DE3438960C2

DE3438960C2 -

Info

Publication number: DE3438960C2
Application number: DE3438960A
Authority: DE
Inventors: Norman E. Ridgefield Conn. Us Lloyd
Original assignee: Stabra AG
Current assignee: Stabra AG
Priority date: 1983-10-24
Filing date: 1984-10-24
Publication date: 1993-09-09
Also published as: ES536995A0; FR2553790B1; HUT36179A; FI844180L; CA1238286A; NL8403231A; MX7644E; FR2553790A1; GB2148298A; SE8405301D0; SE460480B; GB8426861D0; AU587566B2; JPS60214896A; FI79558B; DE3438960A1; BG43190A3; GB2148298B; IT1177029B; IT8423297A1

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 13 angegebene Verfahren zum Isomerisieren von Glucose (Dextrose) in Fructose (Lävulose).

Die meiste Nahrungsmittelglucose wird als enzymatisches Hydrolysat von Maisstärke zur Verfügung gestellt, d. h. als handelsüblicher Maissirup. Glucose hat im allgemei nen eine 60- bis 80%ige Süße im Vergleich zu Saccharose und wird deshalb mit einem entsprechend niedrigeren Preis gehandelt. Seit langem ist es bekannt, Glucose zu Fructose (die noch süßer als Saccharose ist) zu isomerisieren unter Verwendung eines Enzyms mit Glucoseisomeraseaktivi tät, vorzugsweise eines solchen, das auf einem inerten Träger, wie Diethylaminoethylcellulose, porösem Glas oder Chitin, immobilisiert wurde. Genauere Beschreibungen über die enzymatische Umwandlung von Glucose und Fructose unter Verwendung von Glucoseisomerase findet man bei Hamilton, et al. "Glucose Isomerase: a Case Study of Enzyme-Catalyzed Process Technology", Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et al., Plenum Press, New York, (1974), Seiten 94-106, 112, 115-137; Antrim, et al., "Glucose Isomerase Production of High- Fructose Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering, Band 2, Academic Press (1979); Chen, et al., "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem. (1980), Seiten 30 bis 35; Chen, et al. "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem., (1980), Seiten 36-41; Nordahl, et al., "Fructose Manufacture from Glucose by Immobiled Glucose Isomerase", Chem. Abstracts, Band 82, (1975), Abs. Nr. 110316h; and Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem. Abstracts, Band 81, (1974), Abs. Nr. 76474a. Darüber hinaus sind zahlreiche Patente über die Isomerisierung von Glucose bekannt. Typische US-Patentschriften sind: 36 16 221; Reissue 28 885 (ursprünglich 36 23 953); 36 94 314; 37 08 397; 37 15 276; 37 88 945; 38 26 714; 38 43 442; 39 09 354; 39 60 663; 41 44 127 und 43 08 349.

Das Niveau an Fructose; das durch Isomerisierung von Glucosesirup mit Glucoseisomerase erhältlich ist, ist durch das Gleichgewicht der Isomerierungsreaktion begrenzt. Geht man von einem Ausgangssubstrat aus reiner Dextrose aus, so liegt bei 65°C das Reaktionsgleichgewicht bei an nähernd 51 Gew.-% Fructose. Wird eine raffinierte Dextro seflüssigkeit als Substrat verwendet (enthaltend bis zu 6 Gew.-% an Nicht-Monosacchariden) und läßt diese eine ausreichende Zeit in einem Enzymreaktor verweilen, dann erhält man einen annähernd 48 bis 52%igen Fructosesirup als höchste Konzentration nach den vorerwähnten Verfahren des Standes der Technik. Um Sirupe mit höherem Fructose gehalt zu erzielen, muß man Fraktioniersysteme anwenden, durch welche die Kosten des Endproduktes erheblich er höht werden. Bei höheren Temperaturen wird das Gleichge wicht günstiger. Ein Glucoseisomeraseverfahren, das bei einer Temperatur von etwa 90-140°C betrieben werden kann, könnte man verwenden, um direkt Maissirupe mit hohem Fructosegehalt von 53-60 Gew.-% zu erzielen, wobei man dann eine Fraktionierung und ein Kreislaufverfahren ver meiden würde.

Aus Kirk-Othmer "Encyklopedia of Chemical Technology", 3. Ausgabe, Bd. 9, 1980, Seite 149 ist es bekannt, daß man durch Immobilisieren von Enzymen deren Temperaturbeständigkeit verbessern kann.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Isomerisieren von Glucose zu Fructose mittels stabilisierter Glucoseisomerase aufzuzeigen, bei dem man eine Endkonzentration an Fructose von wenigstens 53-60 Gew.-%, bezogen auf den Gesamtkohlehydratgehalt in der glucosehaltigen Flüssigkeit, erhält und man dabei weniger als 1% Psicose und/oder andere Nicht-Fructose, Nicht-Glucose-Zucker gebildet werden.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung in Fructose isomeri sierte Glucose kann aus allen bekannten Quellen für die sen Zucker stammen. Aus Wirtschaftlichkeitsgründen stammt die Glucose im allgemeinen aus den Hydrolysaten von Cellulose oder Stärke unter Verwendung von Säuren und/oder Enzymen, vorzugsweise letzteren, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren. Auf diese Weise erhaltene glucose haltige Flüssigkeiten enthalten typischerweise kleinere Mengen an Polysacchariden, Zuckeroligomeren etc., in Abhängigkeit von der angewendeten Kohlehydratquelle und der angewendeten Hydrolysemethode. Getreidekörner, wie Mais, Milo, Weizen, Roggen und dgl. und stärkehaltige Quellen, wie Kartoffeln, Süßkartoffeln, Karotten, Tapioka und dgl. sind ausgezeichnete Quellen für Stärke, die in das Glucoseausgangsmaterial gemäß der Erfindung umgewandelt wird. In den USA wird Maisstärke wegen seiner vergleichsweise niedrigen Kosten und leichten Verfügbar keit besonders bevorzugt. Da man bei der Herstellung von Nahrungsmittelglucose die Verwendung von enzymatischen Stärkehydrolyseverfahren anwendet, werden solche Ver fahren hier bevorzugt. Enzymatische Hydrolyseverfahren werden in den US-Patentschriften 40 17 363, 39 12 590, 39 22 196, 39 22 197-201 und 42 84 722 beschrieben, die hiermit in die Offenbarung eingeschlossen werden.

Die hier als Enzymquelle für die chemische Stabilisie rung verwendete Glucoseisomerase kann aus allen bekann ten Glucoseisomerase-bildenden Mikroorganismen isoliert werden, einschließlich Streptomyces, flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogens, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Acetobacter oxydans, Acetobacter suboxydans, Acetobacter roseus, Acetobacter melanogenus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, Lactobacillus gavonii, Lactobacillus lycopersici, Lactobacillus mannitopoeus, Lactobacillus pentoaceticus, Pseudomonas hydrophilia, Brevibacterium pentaaminoacidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, and Paracolobactrum aerogenoides. Darüber hinaus kann man Glucoseisomerase, die durch die Genera Nocardia, Micromonospora, Microbispora, Microellobospora und Arthrobacter gebildet wird, verwenden. Streptomyces sp. ATCC 21.175 ist eine ausgezeichnete Quelle für Glucoseisomerase, die erfindungsgemäß verwendet werden kann. Wie schon festge stellt, kann man vorteilhaft Glucoseisomerase verwenden, die bei den hier angewandten verhältnismäßig hohen Iso merisierungstemperaturen stabil ist, z. B. Glucoseisomerase, die von Bacillus stearothermophilus, gebildet wird, und insbesondere von Stämmen ausgewählt aus Bacillus stearo thermophilus ATCC 21 365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 und NRRL B-3682 gemäß US-PS 38 26 714; Glucoseisomerase, die von Mikroorganismen vom Genus Ampullariella gebildet werden, wie Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata und Ampullariella regularis (US-PS 43 08 349); Glucoseisomerase, die von Bacillus licheniformis (europäische Patentanmeldung 41 213) ge bildet wird sowie Glucoseisomerase, die von Thermophilen der in der japanischen Patentveröffentlichung 74 30 588 be schriebenen Genera gebildet wird.

Außer den vorerwähnten Mikroorganismen schließt die vor liegende Erfindung auch die Verwendung von Mutanten und Varianten davon sowie von genetisch umgewandelten Mikro organismen, die durch Einführung von mutierten Glucose isomerase dienen, in andere Mikroorganismen, einschließ lich mesophilen und thermophilen Mikroorganismen, abge leitet werden, ein. Die mutierten Glucoseisomerasegene, die für einen solchen Zweck ausgewählt werden, sind sol che, die Glucoseisomerase ergeben, die bei höheren Tempe raturen, insbesondere oberhalb 90°C und vorzugsweise bis zu 140°C stabil ist. Solche Gene können durch übliche Verfahren, wie sie zum Mutieren von Mikroorganis men verwendet werden, z. B. durch Bestrahlen oder Chemisch- herstellen. Alternativ kann man isolierte Glucoseisomerase gene, die eine Glucoseisomerase mit einer ausreichenden Wärmestabilität ergeben, und wie sie beispielsweise durch gewisse Streptomyces-Stämme gebildet werden, in vitro mutieren. Die Auswahl von geeigneten mutierten Genen ist begleitet von dem Wiedereinführen des mutierten Gens, in entweder dem Eltern- oder einem anderen Organismus und anschließendem Wachstum und Vervielfältigen des Organismus und Prüfen der Wärmestabilität der gebildeten Glucoseisomerase.

