DE2413694C3

DE2413694C3 -

Info

Publication number: DE2413694C3
Application number: DE2413694A
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Ishimatsu; Shoji Kimura; Shigeki Shigesada
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1973-05-30
Filing date: 1974-03-21
Publication date: 1979-11-22
Also published as: GB1441543A; FR2231683A1; IT1017010B; NL7405654A; NL172762B; DE2413694B2; NL172762C; DE2413694A1; FR2231683B1

Description

Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterial, welches eine biologisch aktive Enzymsubstanz auf einem praktisch wasserunlöslichen Träger enthält, ein Verfahren zur Herstellung dieses unbeweglich gemachten Enzymmate-rials sowie ein Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen Umwandlung eines Substrats, bei dem dieses unbeweglich gemachte Enzymmaterial eingesetzt wird.

Bis heute sind zahlreiche verschiedene Aktivitäten unterschiedlicher Enzyme sowie daraus resultierende Verwendungszwecke in weitem Maß untersucht und erkannt worden. Diese Enzyme sind ihrer Natur nach Proteine und sind daher in Wasser löslich. Die Folge davon ist nati.rlich, daß die meisten dieser Enzyme während ihrer Anwendung gelöst werden und verlorengehen.

Es existieren zahlreiche Anwendungszwecke, bei denen Milcrobcnzellen. denen die Wachstumsfunktion fehlt, die jedoch enzymatische Aktivität haben (sogenannte ruhend»: Mikrocrganismenzellen). für verschiedene Enzvmreaktionen verwendet wurden. In diesem Fall sind zwar die Zellen selbst unlöslich, die in ihnen enthaltenen aktiven Enzyme werden jedoch im Laufe der Anwendung herausgelöst und gehen verloren. Damit solche Enzyme und Mikroorganismenzellen ihre biologische Ak'Jvität während langer Dauer beibehalten können, wurden in den letzten Jahren zahlreiche Versuche unternommen, sie in unbewegliche, auf einem wasserunlöslichen Träger angeordnete Substanzen zu überführen, urr ihre enzymatische Aktivität zu verlängern.

Die zu diesem Zweck bisher angewendeten Methoden sind jedoch im Hinblick auf die technische Anwendung mit folgenden verschiedenen Nachteilen behaftet:

1. Träger, deren Verwendung zusammen mit Enzymen zur Herstellung von unlöslich gemachten Enzymen unerläßlich ist, sind teuer.

94 13 fiQ4

% Die zur Reaktion zwischen den Trägern und Enzymen zur Herstellung dieser Materialien verwendeten Verfahren sind kompliziert.

3. Die auf diese Weise unlöslich gemachten Enzyme zeigen ausgeprägt niedere enzymatische Aktivität im Vergleich mit der Aktivität der gleichen Enzyme in der ursprünglichen Form vor dem Unlöslichmachen.

4. Die Substratspezifität, weiche die unlöslich gemachten Enzyme zeigen, weicht manchmal von der Substratspezifität ab, welche die gleichen Enzyme in ihrer ursprünglichen Forin vor dem Unlösliclimachen zeigen. Die Verringerung einer solchen Spezifität ist im Hinblick auf hochmolekulare Substrate besonders deutlich.

5. Zum Unlöslichmachen einer großen Vielfalt von Enzymen ist kein Träger universell anwendbar.

Ein Beispiel für diesen Stand der Technik ist das in der DE-OS 19 55 638 beschriebene Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Enzympräparaten. Bei diesem bekannten Verfahren werden zu einer wäßrigen Lösung eines Enzyms ein oder mehrere wasserlösliche Monomere gegeben, von denen mindestens eines im Laufe der Polymerisation zur Vernetzung befähigt ist, und das System wird danach bis zur Polymerisation von mindestens 80% der Monomeren mit Röntgenstrahlung oder Gamma-Strahlung hoher Dosis bestrahlt Es tut ferner möglich, vor der Polymerisation des oder der Monomeren ein festes poröses Trägermaterial, z. B. einen porösen Kunststoff oder Baumwollwatte, zuzugeben. Das bekannte Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Enzymen hat d.n Nachteil, daß, wahrscheinlich durch die Einwirkung der energiereichen Strahlung, die Aktivität der verw ndeten Enzyme stark vermindert wird. So beträgt die Aktivität des erhaltenen unbeweglich gemachten Enzymmaterials meist weniger als 10% der ursprünglichen Aktivität.

Unter diesen Umständen bestand seit langem ein Bedürfnis nach einer universellen Methode zur Herstellung von leicht zugänglichen und billigen hochaktivei unbeweglich gemachten Enzymmaterialien.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue unbeweglich gemachte Enzympräparate und ein technisch vorteilhaftes Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfugung zu stellen, bei dem die ursprünglichi.: enzymatische Aktivität in hohem Maß erhalten bleibt.

Es hat sich gezeigt, daß diese Aufgabe gelöst werden kann, indem man die Enzyme an Anionenaustausch^· harze mit spezifischen Gruppen bindet.

Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können Enzyme und Mikroorganismenzellen als Gastsubstan/ auf den in den Ansprüchen genannten Trägern in die unbewegliche Form übergeführt werden, wobei ihn; biologische Aktivität in hohem Maße beibehalten wird. Die Verwendung der so hergestellten Materialien ermöglicht es, daß verschiedene Enzym-Reaktionen in einem kontinuierlichen Reaktionssystem durchgeführt werden, was unter Verwendung von üblichen wasserlös liehen Enzymen nicht möglich war. Die Erfindung ist daher Von großer industrieller Bedeutung.

Die erfindungsgemäß verwendeten Träger könnern insbesondere mit den gewünschten Eigenschaften und im gewünschter Form hergestellt wenden, indem die Herstellungsbedingungen in geeigneter Weise eingestellt werden. Es ist daher für die Erfindung charakteristisch, daß die Träger in Übereinstimmung mit del" Ausbildung der Gefäße für die enzymatische Reaktion hergestellt werden, die den Arten der Enzyme und Mikroorganismenzellen, die unlöslich gemacht werden sollen, und den entsprechenden charakteristischen

Enzym-Reaktionen angepaßt sind, und daß unter Verwendung dieser Träger die unlöslich gemachten Enzym-Materialien hergestellt werden.

Das erfindmgsgemäße Verfahren zur Herstellung des unbeweglich gemachten Enzymmaterials utcfaßt folgende drei Verfahrensstufen:

1. Herstellung der Copolymeren,

2. Herstellung von wasserunlöslichen, zum Anionenaustausch geeigneten Matrix-Substanzen durch Quaternisieren der Pyridinringe dieser Copolymeren und

3. Hersteilung von unbeweglich gemachten Enzym-Materialien durch Kombination dieser Matrizen mit Enzymen oder Mikroorganismenzellen.

Die einzelnen Stufen des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden nachstehend ausführlicher erläutert

1. Herstellung des Copolymeren

Erfindungsgemäß geeignete Monomere werden nachstehend erläutert.
Zu Vinylpyridin und dessen Derivaten gehören 2-Vinylpyridin, 4-Vinylpyridin, 2-Methyl-5-vinyIpyridin, 5-Methyl-2-vinyIpyridm, 3-AIlyIpyridin und verwandte Verbindungen, wie 1-Vinylchinolin. Unter Berücksichtigung der Wirtschaftlichkeit und der Copolymerisierbarkeit mit anderen Monomeren ist es jedoch am wünschenswertesten, 4-Vinylpyridin, 2-Vinylpyridin und 2-MethyI-5-vinylpyridin zu verwenden. Zu anderen mit Vinylpyridin und dessen Derivaten copolymerisierbaren Monomeren gehören aromatische Vinylverbindungen, wie Styrol, a-MethylstyroI und halopr.nierte Styrole,

äthylenisch ungesättigte Verbindungen, wie Äthylen, Propylen, Acrylsäure, Methacrylsäure, Methylmethacrylat. Acrolein, Vinylacetat, Acrylnitril, Vinylchlorid, Acrylamid und N-Melhylolacrylamid, Diene, wie Butadien, Isopren und Chloropren, und Divinylverbindungen,

wie Divinylbenzol, Äthylenglycoldimethacrylat, PoIyäthylenglycoldimethacrylat, Butandioldiacrylat, Diallylphthalat und Methylenbisacrylamid.

