DE2818086C2 - Trägermaterial zum Unbeweglichmachen von Enzymen und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents
Trägermaterial zum Unbeweglichmachen von Enzymen und Verfahren zu dessen HerstellungInfo
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Description
wobei das auf den Carboxymethylgruppen beruhende Kationenaustauschvermögen 0,5 mäq/g trockenes
Harz oder mehr, und das auf den Amino- oder Ammoniumgruppen beruhende Anionenaustauschvermögen
is 1 mäq/g trockenes Harz oder mehr betragen.
2. Trägermaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Oberfläche des Harzes
5 m2/g trockenes Harz oder mehr beträgt.
3. Trägermaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Porendurchmesser
der Poren des Harzes 0,015 bis 0,1 μΐη beträgt.
4'r-Trägermateria] nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gesamtvolumen
der Makroporen mit einem Durchmesser von 0,01 bis 0,2 μΐη 0,2 cmVg trockenes Harz oder mehr beträgt.
mit der allgemeinen Formel I
XCH2COOY (I)
wobei X für ein Halogenatom und Y für ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall steht, in Gegenwart von
V3-2 Mol pro Mol der Verbindung der allgemeinen Formel I von Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxiden
oder organischen Aminen mit einem makroporösen, anionenaustauschenden, synthetischen Harz umge
setzt wird, das ein Anionenaustauschvermögen von 1 mäq/g trockenes Harz oder mehr;
eine spezifische Oberfläche von 1 m2/g trockenes Harz oder mehr; und
ein Gesamtvolumen an Makroporen mit einem Durchmesser von 0,01 bis 0,2 μΐη von 0,1 cmVg
trockenes Harz oder mehr aufweist; wobei das Harz umfaßt,
a) ein phenolisches Harz mit primären, sekundären und/oder tertiären Aminogruppen oder quaternären
Ammoniumgruppen als anionenaustauschende Gruppen und primären, sekundären Aminogruppen und/oder Hydroxygruppen als funktionell Gruppen zur Umsetzung mit der
40 Verbindung der allgemeinen Formel I, oder
b) ein Polystyrol- oder Polyvinylchloridharz mit primären und/oder sekundären Aminogruppen als
anionenaustauschende Gruppen und primären, sekundären Aminogruppen und/oder Hydroxygruppen
als funktioneile Gruppen zur Umsetzung mit der Verbindung der allgemeinen Formel I.
6. Verfahren nach Anspruch S, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Verbindung in einer Menge von
2Zi bis 3 Teile auf 1 Teil trockenes Harz eingesetzt wird.
Die Erfindung betrifft Trägermaterialien zum Unbeweglichmachen von Enzymen (solche Trägermaterialien
werden auch als »Enzymimmobilisierungsträger« bezeichnet) und ein Verfahren zu deren Herstellung.
In der Fachwelt ist eine große Anzahl von Trägermaterialien zum Unbeweglichmachen von Enzymen
bekannt. Hierzu gehören Polysaccharide und deren Derivate. Sie weisen zahlreiche Nachteile auf, insbesondere
eine mäßige bis schlechte mechanische Festigkeit.
Sofern Enzyme über ionische Bindungen an ionische Polysaccharidderivate angebracht sind, werden
viele Enzyme von den Reaktionslösungen oder den Produktlösungen mit bereits mäßig hoher Elektrolytkonzentration
leicht abgelöst.
von Enzymen bekannt geworden (vgl. J. Amer. Chem. Soc. 81,5133-5136 (1959)). Hier ist jedoch der Anteil
an pro Gewichtseinheit Trägermaterial unbeweglich gemachtem Enzym sehr klein, und die Aktivität des
erhaltenen, unbeweglich gemachten Enzyms ist sehr gering, so daß der praktische Wert dieser Präparate von
der Fachwelt als sehr gering eingestuft worden ist.
Aus der DE-OS 24 37 870 sind organische Polymere bekannt, die sich als Träger fur biologisch aktive
Materialien eignen. Sie weisen Imidatketten auf, die eine Verknüpfungsreaktion mit dem biologisch aktiven
Material eingehen können.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Trägermaterialien zum Unbeweglichmachen von Enzymen, welche
pro Gewichtseinheit Trägermaterial große Anteile an Enzymen unbeweglich zu machen vermögen, wobei die
unbeweglich gemachten Enzyme eine hohe Aktivität und eine lange Lebensdauer bzw. Beständigkeit aurweisen
sollen, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist mit den Merkmalen der Patentansprüche 1 uad S angegeben.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien besitzen hohe mechanische Festigkeit und Beständigkeit gegen
Mikroorganismen. Desweiteren weisen an diese gebundene Enzyme eine ehr lange Lebensdauer auf.
Damit man ein im hohen Ausmaß mit Carboxymethylgruppen (CM-Gruppen) substituiertes Harz erhält, ist es
wesentlich, das Harz bis weit in die Innenbereiche der Makroporen hinein mit der Reaktionslösung zu benetzen.
Monochloressigsäure und deren Natriumsalz werden als Reagenticn zur Einführung der CM-Gruppen
besonders bevorzugt. Bevorzugt wird ein Anteil von V3 bis 3 Teile Reagens der allgemeinen Formel I auf
1 Teil trockenes Harz.
Als Alkalimetallhydroxide werden z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, als Erdalkalimetallhydroxide
z. B. Magnesiumhydroxid, Calciumhydroxid und als organische Amine z. B. Triethylamin eingesetzt. Unter
diesen Verbindungen wird Natriumhydroxid ganz besonders bevorzugt.
Vorzugsweise beträgt das Gesamtvolumen der Makroporen mit einem Durchmesser von 0,01 bis 0,2 μη
0,2 cnrVg trockenes Harz oder mehr. Die spezifische Oberfläche wird nach dem Stickstofi-Adsorptionsverfahren
bestimmt und nach dem BET-Verfahren errechnet. Der Porendurchmesser und das Porenvolumen werden
mit einem Porosimeter bestimmt, das auf der Basis des Eindringens von Quecksilber arbeitet; bei den ermittelten
Meßergebnissen wird davon ausgegangen, daß die Makroporen zylindrische Form haben mit einem
kreisförmigen Querschnitt. Poren mit einem Durchmesser von mehr als 0,2 μτη tragen zur Stabilisierung der
unbeweglich gemachten Enzyme nicht bei, da der Durchmesser dieser Poren viel größer ist als die Abmessungen
der Enzyme. Der bevorzugte mittlere Porendurchmesser beträgt vorzugsweise 0,015 bis 0,1 μτη.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten makroporösen, anionenaustauschenden synthetischen
Harze sind übliche Handelsprodukte oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind einige handelsübliche, im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare
Anionenaustauscher sowie deren physikalische und chemische Eigenschaften aufgeführt.