Man kann gleichfalls rekombinierte DNA-Verfahren anwen den, um Glucoseisomerase mit einer für die vorliegende Erfindung geeigneten verbesserten Wärmestabilität zu erhalten. Argos et al. (Biochemistry 18 (25): 5698-5703 (1979)) hat festgestellt, daß gewisse Substitutionen von Alanyl für Glycyl, Seryl, Valyl und Lysyl in Enzymen von mesophilen Organismen in den entsprechenden Enzymen aus thermophilen Organismen gefunden werden. Perutz (Science, 201, 1187-91 (1978)) stellt fest, daß die Enzyme von thermophilen Bakterien ihre Extrastabilität hauptsächlich durch zusätzliche Salzbrücken an der Protein oberfläche erlangen. Zuber gibt in "Biochemistry of Thermo phily", Freidman, S. M., ed., Seiten 267-285, Academic Press, N. Y., 1978) weitere Informationen über den Aufbau thermostabiler Enzyme. Sind die Aminosäuresequenz und die dreidimensionale (tertiäre) Struktur einer Glucose isomerase bekannt, dann ist es möglich, in den Isomerase genen eine verbesserte Stabilität durch seitenspezifische Mutationen zu entwickeln unter Ausbildung von Enzymen, die erhöhte Mengen an solchen Aminosäuren enthalten und dadurch stabilere Strukturen aufweisen. Nachdem man die DNA-Sequenz der Glucoseisomerase bestimmt hat, kann ein Gensynthesizer verwendet werden, um eine neue Sequenz zu erzeugen und durch solche künstlich gemachten Gene wird die Wärmestabilität von derart erzeugter Glucose isomerase erhöht. Man kann erwarten, daß solche manipulier ten Enzyme für die Praxis der vorliegenden Erfindung be sonders brauchbar sind.

Da Glucoseisomerase typischerweise intrazellulär von diesen und anderen Mikroorganismen gebildet wird, kann man eine Quelle für Glucoseisomerase durch einfaches Ernten dieser Zellen gewinnen. Die Glucoseisomerase kann von den Zellen in bekannter Weise abgetrennt werden, z. B. durch Zellautolyse oder durch Beschallung in einem Enzymreaktor be kannter Bauart. Vorzugsweise wird die hier verwendete Glucose isomerase, unabhängig von ihrer Quelle, auf einem inerten Substrat in üblicher und bekannter Weise immo bilisiert. Verfahren und Material, die zum Immo bilisieren von Enzymen verwendet werden können, sind bekannt und werden in zahlreichen Publikationen beschrie ben einschließlich Wang et al., Fermentation & Enzyme Technology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1979), Seiten 318-338 und Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc., New York (1980), Band 9, Seiten 148-172, die in die Offenba rung der Erfindung einbezogen werden. Die Gegenwart von geringen Mengen an Kobaltkation und/oder einem wasser löslichen Salz von schwefeliger Säure, wie Natrium sulfit, Natriumbisulfit, Magnesiumsulfit und/oder Magnesiumbisulfit gemäß US-Reissue-Patent Nr. 28 885, um die Denaturierung der Glucoseisomerase während des Verfahrens zu vermindern, kann ebenfalls vorgesehen werden.

Es ist erforderlich, daß die Konzentration an Kohlehydrat in der glucosehaltigen Flüssigkeit im Bereich von 20 bis 85 und vorzugsweise 30 bis 50 Gew.-%, liegt.

Es ist auch erforderlich, daß man die Isomerisierung bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 8 und vorzugs weise im Bereich von 4 bis 7 und insbesondere zwischen 5 und 6,5 durchgeführt. Nimmt man die Isomerisierung erheblich unterhalb oder oberhalb des vorerwähnten pH-Be reiches vor, dann bilden sich sehr große Mengen an uner wünschten Nebenprodukten, wie Piscose, organischen Säuren, gefärbten Produkten, Farbvorläufern, Fructosedianhydriden und dergleichen.

Es wurde festgestellt, daß der pH für eine optimale Akti vität der Glucoseisomerase merklich bei hohen Temperaturen abnimmt. Für Glucoseisomerase aus Streptomyces rubingenosus liegt das Aktivitätsoptimum bei pH 8,6-9,2 bis 25°C, bei pH 6,9-7,5 bis 75°C und bei pH 5,6-6,2 bei 125°C. Wenn also die Isomerisationstemperatur ansteigt, kann man den pH der Isomerisierung erniedrigen, um eine maxi male Enzymaktivität aufrechtzuerhalten und um die Bil dung von Nebenprodukten zu vermeiden.

Ein weiteres wichtiges Erfordernis bei der vorliegenden Erfindung ist die Kontaktdauer der glucosehaltigen Flüs sigkeit mit der chemisch stabilisierten Glucoseisomera se. Diese Kontaktzeit muß im Bereich von etwa 1 s bis etwa 5 h, vorzugsweise etwa 30 s bis etwa 1 h und ganz besonders bevorzugt etwa 2 min bis etwa 30 min aufrecht erhalten werden, um einen Fructosesirup einer annehmbaren Qualität zu ergeben.

Die bevorzugte Kontaktzeit zwischen der Glucoseisomerase und der glucosehaltigen Flüssigkeit hängt zu einem gro ßen Teil von dem pH ab, bei dem Isomerisierungsreaktion durchgeführt wird. Am unteren Ende des pH-Bereiches kann man längere Kontaktzeiten tolerieren, ohne daß ein zu großer Glucose- und Fructoseabbau durch Bildung von Psicose und anderen unerwünschten Abbauprodukten ein tritt. Am oberen Ende des Bereiches sind kürzere Kontakt zeiten erforderlich, um die Bildung von Psicose und von Farbstoffen zu vermeiden. In der Praxis wird die Ge samtzeit, bei welcher sich der glucosehaltige Sirup bei oder in der Nähe der Endreaktionstemperatur befin det, als die Abbauzeit (t_d) angesehen, weil die ein tretenden Zuckerabbaureaktionen nicht enzymatisch sind und unabhängig davon ablaufen ob die Flüssigkeit in Kontakt mit der Glucoseisomerase ist oder nicht. Die Abbauzeit (t_d) schließt die tatsächliche Kontakt zeit (t_a) während das Enzym und das Substrat in Kon takt sind, plus jede manipulierte Zeit, d. h. zum Einbringen und Herausnehmen aus dem Reaktor, bei wel cher das Substrat bei oder in der Nähe der Reaktions temperatur ist, ein. Die tatsächliche Kontaktzeit (t_a) ist die Zeit, während welcher das Enzym reak tiv in Kontakt mit dem Substrat ist, d. h. daß ein direkter Kontakt zwischen dem Substrat und dem Enzym besteht. Deshalb ist die Durchführung der Isomerisie rungen oberhalb 90°C wichtig, um die Zeit zu minimie ren, die erforderlich ist, um die Glucoseflüssigkeit auf die gewünschte Isomerisationstemperatur zu brin gen (wie dies beispielsweise der Fall ist, wenn man die Flüssigkeit mit Wasserdampf unmittelbar vor dem Kontakt mit Isomerase vermischt) und wenn einmal die gewünschten Fructoseniveaus erreicht worden sind, dann soll die Flüssigkeit schnell von irgendeiner aktiven Isomerase getrennt werden und so schnell wie möglich auf unterhalb 90°C und vorzugsweise unterhalb 70°C gekühlt werden.

Um deshalb Sirupprodukte mit annehmbaren Eigenschaf ten zu erhalten, bei denen kein zu starker Abbau der Fructose oder Glucose eingetreten ist, wird die Ab bauzeit in Übereinstimmung mit der folgenden Glei chung

t_d=a log (4300/(T+273)-pH-3,23)

überwacht, wobei t_d die Abbauzeit in Minuten, T die Reaktionstemperatur in °C und pH der pH-Wert der Reaktionsmischung, während welcher sich die Mi schung bei der Reaktionstemperatur befindet, ist.

Die obige Gleichungg zeigt, daß kürzere effektive Kontaktzeiten bei höheren Temperaturen und/oder höhe ren pH-Werten erforderlich sind. Die für die Umset zung verwendeten pH-Werte liegen im allgemeinen nahe oder bei dem Optimum-pH-Wert für die ausgewählte Isomerase. Die Temperatur T kann, je nach der Zusam mensetzung des Substrates und des gewünschten Fructo segehaltes, wie dies nachfolgend noch diskutuiert wird, eingestellt werden. Diese Beziehungen werden beispielsweise in den Gleichungen 5, 6 und 7 gezeigt.

Eine weitere Überwachung der Kontaktzeit kann man da durch erzielen, daß man die Beziehung zwischen der Gleichung 4 ausnutzt, in welcher gezeigt wird, daß die Kontaktzeit umgekehrt proportional der Enzymakti vität ist. Deshalb sollte bei einer Isomerase mit einem optimalen pH von 6,0 und einer Reaktionszeit von 110°C die Abbauzeit auf etwa 100 Minuten oder weniger eingestellt werden.

Verwendet man eine lösliche Form von chemisch stabi ler Glucoseisomerase, ist es erforderlich, eine Inak tivierung vor der Kühlstufe vorzunehmen (z. B. durch eine pH-Verringerung auf einen Bereich, bei dem die Isomerase inaktiviert wird), um jegliche Rückwandlung von Glucose zu Fructose, die sich während der Isome risationsstufe bei den hohen Temperaturen ausgebildet hat, zu vermeiden, denn die Isomerisationsreaktion ist selbstverständlich reversibel.

Der erzielbare maximale Umwandlungsgrad von Glucose in Fructose wird durch das thermodynamische Gleichgewicht zwischen Glucose und Fructose bestimmt, welches wiederum von der Temperatur, bei welcher die Isomerisierung durch geführt wird, abhängig ist. Sehr sorgfältige Untersuchun gen über Gleichgewichtsmischungen von Glucose und Fructose haben folgende Beziehung ergeben:

F = 100 K/(K+1) (2)

worin F der Prozentsatz an Fructose beim Gleichgewicht, bezogen auf Gesamtgewicht von Glucose und Fructose, T die Temperatur (°C), bei welcher die Isomerisierung durchgeführt wird und K die Glucose-Fructose-Gleichgewichts konstante darstellen.

