DE2806674C3

DE2806674C3 - Immobilisierte Enzyme

Info

Publication number: DE2806674C3
Application number: DE2806674A
Authority: DE
Inventors: Masanori Fujimoto; Hideo Hirohara; Shigeyasu Nabeshima; Tsuneyuki Takatsuki Nagase
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1977-02-17
Filing date: 1978-02-16
Publication date: 1980-12-11
Also published as: US4247642A; FR2381059A1; NL7801736A; CA1093991A; FR2381059B1; DE2806674A1; GB1568328A; DE2806674B2

Description

Epichlorbyiirin, Epibromhydrin, Dichiorhydrin, Dibromhydrin, Ethylenglykoldiglycidylether, Triethylenglykoldiglycidylether, Diglycidylether oder
1,6-HexandioldigIycidylether

einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man als Verbindung der allgemeinen Formel II, III oder IV _j0

2-DimethylaminoethyIchIorid 2-Diethylaminoethylchlorid,
2-Dimethylaminoisopropylchlprid, 2-Brom-5-diethyIaminopentan, r>

2-DiphenylaminoethylchIorid, 3-(N,N-DiniethylphenyIamino)-ethylchlorid, 3-Amino-1,2-epoxypropan,
3-Dimethylamino-1,2-epoxypropan, 3-Diethylamino-1,2-epoxypropan.

3- Dibutylamino-1,2-epoxypropan, 3-Diphenylamino-l^-epoxypropan, 3-(N,N-DimethyIphenylamino)-1,2-epoxypropan,

N,N-(23-Epoxypropyl)-methylanilin, 2-Chlorethylamin,

ein Salz der vorstehend aufgeführten Verbindungen Chlorpropionsäure oder ein Salz dieser Carbonsäuren oder Chlormethansulfonsäure, Bromethansulfonsäure, Chlorethansulfonsäure oder ein Salz dieser Säuren einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile Pullulangel oder das ionisierbare Pullulangel in Form von Kügelchen mit einem Durchmesser von 10 bis 500 Mikron und mit einer Wasseraufnahme von 1 bis 50 g/g trockenes Gel einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym mi

Trypsin, Chymotrypsin, Lipase, mikrobielle Protease, Esterase, Cholinesterase, Urease, Bromelain,

Ribonuclease, Desoxyribonuclease, f.,5

Penicillinamidase, Aminoacylase, P-Galactosidase.Glucoseisomerase, Glucoseoxidase, Kreatinkinase,

Peroxidase, Papain, Invertase,
Pepsin, 0-Amylase, Isoamylase,
Maltase oder Uricase

verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vernetzung des Pullulans mit der Verbindung der allgemeinen Formel I in einer.· Lösungsmittel und in Gegenwart von Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid oder Calciumhydroxid bei 10 bis 70⁰C durchgeführt worden ist

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Wasser oder ein Gemisch von Wasser mit einem Alkohol oder Wasser mit Aceton verwendet worden ist

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Pullulangel mit der Verbindung der allgemeinen Formel II, III oder IV in einem Lösungsmittel bei 5 bis 100⁰C umgesetzt worden ist

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel

Wasser, Dimelhylsulfoxid,
N,N-Dimethylformamid,
N,N-Dimethylacetamid, Benzol, Toluol,
Chloroform od« Ethylacetat

verwendet worden ist

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Wasser verwendet worden ist

13. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Base ein Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxid oder ein organisches Amin verwendet worden ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet daß als Base Natriumhydroxid verwendet worden ist.

Es ist bekannt, zur Herstellung immobilisierter Enzyme als Träger Cellulose-, Dextran- und Agarosege-Ie zu verwenden. An Cellulosegel immobilisierte Enzyme haben jedoch den Nachteil, daß bei fortgesetzter Verwendung das Cellulosegel allmählich in Lösung geht Das immobilisierte Enzym ist also nicht über einen längeren Zeitraum haltbar. Ferner ist es schwierig, große Mengen Enzym pro Gewichtseinheit Cellulose zu immobilisieren. Vernetztes Dextran (Dextran-Gele) und Agarose-Gele können zwar verhältnismäßig große Mengen an Enzymen pro Gewichtseinheit immobilisieren, doch ist es schwierig, diese Träger mit dem gewünschten Polymerisationsgrad herzustellen. Aus diesem Grund sind Dextran- und Agarose-Gele sehr teuer, was ihren Einsatz in der Technik erschwert

Aus der DE-OS 24 17 265 sind an Träger gebundene wasserunlösliche Enzymkomplexe bekannt, bei denen als Träger Naturschwamm benutzt wird. Da es sich bei diesem Träger um ein Naturprodukt handelt, ist es gemäß der DE-OS 24 17 265 nur schwer möglich, größere Mengen des Trägers mit den gleichen chemischen und physikalischen Eigenschaften zu erhalten. Auch kann bei der Verwendung eines aus einem Naturprodukt bestehenden Trägers dessen Molekulargewicht und Härte bzw. Wasseraufnahme nicht auf den jeweils gewünschten Wert eingestellt werden, wie dies bei synthetisch herstellbaren Trägern der Fall ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, immobilisierte Enzyme unter Verwendung spezieller Pullulan-Gele zu schaffen, bei denen die vorstehenden Nachteile vermieden werden und die sich durch eine hohe enzymatische Aktivität und Stabilität und annehmbaren Preis auszeichnen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst Die Erfindung ist durch die Patentansprüche definiert

Pullulan ist ein Polymeres von <x-l,6-verknüpfter Maltotriose, einem Trimeren der Glucose. Ein hydrophiles Pullulan-Gel mit dreidimensional vernetzter Struktur wird durch Umsetzen von Pullulan mit einer difunktionellen Verbindung erhalten, die mit den Hydroxylgruppen in den Glucoseeinheiten unter Bildung von Etherbindungen reagiert Ein ionisierbares Pullulan-Gel wird durch Umsetzen des hydrophilen Pullulan-Gels mit einer Verbindung erhalten, die an einem Ende ihres Moleküls eine ionisierbare Gruppe und an ihrem anderen Ende eine funktionell Gruppe aufweist die mit den Hydroxylgruppen in den Glueoseeinheiten in Gegenwart einer Base Etherbindungen ausbildet

Obwohl Pullulan aus Glucoseeinheiten aufgebaut ist, unterscheidet es sich grundlegend in seiner Struktur und in seinen Eigenschaften von den anderen bekannten Polysacchariden, wie Stärke oder Cellulose und deren Derivaten. Pullulan hat zahlreiche günstige Eigenschaften. Beispielsweise ist es in kaltem sowie in warmem Wasser leicht löslich, es bildet wäßrige Lösungen mit niedriger Viskosität, und es ist über lange Zeiträume stabil ohne zu gelieren oder zu altern im Vergleich zu wäßrigen Lösungen anderer Polysaccharide. Außerdem ist Pullulan ungiftig.

Die Verfahren zur Herstellung von hydrophilen Pullulan-Gelen und ionisierbaren Pullulan-Gelen werden nachstehend näher beschrieben.

