DE3010790C2 - Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem, Stärke abbauendem Enzym und dessen Verwendung - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem, Stärke abbauendem Enzym und dessen Verwendung

Info

Publication number
DE3010790C2
DE3010790C2 DE3010790A DE3010790A DE3010790C2 DE 3010790 C2 DE3010790 C2 DE 3010790C2 DE 3010790 A DE3010790 A DE 3010790A DE 3010790 A DE3010790 A DE 3010790A DE 3010790 C2 DE3010790 C2 DE 3010790C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
immobilized
starch
weight
degrading enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE3010790A
Other languages
English (en)
Other versions
DE3010790A1 (de
Inventor
Masaru Souja Okayama Yoneyama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Original Assignee
Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP3287479A external-priority patent/JPS55124494A/ja
Priority claimed from JP55002316A external-priority patent/JPS601879B2/ja
Application filed by Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK filed Critical Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Publication of DE3010790A1 publication Critical patent/DE3010790A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3010790C2 publication Critical patent/DE3010790C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/22—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a beta-amylase, e.g. maltose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisiertem. Stärke abbauenden Enzyms und die Verwendung dieses Enzyms.
immobilisierte Enzyme oder unlöslich gemachte Enzyme stellte man bisher mit verschiedenen Methoden her. _
wie zum Beispiel durch Binden an einen Trägerstoff, durch Einschließen und durch Vernetzen. Es wurde jedoch |
keine Produktion von immobilisiertem. Stärke abbauendem Enzym in großem Maßstab durchgeführt, und man B
verwendete kein immobilisiertes. Stärke abbauendes Enzym zur Herstellung von Reaktionsprodukten aus stärkeartigem bzw. stärkehaltigem Stoff, weil seine Restaktivität nach der Immobilisierung im allgemeinen aufgrund der Rückbildung bzw. Retrogradation der stärkehaltigen Substratlösung mit einem Gehalt an hochmolekularen Substanzen und/oder der erforderlichen hohen Konzentration in der Substratlösung im allgemeinen gering ist.
Es wurden Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem. Stärke abbauendem Enzym und ein Reaktionsprodukt mit dem immobilisierten Enzym untersucht. Man entwickelte das erfindungsgemäße Verfahren, das sich von üblichen Immobilisierungsmethoden unterscheidet, die eine direkte Kopplung des natürlichen Enzymproteins umfassen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten. Stärke abbauenden Enzyms durch Immobilisieren eines Stärke abbauenden Enzyms durch physikalische Adsorption auf einem in Wasser unlöslichen Träger und somit Unlöslichmachen des Enzyms, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man vor der physikalischen Adsorption 0.01 bis 50/o (Gewicht/Volumen) des Stärke abbauenden Enzyms mit 0,001 bis 5% (Gewicht/ Volumen) eines mono- oder polyfunktionellen Mittels aus der aus Diazoverbindungen, Säureanhydriden, Carbonsäuren. Isocyanaten. Isothiocyanaten. Thioamiden, Imiden, Carbodiimide^ Imidocarbonaten. Aldehyden.
Acetalen. Säurehalogeniden. Säurea/.iden und Sulfonylchlorid bestehenden Gruppe bei einem pH-Wert im |
Bereich von 3 bis 10 und einer Temperatur im Bereich von 0 bis 800C 0,1 bis 50 Stunden lang in Lösung |
modifiziert, so daß das Enzym nicht dauerhaft unlöslich gemacht wird, und das entstandene, modifizierte Stärke abbauende Enzym auf einem wasserunlöslichen Träger adsorbiert.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Enzyms entsprechend den Angabendes Patentanspruchs 2.
Erfindungsgemäß \erwendbare Stärke abbauende Enzyme sind beispielsweise Cyclodextringlucanotransferase (E.C. 2.4.1.19). die den Glycosylrest der Stärke oder eines partiellen Stärkehydrolysat überträgt, und alpha-Amylase (E.C. 3.2.1.1). ,/-Amylase (E.C. 3.2.1.2), Glucoamylase (E.C. 3.2.1.3), Pullulanase (E.C. 3.2.1.41) und lsoamylase (E.C. 3.2.1.68). die glucosidische Bindungen hydrolysieren. Verwendbare Enzymzubereitungen wühlt man aus einer Gruppe aus. die rohe Enzyme von Mikroorganismen. Tieren und Pflanzen, und ihr1 gereinigten und partiell gereinigten Zubereitungen umfaßt.
Im Rahmen der Erfindung geeignete monofunktionelle ^ea;renzien bzw. Modifizierungsmittel sind beispielsweise Monoaldehydverbindungen, wie zum Beispiel Acetaldehyd. Propionaldehyd. Butyraldehyd, Octylaldehyd. Lauraldehvd. bzw. Laurinaldehyd. Oleyaldehyd. Benzaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd. und Naphthaldehyd, und ills Acylierungsmittel /um Beispiel Bernsteinsäureanhydrid. Maleinsäureanhydrid, Maleinimid und N-Acetoxysucci· nimid. Wenn man das letzte Reagenz verwendet, kann man einen Acetylrest in das Enzymprotein einführen, indem man das Enzym rr>it einem wasserlöslichen Carbodiimid anstelle von N-Acetoxysuccinimid in Gegenwart von Essigsäure behandelt.
Verwendbare bifunktionelle Reagenzien bzw. Modifizierungsmittel sind beispielsweise Diisocyanatverbindüngen, wie zum Beispiel Hexamethvlendiisocyanat. und Toluol-2.4.-diisocyanat. Dialdehydverbindiingcn, wie zum Beispiel Glyux.il. Glutar.ildehyd und Succinduildehyd. und als Diazoverbindungen zum Beispiel Bisaz.obcnzidin. Zusätzlich zu den genannten Reagenzien sind auch Ν,Ν'-Äthylenbismaleinimid und wasserlösliche Carbodiimide erfindungsgemäß verwendbar.
Verwendbare polyfunktioncllc Reagenzien bzw. Modifizierungsmittel gemäß der Erfindung sind bcispicl.swei-
h) se Cyanurchlorid, Dialclehydsiärke und Dialdchydpullulan.
Hei der Reaktion kann man eine ausreichende Menge eines lür/ym.slabili.salor.s, wie zum Beispiel ein Substrat oder Salz, zugeben und die Inaktivierung des Enzyms während der Modifizierung verhüten.
