KR960007615B1

KR960007615B1 - 미생물 연속 배양에 의한 무색소 풀루란의 생산방법

Info

Publication number: KR960007615B1
Application number: KR1019920023547A
Authority: KR
Inventors: 신익; 남희섭; 권오성
Original assignee: 주식회사 농심; 신춘호
Priority date: 1992-12-08
Filing date: 1992-12-08
Publication date: 1996-06-07
Also published as: KR940014797A

Abstract

내용 없음.

Description

미생물 연속 배양에 의한 무색소 풀루란의 생산방법

제1도는 본 발명에 따른 오우레오바시디움 풀루란스의 연속배양을 위한 배양장치의 개략도이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 에어 쿰푸레셔 2 : 회수배양액

3 : 교반용 모터 4 : 배지 공급용 펌프

5 : 공급용 배지 6 : 에어 스파져

7 : 발효조

본 발명은 오우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullullans)를 연속 배양하여 무색소의 풀루란을 제조하는 방법에 관한 것이다.

1938년 최초로 그 존재가 보고된 풀루란은 포도당을 최소 단위로 하는 천연 다당류로서 세개의 포도당으로 이루어진 말토트리오스가 알파 1-6 결합으로 연결된 선상 구조를 하고 있다. 이러한 풀루란을 불완전 균류인 오우레오바시디움 풀루란스에 의한 공업적 생산방법이 공지되어 있으며(Process Biochem., Nov,P7, 197치, 식품, 의약품, 화장품, 페인트, 필름등에 생분해가 가능한 무공해성 품질 개량 소재로 이용되고 있다.

한편 본 발명에 사용한 오우레오바시더움 풀루란스는 분류학상으로 하이포마이세테스(Hypomycetes)강에 속하는 진균류의 미생물로서 자연계에 널리 분포되어 있다. 또한 이는 불완전 균류로 분류되며 일정한 모양으로 생육하지 않고 생육 조건에 따라 균사체 또는 효모외 복합된 형태로 성장한다. 또한 이 균주는 배양중 멜라닌 성분의 불용성 흑색 색소를 분비한다. 따라서 이 균주가 산업적으로 이용되기 위해서는 이 흑색 색소의 생성을 제어하거나 흑은 후가공 처리에 의해서 이를 제거하는 공정이 요구된다.

그런데 지금까지의 플루란의 생산방법은 오우레오바시디옴 풀루란스의 회분식 배양에 의한 생산으로 배양 중 흑색 색소가 분비되어 배양 후 후가공에 의한 풀루란의 정제시 색소를 제거하는데 많은 어려움이 따르는 단점이 있다. 또한 이러한 문제점을 해결하기 위해 기존의 생산균주를 돌연변이시켜 색소분비가 상당히 감소된 균주를 이용하는 방법이 공지되어 있으나(대한민국 특허공고 92-5970), 이 방법 역시 균주가 복귀 돌연변이를 일으켜 다시 색소를 분비하게 될 가능성이 높다는 단점이 있다.

따라서 본 발명은 오우레오바시디움 풀루란스의 색소생성의 제어를 통해 무색소 풀루란을 생산하는 방법을 제공하는 것이 목적이다. 본 발명자들은 이러한 목적하에 예비실험을 실시한 결과 오우레오바시디움 풀루란스는 회분식 배양시 생육의 시기 즉 유도기, 저수성장기, 정상기, 사멸기에 따라 흑색색소의 분비상태가 일정한 양상으로 변한다는 사실을 알아내었으며 한편 오우레오바시디움 풀루란스는 배지중의 질소원의 농도가 높을 경우 색소분비가 억제된다는 사실이 회분식 실험의 결과로서 공지되어 있는 바, 본 발명자들은 이러한 사실에 착안하여 연속배양방법을 사용할 경우 균체의 생육속도 및 배양액 중의 질소원 농도의 조절이 가능하여 색소분비를 억제하면서 풀루란을 연속적으로 생산할 수 있음을 알게되어 본 발명은 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 발효조에 공급되는 배지중의 질소원의 농도 및 배지의 희석률을 일정하게 유지하는 조건하에서 오우레오바시디움 풀루란스를 연속배양하여 무색소의 풀루란을 생산하는 방법을 제공한다.

