BR112019021396A2 - processo para fabricação de pululano - Google Patents

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Abstract

a presente revelação fornece um processo para fabricação de pululano.

Description

PROCESSO PARA FABRICAÇÃO DE PULULANO
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o beneficio de pedido provisório US No. 62/485.855, depositado em 14 de abril de 2017, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
SUMÁRIO [002] São revelados processos para a produção de pululano por microrganismos em um meio fermentação contendo fosfato de cálcio como uma fonte de fosfato principal.
[003] Pululano é um polimero de glicose, mais particularmente, um polissacarideo consistindo em unidades de maltotriose oí-1, 4-ligada que são conectadas por ligações 0(-l, 6 entre os residues glucosidicos terminais do trissacarideo.
[004] Pululano é obtido a partir de uma cepa de Aureobasidium pullulans extracelularmente quando a cepa é cultivada aerobicamente em um meio de fermentação. Os graus de polimerização do pululano assim obtido são relatados como caindo na faixa de algumas centenas a vários milhares de quilodaltons (kDa). Consistência de alta qualidade do produto pode ser obtida controlando o processo de fermentação.
[005] As películas formadas com pululano apresentam várias propriedades que tornam estas películas apropriadas para a formação de produtos como cápsulas. Tais películas resultantes têm excelente homogeneidade e transparência. Além disso, estas películas têm permeabilidade ao oxigênio muito baixa. Consequentemente, cápsulas fabricadas a partir de pululano são particularmente úteis para o preenchimento
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2/15 de produtos sensíveis ao oxigênio, como peixes e óleos vegetais. Tais películas e cápsulas resultantes fabricadas a partir de pululano também têm um teor de água relativamente baixo e exibem alta estabilidade durante armazenamento, como com relação às propriedades mecânicas e de dissolução.
[006] A origem natural do pululano e suas propriedades superiores como material formador de película tornaram o pululano um polímero desejado para a fabricação de cápsulas tendo ingredientes de origem natural total. Isso iria permitir que as cápsulas fabricadas com pululano atendessem às exigências de rotulagem orgânica. Não obstante a necessidade comercial de uma cápsula atendendo às exigências de rotulagem orgânica, até agora não foram desenvolvidas cápsulas de pululano satisfatórias que atendam aos exigências de rotulagem orgânica. Isto é primariamente devido à ausência de pululano como uma matéria-prima que foi fabricada para atender aos exigências de rotulagem orgânica.
[007] Em uma modalidade, um processo para fabricação de pululano é fornecido, compreendendo: a. preparar um meio de fermentação compreendendo água, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de carbono, uma fonte de fosfato, e uma fonte de magnésio; b. inocular referido meio de fermentação com um microrganismo produzindo pululano; c. cultivar referido microrganismo em referido meio de fermentação de modo a produzir pululano em referido meio de fermentação; em que referida fonte de fosfato compreende fosfato de cálcio.
[008] Em uma modalidade, a fonte de fosfato compreende, consiste essencialmente em ou consiste em fosfato de
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3/15 cálcio .
[009] Em uma modalidade, o meio de fermentação tem uma concentração inicial de fosfato de cálcio de cerca de 0,25 g/L a cerca de 4 g/L.
[0010] Em uma modalidade, a fonte de magnésio é cloreto de magnésio.
[0011] Em uma modalidade, o meio de fermentação tem uma concentração inicial de cloreto de magnésio de 0,01 g/L a 1 g/L.
[0012] Em uma modalidade, a fonte de nitrogênio é extrato de levedura, NH4OH, L-glutamina, NaNOs, NH4CI, arginina, ou uma mistura dos mesmos.
[0013] Em uma modalidade, a fonte de nitrogênio é extrato de levedura.
[0014] Em uma modalidade, a fonte de carbono é glicose, maltose, lactose, sacarose, xaropes de frutas e vegetais, melaços de frutas e vegetais, ou uma mistura dos mesmos.
[0015] Em uma modalidade, a fonte de carbono é sacarose.
[0016] Em uma modalidade, o microrganismo é
Aureobasidium pullulans.
[0017] Em uma modalidade, o microrganismo é
Aureobasidium pullulans ATCC No. 42023.
[0018] Em uma modalidade, o cultivo do microrganismo é parado por pasteurização.
[0019] Em uma modalidade, o peso molecular do pululano é reduzido por pululanase produzida pelo microrganismo, e i processo é livre de uma etapa de adição de um ácido ou calor para reduzir o peso molecular do pululano.