Die Modifizierung eines Stärke abbauenden Enzyms, ohne daß das Enzym dauerhaft unlöslich gemacht wird.
bedeutet, daß man die Modifizierungsreaktion derart einstellt, daß die Reaktionsmischung mit einem Gehalt an modifiziertem Enzym durchscheinend oder leicht wolkig erscheint (keine Niederschlagsbildung).
Im Rahmen der Erfindung geeignete Trägerstoffe sind beispielsweise Aktivkohle, poröses Glas, japanischer saurer Ton, Bleicherde bzw. Bleichton, Kaolinit, Aluminiumoxid. Kieselgel, Bentonit, Keramik, Hydroxylapatit, Calciumphosphatgel, Stärke, Amylose, Pullulan, Dextran, Cellulose, poröse Mischpolymerharze und ihre Derivate.
Bevorzugte poröse Mischpolymerharze sind jene, die nicht-ionisch sind und fähig sind, Enzymprotein zu adsorbieren, und die man durch Mischpolymerisation von Styroimonomerem und Methylstyrol-, Nitrostyrol-, Styrylhalogenid-, Acrylnitril-, Vinylacetat-, Vinylchlorid-, Divinylbenzol-, Butadien- oder Isopuren- bzw. hopren- jj
monoroerem hergestellt hat Geeignete handelsübliche Mischpolymerharze sind Amberlite XAD-I, XAD-Z to XAD-4, XAD-7, XAD-8, XAD-9, XAD-Il und XAD-12; Diaion HP-IO, HP-20, HP-30. HP-40 und HP-50 und Imac Syn-42, Syn-44 und Syn-46.
Zum Adsorbieren und Immobilisieren eines Stärke abbauenden Enzyms, das man derart modifiziert hat daß man das Enzym nicht dauerhaft unlöslich gemacht hat, auf einem der genannten Trägerstoffe bringt man eine Reaktionsmischung mit einem Gehalt an modifiziertem Enzym, vorzugsweise jedoch eine Lösung mit einem Gehalt an modifiziertem Enzym, mit dem Trägerstoff in berührung, nachdem man das modifizierte Enzym dialysiert und/oder ausgesalzen hat und einen Oberschuß an nicht umgesetztem Modifizierungsmittel entfernt hat.
Bezüglich der Arbeitsmethoden zum Inberührung bringen von modifiziertem. Stärke abbauendem Enzym mit dem Trägerstoff kann man eine beliebige Arbeitsmethode anwenden, sofern man dabei das modifizierte Enzym auf dem Trägentoff ohne unnötige Inaktivierung des Enzyms adsorbiert und dadurch immobilisiert: Beispielsweise, indem man einen Trägerstoff zu einer Lösung mit einem Gehalt an modifiziertem Enzym zugibt oder einen Trägerstoff in eine Säule packt und danach die Lösung durch die Säule durchleitet und das modifizierte Enzym adsorbiert und immobilisiert
Dadurch, daß der Gehalt an adsorbiertem, Stärke abbauendem Enzym im Bereich von etwa 0,001 bis 50 Gew.-°/o Trockensubstanz liegt, und insbesondere die Menge auf etwa 1 Gew.-% Trockensubstanz oder mehr leicht ansteigt, wenn man ein poröses Mischpolymerharz verwendet, kann man ein immobilisiertes Enzym mit einer extrem hohen spezifischen Aktivität erzielen.
Das derart erhaltene immobilisierte, Stärke abbauende Enzym verwendet man im allgemeinen unter den
f. nachstehenden enzymatisch wirksamen technischen Bedingungen: Man läßt die Lösung eines stärkeartigen
Substrates mit einem Gehalt an Stärke oder teilweise hydrolysierter Stärke mi*, einer Konzentration von etwa 5 bis 50 Gew.-% u.id einem D.E.-Wert unterhalb von etwa 70 mit dem immobilisierten. Stärke abbauenden Enzym bei einem pH-Wert von etwa 3 i:s 10 und einer Temperatur von etwa 20 bis 80'C etwa 0,1 bis 1000 h lang in Berührung kommen. Die partiell hydrolysierte Stärke kann man durch Verflüssigen eines Stärkebreis nach üblichen Methoden erhalten, zum P^ispiel durch Behandeln mit einer Säure oder einem verflüssigenden Enzym. Obwohl das modifizierte Enzym physikalisch gebunden ist, wenn man das immobilisierte Enzym erfindungsgemäß hergestellt hat, isi die Adsorpiionskraft sehr stark, und demgemäß beobachtet man keinerlei Auslaufen des adsorbierten Enzyms aus dem Trägerstoff sogar während einer Reaktion unter Anwendung einer hohen Koiizentration der Substratlösung.
Bezüglich der Arbeitsweise im Reaktionsgefäß mit dem immobilisierten Enzym kann man eine κintinuierliche Arbeitsweise mit einem Säulensystem oder ein chargenweises System anwenden, wobei die Gewinnung des immobilisierten Enzyms viel einfacher ist, und beide Methoden sind anwendbar.
Weil die thermische Stabilität und pH-Stabilität dcj immobilisierten, Stärke abbauenden Enzyms, das man {
erfindungsgemäß hergestellt hat, durch die Immobilisierung im Vergleich zu den Stabilitäten des natürlichen j
Enzyms beträchtlich erhöht sind, und seine Halbwertszeit im Bereich von mehreren zehn bis mehreren hundert Stunden liegt, kann man das immobilisierte. Stärke abbauende Enzym vorteilhaft zur technischen Herstellung von Reaktionsprodukten aus stärkehaltigen Stoffen verwenden.
F-'crner kann man den Trägerstoff leicht zurückgewinnen und wiederholt verwenden. Wenn das immobilisierte Enzym mit verschiedenen Mikroorganismen verunreinigt ist und seine Aktivität abnimmt, kann man den Trägerstoff leicht wiedergewinnen, weil man die Verunreinigungen, wie zum Beispiel proteinartige Substanzen, leicht aus dem Reaktorsystem durch Auswaschen des immobilisierten Enzyms mit polaren Lösungsmitteln, zum Beispiel Aceton, Methanol oder Äthanol, oder mit einer alkalischen oder sauren Lösung in einer Konzentration von etwa 0.1 bis 5 η entfernen kann. Das zurückgewonnene Harz kann man natürlich wiederholt als Trägerstoff zum Immobilisieren von Enzym verwenden.
Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem. Stärke abbauendem Enzym und die Verwendung dieses so hergestellten Enzyms gemäß den Patentansprüchen 1 und 2.