그런데 미생물의 연속 배양은 일반적으로 생산성의 측면에서 회분식 배양보다 유리한 장점이 있음에도 불구하고 스웨덴의 노보사에 의한 글루코스아이소머레이스 생산(Diers. Ⅰ., Continuous Culture. Vol. 6, Applications and New Fields. pp 209-223, Ellis Horwood, Chichester, 1975), 영국의 ICI사에 의한 단세포 단백질 생산, 맥주의 생산(Hough, J. S., Continuous culture in brewing, pp 226-237. 1975), 요구르트와 버터밀크 생산(Lelieveld, H.L.M., Mixed-strain continuous nlilk fermentation. Process Biochem., 19, 112. 1984)등 극소수가 산업화 되있는 실정이다. 이는 연속배양시에는 발효액의 오염문제, 균주의 안정성 문제, 배지와 연속 살균문제 등의 해결해야 할 문제점이 있기 때문이었다. 이중 배지의 연속살균 문제는 연속 살균 공정의 개발로 현재는 별로 문제가 되지 않으며 발효액의 오염문제 및 균주의 안정성 문제는 연속배양에 사용되는 균주에 따라서 아직도 해결해야 할 문제점으로 남아 있다. 또한 전술한 연속배양의 산업화된 예에서 사용된 균주가 모두 세균 및 효모인 것에서 알수 있듯이 지금까지 진균류에 대해서는 배양중균사체가 형성되어 연속배양의 제어가 더욱 어렵기 때문에 산업적 생산공정 개발은 물론이고 기초 연구 조차도 활발치 못한 실정이었다.

따라서 본 발명에 이용되는 균주도 진균류로서 전술한 연속배양의 일반적인 문제점 외에 배양중 균사체가 형성되는 단점을 함께 안고 있었다. 그러나 이 문제도 본 균주가 생육시기에 따라 일정한 양상으로 형태적변화를 한다는 사실에 착안하여 연속배양시 생육속도를 적당한 범위에서 조절하여 균사체의 생성을 억제하고 효모 형태로 유지함으로써 해결이 가능하였으며, 또한 배양중의 오염문제는 배양액의 점도가 상당히 높아 다른 미생물의 오염을 방지할 수 있었으며, 균주의 안정성 문제는 약 한달간 연속배양 후에도 균주의 안정성 이 확인되었다.

이하 본 발명의 오우레오바시디움 풀루란스의 연속배양에 의한 무색소의 풀루란의 생산방법을 상세히 설명한다. 연속배양은 배지의 희석률(배지의 공급속도/발효조에 실제로 채워진 배지의 부피)을 0.04-0.09 hr^-1로 유지하고, 질소원의 농도가 0.02-0.09%(w/v)인 배지를 발효조에 연속적으로 공급하면서 통상의 호기적 발효조건하에서 발효온도를 25-3O℃, pH를 4-6으로 유지하면서 행한다. 이때 희석률이 낮을수록 질소원의 농도는 상대적으로 높게 한다. 초기의 하루동안은 균체의 충분한 생육을 위하여 통상의 회분식 배양을 하나 이 기간이 경과후에는 상기의 조건에 의한 연속배양을 행한다. 연속 배양이 행해지고 정상상태에 도달하면 배출액을 수시로 회수하여 메탄올 혹은 에탄올을 이용하여 풀루란을 침전, 화수하여 건조한다.

본 발명에 다른 연속배양 방법을 이용하여 풀루란을 제조하기 위해 사용되는 배지로는 탄소원, 무기질소원, 유기질소원, 유기영양원. 소량의 무기물을 함유하는 합성 및 천연배지의 어느것이나 사용할 수 있다.

이때 탄소원으로는 설탕, 포도당, 과당, 전분 가수분해물 등이 이용될 수 있으며, 무기질소원으로는 암모늄 클로라이드, 황산암모늄, 이스트엑기스 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면 무색소의 플루란을 높은 생산성으로 생산할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 제시하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니며, 본원 특허청구의 범위를 벗어나지 않는 범위에서의 모든 변형, 개량도 본 발명의 범위에 속하는 것이다.

실시예 1

(1) 전배양

오우레오바시디움 풀루란스 ATCC 9348을 보존용 배지인 YM 한천 배지(yeast extract 0.3%(w/v).malt extract 0.3%(w/v). 펍톤 0.5%(w/v) 글루코스 1%(w/v), 한천 2%(w/v)과 물로 구성된 배지)에서 2∼3백금이를 취하여 500m1 삼각 플라스크에 들어있는 전배양배지(수크로스 5g, KH₂PO₄0.5g, NaCl 0.1g, MgSO₄·7H₂O 0.02g을 물중에 용해시켜 100m1로 만든 것) 100m1에 접종한 후 27℃에서 150rpm으로 3일간 진탕 배양하여 연속배양을 위한 전배양액으로 사용하였다.