[0020] Em uma modalidade, o meio de fermentação tem um
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4/15 pH inicial de 2,5 a 8.
[0021] Em uma modalidade, o microrganismo é cultivado durante pelo menos 3 dias.
[0022] Em uma modalidade, pululano é produzido a partir dos processos acima.
[0023] Em uma modalidade, o pululano tem um peso molecular de 200 a 500 kDa.
[0024] Em uma modalidade, o pululano tem um teor de Ca2+ de pelo menos 50 mg/kg, ou pelo menos 100 mg/kg, ou pelo menos 200 mg/kg, ou pelo menos 300 mg/kg, ou mesmo pelo menos 500 mg/kg.
[0025] Em uma modalidade, o pululano tem um teor de Mg2+ de pelo menos 10 mg/kg, ou 20 mg/kg, ou 30 mg/kg, ou pelo menos 40 mg/kg, ou mesmo pelo menos 50 mg/kg.
[0026] Em uma modalidade, o pululano tem uma razão de (Mg2+ + Ca2+)/K+ que é maior que 3, ou maior que 5, ou maior que 10, ou mesmo maior que 15.
[0027] Deve ser entendido que tanto a descrição geral acima como a descrição detalhada a seguir são exemplares e explicativas e não são limitadas à matéria reivindicada.
BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO [0028] Figura 1 é um gráfico de curso no tempo de concentração, peso molecular e concentração de biomassa de pululano, medidos no Exemplo 1.
[0029] Figura 2 mostra concentração, peso molecular e concentração de biomassa de pululano, medidos no Exemplo 2.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Definições [0030] Como aqui usado, a referência a um elemento pelo artigo indefinido um ou uma não exclui a possibilidade
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5/15 de que mais de um elemento esteja presente, salvo se o contexto claramente requerer que exista um e apenas um dos elementos. 0 artigo indefinido um ou uma geralmente significa pelo menos um. A revelação de faixas numéricas deve ser entendida como referindo-se a cada ponto discreto dentro da faixa, inclusive pontos finais, salvo se indicado de outra forma. 0 termo cerca de, como usado na revelação de faixas numéricas, indica que o desvio do valor declarado
é aceitável na medida em que o desvio é o resultado da
variabilidade da medição e/ou dá um produto com as mesmas
ou similares propriedades.
[0031] Como usado aqui, % em peso/peso e % em peso
significa em peso como uma porcentagem do peso total.
Processo para fabricação de pululano [0032] Um processo para fabricação de pululano compreende as etapas de
a. preparar um meio de fermentação compreendendo água, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de carbono, uma fonte de fosfato, e uma fonte de magnésio;
b. inocular referido meio de fermentação com um microrganismo produzindo pululano;
c. cultivar referido microrganismo em referido meio de fermentação de modo a produzir pululano em referido meio de fermentação.
[0033] O meio de fermentação pode conter qualquer fonte de carbono apropriada para a produção de pululano. As fontes de carbono apropriadas incluem sacarídeos tal como sacarose, frutose, e glicose; sacarídeos modificados tal como açúcar isomerizado, e açúcar invertido; carboidratos tal como amido; e produtos naturais tal como tapioca e
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6/15 tâmaras. Em uma modalidade preferida, a fonte de carbono é certificada como atendendo às exigências de rotulagem orgânica. Em uma modalidade, a fonte de carbono é sacarose. A fonte de carbono, por exemplo, sacarose, está inicialmente presente no meio de fermentação a uma concentração de lOg/L a 200 g/L, mais preferivelmente de 60g/L a 110g/L.
[0034] O meio de fermentação pode conter qualquer fonte de nitrogênio apropriada para a produção de pululano. Geralmente, sais de amônio, nitratos, peptona e extrato de levedura podem ser usados como fontes de nitrogênio. Em uma modalidade preferida, a fonte de nitrogênio é certificada como atendendo às exigências de rotulagem orgânica. Em uma modalidade, a fonte de nitrogênio é extrato de levedura. A fonte de nitrogênio, por exemplo, extrato de levedura, está presente no meio de fermentação inicialmente a uma concentração de lg/L a 6g/L (0,08 g/L a 0,4 g/L equivalente de nitrogênio).
