze
selbst in niedrigeren Konzentrationen als sie zur Ausfällung der Enzyme erforderlich sind, die Enzyme für alle praktischen
Zwecke davor, in dem Vernetzungsmedium (Salzlö-5 sung) gelöst zu werden, während sie für das Vernetzungsmittel
vollständig zugänglich bleiben, wenn das Enzym in fester Form vorliegt oder sie verhindern, daß das Enzym
sich mit der Salzlösung vermischt, wenn es in gelöster Form vorliegt. Auf diese Weise kann eine optimale Konzentration
an Vernetzungsmittel angewandt werden, die nur zu einer minimalen Schädigung des Enzyms führt und
ihm noch eine ausreicaend gute physikalische Stabilität verleiht. So hat es sich gezeigt, daß-um die Konzentration an Vernetzungsmittel zu verringern die Salzkonzen-
5 tration erhöht werden -nuß, um die Snzymaktivität auf einem
/9
/IA
optimalen Niveau zu halten. Erf mdungsgemäß sollten Salze,
die entweder mit dem Enzym oder dem Vernetzungsmittel reagieren, wie Silber- oder Quecksilbersalzef die das Enzym
inaktivieren können oder Ammoniumsalze oder primäre Aminsalze oder Sulfitsalze, die leicht mit verschiedenen
Vernetzungsmitteln reagierenfvermieden werden. Die Salze,
die für die erfindungsgemäßen Zwecke angewaidt werden
können, variieren in weiten Grenzen in Bezug auf ihre Wirksamkeit und diese Wirksamkeit kann von Enzym zu Enzym
variieren. Einige allgemeine Richtlinien bezüglich der Auswahl des Salzes können jedoch folgendermaßen festgelegt
werden: Es ist günstig, das löslichere Salz zu verwenden, wenn zwei sonst gleiche Eigenschaften besitzen.
So ist Na„SO. im allgemeinen K„SO. vorzuziehen,
aufgrund der wesentlich höheren Löslichkeit. Es hat sich auch gezeigt, daß allgemein Salze von mehrwertigen Anionen
wie Sulfate, Phosphate, Carbonate, Citrate und ähnliches wirksamer sind als einwertige Anionen wie
Chloride und Nitrate. Das Gegenteilige gilt jedoch im 0 allgemeinen für die Kationen: Die einwertigen Kationen
wie Na , K oder Tetramethylammonium sind wirksamer als die mehrwertigen wie Mg oder Ca . Die bevorzugten Salze
sind daher die Alkalisalze von Sulfaten. Phosphaten und Citraten und insbesondere Natriumsulfat, Natriumphosphat,
Kaliumphosphat,Kaliumeitrat und Tetramethylammoniumsulfat.
Die Salzkonzentration wird üblicherweise auf einem Minimum gehalten. Dieses Minimum hängt einerseits ab von dem
fraglichen Enzym, da unterschiedliche Enzyme häufig unterschiedliche
Konzentationen erfordere und andererseits
von der Konzentration an Vernetzungsmittel: Je höher diese ist, umso weiniger Salz ist erforderlich und umge-
/10
kehrt. Die Konzentration an Vernetzungsmittel wird ebenfalls auf einem Minirrum gehalten, da die meisten Enzyme
gegenüber Vernetzungsmitteln empfindlich sind. Die Konzentration sollte jedoch hoch genug sein, um eine wirksame
Immobilisierung sicherzustellen. Es sollte jedocht
Sorgfalt angewadt werden, wenn die optimalen Bedingungen für die Vernetzungsreaktion bei sehr hohen Salzkonzentrationen
festgelegt werden, besonders mit wirksamen Salzen. So hat es sich gezeigt, daß bei hohen Konzentrationen
an Na3SO4 oder Kaliumphosphat z. B. die Aktivitätsausbeuten
wesentlich verringert werden im Vergleich mit solchen, die bei mäßigen Konzentrationen erreicht
werden. Das beruht vermutlich auf der sehr festen Vernetzung, die die Enzyirmoleküle teilweise unzugänglich
5 macht.