Zu Polymeren, die bei der Pfropfcopolymerisation mit Vinylpyridin copolymejisierbar sind und die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, gehören Polybutadien, Polyisopren, Polychloropren, Styrol-Butadien-Copolymere, chloriertes Polyäthylen, Polypropylen. Polyvinylalkohol.
Die Herstellung von erfindungsgemäß verwendeten Copolymeren kann unter Verwendung irgendeiner der bekannten Copolymerisationsmethoden vorgenommen werden. Zur Herstellung von erfindungsgemäß verwendbaren Copolymeren ist es am wichtigsten, daß die anzuwendende Copolymerisationsmethode und die Art des zu verwendenden Monomeren in dieser Stufe so gewählt werden, daß die in der anschließenden Stufe durch Quaternisierung dieser Copolymeren gebüdetei Matrizen hydrophil sind und gleichzeitig in allen Lösungsmitteln, speziell in Wasser, unlöslich sind.

Im Hinblick auf diese Tatsache können die zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendbaren Copolymeren angewendeten Verfahren grob in folgende beide Klassen unterteilt werden:

OA 1 3 KQA

1. Statistische Copolymerisation

Wenn die Methode der radikalischen Copolymerisation, wie beispielsweise als Suspensionspolymerisation und Emulsionspolymerisation, für die Copolymerisation angewendet wird, werden Copolymere erhalten, in denen Vinylpyridin und andere Monomere statistisch angeordnet sind. Obwohl diese Copolymeren in Wasser unlöslich sind, werden sie wasserlöslich, wenn sie in der anschließenden Stufe zur Modifizierung des Polymeren der Quaternisierung unterworfen werden. Aus diesem Grund sollten Vinylpyridin und Divinylverbindungen als wesentliche Komponenten verwendet werden, wenn die Copolymerisation mit Hilfe dieser Methoden durchgeführt wird. In diesem Fall sind wünschenswerte Divinylverbindungen Divinylbenzol und (Poly)äthylenglycoldimethacrylat

Die Zusammensetzung und das Molekulargewicht von Monomeren, welche diese Copoiymeren bilden, sind nicht kritisch, sondern können frei in der Weise prnwsiilt werden Haft Hgj* vorgesehene 7«jä£L· A&r schließlich gebildeten Matrizen erfüllt wird. Aus praktischen Gründen liegt die Menge von Vinylpyridin oder dessen Derivaten, die in den statistischen Copolymeren vorliegen, im Bereich von 20 bis 99 Mol-%, vorzugsweise 50 bis 95 MoI-%, und die der Divinylverbindungen im Bereich von 0,5 bis 30 Mol-%, vorzugsweise 1 bis 20 Mol-%.

Zu bevorzugten Beispielen von Copolymeren, die mit Hilfe der statistischen Copolymerisationsmethode hergestellt werden können, gehören Vinylpyridin-Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, Vinylpyridin-Methylmetnacrylat-DivinylbenzoI-CopoIymere und Vinylpyridin-Äthylenglycoldimethacrylat-Copolymere.

2. Block- und Pfropf-Copolymerisation

Wenn zur Copolymerisation die Methoden der Block-Co^olymerisation und Pfropf-Copolymerisation angewendet werden, werden Copolymere erhalten, in denen Vinylpyridin und andere Monomere oder Polymere in Form von Blöcken angeordnet sind. Wenn diese anderen Monomeren oder Polymeren hydrophob sind, werden in der nachfolgenden Stufe der Polymermodifikation, in der die Copoljmeren quaternisiert werden, um die Hydrophilie der Vinylpyridineinheiten zu erhöhen, die Copolymerisate als ganzes hydrophil, bleiben jedoch im wesentlichen unlöslich in Wasser, weil die aus den anderen Monomeren gebildeten Bereiche des Polymeren immer noch ihre hydrophoben Eigenichaften beibehalten. In diesem Fall ist es daher nicht speziell notwendig. Vernetzungsmittel zu verwenden, wie Divinylverbindungen. Fm Fall der Block-Copolymerisation sind die wünschenswertesten Monomeren zur Copolymerisation mit Vinylpyridin Styrol und Methylmethacrylat. Im Fall der Pfropf-Copolymerisation gehören zu wünschenswerten Grundpolymeren Styrol-Butadien-Copolymere und chloriertes Polyäthylen. Die Art (Zusammensetzung) und das Molekulargewicht von Monomeren, die zur Herstellung der Copolymeren verwendet werden, können frei in der Weise gewählt werden, daß sie dem Eindverwendungszweck der gebildeten Endprodukte (Matrizen) genügen. Für praktische Zwecke liegt die Menge an Vinylpyridin oder dessen Derivaten, die in die Pfropf- und Blockeopolymeren einpolymerisiert werden soll, im Bereich von 25 bis 75 Mol-%, vorzugsweise 40 bis 60 Mol-%.

Konkrete Beispiele für bevorzugte Copolymere, die durch Block- und Pfropf-Copolymerisation gebildet werden, sind Vinylpyridin-Styrol-BIockcopolymere, Vinylpyridin-Methylmethacrylat-BIock-Copolymere und Pfropf-Copolymere aus Vinylpyridin und chloriertem Polyäthylen.

Welche Methode unter- den vorstehend erläuterten gewählt wird, hängt von der Art der Matrizen ab, die hergestellt werden sollen.

Wenn eine Matrize in amorpher Pulverform gewünscht wird, eignet sich für diesen Zweck ein Copolymeres, das durch radikalische Emulsions-Copolymerisation oder ionische Block-Copolymerisation gebildet wird. Wenn eine Matrize in Form von porösen Perlen erforderlich ist, eignet sich für diesen Zweck ein Copolymeres, das durch radikalische Suspensions-Copolymerisation gebildet wurde. Wird eine Matrize in Form eines Films gewünscht, so kann sie hergestellt werden, indem zuerst ein Copolymeres durch ionische Block-Copolymerisation oder Pfr^.-f-CopoIymerisation hergestellt wird und anschli'^Ocn'i ösls resultierende Copolymerisat mit Hilfe der Gießmethode zu einem Film verarbeitet wird.

Die Verfahren zur Herstellung der Copolymeren können daher so gewählt werden, daß sie der endgültigen Form Rechnung tragen, in der die unbeweglich gemachten Enzym-Präparate vorliegen sollen.

2. Herstellung des Trägers

Die Quaternisierung des Stickstoffatoms des Pyridinrings erfolgt am vorteilhaftesten durch Anwendung der Quaternisierungsreaktioii eines Amins mit Hilfe eines Halogenierungsmittels, speziell eines Halogenalkyl-Reagens. Zu wünschenswerten Alkylhalogeniden gehören Methylchlorid, Methylbromid, Propylbromid, Methyljodid und ähnliche Verbindungen.

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist die Verwendung von Alkylhalogeniden und Alkylsulfaten besonders wünschenswert im Hinblick auf die Wirksamkeit des Quaternisierungsvorgangs. Die Bedingungen der Quaternisierung lassen sich unverändert sehr leicht einstellen, wenn sie auch in \bhängigkeit von der speziellen Art der zu verwendenden Quaternisierungsmitte! variabel sind. Wenn beispielsweise ein Alkylhalogenid verwendet wird, kann der Pyridinring praktisch quantitativ quaternisiert werden, indem ein trockenes Polymeres und das Alkylhalogenid in ein druckempfindliches Gefäß gegeben werden und die Reaktanten vier bis fünf Stunden auf eine Temperatur von 70 bis 130° C erhitzt werden.