Handels | Matrix | lonen- | Funktionelle | Spez. | Gesamt | Mittl. | Ionen- |
name des | austauschende | Gruppen für die | Oberfl. | poren- | Poren- | ausUusch- | |
Harzes | Gruppen | CM-Substitution | Bereich | Volumen·) | durchm. | vermögen | |
(m!/g) | (cmVg) | (μ.ΓΠ) | (meq/g) | ||||
Duolite | phenolisch | tertiarisiertes | -OH | 68,1 | 0,563 | 0,025 | 4,38 |
A-4 | Produkt aus PoIy- | ||||||
äthylenpolyimin | |||||||
Duolite | phenolisch | tertiarisiertes | -OH | 24,6 | 0,600 | 0,040 | 5,31 |
A-6 | Produkt aus PoIy- | ||||||
äthylenpolyamin | |||||||
Duolite | phenolisch | Polyäthylenpoly- | -OH, -NH2 | 31,6 | 0,534 | 0,042 | 7,10 |
A-7 | amin | -NHR | |||||
Duolite | phenolisch | teilw. tertiarisier | -OH,-NHR | 95,3 | 0,680 | 0,029 | 4,24 |
S-37 | tes Produkt aus | ||||||
Polyäthylenpoly- | |||||||
amin | |||||||
Duolite | phenolisch | durch Umsetzung | -OH | 90,3 | 0,605 | 0,034 | 1,49 |
S-30 | mit jS-Diäthyl- | ||||||
aminoäthylchlorid- | |||||||
hydrochlorid ein | |||||||
geführte Diäthyl- | |||||||
aminoäthylgruppen | |||||||
Amberlite | Polystyrol | Polyäthylenpoly- | -NH2, -NHR | 2,2 | 0,128 | 0,146 | 3,90 |
IR-45 | amin | ||||||
Diaion | Polystyrol | Polyäthylenpoly- | -NH2, -NHR | 4,6 | 0,290 | 0,033 | 4,20 |
WA-20 | anrn | ||||||
Diaion | Polystyrol | Polyäthylenpoly- | -NH2, -NHR | 5,1 | 0,325 | 0,056 | 4,75 |
W-21 | amin | ||||||
Sumi- | Polyvinyl | Polyäthylenpoly- | -NH2, -NHR | 15,0 | 0,375 | 0,140 | 4,12 |
chelate | chlorid | amin | |||||
KA-800 |
Anmerkung:
worden.
·) Gesamtporenvolumen der Makroporen mit einer Porengröße von 0,01 bis 0,1 μην
Die mechanische Festigkeit nimmt unzureichende Werte an, wenn die spezifische Oberfläche und das
Gesamtporenvolumen zu groß werden; aus diesem Grund beträgt die spezifische Oberfläche vorzugsweise
120 mVg trockenes Harz oder weniger, das Gesamtporenvolumen vorzugsweise 80% oder weniger des Gesamtvolumens
des Harzes.
s Im erfindungsgemäßen Verfahren betragt die als Lösungsmittel eingesetzte Wasserr.ienge im allgemeinen
1 bis 10 Mol pro Mol Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxid. Außerdem soll ein mit Wasser mischbares nichtwäßriges
Lösungsmittel zugesetzt werden, um das Vermischen der Reaktionspartner zu fordern, beispielsweise
Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxin, Tetrahydrofuran. Die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise 500C
oder weniger, um das Auftreten von Nebenraktionen möglichst gering zu halten, besonders bevorzugt S bis
ίο 3O0C. Zweckmäßigerweise wird mit einer solchen Rührgeschwindigkeit gerührt, daß die Reaktionspartner gut
durchmischt werden, ohne daß das Harz zerbrochen wird.
Das auf die CM-Gruppen zurückgehende lonenaustauschvermögen beträgt vorzugsweise 1,0 meq/g
trockenes Harz oder mehr.
Das Unbeweglichmachen von Enzymen auf dem erfindungsgemäßen Trägermaterial ist sowohl über
Das Unbeweglichmachen von Enzymen auf dem erfindungsgemäßen Trägermaterial ist sowohl über
is kovalente Bindungen wie über Adsorption möglich, solange nicht reagiert habende Hydroxylgruppen, primäre
nachfolgenden Beispielen hervorgeht.
findungsgemäße Trägermaterial zuerst mit einer wäßrigen Säure oder einer alkalischen Lösung (jeweils in
0,02 bis 3 molarer Konzentration) aktiviert oder mit einer 0,02 bis 3 molaren Pufferlösung behandelt, deren
Pufferwirkung in der Nähe des pH-Wertes liegt, wo das unbeweglich zu machende Enzym gut arbeitet; die erfindungsgemäßen
Trägermaterialien werden gut mit Wasser gewaschen und daraufhin in eine Enzymlösung
eingetaucht, so daß auch die inneren Bereiche der Makroporen mit der Enzymlösung benetzt werden; hierzu
kann das Gemisch nach Bedarf gerührt werden; nachdem an dem Harz eine ausreichende Menge Enzym
unbeweglich gemacht worden ist, wird das erhaltene Produkt filtriert und mit Wasser gewaschen. Für das Unbeweglichmachen
durch ein Adsorptionsverfahren soll die Temperatur bei 400C oder darunter liegen; bevorzugt
werden Temperaturen bei 100C oder darunter, sofern das unbeweglich zu machende Enzym nicht ein
besonders wärmebeständiges Enzym ist. Die erhaltenen Präparate enthalten gewöhnlich 100 mg oder mehr
Enzymprotein pro g Harz; diese Präparate sind beständig, solange sie nicht mit einer Salzlösung von sehr
hoher Ionenstärke gewaschen werden. Zu den Enzymen, die an den erfindungsgemäßen Trägermaterialien
unbeweglich gemacht werden können, gehören nicht nur diejenigen Enzyme, die aus einfachen Proteinen
bestehen, sondern auch solche Enzyme, die Coenzyme erfordern; weiterhin kann nicht nur eine einzige Sorte
von Enzymen aufgebracht werden, sondern es ist möglich, gleichzeitig zwei oder noch mehr verschiedene
Sorten von Enzymen unbeweglich zu machen. Da die erfindungsgemäßen Trägermaterialien amphoter sind,
können sowohl Enzyme aus sauren Proteinen wie Enzyme aus basischen Proteinen daran unbeweglich gemacht
werden.