Ein anderer Vorteil, der bei der Verwendung von Salzen in dem Vernetzungsmedium auftritt( besteht darin, daß das
Enzym das Teilchen enthält, gehindert wird während der Immobilisierungsreaktion Aggregate zu bilden, wenn
das Enzym in fester Form vorliegt. Eine derartige Aggregation bzw. Agglomaration ist unerwünscht, da sie zu einer
geringeren Wirksamkeit und schlechteren Fließeigenschaften bei der Anwendung führt. Auch in dieser Beziehung
unterscheiden sich die Salze stark.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in mehreren Stufen
durchgeführt werden, deren Reihenfolge nicht kritisch ist. So wird bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Arbeitssweise
ein Träger zunächst mit einer Enzymlösung behandelt, getrocknet und dann in einer Lösung die ein Vernetzungsmittel
und Salz enthält(behandelt, gewaschen und
yf -
gegebenenfalls getrocknet. Bei iiner Abwandlung des
gleichen Verfahrens kann ein Teil der Gesamtsalzmenge in der Enzymlösung enthalten sein. Bei einer weiteren
Abwandlung wird das Enzym zunächst mit dem Vernetzungsmittel behandelt und unmittelbar anschließend mit dem
Salz. Für bestimmte Zwecke z. B., wenn es erwünscht ist, daß das immobilisierte Enzym leicht und faserig ist,
kann die Menge an Träger sehr klein sein oder der Träger kann ganz weggelassen werden un 3 das Enzym wird in einem
0 Koagulationsbad mit dem Vernetzungsmittel und dem Salz behandelt. So kann das Enzym in einer Lösung gelöst
sein, die in einem Salzbad koaguliert wird, wobei das Vernetzungsmittel zu der Enzymlösung oder zu dem Bad vor
oder nach der Koagulation zugesetzt wird. Das Salz kann auch als trockenes Pulver zugesetzt werden anstatt in
Form einer Lösung, wenn es erwünscht ist; die Wassermenge
zu begrenzen. So ist die ReihenJolge,in der die einzelnen
Komponenten zusammengebracht werden oder ihr Zustand, d. h. ob sie in Lösung oder in trockener Form
vorliegen für das erfindungsgemäße Verfahren nicht kritisch.
Der pH-Wert, die Temperatur und die Dauer der Vernetzungsreaktion können einen erheblichen Einfluß auf die Akti-
5 vitätsausbeute haben in Abhängijkeit von dem Enzym und
den inerten Zusätzen, soweit solche vorhanden sind. Im allgemeinen hat es sich gezeigt, daß ein pH-Bereich von
etwa 4 bis etwa 9 geeignet ist. Der in den meisten Fällen geeignete Temperaturbereich liegt zwischen etwa 15
und etwa 300C, obwohl höhere Temperaturen in einigen Fällen mit Vorteil angewandt werden können, z. B., wenn
es erwünscht ist, die Dauer der Vernetzungsreaktion zu verkürzen und niedrigere Temperaturen vorteilhaft angewandt
werden können im Falle von sehr temporaturempfind-
/12
- γι -
lichen Enzymen. Die Dauer der Vernetzungsreaktion kann in weiten Grenzen variieren, von wenigen Minuten bis zu
einigen Tagen, abhängig von der Art und Konzentration des Vernetzungsmittels, der Art und Konzentration des Salzes,
dem Enzym, dem pH-Wert und der Temperatur. Sie sollte daher in jedem einzelnen Falle neu festgelegt werden.
Für Glutaraldehyd und die meisten Enzyme scheint jedoch ein Bereich von etwa 10 min bis zu einigen Stunden
bei Raumtemperatur geeignet zu sein.
Im folgenden wird auf verschiedene Novo Veröffentlichungen
Bezug genommen. Kopien aller dieser Veröffentlichungen können von Novo Inaustri A/S Novo Alle, 2880 Bagsvaerd,
Dänemark erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden
Beispiele näher erläutert.