[0035] O meio de fermentação também contém uma fonte de fosfato compreendendo fosfato de cálcio. Em uma modalidade, a fonte de fosfato consiste em fosfato de cálcio. Fosfato de cálcio é uma fonte preferida de fosfato como ela é capaz de ser certificada como atendendo às exigências de rotulagem orgânica. O fosfato de cálcio está presente no meio de fermentação inicialmente a uma concentração de 0,25 g/L a 4 g/L.
[0036] O meio de fermentação também contém uma fonte de magnésio apropriado para a fabricação de pululano. Em uma modalidade, a fonte de magnésio consiste em cloreto de magnésio. Cloreto de magnésio é uma fonte preferida de
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7/15 magnésio como ela é capaz de ser certificada como atendendo às exigências de rotulagem orgânica. A fonte de magnésio está presente no meio de fermentação inicialmente a uma concentração de 0,01 g/L a 1 g/L. (0,lmM a 10,5mM Mg ou 0,002 g/L a 0,26 g/L Mg) [0037] O meio de fermentação pode conter outros materiais opcionais. Em uma modalidade, o meio de fermentação pode conter ácido ascórbico. Ácido ascórbico pode estar presente em uma quantidade de 0,2 mg/ml a 3 mg/ml do meio de fermentação inicial.
[0038] Outros materiais opcionais que podem ser incluídos no meio de fermentação incluem sais tal como cloreto de sódio.
[0039] O pH do meio de fermentação pode estar na faixa de 2,5 a 8. O pH do meio de fermentação pode ser ajustado por adição de ácidos, bases ou tampões, como hidróxido de sódio, o ácido clorídrico.
[0040] O meio de fermentação pode ser preparado em qualquer recipiente apropriado para cultivar microrganismos, como frascos de agitação ou biorreatores. Os ingredientes do meio de fermentação e água são adicionados ao recipiente e agitados ou mexidos para dissolver ou uniformemente dispersar os ingredientes. O meio de fermentação é, então, esterilizado, por exemplo, por aquecimento a uma temperatura de pelo menos 60 °C durante um tempo de pelo menos 30 min antes da introdução do microrganismo.
[0041] Os microrganismos produzindo pululano que podem ser empregados na presente invenção incluem Aureobasidium pullulans, Pullularia fermentans var fermentans IFO 6401,
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8/15
Pullularia fermentans var fusca IFO 6402, Pullularia pullulans AHU 9553, Pullularia pullulans IFO 6353, e Dematium pullulans IFO 4464. Um microrganismo produzindo pululano preferido é Aureobasidium pullulans, Aureobasidium pullulans podem ser obtidos ATCC. Um clone preferido é Aureobasidium pullulans ATCC No. 42023.
[0042] Após esterilização com calor do meio de fermentação e ajuste do pH, o microrganismo é cultivado no meio com aeração e/ou agitação, a 25°-30°C, preferivelmente a 27°C, durante cerca de 3-7 dias. Aeração pode ser realizada por aspersão. Agitação pode ser realizada por impulsor. Cerca de 3 dias após o inicio da fermentação, o acúmulo de uma quantidade considerável de pululano é observado, e a viscosidade da mistura de cultura aumenta.
[0043] A concentração de pululano e peso molecular no meio podem ser determinados em certos intervalos, e cultivo pode ser descontinuado quando a quantidade de concentração de pululano se aproxima de uma concentração maior do que 20g/L e tem um peso molecular entre 200 kDa e 500 kDa.
[0044] Fermentação pode ser parada quando o peso molecular do pululano está entre 200kDa e 500kDa e a viscosidade de uma solução a 10% em peso do pululano está entre lOOcP e 190cP. Fermentação pode ser parada por pasteurização.
[0045] O peso molecular do pululano produzido durante a fermentação muda com o tempo durante o processo de fermentação. Isto é devido, em parte, à produção de pululanase pelo microrganismo. Em uma modalidade, o peso molecular do pululano produzido durante o processo é controlado principalmente pela pululanase produzida pelo
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9/15 microrganismo. Isto elimina uma outra etapa de adição de um material, tal como um ácido ou uma temperatura elevada, ao biorreator para reduzir o peso molecular do pululano.
[0046] As células microbianas podem ser removidas do meio líquido por centrifugação, e o meio líquido isento de células pode ser descolorido com carbono ativado, se desejado.
[0047] O pululano pode ser purificado por precipitação em um solvente orgânico. Preferivelmente, o sobrenadante após a centrifugação é misturado com um solvente orgânico hidrofílico, como metanol ou etanol, para precipitar o pululano acumulado. Se desejado, o pululano recuperado é dissolvido em água morna e novamente precipitado por solvente.