Das hydrophile Pullulan-Gel ist in der DE-OS 26 27 125 beschrieben. Es wird durch Vernetzen von Pullulan mit einer difunktionellen Verbindung der allgemeineii Formel I

V 7

I l-.

hergestellt, in der X und Z Halogenatome oder Epoxygruppen darstellen und Y einen gegebenenfalls durch Sauerstoffatome substituierteil aliphatischen Rest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet. Das Molekulargewicht des eingesetzten Pullulans unterliegt keinen speziellen Beschränkungen, doch wird vorzugsweise ein Pullulan mit eir.em Durchschnittsmolekulargewicht von 1 χ 10⁴ bis 1 χ 10⁶ verwendet.

Speziell.; Beispiele füi verwendbare difunktionelle Verbindungen der allgemeinen Formel I sind in Anspruch 4 aufgeführt.

Die Vernetzungsreaktion wird vorzugsweise in wäßriger Lösung oder einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und einem Alkohol oder Wasser und Aceton und in Gegenwart einer Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Calciumhydroxid, und gewöhnlich bei Temperaturen von 10 bis 70⁰C während 1 bis 24, vorzugsweise 2 bis 10 Stunden, durchgeführt. Unter sonst gleichen Bedingungen wird mit abnehmender Menge des Lösungsmittels und mit zunehmendem Molekulargewicht des eingesetzten Pullulans sowie mit zunehmender Menge an Verbindung der allgemeinen Formel I der Vernetzungsgrad größer, so daß härtere Kügelchen gebildet we Sen.

Die Härte der hydrophilen Kügelchen oder die Wasseraufnahme der Kügelchen liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 g/g trockene Kügelchan. Kügelchen mit zu großer Wasseraufnahme sind mechanisch schwach, während bei sehr geringer Wasseraufnahme der Kügelchen das dreidimensionale Maschenwerk bzw. die Porengröße des vernetzten Pullulans zu gering und außerdem die Zahl der zum Immobilisieren eines Enzyms verfügbaren Hydroxylgruppen sehr gering wird.

ίο Ein hydrophiles Gel in Kügelchenform ist als Träger zum Immobilisieren des Enzyms erwünscht Ein derartiges Gel wird gewöhnlich durch Dispergieren einer wäßrigen, 20 bis 60 Gewichtsprozent Pullulan enthaltenden Lösung in einem flüssigen Medium hergestellt Als flüssiges Dispergiermedium kommt beispielsweise η-Hexan, Heptan, Isooctan, Benzol oder Toluol in Frage. Dieses flüssige Dk.pergiermedium ist mit der wäßrigen Lösung nicht mischbar und es enthält einen Disnersionsstabilisator, wie Polyvinylacetat Es bildet sich ein zweiphasiges Dispe^onssystem, in der die wäßrige Lösung in Form von Tröpfchen vorliegt Diese Dispersion wird unter Rühren mit eingestellter Geschwindigkeit mit der difunktionellen Verbindung der allgemeinen Formel I umgesetzt Die Teilchengröße des erhaltenen Gels läßt sich empirisch vorherbestimmen. Da die Teilchengröße im allgemeinen eine bestimmte Verteilung aufweist, kann das Produkt gesiebt werden. Kugelförmige Perlen mit einem Durchmesser von 10 bis 500 Mikron sind als Träger zum Immobilisieren von Enzymen bevorzugt

Die Fixierung der Enzyme an das erfindungsgemäß eingesetzte hydrophile Pullulan-Gel erfolgt durch kovalente Verknüpfung der Hydroxylgruppen in den Glucoseeinheiten oder in einigen Fällen unter Verwendung einer difunktionellen Verbindung. Zur Herstellung immobilisierter Enzyme mit hoher enzymatischer Aktivität und guter Beibehaltung der enzymatischen Aktivität dienen vorzugsweise folgende Verfahren:

(1) Die Verknüpfung mittels eines Triazinylderivats unter Verwendung von Cyanurchlorid;

(2) die Verknüpfung über Azid-Bindungen;

(3) die Verknüpfung über Diazo-Bindungen;

(4) die Verknüpfung über ein Monohalogenacetylderivat und

(5) die Verknüpfung durch Umsetzung mit einem Titan-, Zinn-, Zirkon-, Vanadium- oder Eisenchlorid.

Zur Herstellung von an ionisierbaren Pullulan-Gelen immobilisierten Enzymen wird vorzugsweise ein Träger verwendet, der eine gewisse Härte aufweist, d. h. dessen Wasserwiederaufnahme 1 bis 50 g/g trockenes Gel betrag*, und dessen Kügelchen einen Durchmesser von 10 bis 500 Mikron aufweisen. Dieses ionisierbare Puilulangel wird gemäß Anspruch 2 durch Umsetzen mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II, III odsr IV hergestellt.

Das zur Herstellung des ionisierbaren Pullulan-Gels eingesetzte hydrophile Pullulan-Gel ist hinsichtlich seiner Wasserar^fnahme nicht besonders beschränkt.

on Vorzugsweise wird ein hydrophiles Pullulan-Gel mit einer Wasseraufnahme von 1 bis 50, Vorzugsweise 1 bis 30 g/g trockenes hydrophiles Gel verwendet Vorzugsweise hat das hydrophile Pullulan-Gel die Form von Kügelchen mit einem Durchmesser von 10 bis 500 Mikron.

Spezielle Beispiele für Verbindungen der allgemeinen Formel II, III und IV, die mit dem hydrophilen Pullulan-Gel in Gegenwart einer Base umgesetzt

werden können, sind in Anspruch 5 aufgeführt. Die Verbindungen der allgemeinen Formel II, III oder IV werden in mindestens stöchiometrischer Menge eingesetzt. Vorzugsweise werden V30 bis 10 Mol, insbesondere V10 bis 5 Mol dieser Verbindungen/Mol Glucoseein- ■-, heit des Pullulans verwendet.

Beispiele für Basen, die bei der Umsetzung des hydrophilen Pullulan-Gels mit den Verbindungen der allgemeinen Formel H, III oder IV verwendet werden, sind Alkalimetallhydroxide, wie Natrium- und Kaliumhydroxid, Erdalkalimetallhydroxide, wie Calcium- und Magnesiumhydroxid, sowie in einigen Fällen organische Amine, wie Ethylendiamin, Diethylentriamin und Triethylamin. Besonders bevorzugt als Base ist Natriumhydroxid. Die Base wird im allgemeinen in der 0,1- bis r. lOfachen Menge, bezogen auf Mol eingesetzte Verbindung der allgemeinen Formel II, III oder IV, verwendet. Sofern während der Umsetzung eine Halogenwasserstoffsäure freigesetzt wird, ist es erforderlich, die Base in ausreichender Menge zu verwenden, um den Halogen- _>o wassersloff zu neutralisieren.

Hinsichtlich der verwendbaren Lösungsmittel bestehen keine speziellen Beschränkungen, sofern sie die Umsetzung nicht ungünstig beeinflussen. Spezielle Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind _>-.