Beim Unbeweglichmachen der Enzyme über ein übliches Verfahren, das kovalente Bindungen erzeugt,
wird die Reaktivität von noch im erfindungsgemäßen Trägermaterial enthaltenden Hydroxylgruppen, primären
Aminogruppen oder sekundären Aminogruppen ausgenutzt. Übliche Verfahren zur Ausbildung kovalenter
Bindungen sind beispielsweise:
(1) Die Anbringung über s-Triazinyl-Derivate, wobei Cyanuchlorid oder dessen Derivate eingesetzt werden;
(2) die Anbringung unter Verwendung von Glutaraldehyd;
(3) die Anbringung über Azidbrücken; und
(4) die Anbringung unter Verwendung von Monohalogenacelyl-Derivaten.
an unbeweglich gemachten Enzymen pro Gewichtseinheit Trägermaterial gewöhnlich kleiner als im Falle des
so die unbeweglich gemachten Enzyme eine höhere spezifische Aktivität und Beständigkeit in Anwesenheit
von Elektrolyt-Lösungen hoher Konzentration aufweisen.
Es können beliebige Enzyme an den erfindungsgemäßen Trägern unbeweglich gemacht werden, ausgenommen
solche, deren Enzymaktivität beim Unbeweglichmachen verlorengeht. Zu den einsetzbaren Enzymen
gehören z. B. Pronase, Amino-acylase, Glucose-isomerase, Lactase, Nuklease, jß-Amylase, Isoamylase,
Pullulanase, Urease, Deaminase, Lipase, Esterase, Trypsin.
Die Bestimmung des Trockengewichts des Harzes erfolgt nach dem nachfolgenden Verfahren:
Die Ionenaustauscherharze werden in ihre OH-Form bzw. Η-Form überführt; danach werden die Harze bei 600C im Vakuum länger als 6 Stunden getrocknet; anschließend läßt man die Harze so lange stehen, bis sie bei Raumtemperatur (18 bis 2S0C) für eine Zeilspanne von mehr als 2 Stunden ein konstantes Gewicht M) zeigen; anschließend werden die Harze gewogen. Sofern im Rahmen dieser Unterlagen das Gewicht von Harzen und Trägermaterialien angegeben ist, beziehen sich diese Angaben stets auf das Trockengewicht, das nach dem oben angegeben Verfahren ermittelt ist, sofern nicht besondere Angaben gemacht sind.
Das lonenaustauschvermögen wird nach dem nachfolgenden Verfahren bestimmt:
Die Ionenaustauscherharze werden in ihre OH-Form bzw. Η-Form überführt; danach werden die Harze bei 600C im Vakuum länger als 6 Stunden getrocknet; anschließend läßt man die Harze so lange stehen, bis sie bei Raumtemperatur (18 bis 2S0C) für eine Zeilspanne von mehr als 2 Stunden ein konstantes Gewicht M) zeigen; anschließend werden die Harze gewogen. Sofern im Rahmen dieser Unterlagen das Gewicht von Harzen und Trägermaterialien angegeben ist, beziehen sich diese Angaben stets auf das Trockengewicht, das nach dem oben angegeben Verfahren ermittelt ist, sofern nicht besondere Angaben gemacht sind.
Das lonenaustauschvermögen wird nach dem nachfolgenden Verfahren bestimmt:
austauschverrnögen durch Neuiraiisaiiunsiiiration gemessen; der Wert des Austauschvermögens wird pro
des Kationenaustauschvermögens wird das Harz in seine Η-Form überführt und anschließend die gleichen
sind, hat natürlich das nunmehr gemessene Anionenaustauschvermögen einen kleineren Wert als das ursprüngliche
Harz, was auf die Gewichtszunahme durch die Einführung der CM-Gruppen zurückzuführen ist.
10,0 g Duolite A-7 werden in 70 ml Methanol eingebracht; der Aufschlämmung wird eine konzentrierte
Lösung von 6,23 g Natriumhydroxid in 7 ml Wasser zugesetzt; nachdem das Gemisch gut gerührt worden ist,
wird entgast; während das Gemisch mit Eiswasser gekühlt wird, wird 35 min lang an eine Wasserstrahlpumpe
angeschlossen, um das Harz bis weit in die inneren Bereiche der Makroporen hinein zu benetzen. Anschließend
wird eine Lösung von 8,68 g Monochloressigsäure in IO ml Methanol zugesetzt; unter langsamem Rühren läßt
man bei Raumtemperatur (24 ± 1°C) 7 h lang reagieren.
Nachdem die Reaktion beendet ist, wird das Harz nacheinander mit Wasser, 0,5 m wäßriger Natriumhydroxid-Lösung,
Wasser, 0,5 m wäßriger Salpetersäure-Lösung, Wasser, 0,5 m wäßriger Natriumhydroxid-Lösung,
Wasser und 0,5 m wäßriger Salpetersäure-Lösung gewaschen; abschließend wird ausreichend mit
Wasser gewaschen. Durch, diese Behandlung wird das Harz in seine Η-Form übergeführt: is
Gewichtszunahme durch CM-Substitution 3,87 g (= 38,7%) Amino-Anionenaustauschvermögen 5,17 meq/g Harz.
Die Vorbereitung des Harzes wird analog zu Beispiel 1 durchgeführt. Nachdem das Harz 3 Std. lang
entgast worden ist, wird eine Lösung von 1,42 g Natriumhydroxid und 3,35 g Monochloressigsäure in
einem Lösungsmittelgemisch aus 5 ml Wasser und 10 ml Methanol zugesetzt; anschließend läßt man
4 h lang reagieren.
10 g Duolite A-6 werden in eine Lösung von 11 g Natriummonochloracetat in einem Lösungsmittelgemisch
aus 10 ml Wasser und 60 ml Methanol eingebracht; während die Aufschlämmung mit Eiswasser gekühlt
wird, wird 20 min lang an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen, um die Aufschlämmung zu entgasen. Anschließend
wird eine Lösung von 6 g Natriumhydroxid in 8 ml Wasser zugesetzt; daraufhin läßt man bei
22 ± 2°C 6 h lang unter langsamem Rühren reagieren. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird das Harz
abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in seine Η-Form übergeführt. CM-Kationenaustauschvermögen
3,10 meq/g Harz; Gewichtszunahme 22,3%; Amino-Anionenaustauschvermögen 4,38 meq/g Harz.
In einer Vorbehandlung wird Doulite S-30 sorgfältig mit Säure, Lauge und Wasser gewaschen und daraufhin
getrocknet; 10 g dieses Materials werden in 35 ml einer wäßrigen Lösung mit 7,2 g Natriumhydroxid eingebracht.