L>ie erfindungsgemäß hergestellten und verwendeten Träger, die Anionenaustauscherharze darstellen, können eine Gesamt-Anionenaustauschkapaüität in der Größenordnung von 1,5 bis 5,0 tnÄq/g haben. Insbesondere solche mit einer Kapazität in der Größenordnung von 2^ bis 4,5 ip ^q/g sind wünschenswert.

3. Herstellung des unbeweglich
gemachten Enzym-Materials

Zu typischen Enzymen und MikroorganismenzeHen, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen unbeweglich gemachten Enzym-Materialien verwendet weiden können, gehören bakterielle Protease, Aminoacylase,

Adenosindesaminase, AMP-Desaminase, Amidase, Λ-Amylase, /9-Amylase, Glucoamylase, Succinylglucoamylase, Laclatdehydrogenase, Trypsin, Papain, Ribonudease, Dextranase, Glucoseoxidase, Penicillinacylase, Chymotrypsin, Ficin, Pepsin, Cärboxypectidase, Streptokinase, Urease, Invertase, Maltase, Lactase, Lipase, Cellulasc, Catalase, Melibiase, Tyrosinase, Aspartase, Glucoseisomerase, Phenoloxidase und Racemase sowie Mikroorganismenzellen, welche die Aktivität dieser Enzyme beibehalten haben. Die Bindung der vorstehend beschriebenen verschiedenen Enzyme und der entsprechenden Mikroorganismenzellen an die vorstehend angegebenen Träger kann sehr leicht erfolgen, indem die Träger in wäßrige Lösungen der Enzyme oder wäßrige Suspensionen der Mikroorganismenzellen jeder gewünschten Konzentration in einem pH-Bereich eingebracht werden, in welchem die gewählten Enzyme und Mikroorganismenzellen stabil sind. Durch die

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dungsgemäß angestrebten unbeweglich gemachten Enzym-Materialien gebildet. Die Reaktion der Bindung ist innerhalb kurzer Zeit vervollständigt

Die Temperatur der Bindungsreaktion kann innerhalb eines weiten Bereiches gewählt werden, sofern sie unterhalb des Werts liegt, von dem an die Aktivität der Enzyme beeinträchtigt wird. Es ist wünschenswert, die Temperatur im Bereich von 5 bis 20° C zu wählen.

Wie vorstehend erläutert wurde, erfolgt die Bindung zwischen den Trägern und Enzymen oder Mikroorganismenzellen zur Herstellung der unbeweglich gemachten Enzym-Materialien mit Hilfe eines sehr einfachen Verfahrens unter milden Bedingungen, verglichen mit denen der üblichen Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet daher große technische Vorteile.

Bei der Reaktion der Bindung zwischen dem Träger und dem Enzym führt die Zugabe einer Substanz, die anschließend als Substrat für die enzymatische Reaktion dient, und eines Metallions, das dazu dient, diese enzymatische Reaktion zu beschleunigen, zu dem Reaktionssystem, dazu, daß in wirksamer Weise verhindert wird, daß die resultierenden unbeweglich gemachten enzvmatisch aktiven Substanzen in ihrer enzymatischen Aktivität verschlechtert werden.

Falls erforderlich, können die in vorstehender Weise hergestellten unbeweglich gemachten Enzym-Materialien mit Pufferlösungen gewaschen werden, die für die darin enthaltenen Enzyme geeignet sind, oder können mit gereinigtem Wasser gewaschen werden, um sie von nicht gebundenem Enzym zu befreien, und können danach durch Gefriertrocknung lyophilisiert werden, um sie in vollständig t^rockener Form während langer Dauer aufzubewahren.

Die biologische Aktivität dieser unbeweglich gemachten Enzym-Materialien wurde — mit den notwendigen Abwandlungen — mit Hilfe eines Verfahrens untersucht, das zur Bestimmung der Aktivität der ursprünglichen Enzyme vor dem Einbau in diese Materialien verwendet wurde, und die Lebensdauer dieser Aktivität wurde durch Analyse der kontinuierlichen Enzym-Reaktion unter Verwendung einer Füllkörperkolonne bestimmt. Dabei wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Enzym-Materialien ihre biologische Aktivität während langer Dauer beibehalten. Die erfindungsgemäßen unbeweglich gemachten Enzym-Materialien haben sich daher als ausgezeichnet erwiesen.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Träger zeigen zahlreiche Vorteile. So haben sie beispielsweise hohe Ionenaustauschkapazttät, zeigen hohe Hydrophilie trotz ihrer Unlöslichkeit in Wasser und anderen Lösungsmitteln; sie ermöglichen die Bindung einer großen Menge von Enzym und Mikroorganismenzellen; sie haben keine störende Wirkung auf die an sie gebundenen Enzyme (aufgrund der Neutralität des Grtindpolymeren des Trägers), und die in den Materialien vorliegenden Enzyme behalten die gleiche enzymatische Aktivität bei, welche die entsprechenden ursprünglichen Enzyme vor der Bindung an die Träger aufweisen.

Ein weiteres wesentliches Merkmal ist die Tatsache, daß das Enzym und der Träger nicht mit der Festigkeit einer bloßen ionischen Adsorption, sondern mit der Festigkeil einer covalenten Bindung aneinander gebunden sind, so daß das Enzym nicht leicht von dem Träger freigesetzt werden kann. Es wurde bestätigt, daß all diese Vorteile aus der speziellen Tatsache resultieren, ι Ω /^nnniwn-tsv«· ·>»·-*·*»nj-tnt atm··«-!»» riXr% ··»■ » I/a··»* η

dung von Vinylpyridin oder dessen Derivaten als Hauptkomponenten hergestellt wurden.

Enzyme und enzymatisch aktive Mikroorganismenzellen sind sehr wertvoll und haben daher ausgedehnte Verwendung für industrielle Anwendungszwecke gefunden. Da jedoch die Enzyme leicht in Wasser löslich sind, ist es unvermeidbar erforderlich, daß die enzymatischen Reaktionen anteilweise durchgeführt werden. Dk einmal für Reaktionen eingesetzten Enzyme bleiben in den Reaktionsgemischen gelöst und können daher nicht zur wiederholten Verwendung zurückgewonnen werden. Im Fall eines Enzym-Reaktionssystems, in welchem das Reakiionsprodukt die Reaktion stört, wird verhindert, daß die Reaktion über eine gewisse Grenze hinaus abläuft.

Wie vorstehend erläutert wurde, sind die üblichen Methoden der Enzymanwendung von zahlreichen Schwierigkeiten begleitet. Unter diesen Umständen hat man Methoden zum Unlöslichmachen von Enzymen und zum Unbeweglichmachen von Mikroorganismenzellen als wirksame Maßnahmen zur Lösung dieser Probleme erwartet.

So erlaubt speziell das Unlöslichmachen von Enzvmen und das Unbeweglichmachen von Mikroorganismenzellen, daß die resultierenden Präparate in einem zyklischen Verfahren während langer Dauer angewendet werden und daß die Enzym-Reaktionen in einem kontinuierlichen Vorgang durchgeführt werden. Die technischen Gebiete, auf denen Enzyme verwendet werden, können daher im Hinblick auf die Verfahrensso weise rationalisiert werden und im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit stark verbessert werden.