Im folgenden Teil der Beschreibung und den Beispielen sind Werte für den Druckabfall (physikalische Festigkeit)
während des Arbeitens in einer Säule angegeben. Die ser Wert wurde bestimmt nach AF 166/2 einer Beschreibung
eines Novo Laborverfahrens. Einige theoretische Überlegungen
im Zusammenhang mit dieser Druckabf allbeStimmung sind
beschrieben in Starch/Stärke 31 (1979) Nr. lr S. 13 Zum
Vergleich mit handelsüblichen Produkten ist zu erwähnen, daß die besten Werte für den Druckabf all für die bekannte
Zubereitung aus immobilisierter Glukoseisomerase Sweetzyme etwa 9,81 mbar (10 g/cm2 )betragen. Aus den Beispielen
geht hervor, daß der Druckabfall bei den erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten Enzymzubereitungen so gering sein kann wie 1,96 mbar (2 g/cm2) und
daß alle Werte deutlich unter 9,81 mbar (10 g/cm2) liegen,
woraus der technische Fortschritt des erfindungs-5 gemäßen Verfahrens deutlich hervorgeht.
/13
Anteile von 20 g trockener Trägerteilchen, die mit teilweise gereinigter Glukoseisomerase in einer Menge von
2 8 Gew.-% überzogen waren und hergestellt worden waren nach dem in Beispiel 8 der gleichzeitig eingereichten Anmeldung
P ... (lÄ-57 580, Dänische Anmeldung 4430/82) wurden unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur in 500 ml
einer Lösung, enthaltend 0,06 m Natriumphosphat, 1,4 m Na3SO4 und unterschiedliche Mengen Glutaraldehyd,pH 7,0,
suspendiert. Nach 1 h wurden die Teilchen entfernt und 1 h in 0,06 m Natriumphosphatlösung pH 7,0#suspendiert.
Dieser Waschvorgang wurde 3 mal wiederholt und die Teilchen dann über Nacht in der Phosphatlösung stehengelassen
und anschließend ihre Aktivität nach Novo Analyseforskrift AF 189/1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Fig. 1 angegeben, die eine Kurve zeigt, in der der Prozentsatz an Glutaraldehyd gegen die zurückgewonnene Enzymaktivität
in Einheiten/g aufgetragen ist und die die Empfindlichkeit des Enzyms gegenüber Glutaraldehyd zeigt.
Beispiel 2 (Vergleich)
Es wurden Teilchen entsprechend Beispiel 1 hergestellt,
wobei jedoch kein Salz zugesetzt wurde, abgesehen von der minimalen Menge Phosphat, das als Puffer dient
(0,06 m Natriumphosphat pH 6,5). Der Prozentsatz an Glutaraldehyd wurde gegen die zurückgewonnene Enzymaktivität
in Einheiten/g aufgetragen, s. Fig. 2, die zeigt, daß das Vernetzungsmittel zwei gegensätzliche Wirkungen aufweist:
Einerseits erhöht es die Ausbeute, indem es das Enzym vor dem Lösen bewahrt, andererseits verringert es
die Ausbeute durch Inaktivierung des Enzyms. Das Optimum wird in diesem Falle bei ungefähr 1 % Glutaraldehyd erreicht.
Ein Vergleich der Figuren 1 und 2 zeigt, daß das Optimum der Glutaraldehydkonzentration ungefähr 40 mal
/14
-M-
so hoch liegt wie bei Zusatz von 1,4 τη Natriumsulfat und
daß die Ausbeute (der Aktivität) in diesem Falle nur ungefähr 60 % derjenigen bei Zusatz des Salzes beträgt.
Es wurden Teilchen wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei
in diesem Falle jedoch Kaliumphosphat als Salz angewandt wurde und die Salzkonzentration variiert wurde, während
die Glutaraldehydkonzentration auf 3 unterschiedlichen Werten konstant gehalten wurde und der pH-Wert 6,5 betrug.
Der Prozentsatz an Kaliumphosphat wurde gegen die Ausbeute an Enzymaktivität in Einheit/g aufgetragen. Diese
Werte sind in Fig. 3 angegeben, aus der die günstige Wirkung einer Erhöhung der Salzkonzentration deutlich
hervorgeht, besonders bei der niedrigen Glutaraldehydkonzentration.