Während die erhaltene Aufschlämmung mit Eiswasser gekühlt wird, wird 40 min lang an eine Wasserstrahlpumpe
angeschlossen, um die Aufschlämmung zu entgasen; anschließend werden ungefähr 35 ml
Wasser zusätzlich zugesetzt. Daraufhin werden unter Rühren im Verlauf von 2 h 50 ml einer wäßrigen Lösung
mit 18,1 g jS-Diäthylaminoäthylchlorid-Hydrochlorid zugesetzt, während die Aufschlämmung von Harz in
Natriumhydroxid-Lösung bei Raumtemperatur von 22 ± 1°C gehalten wird. Die Reaktion wird für weitere
7 h fortgesetzt, so daß insgesamt eine Resktionsdauer von 9 h erhalten wird. Nach Ablauf der 9 h wird das Harz
filtriert, mit 0,5 m wäßriger Salpetersäure-Lösung, 0,5 m wäßriger Natriumhydroxid-Lösung und daraufhin mit
Wasser gewaschen; unmittelbar anschließend (ohne Trocknung) wird die CM-Substitution wie folgt durchgeführt:
Das gesamte erhaltene Harz wird in eine Lösung von 6,6 g Natriumhydroxid in einem Lösungsmittelgemisch
aus 5 ml Wasser und 40 ml Äthanol eingebracht; unter Kühlung mit Eiswasser wird die Aufschlämmung
30 min lang gerührt; daraufhin werden 70 ml einer Methanol-Lösung mit 13 g Natrium-Monochloracetat
zugesetzt; unter langsamem Rühren läßt man 7 h lang bei 21 ± 2°C reagieren. Nachdem die Reaktion beendet
ist, wird das Harz zweimal entsprechend der nachfolgenden Schrittfolge gewaschen, nämlich mit Wasser, 0,5 ml
wäßriger Natriumhydroxid-Lösung, Wasser und 0,5 m wäßriger Salpetersäure-Lösung; daraufhin wird das erhaltene
Produkt in 2 Anteile aufgeteilt. Der eine Anteil wird wiederholt mit Wasser gewaschen, um das Harz
in die Η-Form überzuführen. Der andere Anteil wird ein weiteres mal mit 0,5 m wäßriger Natriumhydroxid-Lösung
gewaschen und daraufhin wiederholt mit Wasser gewaschen, um das Harz in eine OH-Form überzuführen.
CM-Kationenaustaschvermögen 1,85 meq/g Harz; auf die eingeführten Diäthyiaminoäthylgruppen
zurückführbare Anionenaustauschvermögen 1,49 meq/g Harz.
Obgleich das Anionenaustauschvermögen unmittelbar nach der Umsetzung mit Diäthylaminoäthylchlorid
nicht gemessen worden ist, ist es offensichtlich, daß es vor der Einführung der Carboxymethylgnippen mehr als
1,49 meq/g Harz betragen hat Wenn dieses amphotcre, ionenausUuschende Harz als Trägermaterial für das
Unbeweglichmachen eingesetzt wird, wird das gesamte Harz in seine Η-Form übergeführt.
In der nachfolgenden Tabelle 2 sind die Reaktionsbedingungen für das Einfuhren der CM-Gruppen in Harze
mit anionenaustauschenden Amino-Gruppen zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Harze sowie deren
S Eigenschaften aufgeführt. Vor der Durchfuhrung der erfindungsgemäßen Reaktion werden die ausgewählten
Harze in eine alkalische Lösung oder in eine Lösung mit dem CM-Reagenz eingebracht; anschließend wird
die Lösung, während sie mit Eiswasser gekühlt wird, 30 bis 60 min lang entgast. Zur Bestimmung des auf die
CM-Gruppen zurückführbaren Kationcnaustauschvermögens werden die erfindungsgemäßen Harze durch
Waschen analog Beispiel 1 in ihre U-Form überführt. Zur Bestimmung des Amino-Anionenaustauschver-
lü mögens werden die erfindungsgemäßcn I larze nach Durchführung der CM-Substitution durch Waschen in ihre
OH-Form überführt.
Bei | Harz | Reaktionsbedingungen | Menge NaOH |
Menge ClH2COOH |
Menge H2O |
Menge CHjOH |
Reaktions- Temp. |
Reaktions dauer |
Ergebnisse | Anionen- austausch- vermögen (Amino-Gruppen) |
spiel | (jeweils Handels namen) |
Menge Harz |
(g) | (g) | (ml) | (ml) | (0C) | <h) | Kationen- austausch- vermögen (CM-Gruppen) |
(meq/g Harz) |
(K) | (meq/g Harz) | |||||||||
5 | Duolite A-4 |
6 | Duolite AA |
7 | Duolite A-7 |
8 | Duolite S-37 |
9 | Diaion WA-21 |
10 | Sumichelate KA-800 |
11 | Diaion WA-20 |
12 | Amberlite IR-45 |
9,9
5,0
6,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
3,3
4,0
1,71
7,5
9,0
9,0
9,0
9,0
8,73
8,5')
5,26')
8,5
5,0
5,5
4,0
4,0
ungerähr 120 |
21+2 | 7 |
ungefähr 50 |
25 ±1 | 6 |
ungefähr 80 |
23±2 | 6,5 |
ungefähr 150 |
25±2 | 7,0 |
ungefähr 100 |
22 ±1 | 7,0 |
ungefähr 100 |
20 ±2 | 7,0 |
ungefähr 120 |
20 ±2 | 7,0 |
ungefähr 120 |
20 ±2 | 7,0 |
') Lösung von Natrium-Monochloracetat in Aceton;
:) GesamUustauschvermögen, nachdem das Produkt zweimal unter den angegebenen Bedingungen gewaschen worden ist;
') Lösungsmittel Äthanol.
2,43
2,15
3,56
2,85
2,15
3,56
2,85
0,97
1,1O2)
1,1O2)
1,11
1,352)
1,352)
0,61
0,742)
0,742)
0,55
0,682)
0,682)
3,78 3,62 5,60
3,57
4,45 4,322)
3,85
3,722)
4,01 2
3,66 3,582)
t—» OO
O OO ON
Versuch 1
800 mg Lactase aus Aspergillus Oryzae (mit einer Aktivität des gelösten Enzymes von 24,1 μΜοΙ/mg · min
bei pH 4,5 und 40°C gegenüber einem Substrat von 13,3 w/v% gereinigter Lactose) werden in 40 ml, ungefähr
bei 4°C gehaltener 0,02 m Acetatpuffer-Lösung (pH 5,5) gelöst. In diese Lösung werden 4,0 g nach Beispiel
1 hergestelltes CM-substituierles Duolite A-7 eingebracht; zum Unbeweglichmachen des Enzyms hält
man 16 h lang bei ungefähr 4°C und rührt bei 80 U/min. Nach Beendigung der Reaktion wird das Produkt
sorgfältig mit 0,05 m Acetatpuffer-Lösung (pH 4,5) gewaschen, bis sich in der Waschlösung Enzymprotein
nicht länger nachweisen läßt. Aus dem Proteingehalt der Waschlösung (nach dem Lowry-Verfahren bestimmt)
wird für den Anteil an unbeweglich gemachtem Enzym ein Wert von 149 mg/g Trägermaterial errechnet.