Dabei beruht die Erfindung auf der Feststellung, daß man ein immobilisiertes. Stärke abbauendes Enzym mit einer hohen Aktivität zum Stärkeabbau leicht erhalten kann, indem man in Lösung ein Stärke abbauendes Enzym mit einem Modifizierungsmittel derart modifiziert, daß das Enzym nicht dauerhaft unlöslich gemacht wird, und das modifizierte Enzym auf einem Trägerstoff adsorbiert. Die Erfindung beruht ferner auf der .Feststellung, daß man Reaktionsprodukte aus stärkehaltigen Stoffen leicht mit dem immobilisierten, Stärke /abbauenden Enzym herstellen kann.
Nachstehend wird die Erfindung durch Versuche und Beispiele näher erläutert.
Versuch 1
Herstellung eines Stärke abbauenden Enzyms
5
In 1500 I eines sterilisierten flüssigen Mediums mit einem Gehalt an 2,5% (Gewicht/Volumen) löslicher Stärke, 0,5% (Gewicht/Volumen) Maisquellwasser, 03% (Gewicht/Volumen) Ammoniumnitrat, 0,1 (Gewicht/Volumen) K2HPO4,0,05% (Gewicht/Volumen) MgSO4 · 7 H2O und 0,5% (Gewicht/Volumen) CaCO3 impfte man Bacillus stearothermophilus, kultivierte die Mischung bei 500C 72 h lang unter Rühren und aeroben Bedingungen. Die Kulturbrühe zentrifugierte man danach und erhielt eine überstehende Flüssigkeit mit einer Cyclodextringlucanotransferase-Aktivität (Aktivität glucosidischer Transferase) von 120 Einheiten/ml (wie sie gemäß der nachstehenden Untersuchungsmethode definiert sind). Die überstehende Flüssigkeit kühlte man auf 4°C ab und salzte day Enzym in der überstehenden Flüssigkeit durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 60% aus. Danach sammelte man den erhaltenen Niederschlag. Den gesammelten Niederschlag löste man in einer geringen Menge Wasser, dialysierte gegen Wasser über Nacht und lyophilisierte danach zu Pulver. Der so erhaltene pulverförmige Niederschlag wies eine spezifische Aktivität von etwa 230 Einheiten/mg Protein auf, die Gesamtaktivitätsausbeute betrug etwa 80%, bezogen auf die Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit der Kulturbrühe.
Die Aktivität der Cyclodextringlucanotransferase (die Aktivität der glucosidischen Transferase) wurde folgendermaßen untersucht:
Zu 2 ml einer Lösung von alpha-Cyclodextrin (1 Gew.-%) gab man 2 ml einer Saccharoselö^.ng (2,5 Gew.-%) und eine vorgegebene Menge Enzyrnlösung bis zu einem Endvolumen von 4,5 mL Die Misehurg inkubierte man bei 40" C für einen vorgegebenen Zeitraum und nahm 0,5 ml der Reaktionsmischung als Probe. Danach gab man zur Reaktionsmischung 0.1 ml einer Lösung mit einem Gehalt an technischer Glucoamylase (5 Einheiten) und inkubierte bei dieser Temperatur weitere 1 h lang und zersetzte alle Oligosaccharide mit alpha-l,4-Bindur.g mit Ausnahme von alpha-Cyclodextrin zu Glucose. Die freigesetzte Glucose bestimmte man mit der Somogyi-Nelson-Methode.
Eine Einheit von Cyclodextringlucanotransferase-Aktivität wird als die Menge an Enzym definiert, die 1 μΜοΙ alpha-Cyclodextrin pro min unter den genannten Bedingungen hydrolysiert
Versuch 2
Modifizierung eines stärke abbauenden Enzyms
Ein Pulver von Cyclodextringlucanotransferase, die man gemäß der Methode von Versuch 1 hergestellt halte, löste man in einem 0.05 M Acetatpuffer (0,05 Mol/l) mit einem pH-Wert von 6,0 und einem Gehalt an 0,02 M Calciumchlorid (0,02 Mol/l) und erhielt eine Stärke abbauende Enzymlösung mit einer Proteinkonzentralion von 0.2% (Gewicht/Volumen). Zu gleichen Teilen von je 4 ml der genannten Lösung gab man eine wässerige Glutaraldehydlösung. erhielt eine Konzentration von 1, 5, 10, 20, 50, 80, 100, 150 bzw. 200Gew-% Protein, unterwarf danach die erhaltenen Lösungen der Modifizierungsreaktion bei Raumtemperatur 1 h lang unter sanftem führen. Danach dialysierte man die Reaktionsmischungen gegen Wasser weitere 5 h lang und entfernte überschüssigen nicht umgesetzten Glutaraldehyd, und man jntersuchte die Aktivitäten der dialysierten Lösungen und bestimmte die Aktivitätsausbeute (Prozent), bezogen auf das eingesetzte natürliche Enzym. Die Ergebnisse sind in Zeile A der nachstehenden Tabelle gezeigt. Einen Vergleichsversuch führte man auf gleiche Weise mit der Ausnahme durch, daß man die wässerige Glutaraldehydlösung durch Wasser ersetzte. Das Aussehen der Lösungen mit einem Gehalt an modifiziertem Enzym ist in Zeile B der Tabelle beschrieben.
Versuch 3
Immobilisierung eines modifizierten. Stärke abbauenden Enzyms
Zu jeder Lösung des dialysierten modifizierten Enzyms, die man gemäß Versuch 2 hergestellt hatte, gab man 1 g (Naßgewicht) Mischpolymerharz Diaion HP-20 als Trägerstoff, adsorbierte das modifizierte Enzym und stellte immobilisiertes. Stärke abbauendes Enzym her. Man i'-tr.rsuchte die Aktivitäten des Nichtadsorbiertcn und bestimmte den Immobilisierungsgrad (%) jedes System. Die Ergebnisse sind in Zeile C der Tabelle gezeigt. Die Scheinaktivität der immobilierten. Stärke abbauenden Enzyme untersy.hte man und bestimmte die Akiivitätsausbeute (%), bezogen auf das eingesetzte natürliche Enzym. Die Ergebnisse sind in Zeile D der Tabelle gezeigt.