Der Versuch des Beispiels 3 wurde wiederholt, wobei je-0 doch Natriumsulfat anstelle von Kaliumphosphat verwendet
wurde. Die Molarität von Na„SO. wurde gegen die gewonnene
Enzymaktivität in Einheit/g aufgetragen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 angegeben, aus der die günstige Wirkung
des Salzes deutlich hervorgeht. Wie ebenfalls aus Fig. 4 hervorgeht, existiert ein Optimum für die Salzkonzentration
jenseits dessen die Aktivität abnimmt, wobei dieses Optimum von der Glutaraldehydkonzentration
abhängt.
0 Beispiel 5
Der in Beispiel 3 angegebene Versuch wurde wiederholt,
wobei lediglich die Salzkonzentration erhöht wurde. Die Molarität an Kaliumphcsphat wurde gegen die gewonnene
Enzymaktivität in Einheiten/g aufgetragen. Die Ergebnis-5 se sind in Fig. 5 angegeben. Ein Vergleich zwischen
/15
Fig. 4 und 5 zeigt, daß Na SO. und Kaliumphosphat sich ähnlich verhalten.
Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt,
wobei jedoch Kaliumeitrat pH 7,0 anstelle von Phosphat und Sulfat in dem Vernetzungsmedium angewandt wurden. In
Fig. 6 ist die Glutaraldehydkonzentration gegen die Aktivität in Enzymeinheiten/g aufgetragen und die Ergeb-ο
nisse ähneln deutlich denen in Beispiel 1.
20 g getrocknete Trägerteilchen,- die wie in Beispiel 4 der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung P ...
(lA-57 580, Dänische Anmeldung 4430/82) hergestellt worden
waren, wurden in einem Wirbelbett vom Lab Typ fluidisiert. 45,8 g einer 11 %igen (Gew./Gew.) homogenisierten
Zellaufschlämmung (gezüchtet wie in Beispiel 1 der Dänischen Patentanmeldung 5190/79 angegeben und Aufschlämmung
hergestellt wie in Beispiel 4 dieser Patentanmeldung) enthaltend 80,1 E/g thermophile Lactase von
Bacillus Sp NRRL B 11.229 wurden bei 30 bis 400C auf die
Trägerteilchen aufgesprüht und die überzogenen Teilchen konnten trocknen. Die Einheit der Lactasenaktivität
ist definiert als die Menge Lactase, die 1 μΐη.1 Lactose/min
unter den folgenden Reaktionsbedingungen spaltet: Substratkonzentration = 10 % Lactose, Temperatur =
600C, pH .= 6,5, Reaktionszeit = 30 min. Die gewonnene
Enzymaktivität betrug 79,8 %. 10 g überzogene Kügelchen
wurden dann in 250 ml einer-Lösung behandelt, enthaltend
0,06 m Na2HPO4, 1,4 m Na2SO4 und 0,1 % (Gew./Vol.) GIutaraldehyd
pH 7,5. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die Teilchen entfernt und gründlich mit 0,06 m K„HPO4
/16
4f
bei pH 7,5 gewaschen. Die Aktivitätsausbeute in Bezug auf die Vernetzungsstufe betrug 17,2 %.
24 g getrocknete Trägerteilchen, die entsprechend Beispiel 4 der gleichzeitig eingereichten Anmeldung P ...
(lA-57 580, Dänische Anmeldung 4430/82) hergestellt worden
waren wurden in 2Cr2 g einer Lösung aus 39,6 Gew.-%
teilweise gereinigter Amyloglukosidase von A. niger gegeben, die erhalten worden war durch Ultrafiltration des
Handelsproduktes AMG 200L (beschrieben in der Novo-Schrift
NOVO Enzymes AMG, B 020 g-GB)#um niedermolekulare
Bestandteile zu entfernen bis zu einem Feststoffgehalt
von 39,6 Gew.-% (Aktivität 2610 IAG/g, wobei die Aktivitätseinheit
definier : ist in Novo Analyseforskrift AF 159/2). Es wurde 1 h Vakuum angelegt. Das so erhaltene
Produkt enthielt 25 Gew.-% teilweise gereinigte Amyloglukosidase-Feststoffe
mit einer Ausbeute an Enzymaktivität von 77,9 %.