Das unbeweglich gemachte Enzym hat eine spezifische Aktivität von 4,8 μΜοΙ/mg · min, was aus dem Anteil
an erzeugter Glukose errechnet wird, wenn man das unbeweglich gemachte Enzym bei 400C und einem
is pH-Wert von 4,5 15 min lang mit 13,3 w/v% gereinigter Lactose als Substrat bei 80 U/min rührt.
Ein Anteil von 3,0 g unbeweglich gemachtes Enzym wird in eine mit einem Heizmantel versehene Säule
gepackt (Innendurchmesser der Säule 12 mm); mit einer Raumgeschwindigkeit von 2,3 h '' wird eine Lösung
von 7 w/v% gereinigter Lactose in 0,02 m Acetatpuffer (pH 4,5) durch die Säule geführt, welche bei einer
Temperatur von 400C gehalten wird. Durch Analyse der im Eluat enthaltenen Glukose wird eine 100%ige
Spaltung der Lactose festgestellt. Sofern eine Lactose-Lösung gleicher Konzentration 100 Tage lang fortlaufend
unter den gleichen Bedingungen durch die Säule geführt wird, beträgt die Lactosespaltung am 100. Tag
immer noch 100%. Das bedeutet, die Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms hat überhaupt nicht
abgenommen. Sofern die angegebene Bestimmung der spezifischen Aktivität 25mal wiederholt wird, wobei
ungefähr 100 mg unbeweglich gemachtes Enzym eingesetzt werden, beträgt die Aktivität bei der 25. Be-Stimmung
4,7 μΜοΙ/mg · min, was bedeutet, daß die Aktivität auch bei dieser absatzweisen Methode nicht
abgenommen hat.
Versuch 2
1200 mg der in Versuch 1 angegebenen Lactase werden in 60 ml 0,05 m Acetatpuffer-Lösung (pH 5,5) gelöst.
In diese Lösung werden 6 g des nach Beispiel 2 erhaltenen CM-substituierten Doulite-A-7 eingebracht;
zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird 6 Std. lang bei 20 ± 2°C gehalten, während die Lösung mit ungefähr
180 U/min gerührt wird. Nach Beendigung der Reaktion wird das unbeweglich gemachte Enzym analog zu
Versuch 1 gewaschen. Aus dem Proteingehalt der Waschlösung wird ein Anteil von 170 mg/g Harz unbeweglieh
gemachtes Enzym errechnet. Entsprechend den Bedingungen nach Versuch 1 wird für das unbeweglich
gemachte Enzym eine spezifische Aktivität von 5,2 μΜοΙ/mg · min ermittelt. Das unbeweglich gemachte
Enzym wird in zwei gleiche Anteile aufgeteilt. Der eine Anteil wird in eine mit einem Heizmantel versehene
Säule (Innendurchmesser 14 mm) gepackt, und die in Versuch 1 angegebene Lösung mit gereinigter Lactose
bei einer Raumgeschwindigkeit von 8,0 h'1 durch die Säule geführt. Mit diesem unbeweglich gemachten
Enzym wird eine 95%ige Spaltung der Lactose erhalten. Die Lactosespaltung wird fortlaufend 30 Tage lang
mit der gleichen Säule durchgeführt. Am 30. Tag wird eine Lactosespaltung von 94% festgestellt. Das heißt,
im Bereich der geringfügigen experimentellen Fehlerquellen hat die Aktivität des unbeweglich gemachten
Enzyms auch nach einer ununterbrochenen Versuchsdauer von 30 Tagen überhaupt nicht abgenommen.
45 Versuch 3
Die andere Hälfte der nach Versuch 2 erhaltenen unbeweglich gemachten Lactase (das entspricht etwa 3 g
Trägermaterial) wird in eine mit Heizmantel versehene Säule (Innendurchmesser 14 mm) gepackt. Eine Lösung
von 12 w/v% gereinigter Lactose in der in Versuch 1 angegebenen Pufferlösung wird mit einer Raumgeschwindigkeit
von 5,0 h1 fortlaufend 30 Tage lang durch die Kolonne geführt. Aus dem Glukosegehalt des Eluates
wird nach 2tägiger Versuchsdauer eine Lactosespaltung von 91 ±2,5% errechnet, was bedeutet, daß die
Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms praktisch nicht abgenommen wird.
Versuch 4 55
600 mg Lactase aus Aspergillus Oryzae (Aktivität des gelösten Enzyms 50,9 μΜοΙ/mg · min (bei pH 4,5
und 400C) gegenüber 13,3 w/v% gereinigter Lactose als Substrat) werden in 30 ml 0,05 m Acetatpuffer-Lösung
(pH 5,5) gelöst. In diese Lösung werden 3,0 g des nach Beispiel 5 erhaltenen CM-substituierten Duolite A-4
eingebracht; zum Unbeweglichmachen hält man das Gemisch 7 h lang bei ungefähr 20°C und rührt mit
180 U/min. Nach Beendigung der Reaktion wird das unbeweglich gemachte Enzym analog zu Versuch 1 gewaschen.
Der Anteil an unbeweglich gemachtem Enzym beträgt 118 mg/g Trägermaterial. Entsprechend den
in Versuch 1 angegebenen Bedingungen wird eine spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms
von 9,2 μΜοΙ/mg · min gemessen. Dieses unbeweglich gemachte Enzym wird in eine mit Heizmantel
versehene Säule (Innendurchmesser etwa 13 mm) gepackt und die in Versuch 1 angegebene Lösung von gcreinigter
Lactose bei einer Raumgeschwindigkeit von 5,0 h ' fortlaufend 30 Tage lang durch die bei 600C gehaltene
Säule geführt. Auch nach Ablauf von 30 Tagen wird eine lOO'/iige Lactosespaltung festgestellt; eine
Verringerung der Enzymaktivität wird nicht beobachtet. Die kontinuierliche Lactosespaltung wird für weitere
20 Tage im wesentlichen unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt; abweichend wird lediglich die Raum-
geschwindigkeit auf 8,0 h ' erhöht. Auch unter diesen Bedingungen wird weiterhin eine 100%ige Spaltung
festgestellt. Das bedeutet, auch nach einer kontinuierlichen Versuchsdauer von SO Tagen ist überhaupt keine
Verminderung der Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms eingetreten.