Die tatsächliche Kontaktzeit zwischen dem glucosehaltigen Sirup und der Isomerase in dem Reaktor kann unter Bezug auf die nachfolgende Gleichung errechnet werden, wenn man einen Reaktor, der Isomerase in immobilisierter Form enthält, verwendet,

Darin bedeuten:

t=die tatsächliche Kontaktzeit,
C=Konzentration an Glucose und Fructose,
V=das freie Flüssigkeitsvolumen in dem gepackten Bett (Bettvolumen minus dem von den immobilisierten Enzym teilchen eingenommenen Volumen),
F_e=Fructosefraktion in der Glucose/Fructosemischung beim Gleichgewicht bei der Isomerisierungstemperatur,
F_o=Fraktion von Fructose (bezogen auf G+F) am Eingang des gepackten Bettes,
F=Fraktion an Fructose (bezogen auf G+F) in der aus dem gepackten Bett austretenden Lösung,
k=Reaktionskonstante für die Isomerisierung unter Iso merisierungsbedingungen,
A=Isomeraseaktivität in dem gepackten Bett.

Werte für k für die in den Beispielen hergestellte immo bilisierte Isomerase liegen im Bereich von 0,07 bis 5 g h^-1 IGIU^-1 bei Temperaturen von 90°C bzw. 140°C. Diese Beziehung zeigt die Notwendigkeit, die Kontakt zeit bei hohen Temperaturen bei Verwendung von gepackten Betten mit hoher Aktivität pro Volumeneinheit zu minimie ren. Die nach den in den folgenden Beispielen beschriebenen Verfahren hergestellten gepackten Betten können bis zu 2000 IGIU/ml erhalten, wodurch man in weniger als 1 min in einem Hochtemperaturreaktor einen Gleichgewichts- Fructosegehalt von 99,5% erzielt, wenn man Stufenreakto ren, die bei unterschiedlichen Temperaturen betrieben wer den, verwendet und die Zufuhr zu einem ersten Reaktor bei einer niedrigen Temperatur isomerisiert wird, bevor man in einem zweiten Reaktor bei einer höheren Temperatur isomerisiert. Wendet man ein Stufenreaktorsystem an, dann ist es vorteilhaft, ein Verfahren zum enzymatischen Umwandeln von Glucose in Fructose anzuwenden, bei dem man eine glucosehaltige Flüssigkeit, enthaltend 20 bis 85 Gew.-% Kohlehydrate, mit Glucoseisomerase bei einer Temperatur von 20°C bis 80°C und einem pH von 6,0 bis 9,0 bei einer Kontaktzeit von 0,5 bis 2 h in Berührung bringt, um 40 bis 45 Gew.-% der in der Flüssigkeit enthaltenen Glucose in Fructose umzuwandeln, worauf man dann die Temperatur in dem Isomerisierungsmedium auf 90°C bis 140°C erhöht und den pH im Isomerisierungs medium auf einen Bereich von 3 bis 8, je nach dem, wie es erforderlich ist, einstellt und dann die fructosehaltige Flüssigkeit mit der Glucoseisomerase eine weitere Zeit zwischen 1 s bis 5 h in Berührung bringt, um dadurch das Umwandlungsniveau auf 53 bis 60 Gew.-% der in der ursprünglichen glucosehaltigen Lösung enthaltenen Glucose zu bringen, wobei sich dann weniger als 1% Psicose oder andere Nicht-Fructose-, Nicht-Glucose-Zucker bilden. Die Verwendung von hochakti ven gepackten Betten kann somit zu sehr niedrigen wirk samen Kontaktzeiten führen, wodurch wiederum ein Abbau der Fructose, der bei den erfindungsgemäß erforderlichen hohen Temperaturen eintritt, minimiert werden kann.

Bei der Auswahl der Immobilisierungstechnik für die Glucoseisomerase werden Methoden bevorzugt, die in der Lage sind, kleine im wesentlichen nicht-komprimierbare poröse Katalysatorteilchen zu ergeben, so daß eine Limi tierung der Isomerisierungsrate durch Diffusionseffekte minimiert wird. Alternativ kann man die Isomerase in den Poren einer Membran immobilisieren, durch welche die Glucoselösung während der Hochtemperaturisomerisierung hindurchgezwängt wird, so daß ein guter Kontakt zwischen dem Enzym und dem Subtrat vorliegt und Diffusionsein schränkungen minimiert werden. Der zum Immobilisieren verwendete Träger ist vorzugsweise vollkommen unlöslich und inert, um eine unzulässige Verunreinigung oder einen Abbau der Glucose/Fructosekomponenten in den Substratlö sungen zu vermeiden.

In der Praxis werden jedoch fructosehaltige Sirupe nicht aus reiner Glucose hergestellt. Vielmehr verwendet man Stärkehydrolysate, die nach den vorerwähnten Druckschrif ten hergestellt werden, als Glucosequelle und diese ent halten immer Nicht-Glucose- und Nicht-Fructose-Saccharide (nachfolgend als Polysaccharide bezeichnet), die sich von einer unvollständigen Stärkehydrolyse ableiten und die Umwandlungsprodukte von Glucose. Typischerweise ma chen diese 3 bis 8% des Gesamttrockengewichts von den durch die Stärkehydrolyse erhaltenen Sacchariden aus. Deshalb ist es erforderlich, unter Berücksichtigung der Temperatur, bei welcher die Isomerisierung durchgeführt werden soll, daß alle in der Glucoseflüssigkeit enthal tenen Polysaccharide sowie auch die anderen Faktoren, wie der Gesamtfructosegehalt auf Trockenbasis, die Bildung von Psicose und von anderen Nicht-Glucose- und Nicht- Fructose-Produkten während der effektiven Kontaktzeit der Glucoseflüssigkeit und der Isomerase berücksichtigt werden. Die Beziehungen zur Berechnung der Isomerisations temperatur werden nachfolgend gezeigt:

T=Isomerisierungstemperatur (°C),
F=Gleichgewichtsfructosegehalt (%, bezogen auf Gesamt glucose+Fructose) bei der Temperatur T,
M=% Fructosetrockengehalt, erforderlich in dem iso merisierten Produkt,
C=Psicose und andere Abbauprodukte, die sich während der effektiven Isomerisierungskontaktzeit bilden,
Q=% des Gleichgewichts, das sich während der Isomeri sierungsreaktion einstellt,
P=% Polysaccharidgehalt der Glucoseflüssigkeit.

Typischerweise bilden sich weniger als 1% und vorzugswei se weniger als 0,5% Psicose und andere Abbauprodukte und man kann ein 99,5%iges Gleichgewicht erzielen. Um deshalb Sirupe mit 55,5% Fructose (Trockengehalt) her zustellen, benötigt man die nachfolgenden Isomerisie rungstemperaturen für Glucoseflüssigkeiten mit den ange gebenen Polysaccharidgehalten:

Polysaccharid in der Glucoseflüssigkeit (% Trockenbasis)
Isomerisierungstemperatur (°C)
0
95,7
1	99,1
2	104,3
3	108,9
4	113,8
6	124,3
8	136,1

Für den Handel geeignete Produkte enthalten Produkte durchschnitt lich 55,5% Fructose auf Trockenbasis. Dies beruht darauf, daß bei einem solchen Fructosegehalt ein Maissirup mit hohen Fructosegehalt (HFCS) die gleiche Süße entwickelt, wie Saccharose, jeweils auf das gleiche Trockengewicht bezogen. Weiterhin ist ein HFCS mit 55,5% Fructosegehalt ein im Handel eingeführter Artikel, den man ganz oder zum Teil als Ersatz für Saccharose in zahlreichen Nahrungs mitteln und insbesondere in kohlensäurehaltigen Säften und Getränken verwendet. Der Verbrauch von HFCS in den USA beträgt erwartungsgemäß 1,31 · 10⁶ kg in 1982 und wächst 1983 auf 1,8 · 10⁶ kg. Aufgrund der Schwierigkeiten, die beim Liefern, Lagern, Abmessen und Formulieren von HFCS in Nahrungs mitteln auftreten, besteht ein großer Bedarf an gleich mäßigen Produkten, unabhängig von den HFCS-Herstellern, so daß man Produkte aus unterschiedlichen Quellen austausch bar und gleichzeitig verwenden kann. Deshalb haben Fructose niveaus von 55-56% auf Trockengewichtbasis eine be sondere Bedeutung bei den HFCS-Herstellern erlangt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt Fructoseniveaus von wenigstens 53% und vorzugsweise wenigstens 54% und insbesondere wenigstens 55%.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, an stelle von einer Lösung, die nur Glucose als Substrat enthält, eine Lösung von Glucose zu verwenden, in welcher bereits ein Teil der Glucose zu Fructose isomerisiert ist. Beispielsweise kann man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Lösung von isomerisierter Glucose, die bis zu 50% Fructose enthält, behandeln, um dadurch die Konzentration der Fructose auf die erwünschteren Niveaus oberhalb 50% und vorzugsweise auf Niveaus von 55 bis 56% oder darüber zu bringen.

Lösungen von Glucose, die Fructose in Mengen von weniger als 50 Gew.-%, bezogen auf die Kohlehydrate enthalten, können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.

Unter Berücksichtigung der vorerwähnten Erfordernisse des pH-Wertes und der Kontaktzeit kann man bekannte Glucoseisomerisierungsverfahren in geeigneter Weise so anpassen, daß sie bei 90 bis 140°C und vorzugs weise bei 100 bis 110°C betrieben werden und wobei man die erfindungsgemäßen Hoch-Glucose-Fructose- Sirupe erhält.