Da die Träger mit Hilfe eines rein chemischen Syntheseverfahrens hergestellt werden, können sie in einer reichen Vielfalt der Arten erhalten werden, indem die Polymerisationsmethode, die Bedingungen der Polymerisation und die Zusammensetzung des Monomergemisches in geeigneter Weise gewählt werden. Demnach können unbeweglich gemachte Enzym-Materialien in jeder beliebigen Form erhalten werden, welche den speziell verwendeten verschiedenen Reaktionsgefäßen angepaßt ist.

Unter den verschieden möglichen Reaktionsgefäßen ist eine Füllkörperkolonne (Kolonne mit Fülfkörperschicht) besonders wirksam. Bei Verwendung dieses speziellen Reaktionsgefäßes kann die gewünschte Enzym-Reaktion in einfacher Weise kontinuierlich und im wesentlichen automatisch während langer Dauer durchgeführt werden, indem lediglich die Kolonne mit

dem unbeweglich gemachten Enzym-Material, das in Form von Perlen oder Pulver hergestellt wurde, bis zu einer festgelegten Kapazität gefüllt wird und mit einem gegebenen Substrat in festgelegter Beschickungsrati: beschicht wird.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kolonne mit dem unbeweglich gemachten Enzym-Material in Verbindung mit einem inaktiven Verdünnungsmittel gefüllt.

Dieser Zusatz des Verdünnungsmittels dient dazu ^|0 mögliches Verstopfen oder KanalK'dung in der Kolonne zu verhindern und infolgedessen das Reaktionssystem in stabilem Zustand zu halten.

Zu Beispielen für zu diesem Zweck geeigneten Verdünnungsmitteln gehören Holzpulver, Glasperlen, Cellulosepulver, Kunststoffperlen, Diatomeenerde, CeIite und andere anorganische Substanzen. Es kann auch jede ähnliche Substanz verwendet werden, soweit sie inaktiv ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur kontinuierlichen Umwandlung eines Substrats eignet sich besonders gut zur Überführung von N-Acetyl-D-L-aminosäure in eine L-Aminosäure mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Aminoacylase, zur Umwandlung von Stärk«: in Glucose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoamylase, zur Überführung von Glucose in Fructose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoseisornerase, zur Überführung von Glucose in Gluconsäure mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoseoxydase, zur Umwandlung von Stärke i'i G'TCose mit Hilfe unbeweglich gemachter Succinylglu· coamylase oder zur Überführung von Saccharose in Glucose und Fructose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Invertase.

Beispiel 1

Herstellung von quaternisiertem
(2-Viny!pyridin-Styrol)-Blockcopolymerem

Ein Reaktor mit einem Fassungsvermögen von l,i Liter, aus welchem die Lutt vollständig mit irockenerr N2 verdrängt war, wurde mit 800 cm³ gereinigten Tetrahydrofuran und 55,2 cm³ (0,48 Mol) gereinigten Styrol (nachstehend als »St« bezeichnet) beschickt unc von außen gekühlt, bis die Temperatur des Inhalts au -20⁰C gefallen war. Danach wurden 2,0 Milliir.o n-Butyllithium dem Reaktorinhalt zugesetzt, um di( Polymerisation einzuleiten. Etwa 30 Minuten danach wurden 50,4 cm³ (0,48 MoI) gereinigtes 2-VinyIpyridii (nachstehend als »2-VP« bezeichnet) zugesetzt, und dir Reaktion wurde weitere 30 Minuten fortgesetzt. Danr wurde eine geringe Menge n-Propanol zugesetzt, un die Polymerisation zu unterbrechen, und das Reaktions gemisch wurde in eine große Volumenmenge Wasser eingeführt, um das gebildete Polymere abzutrennen Das erhaltene Polymere wurde dann getrocknet Dir Umwandlung betrug 100%. Die Analyse des Copolyme risats durch IR- und NMR-Spektroskopie zeigte, daf· 2-VP und St im wesentlichen äquimolar in einem der Block-Copolymerisation entsprechenden Muster ge bunden waren. Eine Glaskolonne mit einem Innendurchmesser von 3 cm wurde schichtweise mit 20 g des pulverförmiger! 2-VP-St-BIock-Copolymeren (Korngröße gemäß ASTM-Siefa mit 60 bis 100 mascherl} und dampfförmiges Methylbromid wurde während etwii 2 Stunden in einer Beschickungsrate von 100cm³/Mir..

durchgclcitct. Das so erhaltene quaternisierte Block· Copolymere zeigte eine Gewichtserhöhung von 7 g, die anzeigte, daß die entsprechende Menge Methylbromid gebunden worden war. Dieses Copolymere blieb ungelöst ifi Tetrahydrofuran, Methanol und Wasser. Es zeigte sich, daß es eine Anionenaustauschkapazität von etwa 3,j rriÄq/g hatte. Diese Anionenaustauschkapazität wurde mit Hilfe der Silbernitrat-Titrationsmethode bestimmt.

Beispiel 2

Durch Wiederholung der Verfahrensweise des Beispiels 1, mit der Abänderung, daß 0,72 Mol 2-VP und 0,24 Mol St verwendet wurden, wurde ein quaternisiertes Block-Polymeres hergestellt. Es wurde gefunden, daß das resultierende Copolymere eine Anionenaustauschkapazität von 4,6 mÄq/g hatte.

Beispiel 3

Durch Wiederholung der Verfahrensweise gemäß Beispiel 1, mit der Abänderung, daß 0,24 Mol 2-VP und 0,72 Mol Sn verwendet wurden, wurde ein quaternisiertes Block-Copolymeres hergestellt Das resultierende Copolymerisat zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 2,5 mÄq/g.

Beispiel 4

Herstellung eines quaternisierten statistischen

(2-Vinylpyridin-Styrol-Divinylbenzol)-Copolymeren

Ein Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 2 Liter, in welchem die Luft mit trockenem N2 verdrängt war, wurde zuerst mit 1000 g Wasser und 10 g Polyvinylalkohol als Suspensionsstabilisator und danach mit 250 g 2-VP und 250 g Styrol und 10 g Divinylbenzol (nachstehend ais »DVBz« bezeichnet) beschickt. Der Reaktorinhalt wurde unter Rühren bei einer Temperatür von 70°C gehalten. Dann wurden 2 g Benzolperoxid zugesetzt, um die Polymerisation zu initiieren. In etwa 20stündiger Reaktion wurde ein Copolymeres erhalten, welches in Form von Perlen auskristallisierte. Das Copolymere wurde durch Filtration abgetrennt, gründlieh mit Methanol und Wasser gewaschen und getrocknet Der Umsatz betrug 95%. Die Elementaranalyse zeigte, daß dieses Copolymere Styrol und 2-Vinylpyridin in äquimolaren Mengen enthielt und eine vernetzte Struktur hatte. In einen Autoklav aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 500 cm³ wurden 100 g des statistischen (2-VP-St-DVBz)-Copolymeren in Form von Perlen (Siebgröße entsprechend einem ASTM-Sieb mit 10 bis 100 Maschen) und 100 g Methylbromid gegeben und 5 Stunden bei 80°C umgesetzt Am Ende der Reaktion wurde der Autoklavinhalt von nicht umgesetztem Methylbromid befreit, und das Reaktionsprodukt wurde getrocknet Das so erhaltene quaternisierte Polymere zeigte einen Gewichtsanstieg von 40 g, wodurch angezeigt wurde, daß die entsprechende Menge an Methylbromid gebunden worden war. Dieses Polymere erwies sich als unlöslich in allen Lösungsmitteln und zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 3,6 mÄq/g.

Beispiel 5

Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholen der Verfahrensweise des Beispiels 4 erzielt, jedoch mit der Abänderung, daß 375 g 2-VP und 125 g St verwendet wurden. Das resultierende Copolymere zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 4,5 mÄq/g.