Versuch 5
100 mg handelsüblich erhältliches Papain werden in 30 ml bei 40C gehaltener 0,02 m Phosphatpuffer-Lösung
(pH 6,2) gelöst. In diese Lösung werden 1,0 g nach Beispiel 16 erhaltenes CM-substituiertes Duolite A-4 eingebracht;
zur Reaktion hält man 10 h lang bei 4 bis 100C, wobei mit 150 U/min gerührt wird. Das Produkt wird
sorgfaltig mit 0,05 m Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,2), 0,1 m wäßriger Natriumchlorid-Lösung und im Ionenaustauscher
entionisiertes Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Waschlösungen werden vereinigt,
und nach dem Lowry-Verfahren der Proteingehalt bestimmt. Aus dem ermittelten Proteingehalt ergibt sich
ein Anteil von 76 mg unbeweglich gemachtes Enzym pro g Trägermaterial. Bei 400C und pH 6,2 wird
die spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms gegen 0,28 m N-Benzoyl-L-argininäthylester |
(BAEE) als Substrat mit einem bei konstantem pH-Wert arbeitenden Meßgerät bestimmt; es wird eine is ·'
spezifische Aktivität von 2,7 μΜοΙ/mg ■ min ermittelt, was einer Aktivität von 35% der spezifischen Aktivität
des ursprünglichen, gelösten Enzyms entspricht. Die oben angegebene Messung der spezifischen Aktivität
dieses unbeweglich gemachten Papains wird 15mal wiederholt; bei der 15. Messung werden immer noch
98% der ursprünglich ermittelten Aktivität festgestellt, was bedeutet, daß lediglich eine sehr geringe Aktivi- £-
tätsabnahme stattgefunden hat. Die oben angegebenen Messungen der Aktivitäten des unbeweglich gemachten 20 ~
Enzyms und des gelösten Enzyms erfolgten in Anwesenheit von 2 χ 10 ~3m Äthylcndiamintetraessigsäure,
5 χ 10"3 m Cystein und 0,1 m Natriumchlorid. 'M
Versuch 6
25
60 mg handelsüblich erhältliches, gereinigtes Trypsin werden in 15 ml bei ungefähr 4°C gehaltener 0,05 m ■
Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gelöst. Dieser Lösung werden 1,0 g des nach Beispiel 8 erhaltenen CM-substituierten
Duolite S-37 zugesetzt; zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird bei ungefähr 4°C die Lösung langsam
gerührt (ungefähr 60 U/min). Nach 10 h wird das unbeweglich gemachte Trypsin abfiltriert und gut mit
0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung, 0,1 m Natriumchloridlösung und destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge
gewaschen. Die Waschlösungen werden vereinigt und durch Bestimmung der Intensität einer charakteristischen '
Trägermaterial unbeweglich gemacht worden sind. Die spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten
Trypsin wird bei 300C und pH 7,5 in Abwesenheit von 0,02 m Calciumchlorid gegen BAEE als Substrat mit
dem genannten Meßgerät bestimmt; es wird eine spezifische Aktivität von 5,8 μ Mol/mg ■ min ermittelt,
was 22% der ursprünglichen Aktivität des gelösten Enzyms entspricht. An etwa 100 mg dieses unbeweglich
gemachten Trypsins werden die Messungen zur Bestimmung der spezifischen Aktivität 3mal unter den
oben angegebenen Bedingungen wiederholt; bei der 5. Messung wird eine spezifische Aktivität von
4,6 μ Mol/mg ■ min festgestellt.
40
Versuch 7
Es wird eine Lösung von 20 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,7) mit 125G Sumner-Einheiten handelsüblich
erhältlicher Urease hergestellt. Dieser Lösung werden 1,0 g des nach Beispiel 9 erhaltenen, CM-substituierten
Diaion WA-21 zugesetzt; zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird bei ungefähr 4°C 16 h lang 45 ι
gerührt (ungefähr 60 U/min). Anschließend wird das unbeweglich gemachte Enzym abfiltriert und sorgfältig [
mit 0,05 m Phosphatpufferlösung und daraufhin mit destilliertem Wasser gewaschen, bis im Filtrat Protein ;
nicht länger nachweisbar ist. Aus dem Proteingehalt der Waschwässer wird errechnet, daß 1 g Trägermaterial :;
382 Sumner-Einheiten unbeweglich gemachtes Enzym enthalten. Zur Bestimmung der Aktivität des unbeweglich
gemachten Enzyms wird die erforderliche Zeitspanne ermittelt, bis eine 0,1 m Phosphatpufferlösung so
mit 3,0 Gew.-% Harnstoff bei 2O0C ihren pH-Wert von 6,7 auf 7,7 ändert; hieraus wird ermittelt, daß 1 g Trägermaterial
eine Enzymaktivität von 412 Sumner-Einheiten aufweist.
Anmerkung (1): Eine Sumner-Einheit bezieht sich auf diejenige Menge En;tym, welche im Verlauf von
5 min in einer bei 200C und pH 7,0 gehaltenen Phosphatpuflerlösung so viel Harnstoff zersetzt, daß die Lösung
1 mg Ammoniak-Stickstoff enthält. ss
Verspch 8
255 mg aus Streptomyces sp. extrahierte und bis zu einer Aktivität von 36 000 gereinigte Glukoseisomerase
werden in 30 ml 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7,65) gelöst. Dieser Lösung werden 3,0 g des nach Beispiel 1
erhaltenen, CM substituierten Duolite A-7 zugesetzt. Zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird 9 h lang
bei Raumtemperatur (ungefähr 18°C) gerührt (ungefähr 120 U/min). Das erhaltene, unbeweglich gemachte
Enzym wird abfiltriert und gut mit 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 7,65) gewaschen. Aus der Aktivität des
Filtrates wird ermittelt, dall 1 g Trägermaterial eine Enzymaktivität von 9500 Einheiten aufweist, was einem
Anteil von 61 mg unbeweglich gemachtem Protein pro g Trägermaterial entspricht. Die erhaltene unbeweglich
gemachte Glukose-Isomerase wird in eine mit Heizmantel versehene Säule (Innendurchmesser
12 mm) gepackt, und eine 54 w/v% wäßrige Lösung von gereinigter Glukose (pH 7,65, mit 5 χ 10 * m
MgSO4 χ 7 H2O) wird mit einer Raumgeschwindigkeit von 2,0 h ' durch die bei 6O0C gehaltene Säule ge-
führt, wobei die Isomerisierung der Glukose stattfindet. Etwa SOO Std. nach Aufnahme der Isomerisierung
wird immer noch ein Umwandlungsgrad von SO bis 51% erhalten; bei fortschreitender Versuchsdauer nimmt
dieser Umwandlungsgrad schrittweise ab.
Anmerkung (2): Eine Einheit der Glukose-Isomerase bezeichnet diejenige Enzymmenge, welche in 0,05 m
s Phosphatpufferlösung mit 0,005 m MgSO4 χ 7 H2O und mit 0,1 m D-Glukoselösung als Substrat bei 70°C und
pH 7,0 innerhalb 1 h ' mg Fructose erzeugt.
Anmerkung (3): Die Bestimmung der Fructose erfolgt nach dem Cystein-Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren
wie es in JAS beschrieben ist.
10 Versuch 9
200 mg Pullulanase aus Aerobacter Aerogenes werden in 30 ml 0,02 m Acetatpufferlösung (pH 5,0) gelöst.
Der Lösung werden 3 g des nach Beispiel 9 erhaltenen CM-substituierten Diaion WA-21 zugesetzt Zum Unbeweglichmachen
des Enzyms wird bei ungefähr 100C 16 h lang langsam gerührt. Das unbeweglich gemachte
is Enzym wird abfiltriert, und aus der Aktivität der vereinigten Waschwässer wird ein Gehalt von 43 mg Enzym
pro g Trägermaterial ermittelt. Das gesamte unbeweglich gemachte Enzym wird in eine mit Heizmantel
versehene Säule (Innendurchmesser 12 mm) gepackt, und eine 1,0%'ige Lösung von gereinigtem Pullulan
(pH 5,0) wird 10 Tage lang mit einer Raumgeschwindigkeit von 1 h~' kontinuierlich durch die bei 400C gehaltene
Säule geführt. Mittels dem Somogyi-Nelson-Verfahren wird der Gehalt an Maltotriose in dem Elluat
bestimmt; hierbei wird festgestellt, daß im Verlauf der 10 Tage die Umwandlung in Maltotriose unverändert
95 ±4% beträgt.
Versuch 10
Analog zu Versuch 1 werden 600 mg der dort verwendeten Lactase an 3,0 g des nach Beispiel 11 erhaltenen,
CM-substituierten Diaion WA-20 unbeweglich gemacht. Das unbeweglich gemachte Enzym wird abfiltriert,
und aus dem Proteingehalt der Waschlösungen wird ein Anteil yon 98 mg unbeweglich gemachtes Enzym
pro g Trägermaterial errechnet. Unter den in Versuch 1 angegebenen Bedingungen wird eine spezifische
Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms von 4,5 μΜοΙ/mg · min ermittelt. An ungefähr 100 mg dieser
unbeweglich gemachten Lactase wird die Messung der spezifischen Aktivität 15 mal wiederholt, wobei zu
jeder Messung eine neue Lactose-Lösung eingesetzt wird; bei der 15. Messung wird eine Aktivität von
3,5 μΜοΙ/mg · min ermittelt. Daraus ist ersichtlich, daß das nach Beispiel 11 erhaltene Trägermaterial hinsichtlich
der Stabilität des unbeweglich gemachten Enzyms bei der Anwendung etwas schlechter ist, als
diejenige des nach Beispiel 1 erhaltenen Trägermaterials. Einer der Gründe hierfür kann darin liegen, daß
bei dem Material nach Beispiel 11 weniger CM-Gruppen eingeführt worden sind. Andererseits ist ersichtlich,
daß an dem nach Beispiel 11 erhaltenen Trägermaterial unbeweglich gemachte Enzyme eine größere
Stabilität (d.h. eine längere Lebensdauer) aufweisen, als das Produkt des nachfolgenden Vergleichsversuchs.
Im wesentlichen wird der Versuch 10 wiederholt; abweichend davon wird Diaion WA-20 als Trägermaterial
eingesetzt, da die aus Aspergillus-Oryzae gewonnene Lactase ein saures Protein darstellt. Nach den üblichen
Verfahren wird ein Gehalt von 79 mg unbeweglich gemachtes Enzym pro g Trägermaterial festgestellt. Die
spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms beträgt 3,6 μΜοΙ/mg ■ min. Die Messung der
spezifischen Aktivität wird lOmal wiederholt; hierbei ist die spezifische Aktivität bereits bei der 5. Messung
auf 1,4 μΜοΙ/mg - min abgefallen; bei der 10. Messung wird lediglich noch eine spezifische. Aktivität von
0,3 μΜοΙ/mg ■ min festgestellt. Hieraus ist ersichtlich, daß nach diesem Vergleichsversuch ein beständiges,
unbeweglich gemachtes Enzym, das den Anforderungen bei der industriellen Anwendung standhält, nicht
erhalten wird.
Versuch 11
2,0 g des nach Beispiel 6 erhaltenen, CM-substituierten Duolite A-4 werden in 20 ml 1 η Natriumhydroxid-Lösung
eingebracht. Die Lösung wird bei 4°C 15 min lang entgast und anschließend die überschüssige Alkalilauge
durch Filtiation entfernt. Das zurückbleibende Harz wird in 25 ml bei Raumtemperatur (ungefähr 200C)
gehaltenes Dioxan eingebracht und etwa 5 min lang gerührt; anschließend werden eine vorher zubereitete
Lösung von 4 g Cyanurchlorid in 20 ml Dioxan zugesetzt und daraufhin bei Raumtemperatur heftig gerührt.
Nach Ablauf von 3 min werden 25 ml kaltes Wasser zugesetzt und nach weiteren 5 see werden 25 ml Essigsäure
zugesetzt, um die Reaktion abzubrechen. Das Reaktionsprodukt wird filtriert, und das Harz unmittelbar
anschließend mit kaltem Wasser und kaltem Aceton gewaschen. Daraufhin wird das Harz in 30 ml 0,05 m
Phosphatpufferlösung (pH 7,8) eingebracht, welche 220 mg handelsüblich erhältliche Pronase E aus Streptomyces
Griseus enthält. Die Lösung wird bei ungefähr 4°C und pH 7,8 (was durch Zugabe von 0,2 η Natriumhydroxid-Lösung
gewährleistet wird) 5 h lang gehalten. Anschließend wird das unbeweglich gemachte
Enzym abfiltriert und sorgfältig mit eiskalter 1 m Natriumehlorid-Lösung, 0,1 m Phosphatpuffer-Lösung und ,;■·
eiskaltem Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, bis in der Waschlösung Protein nichgt langer nachweisbar ;V
ist. Es wird ein Enzymgehalt von 86 mg unbeweglich gemachtem Enzym pro g Trägermaterial ermittelt. Die
spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms beträgt bei 4Q3C und pH 6,0 gegen eine 20%ige y.