Die Thermostabilität der Glucoseisomerase kann durch ein oder mehrere chemische Behandlungen merklich erhöht wer den, wobei das Enzym jedoch eine beachtliche Aktivität beibehält. Ein so behandeltes Enzym wird als "chemisch stabilisierte Isomerase" bei der vorliegenden Erfindung bezeichnet.

Die chemische Stabilisierung der Isomerase kann auf verschiedene Weise, mittels welcher man eine erhöhte Stabilität erzielen kann, erfolgen. Eine fundamentale Arbeitsweise besteht darin, daß man strukturelle Elemente in das Enzymmolekül derart einführt, daß das Enzym beim Erhitzen oberhalb seines normalen thermischen Denaturisierungspunktes beständig bleibt. Eine bevorzugte Metho de, um dies zu erzielen, besteht darin, daß man das Enzym durch chemische Substitution mit Resten, welche polymerisierbare Vinylgruppen enthalten, modifiziert, wobei die letzteren fest an die Oberfläche des Enzym moleküls an einigen Punkten gebunden sind. Anschließend wird das modifizierte Enzym mit einer oder mehreren poly merisierbaren Vinylverbindung(en) in einer wäßrigen Lösung vermischt und die Mischung wird unter Ausbildung eines chemisch stabilisierten Enzyms, in welchem das Enzym fest an verschiedenen Punkten an eine dreidimensiona le Polymermatrix gebunden ist, welche eine Struktur auf weist, die komplementär der Struktur des Enzyms ist, copolymerisiert.

Beispiele für diese Art der Stabilisierung werden von Martinek et al. in Biochem. Biophys. Acta 485, 1-12 (1977) und von Kulys et al. in Biokhimiya, 42, Nr. 3, 453-59 (1978) beschrieben.

Es ist wichtig, daß man bei der Durchführung der vorer wähnten Reaktionen Bedingungen vermeidet, die zu einer Denaturisierung der Isomerase mit einem dadurch beding ten Aktivitätsverlust führt. Beispielsweise muß man extre me pH-Werte und Temperaturen während aller Manipulationen, die erforderlich sind, um die obigen Umsetzungen durchzu führen, vermeiden.

Beispiele für Reagentien, die zum Modifizieren der Isome rase unter Einführung von polymerisierbaren Vinylgrup pen geeignet sind, sind Acryloylchlorid, Methacryloyl chlorid, Acrolein, Crotonaldehyd, Maleinsäureanhydrid, 3,4-Depoxybuten, Acrylsäure-2,3-epoxypropylester, Acryl säure-2,3-thioglycidylester, 1-Allyloxy-3-(N-ethylen imin)-2-propanol, Acrylsäure-O-succinamidester, Chlor maleinsäureanhydrid, Maleinsäureazid, 3-Brompropen und Allylisothiocyanat. Einige Verbindungen sind in der Lage mit den freien Aminogruppen der Isomerase zu reagie ren, z. B. epsilon-Aminogruppen von Lysinresten.

Weitere Verbindungen, die in der Lage sind, mit den freien Carboxylgruppen der Isomerase zu reagieren, kann man auch verwenden, um polymerisierbare Vinylreste als Substituenten einzuführen, wie für jeden Fachmann er sichtlich ist.

Beispiele für Vinylverbindungen, die man mit der modi fizierten Isomerase copolymerisieren kann, sind Natrium acrylat, Natriummethacrylat, Acrylamid, Hydroxyethyl methacrylat, Acryloylpiperidin-4-spiro-2′-(1′,3′-diox acrylopentan), 1-Acryloyl-4-piperidon und Acryloyl methoxyamin. Im allgemeinen bevorzugt man wasserlösliche Monomere oder Monomerengemische, welche wasserlösliche Polymere ergeben (wenn man sie in Abwesenheit eines Ver netzungsmittels polymerisiert).

Typische difunktionelle Vinylverbindungen werden in die Monomerengemische (in Mengen von 0,1-5% der Gesamtmono meren) eingebracht, um Vernetzungsstellen auszubilden, die dann zu dreidimensionalen Polymerennetzwerken führen. Geeignete Verbindungen sind N,N′-Methylen-bis-acrylamid und Ethylenglykoldimethacrylat. Bei Verwendung dieser Ver bindungen bilden die polymerisierten Mischungen unlösliche Gele unter Erhalt einer immobilisierten Isomerase.

Die üblicherweise bei Vinylpolymerisationen verwendeten Initiatoren können auch hier verwendet werden, z. B. Ammoniumpersulfat plus Natriumbisulfit, Hydrogenperoxid plus Ferrosulfat, Kaliumsulfat plus N,N,N′,N′-Tetra methyl-ethylendiamin und Riboflavin (plus Licht).

Alternativ können nicht-kovalente Bindungen an die drei dimensionale Polymermatrix ausreichen, um dem Isomerase molekül die gewünschte Festigkeit zu geben und dadurch eine merkliche Erhöhung der Thermostabilität zu bewir ken. Dies kann man erzielen, wenn man Isomerase mechanisch in ein vernetztes Polymergel einhüllt. In diesem Fall ist es nicht erforderlich, daß man die Isomerase durch Ein führen einer Vinylverbindung vor der Polymerisationsstu fe modifiziert. Die Konzentration des Gels muß jedoch größer als etwa 30 Gew.-% betragen, um eine merkliche Sta bilisierung zu erzielen, wobei Gele mit einer Konzentration von etwa 50% bevorzugt werden. Monomere, die Polymergele ergeben, die elektrostatische und Wasserstoffbindungen mit der Isomerase ausbilden, sind beispielsweise Natrium acrylat, Natriummethacrylat, Acrylamid und Hydroxyethyl methacrylat.

Beispiele für die Stabilisierung durch Inkorporieren in einen Gel werden von Martinek et al. in Biochem. Biophys. Acta 485, 13-28 (1977) und von Kulys et al. in J. Solid Phase Biochem. 3, 95-105 (1978) angegeben.

Eine dritte Methode zur Verfestigung der Isomerase besteht in einer intramolekularen Vernetzung, wodurch eine zusätzliche Thermostabilität erzielt wird.

Beispiele für solche Stabilisatoren werden von Torchilin et al. in Biochem. Biophys. Acta, 522, 277-283 (1978), Martinek et al. in J. Solid Phase Biochem. 2, 343-85 (1977) und Torchilin et al. in Biochem. Biophys. Acta, 568, 1-10 (1979) beschrieben.

Geeignete erfindungsgemäße verwendbare Vernetzungsmittel sind zweifunktionelle Verbindungen, die in der Lage sind, mit den entsprechenden funktionellen Gruppen an dem Enzymmole kül zu reagieren. Meistens sind solche funktionellen Grup pen Aminogruppen, und zwar im allgemeinen primäre Amino gruppen, die mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, wie Carboxylsäuren, Sulfonylhalogeniden, Aldehyden, Iso cyanaten, Propiolaten und dergleichen reagieren können.

Die Vernetzungsmittel schließen somit Dicarbonsäureanhydride, wie Bernsteinsäureanhydrid und Adipinsäureanhydrid ein und die entsprechenden Dialdehyde schließen Glyoxal, Bernstein säureanhydrid und Glutaraldehyd ein. Ungesättigte Verbin dungen, wie Acrolein und Crotonaldehyd, Diolpropiolate, wie Ethylenglykol-bispropiolat, Propylenglykolbispropiolat und Hexamethylenglykolbispropiolat sowie Disulfonyl halogenide, wie Benzol-1,3-disulfonylchlorid, Naphthalin- 1,5-disulfonylchlorid und Tolyl-2,4-disulfonylchlorid sind eingeschlossen.

Da das Enzym Säuregruppen enthält oder so modifiziert wird, daß es Säuregruppen enthält, die mit Aminen reaktiv sind, kann man difunktionelle Amine als Vernetzungsmit tel verwenden. Dazu gehören beispielsweise Diamine mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Phenylen diamin, Butylendiamin, Hexylendiamin, Octylendiamin, Pentylendiamin, Ethylendiamin und Dodecylendiamin.

Die Menge des Vernetzungsmittels kann erheblich variieren, wobei das Verhältnis von Enzym zu Vernetzungsmittel im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,0001 liegt. Das Verfahren zur Erzielung der jeweiligen Bindung hängt zu einem ge wissen Grad von der Art des ausgewählten Vernetzungs mittels und des Enzyms ab. Im allgemeinen wird das Reagens in einem geeigneten inerten Lösungsmittel gelöst und die Umsetzung wird bei einer ausreichend niedrigen Temperatur durchgeführt, um negative Wirkungen auf das Enzym, das gegenüber hohen Temperaturen empfindlich ist, zu vermei den. Im allgemeinen wird daher die Umsetzung vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur durchgeführt unter Verwendung von Wasser oder wäßrigen Lösungsmitteln als Reaktionsmedium.

Außer der Einführung von polymerisierbaren Vinylgruppen in das Enzymmolekül und anschließender Polymerisation gemäß den vorerläuterten Verfahren schließt eine weitere Ausführungsform ein, daß man ein vorgebildetes Polymer mit der Isomerase unter Ausbildung von intermolekularen kovalenten Bindungen und Bildung eines stabilisierten Moleküls kondensiert. Beispielsweise kann man Polypeptide, wie natürlich vorkommende Proteine und deren Hydrolyse produkte nach bekannten Verfahren unter Ausbildung von Peptidbindungen mit Glucoseisomerase unter Bildung eines stabilisierten Enzyms umsetzen. Die so hergestellten Produkte können wasserlöslich sein, aber man kann sie unter Verwendung von Vernetzungsmitteln, wie Glutaraldehyd, unlöslich machen und das dabei gebildete vernetzte Enzym ist dann gewöhnlich besonders stabil. Die Peptidbildungs reaktionen werden in bekannter Weise durchgeführt, z. B. unter Verwendung von Carbodiimiden.