20 g Teilchen mit 71,8 % Feststoffgehalt wurden dann in
1600 ml einer Lösung behandelt, bestehend aus 0,06 m
NaH2PO4, 1,4 m Na2SO4 und 0,2 % Glutaraldehyd pH 4,5.
Nach 1 h wurden die Teilchen abfiltriert und mit 0,06 m
5 NaH-PO. bei pH 4,5 gewaschen.
Die gewonnene Enzymaktivität bezogen auf die Vernetzungsstufe ^betrug 55,1 %.
40 g Trägerteilchen, die entsprechend Beispiel 4 der gleichzeitig eingereichten Anmeldung P ... (lA-57 580,
Dänische Anmeldung 44 30/82) erhalten worden waren und
/17
yr -
einen Feststoffgehalt von 98,3 % besaßen,und 24 g im
Vakuum eingedampftes teilweise gereinigtes Glukoseisomerase-Konzentrat
von Bacillus coagulans wurden mit 5 % Glukose und 8 % Natriumsulfat (Feststoffgehalt 41,8 %)
vermischt und die Flüssigkeit konnte die Luft in den Poren der Teilchen durch Vakuumbehandlung verdrängen.
Das Gewicht nach dem Vermischen'betrug 63,22 g. Der Feststoff gehalt war 79,2 %.
Anteile von 18g dieser Zubereitung (ungefähr 14g Feststoffe)
wurden 1 h bei Raumtemperatur mit 375 ml einer Lösung enthaltend in allen Fällen 1,5 m Natriumsulaft,
5 % Glukose und 0,06 m Natriumphosphat pH 7,5 behandelt
und außerdem mit entweder 0,1 oder 0,2 oder 0,3 % GIutaraldehyd.
Nach dieser Behandlung wurden die Anteile 5 mal mit etwa 150 ml 1 %iger Natriumphosphatlösung pH 7,5 gewaschen.
Die Enzymaktivität wurde bestiuimt nach AF 189/1 nach
Ablaufen der Flüssigkeit von den Teilchen. Auch der Feststoff gehalt wurde an den Teilchen von denen das Wasser
abgelaufen war, bestimmt.
Man erhielt die folgenden Ergebnisse:
/18
- 1-8 -
Feststoff- E/g E/g Aus- Ausbeute gehalt feucht trok- beute immob.
(%) ken (%) (%)
Enzymkonzentrat 41,8 1415 3385 Enzymkonzentrat
+ Träger 79,2
inxnob.mit 0,1 % GA*)32, 5 " 0,2% " 38,9
•ι π o,3% "
*)= Glutaraldehyd
Der Druckabfall wurde an Proben entsprechend 5 g Feststoffen untersucht.
Glutaraldehydkon-15
463 | 585 | 86 | — |
158 | 486 | 72 | 83 |
141 | 362 | 53 | 62 |
117 | 333 | 49 | 57 |
zentration zur Immobilisierung |
25 | Druckabfall h 50 h |
0,1 % | 3 | 5 . |
0,2 % | 1 | 3 |
0,3 % | 2 | 3 |
Beispiel 10 |
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzymproduktes auf der Grundlage
von Aktivkohle von Norit als Träger..
Es wurden 20 g Norit Rox 0,8 Aktivkohle Typ A-3397 in
33 g einer Lösung aus 39,2 Gew.-% teilweise gereinigte Glukoseisomerase von Bacillus coagulans (Aktivität 3950
E/g Feststoffe, wobei die Aktivitätseinheit definiert ist in Novo Analyseforskr..ft AF 189/1) gegeben.
Es wurde 20 h bei 4°C Vakuum angelegt, das während dieser Zeit 4 mal aufgehoben wurde. Das so erhaltene Produkt
enthielt 35 Gew.-I teilweise gereinigte Glukoseiso-
/19
merase-Feststoffe mit einer 97 %igen Gewinnung der Enzymaktivität
.