Wasser, Dimethylsulfoxid,

N,N-Dimethylformamid, N₁N-Dimethy!acetamid,

Benzol, Toluol, Chloroform und Ethylacetat.

Das bevorzugte Lösungsmittel ist Wasser. Die Reaktionsbedingungen unterliegen ebenfalls keinen speziellen Beschränkungen. Im allgemeinen eignen sich Reaktionstemperaturen unterhalb 200⁰C, wobei in einigen Fällen bei Temperaturen oberhalb 100°C unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können. Deshalb wird eine Reaktionstemperatur von 5 bis 100° C bevorzugt.

Die Fixierung der Enzyme an das ionisierbare Pullulan-Gel kann entweder nach der ionischen Bindungsmethode durch Adsorption oder durch kovalente Verknüpfung erfolgen.

Rpi rii?r ir»ni>:rhpn Rinrfnn^mpthnHp u/irri al« Träopr

ein kationaktives oder anionaktives Pullulan-Gel verwendet, je nach dem isoelektrischen Punkt und dem pH-Optimum des zu immobilisierenden Enzyms. Beispielsweise werden zur Immobilisierung von Enzymen mit einem isoelektrischen Punkt bei etwa 5 und einem pH-Optimum von etwa 7 kationenaktive Pullulan-Gele als Träger verwendet, beispielsweise Pullulan-Gele mit Diethyliiminoethylgruppen, Während zur Immobilisierung von Enzymen mit e'nem isoelektrischen Punkt um etwa 10, die im Neutralbereich ihr pH-Otimum haben, anionaklive Pullulan-Gele, wie carboxymethyliertes PuHulan-Gel als Träger verwendet werden.

In der ersten Stufe der Herstellung immobilisierter Enzyme nach der ionischen Bindungsmethode wird also ein ioniisierbares Pullulan-Gel in üblicher Weise, beispielsweise mit einer 0,02- bis !molaren Lösung von Salzsäure oder Natriumhydroxid behandelt, um die ionenaustauschenden Gruppen zu aktivieren, oder das ionisierbare Pullulan-Gel wird auf das pH-Optimum des zu immobilisierenden Enzyms mittels einer Pufferlösung (0,02- bis 1 molar) eingestellt In der nächsten Stufe wird das so behandelte ionisierte Pullulan-Gel eine ausreichende Zeit in eine das zu immobilisierende Enzym enthaltende Lösung gegeben, die gegebenenfalls gerührt wird. Danach wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und gewaschen. Vorzugsweise wird das Enzym bei Temperaturen von 0 bis 40~C, insbesondere etwa 4°C, adsorbiert. Die bevorzugte Adsorptionszeit beträgt 1 bis 24 Stunden. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Enzym enthält im allgemeinen höchstens etwa 100 mg Enzym/g trockenen Träger. Das immobilisierte Enzym zeigt eine hohe enzymatische Aktivität und ist stabil, sofern es nicht mit einer Salzlösung hoher Ionenstärke gewaschen wird.

Bei der kovalenten Verknüpfung werden immobilisierte Enzyme mit hoher enzymatischer Aktivität und guter enzymatischer Stabilität nnch den üblichen Verfahren erhalten, die entweder die Reaktionsfähigkeil der im Pullulan-Gel vorhandenen Hydroxylgruppen oder einer später in das Molekül eingebauten ionisierbaren Gruppe, beispielsweise einer primären oder sekundären Aminogruppe oder einer Carboxylgruppe, ausnützen. Diese Verfahren haben sich bereits zur Herstellung ionisierter Cellulose- oder Dextran-Geie bewahrt. Besonders günstige Methoden, die die Reaktionsfähigkeit der ursprünglich im Pullulan-Gel vorhandenen Hydroxylgruppen oder einer später in das Gel eingeführten ionisierbaren Gruppe, beispielsweise einer primären oder sekundären Aminogruppe oder einer Carboxylgruppe, ausnutzen, sind folgende Methoden:

(1) Die Verknüpfung über ein Triazinylderivat mittels Cyanurchlr-id;

(2) die Verknüpfung über eine Azid-Bindung;

(3) die Verknüpfung über eine Diazo-Bindung:

^!" (4) die Verknüpfung über ein Monohalogenacetylderivat;

(5) die Verknüpfung über ein Carbodiimid und

(6) die Verknüpfung mit einem Träger unter Verwendung von Glutardialdehyd. Die kovalente Verknüpfung ist zwar schwieriger durchführbar, doch liefert sie stabilere immobilisierte Enzyme als die ionische Bindungsmethode.

Spezielle Beispiele für Enzyme, die erfindungsgemäß .10 immobilisiert werden können, sind in Anspruch 7 aufgeführt.

Πιο Qoicnialf) oclöiitorn rlio CrfiriHiincr T*»ili> nnrl

Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Eine Lösung von 40 Teilen Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 72 000 in 80 Teilen Wasser wird mit 12,5 g Natriumhydroxid versetzt. Die

ϊο erhaltene Lösung wird in ein Dispergiermedium aus 10 Teilen Polyvinylacetat, 160 Teilen Toluol und 1.2 Teilen Sorbitanmonostearat gegeben. Das Gemisch wird bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 800 U/min gerührt, um die wäßrige Lösung zu feinen Tröpfchen zu zerteilen. 1 Stunde nach Beginn der Zugabe der wäßrigen Lösung zum Dispergiermedium werden 29 Teile Epichlorhydrin eingetragen, und das Gemisch wird 5 Stunden bei 50⁰C umgesetzt Sodann wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit Toluol und sodann mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet Es wird ein hydrophiles Pullulan-Gel in Kügelchenform mit einer Wasseraufnahme von 235 g/g erhalten.

100 Teile des erhaltenen hydrophilen Pullulan-Gels werden in 480 Teilen einer wäßrigen Lösung dispergiert, die 110 Teile Natriumhydroxid enthält Die erhaltene Dispersion wird unter Rühren bei Raumtemperatur (etwa 20⁰C) tropfenweise innerhalb 4 Stunden mit einer

Lösung von 240 Teilen 2-Diethylaminoethylchlorid-hydrochlorid in 220 Teilen Wasser versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch noch weitere 14 Stunden umgesetzt. Das entstandene Reaktionsprodukt wird abfiltriert und mit Wasser und Methanol i gewaschen. Es wird ein Dielhylaminoethyl-Pullulan-Gel (DFAE-Pullulan-Gel) in Kügelchenform erhalten. Die Ktigp.lchen haben in trockenem Zustand einen Durchmesser von 37 bis 149 Mikron und eine Wasseraufnahme von 2,8 g/g. Der Amingehalt beträgt 2,7 mÄq/g in gemessen durch Leitfähigkeitstitration.

Mit dem erhaltenen DEAE-Pullulan-Gel wird technische Pronase E nach der ionischen Bindungsmethode folgendermaßen immobilisiert.