(2) 본배양

본배양은 제1도에 나타낸 것과 같은 발효조를 이용하였으며, 배양온도 27℃, 교반속도 500rpm, 공기공 급속도 1vvm에서 배양액의 pH를 4.5로 조절하면서 행하였다.

(a) 회분식배양

회분식 배양은 본배양배지(수크로스 5g, KH₂PO₄0.5g, NaCl 0.1g, MgSO₄·7H₂O 0.02g, NH₄, Cl 0.06g을 물 중에 용해시켜 100m1로 만든것) 1800ml에서 하루동안 배양하였다.

(b) 연속배양

이어서 연속배양은 공급룡 배지 (설탕 3g, KH₂PO₄0.5g, NaCl 0.1g, MgSO₄·7H₂O 0.02g, NH₄Cl 0.06g을 물중에 용해시켜 100m1로 만든 것)를 0.07 hr^-1의 희석률로 공급하면서 행하였다. 발효조안에 있는 전체 배양액의 약 10배 부피 이상의 배지가 공급된 후 균체 성장도를 600nm에서의 흡광도에 의해 측정하여 정상상태임을 확인하였다. 이후 주기적으로 배출된 배양액을 통상의 방법대로 원심분리하여 균체를 제거하고 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 풀루란을 침전시킨 후 진공 건조하여 백색의 풀루란을 연속적으로 제조할 수 있었다.

이와 같이 배양했을 경우의 색소분부상태, 풀푸란 생산성, 균주의 풀루란 생산능력을 표 1에 나타내었다.

하기 표 1 내지 7에서 색소분배 상태를 다음과 같은 등급으로 표시하였다.

+++: 매우 많음

++ : 많음 :

+ : 약간

- : 없음

비교예 1

오우레오바시디움 풀루란스 ATCC 9348을 실시예 1에서와 마찬가지로 전배양을 하고 실시예 1과 같은 본 배양배지 및 배양조건을 사용하여 7일동안 희분식 배양을 하였다.

이 경우의 색소분비상태, 풀루란 생산성, 균주의 풀루란 생산능력을 표 1에 나타내었다.

표 1에서 볼수 있는 바와 같이 연속식 배양이 풀루란의 생산성 측면이나 무색소 풀루란의 제조측면에서 회분식 배양보다 훨씬 유리함을 알수 있다.

실시예 2

연속배양시 공급용 배지중의 NHCl의 농도(%.w/v)를 표 2와 같이 변화시키고 그리고 배지의 희석률을 0.04 hr로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 회석률=0.04 hr일때 질소원의 농도 변화에 따른 연속 배양시의 효모 형태 균체의 비율, 색소분비상태, 풀루란 생산성을 표 2에 나타내었다.

상기 표 2로부터 알수 있듯이, 공급용 배지중의 질소원의 농도가 0.06%일때 색소도 분비되지 않고 풀루란의 생산성도 양호했다.

실시예 3

연속배양시 공급용 배지중의 NHCl의 농도를 표 3과 같이 변화시키고 그리고 배지의 희석률을 0.05 hr로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 희석률=0.05 hr일때 질소원 농도의 변화에 따른 연속배양시의 효모상태 균체의 비율, 색소분비상태, 풀루란생산성을 표 3에 나타내었다.

상기 표 3으로부터 명확한 바와같이 NHCl의 농도가 0.05-0.09%일때 색소도 분비되지 않고 풀루란 생산성도 양호했다.

실시예 4

연속배양시 공급용 배지중의 NHCl의 농도를 표 4와 같이 변화시키고 그리고 배지의 희석률을 0.06 hr으로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 회석률=0.06hr일 때 질소원 농도변화에 따른 연속배양시의 효모형태 균체의 비율, 색소분비상태, 풀루란 생산성을 표 4에 나타내었다.

상기 표 4로부터 명확한 바와같이 NHCl의 농도가 0.03-0.09%일때 색소도 분비되지 않고 풀루란 생산성도 양호했다.

실시예 5

연속배양시 공급용 배지중의 NHCl의 농도를 표 5와 같이 변화시키고 그리고 배지의 희석률을 0.07 hr로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 회석률=0.07 hr일때 질소원농도변화에 따른 연속배양시의 효모형태 균체의 비율, 색소분비상태, 풀루란 생산성을 표 4에 나타내었다.

상기 표 5로부터 명확한 바와같이 NHCl의 농도가 0.02-0.09%일때 색소도 분배되지 않고 풀루란 생산성도 양호했다.