Beispiel 6

Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, indem die Verfahrensweise des Herstellungsbeispiels 4 wiederholt wurde, mit der Abänderung, daß 375 g 4-Vinylpyridin (als »4-VP« bezeichnet) anstelle von 2-VP und 125 g Methylmethacrylat (nachstehend als »MMA« bezeichnet) anstelle von Styrol verwendet wurden. Das resultierende Copolymere zeigte eine AnionenaustauschkaDazität von 4,3 mÄq/g.

Beispiel 7

Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholung der Verfahrensweise des Herstellungsbeispiels 4 erzielt, mit der Abänderung, daß 20 g Äthylenglycoldimethacrylat (nachstehend als »EDMA« bezeichnet) anstelle von Divinylbenzol verwendet wurden. Es zeigte sich, daß das resultierende Copolymere eine Anionenaustauschkapazität von 3,5 mÄq/g hatte.

Beispiel 8

Ein Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 2 Liter, in welchem die Luft mit trockenem Stickstoff verdrängt war, wurde zuerst mit 1000 g reinem Wasser und 30 g Natrium-Fettsäureseife als Emulgator und danach mit 250 g 4-VP, 250 g St und 10 g DVBz beschickt Ferner wurden 1,5 g t-Dodecylmercaptan als Molekulargewichts-Modifiziermittel zugegeben. Der Reaktorinhalt wurde unter Rühren bei einer Temperatur von 5ö"C gehauen. Dann wurueu 5,5 g Kaliumpersulfat als Katalysator zugegeben, um die Polymerisc'.ion einzuleiten. Nach etwa 20stündiger Polymerisation wurde das gebildete Polymere durch Zugabe von 2 Liter Aceton aus dem Reaktionsgemisch ausgefällt. Das ausgefällte Polymere wurde durch Filtration abgetrennt, gründlich mit reinem Wasser gewaschen und getrocknet Der Umsatz wurde zu 90% festgestellt. Die Elementaranalyse zeigte, daß dieses Copolymere St und 4-VP in äquimolaren Mengen enthielt und eine vernetzte Struktur hatte. Dann wurden 100 g des in vorstehender Weise hergestellten pulverförmigen Polymeren (Korngröße entsprechend einem ASTM-Sieb mit 100 bis 200 Maschen) mit Methylbromid quaternisicrt, wobei die Verfahrensweise des Beispiels 4 wiederholt wurde. Das resultierende Polymere erwies sich als unlöslich in allen Lösungsmitteln und hatte eine Anionenaustauschkapazität von 3,4 mÄq/g.

Beispiel 9

Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholung der Verfahrensweise des Hersteüungsbcispicls S erzielt, mit der Ausnahme, daß 375 g 2-VP anstelle von 4-Y? und 125 g MMA anstelle von St verwendet wurden. Das resultierende Polymere zeigte eine Anionenaustausehkapazität von 4,5 mÄq/g.

Die Herstellung von unbeweglich gemachten Enzym-Präparaten gemäß der Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben.

Beispiel 10

Herstellung eines unbeweglich gemachten

Aminoacylase-Präparats

2 g des in dem Herstellungsbeispiel 1 erhaltenen quaternisierten Block-Copolymeren (Teilchengröße entsprechend einem ASTM-Sieb mit 60 bis 100 Maschen) wurden über Nacht in 100 cm^J einer 0,1 m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gelegt, und das resultierende gepufferte Polymere wurde abfiltriert, um als feuchtes Trägermaterial verwendet zu werden. Dann wurde dieser feuchte Träger einer Lösung zugesetzt, die durch Auflösen von 1 g einer handelsüblichen Aminoacylase (Aktivität 10 000 E/g) aus einer Spezies des Genus Aspergillus in 100 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gebildet war und in dieser Lösung suspendiert. Die Suspension wurde 2 Stunden bei 4⁰C gerührt. Danach wurde die Suspension zentrifugiert, und der resultierende Niederschlag wurde mehrere Male mit 0,1 m Phosphatpufferlösung vom pH 8.0

jo gewaschen. Der so erhaltene Niederschlag wurde schließlich lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 2,3 g. Die Proteinkonzentration in der überstehenden Flüssigkeit die bei der vorstehend beschriebenen Reaktion erhalten wurde, wurde mit Hilfe des Lowry-Verfahrens (J. Biol.

Chem., 193, 26 [1951]) analysiert, wobei gezeigt werden konnte, daß sie völlig frei von Protein war. Dies zeigt klar die Tatsache an, daß die gesamte Menge der verwendeten Aminoacylase an den Träger gebunden wurde. Dann wurde die enzymatische Aktivität des so erhaltenen unbeweglich gemachten Aminoacylase-Präparats nach folgender Methode geprüft- ein Gemisch aus 10 mg der Testprobe, 1 cm³ reinem Wasstr, 2 cm³ euicf G₁I in Fnosphaipuffciiüsurig vun pü o,G unu i ».in-' 0,1 m N-Acetyl-DL-methionin (pH 8,0, enthaltend 5,0xl0-⁴m Co⁺+) wurde 30 Minuten bei 37°C gebrütet Das freigesetzte Methionin wurde durch Colorimetrie mit Hilfe von Ninhydrin bestimmt Die Aktivitätseinheiten wurden unter der Annahme angegeben, daß die Einheit 1 Einheit/g, der Menge entspricht

so die zur Bildung von 1 μ Mol Methionin aus 1 g einer gegebenen Probe unter festgelegten Bedingungen entspricht Es wurde gefunden, daß das in diesem Beispiel erhaltene unbeweglich gemachte Aminoacylase-Präparat eine Aktivität von etwa 1500 Einheiten/g hatte.

Beispiele 11 bis 14

Die nachstehende Tabelle 1 zeigt verschiedene unbeweglich gemachte Aminoacylase-Materialien, die unter Verwendung verschiedener Träger erhalte . wurden, die in den vorstehend angegebenen Beispielen zur Herstellung der Träger erhalten wurden. Die Bedingungen des Unlöslichmachens und die Methode iur Bestimmung der enzymatischem. Aktivität, die in Beispiel 10 beschrieben sind, wurden auch in diesem Fall mit erforderlichen Modifizierungen angewendet

13

14

Tabelle Beispiel Beispiel der

Trägerhcrstellung

Zusammensetzung des Ausgangspolymeren

Ausbeute des
unbeweglich
gemachten
Produkts

(E)

Anteil der

gebundenen

Aminoacylase

Aktivitätseinheiten des Enzyms

11 2 2-VP-St-Block-Copolymeres 3,0 100 2500

12 4 2-VP-St-DVBz-Copolymeres 2,0 100 800

13 5 2-VP-St-DVBz-Copolymeres 2,5 95 1700

14 6 4-VP-MMA-DVBz- 2,7 100 2100

Copolymeres

*) Die Wer'e in dieser Spalte Würden erhalten, indem die Pro&inkonzeritration der obenstehenden Flüssigkeit der jeweiligen

Reaktionsgemische mit Hilfe des Lowry-Verfahrens geprüft wurde,

**) Die Werte in dieser Spalte wurden erhalten, indem die Bestimmung unter Verwendung von N-AcetyNDL-methionin als Substrat durchgeführt wurde.

Beispiele 15 bis

Herstellung von unbeweglich gemachten Glucoamylase-Präparaten

In Tab(,!.ie 2 sind bevorzugte Ausführungsformen des Rhizopus auf verschiedenen Trägern gezeigt, die in den Unbeweglichmacherts einer handelsüblichen Glucoamy- angegebenen Beispielen zur Trägerhersteilung erhalten läse (Aktivität 5000 E/g) aus einer Spezies des Genus wurden.