[0048] O pululano obtido após a secagem é um pó esbranquiçado que dissolve muito prontamente em água para formar uma solução viscosa. O peso molecular do pululano obtido varia dependendo das condições de cultura entre 50.000 e 4.500.000 Da. O rendimento de pululano também varia de 20 a 75%, dependendo das condições de cultura.
[0049] Em uma modalidade, o pululano resultante tem uma concentração relativamente elevada de íons cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) . O meio de fermentação contém fosfato de cálcio e cloreto de magnésio. Isto resulta em um produto de pululano final contendo quantidades relativamente elevadas de cálcio e magnésio. Além disso, o uso de um processo de precipitação, e a ausência de um processo de troca iônica para remover íons, retém uma fração significante do cálcio e magnésio de partida. Em uma modalidade, o pululano tem um teor de Ca2+ de pelo menos 50 mg/kg, ou pelo menos 100
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10/15 mg/kg, ou pelo menos 200 mg/kg, ou pelo menos 300 mg/kg, ou mesmo pelo menos 500 mg/kg. Em outra modalidade, o pululano tem um teor de Mg2+ de pelo menos 10 mg/kg, ou 20 mg/kg, ou 30 mg/kg, ou pelo menos 40 mg/kg, ou mesmo pelo menos 50 mg/kg. Em uma modalidade, a razão de (Mg2+ + Ca2+)/K+ é
maior do que 3, ou maior do que 5, ou maior do que 10, ou
mesmo maior do que 15 .
[0050] Em outra modalidade da invenção, um meio de
fermentação seco é fornecido que é apropriado para uso para
obtenção do meio de fermentação para fabricação de pululano orgânico. Em uma modalidade, o meio de fermentação seco compreende
(a) uma fonte de carbono em uma quantidade de 8 9% em
peso a 99% em peso;
(b) uma fonte de nitrogênio em uma quantidade de 0, 9%
em peso a 9% em peso; e
(c) uma fonte de fosfato consistindo em fosfato de
cálcio em uma quantidade de 0,2% em peso a 0,7% em peso.
[0051] Em uma modalidade, o meio de fermentação seco compreende cloreto de magnésio em uma quantidade de 0,009% em peso a 1,6% em peso.
[0052] Deve ser entendido que as modalidades descritas aqui não estão limitadas às mesmas. Outras modalidades da presente revelação serão evidentes para os técnicos no assunto a partir da consideração do relatório descritivo e da prática das modalidades reveladas. Os seguintes exemplos devem ser considerados como apenas exemplares, com um verdadeiro escopo e espírito da presente revelação sendo indicados pelas seguintes reivindicações.
Exemplo 1
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11/15 [0053] Um meio de fermentação de pululano orgânico foi preparado como a seguir. Dois g/L de fosfato de monocálcio (Ca (H2PO4) 2) , 0,2 g/L de sulfato de magnésio (MgSCú) , e 1 g/L cloreto de sódio (NaCI) foram adicionados a água e deixados dispersar uniformemente sob agitação forte durante pelo menos 15 minutos. O fosfato de monocálcio não dissolveu completamente, mas dispersou uniformemente na suspensão. Três g/L de extrato de levedura orgânico foram, então, adicionados à mistura e deixados dissolver. Finalmente, 100 g/L de sacarose orgânica foram adicionados à mistura e deixados dissolver. Após ajustar o volume final com água adicional, o pH da solução foi medido a 4,85. O
meio foi esterilizado com vapor a 121 °C durante 40
minutos .
[0054] Uma cultura de inóculo foi preparada por
inoculação de um frasco de agitação de 125 mL contendo 30
mL do meio de fermentação de pululano orgânico com uma raspagem de uma cultura de placa de A. pullulans. A cultura de placa foi cultivada em ágar de dextrose de batata. Os frascos de agitação foram então passados a uma taxa de diluição de 1:60 pelo menos a cada 4 dias até biomassa suficiente ser obtida para ter 0,32 mg/mL de concentração de biomassa inicial em biorreatores.