Gewünschtenfalls kann das Ausgangsenzym derivatisiert werden, um eine gewünschte Funktionalität in das Molekül zum Zwecke der Kondensation mit dem vorgebildeten Mole kül einzubringen. So kann man zum Einbringen einer Carboxy funktionalität ein freies Amino-enthaltendes Enzym mit einer Dicarbonsäure umsetzen unter Ausbildung eines Carb oxy-enthaltenden Enzyms.

Bevorzugte Polymere, die in der vorerwähnten Ausführungs form verwendet werden können, sind alle solche, die die jeweiligen Arten und Mengen der funktionellen Gruppen, z. B. Amino oder Carboxy, für die beabsichtigte Reaktion enthalten. Bevorzugt werden Polypeptide, wie natürliche Proteine, z. B. Chitosan, Hefeprotein und dergleichen und auch Mischungen davon und als aminohaltige Polymere Poly ethylenimin. Im allgemeinen bilden die bevorzugten vorge bildeten Polymere wasserlösliche Produkte, wobei diese dann vorzugsweise durch Umsetzen mit einem Vernetzungs mittel, z. B. mit Glutaraldehyd und in anderen vorher erwähnten unlöslich gemacht werden.

Bei den vorerwähnten Modifizierungsmethoden für das Enzym ist es wesentlich, daß eine ausreichende chemische Funk tionalität, z. B. Amino- oder Carboxy-Gruppen, vorliegen, um ein ausreichendes Niveau des gewünschten Ergebnisses zu erzielen.

Bei der Auswahl des vorgebildeten Polymers, das mit dem Enzym umgesetzt werden soll, ist es beispielsweise er forderlich, daß das Polymer Gruppen enthält, die mit den verfügbaren Gruppen an dem Enzymmolekül reaktiv sind. So würde man ein Protein mit Carboxygruppen auswählen, um mit den entsprechenden Aminogruppen des Enzyms zu reagie ren. Darüber hinaus muß eine ausreichende Anzahl der reaktiven Gruppen bei den ausgewählten Reaktanten vor liegen, um eine Bindung an vielen Stellen zu bewirken, und dadurch eine merkliche Stabilisierung zu erzielen. Die Bestimmung der Art und der Zahl solcher reaktiven Gruppen für die jeweiligen Reagentien ist natürlich aus dem Stand der Technik bekannt.

Ein weiteres Verfahren, mittels dessen man die Thermosta bilität von Enzymen erhöhen kann, besteht darin, daß man die Oberflächenstruktur chemisch verändert, und zwar ohne merklichen Aktivitätsverlust. So kann man Oberflächenamino gruppen amidinieren (Ludwig, M. L. und Hunter, M. J., Meth. Enzymol. 11, 595-604 (1967)) oder guanidinieren (Kimmel, J. R., Meth. Enzymol. 11, 584-589 (1967)), um Substituenten auszubilden, die Arginin sehr ähnlich sind. Milchsäuredehydrogenase und andere Proteine sind so stabilisiert worden (siehe Tuengler, F. und Pfleiderer, G., Biochem. Biophys. Acta, 284, 1-8 (1977); Minotani, N., et al., Biochim. Biphys. Acta, 581, 334-341 (1979); und Cupo, P., et al., J. Biol. Chem., 255, 10 828-10 833 (1980)).

Die Aktivität von löslichen Isomerasezubereitungen wurde bestimmt nach Lloyd et al. in Cereal Chemistry, 49, Nr. 5, Seiten 544-553 (1972). Ein IGIU ist die Menge an Isomerase, die 1 µMol Glucose pro min in Fructose umwandelt, und zwar in einer Lösung, die 2 Mol Glucose pro l, 0,02 Mol MgSO₄ pro l und 0,001 Mol CoCl₂ pro l bei einem pH von 6,85 (0,2 M Natriummaleat) enthält und eine Temperatur von 60°C aufweist.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird die direkte Isomerisierung einer glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus raffinier tem Maisstärkehydrolysat besteht unter Erhalt einer Zu sammensetzung mit 55,5% Fructose (Trockenbasis) und unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfah ren beschrieben. Zunächst wird eine Niedrigtemperatur isomerisierung bei 70°C durchgeführt und das Produkt die ser Umsetzung wurde in einem zweiten Hochtemperaturreaktor (105,2°C), enthaltend chemisch stabilisierte Isomerase, eingeführt. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein lösli ches Polymer gebunden war, welches dann unter Ausbildung eines immobilisierten Katalysators insolubilisiert wurde.

Das Hydrolysat wurde aus Maisstärke nach dem in US-PS 36 44 126 (Verflüssigung) und US-PS 32 80 006 (Sacchari fizierung) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die sacchari fizierte Flüssigkeit wurde gemäß US-PS 38 34 940 raffiniert unter Erhalt von 95,3%iger Glucose (Trockenbasis). Es wurde ausreichend kristallinie Glucose zugegeben und der Gesamtglucosegehalt auf 97,6% (Trockenbasis) gebracht. Die erhaltene Lösung hatte folgende Zusammensetzung:

Gesamttrockensubstanz (%)
50,2
Glucose (% Trockenbasis)	97,6
Fructose (% Trockenbasis)	0,0
Polysaccharid (% Trockenbasis)	2,4
Psicose (% Trockenbasis)	0,0
NaHSO₃ (mM)	50,0
MgSO₄ (mM)	5,0
CoCl₂ (mM)	0,1
pH	6,8

Die Niedrigtemperaturisomerisierung wurde durchgeführt, indem man die obige Substratlösung durch den Niedrig temperaturreaktor mit einer Fließrate von 3,2 ml/min bei 70°C pumpte. Der Niedrigtemperatur (70°C)-Isomera sereaktor bestand aus gepackter Isomerase, die auf DEAE-Cellulose (hergestellt gemäß US-PS 37 88 945) immobilisiert war und die in eine Säule eingebracht wurde mit einem Durchmesser von 2,54 cm, wobei die Säule einen Einlaß und einen Auslaß hatte und die mit einem Mantel zum Zirkulieren von Wasser aus einem Thermostaten versehen war. Der Kopfraum oberhalb der Packung enthielt ein Thermometer und war im übrigen mit Glasperlen gefüllt, um den toten Raum soweit wie mög lich zu minimieren. Der Reaktor enthielt ausreichend immobilisierte Isomerase, um 20 000 IGIU zu ergeben und das gepackte Bett hatte eine Höhe von etwa 15 cm. Die ersten 1000 ml, die aus dem Reaktor heraustraten, wurden verworfen. Anschließend wurde der Abfluß zur Verwendung in der zweiten Hochtemperaturisomerisierung gesammelt.

Der chemisch stabilisierte Katalysator für den Hochtempe raturreaktor wurde in folgender Weise hergestellt:

Eine Spezies von Streptomyces rubigenosus, erhalten von S. rubigenosus ATCC 21175 wurde in einer aeroben Tauchfer mentation auf einem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:


Gew.-%
Dextrose
9,0
Maismeische	1,6
Diammoniumphosphat	0,08
Mangansulfat	0,06
Antischaummittel (Pluronic PL-61)	0,003

Das Medium wurde 45 min bei 121°C sterilisiert, abgekühlt und auf den pH 6,8-7,0 eingestellt. Dann wurde es mit 14% (V/V) eines Inokulums aus dem Gehalt eines Impfgut fermenters, hergestellt mit der S. Rubigenosus-Variante der oben erwähnten Art, inokuliert. Die Fermentierung wur de unter aseptischen Bedingungen bei 30°C während etwa 60 h unter Belüftung mit 0,65 vvm. durchgeführt. S. rubigenosus ATCC 21175 kann auch zum Inokulieren und zur Herstellung von Isomerase verwendet werden, wobei in diesem Fall ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet wird:


Gew.-%
Dextrose
0,24
Maismeische (Feststoffe)	1,5
Sorbit	1,6
CoCl₂	0,02
Diammoniumphosphat	0,56
Xylose	1,0

Glucoseisomerase wurde aus dem S. rubigenosus extrahiert, wobei man eine Lösung von roher, ungereinigter Glucoseisomerase erhielt.

Die rohe Isomerase wurde dann durch Absorption auf DEAE-Cellulose (hergestellt gemäß US-PS 38 23 133) gereinigt, filtriert und das adsorbierte Produkt wurde mit 0,1 M NaCl-Lösung gewaschen unter Entfernung der Verunreinigungen und dann durch Kontaktieren mit 0,45 M NaCl-Lösung desorbiert. Während der Reinigungsstufen wurde der pH-Wert aller Lösungen auf 7,5 gehalten. Die Lösung der partiell gereinig ten Isomerase wurde mit 3 Volumina 95%igem Ethanol bei 0°C zum Ausfällen der Isomerase vermischt. Perlite-Filter hilfe wurde zugegeben und der gewonnene Feststoff wurde durch Filtrieren gewonnen und an der Luft getrocknet, wobei man eine lösliche Isomerasezubereitung erhielt, die 2500 IGIU/g enthielt.

Die gereinigte Isomerase wurde in 1 mM MnCl₂ bei Raum temperatur gelöst unter Erhalt einer Lösung, enthaltend 10 mg Isomerase pro ml und die Mischung wurde zur Ent fernung der Filterhilfe filtriert. Die spezifische Akti vität dieser Zubereitung betrug 37,3 IGIU/mg Protein.