Tabelle

Beispiel

Beispiel der Trägerher stellung

Träger

Zusammensetzung des Ausgangspolymeren

Glucoamylase

verwendete Menge

15	1	2-VP-St-Block-
		Copolymeres
16	2	2-VP-St-Block-
		Copolymeres
17	5	2-VP-St-DVBz-
		Copolymeres
18	6	4-VP-MMA-DVBz-
		Copolymeres
19	7	2-VP-St-EDMA-
		Copolymeres
20	8	4-VP-St-DVBz-
		Copolymeres

Jeder Träger, 2 g, wurde mit 0,1-m Acelatpufferlösung (pH 4,5) gepuffert und in einen feuchten Träger übergeführt.

g Glucoamylase wurden in 100 m! 0,1-m Acetatpufferlösung (pH 4,5) gelöst.

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Beispiel

Bedingungen des Unbeweglichir.achens

Ausbeute an unbeweglich gemachtem Produkt	Anteil der gebundenen Gluco amylase	Einheiten der Enzym aktivität
(g)	(%)**)	(E/g)*)
2,3	50	400
2,6	70	500
2,5	65	430
2,5	68	450
2,4	65	400
2,0	53	280

Jeder feuchte Träger wurde zu der Glucoamylaselösung gegeben und 2 Std. bei 4 C gerührt, um die Umsetzung zu gewährleisten. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, der Niederschlag mehrere Male mit 0,1-m Acetatpufferlösung (pH 4,5) gewaschen und dann lyophilisiert.

Der Anteil der gebundenen Glucoamylase wurde bestimmt, indem die Proteinkonzentration in der überstehenden Flüssigkeit des jeweiligen Reaktionsgemisches mit Hilfe des Lowry-Verfahrens geprüft wurde.

Die enzymalische Aktivität wurde nach folgender Methode bestimmt Ein Gemisch aus 10 mg einer gegebenen Probe, 1 cm³ reinem Wasser und 9 m³ einer 0J>6%igen Lösung von löslicher Stärke (in 0,1-m Acetatpulfer von pH 4,5) wurde 30 Minuten bei 40 C bebrütet Das resultierende Gemisch wurde mit Hilfe der DNS-Melhode auf reduzierenden Zucker geprüft. Die Aktivitälseinheiten wurden angegeben, indem als Einheit. 1 E/g, die Menge angenommen wurde, die 10 mg reduzierenden Zucker aus I g einer gegebenen Probe unter festgesetzten Bedingungen erzeugt

Beispiele 21 bis 16

Herstellung von unbeweglich gemachten Glucoseisomerase-Präparaten

In Tabelle 3 sind bevorzugte Ausführungsformen für das Unlöslichmachen handelsüblicher Mikroorganismenzellen gezeigt, die Glucoseisomeraseaktivität zeigen (Aktivität 1000 GIE) und einer Spezies des Genus

Tabelle 3

Streptomyces angehören. Dabei wurden verschiedene Träger verwendet, die in den vorstehend angegebene« Beispielen zur Trägerherstellung erhalten wurden.

Beispiel

Beispiel
der Trägerher
stellung

Träger

Zusammensetzung des Ausgangspolymeren

Glucoamviase

verwendete Menge

2-VP-St-DVBz-Copolymeres (60 bis 100 Maschen)

4-VP-MMA-DVBz-CopolymeresUOO bis 200 Maschen)

4-VP-St-DVBz-Copolymeres (100 bis 200 Maschen)

2-VP-MMA-DVBz-Copolymeres (200 bis 400 Maschen)

0,5 g jedes Trägers wurden mit 0,1-m PhosphatpufTerlösung von pH 8,0 gepuffert und iii einen feuchten Tager übergeführt.

2,0 g Zellen (0,8g Feststoffe) wurden in 100 cm³ Wasser suspendiert

Tabelle 3 (Fortsetzung)

Beispiel

Bedingungen des Unbcwcglichmachens Ausbeute an
unbeweglich
gemachtem
Produkt

Anteil an Einheiten gebundenem der Enzym und Enzym-Zcllcn aktivität

(GIU)")

Jeder feuchte Träger wurde zu der Zcllsuspension gegeben, und es wurde 2 Stunden bei 4 (" gerührt, um die Reaktion zu gewährleisten. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgcniisch zentrifugiert, und der Niederschlag wurde mehrere Male mit Wasser gewaschen und dann lyophilisicrt 1.2 1.1 ι ι

100
HKI
100
100

700 800 700 850

Die Werlc des Anteils an gebundenem I n/ym und gebundenen /eilen wurde fcslgestclll. indem die I'roleinkon/enlralinn der überstehenden Flüssigkeit der Reaktionsgemische nach dem I.nwry-Vcrfahren geprüft wurde Die En/ymaklivilal wurde mil Hilfe eines modifizierten Inkasaki-Vcr^ralircns hcslimmt (Agricultural Hmlogical Chemistry. Vol.30. 1248 [1 WiOl( Die Aktnitalscinhcilcn wurden angegeben, indem als l-inheit. I (ill . die Menge angenommen wurde, die zur Hildunp .im I nip I ructnse aus 1 μ einer pcpcbcncn Probe während CiO Minuten bei 70 ( führt

IJ e i s ρ i e I e 25 bis 28
Herstellung von verschiedenen unbeweglich gcmachlen tirizym-Präparaten

Tabelle 4 /cipi hevor/iigli· Ausfühningsformen Kir das Unbcwi-plictimarhcn von Gliicnscoxidasc. alkali scher Proton··· und Invcriasc auf vcrv hirricncn Trägern, die in den angegebenen Beispielen der Triigerhcrslcllung erhallen worden waren.

909 647/222

17

Tabelle

Beispiel	Beispiel der Träger herstellung	Träger Zusammensetzung des Ausgangspolymeren	verwendete Menge	Enzym Art	und Zellen Art der Ver wendung
25	5	2-VP-St-DVBz-Copolymeres (60-100 Maschen)	(D	(2)	(3)
26	4	2- VP-St-D VBz-Copolymeres (60-100 Maschen)	(4)	(5)	(6)
27	6	4-VP-MMA-D VBz-Copolymeres (100-200 Maschen)	(4)	(5)	(6)
28	5	2-VP-St-DVBz-Copolymeres (60-100 Maschen)	(7)	(8)	(9)

Tabelle 4 (Fortsetzung)

Beispiel

Bedingungen des Unbeweglichmachens

Ausbeute an Anteil an Einheiten

unbeweglich gebundenem der Erizym-

gemachtem Enzym und aktivität

Produkt Zellen

(GIE)

Jeder Enzymlösung wurde der gepufferte feuchte Träger zugesetzt, dann wurde 2 Stunden bei 4 C" gerührt, um die Reaktion zu gewährleisten. Nach der Reaktion wurde das Reaklionsgemisch zentrifugiert, und der erhaltene Niederschlag wurde mehrfach mit Wasser gewaschen lyophilisiert.

2,1	60	lOOO²)
2,2	75	1600¹)
2,5	100	3000¹)
2,4	85	5OOO⁴)

(1) 2g Träger wurJe mit 0,1-m AcetatpufTer (pH 5,5) gepuffert

(2) Glucoscnxidase (der Sigma Chemical Company, Type II, Aktivität: 18 900 E/g).

(3) I g Fn/ym wurde in 100ml 0,1-m AcetalpulTer (pH 5.5) gelöst

(4) 2g Träger wurden mit 0,1-m I'hosphatpulTer (pH 8.0) gepuffert.

(5) Alkalische Protease (Ilandclsprodukt, Aktivität: 30000 E/g)

(6) I g In/ym wurde in 100ml (1.1-m Phosphatpuffer (pH 8.0) gelöst

(7) 2g Trager wurden mit 0,1-m AcclatpufTer (pH 5.0) gepuffert

(8) Invcrtiise (Sigma Chemical C ompan/. Aktivität 100(X)O E/g) (^l)| 1 g Enzym wurde in IfM) nil 0.1-m AcetatpufTer (pH 5.0) gelost.