98 % des oben erwähnten agglomerierten Produkts wurden dann in 890 ml einer Lösung von 0,06 m KH7PO4, 1,4 m
Na3SO4 und 0,18 % Glutaraldehy.l,deren pH-Wert mit 4 η
NaOH auf 7,5 eingestellt war( immobilisiert. Nach 2 h
bei Raumtemperatur unter leichtem Bewegen wurden die Teilchen abfiltriert und gründlich mit 0,06 m KH PO.
pH 8,0 gewaschen.
Die Aktivität wurde in der Vernetzungsstufe zu 31 % zurückgewonnen
.
15. Beispiel 11
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Enzymzubereitung mit einem Träger/
bestehend aus Kieselsäure-Kügelchen mit einem Durchmesser von etwa 2 mm.
20
20
A) 20 g der Kieselsäure-Kügelchen wurden in einem Wirbelbett vom Lab Typ fluidisiert und 40 g einer Lösung von
15 Gew.-% teilweise gereinigter Glukoseisomerase von
Bacillus coagulans (Aktivität 3306 E/g Feststoffe, die Aktivität ist definiert in Novo Analyseforskrift
AF 189/1) wurden bei 25 bis 300C auf die Kügelchen
aufgesprüht und die überzogenenen Kügelchen konnten trocknen. Das so erhaltene Produkt enthielt 23 Gew.-%
teilweise gereinigte Glukoseisomerase mit einer Aktivitätsausbeute von 78 %.
95 % der überzogenen Kügelchen wurden dann in 500 ml einer Lösung, enthaltend 0,06 m K2HPO4, 1,4 m Na3SO4
/20
und 0,1 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd/mit 4 η NaOH auf
pH 7,5 eingestellt, behandelt. Nach 1 h bei Raumtemperatur
wurden die Teilchen entfernt und gründlich mit 0,06 m KH2PO.,pH 8,0;gewaschen. Dann wurde die Aktivität
bestimmt. Die Aktivität wurde in der Vernetzungsstufe zu 55 % zurückgewonnen.
B) 20 g der Kieselsäure-Kügelchen wurden in 15 g einer
Lösung von 40 Gew.-% teilweise gereinigter Glukoseisomerase
von Bacillus coagulans (Aktivität 3270 E/g
Feststoffe) unter Zusatz von 0,56. m Nä„SO. behandelt.
Es wurde 2 0 min Vakuum angelegt und dieses während dieser Zeit 4 mal aufgehoben. Das so erhaltene JProdukt
enthielt 20 Gew.-% teilweise gereinigte Glukoseisomerase mit einer 9 0 %igen Rückgewinnung der Enzymaktivität.
95 % der überzogenen Kügelchen wurden dann wie in Teil A) dieses Beispiels beschrieben behandelt.
Die Aktivität wurde in dieser Vernetzungsstufe zu 45 % zurückgewonnen.
20
20
In einigen Fällen, wenn das Enzym besonders schwierig zu vernetzen ist, können Salze nicht nur vorteilhaft son-,
dem auch unbedingt erforderlich sein, wenn das Enzym in reiner Form immobilisiert werden soll.· Ein gutes Beispiel
ist die Amyloglukosidase von Novo (Handelsname AMG 00 L, s. die Broschüre Novo enzymes AMG, B B 020 g-GB
Juli 1982) die in reinem Zustand praktisch nicht mit Glutaraldehyd immobilisiert werden kann. Es hat sich als
unmöglich erwiesen, diese Amyloglukosidase zu immobilisieren, selbst bei so "ionen Konzentrationen wie 50 Gew.-%
Glutaraldehyd. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem Salze zugesetzt werden, ist es jedoch (wenn
auch bei verhältnismäßig hohen Konzentrationen) möglich, das Enzym sogar bei einer so geringen Glutaraldehydkonzentration
wie 0,05 % (Gew./Vol.) zu immobilisieren wie
/21
aus den folgenden Beispielen 12 bis 17 hervorgeht. Die
so erhaltenen Enzymzubereitungen, die ausgezeichnet filtrierbar sind und noch leicht aufgeschlämmt werden können,
können vorteilhafter Weise zur Herstellung von beispielsweise Bier mit niedrigem Kaloriengehalt angewandt
werden.
Handelsübliche Novo AMG 200 L, die auf einen Feststoffgehalt
von 3 0 % (Gew./Vol.) verdünnt worden war, wurde mit Diatomeenerde (Hyflo Celite) vermischt und getrocknet,
wodurch man eine Zubereitung erhielt, enthaltend 21 Gew.-% Feststoffe aus der AMG-Zubereitung. 1 g Anteile dieses Mittels
wurden dann zu einer Lösung,enthaltend 2,4 m Na7SO4,
0,0 6 m Kaliumphosphat^ pH 6,5, und Glutaraldehyd in unterschiedlichen
Konzentrationen bei 32°C zugegeben und das Gemisch 20 h bei dieser Temperatur stehen gelassen. Die
Teilchen wurden dann abfiltriert und 3 mal mit entionisiertem Wasser gespült und die Aktivitätsausbeute gemessen.
Die Ergebnisse zeigten das bekannte Muster der beiden entgegengesetzten Effekte von Glutaraldehyd mit einem
Optimum bei 0,05 % wie aus Fig. .7 hervorgeht.
Es wurde wie in Beispiel 12 gearbeitet, wobei jedoch unterschiedliche
Konzentrationen an Na„SO. angewandt wurden.
Die Aktivitätsausbeute ist bei diesem Enzym außerordentlich empfindlich auf die vorhandene Salzmenge wie
aus Fig. 8 hervorgeht.
Es wurde wie in Beispiel 12 gearbeitet mit der Ausnahme, daß eine AMG-Zubereitung ,enthaltend nur halb so viel Enzym
angewandt wurde. Als Ergebnis dieser Arbeitsweise
/22
ZH
wurde deutlich eine Verschiebung des Glutaraldehyd-Optimums
zu einer niedrigeren Konzentration hin beobachtet wie aus Fig. 9 hervorgeht.
Novo AMG 2 00 L wurde sprühgetrocknet und das erhaltene Pulver als Ausgangsmaterial angewandt und das Verfahren
etwas abgewandelt: 0,5 g des AMG-Pulvers wurden zu 100 ml
einer Lösung gegeben, enthaltend 2,5 m Na_SO., 0,,l m
Kaliumphosphat pH 6,5(und Ί % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd
bei 320C und das Gemisch 1 h unter gelegentlichem Schütteln
bei dieser Temperatur stehen gelassen. Die so entstandenen unlöslichen Teilchen wurdenabfiltriert und erneut
in dem gleichen Medium jeodch ohne Glutaraldehyd und bei der gleichen Temperatur 20 h inkubiert. Sie wurden
dann abfiltriert und 3 mal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Diese leicht filtrierbaren Mikrokügelchen besaßen
einen Durchmesser von etwa 10 bis 1 00 μΐη und enthielten
19 % der ursprünglichen Aktivität.
Es wurde entsprechend Beispiel 15 gearbeitet, mit der
Ausnahme, daß Glutaraldehyd zu der Salzlösung nach der Zugabe des Enzympulvers zugesetzt wurde. Man erhielt auf
diese Weise ein ähnliches Produkt, das 34 % der ursprünglichen Aktivität enthielt.
Es wurde wieder entsprechend Beispiel 15 gearbeitet, mit
der Ausnahme, daß nur 0,4 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd angewandt wurden und die Gesamtinkubationszeit auf 3 h
verringert wurde. Auf diese Weise erhielt man ein Pro-•dukt, das 37 % der ursprünglichen Aktivität enthielt.
/23
Beispiel 18
Dieses Beispiel zeigt die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens auf andere Vernetzungsmittel als GIutaraldehyd,
nämlich mehrwertige Kationen. In diesem Falle wurde Sn als Vernetzungsmittel angewandt. So wurden
0,5 g der Celite-AMG-Zubereitungentsprechend Beispiel 12J
vor dem Vernetzen langsam unter Rühren zu 100 ml einer
Lösung enthaltend 2 m Na„SO>, 0,4 m Kaliumacetat (pH 4,35)
und 0,0086 m SnCl. . 5H„O gegeben und das Gemisch 5 min
unter gelegentlichem Schütteln bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die so entstandenen Teilchen wurden abfiltriert
und in 100 ml 0,2 m Kaliumacetatlösung pH 4,35,
dispergiert und die Suspension dann 5 min gerührt. Diese Arbeitsweise wurde 3 mal wiederholt. Das Endprodukt besaß
43 % der ursprünglichen Aktivität.