Eine Lösung aus einem löslichen Polyaminpolymer wurde hergestellt, indem man 39,0 g Chitosan in 13 l 0,08 N HCl auflöste. Die Chitosanlösung wurde durch Zugabe von 380 g NaCl auf 0,5 M NaCl eingestellt und die erhaltene Lösung wurde mit 8 N NaOH auf 6,15 eingestellt. Dann wur de die Chitosanlösung durch einen Whatman 3-Papierfil ter zum Entfernen von unlöslichem Material filtriert. zu 13 l von 0,3% Chitosan in 0,5 M NaCl bei pH 6,15 wurde folgendes zugegeben: 100 ml lösliche Isomerase ent haltend 100 000 IGIU-Aktivität, 197,6 g Xylit und 0,619 g CoCl₂ · 6 H₂O. Diese Lösung wurde 2 h gerührt und anschließend wurden 6,24 g 1-Ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimid zugegeben und dadurch wurden die Carboxyl gruppen der Isomerase kovalent an vielen Punkten mit den Aminogruppen des Chitosans gebunden. Nach 2 h bei Raum temperatur wurden 15,6 ml einer 50%igen (V/V) Glutar aldehydlösung, eingestellt mit 8 N NaOH auf pH 6,0, zugegeben, um den kovalent gebundenen Isomerase-Chitosan- Komplex zu insolubilisieren. Nach 15 min wurden 2 l 1 M Phosphatlösung bei pH 8,0 zugegeben, um das Zerkleinern des bei der Glutaraldehydzugabe gebildeten Gels zu er leichtern. Das gebildete insolubilisierte Isomerase-
Chitosan wurde mit entionisiertem Wasser auf einem Buchner-Vakuumfilter gewaschen. Diese Zubereitung ließ man über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft trocknen und siebte sie dann auf einer Maschengröße von 12-60 mesh (1,4-0,25 mm). Der trockene Katalysator hatte eine Aktivität von 384 IGIU/g.

Der bei 105,2°C betriebene Reaktor wurde in folgender Wei se hergestellt: Ein 13 g-Anteil des Katalysators wurde im Substrat suspendiert und unter einem Laborvakuum bei Raumtemperatur während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,5×20 cm- Bettes in einer ummantelten Glassäule verwendet. Das ge packte Bett enthielt 4992 IGIU.

Das aus der ersten bei 70°C durchgeführten Isomerisation erhaltene Substrat wurde auf pH 6,75 eingestellt und auf 42,0% Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule unter einem Druck von 1,7 bar (10 psig) mit einer Fließrate von 1,96 ml/min bei 60°C während 30 min gepumpt. Die Temperatur in der Säule wurde mittels eines Thermometers überwacht, welches direkt ober halb des Bettes angebracht war und von 0,5 cm Glasperlen umgeben war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu minimieren. Die Säulentemperatur wurde dann schnell erhöht, indem man Öl, das in einem thermostatisch gesteuerten Bad auf 106°C eingestellt war, in Kreislauf fuhr.

Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem kalibrierten Aufzeichnungspolarimeter gemessen. Der Fructosegehalt be trug 50-58%. Nachdem die Säulentemperatur 105,2°C erreicht hatte und nachdem der Fructosegehalt des Abflusses das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt und direkt in einem Eisbad gekühlt. Der pH wurde auf 4,90 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt. Der Abfluß wurde gesammelt bis der scheinbare Fructosegehalt unter halb 55% abfiel.

Die aus dem bei 70°C und bei 105,2°C-Reaktoren erhaltene isomerisierte Lösung wurde auf die Kohlehydrat zusammensetzung und Farbe untersucht und die Ergebnisse wur den mit gleichen Analysenergebnissen verglichen, die mit einer unisomerisierten Substratlösung erhalten wurden und werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 70°C und 105,2°C isomerisiert wurden

Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 55,5%ige Fructose erhält, wobei der Gehalt an Psicose unterhalb 0,4 Gew.-% (Trockenbasis) lag. Die Erhöhung der Farbe betrug <20 (CIRF×100).

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer glucosehaltigen Lösung (bestehend aus raffiniertem Maisstärkehydrolysat plus kristalliner Glucose) bei einer hohen Temperatur unter Erhalt einer Zusammensetzung, die 55,2% Fructose auf Trockenbasis enthielt, gezeigt, wobei eine zweistufige Isomerisierung angewendet wurde und man bei der zweiten Stufe eine chemisch stabilisierte Isomerase verwendete, die aus Glucoseisomerase bestand, die mit Polyethylenimin einen Komplex bildete und wobei der Komplex durch Behandeln mit Glutaraldehyd unlöslich gemacht wurde.

Herstellung von stabilisierter Isomerase

Eine lösliche Glucoseisomerase wurde wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die gereinigte Isomerase wurde in 1 mM MnCl₂ unter Erhalt einer Lösung, enthaltend 9 mg Isomerase pro ml bei Raumtemperatur gelöst und von der Mischung wurde die Filterhilfe abfiltriert. 60 ml 10%iges (W/V) Polyethylenimin (Molekulargewicht 600, pH 8) und 3 g Xylit wurden zu 300 ml der Enzymlösung gegeben und die erhaltene Lösung wurde für 15 min gerührt. 10 ml 2,5 M Glutaraldehyd wurden zugegeben und die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das insolubilisierte Enzym wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht in einem Konvektionsofen bei 37°C getrocknet. Nach dem Trocknen erhielt man 12,8 g immobilisierte Isomerase, enthaltend etwa 775 IGIU/g. 12 g des immobilisierten Enzyms wurden in dem Substrat suspendiert, im Vakuum bei 60 min bei Raumtemperatur entlüftet und zur Herstellung eines Hochtemperaturreaktors mit einem Durchmesser von 1,5 cm verwendet.

Das Substrat für den Reaktor wurde in der ersten Stufe der zweistufigen Isomerisierung wie im Beispiel 1 hergestellt. Dieses Substrat hatte folgende Zusammensetzung:

Gesamttrockensubstanz (%)
42,6
Glucose (% Trockenbasis)	46,4
Fructose (% Trockenbasis)	51,3
Polysaccharid (% Trockenbasis)	2,3
Psicose (% Trockenbasis)	0,0
NaHSO₃ (mM)	0
MgSO₄ (mM)	50
CoCl₂ (mM)	0,1
pH	6,75

Das Substrat wurde durch den Reaktor während 45 min bei 60°C in einer Rate von etwa 5 ml/min gepumpt. Die Säulentemperatur wurde auf 101,6°C erhöht und die Fließrate auf 2 ml/min verringert. Ein Druck von 1,84 bar wurde an die Säule angelegt, um ein Sieden des Substrats zu verhindern. Der Abfluß wurde mit einem kalibrierten Aufzeichnungspolarimeter überwacht und enthielt 50-58% Fructose. Der Abfluß, der mehr als 55% Fructose enthielt, wurde in einem Eisbad gesammelt und mit 1,0 M Zitronensäure auf pH 4,0 eingestellt.

Der Abfluß aus dem Hochtemperaturreaktor, das Substrat aus dem Reaktor der ersten Stufe und die ursprüngliche glucosehaltige Lösung, die als Substrat in dem Reaktor der ersten Stufe verwendet worden war, wurden analysiert auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Zusammensetzung der Lösungen aus der Isomerisierung der ersten und zweiten Stufe

Diese Ergebnisse zeigen, daß man 55,2%ige Fructose erhält, wobei der Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-% (Trockenbasis) liegt.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung von Glucose zu einer 57,2%igen Fructose durch ein zweistufiges Isomerisierungsverfahren gezeigt, wobei der erste Reaktor bei 70°C und der zweite (Hochtemperatur-)Reaktor bei 110,4°C betrieben wurde. Die bei der Hochtemperaturreaktion verwendete chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein lösliches Polymer gebunden war, welches dann unter Ausbildung eines immobilisierten Katalysators insolubilisiert wurde.

Das Substrat und dessen Umwandlung in dem bei 70°C betriebenen Reaktor der ersten Stufe wird in Beispiel 1 beschrieben.

Der in dem Hochtemperatur-Reaktor bei 110,4°C verwendete immobilisierte Katalysator wird gleichfalls im Beispiel 1 beschrieben.

Der 110,4°C-Reaktor wurde in folgender Weise hergestellt. Ein Anteil von 28,4 g des Katalysators wurde in dem Substrat gelöst und unter einem Laboratoriumsvakuum bei Raumtemperatur während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 2,5×12,4 cm-Bettes in einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 10.885 IGIU.

Das in der ersten, bei 70°C betriebenen Isomerisierungsstufe erhaltene Substrat wurde auf pH 6,47 eingestellt und auf 42,0% Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule unter einem Druck von 1,84 bar (12 psi) mit einer Fließrate von 3,38 ml/min bei einer Temperatur von 60°C während 30 min gepumpt. Die Temperatur innerhalb der Säule wurde mittels eines Thermometers, das direkt oberhalb des Bettes angebracht war und das durch 0,3 cm Glasperlen umgeben war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu minimieren, überwacht. Die Säulentemperatur wurde dann schnell erhöht, indem man Öl mit einer Temperatur von 111°C aus einem thermostatisiertem Bad durch die Ummantelung zirkulierte.

Der Abfluß aus der Kolonne wurde mit einem kalibrierten Aufzeichnungspolarimeter überwacht und enthielt 50-58% Fructose. Nachdem die Säulentemperatur 110,4° erreicht hatte, und nachdem der Fructosegehalt im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt und unmittelbar darauf in einem Eisbad gekühlt. Der pH wurde auf 4,0 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt.