[0055] Os biorreatores foram pré-carregados com meio de fermentação de pululano orgânico e controlados a uma temperatura de 28 °C e agitados a uma entrada de potência de 700 W/m3 com um impulsor Rushton único antes da inoculação e pela duração da fermentação. Inóculo foi então adicionado ao reator a um volume suficiente para dar uma concentração de biomassa no reator de 0,32 mg/mL. Oxigênio
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12/15 dissolvido foi controlado para >50% de saturação de ar por aspersão de oxigênio puro através de um aspersor de pedra de 15pm. O sistema de gaseificação do reator foi projetado de modo que uma taxa de transferência de oxigênio de pelo menos 110 mM/h foi obtida a fim de manter condições não hipóxicas. O gás de exaustão foi encaminhado através de um condensador em que o condensado foi retornado diretamente para o meio de fermentação. O volume de trabalho dos reatores foi 1,25 L, e o volume do reator total foi 2L. A fermentação foi então deixada progredir durante 93 horas. O pH foi descontrolado. A fermentação foi parada por aquecimento da cultura a >60 °C a 93 horas.
[0056] A cultura foi amostrada diariamente para medir a concentração de biomassa, a concentração de pululano e o peso molecular de pululano.
[0057] Concentração de biomassa foi determinada como a seguir. Uma amostra de 30 mL foi removida do biorreator e colocada em um tubo de centrifuga pré-pesado de 50 mL. A amostra foi então centrifugada a uma força de 10.000 g durante 20 minutos. O sobrenadante foi retido para determinar a concentração e o peso molecular do pululano. O grânulo foi lavado com 10 mL de água, recolocado em suspensão e centrifugado por mais 20 minutos a uma força de 10.000 g. O grânulo foi então congelado de modo instantâneo e liofilizado até secura. O grânulo seco foi então pesado e a concentração de biomassa calculada com base no volume da amostra de biorreator e no peso do grânulo.
[0058] Concentração de pululano foi determinada precipitando 20 mL do primeiro sobrenadante da análise de biomassa em etanol frio a 90% a uma razão de 1: 1,4. O
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13/15 pululano precipitado foi então dissolvido em água a 10% em peso. Esta solução foi então precipitada novamente em etanol frio fresco na mesma razão. O grânulo resultante foi então seco e pesado. A concentração de pululano foi então determinada com base no volume da amostra de sobrenadante e no peso do grânulo de pululano seco.
[0059] O peso molecular do pululano foi determinado dissolvendo o grânulo de pululano seco em água a uma concentração de 10 mg/mL. A solução resultante foi então filtrada através de um filtro de 0,45 pm e então injetada em um sistema de cromatografia liquida de alta pressão (HPLC) . O sistema HPLC foi equipado com uma coluna de exclusão de tamanho. O polímero de pululano foi retido na coluna por um tempo diretamente relacionado ao tamanho e à conformação do polímero. O tempo de retenção foi determinado detectando a eluição de pululano via um detector de índice de refração. O tamanho do polímero foi determinado pela resposta do polímero em um detector de espalhamento de luz a laser de múltiplos ângulos. A resposta no detector de espalhamento de luz a laser de múltiplos ângulos foi normalizada e verificada pela medição de outros padrões de peso molecular conhecidos.
Exemplo 2 [0060] Neste exemplo, as culturas de células foram passadas e mantidas como descrito no Exemplo 1, incluindo a passagem do conjunto de inoculação e a receita do meio de pululano orgânico. Para avaliar um meio de pululano orgânico totalmente certificado, foi avaliada a substituição do MgSCú por um MgC12 orgânico certificado (Mitoku; Tóquio, Japão). Nesta experiência, 3 frascos de
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14/15 agitação separados de 125 mL de PETG foram inoculados com 0,5 mL de inóculo em um volume de 30 mL de meio de pululano orgânico (1:60). Um desses frascos de agitação continha meio com a mesma composição descrita no Exemplo 1. Para os outros dois frascos de agitação, MgC12 foi substituído pelo MgSCh em concentrações de 0,16 g/L e 0,32 g/L (os restantes componentes foram iguais aos descritos no Exemplo 1). Essas culturas de frascos de agitação foram cultivadas por 4 dias em uma incubadora orbital de agitador a 28°C a 200 RPM de agitação. No quarto dia, essas culturas de frascos de agitação foram analisadas quanto ao rendimento de pululano e biomassa usando os mesmos procedimentos descritos no Exemplo 1. Os resultados deste estudo são mostrados na Figura 2 .
Exemplo 3 [0061] Neste exemplo, pululano foi produzido seguindo o processo de Exemplo 2. Este pululano (denominado pululano A) e uma amostra representativa de pululano produzido por Hayashibara (denominado pululano B) foram analisados para teores de Mg2+ e Ca2+ seguindo os protocolos padrão SM3111B e D (espectroscopia de absorção atômica de chama) respectivamente. Cada amostra de pululano foi analisada em triplicata. A partir desta análise, foi determinado que a concentração de ambos Mg2+ e Ca2+ é maior em pululano A do que em pululano B.
Tabela 1. Resultados de análise de metal de pululano
Pululano A Pululano B
Mg2+ (mg/ kg) Ca2+ (mg/ kg) K+ (mg/ kg) (Mg2++ Ca2+) Mg2+ (mg/ kg) Ca2+ (mg/ kg) K+ (mg/ kg) (Mg2++ Ca2+)
K+ K+
Réplica 1 66, 8 746 48, 1 16, 9 2,57 20,5 11,4 2,0
Réplica 2 66, 0 696 44,2 17,2 2,73 21,9 11,4 2,2
Réplica 3 66, 0 688 43, 6 17,3 2,52 39, 7 11,1 3, 8
Média ± 66,3 710 45,3 17,1 2,6 27,4 11,3 2,6
Petição 870190102249, de 11/10/2019, pág. 32/39
15/15
Desv. Padrão ±0,5 ±31,4 ±2,3 ±0,2 ±0,1 ±10,7 ±0,2 ±1,0
Valores expressos em mg de metal por quilograma de pululano

Claims (20)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para fabricação de pululano, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a. preparar um meio de fermentação compreendendo água, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de carbono, uma fonte de fosfato, e uma fonte de magnésio;
    b. inocular referido meio de fermentação com um microrganismo produzindo pululano;
    c. cultivar referido microrganismo em referido meio de fermentação de modo a produzir pululano em referido meio de fermentação;
    em que referida fonte de fosfato compreende fosfato de cálcio.
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referida fonte de fosfato consiste em fosfato de cálcio.
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que referido meio de fermentação tem uma concentração inicial de fosfato de cálcio de cerca de 0,25 g/L a cerca de 4 g/L.
  4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referida fonte de magnésio é cloreto de magnésio.
  5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido meio de fermentação tem uma concentração inicial de cloreto de magnésio de 0,01 g/L a 1 g/L.
  6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referida fonte de nitrogênio é selecionada dentre o grupo
    Petição 870190102249, de 11/10/2019, pág. 34/39
    2/3 consistindo em extrato de levedura, NH4OH, L-glutamina, NaNOs, NH4CI, e L-arginina.
  7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referida fonte de nitrogênio é extrato de levedura.
  8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referida fonte de carbono é selecionada dentre o grupo consistindo em glicose, maltose, lactose, sacarose, xaropes de frutas e vegetais, melaços de frutas e vegetais.
  9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referida fonte de carbono é sacarose.
  10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido microrganismo é Aureobasidium pullulans.
  11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido microrganismo é Aureobasidium pullulans ATCC No. 42023.
  12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido cultivo de referido microrganismo é parado por pasteurização.
  13. 13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o peso molecular de referido pululano é reduzido por pululanase produzida pelo referido microrganismo, e referido processo é livre de uma etapa de adição de um ácido ou calor para reduzir o peso molecular de referido
    Petição 870190102249, de 11/10/2019, pág. 35/39
    3/3 pululano.
  14. 14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido meio de fermentação tem um pH inicial de 2,5 a 8.
  15. 15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que referido microrganismo é cultivado durante pelo menos 3 dias .
  16. 16. Pululano, caracterizado pelo fato de ser produzido a partir do processo, conforme definido com qualquer uma das reivindicações precedentes.
  17. 17. Pululano de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular de 200 a 500 kDa.
  18. 18. Pululano, caracterizado pelo fato de ter um teor de
    Ca2+ de pelo menos 50 mg/kg, ou pelo menos 100 mg/kg, ou pelo menos 200 mg/kg, ou pelo menos 300 mg/kg, ou mesmo pelo menos 500 mg/kg.
  19. 19. Pululano, caracterizado pelo fato de ter um teor de Mg2+ de pelo menos 10 mg/kg, ou 20 mg/kg, ou 30 mg/kg, ou pelo menos 40 mg/kg, ou mesmo pelo menos 50 mg/kg.
  20. 20. Cápsula de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a razão de (Mg2+ + Ca2+) /K+ é maior do que 3, ou maior do que 5, ou maior do que 10, ou até mesmo maior do que 15.
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