¹I Die Werte fur den Anteil an gebundenen Enzymen und /eilen wurden in gleicher Weise wie in den vorhergehenden Beispielen nut Hilfe des I owry-Verfahrcns bestimmt

·') Bestimmt durch die Tilrationsmclhodc (Soc C hem Ind (Lnndnnl, Monograph II. 7? [l%1]) Die Aktivitätseinheiten wurden unter der Voraussetzung angegeben, daß einer I inhcit/g die Menge entspricht, die zur Oxidation von l,0;iMol Glucose zu (iluumsjurc durch I g einer gegebenen Probe hei pH 5,| bei 35 C während einer Minute befähigt ist.

Ί Bestimmt mit Hilfe der Casem-Mcthode nach Polin (Standard biochemical Experiment. Kobundo. 2O7[1953|). Die Aktivitatseinheiten wurden unter der Annahme angegeben, daö cmc Einheit/g der "Jildung einer solchen Menge nicht proleinar'igcr Substanz pro I g einer gegebenen I'robe entspricht, dall eine Absorption bei ftfiOm·» erzielt wird, die I ('Tyrosin entspricht, nachdem I Minute bei pH 8,0 bei 3 ( stehengelassen wurde

¹I Bestimmt dunh die Methode nach ti t ischer und I Kohles (HeIv them Uta . 34. 1123 |l^l)5l|). Die Einheitcrder Pnzymaktivit.il wurden unter der Annahme angegeben, daß die Einheit, I Einheit/g, der Menge entspricht, die 1 mg llexme aus Saccharose .ils Substrat nach 3 Minuten dauerndem Stehenlassen bei 20 ( freisetzt

Beispiele 29 bis 32
Herstellung von unbeweglich gemachten Succinylglucoamylase-Pra'paratcn

In Tabelle 5 sind bevorzugte Ausfiihrungsformen für das Unlöslichmachen von Succinyl-Derivaten von handelsüblicher Glucoamylase (Aktivität: 5000 E/g) aus Spezies des Genus Rhizopus auf verschiedenen Trägern gezeigt, die in den angegebenen Beispielen zur Trägerhcrstelking erhalten wurden.

Tabelle 5

Pei-	Beispiel eier	Träger	5 (Fortsetzung)	des Unbeweglichmachens	verwendete	Gluco-	Bedingungen der	(E/g)')
spiel	TrSgRr-		Bedingungen		Menge	amylnse	Succinylierung;
	herstellung	Zusammensetzung des Ausgangs-					Gewichtsverhältnis
		polymeren			2,0 g		Glucoamylase/Beni'
					2,0 g		steinsäureanhydrid
29	5	2-VP-St-DVBz-Copolymeresi				1,0 g	1/0,6
30	6	4-VP-MMA-DVBz-		2,0 g	1,0g	1/0,3
		Copolymeres
31	7	2-VP-St-EDMA-	\0 g	1,0g	1/0,3
		Copolymeres
32	8	4-VP-St-DVBz-CcpoIymeres		UOg	1/0,2
Tabelle
Bei		Ausbeute an	Prozent Einheiten der
spiel		unbeweg	gebundene Enzymaktivität
		lichem	Gluco
	Produkt	amylase²)
	(E)

Das Unbeweglichmachen wurde durchgeführt, indem Succinylglucoamylaselösirng unter den gleichen Bedingungen des Unlöslichmachens wie in Beispielen 15 bis 20 eingesetzt wurde.

2,5
2,3
2,3
2,0

100
97
95
80

650 700 630 580

') Succinylierung d-r Glucoamylase: 1,0g handelsüblicher Glucoamylase wurde in 50 cm³ 0,1 -m PhosphatpufferfpH 7,0) gelöst. Unter Rühren des Gemisches bei Raumtemperatur v/u de Bernsteinsäureanhydrid anteilweise zugesetzt. Wenn der pH-Wert des Gemisches nach der Reaktion u icr 7,0 lag, wurde ::ine 0,1-m Natriumcarbonatlösung zugegeben, um den pH-Wert über 7,5 zu erhöhen, und dann wurde erneut Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt. Unter Wiederholung dieses Vorgangs wurde die Gesamtmenge an Bernsteinsäuri nhydrid zugesclzt. Der End-pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.

²) Bestimmt nach der gleichen Methode wie der gebundene Anteil an Glucoamylase in Beispielen 15 bis 20.

³) Bestimmt in gleicher Weise wie die Einheilen der Enzym-Aklivität in Beispielen 15 bis 20.

Beispiel 33

Kontinuierliche Bildung von L-Methionin aus

N-Acetyl-DL-methionin mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Aminoacylase-Praparats

Eine Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Höhe von 300 mm, die bei 50'C gehalten wurde, wurde mit 1 g des in Beispiel 10 hergestellten unbeweglich gemachten Aminoacyla.'.ematerials gefüllt. Eine 0,2m-Lösung von N-Acetyl-DL-methionin (pH 7.0; 5x10 ⁴mC'o") wurde kontinuierlich in einer Ströinungsrate von 5 cm Vh von oben nach unten durch die Kolonne geleitet. Der aus dem Kolonnenboden abfließende Abstrom wurde colorimetrisch mit Hilfe der Ninhydrinmethode analysiert, iim die Ausbeute an 1. Methionin zu bestimmen. Nach 30 Tagen einer kontinuierlichen Reaktion wurde die Umwandlung von NAcetyll. -methionin in dem Ausgaugsmalenal, N-Acetyl DI.-methionin, /u I.-Methionin, zu 100% festgestellt.

Beispiel 34

Kontinuierliche Herstellung von

L-2-Aminobuttersäure aus N-Acetyl-DL^*

aminobuttersäure mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Aminoacylase-Praparats

' Die gleiche Kolonne wie in Beispiel 33 wurde mit 1 g der unbeweglich gemachten Äminoacylase, die in Beispiel 14 hergestellt worden war, gefüllt. N-Acetyl-DL-2-aminobuttersäure (0,2 m. pH 7,0, 5x10 ⁴m Co*⁺) wurde von oben nach unten kontinuierlich in einer Strömungsrate von 5 cm Vh durch die Kolonne geleitet. Die Reaktionstemperatur betrug 50"C. Nach 30tägiger kontinuierlicher Reaktion wurde gefunden.

daß die Umwandlung von NAcetyl-L-2-aminobutter-

i> säure zu L-2-Aminobuttersäure 100% betrug.

Beispiel 35

Kontinuierliche Herstellung von Glucose aus

Stärke mit Hilfe eines unbeweglich

gemachten Glucoamylase-Materials

Line Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 15 mm und einer Höhe von 300 mm. die bei 40 ( gehalten wurde, wurde mit 2.0 g des unbeweglich gemachten Glucoamylase-Materials gefüllt, das in Beispiel 17 hergestellt worden war. Eine Starkelösung (30% Gewicht/Gewicht) (pH 4,5, Dextroseäquivalent =20) wurde von oben nach unten kontinuierlich in einer Fließrate von 5 cm Vh durch die Kolonne geleitet Der aus dem Boden der Kolonne abfließende Absirom wurde mit Hilfe der DNS-Methode analysiert, um di Ausbeute an Glucose zu bestimmen. Nach 30tägiger kontinuierlicher Reaktion wurde gefunden, daß die Umwandlung von Stärke in Glucose mehr als 95% betrug. Die mitflem Produkt durchgeführte Papierchromatographie zeigte, daß kein Anzeichen der Bildung von Oligodextrose in dem Produkt vorhanden war.

O CC\ .