Die bei 70°C und 110,4° aus den Reaktoren erhaltenen isomerisierten Lösungen wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe untersucht und die Ergebnisse wurden mit Analysen verglichen, die man mit unisomerisierten Substratlösungen erhielt. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Zusammensetzung von Substratlösungen, isomerisiert bei 70°C und bei 110,4°C

Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 57,2%ige Fructose erhält mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,4 Gew.-% (Trockenbasis) und wobei der Farbwert (CIRFX100) unterhalb 20 liegt.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird die Direktionsisomerisierung einer glucosehaltigen Lösung aus hauptsächlich raffiniertem Maisstärkehydrolysat gezeigt, wobei man eine Zusammensetzung mti 56,3% Fructose auf Trockenbasis unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfahren erhielt. Zunächst wurde eine Isomerisierung bei niedriger Temperatur bei 70°C durchgeführt und das Produkt aus dieser Umsetzung wurde als Zufuhr für einen zweiten Hochtemperaturreaktor (103,3°C) verwendet, wobei der Hochtemperaturreaktor chemisch stabilisierte Isomerase enthielt. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym mit einem Schutzprotein (z. B. einem solchen, das sich von Hefe ableitet) koreagiert worden war.

Die Niedrigtemperaturisomerisierungsstufe einschließlich der Beschreibung des Substrats und der Versuchsbedingungen entsprechen denen des Beispiels 1.

Das chemisch stabilisierte Glucoseisomeraseenzym, welches in dem Hochtemperaturreaktor verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt: Lösliche Glucoseisomerase, die chemisch stabilisiert werden sollte, wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt. Die spezifische Aktivität dieser Zubereitung betrug etwa 40 IGIU/mg Protein. Ein Schutzprotein wurde aus Bäckerhefe wie folgt erhalten: Zu 1229 g eines feuchten Kuchens aus Bäckerhefe wurden 1000 g Wasser und 500 g Toluol gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur erwärmt und dann auf 85°C erhitzt und bei dieser Temperatur etwa 30 min gehalten. Dann wurde die Mischung auf einem Buchner-Trichter filtriert. Nahezu das gesamte Toluol verblieb in der unlöslichen Zelldebris, während das wäßrige Filtrat lösliches Hefeextrakt enthielt. Das wäßrige Filtrat wurde auf einem Drehverdampfer bei 40°C auf 276 g vermindert und dann wurden 41 g Trichloressigsäure unter Rühren zugegeben. Das ausgefallene Hefeprotein wurde gesammelt und in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) wieder aufgelöst. Dann wurde durch Filtrieren geklärt und die Lösung wurde mit 900 ml (etwa 3 Volumina) Aceton behandelt. Der Niederschlag wurde gesammelt, in 0,01 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und die erhaltene Lösung wurde gegen einen 0,01 M Natriumphosphatpuffer dialysiert. Das erhaltene Produkt (150 ml) war mit den aus Bäckerhefe erhaltenem Schutzprotein markiert. Eine 0,6%ige Chitosanlösung wurde hergestellt, indem man 24 g Chitosin in 4 l 0,08 N HCl löste. Die Lösung wurde mit 8 N auf den pH-Wert 6,2 eingestellt, durch ein Whatman 3-Filterpapier filtriert und dann gegen 16 l entionisiertes Wasser dialysiert. In ein 400 ml Glas wurden etwa 100 000 IGIU lösliches Glucoseisomeraseenzym (vermischt mit Filterhilfe), 1 g Xylit und 100 ml (2/3) des aus der Bäckerhefe erhaltenen Schutzproteins vorgelegt. Zu dieser Mischung wurden 2,4 mg MgSO₄ · 7 H₂O und 24 µl einer molaren Kobaltchloridlösung gegeben. Von der Mischung wurde die Filterhilfe abfiltriert und die Lösung wurde auf einem Drehverdampfer bei etwa 40°C bis nahezu zur Trockne in einem 2 l Rundkolben konzentriert. Zu dem Kolben wurden dann 800 ml Chitosan (pH 6,2) gegeben. Die Mischung wurde auf einem Drehverdampfer von ewa 40°C auf nahezu zur Trockne konzentriert und dann wurden 640 µl 50%ige Glutaraldehydlösung (pH auf 6,5 eingestellt) zugegeben. Die Mischung wurde in einem kalten Raum über Nacht aufbewahrt. Dann wurde das Gel aus dem Kolben entnommen und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,595 mm gepreßt und bei etwa 37°C ofengetrocknet. Die trockene Enzymbereitung wurde zur Entfernung von Feinstoffen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,177 mm gesiebt und dann wurden (8,9 g des Endproduktes) für die Hochtemperaturisomerisierung verwendet.

Ein Reaktor, der bei 103,3°C betrieben wurde, wurde wie folgt hergestellt: Die obige Glucoseisomerasezubereitung (8,9 g) wurde in dem Substrat suspendiert und unter einem Laboratoriumsvakuum 30 min bei Raumtemperatur entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,5×29 cm-Bettes in einer unmantelten Glassäule verwendet.

Das aus der ersten bei 70°C betriebenen Isomerisierung erhaltene Substrat wurde auf pH 6,75 eingestellt und auf 42,0% Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einer Fließrate von etwa 1,5 ml/min und bei einer Temperatur von 60°C während 30 min gepumpt. Die Temperatur innerhalb der Säule wurde mit einem Thermometer, das direkt oberhalb des Bettes angebracht war und das von Glasperlen (0,5 mm Durchmesser) umgeben war, um das tote Volumen zu minimieren, überwacht. Die Säulentemperatur wurde dann schnell durch durch die Ummantelung zirkulierendes Öl aus einem 104°C thermostatisierten Bad erhöht.

Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter, das Ablesungen von 50-58% Fructose zeigte, überwacht. Fraktionen (etwa 5 ml) wurden gesammelt bis 55% oder mehr Fructose gebildet wurden und an diesem Punkt wurde der Versuch abgebrochen. Während der Probenentnahme wurde der Abfluß schnell auf einem Eisbad gekühlt und der pH wurde auf etwa 4,0 durch Zugabe von molarer Zitronensäure (0,1 ml) und dann durch verdünnte HCl auf etwa 4,0 eingestellt.

Die bei 70°C und bei 103,3°C aus den Reaktoren erhaltenen isomerisierten Lösungen wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe untersucht und die Ergebnisse wurden mit Analysen verglichen, die mit unisomerisierter Substratlösung erhalten wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 70°C und bei 103,3° isomerisiert wurden

Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 56,3%ige Fructose erhält, wobei der Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-% (Trockenbasis) lag.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus einem raffinierten Maisstärkehydrolysat mit einer niedrigen Salzkonzentration bestand, gezeigt unter Erhalt einer Zusammensetzung mit 55,4% Fructose auf Trockenbasis und unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfahrens. Zunächst wurde eine Niedrigtemperaturisomerisierung bei 70°C durchgeführt und das Produkt aus dieser Umsetzung wurde als Zufuhr in einem zweiten Hochtemperaturreaktor (112,6°C), enthaltend chemisch stabilisiertes Isomerase, verwendet. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein lösliches Polymer mit zahlreichen Bindungen gebunden war und welches unter Ausbildung eines immobilisierten Katalysators dann unlöslich gemacht worden war.

Das Hydrolysat wurde aus Maisstärke nach den in US-PS 36 44 126 (Verflüssigung) und US-PS 32 80 006 (Saccharifizierung) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die saccharifizierte Flüssigkeit wurde gemäß US-PS 38 34 940 gereinigt unter Erhalt eines Produktes, enthaltend 93,8% Glucose (Trockenbasis). Es wurde soviel kristalline Glucose zugegeben, daß der Gesamtglucosegehalt 96,9% (Trockenbasis) betrug. Die erhaltene Lösung hatte folgende Zusammensetzung:

Gesamttrockensubstanz (%)
50,3
Glucose (% Trockenbasis)	96,9
Fructose (% Trockenbasis)	0,1
Polysaccharid (% Trockenbasis)	3,1
Psicose	0,0
NaHSO₃ (mM)	2,5
MgSO₄ (mM)	2,5
CoCl₂ (mM)	0,1
pH	6,8

Die Niedrigtemperaturisomerisierung wurde durchgeführt, indem man die obige Substratlösung bei 70°C durch den in Beispiel 1 beschriebenen Niedrigtemperaturreaktor mit einer Fließrate von 2,5 ml/min pumpte. Die ersten aus dem Reaktor abfließenden 1000 ml wurden verworfen. Der anschließend aus dem Reaktor erhaltene Abfluß wurde für die Verwendung bei der zweiten Hochtemperaturisomerisierung gesammelt.

Der in dem Hochtemperaturreaktor verwendete chemisch stabilisierte Katalysator wurde in folgender Weise hergestellt: Lösliche Glucoseisomerase wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt. Die spezifische Aktivität dieser Zubereitung betrug etwa 40 IGIU/mg Protein. Eine Lösung eines löslichen Polymers, eines Polyamins, wurde erhalten, indem man 48,4 g Chitosan in 15 l 0,08 N HCl löste. Die Chitosanlösung wurde durch Zugabe von 438 g NaCl auf 0,5 M NaCl eingestellt und die erhaltene Lösung wurde mit 8 N NaOH auf den pH 6,1 eingestellt. Dann wurde die Chitosanlösung durch ein Whatman 3-Filter zur Entfernung von unlöslichem Material filtriert. Zu 15 l 0,3% Chitoson in 0,5 M NaCl bei pH 6,1 wurden folgende Substanzen zugegeben: 520 ml lösliche Isomere, enthaltend etwa 602 000 IGIU-Aktivität, 236 g Xylit und 3,07 g MnCl₂ · 4 H₂O.