I g trockenes DEAE-Pullulan-Gel wird zunächst mit π 0,1 normaler Natronlauge behandelt und sodann zur Abtrennung von überschüssigem Natriumhydroxid gründlich mit Wasser gewaschen. Das erhaltene aktivierte DEAE-Pullulan-Gel wird in 20 ml eines 0.02molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 einge- >o tragen, der 50 mg technische Pronase E gelöst enthält. Die Adsorption des Enzyms wird bei 4°C während 5 Stunden unter gelindem Rühren durchgeführt. Sodann wird das DEAE-Pullulan-Gel auf einer Glasfilternutsche abfiltriert und gründlich mit 0,02molarem Phosphatpuf- >■·> fer vom pH-Wert 7.0 und Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt und aufbewahrt. Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 39 mg Pronase E am Träger adsorbiert sind. Die spezifische Aktivität des immobili- m sierten Enzyms wird bei 30°C und einem pH-Wert von 7,0 mittels eines pH-stat-Geräts bestimmt. Es wird N-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE) als Substrat verwendet. Unter den Bedingungen des Vorliegens von überschüssigem Substrat gegenüber dem Enzym beträgt ; die spezifische Aktivität 3,2 mMol/mg· min. Dieser Wert entspricht 35% der enzymatischen Aktivität in der Lösung vor der Immobilisierung. Die enzymatisch^ Aktivität des immobilisierten Enzyms wird 5mal unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben to gemessen. Beim 5. Versuch beträgt die enzymatische Akirviiäi

ciwa /J-7U uei cii/cyiiiaiiiLneii rtKiivitai des ersten Versuchs.

Bei spi e I 2 _r

70 mg Pronase E werden in 25 ml einer 4⁰C kalten 0,05mo!aren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 1,0 g (Trockengewicht) des gemäß Beispiel 1 hergestellten DEAE-PuIIu-Ian-Gels versetzt. Zur Adsorption des Enzyms wird das vi Gemisch bei etwa 4°C langsam gerührt. Sodann wird die immobilisierte Pronase E nacheinander mit 0,05mo-Iarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 63, einer 0,1 molaren Kochsalzlösung und vollentsalztem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung proteinfrei ist. Das Filtrat und die Wasch lösungen werden vereinigt. Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 49 mg Pronase E am Träger adsorbiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird bei 40⁰C und einem pH-Wert von 6,0 mittels eines to pH-stat-Geräts unter Verwendung von DL-Lysinmethylester als Substrat bestimmt. Sie beträgt 37% der Aktivität des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung.

Beispiel 3

100 mg technisches Papain werden in 3OmI einer 0,02molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 bei 4° C gelöst.

Gemäß Beispiel 1 wird ein hydrophiles Pullulan-Gel in Kügelchenform mit einer Wasseraufnahme von 2,5 g/g unter Verwendung der gleichen Ausgangsverbindungen und unter den gleichen Reaktionsbedingungen hergestellt, jedoch werden 24,5 Teile Epichlorhydrin eingesetzt. Eine Lösung von 30 Teilen des hydrophilen Pullulan-Gels, 30 Teilen Monochloressigsäure und 20 Teilen Wasser wird in 200 Teilen Methanol 6 Stunden bei 10⁰C gerührt. Es wird ein Carboxymethylpullulan-Gel (CM-Pulliilan-Gel) in Kügelchenform erhalten. In trockenem Zustand haben die Kügelchen einen Durchmesser von 74 bis 149 Mikron und eine Wasseraufnahme von 2.9 g/g. Der Carboxylgruppengehalt beträgt 3,1 mÄq/g, gemessen durch Leitfähigkeitstitration.

Die vorstehend beschriebene Papainlösung wird mit 1,0 g des CM-Pullulan-Gels versetzt und das Gemisch wird zur Adsorption des Enzyms bei 4°C langsam gerührt. Sodann wird das immobilisierte Enzym gemäß Beispiel 2 gewaschen. Filtrat und Waschlöungen werden vereinigt. Die Menge des Proteins wird nach der Methode von Lowry bestimmt. Die Menge des immobilisierten Enzyms beträgt 30,1 mg. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird bei 40⁰C und einem pH-Wert von 6,2 mittels eines pH-stat-Geräts unter Verwendung von BAEE als Substrat bestimmt. Sie beträgt 1,70 μΜοΙ/mg· min. Dies entspricht 23% der enzymatischen Aktivität in der Lösung vor der Immobilisierung. Bei der Messung der spezifischen Aktivität des immobilisierten Enzyms und des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung liegen 2 χ 10¹MoI Ethylendiamintetraessigsäure.

5 χ 10 ³ Mol Cystein und 0,15 Mol Natriumchlorid vor.

Beispie I 4

50 mg technisches gereinigtes Trypsin werden in 30 ml einer 0,02molaren Tris-Salzsäure-Pufferlösung (enthaltend Calciumchlorid in einer Konzentration von 0,02molar) bei 4°C gelöst. Die erhaltene Lösung wi. j mit 1,0 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten CM-PuIIuiail-Gcn vciaciii, uiiu uaa

wiiu 3 oiunucil uci

etwa 4°C langsam gerührt. Die Messung der UV-Absorptionsintensität des Proteins in der wiedergewonnenen Lösung ergibt, daß 22 mg Trypsin immobilisiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird mittels eines pH-stat-Geräts bei 30°C und einem pH-Wert von 7,5 in Gegenwart von Calciumchlorid in einer Konzentration von 0,02molar gemessen. Sie beträgt 5,5 μΜοΙ/mg-min. Dies entspricht 21% der enzymatischen Aktivität in der Lösung vor der Immobilisierung.

Beispiel 5

Glucoseisomerase mit einer Aktivität von 7500 Einheiten und einem Proteingehalt von 84 mg (bestimmt nach Lowry) wird in 25 ml einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,5 gelöst Das Glucoseisomerase-Präparat ist durch Vermählen lebender Zellen von Streptomyces phaeochromogenes, Zentrifugieren in der Kälte und Reinigen des Oberstandes durch Acetonfällung hergestellt worden.

Ein DEAE-Pullulan-Gel in Kügelchenform mit einem Durchmesser in trockenem Zustand von 39 bis 149 Mikron, einer Wasseraufnahme von 3,0 g/g und einem Diethylaminoethylgruppengehalt von 24 mÄq/g, gemessen durch Leitfähigkeitstitration, wird folgendermaßen hergestellt: 32 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten

11 12

hydrophilen Pullulan-Gels werden in einer Lösung von und das Gel enth'.Mt 0,57 mÄq/g jS-Hydroxypropyltri-

35 Teilen Natriumhydroxid in 150 Teilen Wasser methylaminogruppen (/7-HPTMA), bestimmt durch

eingeweicht und dispergiert. Sodann wird die erhaltene Leitfähigkeitstitration.