Wie aus den Ergebnissen der Tabelle ersichtlich ist, ist es zur Herstellung eines immobilisierten. Stärke abbauenden Enzyms mit einer hohen Scheinaktivität notwendig, daß man ein Stärke abbauendes Enzym derart modifiziert, daß man das Enzym nicht dauerhaft unlöslich macht, aber es auf einem Trägerstoff adsorbiert und immobilisiert. Obwohl ein natürliches immobilisiertes Enzym ebenfalls einen Immobilisierungsgrad νοη, 100% erzielte, stellte man nur eine viel geringere Scheinaktivität des erhaltenen immobilisierten Enzym-3 fest. Ferner verminderte die Steigerung der Modifizierungsreaktion auf ein Niveau, bei dem man das Enzym dauerhilft unlöslich gemacht hütte, die Aktivitiitsausbcutc und halbierte den Immobilisierungsgrad, Demgemäß wurde die # Scheinaktivität d?s erhaltenen immobilisierten Enzyms extrem vermindert.
O
O		 0,004
1		 0,02
5		 3Q 10 790 0,32
80		 0,4
100		 0,6
150		 0,8
200
Tiibellc 100 100 100 86 73
!eicht
89
61		 41
wolkig
76
29		 19
Nieder^
schlag
53
8,2
b' 100
1,6		 100
38		 100
64		 0,04
10		 0,08
20		 0,2
50		 91
75
Λ (%)
I)
C (%)
D (%)		 98
transparent -
97
73		 95 90
95
81		 93
78
Beispiel 1
Immobilisierte Cyclodextringlucanotransferase
Ein Pulver von Bacillus-Cyclodextringlucanotransferase, das man gemäß der Methode von Versuch 1 hergestellt hatte, löste man in 0,05 M Acetatpuffer (0,05 Mol/l) mit einem pH-Wert von 6.0 und einem Gehalt an 2 mM Calciumchlorid (2 mMol/1) und erhielt eine Enzymlösung von 0,4% (Gewicht/Volumen). Zu 100 ml Lösung gab man eine wässerige Glutaraldehydlösung, erhielt eine Konzentration von 0,5% (Gewicht/Volumen), hielt die ]
erhaltene Mischung bei Raumtemperatur 2 h lang und bewirkte die Modifizierungsreaktion. Danach gab man zur Reaktionsmischung 10 g (Naßgewicht) Mischpolymerharz Diaion HP-30, adsorbierte das modifizierte Enzym, wusch das Produkt mit Wasser und erhielt eine immobilisierte Cyclodextringlucanotransferase.
Die Gesamtaktivitätsausbeute des so erhaltenen immobilisierter. Enzyms betrug etwa 77% bezogen auf das eingesetzte Enzym.
Die immobilisierte Cyclodextringlucanotransferase war für verschiedene Anwendungen brauchbar. Beispielsweise konnte man sie vorteilhaft zur Herstellung von Cyclodextrin oder verschiedenen Zuckern, zum Beispiel Glycosylsaccharose, Glycosyllactose, Glycosylriboflavin, Glycosyläsculin. Glycosylrutin und Glycosylsteviosid aus den jeweiligen Mischungen von partiellem Stärkehydrolysat und einer Verbindung der aus den Zuckerakzeptoren Saccharose, Lactose, Riboflavin, Äsculin, Rutin und Steviosid bestehenden Gruppe herstellen. In diesen Fällen betrug die Halbwertszeit der immobilisierten Cyclodextringlucanotransferase bei einer Reaktionstemperatur von etwa60°C etwa800 h.
worin a' (% Gewicht/Volumen) die Glutaraldehydkonzentration (% Gewichtrvoiumen), b' (Gew.-%) die Menge ρ
an zugegebenem Glutaraldehyd pro Enzymprotein (Gew.-%), A (%) die Aktivitätsausbeute (%) des modifizier- 40 | ten und dialysierten Enzyms, B das Aussehen der Lösung mit einem Gehalt an modifiziertem und dialysiertem Enzym, C (%) den Immobilisierungsgrad des geprüften modifizierten und dialysierten Enzyms bedeuten;
(Gesamtaktivität vor der Adsorption) - (Aktivität in der
..... . ,„., überstehenden Flüssigkeit) _ inn
Immobilisierungsgrad (%) = x 100
Gesamtaktivität vor der Absorption
und D (%) die Aktivitätsausbeute des immobilisierten Enzyms bezogen auf das eingesetzte natürliche Enzym bedeutet
Zur Modifizierung eines Stärke abbauenden Enzyms derart daß man das Enzym nicht dauerhaft unlöslich macht, sollte man iine äquivalente oder viel geringere Menge an Modifizierungsmittel je nach den Reaktionsb . · dingungen verwenden, wie zum Beispiel Proteinkonzentration. Reaktionstemperatur und Reaktionszeit.
Beispiel 2
Immobilisierte alpha-Amylase
Eine technische Aspergillus-alpha-Amylase (DENAZYME) löste man in Wasser und erhielt eine Proteinkonzentration von 0,15% (Gewicht/Volumen). Zu 50 ml der Lösung gab man 2 ml 1 M Acetatpuffer (1 Mol/l) mit einem pH-Wert von 6,0, mit einem Gehalt an 300 mg l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinäthyl)-carbodiimidmetho-ploluolsulfonat, hielt die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur 4 h lang und dialysierte gegen Wasser weitere 5 h lang. Zur dialysierten modifizierten Enzymlösung gab man 5 g (Naßgewicht) Mischpolymerharz Amberlite X A D-1, rührte die Mischung sanft über Nacht bei dieser Temperatur und erhielt eine immobilisierte alpha-Amyläse.
Die Gesamtaktivitätsausbeute, bezogen auf das eingesetzte natürliche Enzym, betrug etwa 60%. In diesem Fall untersuchte man die Enzymaktivität auf folgende Weise:
Zu 2 ml einer Substratlösung, bestehend aus einem 0,1 M Acetatpuffer (0,1 Mol/l) mit einem pH-Wert von 6,0,
und einer sauer teil-hydrolysierten wachsartigen Maisstärke bzw. Kornstärke in einer Konzentration von 5 Gew.-% und mit einem D.E.-Wert von 50 gab man eine vorgegebene Menge an Enzym und crhicll ein Endvolumen von 2,5 ml. Danach inkubierte man die Mischung bei 40°C 10 min lang und bewirkte die cnzymalische Reaktion. Die freigesetzten Zucker untersuchte man auf Basis von Glucose gemäß der Somogyi-Nclson-Methode.
Eine Einheit an Enzymaktivität definierte man als die Menge an Enzym, die 1 μΜοΙ reduzierende Zucker (auf Basis von Glucose) pro min unter den genannten Bedingungen erzeugt.
Die so erhaltene immobilisierte alpha-Amylase war für verschiedene Anwendungen brauchbar. Beispielsweise V.&J das Produkt bei der Herstellung von Maissirup, Glucose oder Maltose aus stärkehaltigem Stoff geeignet und ίο zeigte eine Halbwertszeit von etwa 400 h bei einer Reaktionstemperatur von etwa 60° C.