Diese Lösung wurde 2 h gerührt und dann wurden 7,44 g 1-Ethyl-3-dimethyl-aminopropylcarbodiimid zugegeben, um die Carboxylgruppen der Isomerase an die Aminogruppen des Chitosans kovalent an zahlreichen Punkten zu binden. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurden 15,5 ml einer 50%igen (W/W) Glutaraldehydlösung, eingestellt auf 6,0 mit 8 N NaOH, zu der Reaktionsmischung zugegeben, um den kovalent gebundenen Isomerase-Chitosan-Komplex zu insolubilisieren. Nach 15 min wurden 4 l einer 1 M Phosphatlösung bei pH 8,0 in das unlösliche Isomerase- Chitosan eingemischt. Das immobilisierte Isomerase- Chitosan wurde mit entionisiertem Wasser auf einem Buchner-Vakuum-Filter mit einem Whatman 3-Filterpapier gewaschen. Die Zubereitung wurde dann an der Luft getrocknet, zerkleinert und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1,4 bis 0,25 mm gesiebt. Der trockene Katalysator zeigte eine Aktivität von 803 IGIU/g.

Ein 112,6°C-Reaktor wurde wie folgt hergestellt. Ein 7,0 g Anteil des Katalysators wurde in dem Substrat suspendiert und unter einem Laboratoriumsvakuum bei Raumtemperatur während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,0×40 cm-Bettes in einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 5621 IGIU.

Das bei der ersten 70°C-Isomerisierung erhaltene Substrat wurde auf pH 6,55 eingestellt und dann mit entionisiertem Wasser auf 42,0% Trockensubstanz verdünnt, wodurch auch die Salzkonzentration auf 2,1 mM NaHSO₃ und 2,1 mM MgSO₄ erniedrigt wurde. Dieses Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einem Druck von 1,84 bar (12 psig) während 10 min mit einer Fließrate von 8 ml/min bei 60°C gepumpt. Die Temperatur in der Säule wurde mittels eines Thermometers überwacht, welches direkt oberhalb des Bettes angebracht und das mit Sand bis zur Temperaturskala eingebettet war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu vermindern. Die Säulentemperatur wurde dann schnell durch aus einem thermostatisierten Bad auf etwa 114°C erhitztes zirkulierendes Öl erhöht. Die Säulentemperatur wurde auf 112,6°C erhöht und die Fließrate auf 1,89 ml/min vermindert.

Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter überwacht, welches Ablesungen zwischen 50 und 58% Fructose zeigte. Nachdem die Säulentemperatur 112,6°C erreicht hatte und der Fructosegehalt im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt. Der pH wurde unmittelbar darauf durch Zugabe von 1 M Zitronensäure auf 4,0 eingestellt und der Abfluß wurde gesammelt bis der scheinbare Fructosegehalt unterhalb 55% absank.

Die aus den 70°C- undd 112,6°C-Reaktoren erhaltenen isomerisierten Lösungen wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe untersucht und die Ergebnisse wurden mit solchen Analysen verglichen, die mit unisomerisierten Substratlösungen erhalten wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 70°C und 112,6°C isomerisiert wurden

Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 55,4%ige Fructose mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-% (Trockenbasis) und einen Farbwert <9 (CIRF×100) erhält.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus raffiniertem Maisstärkehydrolysat mit niedrigem Salzgehalt bestand, unter Erhalt einer Zusammensetzung mit 54,8% Fructose auf Trockenbasis und einem sehr niedrigen Gehalt an Psicose (<0,1%) und einer Farbe (<2 CIRF×100), und unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfahrens. Der erste (Niedrigtemperatur-)Reaktor wurde bei 70°C und der zweite (Hochtemperatur-)Reaktor bei 105,8°C betrieben. Die im Hochtemperaturreaktor verwendete chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein geeignetes Polymer mit zahlreichen Verknüpfungspunkten gebunden war, worauf man dann einen insolubilisierten immobilisierten Katalysator herstellte.

Das Substrat und dessen Umwandlung in dem bei 70°C betriebenen Reaktor in der ersten Stufe war das gleiche wie im Beispiel 5.

Der in dem Hochtemperaturreaktor bei 105,8°C verwendete immobilisierte Katalysator war der gleiche wie im Beispiel 5.

Der 105,8°C-Reaktor wurde wie folgt hergestellt: Ein 5,63 g Anteil des Katalysators wurde in dem Substrat suspendiert und unter Laboratoriumsvakuum bei Raumtemperatur während 30 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,0×32 cm Bettes in einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 4521 IGIU.

Das in der Isomerisierung der ersten Stufe bei 70°C erhaltene Substrat wurde auf pH 6,5 eingestellt und mit entionisiertem Wasser auf 42,0% Trockensubstanz verdünnt, wodurch auch die Salzkonzentration auf 2,1 mM MgSO₄ und 2,1 mM NaHSO₃ erniedrigt wurde. Das Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einem Druck von 1,7 bar (10 psig) und mit einer Fließrate von 8 ml/min während 10 min gepumpt und dabei die Temperatur bei 60°C gehalten. Die Temperatur in der Säule wurde mittels eines Thermometers überwacht, das direkt oberhalb des Bettes angebracht war und welches bis zum Beginn der Temperaturskala mit Sand umgeben war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu minimieren. Die Säulentemperatur wurde dann schnell durch in der Umwandlung zirkulierendes Öl aus einem thermostatisierten Bad von etwa 107°C erhöht.

Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter, das auf Ablesungen zwischen 50 und 58% Fructose kalibriert war, überwacht. Nachdem die Säulentemperatur 105,8°C erreicht hatte und der Fructosegehalt im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt. Der pH wurde direkt darauf auf 4,90 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt.

Die isomerisierten Lösungen aus den 70°C- und 105,8°C- Reaktoren wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe analysiert und die Ergebnisse wurden mit Analysen verglichen, die mit der unisomerisierten Substratlösung erhalten worden waren und werden in der Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 6

Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 70°C und 105,8°C isomerisiert wurden

Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 54,8%ige Fructose erhält, mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,1 Gew.-% (Trockenbasis) und einem Farbwert (CIRF×100) unterhalb 2.

Claims

1. Verfahren zum Isomerisieren von Glucose zu Fructose, wobei man eine glucosehaltige Flüssigkeit mit stabilisierter Glucoseisomerase bei einer Temperatur zwischen 90 und 140°C bei einem pH-Wert von 3 bis 8 und einer tatsächlichen Kontaktzeit, die ausreicht, um eine Endkonzentration von wenigstens 53 bis 60 Gew.-% Fructose, bezogen auf den Gesamt-Kohlehydratgehalt in der Flüssigkeit, zu erhalten, in Berührung bringt und wobei man weniger als 1% Psicose und/oder andere Nicht- Fructose, Nicht-Glucose-Zucker erzielt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abbauzeit auf einen Wert überwacht, der gleich oder weniger als der Wert, berechnet nach der Formel t_d = a log (4300/T+273)-pH-3,23) (1)ist, worin bedeuten:
T die Reaktionstemperatur in °C;
pH den pH-Wert der Reaktionsmischung; und
t_d die Abbauzeit in Minuten ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die glucosehaltige Flüssigkeit durch die Hydrolyse von Maisstärke gewonnen wurde.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die glucosehaltigen Flüssigkeit durch Isomerisierung von Maisstärkehydrolysat bis zu einem Fructosegehalt von bis zu 52%, bezogen auf den Gesamt-Kohlehydratgehalt, erhalten wurde.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für die Glucoseisomerase ein Mikroorganismus, ausgewählt aus Streptomyces sp. ATCC 21 175 ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für die Glucoseisomerase ein Mikroorganismus ist, in welchen eine mutierte Glucoseisomerase unter Ausbildung von mutierten Genen, die eine Glucoseisomerase mit hoher Wärmestabilität ergeben, eingeführt worden ist.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die glucosehaltige Zufuhrlösung 30 bis 50 Gew.-% Kohlehydrate enthält.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die glucosehaltige Zufuhrflüssigkeit mit chemisch stabilisierter Glucoseisomerase bei 100 bis 110°C in Berührung gebracht wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Isomerisationsmediums auf 5 bis 6,5 gehalten wird.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontaktzeit 2 bis 30 Minuten beträgt.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die chemisch stabilisierte Glucoseisomerase in einer immobilisierten Form verwendet wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die chemisch stabilisierte Glucoseisomerase auf Diethylaminoethylcellulose immobilisiert worden ist.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die glucosehaltige zugeführte Flüssigkeit, enthaltend 20 bis 65 Gew.-% Glucose, mit Glucoseisomerase bei einer Temperatur von 20 bis 80°C bei einem pH von 6 bis 9 und einer Kontaktzeit, die ausreicht um einen Endgehalt in der Flüssigkeit von wenigstens 40 bis 50 Gew.-% an Fructose, bezogen auf den Gesamt-Kohlehydratgehalt, zu erhalten, in Kontakt hält, daß man die Temperatur in dem Isomerisationsmedium von 90 auf 130°C erhöht, daß man den pH-Wert des Isomerisationsmediums im erforderlichen Maße anpaßt innerhalb des Bereiches von 3 bis 8, daß man die fructosehaltige Flüssigkeit mit chemisch stabilisierter Glucoseisomerase während einer tatsächlichen Kontaktzeit, die ausreicht um einen Endgehalt in der Flüssigkeit von wenigstens 53 bis 60 Gew.-% an Fructose, bezogen auf den Gesamt- Kohlenwassserstoffgehalt, zu erzielen, in Kontakt hält, wobei man die Abbauzeit auf einen Wert einstellt, der gleich oder weniger dem Wert ist, der durch die Formel t_d = a log (4300/T+273)-pH-3,23) (1)gegeben ist, worin T die Reaktionstemperatur in °C, pH der pH-Wert der Reaktionsmischung und t_d die Abbauzeit in Minuten ist, wobei man im wesentlichen die Bildung von Psicose und/oder anderen Nicht-Glucose-Nicht-Fructose-Zuckern ausschließt.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene Fructose-Glucose-Sirup auf eine Temperatur unterhalb 80°C gekühlt wird.