In diesem Beispiel wurde ein Produkt nach dem Verfahren des Beispiels 18 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die
Konzentrationen an Acetat und Zinn salz auf 0,8 m bzw. 0,017 m verdoppelt wurden. Man erhielt ein ähnliches Produkt
mit einer Aktivitätsausbeute von 65 %.
In diesem Beispiel wurde das Verfahren des Beispiels 18
wiederholt, jedoch die Acetatkonzentration auf die Hälfte, d. h. 0,2 m verringert. Man erhielt wieder ein ähnliches
Produkt mit einer Aktivitätsausbeute von 48 %.
In diesem Beispiel wird die Verwendung noch eines weiteren Vernetzungsmittels, nämlich von Benzochinon beschrieben.
Es wurden 0,5 g einer getrockneten Celite-AMG-
/24
Zl
Zubereitung entsprechend Beispiel 12 zu. 75 ml eines Gemisches
gegeben, enthaltend 2,1 m Na_SO. und 0,05 m
Natriumacetat und anschließend wurden 5 ml einer Lösung von 20 % (Gew./Vol.) Benzochinon in reinem Ethanol zugegeben
und das Gemisch 80 min unter gelegentlichem Rühren bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die so erhaltenen
Teilchen wurden abfiltriert, in 75 ml 0,1 m Kaliumacetatpuff
erj pH 4,4( dispergiert, 5 min gerührt und erneut
filtriert. Diese Arbeitsweise wurde 3 mal wiederholt und anschließend die Aktivität bestimmt. Die Aktivitätsausbeute betrug 14 %.
6238
Claims (9)
- P a t e η t a nsprüche1 .J Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen mit Hilfe eines Vernetzungsmittels durch Zusammenbringen einer Enzymzubereitung in fester oder gelöster Form mit einem Vernetzungsmittel in einem wäßrigem Medium und Isolierung des immobilisierten Enzyms, dadurch gekennzeichnet , daß man ein wasserlösliches Salz, das mit dem Vernetzungsmittel nicht reagiert und das Enzym nicht inaktiviert, in einer solchen Konzentration zugibt, daß ein Lösen des Enzyms oder ein Vermischen mit der Salzlösung während der Vernetzungsreaktion verhindert werden.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Enzymzubereitung einen Träger umfaßt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einer Schicht des festen Enzyms überzogen ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß eine Enzymlösung in einen porösen Träger eingedrungen ist./2
- 5» Verfahren nach einem ter Ansprüche 1 bis 4,dadurch gekennzeichnet , daß das Vernetzungsmittel GIutaraldehyd ist.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Glutaraldehydkonzenträtion in dem wäßrigen Medium zwischen 0,001 und 5 % (Gew./VoI4 )■» vorzugsweise 0,005 bis Ί % (Gew./VoI.),beträgt.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüchea*T~bis 6, dadurch g e kennzeich" net , daß das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe der Sulfate, Phosphate, Citrate, (Bicarbonate, Carbonate, Fluoride,"^ee^PeEtee-T—Tartrate, Polysul- ~'/ fate, Polyphosphate, Ferrocyanide, Phenolsulfonate, Soi<bate, Ethylsulfate, Chloride, Nitrate und Succhinate de|r Alkalimetalle insbesondere aus Natriumsulfat r Natriumphosphat, Kaliumphosph· t und Kalium citrat.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß die Salzkonzentration zwischen 0,2 m und der Sättigung, insbesondere zwischen 0,5 m und etwa 3 m liegt. \
- 9 . Verfahern nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch g e kennzeichnet , daß das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoseisomerase, Amylasen, insbesondere Amyloglukosidase, Pullulanase, Lactase, Pectinasen, Naringinase, Penicillinacylasen, Inulinasen, Lipasen und Proteasen.6238
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