Beispiel 3
Immobilisierte ß· Amylase
Eine /?-Amylasezubereitung, die man auf übliche Weise aus entfetteten Sojabohnen extrahiert und ausgcsalzen hatte, löste man in einem 0,5 M Phosphatpuffer (0,5 Mol/l) mit einem pH-Wert von 7,0 und mit einem Gehall von 0,01 M Maltose(0,01 mMol/l)und erhielt eine Proteinkonzentration von 0,1% (Gewicht/Volumen).Zu 50 ml Lösung gab man 20 ml einer Acetonlösung von Cyanurchlorid (0,1% Gewicht/Volumen), hielt die Mischung i h
2ά iaiig bei 4° C, wobei man ein Absinken dss pH-Wertes verhütete, und dialysierte danach gegen Wasser wriicn· 5 h lang. Zu der Reaktionsmischung gab man 5 g (Naßgewicht) Mischpolymerharz Diaion HP-10, rührte die erhaltene Mischung sanft bei 4°C über Nacht und erhielt eine immobilisierte/?-Amy läse.
Die Gesamtaktivitätsausbeute des immobilisierten Enzyms betrug etwa 68%, bezogen auf das eingesetzte natürliche Enzym. Die Enzymaktivität untersuchte man auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2.
Die immobilisierte ^-Amylase war für verschiedene Anwendungen brauchbar. Insbesondere war sie zur Herstellung von konzentriertem Maltosesirup oder Maltose aus stärkehaltigen Stoff geeignet und zeigte eine Halbwertszeit von etwa 200 h bei einer Reaktionstemperatur von etwa 50° C.
Beispiel 4
Immobilisierte Glucoamylase
Eine technische Aspergillus-Glucoamylase-XL 128 verdünnte man mit einem 0,02 M Acetatpuffer (0,02 Mol/l) mit einem pH-Wert von 5.0 und erhielt eine Proteinkonzentration von 0,15% (Gewicht/Volumen). Zu 50 ml der Lösung gab man 20 ml einer Dioxanlösung von ToluoI-2,4-diisocyanat (0,3% Gewicht/Volumen), hielt die erhaltene Lösung über Nacht bei 4° C und dialysierte danach gegen Wasser weitere 5 h lang. Danach gab man zu der Lösung mit einem Gehalt an modifiziertem Enzym 5 g (Naßgewicht) Mischpolymerharz Imac Syn-46, rührte sanft »her Nacht bei 4° C, wusch das Produkt mit Wasser und erhielt immobilisierte Glucoamylase.
Die Gesamtaktivitätsausbeute betrug, bezogen auf das eingesetzte natürliche Enzym, etwa 70%. Die Glueoiimylaseaktivität untersuchte man auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 mit der Ausnahme, daß man den pH-Wert der Substratlösung auf 4,5 einstellte.
Das Produkt war für verschiedene Anwendungen geeignet. Insbesondere war die so erhaltene immobilisierte Glucoamylase zur Herstellung von Glucose oder Sirup mit einem hohen Zuckergehalt geeignet und zeigte eine Halbwertszeit von etwa 300 h bei einer Reaktionstemperatur von etwa 500C.
Beispiel 5
Immobilisierte Pullulanase
Eine technische rohe Aerobacter-Pullulanase löste man in einem 0,02 M Phosphatpuffer (0,02 Mol/l) mit einem pH-Wert von 7,5 und erhielt eine wässerige Lösung mit einer Proteinkonzentration von 0,15% (Gewicht/ Volumen). Danach gab man zu 50 ml der Lösung 25 ml einer Dioxanlösung von Hexamethylendiisocyanat (0.1 % Gewicht/Volumen), hielt die Mischung bei Raumtemperatur 3 h lang und dialysierte danach gegen Wasser weitere 5 h lang. Zu der Lösung mit einem Gehalt an modifiziertem Enzym gab man 5 g (Naßgewicht) Mischpolymerharz Diaion HP-30 und rührte sanft über Nacht bei Raumtemperatur. Das Produkt wusch man mit Wasser und erhielt immobilisierte Pullulanase.
Die Gesamtaktivitätsausbeute betrug etwa 55%. bezogen auf das eingesetzte natürliche Enzym. In diesem Fall untersuchte man die Enzymaktivität auf gleiche Weise wie in Beispiel 2.
^, Das Produkt war für verschiedene Anwendungen brauchbar. Beispielsweise war es zur Herstellung von
f 60 Maltosesirup oder Maltose aus stärkehaltigen Stoff geeignet und zeigte eine Halbwertszeit von etwa 300 h bei einer Reaktionstemperatur von etwa 50° C.
Beispiel 6
65 Immobilisierte Isoamylase
Eine technische gereinigte Pseudomonas-Isoamylase löste man in einem 0,1 M Acetatpuffer (0.1 Mol/l) mit einem pH-Wert von 4.5 und erhielt eine Proteinkonzentration von 0,1% (Gewicht/Volumen). Zu 50 ml der
•j ν/ .ι \j ι ~>\j
Lösung gab man 10 ml einer wässerigen Glutaraldehydlösung (0,5% Gewicht/Volumen), hielt die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur 2 h lang, gab danach 25 g (Naßgewicht) poröses Glas zu, rührte sanft über Nacht bei 4°C und erhielt immobilisierte Isoamylase.
Die Gcsamtaktivitätsausbeutc betrug etwa 65%, bezogen auf das eingesetzte natürliche Enzym. Die Enzymaklivitäl untersuchte man wie in Beispiel 4.
Die immobilisierte Isoamylase war für verschiedene Anwendungen geeigent. Beispielsweise war es zur Herstellung vor» Maissirup bzw. Kornsirup, Glucose, Sirup mit einem hohen Maltosegehalt oder Maltose geeignet und zeigte eine Halbwertszeit von etwa 200 h bei einer Reaktionstemperatur von etwa 5Ö°C.
Beispi e 1 7
Herstellung eines Sirups mit einem Gehalt an Oligoglucosylfructosid
Man führte die Verflüssigung von 20 1 eines Breis von Tapiokastürke (28 Gew.-%) mit einem technischen Verflüssigungsenzym NEOSPITASE bis zu einem D.E-Wert von etwa 7,0 auf übliche Weise durch, erwärmte die verflüssigte Stärkelösung auf 120°C, inaktivierte das in der Lösung vorhandene Enzym, entfärbte bei 80 bis 90'- C und filtrierte. Danach stellte man eine Substratlösung her, indem man Saccharose und Calciumchlorid in dem Filtrat auflöste, das eine Konzentration von etwa 24 Gew.-% aufwies, und erhielt eine Saccharosekonzentration von etwa 12 Gew.-% und eine Calciumchloridkonzentration von etwa 10-J M(IO- s Mol/l).