Beispiel 36

Kontinuierliche Bildung von Fructose aus

Glucose mit Hilfe eines unbeweglich
gemachten Glucoseisomerase-Materials

Eine Mantelkolonne mit 26 mm Innendurchmesser und 300 mm Höhe, die bei 60⁰C gehalten wurde, wurde mit einem homogenen Gemisch aus 1,0 g des unbeweglich gemach'tn Glucoseisomerase-Materials, das gemäß Beispiel 24 hergestellt worden war, und 3,0 g Cellulosepulver als Verdünnungsmittel (200—400 Maschen ASTM-Sieb) gefüllt. Eine 30%ige (Gewicht/Gewicht) Glucoselösung (pH 8,0, 5xlO"³m MgSO₄ · 7 H₂O) wurde kontinuierlich in einer Strömungsrate von 5 crnVh von oben nach unten durch die Kolonne geleitet. Der aus dem Kolonnenboden abfließende Abstrom wurde mit Hilfe der Cystein-Carbazol-Methode analysiert, um die Ausbeute an Fructose zu bestimmen. In den frühen Stad'en der Reaktion wurde die Bildung von Fructose in einer Menge entsprechend etwa 50% der Glucose beobachtet (isornerisieningsrate 50%). Auch nach 30tägiger kontinuierlicher Reaktion war die Isomerisierungsrate immer noch höher als 47%.

Beispiel 37

Kontinuierliche Herstellung von Gluconsäure aus

Glucose unter Verwendung eines unbeweglich

gemachten Glucoseoxidase-Präparats

In ein Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 1 Liter wurden 2 g der in Beispiel 25 hergestellten unbeweglich gemachten Glucoseoxidase und 500 cm³ einer 15gewichtsprozentigen Glucoselösung (pH 5,2) gegeben, und das Gemisch wurde bei 35° C gerührt, indem saubere Luft eingepreßt wurde, um die Reaktion durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde durch geeignete Zugabe von NaOH konstant auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellt. Nach 48stündiger Reaktion

wurde der Gehalt des Reaktionsgemisches an nicht umgesetzter Glucose geprüft. Die Analyse zeigte daß 100% Glucose umgesetzt war. Durch Papierchromatographie des erhaltenen Produkts wurde festgestellt, daß es vollständig aus Gluconsäure bestand.

Beispiel 38

Kontinuierliche Herstellung von Glucose und

Fru2tose aus Saccharose mit Hilfe eines
unbeweglich gemachten Invertase-Präparats

Eine Kolonne mit 10 mm Innendurchmesser und 300 mm Höhe wurde mit 1 g des in Beispiel 28 hergestellten unbeweglich gemachten Invertase-Materials gefüllt. Bei Raumtemperatur wurde eine 10%ige (Gewicht/Gewicht) Saccharoselöuing vom pH-Wert 4,5 von oben nach unten kontinuierlich in einer Fließrate von 5 cmVh durch die Kolonne geleitet. Der aus dem unteren Ende der Kolonne abflie".nde Abstrom wurde mit Hilfe der DNS-Methode und der Cystein-Carbazol-Methode analysiert, um die Umwandlung zu Glucose zu bestimmen. Selbst nach einem Monat einer kontinuierlichen Reaktion wurde die Umwandlung von 100% noch aufrechterhalten.

Beispiel 39

Kontinuierliche Herstellung von Glucose aus

Stärke mit Hilfe eines unbeweglich
gemachten Succinylglucoamylase-Präparals

Die kontinuierliche Herstellung von Glucose aus Stärke wurde mit Hilfe von 2,0 g Succinylglucoamylase, die in Beispiel 30 erhalten wurde, in gleicher Weise wie in Beispiel 35 durchgeführt.

Nach kontinuierlich durchgeführter Reaktion während 45 Tagen wurde gefunden, daß der Umwandlungsgrad von Stärke zu Glucose mehr als 97% betng.

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterial, enthaltend eine 's biologisch aktive Enzymsubstanz auf einem praktisch wasserunlöslichen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß es ein biologisch aktives Enzym oder Mikroorganismenzellen mit Enzymaktivität, gebunden an ein wasserunlösliches Anionen austauscherharz, in dessen Moleküleinheiten quaternisierte Pyridinringe vorliegen, auf Basis eine; Copolymeren von Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats mit einem oder mehreren copolymerisierbaren Monomeren, die aromatische Vinylverbindüngen, äthylenisch ungesättigte Verbindungen, dienisch ungesättigte Verbindungen oder ungesättigte Divinylverbindungen sein können, enthält, welches ein durch Radikalpolymerisation gebildete; Copolymeres aus 20 bis 99 Mol-% Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats. 0.5 bis 30 Mol-% der ungesättigten Divinylverbindungen und 0 bis 70 Mol-% eines der anderen copolymerisierbaren Monomeren oder ein Block- oder Pfropfcopolymeri · sat, welches 25 bis 75 Mol-% Vinylpyridin- oder Vmylpyridinderivateinheiten enthält, darstellt.

2. Enzymmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Anionenaustauscherhart mit einer Gesamt-Anionenaustauschkapazität von 2,0 bis 5,0 mÄq/g aufweist

3. Enzymmaterial nach Anspruch 1 oder 1; dadurch gekennzeichnet, daß als Vinylpyridin bzw. Vinylpyridinderivat 4-Vinylpyridin, 2-Vinylpyridin oder 2-Methyl-S-vinylpyridin eingesetzt wurde.

4. Enzymmaterial nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als ungesättigte Divinylverbindungen Divinylbenzol oder (Poly)· äthylenglycoldimethacrylat eingesetzt wurden.

5. Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis

4, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Radikalpolymerisation 50 bis 55 Mol-% Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats, 1 bis 20 Mol-% ungesättigte Divinylverbindungen und 0 bis 70 Mol-% eines der anderen copolymerisierbaren Monomeren copolymerisiert wurden.

6. Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Block- oder Pfropfcopolymerisation 40 bis 60 Mol-% Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats copolymerisiert wurden

7. En/ymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis

6. dadurch gekennzeichnet, daß Pyridinringe des Anionenaustauscherharzes mit Hilfe von Methylchlorid, Methylbromid, Methyljodid oder Dimethylsulfat quaternisiert worden sind. π

8. Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis

7. dadurch gekennzeichnet, daß es als biologisch aktive Enzym-Substanz Aminoacylase, Glucoamylase, Succinylglucoamylase, Glucoseisomerase, Glucoseoxidase. alkalische Protease, lnvertase oder Mikroorganismenzellen aufweist, die diese Enzyme enthalten.

9. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen, enzymatisch aktiven, unbeweglich gemachten Enzymmaterials, enthaltend eine biologisch aktive Enzym-Substanz auf einem praktisch wasserunlöslichen Träger nach Ansprüchen 1—8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein biologisch aktives Enzym oder Mikroorganismenzellen, die ein solches Enzym enthalten, mit einem wasserunlöslichen Anionenaustauscherharz, in dessen Moleküleinheiten quaternisierte Pyridinringe vorliegen, auf Basis eines Copolymeren von Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats mit einem oder mehreren copolymerisierbaren Monomeren, die aromatische Vinylverbindungen, äthylenisch ungesättigte Verbindungen, dienisch ungesättigte Verbindungen oder ungesättigte Divinylverbindungen sein können, umsetzt, weiches ein durch Radikalpolymerisation gebildetes Copoiymeres aus 20 bis 99 Mol-% Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats, 0,5 bis 30 Mol-% der ungesättigten Divinylverbindungen und 0 bis 7Oi Mol-% eines der andei en copolymerisierbaren Monomeren oder ein Block- oder Pfropfcopolymerisat, welches 25 bis 75 Mol-% Vinylpyridin- oder Vinylpyridinderivateii.neiten enthält, darstellt

10. Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen Umwandlung eines Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym ein wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 8 verwendet wird.