Dispersion tropfenweise mit einer Lösung von 68 Teilen 3,0 g des erhaltenen /3-HPTMA-Pullulan-Gels werden

2-Diethylaminoethylchlorid-hydrochlorid in 40 Teilen > in die vorstehend beschriebene Enzymlösung eingetra-

Wasser versetzt. Die Umsetzung wird 18 Stunden bei gen. Das Gemisch wird !0 Stunden bei 15 bis 20°C und

Raumtemperatur durchgeführt. 80 U/min geschüttelt. Nach beendeter Adsorption wird

3,0 g des auf die vorstehend beschriebene Weise das immobilisierte Enzym gemäß Beispiel 5 gewaschcr..

erhaltenen DEAE-Pullulan-Gels werden in die vorste- Aufgrund der Bestimmung der enzymatischen Aktivität

hend beschriebene Enzymlösung eingetragen, und das in in der Waschlösung sind 65 mg Protein am Träger

Gemisch wird 10 Stunden bei 60 U/min und bei einer adsorbiert. Die enzymatische Aktivität des immobilisier-

Temperatur von etwa 15°C geschüttelt. Nach beendeter ten Enzyms beträgt 7110 Einheiten.

Adsorption wird das immobilisierte Enzym abfiltriert Die erhaltene immobilisierte Glucoseisomerase wird

und gründlich mit einer 0,05molaren Phosphatpufferlö- in eine ummantelte Kolonne mit einem Innendurchmes-

sung vom pH-Wert 7,5 gewaschen. Aufgrund der η ser von 1,5 mm gefüllt. Bei einer Manteltcmperauir von

Messung der enzymatischen Aktivität und des Protein- 65°C wird vom Kopf der Kolonne eine 54gewichtspro-

gehalts des Filtrats sind 71 mg des Proteins am Träger /.entige wäßrige Lösung von kristalliner Glucose

gebunden. Die enzymatische Aktivität der immobilisier- (enthaltend 5 χ 10 ' Mol MgSO₄ - 7 H>O und eingestellt

ten Giucoseisomerase beträgt 6980 tinheiten. aiii einen pH-Wert von 7,65) mittels einer Pumpe bei

Die erhaltene immobilisierte Glucoseisomerase wird _'» einer Raumgeschwindigkeit von 2 Std. -' hindurchgelei-

in eine ummantelte Kolonne mit einem Innendurchmes- tet. Die Umwandlung in Fructose beträgt über einen

ser von 1,0 mm gefüllt. Bei einer Temperatur im Mantel Zeitraum von 350 Std. konstant 53.5%.

von60°C wird vom Kopf der Kolonne eine 54gewichts- . .

prozentige wäßrige Lösung von kristalliner Glucose, die Ue ι spiel

Magnesiumionen in einer Konzentration von r. 100 mg /3-Galactosidase — gewonnen als extracellu-

5 χ 10-^Jmolar enthält, und die auf einen pH-Wert von läres Enzym aus Aspergillus oryzae und gereinigt durch

7,5 eingestellt ist, mittels einer Pumpe durch die Alkoholumfällung — werden in 25 ml einer 0,02moiaren

Kolonne geleitet. Die Strömungsgeschwindigkeit Citrat-Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 5,5 gelöst.

(Raumgeschwindigkeit) wird auf 2 Std.-' eingestellt. Die Die erhaltene Lösung wird mit 1.0 g des gemäß Beispiel

Kolonne wird ununterbrochen betrieben. Die Umwand- w 5 hergestellten DEAE-Pullulan-Gels versetzt. Das

lung in Fructose beträgt innerhalb der ersten 350 Gemisch wird 10 Stunden bei 4⁰C und 60 U/min

Stunden konstant 51,5%, und danach nimmt sie langsam geschüttelt. Nach beendeter Adsorption wird das

ab. Die Halbwertszeit beträgt etwa 50 Tage. immobilisierte Enzym mit einer 0.02molaren Citrat-Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 5,5 und vollem-π salztem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung

Eine Einheit Glucoseisomerase ist die Menge Enzym. proteinfrei ist. Die Messung der UV-Adsorptionsinten-

die 1 mg/Std. Fructose bildet, wenn die Isomerisierung sität des Proteins in der Waschlösung ergibt, daß 40 mg

mit 0,1 molarer D-Glucose als Substrat in Gegenwart Enzym am Träger adsorbiert sind. Die Bestimmung des

von 0,05molarem Phosphatpuffer und 0,005molarem Proteins nach der Methode von Lowry ergibt einen

Phosphatpuffer und 0,005molarem MgSO₄ · 7 HjO bei in Wert von 43 mg adsorbiertes Enzym. Die spezifische

70°C und einem pH-Wert von 7.0 während 1 Stunde Aktivität des immobilisierten Enzyms wird bei ^0^?C und

— — ·~··Ο ~·—«"»····«· V Il IV. I 14 JJI 1 ' TT \-l I TVMt T.^ Uli ^gV „ IVI I I jp> ULh IlUgVI

Lactoselösung als Substrat gemessen. Sie beträgt

• 1.70 μΜοΙ/mg ■ min. Die Aktivität wird durch colorime·

Die quantitative Bestimmung der Fructose wird nach -n trische Bestimmung der entstandenen Menge an

der Cystein-Carbazol-Schwefelsäuremethode gemäß Glucose gemessen, die bei der Umsetzung mit einem

der JAS-Prüfnorm durchgeführt. Reagens aus Glucoseoxidase, Peroxidase und Farbstoff

In den nachstehenden Beispielen wird die Aktivität gebildet wird,

der Glucoseisomerase und die Menge an entstandener .

Fructose in gleicher Weise bestimmt, wie dies in Beispiel 8

vorstehend beschrieben ist. 2 g gemäß Beispiel 1 hergestelltes DEAE-PuIIu-

. lan-Gel werden in 25 ml In Natronlauge eingetragen

Beispiel 6 und 15 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 20°C)

Glucoseisomerase mit einer Aktivität von 7600 gerührt Nach dem Abfiltrieren der überschüssigen

Einheiten und einem Proteingehalt von 70 mg, die 55 Natronlauge wird das erhaltene DEAE-Pullulan-Gel 5

gemäß Beispiel 5 gereinigt worden ist, wird in 25 ml Minuten bei Raumtemperatur in 25 ml Dioxan eingetra-

einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert gen. Sodann wird das Gel mit 20 ml einer Dioxanlösung

7,65 gelöst versetzt, die 4 g Cyanursäurechlorid enthält Das

10 Teile des gemäß Beispiel 3 hergestellten Gemisch wird bei Raumtemperatur gerührt Nach 1

hydrophilen Pullulan-Gels werden in 100 Teile einer bo Minute wird das Gemisch mit 25 ml Eiswasser und

wäßrig alkalischen Lösung von jJ.y-Epoxypropyltrime- hierauf mit 25 ml Essigsäure versetzt um die Re^.don

thylammoniumchlorid eingetragen, das durch Epoxida- abzubrechen. Danach wird die Lösung abfiltriert und

tion von 30 Teilen y-Chlor-JJ-hydroxypropyltrimethyl- das erhaltene s-Triazinyl-DEAE-Pullulan-Gel rasch mit

ammoniumchlorid mit 6 Teilen Natriumhydroxid herge- kaltem Aceton und eiskaltem Wasser gewaschen und

stellt worden ist Es wird ein ß-Hydroxypropyltrimethyl- 65 unmittelbar darauf zur Immobilisierung verwendet, die

aminopullulan-Gel in Kügelchenform erhaltef Der folgendermaßen durchgeführt wird.