실시예 6

연속배양시 공급용 배지중의 NHCl의 농도를 표 4와 같이 변화시키고 그리고 배지의 희석률을 0.08hr으로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 회석률=0.08hr일 때 질소원 농도변화에 따른 연속배양시의 효모형태 균체의 비율, 색소분비상태, 풀루란 생산성을 표 6에 나타내었다.

상기 표 6으로부터 명확한 바와같이 NHCl의 농도가 0.01-0.03%일때 색소도 분비되지 않고 풀루란 생산성도 양호했다.

실시예 7

연속배양시 공급용 배지중의 NHCl의 농도를 표 4와 같이 변화시키고 그리고 배지의 희석률을 0.09hr로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 희석률=0.09hr일때 질소원 농도변화에 따른 연속배양시의 효모형태 균체의 비율, 색소분비상태, 풀루란 생산성을 표 7에 나타내었다.

상기 표 7로 알수 있듯이 희석률이 0.09hr일때에는 MHCl의 농도가 0.01%일때 색소도 분비되지 않고 풀루란의 생산성도 양호했다.

실시예 8

연속배양시 질소원으로 NHCl 대신에 황산암모늄을 사용하는 공급용 배지(수크로스 3g, KHPO0.5g, NaCl 0.1g, MgSO, ·7HO 0.02g, 황산암오늄 0.079을 물중에 용해시켜 100m1로 만든 것)을 사용한 것 및 희석률을 0.06 hr로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 이때 풀루란의 생산성은 0.31g-풀루란/l/시간이었다.

실시예 9

연속배양시 질소원으로 NHCl 대신에 이스트 엑기스를 사용하는 공급용 배지(수크로스 3g, KHPO0.5g, NaCl 0.1g. MgSO·7HO 0.02g. 이스트엑기스 0.12g을 물중에 용해시켜 100ml로 만든 것)을 사용한 것 및 희석률을 0.05hr로 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 이 때 풀루란의 생산성은 0.30g-풀루란/ l /시간이었다.

실시예 10

다음과 같은 점을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 풀루란을 제조하였다. 오우레오바시디움 풀루란스 ATCC 9348 대신에 오우레오바시디움 풀루란스 IFO 4464를 사용하였다. 배지중의 질소원으로 NHCl 대신에 황산암모늄과 이스트 엑기스를 사용하여 전배양에서는 수크로스 5g, KHPO0.5g, NaCl 0.1g, MgSO·7HO 0.02g. 황산암모늄 0.06g, 이스트 엑기스 0.1g을 물중에 용해시켜 100m1로 만든 배지를 사용하였다. 본배양중 회분식 배양에서는 수크로스 5g, KHPO,0.5g, NaCl 0.1g, MgSO·7HO 0.02g, 황산암모늄 0.06g, 이스트 엑기스 0.1g을 물중에 용해시켜 100m1로 만든 배지를 사용하였다. 공급용 배지로는 수크로스 3g, KHPO0.5g, NaCl 0.1g, MgSO‥‥ 7HO 0.02g, 황산암모늄 0.03g, 이스트엑기스 0.1g을 물중에 용해시켜 100m1로 만든 배지를 사용하였으며. 배지의 희석률은 0.05hr이었다.

이때 풀루란의 생산성은 0.35g-풀루란/l/시간이었다.

Claims

오우레오바시디움 플루란스를 연속배양하여 풀루란을 생산하는 방법에 있어서 발효조에 공급되는 배지중의 질소원 의농도는 0.02-0.09%(w/v)가 되고 희석률은 0.04-0.08hr^-1이 되도록 조절배양하는 것을 특징으로 하는 풀루란의 생산방법.
제1항에 있어서, 희석률은 0.04hr^-1이고 질소원의 농도는 0.06%(w/v)인 방법 .
제1항에 있어서, 희석률은 0.05hr^-1이고 질소원의 농도는 0.05-0.09%(w/v)인 방법
제1항에 있어서, 희석률은 0.06hr^-1이고 질소원의 농도는 0.03-0.09%(w/v)인 방법
제1항에 있어서, 희석률은 0.07hr^-1이고 질소원의 농도는 0.02-0.09%(w/v)인 방법.
제1항에 있어서, 희석률은 0.08hr^-1이고 질소원의 농도는 0.01-0.03%(w/v)인 방법.
제1항에 있어서, 희석률은 0.09 hr^-1이고 질소원의 농도는 0,01%(w/v)인 방법.