Man fährte eine kontinuierliche Reaktion mit einem Säu'.ensystem durch, das aus ei"?»· Knnststnffsäule 3Q bestand, die man mit 20 g immobilisierter Cyclodextringlucanotransferase gepackt hatte, welche man gemäß der Methode von Beispiel 1 hergestellt hatte, und führte dabei die Substratlösung durch die Säule mit einer Raumgeschwindigkeit von etwa 6 Betten bzw. Schichten pro Stunde, bei einem pH-Wert von 6,5 und 650C. Das Eluat reinigte man durch Entfärben mit einer Säule, die mit gekörnter Aktivkohle gepackt war, und Entionisieren mit einer lonenaustauschersäule, die man mit Ionenaustauschern der Η-Form und der OH-Form gepackt hatte.
Die gereinigte Lösung engte man unter vermindertem Druck ein und erhielt einen Sirup mit einem Wassergehalt von etwa 20 Gew.-% in einer Ausbeute von etwa 93% Trockensubstanz.
I./ is Produkt war ein farbloser, durchscheinender, geruchloser und nicht kristalliner sirupartiger Süßstoff mit einer relativ hohen Viskosität, hohen Süße und mildem Geschmack. Weil der Hauptbestandteil des Produktes Oligoglucosylfructosid war, war er vorteilhaft als wenig karieserzeugender Süßstoff für Nahrungsmittel und Getränke und zur Verbesserung ihrer Eigenschaften geeignet.
Beispiel 8
Herstellung eines Siruppulvers mit einem Gehalt an Oligoglucosylfructosid
101 einer Reaktionsmischung, die man gemäß der Methode von Beispiel 7 hergestellt hatte, kühlte man auf 50/ C, führte sie durch eine Kunststoffsäule, die man mit 20 g immobilisierter alpha-Amylase gepackt hatte, welche man gemäß der Methode von Beispiel 2 hergestellt hatte, mit einer Raumgeschwindigkeit von etwa 10 Betten /h und bewirkte eine weitere enzymatische Reaktion und setzte die Viskosität auf 2/3 herab.
Das Eluat reinigte man auf gleiche Weise wie in Beispiel 7, engte unter vermindertem Druck ein, sprühtrockncte und erhielt ein Siruppulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 2 Gew.-% in einer Ausbeute von etwa 90% Trockensubstanz.
Das Produkt war ein weißer, farbloser, nicht kristalliner und leicht wasserlöslicher pulverförmiger Süßstoff mit einer hohen Süße. Zusätzlich zu den genannten Eigenschaften war das Produkt, weil sein Hauptbestandteil Oligoglucosylfructosid war, vorteilhaft als wenig karieserzeugender Süßstoff für Nahrungsmittel und Getränke und zur Verbesserung ihrer Eigenschaften geeignet.
Beispiel 9
Herstellung eines Siruppulvers mit einem Gehalt an Cyclodextrin
Die Verflüssigung von 45 1 eines Breis von Maisstärke bzw. Kornstärke (etwa 30 Gew.-%) führte man mit Säure bis zu einem D.E-Wert von etwa 10 auf übliche Weise durch, kühlte die verflüssigte Stärkelösung rasch auf eine Temperatur von etwa 80 bis 90°C ab, neutralisierte gleichzeitig auf einen pH-Wert von 6.0. entfärbte danach mit Aktivkohle und kühlte auf 65°C.
Kine kontinuierliche enzymatische Reaktion mit einem Säulensystem, das aus einer Säule aus rostfreiem Stahl bestand, die mit 50 g immobilisierter Cyclodextringlucanotransferase gepackt war. die man gemäß der Methode von Beispiel 1 hergestellt hatte, führte man durch, indem man die genannte Lösung durch die Säule mit einer Raumgeschwindigkeit von etwa 3 Betten/h leitete.
Das Eluat reinigte man, engte unter vermindertem Druck ein, sprühtrocknete wie in Beispiel 8 und erhielt ein Dextrinpulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 1 Gew.-% mit einer Ausbeute von etwa 90% Trockensubstanz.
Das Produkt war ein weißes, geruchloses und leicht wasserlösliches Pulver. Weil das Produkt etwa 20% Cyclodextrin Trockensubstanz enthielt, war es vorteilhaft als aromahaltendes Mittel, Stabilisierungsmittel, Füllstoff und Trägerstoff für Nahrungsmittel, Getränke. Gescu.nackstoffe. Kosmetika und Medikamente geeignet.
Beispiel 10
Herstellung eines Pulvers tür Sirup mit niederer Viskosität
Eine Substratlösung stellte man her, indem man 50 1 eines Breis von Maisstärke bzw. Kornstärkc (etwa 35 Gew.-%) mit Säure bis zu einem D.E.-VVert von etwa 20 auf übliche Weise verflüssigte, rasch auf etwa 80 bis 90'C abkühlte, gleichzeitig auf einen pH-Wert von 5,0 neutralisierte, mit Aktivkohle entfärbte und auf 50"C abkühlte.
Eine kontinuierliche enzymatische Reaktion mit einem Säulensystem, das aus einer Säule aus rostfreiem Stahl bestand, die mit 150 g immobilisierter Isoamylase gepackt war, die man gemäß der Methode von Beispiel 6 hergestellt hatte, führte man durch, indem man die genannte Lösung durch die Säule mit einer Raumgeschwindigkeit von etwa 1 Bett/h durchleitete.
Die Analyse des Eluats zeigte, daß die Viskosität der Substratlösung auf etwa 1/2 durch die Reaktion abgenommen hatte, obwohl ein leichter Anstieg des D.E.-Wertes auftrat.
Das Eluat reinigte man, engte unter vermindertem Druck ein, sprühtrocknete wie in Beispiel 8 und erhielt ein Dextrinpulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 2 Gew.-% mit einer Ausbeute von etwa 90% Trockensubstanz.
Das Produkt war ein weißes, geruchloses und leicht wasserlösliches Siruppulver. Weil das Produkt fast geschmacklos war, aber eine niedere Viskosität aufwies, war es vorteilhaft als Stabilisierungsmittel, Füllmittel
2ü und Bindemittel für Nahrungsmittel und Getränke geeignet.