DL-Lysinmethylester-Lösung als Substrat 2,7 μ Mol/mg ■ min. ;>i
10 I
28 IS 086
Anschließend wird die Bestimmung der spezifischen Aktivität bei 4O°C und ph 6,0 ml mit 10%ider L-Lysinmethylester-Lösung
als Substrat wiederholt. Die Versuchsdauer pro Versuch wird auf 40 min festgesetzt, und
das Fortschreiben der Reaktion mittels einem bei konstantem pH-Wert arbeitendem Meßgerät bestimmt. Auf
diese Weise wird die Bestimmung der spezifischen Aktivität so Isng; wiederholt, bis die Reaktion auf den halben
Wert der ersten Reaktion abgenommen hat. Die dabei ermittelte Anzahl von Versuchen wird als »Halbwerts- s
zahl« bezeichnet Für dieses unbeweglich gemachte Enzym beträgt die Halbwertszahl 83.
Versuch 12
2 g des nach Beispiel 2 erhaltenen, CM-substituierten Duolite A-7 werden in Methanol eingebracht, mittels
gasförmigem Chlorwasserstoff in den Methylester umgewandelt, daraufhin mit Hydrazinhydrat zum Hydrazid
umgesetzt und schließlich mit 3%iger Natriumnitritlösung das Azid gebildet. Unmittelbar anschließend wird
das erhaltene Produkt in 20 ml PhosphatpufTerlösung eingebracht, welche 1000 Sumner-Einheiten kommerziell
erhältliche Urease (vertrieben von Tokyo Kasei Co.) enthält. Zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird unter
leichtem Rühren 16 h lang bei ungefähr 4°C gehalten. Daraufhin wird das unbeweglich gemachte Enzym mit
S m Natriumchloridlösung, 0,1 m PhosphatpufTerlösung (pH 6,7) und entionisiertem Wasser in dieser Reihenfolge
gewaschen. Mittels colorimelrischer Messung bei 200C gegen eine 3,0%ige Harnstofflösung als Substrat
wird für die spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms eine Aktivität von 290 Sumner-Einheiten
pro g Trägermaterial ermittelt. Diese Messung wird lOmal wiederholt, wobei kaum eine Abnahme der Aktivität
festgestellt werden konnte.
Versuch 13
2,0 g des nach Beispiel 4 erhaltenen CM-substituierten Duolite S-30 werden in 20 ml Dioxanlösung eingebracht,
welche 25 g Bromessigsäure enthält; anschließend wird bei Raumtemperatur 8 h lang langsam
gerührt. Daraufhin werden tropfenweise 17 ml Bromacetylbromid zugesetzt und nochmals 6 h lang gerührt.
Nach Beendigung der Reaktion wird das erhaltene Bromacetylierte Harz mi? eiskalter 0,1 m Natriumcarbonatlösung
und daraufhin mit eiskaltem Wasser gewaschen. Das erhaltene Harz wird in 0,2 m PhosphatpufTerlösung
(pH 85,) eingebracht, welche 100 mg Aminocyclase (Aktivität 15 000 Einheiten/g); zum Unbeweglichmachen
des Enzyms wird unter langsamem Rühren 18 h lang bei ungefähr 4°C gehalten. Das erhaltene unbeweglich
gemachte Enzym wird wiederholt gewaschen. Bei 37°C gegen 0,2 m N-Acetyl-DL-methioninlösung (pH 7,0,
mit 1 xlO'4 Mol CoCI5) als Substrat wird aus dem Anteil an gebildetem L-Methionin eine spezifische Aktivität
von 270 Einheiten pro g Trägermaterial ermittelt. Das gesamte unbeweglich gemachte Enzym wird in eine mit
Heizmantel versehene Säule (Innendurchmesser IO mm) gebracht und die gleiche N-Acetyl-DL-Methionin-Lösung
wird mit einer Raumgeschwindigkeit von 1,1 h ' kontinuierlich durch die bei 40°C gehaltene Säule
geführt. Nach Ablaufeines Tages beträgt das Ausmaß der Hydrolyse des L-Isomeren 99%; nach Ablauf von
10 Tagen war im wesentlichen keine Ahnahme der Enzymaktivität festzustellen.
Claims (1)
1. Trägermaterial zum Unbeweglichmachen von Enzymen, bestehend aus einem makroporösen,
amphoterea, synthetischen Ionenaustauscherharz mit einer spezifischen Oberfläche von 1 mVg trockenes
S Harz oder mehr unc" einem Gesamtvolumen an Makroporec mit einem Durchmesser von 0,01 bis 0,2 μτη
von 0,1 cmVg trockenes Harz oder mehr; wobei das Harz umfaßt
a) ein phenolisches Harz, das primäre, sekundäre und/oder tertiäre Aminogruppen oder quarternäre
Ammoniumgruppen als Anionen-Austauschergruppen und Carboxymethylgruppen als Kationen-Austauschergruppen
aufweist; oder
b) ein Polystyrol- oder Polyvinylchloridhart, das primäre und/oder sekundäre Aminogruppen als Anionen-Austauschergruppen,
und Carboxymethylgruppen als Kationen-Austauschergruppen aufweist,
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2818086A DE2818086C2 (de) | 1978-04-25 | 1978-04-25 | Trägermaterial zum Unbeweglichmachen von Enzymen und Verfahren zu dessen Herstellung |
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Publications (2)
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ID=6037958
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DE2818086A Expired DE2818086C2 (de) | 1978-04-25 | 1978-04-25 | Trägermaterial zum Unbeweglichmachen von Enzymen und Verfahren zu dessen Herstellung |
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JPS56140890A (en) * | 1980-04-04 | 1981-11-04 | Sumitomo Chem Co Ltd | Immobilized lactase and its preparation |
JPS5765183A (en) * | 1980-10-06 | 1982-04-20 | Sumitomo Chem Co Ltd | Sterilization and washing of immobilized lactase |
DE3112336A1 (de) * | 1981-03-28 | 1982-10-07 | Röhm GmbH, 6100 Darmstadt | "verfahren zur spaltung von milchzucker" |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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GB1485122A (en) * | 1973-08-06 | 1977-09-08 | Nat Res Dev | Biologically active matrices |
DE2540688C3 (de) * | 1975-09-12 | 1979-10-31 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von als Ionenaustauscher verwendbaren Ethern des Polyhydroxymethylens |
-
1978
- 1978-04-25 DE DE2818086A patent/DE2818086C2/de not_active Expired
Also Published As
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DE2818086A1 (de) | 1979-10-31 |
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