Teilchendurchmesser beträgt in trockenem Zustand 39 Das erhaltene s-Triazinyl-DEAE-Pullulan-Ge! wird in

bis 149 Mikron. Die Wasseraufnahme beträgt 2,8 g/g, eine Lösung eingetragen, die 170 mg Pronase E in 20 ml

einer Phosphatpufferlösung enthält. Die Lösung wird auf 4° C und einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, und das Gemisch \*'ird 5 Stunden gerührt. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 0,2 normaler Natronlauge auf 8,0 eingestellt, und die Temperatur soll 4⁰C nicht übersteigen. Nach 5stündiger Umsetzung wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und mit 5molarer Kochsalzlösung, 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 und kaltem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung proteinfrei ist. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt. Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 66 mg Pronase E am trockenen Träger immobilisiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird mittels eines pH-stat-Geräts an einer 20gewichtsprozentigen Lösung von DL-Lysinmethylester als Substrat bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,0 bestimmt. Sie beträgt 2,94 μΜοΙ/mg · min. Dies entspricht 60% der <;np7ifi<;rhpn Aktivität rip*; Fn7vnr: in Hpr I ο^ιιησ vnr

dem Immobilisieren.

Beispiel 9

1,0 g gemäß Beispiel 1 hergestelltes DEAE-Pullu· lan-Gel werden in 35 ml Wasser eingetragen. Sodann wird das Gemisch bei 4°C unter Rühren mit 1.0g Bromcyan versetzt. Hierauf wird 5 normale Natronlauge eingetropft, um den pH-Wert auf 11,0 einzustellen. Sobald keine weitere Abnahme des pH-Wertes mehr erfolgt, wird das Gel abfiltriert und rasch mit einer 0,1 molaren Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0 gewaschen. Das erhaltene, mit Bromcyan aktivierte DEAE-Pullulan-Gel wird in 10 ml einer O.lmolaren Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen, die 80 mg Pronase E enthält. Das Gemisch wird 2 Stunden unter gelindem Schütteln gerührt. Zur Desaktivierung nicht umgesetzter aktiver Gruppen wird die erhaltene immobilisierte Pronase mit dem lOfachen ihres Volumens Wasser gewaschen und sodann in eine l.Omolare Ethanolaminlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur (etwa 20⁰C) wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und mehrmals mit einer 0,1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,0, die 1 Mol/Liter Natriumchlorid enthält, einer O.lmolaren Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0, die 1 Mol/Liter Natriumchlorid enthält, sowie kaltem Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt. Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 31mg Pronase E/g trockenes Gel immobilisiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird mittels eines pH-stat-Geräts mit DL-Lysinmethylester als Substrat bei 40⁰C und einem pH-Wert von 6,0 und einer Substratkonzentration von 20 Gewichtsprozent bestimmt Sie beträgt 3,12 μΜοΙ/mg ■ min. Dies entspricht 52% der spezifischen Aktivität des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung.

Beispiel 10

Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 8 werden 2,0 g des gemäß Beispiel 6 hergestellten /?-HPTMA-PuIlulan-Gels mit Cyanurchlorid umgesetzt und gewaschen. Es wird ein s-Triazinyl-jS-HPTMA-Pul-Iulan-Gel erhalten. Dieses Gel wird in 25 ml einer 0,05moiaren Phosphatpufferlösung eingetragen, die 60 mg einer Glucoseisomerase (110 Einheiten/mg) aus Streptomyces phaeoehromügenes enthält. Die Immobilisierung und das Waschen erfolgt gemäß Beispiel 8. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms wird folgendermaßen bestimmt: Das Gel wird in 50 ml einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,65 und mit einem Magnesiumionengehalt von 0,005 Mol/Liter, die 0,1 Mol/Liter Glucose enthält, 1 Stunde

-. bei 70⁰C geschüttelt. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms beträgt 6270 Einheiten. Das immobilisierte Enzym wird in eine ummantelte Kolonne mit einem Durchmesser von 12 mm gefüllt. Durch den Mantel wird 60° C warmes Wasser geleitet. Durch die Kolonne wire

in 54gewichtsprozentige (3 Mol/Liter) Glucoselösung vom pH-Wert 7.5. die 0.005 Mol/Liter Magnesiumionen enthält, in einer Raumgeschwindigkeit von 3,0 Std.~' geleitet. Der Fructosegehalt der abfließenden Lösung wird nach der Cystein-Carbazol-Schwefelsäure-Metho-

i) de bestimmt. Die Umwandlung von Glucose in Fructose betrag! 52%.

Beispiel 11

9 σ opmäR Rpknipl 1 hprtrpstplltp·: ΠΜ-Piilliilsin-Gpl

werden in 40 ml Methanol eingetragen und durch Einleiten von gasförmigem Chlorwasserstoff in den Methylester überführt. Der Methylester wird mit Hydrazin-hydrat zum Hydrazid umgesetzt, das mittels 3prozentiger Natriumnitritlösung in das Azid überführt

r> wird. Das erhaltene Azid wird sofort in 25 ml einer Phosphatpufferlösung eingetragen, die 1000 Sumner-Einheiten technischer Urease enthält, und 12 Stunden bei 4°C gelinde geschüttelt. Nach beendeter Umsetzung wird das immobilisierte Enzym mit 5molarer Kochsalz-

«i lösung, 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,7 und destilliertem Wasser gewaschen. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms wird colorimetrisch nach D. D. Van Slyke u. Mitarb., J. Biol. Chem., Bd. 154 (1944), S. 623, bestimmt. Sie beträgt 500 Sumner-Einheiten.

^!> Beispiel 12

2,0 g gemäß Beispiel 5 hergestelltes DEAE-PuIIulan-Gel werden gemäß Beispiel 8 mit Cyanursäurechlorid umgesetzt und gewaschen. Es wird ein s-Triazinyl-DEAE-Pullulan-Gel erhalten.