Beispiel 11
Herstellung eines Maltosesirups
Eine Substratlösung stellte man her, indem man 100 1 eines Breis von Kartoffelstärke (etwa 15 Gcw.-"/n) mit Säure bis zu einem D.E.-Wert von etwa 4 auf übliche Weise verflüssigte, auf eine Temperatur von etwa 80 bis 90: C abkühlte, auf einen pH-Wert von 6,0 gleichzeitig neutralisierte, mit Aktivkohle entfärbte und rasch auf 50: C abkühlte.
Eine kontinuierliche enzymatische Reaktion mit einem Säulensystem, das aus einer Kunststoffsäulc bestand, die mit 200 g immobilisierterp^Amylase und 100 g immobilisierter Pullulanase gepackt war, die man gemäß den Methoden der Beispiele 3 bzw. 5 hergestellt hatte, führte man durch, indem man die genannte Substrallösung durch die Säule mit einer Raumgeschwindigkeit von etwa 2 Betten/h durchleitete.
Das Eluat reinigte man und engte unter vermindertem Druck wie in Beispiel 7 ein und erhielt einen durchscheinenden Maltosesirup mit einem Wassergehalt von etwa 25 Gew.-% in einer Ausbeute von etwa 95% Trockensubstanz.
Weil das Produkt ein Sirup mit einem Maltosegehalt von etwa 83% Trockensubstanz und einer geringen Süße war und relativ leicht ?ur Kristallisation neigte, bevorzugte man ihn als schwach süßendes Mittel. Man kann also die zu starke Süße von beliebigen Nahrungsmitteln und Getränken, die auf eine zu starke Verwendung von Saccharose zurückgeht, proportional mittels des Produkts auf eine gewünschte Süße ohne irgendeine Veränderung ihrer Eigenschaften herabsetzen.
Beispiel 12
Herstellung eines Pulvers von kristalliner Maltose
Eine kontinuierliche enzymatische Reaktion mit einem Säulensystem, das aus einer Kunststoffsäule bestand, die man mit 200 g immobilisierter alpha-Amylase gepackt hatte, die man gemäß der Methode von Beispiel 2 hergestellt hatte, führte man durch, indem man 500 1 einer Substratlösung, die man gemäß der Methode von Beispiel 11 hergestellt hatte, durch die Säule bei einer Raumgeschwindigkeit von etwa 5 Betten/h durchlciicle.
Die Reaktion steigerte den Maltosegehalt der Lösung auf 86% Trockensubstanz.
Das Eluat reinigte man gleich wie in Beispiel 8, engte auf einen Wassergehalt von etwa 30 Gew.-% ein, Kct/tc das Konzentrat in eine Kristallisiervorrichtung ein, gab kristalline Maltose bis zu einer Endkonzenlration von 2% zu. kühlte danach unter Rühren von 40 bis 25=C im Verlauf von 2 Tagen ab und erhielt eine Füllmasse mit einem Gehalt an kristalliner Maltose von etwa 43% Trockensubstanz.
Die Füllmasse sprühte man vom oberen Teil einer Trocknungssäule durch eine Düse von 1.5 mm Durchmesser
mit Hilfe einer Hochdruckpumpe bei einem Druck von 150 kg/cm2. Heiße Luft von 85°C führte man vom oberen Ende der Trocknungssäule derart zu. daß man die Charge bzw. das eingesetzte Material auf einem bewegten Förderer aus Drahtnetz sammelte, der am unteren Teil der Säule angeordnet war. Von unterhalb des Förderers blies man warme Luft von 40rC aufwärts durch den Förderer, während man die Charge nach und nach aus der Trocknungssäule förderie. Der Förderer arbeitete mit einer Geschwindigkeit, bei der man 40 min brauchte, um das trockene kristalline Pulver vom unteren Teil der Trocknungskolonne zu einer Alterungskolonne zu fördern.
wo man das Produkt mit warmer Luft 6 h lang belüftete und die Kristallisierung und Trocknung vervollständigte, wodurch man ein Pulver von kristalliner Maltose mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 6 Gew.-% in einer Ausbeute von etwa 85% Trockensubstanz erhielte.
Weil das Produkt extrem w enig hygroskopisch war, bestand keine Gefahr der Verdichtung oder Verfestigung. Ferner war das Produkt als schwach süßendes Mittel, als fermentierbarer Zucker und als Trägersloff für Nahrungsmittel. Getränke und Medikamente geeignet.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten, Stärke abbauenden Enzyms durch Immobilisieren eines Stärke abbauenden Enzyms durch physikalische Adsorption auf einem in Wasser unlöslichen Träger und somit Unlöslichmachen des Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der physikalischen Adsorption 0,01 bis 5% (Gewicht/Volumen) des Stärke abbauenden Enzyms mit 0,001 bis 5% (Gewicht/Volumen) eines mono- oder polyfunktionellen Mittels aus der aus Diazoverbindungen, Säureanhydriden, Carbonsäuren, Isocyanaten, Isothiocyanaten, Thioamiden, Imiden, Carbodiimides Imidocarbonaten, Aldehyden, Acetalen, Säurehalogeniden, Säureaziden und Sulfonylchlorid bestehenden Gruppe.bei einem pH-Wert im
ίο Bereich von 3 bis 10 und einer Temperatur im Bereich von 0 bis 800C 0,1 bis 50 Stunden lang in Lösung modifiziert, so daß das Enzym nicht dauerhaft unlöslich gemacht wird, und das entstandene, modifizierte Stärke abbauende Enzym auf einem wasserunlöslichen Träger adsorbiert.
2. Verwendung des nach Anspruch 1 hergestellten immobilisierten, Stärke abbauenden Enzyms zur Herstellung von Kornsirup. Maissirup, Glucose, Maltose, Cyclodextrin, Glycosylsaccharose, Glycosyllactose, Glycosylriboflavin, Glycosyläsculin. Glycosylrutin und Glycosilsteviosid.