Gemäß Beispiel 8 werden 400 mg der in Beispiel 7 verwendeten /3-Galactosidase aus Aspergillus oryzae zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms verwendet. Es werden 120 mg Enzym/g trockenen Träger gebunden. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms beträgt 2,2 μΜοΙ/mg · min, gemessen bei 30° C und einem pH-Wert von 4,5 mit 5prozentiger Lactoselösung als Substrat

-_n Beispiel 13

Aus Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 100 000 wird durch Vernetzung mit Epichlorhydrin ein hydrophiles Pullulangel in Kügelchenform hergestellt, dessen Teilchengröße in trockenem Zustand 37 bis 74 Mikron und dessen Wasseraufnahme 3,5 g/g beträgt. 2 g des hydrophilen Pullulangels werden in 25 ml In Natronlauge eingetragen und 15 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 20° C) gerührt Nach dem Abfiltrieren der überschüssigen Natronlauge

so wird das so behandelte hydrophile Pullulangel in 35 ml Dioxan eingetragen und 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt Hierauf werden 2OmI einer Dioxanlösung zugegeben, die 4 g Cyanursäurechlorid enthalten, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur kräftig gerührt Nach 1 Minute wird das Reaktionsgemisch mit 25 ml Eiswasser und sodann rasch mit 25 ml Essigsäure versetzt, um die Reaktion abzubrechen. Nach dem Abfiltrieren des Lösungsmittels wird das erhaltene

hydrophile s-Triazinyl-Pullulan-Gel rasch mit kaltem Aceton und Eiswasser gewaschen und unmittelbar danach zur Immobilisierung eines Enzyms eingesetzt Die Immobilisierung wird folgendermaßen durchgeführt:

Das Gel wird in eine Lösung von 165 mg Pronase E in 2OmI einer 4° C kalten Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen und 5 Stunden gerührt Der pH-Wert wird mit 0,2 η Natronlauge auf 8,0 eingestellt Die Temperatur soll 4° C nicht übersteigen. Nach 5stündiger Umsetzung wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und mit 5molarer Kochsalzlösung, 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 und kaltem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung proteinfrei ist Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt daß 76 mg Pronase E/g trockenes Gel gebunden sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms mittels eines pH-stat-Geräts unter Verwendung von DL-Lyunmethylester als Substrat bei 30⁰C, einem pH-Wert von 6,0 und einer Substratkonzentration νς>η 10 Gewichtsprozent beträgt 2,53μΜοΙ/π^ ■ min. Dies entspricht 52% der spezifischen Aktivität des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung.

Beispiel 14

Gemäß Beispiel 13 wird ein hydrophiles Pullulangel in Kügelchenform mit einer Teilchengröße von 37 bis 74 Mikron in trockenem Zustand und einer W.isseraufnahme von 2,7 g/g aus Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 100 000 durch Vernetzung mit Epichlorhydrin hergestellt. 2 g des erhaltenen hydrophilen Pullulan-Gels werden mit Cyanursäurechlorid umgesetzt und gewaschen. Es wird ein hydrophiles s-Triazinyl-Pullulan-Gel erhalten. Dieses Gel wird in 25 ml einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung eingetragen, die 60 mg Glucoseisomerase (110 Einheiten/mg) aus Streptomyces phaeochromogenes enthält. Die Immobilisierung und das Waschen wird gemäß Beispiel 13 durchgeführt. Zur Bestimmung der Aktivität des erhaltenen immobilisierten Enzyms wird das Gel in 50 ml einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,5, die 0,005molar Magnesiumionen enthält, die 0,1 Mol Glucose enthält, 1 Stunde bei 70⁰C geschüttelt. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms beträgt 4950 Einheiten. Ein Anteil des immobilisierten Enzyms entsprechend 3500 Einheilen wird in eine ummantelte Kolonne mit einem Durchmesser von 8 mm gefüllt. Durch den Mantel wird 70⁰C warmes Wasser geleitet Durch die Kolonne wird in einer Raumgeschwindigkeit von 3,5 Std.-' eine 3molare Glucoselösung vom pH-Wert 7,5, die 0,005 Mol Magnesiumionen enthält, hindurchgeleitet Die Fructose in der abfließenden Lösung wird nach der Cystein-Carbazol-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Die Umwandlung von Glucose in Fructose beträgt 52%.

Beispiel 15

Durch Umsetzung von Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 60 000 mit Epichlorhydrin wird ein hydrophiles Gel mit einer Teilchengröße von 74 bis 125 Mikron in trockenem Zustand und einer Wasseraufnahme von 5,6 g/g hergestellt. 2 g des erhaltenen hydrophilen Pullulan-Gels werden in 2 η Natronlauge eingetragen und sodann mit Monochloressigsäure in einem Gemisch von Wasser und Methanol carboxymethylierl. Das carboxymethylierte hydrophile Pullulangel wird hierauf mit Methanol unter Verwendung von Chlorwasserstoffgas in den Methylester überführt Der Methylester wird sodann mit Hydrazinhydrat zum Hydrazid und hierauf mit 3prozentiger Natriumnitritlösung zum Azid umgesetzt Das erhaltene Azid wird sofort in 25ail einer Phosphatpufferlösung eingetragen, die 1000 Sumner-Einheiten einer technischen Urease enthält, und 12 Stunden bei 4° C gelinde geschüttelt Nach beendeter Umsetzung wird das

ι ο erhaltene immobilisierte Enzym mit 5molarer Kochsalzlösung, 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,7 und destilliertem Wasser gewaschen. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms wird colorimetrisch nach der Methode von Van Slyke bestimmt Sie beträgt 480

Sumner-Einheiten.

Beispiel 16

2 g des in Beispiel 14 eingesetzten hydrophilen Pullulan-Geis werden in 2OmI einer Dioxanlösung eingetragen, die 25 g Bromessigsäure enthält Das Gemisch wird 8 Stunden bei Raumtemperatur gelinde geschüttelt Sodann wird das Gemisch langsam und tropfenweise mit 17 ml Bromacetylbromid versetzt Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch weitere 6 Stunden gerührt Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsprodukt mi* eiskalter, 0,1 molarer Natriumcarbonatlösung und Eiswasser gewaschen. Es wird ein bromacetyliertes hydrophiles Pullulangel erhalten. Das

jo erhaltne Gel wird in eine 0,2moiare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,5 eingetragen, die 100 mg Aminoacylase (10 000 Einheiten/g) enthält und 18 Stunden bei 5° C gelinde gerührt. Das erhaltene immobilisierte Enzym wird mehrmals mit Phosphatpuf ferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen und sodann auf seine Aktivität untersucht Es wird die Menge an L-Methionin bestimmt, wenn das immobilisierte Enzym bei 37° C mit einer O^molaren Lösung (pH-Wert 7,0; enthaltend 0,5x10-« M CoCl₂) von N-Acetyl-DL-me-

4i) thionin als Substrat behandelt wird. Die Aktivität beträgt 370 Einheiten und das Ausmaß der Immobilisierung 37%. Die Aktivitätsmessung wird lOmal wiederholt Beim 10. Versuch beträgt die Aktivität immer noch 92% der Anfangsaktivität.

Beispiel 17

1,0 g des in Beispiel 15 eingesetzten hydrophilen Pullulan-Gels werden in 10 ml einer 15gewichtsprozen tigen Titantetrachloridlösung eingetragen. Das Ge misch wird 5 Minuten kräftig gerührt Danach wird das Gel abfiltriert und gründlich mit Wasser sowie einer Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,0 gewaschen. Das erhaltene hydrophile Gel mit Titanchloridgruppen wird in eine 0,1 molare Succinatpufferlösung vom pH-Wert 5,0 eingetragen, die 100 mg lnvertase enthält Das Gemisch wird 18 Stunden bei 4° C gerührt Das erhaltene immobilisierte Enzym wird mit 0,5molarer Kochsalzlösung und 0,1 molarer Succinatpufferlösung

ho gründlich gewaschen. Die Aktivität des erhaltenen immobilisierten Enzyms betragt 720 Einheiten, gemessen bei 55°C mit einer lprozentigen Sucroselösung in 0,1 molarer Succinatpufferlösung.

Anm.

Eine Einheit der Invertaseaktivität entspricht der Menge an Enzym, die 1 μΜοΙ Glucose/min bei 55°C und einen pH-Wert von 5,0 freisetzt

030 250/318

Beispiel 18

1,0 g gemäß Beispiel 15 eingesetztes hydrophiles Pullulan-Gel werden in 40 ml Wasser eingetragen. Nach Zusatz von 1,0 g Bromcyan wird das Gemisch unter Kühlung bei 4° C gerührt Der pH-Wert wird durch tropfenweise Zugabe von 5 η Natronlauge auf 11,0 eingestellt Unmittelbar nachdem der pH-Wert nicht weiter abnimmt, wird das Gel abfiltriert und rasch mit 0,1 molarer Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0 gewaschen. Das so erhaltene hydrophile, mit Bromcyan aktivierte Gel wird in 10 ml einer 0,1 molaren Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen, die 80 mg Pronase E enthält Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gelinde geschüttelt Zur Desaktivierung der nicht umgesetzten aktiven Gruppen wird das erhaltene immobilisierte Enzym mit dem lOfachen Volumen Wasser gewaschen und hierauf in eine I.Omolare Ethanolaminlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und mehrmals mit 0,1 molarer Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,0, die 1 molar Natriumchlorid ist, 0,1 molarer Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0, die 1 molar Natriumchlorid ist sowie kaltem Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 33 mg

ίο Pronase E/g trockenes Gel gebunden sind Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird mittels eines pH-stat-Geräts unter Verwendung von DL-Lysinmethylester als Substrat bei 40⁰C, einem pH-Wert von 6,0 und einer Substratkonzentration von 10 Gewichtsprozent gemessen. Sie beträgt 2,76 μΜοΙ/ mg · min. Dies entspricht 46% der spezifischen Aktivität des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung.

Claims

28 06
ι R₁ R₁ 5 674 2 man ein hydrophiles oder ionisierbares PuIIu- ionischen Bindungsmethode oder dwch kova- das hydrophile Pullulan-Gel durch Vernetzen / / Sm
Bedeutung hat, oder einem Salz dieser Verbin Ian-Gel als Träger verwendet und daß man die lente Verknüpfung bewirkt, wobei von Puiiuian mit einer difunktioneüen Verbin Patentansprüche: -N oder N R₂ dung, oder mit einer Verbindung der allgemei Immobilisierung der Enzyme an dem Träger nach dung der allgemeinen Formel I nen Formel IV der a) 1. Immobilisierte Enzyme, dadurch gekenn
zeichnet, daß sie nach der ionischen Bindungs R, R₁ HaI-CH₂-CH₂-(NH-CH₂-CH₂J_n-NH, Χ—Υ—Ζ (I) methode oder durch kovalente Verknüpfung immo 10 (IV) bilisiert worden sind und sie unter Verwendung eines darstellt, wobei Ri, Rj und Rj Wasserstoffatome, hergestellt worden ist, in der X und Z hydrophilen oder ionisierbaren Pullulan-Gels herge Methyl-, Ethyl-, Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- in der η den Wert 0,1, 2 oder 3 hat und Hai ein Halogenatome oder Epoxygruppen darstellen stellt worden sind, wobei oder Phenylgruppen bedeuten, oder einem SaI/ Halogenatom ist, oder einem Salz dieser und Y einen gegebenenfalls durch Sauerstoff dieser Verbindung, oder mit einer Verbindung Verbindung hergestellt worden ist atome substituierten aliphatischen Rest mit 1 a) das hydrophile Pullulan-Gel durch Vernetzen der allgemeinen Formel III Ii bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet, und von Pullulan mit einer difunktionellen Verbin 2. Verfahren zur Herstellung der immobilisierten das ionisierbare Pullulan-Gel durch Umsetzen dung der allgemeinen Formel I Enzyme nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet. des hydrophilen Pullulan-Gels in Gegenwart X, \ r_} (CH₂I_n Z₁ (III)
■·\ ^ daß einer Base entweder mit einer Verbindung der Χ—Υ—Ζ (I) in der X₃ die Gruppe Hal—(QWi)_n,-. wobei Hai b) allgemeinen Formel Il ein Halogenatom ist und mden Wert I₁2 oder 3 20 X₁-R-Z, (II) hergestellt worden ist, in der X und Z hat, oder X₂ die Gruppe Halogenatome oder Epoxygruppen darstellen in der Xi ein Halogenatom oder eine Ethylen- und Y einen gegebenenfalls durch Sauerstoff CII₂ CH (CH₂)_r oxidgruppe, R einen linearen, gegebenenfalls atome substituierten aliphatischen Rest mit 1 O durch eine Hydroxylgruppe substituierten Alky bis 3ö Kohlenstoffatomen bedeutet, und darstellt, wobei ρ den Wert 1,2 oder J hat. π den 25 lenrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Z, b) das ionisierbare Pullulan-Gel durch Umsetzen Wert 0. I. 2 oder 3 hat und Zi die vorstehende eine Carboxyl-, Phosphorsäure-, Sulfonsäure- des hydrophilen Pullulan-Gels in Gegenwart oder Guanidinogruppe eine Gruppe der allge einer Base entweder mit einer Verbindung der meinen Formel allgemeinen Formel II JO R, R, X₁-R-Z₁ (II) N oder -N-R₂ in der Xi ein Halogenatom oder eine Ethylen- \ oxidgruppe R₂ R., Yt CH, CH- darstellt, wobei Ri, Rj und Rj Wasserstoffatome, \* /
/ Methyl-, Ethyl-, Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- O oder Phenylgruppen bedeuten, oder einem Salz R einen linearen, gegebenenfalls durch eine 40 dieser Verbindung, oder mit einer Verbindung Hydroxylgruppe substituierten Alkylenrest mit der allgemeinen Formel III
1 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Zi eine X₂-I- f ICH₂I_n Z₁ (III) Carboxyl-, Phosphorsäure, Sulfonsäurc- oder ''V Guanidinogruppe, eine Gruppe der allgemeinen in der X₂ die Gruppe Hai—(CH2)_m—■ wobei Hai !■"ormel 4Ί ein Halogenatom ist und m den Wert 1,2 oder 3 hat, oder X2 die Gruppe , CH₂ CH (CH₂),, I c/ j darstellt, wobei pdcn Wert I, 2 oder 3 hat, π den 3 V' ",", Wl h'l

Wert O₁1, 2 oder 3 hat und Zi die vorstehende Bedeutung hat, oder einem Salz dieser Verbindung, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IV

5 HaI-CH₂-CH₂-(NH-CH₂-CH₂J_n-NH₂

OV)

in der η den Wert 0,1₁2 oder 3 hat und Hai ein Halogenatom ist, oder einem Salz dieser Verbindung hergestellt worden ist

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Pullulan mit einem Molekulargewicht von 1 χ 10⁴Ws 1 χ 10* einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I