DE3010790A 1979-03-20 1980-03-20 Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem, Stärke abbauendem Enzym und dessen Verwendung Expired DE3010790C2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3287479A JPS55124494A (en) 1979-03-20 1979-03-20 Production of fixed enzyme
JP55002316A JPS601879B2 (ja) 1980-01-12 1980-01-12 固定化酵素による反応物の製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3010790A1 DE3010790A1 (de) 1980-11-20
DE3010790C2 true DE3010790C2 (de) 1986-11-13

Family

ID=26335670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3010790A Expired DE3010790C2 (de) 1979-03-20 1980-03-20 Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem, Stärke abbauendem Enzym und dessen Verwendung

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4338398A (de)
CA (1) CA1135642A (de)
DE (1) DE3010790C2 (de)
FR (1) FR2451942A1 (de)
GB (1) GB2049701B (de)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4511654A (en) * 1982-03-19 1985-04-16 Uop Inc. Production of high sugar syrups
FR2525629B1 (fr) * 1982-04-27 1985-06-14 Ags Bmp Argiles Mineraux Support de fixation de micro-organismes
EP0093027A1 (de) * 1982-04-27 1983-11-02 ARGILES & MINERAUX AGS-BMP Träger für die Fixierung von Mikroorganismen
HU187152B (en) * 1982-08-24 1985-11-28 Reanal Finomvegyszergyar Process for the immobilization of cyclodextrine glycoziltransferaze enzyme
US4438196A (en) * 1982-09-28 1984-03-20 Miles Laboratories, Inc. Immobilization of biocatalysts on granular carbon
GB8323383D0 (en) * 1983-08-31 1983-10-05 Cpc International Inc Starch hydrolysis
DE3626213A1 (de) * 1986-08-02 1988-02-04 Hoechst Ag Enzymatische synthese von cyclodextrinen mit (alpha)-glucosylfluorid als substrat fuer cyclodextrin-(alpha)(1->4)glucosyltransferase
EP0257535B1 (de) * 1986-08-28 1994-01-26 Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd. Verfahren zur Herstellung von Zuckern aus Stärke
DE3886412T2 (de) * 1987-09-28 1994-05-11 Novonordisk As Verfahren zur immobilisierung von lipasen.
DE3842700A1 (de) * 1988-12-19 1990-06-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur proteinimmobilisierung an einer festphase, so hergestellte protein tragende festphase sowie deren verwendung
US5145781A (en) * 1989-03-08 1992-09-08 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Preparation and uses of alpha-glycosyl rutin
JP2735458B2 (ja) * 1993-06-18 1998-04-02 日本碍子株式会社 生体触媒用担体
FR2787807B1 (fr) * 1998-12-29 2002-01-18 Roquette Freres Alpha-amylase maltogenique immobilisee et son utilisation dans la fabrication d'un sirop riche en maltose
US6184011B1 (en) * 1999-03-22 2001-02-06 Cbd Technologies, Ltd Method of releasing solid matrix affinity adsorbed particulates
WO2005047521A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Investigen, Inc. Methods of preparing nucleic acid for detection
ES2556985T3 (es) 2011-01-11 2016-01-21 Capsugel Belgium Nv Nuevas cápsulas duras que comprenden pululano
BR112019021396A2 (pt) 2017-04-14 2020-04-28 Capsugel Belgium Nv processo para fabricação de pululano
CA3059527A1 (en) 2017-04-14 2018-10-18 Capsugel Belgium Nv Pullulan capsules
CN116764157A (zh) * 2023-01-12 2023-09-19 苏州盛仓生物环保科技有限公司 一种酶氧化降解甲苯的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL6812443A (de) * 1968-08-31 1970-03-03
US3705084A (en) * 1970-03-18 1972-12-05 Monsanto Co Macroporous enzyme reactor
US3691016A (en) * 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
GB1400468A (en) * 1972-07-22 1975-07-16 Beecham Group Ltd Enzyme preparation and use thereof
CA1023287A (en) * 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
IT1034957B (it) * 1975-04-09 1979-10-10 Snam Progetti Procedimento per la modifica chimica di sostanze proteichemezzi adatti allo scopo e procedimento per la preparazionedi questi
US4121974A (en) * 1977-06-29 1978-10-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Preparation of retrogradation-resistant starches with immobilized amylases
CA1091172A (en) * 1978-01-12 1980-12-09 Richard A. Cormier Immobilization of enzymes
JPS5819276B2 (ja) * 1978-03-09 1983-04-16 株式会社林原生物化学研究所 末端にフラクト−スを結合したオリゴ糖類の製造方法
US4226937A (en) * 1979-04-27 1980-10-07 Cpc International Inc. Method using glucoamylase immobilized on porous alumina

Also Published As

Publication number Publication date
FR2451942A1 (fr) 1980-10-17
CA1135642A (en) 1982-11-16
US4338398A (en) 1982-07-06
GB2049701B (en) 1983-04-27
DE3010790A1 (de) 1980-11-20
FR2451942B1 (de) 1985-04-26
GB2049701A (en) 1980-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3010790C2 (de) Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem, Stärke abbauendem Enzym und dessen Verwendung
DE3874119T2 (de) Verfahren zur enzymatischen herstellung von oligodextranen, verwendbar bei der produktion von ersatzmitteln fuer zucker, und diese oligodextrane.
DE3587623T2 (de) Enzymatische Hydrolyse von körniger Stärke direkt bis zu Glukose.
DE3020614C2 (de) Verfahren zur Gewinnung von Cyclodextrinen
DE69821047T2 (de) Verfahren zur Herstellung von isomalto-oligosaccharid-reichen Sirupen
DE2249836C3 (de) Verfahren zum Herstellen von Pullulan
DE2162276A1 (de) Süßstoff und Verfahren zu dessen Herstellung
DE3438960C2 (de)
DE2909093C2 (de)
US4603110A (en) Starch hydrolyzates and preparation thereof
EP1141370B1 (de) Alpha-1,4-glucanketten enthaltende polysaccharide sowie verfahren zu ihrer herstellung
US3703440A (en) Process for the production of starch syrups that have fructose on their molecular ends
DE3323591C2 (de)
US5578469A (en) Process for preparing neotrehalose, and its uses
JP3181337B2 (ja) キトサンオリゴ糖混合物の製造方法、及びキチンオリゴ糖混合物の製造方法
US3996107A (en) Enzymatic production of a starch conversion product having a high maltose content
DE2226581C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Maltose
DE3323617C2 (de)
DE69521450T2 (de) Glukane mit cyclischer Struktur und Verfahren zu deren Herstellung
JPS6318480B2 (de)
DE2424833C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Maltose
DE2166121A1 (de) Verfahren zur herstellung von verzuckerungsprodukten von staerke, die geeignete diaetetische und natuerliche suesstoffe darstellen
DE3788908T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Zuckern aus Stärke.
JP3020064B2 (ja) 焙焼デキストリンの加水分解物
DE69825926T2 (de) Gereinigte säurestabile Alpha-Amylase von schimmeliger Herkunft

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee