ES2897489T3

ES2897489T3 - Método de producción de polvo que contiene pululano

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Publication number: ES2897489T3
Application number: ES11795838T
Authority: ES
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 2010-06-17
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2031-06-17
Also published as: KR20130114077A; JPWO2011158936A1; CN103140503B; KR20190064653A; KR20170001712A; US20190085367A1; EP3950721A1; EP2583982A1; JP2015052129A; JP5932955B2; JP5669838B2; US20130195941A1; JP2016145248A; IL223623A; KR20180067698A; CN106008740A; WO2011158936A1; CN103140503A; KR101983568B1; EP2583982B1

Abstract

Un proceso de producción de una composición en partículas que consiste en pululano y sacáridos concomitantes que contienen manitol, que comprende las etapas de: cultivar un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans en un medio de cultivo que comprende una mezcla de sacáridos que contiene glucosa y maltosa como fuentes de carbono; retirar las células del cultivo resultante; y decolorar, desalar, concentrar y pulverizar lo resultante; en donde dicho microorganismo tiene la propiedad de que el rendimiento (%) de sacáridos concomitantes no es superior al 3 %; en donde dicha mezcla de sacáridos que contiene glucosa y maltosa tiene el equivalente de dextrosa de 50 a 90; en donde dicho microorganismo tiene la propiedad de que la relación entre "el rendimiento (%) de sacáridos concomitantes" y "el rendimiento (%) de pululano con respecto a sacáridos" es 0,05 o inferior; en donde dicho "rendimiento (%) de sacáridos concomitantes" se define por la siguiente ecuación: rendimiento (%) de sacáridos concomitantes = { (Concentración (%) de sacáridos concomitantes) / (Concentración (%) de fuentes de carbono del medio de cultivo) } x 100; en donde dicho "rendimiento (%) de pululano con respecto a sacáridos" se define por la siguiente ecuación: rendimiento (%) de pululano con respecto a sacáridos = { (Concentración (%) de pululano) / (Concentración (%) de fuentes de carbono del medio) } x 100; en donde dicho proceso no contiene una etapa de retirar sacáridos concomitantes; y en donde dicha composición en partículas tiene las siguientes características (1) a (4): (1) dicho pululano y dichos sacáridos concomitantes son respectivamente insoluble y solubles en 75 % en volumen de metanol en agua; (2) el contenido de dicho pululano con respecto al contenido de los sacáridos totales en toda dicha composición en partículas es del 97 % en peso o superior, cuando se determina basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico; (3) el contenido de dichos sacáridos concomitantes con respecto al contenido de los sacáridos totales en toda dicha composición en partículas es del 3 % en peso o inferior, cuando se determina basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico; y (4) el contenido de dicho manitol no supera el 2 % en peso, en una base de sólidos secos.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de producción de polvo que contiene pululano

Campo técnico

La presente invención se refiere a un proceso de producción de una composición en partículas que contiene pululano.

Técnica anterior

Como es bien sabido, el pululano es un polisacárido incoloro e inodoro soluble en agua, un a-glucano lineal que consiste básicamente en unidades repetidas de maltotriosa unidas juntas en un modo de enlace a-1,6, producido por un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans, un tipo de hongo. El pululano es un polisacárido seguro y comestible producido a partir del microorganismo normalmente por asimilación de sacáridos, tales como almidón o jarabe de almidón como fuentes de carbono. Puesto que el pululano tiene propiedades tales como solubilidad en agua satisfactoria, adhesividad relativamente alta y capacidad de formación de películas mejorada, se ha usado ampliamente en los campos de los productos cosméticos y farmacéuticos, así como de los productos alimenticios, en un modo de uso tal como un adhesivo o material de recubrimiento para productos alimenticios y productos farmacéuticos, un producto moldeado tal como películas comestibles y hojas dispersadas con componentes tales como colorantes, y como cápsulas encapsuladas con gránulos que contienen componentes funcionales usados en los campos de los productos alimenticios y los productos farmacéuticos.

Por ejemplo, la publicación de patente japonesa N.° 4291/84, y las patentes japonesas abiertas a consulta por el público N.° 111817/84 y 1993-285969, desvelan procesos de producción de películas de pululano; la patente japonesa abierta a consulta por el público N.° 155975/82 y la patente japonesa Tokuhyo N.° 2009-539719 desvelan usos de las películas de pululano para el embalaje de alimentos; la patente japonesa N.° 3350823 desvela un adhesivo compuesto de pululano como componente principal; la publicación de patente japonesa N.° 6346/77 desvela un método de prevención de la oxidación usando una película de pululano o recubrimiento de pululano; la patente japonesa abierta a consulta por el público N.° 16217/85 desvela un edulcorante en película para la dieta preparado dispersando un edulcorante en una película de pululano; y la publicación de patente japonesa N.° 553/95 y la patente japonesa abierta a consulta por el público N.° 2005-21124 desvelan preparaciones de película preparadas por agentes dispersantes en pululano; Satoshi NAKAMURA, "Yu-Kagaku" (Productos químicos del petróleo), Vol. 34, N.° 10, pp. 865-871, 1985, desvela una visión general sobre el método para la preparación de una membrana de pululano; y Satoshi NAKAMURA, "Ciencia de los alimentos japonesa", Vol. 25, N.° 4, pp. 61-67, 1986, "Industria alimentaria", Vol. 30, N.° 10, pp. 33-39, 1987, Korin Publishing Co., Ltd., Tokio, Japan, "Housou-Gijyutsu" (Tecnología del embalaje), Vol. 29, N.° 8, pp. 852-859, 1991, Yoshinao TANAKA, "Convertech", Vol. 28, N.° 9, pp.

17-19, 2000, Kanou TAk EuCHI, y "Shoku-no-Kagaku" (Ciencia de los alimentos), Vol. 277, marzo, pp. 96-99, 2001, Korin Publisher, Tokio, Japón, introducen procesos de producción de películas de pululano como películas comestibles, y usos de las mismas.

En las publicaciones de patente japonesa N.° 36360/76, 42199/76 y 42635/80, el mismo solicitante de la presente invención ya ha desvelado procesos de producción de pululano y composiciones en partículas que contienen pululano a escala industrial cultivando un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans en un medio de cultivo que contiene, como fuentes de carbono, sacáridos tales como jarabe de almidón o hidrolizado parcial de almidón. El pululano se forma en el cultivo del microorganismo anteriormente identificado, y el cultivo resultante que contiene pululano se purifica a través de las etapas de eliminación de las células de los microorganismos por centrifugación o filtración, y si fuera necesario, después de la decoloración y la desalación de lo resultante, añadiendo a ello un disolvente orgánico, tal como metanol. Puesto que el pululano es insoluble en metanol y los sacáridos concomitantes distintos del pululano son normalmente solubles en metanol acuoso, se añade un disolvente orgánico tal como el metanol al cultivo anteriormente identificado para precipitar pululano para separar en precipitante y sobrenadante. Así, se pueden retirar los sacáridos concomitantes. Repitiendo estos tratamientos de adición de dicho disolvente orgánico y separación del precipitante y el sobrenadante, el pululano se purifica y mejora su pureza. El pululano purificado se prepara en una composición en partículas que contiene pululano por una etapa de pulverización apropiada. La patente japonesa abierta a consulta por el público N.° 21739/83 y las patentes japonesas N.° 27099/80 y 50665/83 desvelan procesos de producción de productos moldeados, tales como películas, membranas de recubrimiento, hojas y cápsulas que usan el pululano que se ha purificado y producido como antes.

Se requiere una cantidad relativamente grande de disolvente orgánico en la etapa de purificación del pululano por precipitación con disolvente, donde un disolvente orgánico se añade a un cultivo que contiene pululano para precipitar pululano que luego se separa del sobrenadante. Por lo tanto, aunque el disolvente orgánico usado se recupera por medio de destilación, etc., el coste de los aparatos y los disolventes orgánicos requeridos para dicha recuperación no es despreciable, lo que da como resultado un incremento no satisfactorio de su coste de producción. La etapa de purificación en sí misma para la precipitación y la separación del pululano es laboriosa y requiere tiempo y esfuerzo, y después de todo esto da como resultado un incremento de precio de la composición en partículas que contiene pululano resultante. Debido a esto, la composición en partículas que contiene pululano producida por la etapa de purificación anterior es, por ejemplo, como se desvela por Satoshi NAKAMURA en "Yu-Kagaku" (Productos químicos del petróleo), Vol. 34, N.° 10, pp. 865-871, 1985, "Ciencia de los alimentos japonesa", Vol. 25, N.° 4, pp. 61-67, 1986, "Industria alimentaria", Vol. 30, N.° 10, pp. 33-39, 1987, Korin Publishing Co., Ltd., Tokio, Japón, y publicación de patente japonesa N.° 49164/85, limitada a usos específicos para "pululano de calidad para reactivo" o "muestra patrón de pululano" para patrón molecular para ensayar el peso molecular, y "adyuvante de plasma" en el campo de los productos farmacéuticos. Como marcadores moleculares que consisten en pululano, la patente japonesa N.° 3012917 desvela un pululano separado y purificado en cromatografía de líquidos de alta resolución en modo de separación normal usando una columna rellena con una sílice unida por amida.

Considerando las circunstancias anteriores, el mismo solicitante de la presente invención desvela en la patente japonesa N.° 3232488 un proceso de producción de un producto de alto contenido de pululano con un aumento de contenido de pululano de hasta al menos aproximadamente el 50 % en peso, en una base de sólidos secos (b.s.s.), preferentemente, aproximadamente 55 % a aproximadamente 90 % en peso. Puesto que el producto se puede producir sin emplear etapas de purificación complicadas por la sedimentación con disolvente, tiene la característica ventajosa de que se puede producir fácilmente a menor coste. En la patente japonesa N.° 4203322, el mismo solicitante de la presente invención desvela un producto de alto contenido de pululano con una estabilidad mejorada contra el cambio de humedad añadiéndole a,a-trehalosa; en la patente japonesa abierta a consulta por el público N.° 2003-96103, el solicitante desvela una composición en partículas que contiene pululano con una estabilidad mejorada contra el cambio de humedad añadiendo homogéneamente a él un sacárido no reductor que consiste en glucosas como un sacárido constituyente; y en la patente japonesa abierta a consulta por el público N.° 2004 261132, el mismo solicitante de la presente invención desvela un proceso de producción de pululano con una relación reducida de (peso molecular medio ponderal)/(peso molecular medio numérico).

A partir de aquí, el mismo solicitante de la presente invención desarrolló el hallazgo observado en la patente japonesa N.° 3232488 anteriormente identificada para explorar una composición en partículas que contiene pululano con un elevado contenido de pululano de hasta al menos 90 % en peso sin emplear etapas de purificación de sedimentación con disolvente, y comercializó dos tipos de composiciones en partículas de uso general que contenían pululano denominadas "PI-20" (comercializadas por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón) y "PF-20" (comercializadas por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón) dirigidas a su uso en productos alimenticios, productos farmacéuticos y cosméticos (véase Satoshi NAKAMURA en "Yu-Kagaku" (Productos químicos del petróleo), Vol. 34, N.° 10, pp. 865-871, 1985, "Ciencia de los alimentos japonesa", Vol. 25, N.° 4, pp.

61-67, 1986, y "Shokuhin-Kogyo" (Industria alimentaria), Vol. 30, N.° 10, pp. 33-39, 1987, Korin Publishing Co., Ltd., Tokio, Japón). A partir de aquí, estos dos tipos de composiciones en partículas se integraron en el "Aditivo alimentario Pululano" (comercializado por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón) que es sustancialmente equivalente a "PI-20", y ahora se ha comercializado el "Aditivo alimentario Pululano". Puesto que el "Aditivo alimentario Pululano" tiene una potencia adhesiva satisfactoria, adherencia, capacidad de formación de membrana y lubricidad, así como seguridad y precio relativamente bajo, se ha usado ampliamente como composiciones en partículas de uso general que contienen pululano; agentes que confieren viscosidad al alimento, enlaces, adhesivos y agentes de recubrimiento; películas de color sólidas instantáneamente solubles en agua después del procesamiento; películas impresas que se imprimen con tintas comestibles; y como películas mezcladas amasadas con productos alimenticios, aromas, etc.

Según los resultados posteriores de los presentes inventores, que varían dependiendo de su espesor, las películas de pululano preparadas con el "Aditivo alimentario Pululano" anteriormente identificado tienen diversas propiedades mejoradas, pero tienen los siguiente defectos de causan la fisuración o rotura ocasional llegando a ser inutilizables cuando se formó un sitio de concentración de esfuerzos por plegamiento, inflexión o similares. Aunque el "Aditivo alimentario Pululano" alcanza su contenido de pululano de al menos el 90 % en peso, el contenido o la distribución molecular del pululano contenido en su interior no es constante, dependiendo de su lote de producción, y así tiene el defecto de que se podrían obtener difícilmente productos con propiedades constantes de solubilidad y potencia adhesiva. Según la confirmación por los inventores de la presente invención, el contenido de pululano en el "Aditivo alimentario Pululano" es al menos el 90 % en peso; sin embargo, cambia normalmente en el intervalo de aproximadamente 90 % a aproximadamente 96 % en peso, dependiendo de su lote de producción. Tras este cambio, el contenido de sacáridos concomitantes distintos de pululano cambiará en el intervalo de aproximadamente 4 % a aproximadamente 10 % en peso. Cuando el intervalo de fluctuación del contenido de sacáridos concomitantes cambia incluso el doble o más, influye naturalmente en la solubilidad y la adhesividad de una composición en partículas que contiene pululano, dando como resultado el defecto de que difícilmente se obtendría un producto deseado con solubilidad constante, potencia adhesiva, o similares. Similarmente, cuando la distribución molecular del pululano contenido en la composición en partículas cambia, influye en la solubilidad y la potencia adhesiva del pululano en sí, y esto, junto con el cambio del contenido de sacáridos concomitantes, provoca inevitablemente el cambio de solubilidad y la adhesividad de la composición en partículas. Debido a esto, cuando el "Aditivo alimentario Pululano" se usa en productos moldeados que incluyen películas y propiedades tales como la resistencia, la solubilidad y la desintegrabilidad de los productos moldeados obtenidos con ellas son casos extremos, los productos moldeados son diferentes entre sí dependiendo del lote de producción del "Aditivo alimentario Pululano". Por ejemplo, se requieren productos farmacéuticos tales que la dinámica de sus componentes eficaces en cuerpos vivos, tales como la absorción, la distribución, el metabolismo y la depuración, sea constante después de sus administraciones. Por tanto, los aditivos farmacéuticos usados para dichos productos farmacéuticos deben ser aquellos que no afecten los efectos farmacológicos, pero mantengan establemente sus disposiciones. Sin embargo, cuando se usa el "Aditivo alimentario Pululano" convencional como un aditivo farmacéutico, por ejemplo, como un agente adhesivo para comprimidos, etc., como productos farmacéuticos, la velocidad de disolución de los componentes eficaces de los productos farmacéuticos podría no ser constante, dependiendo de su lote de producción, y esto tiene el temor de afectar a la farmacocinética en los cuerpos vivos. Así, dejando de lado su uso como productos alimenticios, el "Aditivo alimentario Pululano" no debe ser necesariamente bastante suficiente para un aditivo para que su uso como productos farmacéuticos requiera propiedades persistentes, tales como resistencia, solubilidad y potencia adhesiva, y también requiera una disposición constante; o para su uso como productos de parafarmacia y cosméticos. El defecto anteriormente identificado, inherente al "Aditivo alimentario Pululano" como una composición en partículas que contiene pululano general, se debe vencer esencialmente para ampliar más el uso del pululano o el producto moldeado que contiene pululano a los campos de productos alimenticios, así como a productos farmacéuticos, productos de parafarmacia y cosméticos, que se requiere que se produzcan en un modo tal que se mantenga una calidad constante o persistente sin dispersión, independientemente de sus lotes de producción; o además para ampliar el uso del pululano o productos moldeados que contienen pululano al campo de usos donde se requiere una mayor resistencia para dichos productos moldeados que contienen pululano, por ejemplo, películas de pululano, incluso en el campo de los productos alimenticios donde se ha usado convencionalmente el "Aditivo alimentario Pululano".

El documento de patente WO 2007/149276 A2 desvela películas de pululano y su uso en el embalaje de comestibles.

El documento de patente EP 1398346 A1 desvela un objeto moldeado que comprende pululano y a,a-trehalosa. El documento de patente EP 0586034 A2 desvela un producto que contiene pululano que tiene un peso molecular medio inferior a 250.000, siendo dicho producto preparado cultivando continuamente un microorganismo capaz de producir pululano en un medio de cultivo nutritivo que contiene 10-20 % p/vol de sacárido mientras que se controla la viscosidad del medio de cultivo nutritivo hasta un nivel inferior a 30 cp.

El documento de patente EP 1454 950 A1 desvela un polvo que contiene pululano que comprende pululano como componente principal y un sacárido no reductor, en donde el polvo que contiene pululano se prepara por las etapas de preparación de una disolución disolviendo el pululano y un sacárido no reductor homogéneamente, pulverización de la disolución y recogida del polvo que contiene pululano resultante.

Prasongsuk et al. (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, vol. 34, N.° 1, pp. 55-61) desvela la producción de pululano por cepas aisladas tropicales de Aureobasidium pullulans.

Singh et al. (Carbohydrate Polymers, vol. 73, N.° 4, pp. 515-531) desvela fuentes microbianas, la producción y aplicaciones del pululano.

Yun et al. (Biotechnology Letters, vol. 16, N.° 9, pp. 949-945) desvela la producción de polioles extracelulares en Aureobasidium pullulans.

Kim et al. (Biotechnology Letters, vol. 22, pp. 987-990) desvela la producción de pululano de alto peso molecular por Aureobasidium pullulans usando glucosamina.

Madi et al. (Journal of Chemical Technology and Biotechnology, vol. 65, N.° 4, pp. 343-350) desvela la influencia del pH y la aeración del cultivo sobre la producción de etanol y el peso molecular del pululano por Aureobasidium pullulans.

El documento de patente US 3.959.009 A desvela un método continuo de purificación de pululano.

Rekha et al. (Trends Biomater. Artif. Organs, vol. 20, pp. 1-6) desvela pululano como un material biológico para aplicaciones biomédicas.

Wiley et al. (Journal of Environmental Polymer Degradation, vol. 1, N.° 1, pp. 3-9) desvela el control de la distribución de pesos moleculares del pululano producido por Aureobasidium pullulans.

Sumario

La presente invención, que se hizo para resolver el defecto anterior que reside en la composición en partículas que contiene pululano convencional, tiene como objetivo proporcionar un proceso de producción de una composición en partículas que contiene pululano que se produce sin emplear etapas complicadas de purificación por sedimentación con disolvente o similares, tiene una mayor resistencia a la rotura que las de las convencionales cuando se conforma en una película, tiene una composición constante que retiene establemente su contenido de sacáridos concomitantes hasta un nivel extremadamente bajo y, preferentemente, tiene una distribución molecular del pululano contenido en ella.

Los presentes inventores estudiaron enérgicamente para resolver el objetivo anterior y se necesitó repetidamente un proceso de ensayo y error para encontrar mutantes específicos de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans, que da pululano en una cantidad sustancialmente igual a la de la cepa original, pero tienen una relación significativamente menor de sacáridos distintos de pululano, es decir, sacáridos concomitantes, entre los microorganismos artificialmente producidos de la especie Aureobasidium pullulans cuando se cultiva en un medio de selección que contiene glucosa y maltosa como fuentes de carbono. Entre estos mutantes, se seleccionó aquél con una relación mínima de sacáridos concomitantes, se cultivó en un medio de cultivo que contenía glucosa y maltosa como fuentes de carbono, seguido de la producción de una composición en partículas que contiene pululano en el modo usual sin emplear etapas de purificación por precipitación con disolvente para la precipitación del pululano con un disolvente orgánico. Así, se obtiene una composición en partículas que contiene pululano con una cantidad significativamente menor de manitol, un metabolito de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans, en comparación con el "Aditivo alimentario Pululano" anteriormente identificado. Cuando se formó una película de pululano con la composición en partículas en el modo usual, la resistencia a la rotura fue significativamente superior a la obtenida con el "Aditivo alimentario Pululano" anterior. Además, el contenido de sacáridos concomitantes en la composición en partículas sigue estando estable en un nivel extremadamente bajo independientemente de su lote de producción, la composición de sacáridos sigue siendo aproximadamente estable y la distribución molecular del pululano contenido en la composición sigue siendo estable dentro de un intervalo constante. Por lo tanto, la composición en partículas puede mantener su calidad a un nivel constante en términos de la resistencia a la rotura anterior, así como la solubilidad en agua y la potencia adhesiva para unirse a otras sustancias entre sí. Incluso cuando se conforma en productos moldeados, tales como productos farmacéuticos, productos de parafarmacia y cosméticos en forma de una película, hoja, comprimido o gránulo, la composición en partículas proporciona a los productos moldeados una calidad constante en términos de propiedades físicas, tales como resistencia, solubilidad y desintegrabilidad. Así, la composición en partículas que contiene pululano puede formar productos moldeados con propiedades físicas constantes y persistentes requeridas para los productos farmacéuticos, productos de parafarmacia, cosméticos, etc., y particularmente, incluso cuando se usen en productos farmacéuticos, la composición en partículas se puede usar como un aditivo farmacéutico debido a que no hay temor de afectar la disposición de componentes eficaces que es inducible por dispersión de la disolución o disgregación.

La presente invención resuelve el objetivo anterior proporcionando un proceso según la reivindicación 1. Las características preferidas se explican en las reivindicaciones dependientes.

En el presente documento se describe una composición en partículas que contiene pululano, caracterizada por que se produce cultivando un mutante de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans en un medio de cultivo que contiene glucosa y maltosa como fuentes de carbono sin emplear una etapa de retirada de los sacáridos concomitantes del medio de cultivo resultante; consiste en una fracción insoluble de pululano en 75 % en volumen de metanol en agua y una fracción de sacáridos concomitantes soluble en la disolución acuosa de metanol; tiene una relación de 3 % en peso o menor de sacáridos concomitantes en términos del contenido de sacáridos concomitantes con respecto al contenido total de azúcares contenidos en toda la composición en partículas, determinada basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico; y que contiene manitol.

Como se ha descrito anteriormente, la composición en partículas que contiene pululano tiene la característica significativa de que tiene una menor relación de 3 % en peso o menor de sacáridos concomitantes en términos del contenido de sacáridos concomitantes con respecto al contenido total de azúcares contenidos en la composición en partículas completa, y el contenido de sacáridos total anterior y el contenido de sacáridos concomitantes se determinan ambos basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico. Como es bien sabido, el método de antronaácido sulfúrico es un sistema de ensayo para sacáridos donde se utiliza la reacción de color de la antrona, y se obtiene la absorbancia de la reacción de color como una cantidad proporcional al contenido de sacáridos, y por lo tanto el contenido de sacáridos se puede obtener basándose en los datos. En el caso de determinar los sacáridos que consisten en glucosa, se pueden determinar en términos de D-glucosa usando D-glucosa como sustancia patrón. El método de antrona-ácido sulfúrico se emplea como un ensayo para "Monosacáridos y oligosacáridos" en la prueba de purificación para pululano como se desvela en "Japanese Standard of Food Additives" (8a edición), publicado por Japan Food Additives Association (JAFA), pp. 572-573 (véase la columna de "Pululano"), 2007. Puesto que el método descrito en "Japanese Standard of Food Additives" anteriormente identificado es un método convencional ampliamente reconocido, en la presente memoria descriptiva, como se desvela en el Experimento 2-3 descrito después, la relación entre el contenido de sacáridos concomitantes y el contenido de sacáridos totales contenido en la composición en partículas completa se determina según el ensayo de "Monosacáridos y oligosacáridos" descrito en "Japanese Standard of Food Additives" anterior.

Entre los sacáridos, por ejemplo, como el manitol descrito después, hay sacáridos que no están coloreados y son indetectables por el método de antrona-ácido sulfúrico, y el contenido de sacáridos totales y el contenido de sacáridos concomitantes no corresponden necesariamente exactamente con el contenido de sacáridos totales y el contenido de sacáridos concomitantes. En la presente memoria descriptiva; sin embargo, el contenido de sacáridos totales determinado basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico se denomina simplemente "contenido de sacáridos totales", a menos que se especifique lo contrario; y también el contenido de sacáridos concomitantes en la fracción de sacáridos concomitantes, determinado basándose en el método, se denomina simplemente "contenido de sacáridos concomitantes".

El contenido de pululano en una composición en partículas que contiene pululano se puede determinar ensayando el contenido de pululano en una fracción de pululano basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico según el ensayo para el contenido de sacáridos concomitantes; sin embargo, puesto que la composición en partículas que contiene pululano consiste en una fracción de pululano y una fracción de sacáridos concomitantes, el contenido de pululano de la composición en partículas puede ser fácilmente determinado restando el contenido de sacáridos concomitantes anterior del contenido de sacáridos totales anterior. Por consiguiente, la relación entre el contenido de sacáridos concomitantes y el contenido de sacáridos totales es del 3 % en peso o inferior, y esto significa que el contenido de pululano en una fracción de pululano es del 97 % en peso o superior. Por supuesto, el contenido de pululano no contiene sacáridos, tales como manitol, que no son detectados por el método de antrona-ácido sulfúrico.

Por consiguiente, puesto que la composición en partículas que contiene pululano producida por el método de la presente invención contiene sacáridos concomitantes cuyo nivel máximo es extremadamente bajo como del 3 % en peso del contenido de sacáridos totales, si el contenido de sacáridos concomitantes varía desde más del 0 % en peso hasta el 3 % en peso, la relación de cambio con respecto al 97 % en peso restante o superior de pululano es relativamente baja y, por lo tanto, la composición de sacáridos totales de la composición en partículas que contiene pululano es aproximadamente constante en conjunto.

Como se ha descrito anteriormente, la composición en partículas tiene otra característica importante, que contiene manitol. Variando dependiendo de los tipos de fuentes de carbono usados en el cultivo, el manitol es una sustancia que está contenida en el cultivo como un metabolito de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans. Sin embargo, el manitol es soluble en metanol acuoso y se retira cuando el cultivo resultante se purifica por precipitación en disolvente usando disolvente(s) orgánico(s). Por consiguiente, el hecho de que el manitol no sea retirado de la composición en partículas y que esté contenido en ella significa que la composición en partículas que contiene pululano es la producida sin emplear una etapa de retirada de sacáridos concomitantes por precipitación en disolvente usando disolventes orgánicos, etc. La composición en partículas contiene normalmente aproximadamente 2 % en peso, b.s.s., de sacáridos que no están coloreados y se detectan por el método de antrona-ácido sulfúrico, y el componente principal es manitol.

Para una comparación, el manitol se cuantifica, por ejemplo, en el análisis por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) mostrado en el Experimento 4 descrito después. Puesto que se supone que el límite de detección del manitol en el análisis de HPLC es normalmente aproximadamente del 0,01 % en peso, el hecho de que la composición en partículas que contiene pululano significa que contiene al menos 0,01 % en peso, b.s.s., de manitol. Dependiendo de la variedad de los tipos de fuentes de carbono usados en el cultivo, el contenido de manitol en la composición en partículas que contiene pululano no supera normalmente el 2 % en peso, b.s.s. El manitol se disuelve en 75 % en volumen de metanol en agua y normalmente está contenido en una fracción de sacáridos concomitantes; sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, el manitol no está contenido en el contenido de sacáridos concomitantes debido a que no se detecta en el método de antrona-ácido sulfúrico.

Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, la composición en partículas que contiene pululano contiene manitol y se produce sin emplear una etapa de retirada de sacáridos concomitantes por precipitación en disolvente usando disolvente(s) orgánico(s), etc., el contenido de sacáridos concomitantes es extremadamente tan bajo como el 3 % en peso o inferior. Por consiguiente, la composición en partículas, que contiene manitol y tiene una cantidad de sacáridos concomitantes extremadamente más baja, todavía no ha sido proporcionada antes de que se hiciera la presente invención en la medida en que el solicitante de la presente invención conoce y así es una composición en partículas que contiene pululano novedosa.

La composición en partículas que contiene pululano se puede conformar en una película con un espesor de 100 pm, más particularmente, se obtiene una película con un espesor de 100 pm colando una disolución acuosa al 20 % p/vol de la composición en partículas sobre una placa lisa, secando la disolución colada a 25 °C y dejando que el producto secado repose a una humedad relativa del 22 %. La película así obtenida presenta una resistencia a la rotura por perforación de 20 MPa o superior en la prueba de perforación para la resistencia a la rotura usando un adaptador para la prueba de perforación que tiene un área en sección de 1 mm2. Como se muestra en el experimento descrito después, la resistencia a la rotura por perforación anteriormente identificada es significativamente superior a la obtenida con el "Aditivo alimentario Pululano" anteriormente identificado. El hecho muestra que la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención tiene una característica ventajosamente significativa en que tiene una resistencia a la rotura por perforación relativamente alta cuando se conforma en una película, aunque la composición en partículas es el denominado "Producto industrial de uso general" producido sin emplear etapas de purificación para el pululano, tales como la sedimentación con disolvente o similares.

También se proporciona un proceso de producción de una composición en partículas que contiene pululano, caracterizada por que contiene las etapas de cultivar un mutante de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans en un medio de cultivo que contiene glucosa y maltosa como fuentes de carbono; retirar las células del cultivo resultante; y decolorar, desalar, concentrar y pulverizar lo resultante, sin emplear una etapa de retirar sacáridos concomitantes.

Se puede usar cualquier mutante de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans en el proceso de la presente invención, en tanto que pueda producir la composición en partículas que contiene pululano sin emplear etapas de retirada para retirar los sacáridos concomitantes, y no se debe limitar a las específicas. Los ejemplos preferidos de dichos mutantes incluyen el mutante descrito después de la cepa S-2 de Aureobasidium pullulans (depositada en el Depósito internacional de organismos de patente, el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada con el número de acceso de FERM BP-11261). Basándose en la divulgación de la presente memoria descriptiva, estos mutantes se pueden obtener usando la cepa S-2 anterior como cepa original y aplicando a la misma el método de mutación convencional y el método de cribado descrito después. Como se muestra en el Experimento 1 descrito después, la cepa S-2 es mutada aleatoriamente por un método de mutación convencional, seguido del cribado de mutantes resultantes con un índice del contenido de sacáridos concomitantes distintos de pululano contenidos en los cultivos resultantes, y la selección de aquellos con contenidos de sacáridos concomitantes significativamente menores que los de la cepa S-2 como su cepa original.

Entre los mutantes así obtenidos, un ejemplo de mutante preferentemente utilizable es, por ejemplo, la cepa mutante MA446 (depositada en el Depósito internacional de organismos de patente, el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada con el número de acceso de FERM ^bP-11250).

Se pueden obtener películas con una resistencia a la rotura por perforación relativamente alta usando la composición en partículas que contiene pululano, que es un producto caro producido sin emplear etapas complicadas de purificación por precipitación con disolvente o similares. Así, la composición en partículas tiene el mérito de que se usa más ampliamente cuando se conforma, por ejemplo, en una película de pululano. Según el proceso de producción de la composición en partículas que contiene pululano de la presente invención, se obtiene el mérito de que la composición en partículas que contiene pululano anteriormente identificada con el mérito ventajoso anteriormente mencionado se puede obtener fácilmente y de forma barata sin emplear etapas complicadas de purificación por precipitación con disolvente o similares.

También se proporciona un producto moldeado que contiene pululano producido usando como material al menos parcialmente la composición en partículas que contiene pululano. Como se ha descrito anteriormente, aunque la composición en partículas que contiene pululano de la presente divulgación es el denominado "Producto industrial de uso general" producido sin emplear etapas de purificación para el pululano, tal como la precipitación con disolvente, tiene la característica ventajosa de que confiere una resistencia a la rotura por perforación relativamente alta cuando se conforma en una película. Además, la composición en partículas que contiene pululano tiene las siguientes características de manera que se puede usar como un aditivo farmacéutico en productos farmacéuticos, productos de parafarmacia, cosméticos, etc., que requieren una disposición constante de componentes eficaces; el contenido de sacáridos concomitantes es extremadamente tan bajo como el 3 % en peso o inferior, la composición de sacáridos se retiene casi establemente independientemente de su lote de producción debido a que tiene una pureza de pululano relativamente alta, y la resistencia a la rotura y las propiedades físicas, tales como la solubilidad y la potencia adhesiva, varían menos y difieren menos. Los ejemplos de las formas usadas en los productos farmacéuticos, etc., la composición en partículas se puede conformar en películas, así como, por ejemplo, hojas, comprimidos, gránulos y fibras, o agentes de recubrimiento, agentes de recubrimiento de azúcar, diluyentes/cargas/adyuvantes, agentes adhesivos y preparaciones sólidas, tales como una preparación sólida que se va a reconstituir tras el uso dirigido para su uso en líquidos. Por consiguiente, la composición en partículas puede proporcionar productos moldeados que tienen propiedades constantes y persistentes requeridas para productos farmacéuticos, productos de parafarmacia, cosméticos, etc. Particularmente, cuando se usa en productos farmacéuticos, la composición en partículas que contiene pululano puede proporcionar productos que tienen cada uno menor dispersión en términos de los aspectos de las propiedades físicas, tales como la velocidad de disolución, tasa de integración y resistencia a la rotura; y tienen un menor temor de afectar la disposición de componentes eficaces debido a la disolución o disgregación de los mismos. Así, la composición en partículas se puede usar como un aditivo farmacéutico. La composición en partículas que contiene pululano también se puede usar como un material para medicinas sólidas en forma de una preparación sólida que se va a reconstituir tras el uso dirigido para su uso en inyecciones, etc., aplicando a ella un método convencional en general para prepararlas libre de pirógenos.

Breve descripción de dibujos

La FIG. 1 es un patrón de elución de una disolución acuosa de la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención cuando se somete a cromatografía de exclusión molecular.

La FIG. 2 es un patrón de elución de una disolución acuosa del "Aditivo alimentario Pululano" cuando se somete a cromatografía de exclusión molecular.

La FIG. 3 es un patrón de elución de una disolución acuosa de una fracción de sacáridos concomitantes disolvible en 75 % en volumen de metanol en agua de la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención, cuando se somete a cromatografía de exclusión molecular. La FIG. 4 es un patrón de elución de una disolución acuosa de a fracción de sacáridos concomitantes disolvible en 75 % en volumen de metanol en agua del "Aditivo alimentario Pululano", cuando se somete a cromatografía de exclusión molecular.

La FIG. 5 es un patrón de difracción de análisis de dispersión de ángulo pequeño de rayos X en el intervalo del ángulo de dispersión 20 de 0,001 a 0,1° en una luz de radiación de una película formada con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención.

La FIG. 6 es un patrón de difracción de análisis de dispersión de ángulo pequeño de rayos X en el intervalo de ángulo de dispersión 20 de 0,01 a 2° en una luz de radiación de una película formada con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención.

Descripción detallada

La composición en partículas que contiene pululano se produce cultivando un mutante de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans en un medio de cultivo que contiene glucosa y maltosa como fuentes de carbono sin emplear una etapa de retirada de sacáridos concomitantes; consiste en una fracción de pululano y una fracción concomitante que son respectivamente insoluble y soluble en 75 % en volumen de metanol en agua; tiene una relación de 3 % en peso o menor de sacáridos concomitantes con respecto al contenido de sacáridos totales contenidos en la composición en partículas completa; y contiene manitol. El término "75 % en volumen de metanol en agua" significa una mezcla que contiene agua y metanol en una relación en volumen de 1:3.

Se puede usar cualquier mutante, en tanto que los mutantes de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans puedan producir la composición en partículas que contiene pululano sin emplear una etapa de retirar sacáridos concomitantes de los cultivos resultantes. Los ejemplos de cepas originales utilizables en la presente invención incluyen la cepa S-2 de Pullularia sp., un microorganismo productor de pululano, desvelado por Seinosuke UEDA en "Kogyo-Kagaku-Zasshi" (Revista de la industria química), Vol. 67, pp. 757-760, 1964. Actualmente, los microorganismos del género Pullularia se clasifican en los del género Aureobasidium y solo se conoce una especie, Aureobasidium pullulans. Puesto que la cepa S-2 produce pululano y, como se describe después, tiene las características de cultivo que coinciden bien con las de Aureobasidium pullulans, se ha identificado como un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans y se depositó el 28 de junio de 2010 en el Depósito internacional de organismos de patente, el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, AIST Tsukuba Center 6, 1-1, Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón, con el número de acceso de FERM BP-11261. Para obtener mutantes de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans utilizable en la presente invención, la cepa S-2 anteriormente identificada se trata con tratamiento por mutación realizado convencionalmente en la técnica, tal como exposición a rayos ultravioleta y tratamientos con agente con agentes inducibles por mutación, por ejemplo, como se desvela en Sumita SUGIYAMA et al., "Shin-Pan-Biseibutsu-Kagaku-Jikken-Ho", pp.

126-133, Kodansha Scientific Ltd., Tokio, Japón, 20 de marzo de 1999; se deja que los mutantes resultantes se cultiven en un medio de cultivo que contiene glucosa y maltosa como fuentes de carbono, seguido del cribado de los mutantes deseados con un índice de contenido de sacáridos concomitantes contenidos en los cultivos resultantes; y se deben seleccionar aquellos cuyo contenido de sacáridos concomitantes sea significativamente inferior al de la cepa S-2 como cepa original. El Experimento 1 descrito después describe con detalle un ejemplo de dicho cribado. Los ejemplos de los mutantes deseables utilizables en la presente invención son aquellos en los que el contenido de sacáridos concomitantes es inferior al contenido del medio de cultivo resultante cuando se cultivan en un medio de cultivo de selección que contiene glucosa y maltosa como fuentes de carbono, y más preferentemente, aquellos en los que el contenido de sacáridos concomitantes no es superior al 50 % del cultivo de la cepa S-2 como cepa original.

Como se ha descrito anteriormente, aunque la composición en partículas que contiene pululano nunca se debe limitar a aquellas que se producen a partir del cultivo de un mutante específico, ejemplos concretos de mutantes preferibles que pueden producir la composición en partículas que contiene pululano incluyen la cepa MA446 de Aureobasidium pullulans obtenida mutando la cepa S-2 de Aureobasidium pullulans anterior. Similarmente como en la cepa S-2 como cepa original, la cepa MA446 mutante produce pululano y tiene características de cultivo que coinciden bien con las de Aureobasidium pullulans; por lo tanto, se identificó como un microorganismo que pertenece a Aureobasidium pullulans y se depositó el 30 de abril de 2010 en el Depósito internacional de organismos de patente, el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, AIST Tsukuba Center 6, 1-1, Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón, con el número de acceso de FERM BP-11250.

Para una comparación, la cepa S-2 como cepa parental y la cepa MA446 mutante tienen las siguientes características de cultivo:

Características de cultivo de la cepa S-2 y la cepa MA446 mutante>

Se cultivan aeróbicamente a 27 °C sobre medio de agar de patata-dextrosa (un polvo de exudado de patata 4,0 g, glucosa 20,0 g, agar 15,0 g, agua refinada 1.000 ml, pH 5,6) y producen un pigmento de color oscuro. No aparece ni el cuerpo fructífero ni se mueve en una forma deformada. No se observa reproducción sexual, pero sí se observa una pared septal. Después de aproximadamente cuatro días de crecimiento, forman conidióforos en forma de una gemación aciniforme unisexual y forman conidióforos en forma de una gemación en el borde o la parte intermedia de una hifa lineal. Los conidióforos madurados existen en forma de una monoespora, no tienen color y tienen una superficie suave.

Se puede usar cualquier medio de cultivo en el cultivo de mutantes en tanto que pueda producir la composición en partículas que contiene pululano sin emplear básicamente una etapa de retirada de sacáridos concomitantes de los cultivos resultantes que contienen menores cantidades de sacáridos concomitantes, y además aquellos que contienen apropiadamente fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, fuentes de nutrición orgánica, sustancias inorgánicas, etc., similarmente a los que se usan en el cultivo de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans para producir pululano.

Los ejemplos de las fuentes de carbono incluyen mezclas de sacáridos que contienen glucosa y maltosa, preferentemente, sacáridos que contienen glucosa y maltosa que tiene un equivalente de dextrosa (abreviado como "ED", en lo sucesivo) de 50 a 90, y más preferentemente, sacáridos que contienen glucosa y maltosa en cantidades respectivas de al menos el 10 % en peso, b.s.s. En el caso de que carezca de uno o ambos de la glucosa y la maltosa, el contenido de sacáridos concomitantes no se reduce tanto, dando como resultado la dificultad de producir la composición en partículas que contiene pululano. Por tanto, no se desea que, en el caso de uso de sacáridos, como fuentes de carbono, con un ED inferior a 50 o superior al 90, el rendimiento de pululano disminuya para reducir el contenido de pululano en la composición en partículas que contiene pululano resultante y para aumentar relativamente el contenido de sacáridos concomitantes. Es conveniente que la concentración de fuentes de carbono en los medios de cultivo sea del 5 al 20 % p/vol.

Los ejemplos de fuentes de nitrógeno incluyen uno o más componentes seleccionados de fuentes de nitrógeno inorgánico, tales como sales de amonio y nitratos; y fuentes de nitrógeno orgánico, tales como glutamatos, peptonas, extractos de levadura y extracto soluble de maíz. Como otras sustancias inorgánicas, se puede usar apropiadamente fosfatos, sales de magnesio y sales de hierro. Las condiciones de cultivo de los microorganismos se realizan deseablemente de forma aerobia mientras se remueve o agita en condiciones de aireación. Como temperaturas de cultivo preferibles, 27 °C es adecuada para el crecimiento de Aureobasidium pullulans. Como tiempo de cultivo, se realiza preferentemente hasta casi alcanzar el máximo nivel de rendimiento de pululano después del consumo de fuentes de carbono y para alcanzar un nivel de sacáridos concomitantes aproximadamente constante después de su disminución. Si fuera necesario, para aumentar el rendimiento de pululano o para producir pululano con un peso molecular deseado, se puede emplear el cultivo continuo añadiendo agentes de control del pH apropiados a los medios de cultivo o controlando la tasa de dilución de los líquidos de cultivo extrayendo muestras de los mismos en intervalos o continuamente y suministrando o suplementando apropiadamente a él una preparación reciente de medios de cultivo nutritivos.

Los sobrenadantes de cultivo que contienen pululano se pueden obtener de los cultivos resultantes retirando células de los cultivos con métodos apropiados convencionalmente usados, tales como centrifugación y filtración. La composición en partículas que contiene pululano se puede obtener de manera convencional por decoloración, desalación, concentración, secado y pulverización de los sobrenadantes de cultivo.

En general, se puede emplear filtración con un carbón activado en polvo como tratamiento de decoloración. Las resinas de intercambio catiónico y las resinas de intercambio aniónico se usan normalmente en el tratamiento de desalación. Los ejemplos de resinas de intercambio catiónico incluyen las resinas de intercambio catiónico comercializadas, tales como "DIAION PK218" (Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón), "DIAION SK-1B" (Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón); y los ejemplos de resinas de intercambio aniónico incluyen las resinas de intercambio aniónico comercializadas, tales como "DIAION WA30" (Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón) y "AMBERLITE IRA411" (Japan Organo Co., Ltd., Tokio, Japón).

El secado y la pulverización de los sobrenadantes de cultivo se pueden realizar basándose en métodos convencionales. Por ejemplo, después del secado, los bloques resultantes pueden ser pulverizados en composiciones en partículas o los sobrenadantes de cultivo pueden ser simultáneamente secados y pulverizados por un método de secado por pulverización.

La composición en partículas que contiene pululano así obtenida contiene 3 % en peso o menos de sacáridos concomitantes con respecto al contenido de sacáridos totales contenidos en la composición en partículas completa, en otras palabras, contiene establemente pululano en una cantidad del 97 % en peso o superior, y más preferentemente, la composición contiene 1 % en peso o menos de sacáridos concomitantes con respecto al contenido de sacáridos totales contenidos en la composición en partículas completa, en otras palabras, contiene establemente pululano en una cantidad del 99 % en peso o más y contiene manitol.

A este respecto, los sacáridos concomitantes en la fracción de sacáridos concomitantes contienen sacáridos con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90 en la composición en partículas que contiene pululano. El término "sacáridos con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90", como se denomina en el presente documento, significa concretamente, como se describe en el Experimento 4 tratado después, componentes que se detectan en el intervalo de aquellos con un peso molecular correspondiente a un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90, cuando una fracción de sacáridos concomitantes disolvible en 75 % en volumen de metanol en agua de la composición en partículas se somete a cromatografía de exclusión molecular (abreviada "GPC", en lo sucesivo); concretamente, los que se detectan en el intervalo de peso molecular de 500 a 15.000 dáltones en vista del hecho de que el peso molecular medio determinado en GPC tiene un error constante.

En la composición en partículas que contiene pululano, el contenido de sacáridos con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90 es preferentemente del 2 % en peso o inferior del contenido de sacáridos totales contenidos en la composición en partículas completa. Cuando el contenido de sacáridos con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90 supera el 2 % en peso, no es conveniente debido a que puede no obtenerse una resistencia a la rotura por perforación recomendada cuando se conforma en una película. A este respecto, se considera que los sacáridos anteriores con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90 tienen básicamente una estructura de tipo pululano en donde moléculas de maltotriosa se acoplan en un modo de enlace a-1,6 debido al hecho de que forman tanto maltotriosa como componente principal como maltotetraosa en una cantidad relativamente pequeña cuando se somete a la acción de pululanasa. Sin embargo, los sacáridos son los que tienen un peso molecular relativamente bajo y se disuelven en 75 % en volumen de metanol en agua, aunque tienen una estructura de tipo pululano.

Como se ha descrito anteriormente, variando dependiendo de los tipos de fuentes de carbono usados en los medios de cultivo, el cultivo de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans contiene normalmente manitol como metabolito del mismo. El manitol es disolvible en 75 % en volumen de metanol en agua y está contenido en la composición en partículas que contiene pululano, a menos que los sacáridos concomitantes se retiren del cultivo por precipitación en disolvente o similares. Así, el hecho de que el manitol esté presente en la composición en partículas que contiene pululano significa que la composición en partículas es la producida sin emplear una etapa de retirar sacáridos concomitantes por precipitación en disolvente o similares. Como se ha descrito anteriormente, el manitol no se detecta por el método de antrona-ácido sulfúrico; sin embargo, el manitol en la composición en partículas se puede determinar en el análisis de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) descrito después usado en el Experimento 4. El contenido de manitol en la composición en partículas que contiene pululano de la presente divulgación es normalmente del 0,04 % en peso o superior, b.s.s., y nunca supera el 2 % en peso.

Aunque el peso molecular de pululano como componente principal de la composición en partículas que contiene pululano no debe ser limitado específicamente a los específicos, en tanto que dicho pululano confiera una resistencia a la rotura por perforación deseada cuando se conforma en una película, es conveniente que tenga un peso molecular medio ponderal, determinado por GPC (designado "Mw", en lo sucesivo), de aproximadamente 50.000 a 1.000.000 dáltones, más preferentemente, aproximadamente 50.000 a 500.000 dáltones. Cuando el peso molecular de pululano se encuentra por debajo de Mw 50.000 dáltones, no se prefiere debido a que es difícil que dicho pululano sea conformado en una película. Mientras que, cuando el peso molecular del pululano supera Mw 1.000.000 dáltones, la viscosidad de una disolución acuosa de dicho pululano puede llegar a ser demasiado alta como para ser usada fácilmente como un problema.

En una composición en partículas que contiene pululano producida a partir de un cultivo de un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans a través de las etapas de decolorar, desalar, concentrar, secar y pulverizar sin emplear etapas de retirada para retirar sacáridos concomitantes por precipitación con disolvente o similares, la relación entre Mw y el peso molecular medio numérico (designado "Mn", en lo sucesivo) del pululano es normalmente aproximadamente 10 a 70 (Mw/Mn). En la composición en partículas que contiene pululano, la relación Mw/Mn y no debe ser limitada específicamente a las específicas, en tanto que se obtenga la resistencia a la rotura por perforación deseada, cuando se conforma en una película; sin embargo, relaciones preferibles son 100 o inferior, más preferentemente, aquellas en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 70. Cuando la relación Mw/Mn supera 100, concretamente cuando la composición en partículas tiene un amplio intervalo de distribución de pesos moleculares de pululano, la capacidad de conformación de la membrana de la composición en partículas es mala y, cuando se conforma en una película, no se podría obtener ninguna película con una alta resistencia a la rotura por perforación estable.

La composición en partículas que contiene pululano tiene un aspecto blanco y capacidad de flujo satisfactoria, y presenta una solubilidad en agua preferible similarmente como en la composición en partículas que contiene pululano convencional. Dependiendo del uso, la composición en partículas que contiene pululano se puede usar después de mezclar con uno o más componentes, usar en los campos de productos alimenticios, productos farmacéuticos, productos de parafarmacia y cosméticos en general, seleccionados del grupo que consiste en otros materiales, por ejemplo, polisacáridos distintos de pululano, agentes de carga, excipientes/adyuvantes, cargas, agentes que confieren viscosidad, tensioactivos, agentes espumantes, agentes antiespumantes, agentes de control del pH, estabilizadores, retardantes de la llama, agentes de desmoldeo, antisépticos, colores, aromas, nutrientes, preferencias que incluyen tabacos, agentes que confieren sabor, medicinas y sustancias fisiológicamente activas. Cuando se conforma en una película como un ejemplo concreto de un producto formado fabricado a partir de la composición en partículas que contiene pululano, la película tiene una resistencia a la rotura por perforación satisfactoria, tiene una solubilidad satisfactoria similarmente como en las composiciones convencionales en partículas que contienen pululano, y tiene una durabilidad ventajosa en uso. Así, la composición en partículas que contiene pululano se puede usar como un material para películas, hojas y recubrimientos usados en los campos de los productos alimenticios, productos farmacéuticos, cosméticos, etc. En el caso de la conformación de la composición en partículas que contiene pululano en una película o similares, se pueden usar tensioactivos que contienen ésteres de ácidos grasos de sacáridos, tales como éster de ácido graso de azúcar como agente de desmoldeo.

Como se ha descrito anteriormente, la composición en partículas que contiene pululano tiene tanto una solubilidad en agua satisfactoria como una alta resistencia satisfactoria cuando se conforma en películas o similares; tiene una alta pureza de pululano en la que el contenido de sacáridos concomitantes con respecto a los sacáridos totales es del 3 % en peso o inferior y el contenido de pululano es del 97 % en peso o superior; tiene una composición de sacáridos aproximadamente constante y tiene un intervalo establemente constante de distribución de pesos moleculares de pululano en sí. Por lo tanto, cuando se usa en productos conformados, se espera que la composición en partículas confiera una resistencia, velocidad de disolución y tasa de disgregación fijas sorprendentemente constantes para los productos conformados. Por consiguiente, la composición en partículas que contiene pululano se puede usar en productos alimenticios y también se usa como un aditivo farmacéutico en productos farmacéuticos, productos de parafarmacia, cosméticos, etc., donde se requiere la disposición de componentes eficaces de la misma para ser sorprendentemente coherente. La composición en partículas se puede usar en películas, así como en productos moldeados, tales como fibras para hojas, gasas, hilos quirúrgicos, etc.; se puede usar como excipientes/adyuvantes/cargas, adhesivos o agentes de recubrimiento en la preparación de comprimidos y gránulos. Además, la composición en partículas se puede preparar en medicinas sólidas en forma de una preparación sólida a reconstituir al utilizarla para su uso en preparaciones líquidas. Estos cosméticos, productos farmacéuticos y productos de parafarmacia así obtenidos no tienen disparidad, pero tienen calidad estable, constante y coherente independientemente de sus lotes de producción. En particular, en productos farmacéuticos, no existe temor de que afecte la disposición de componentes eficaces debido a la variabilidad en la solubilidad y la desintegrabilidad.

Además de la composición en partículas que contiene pululano, los componentes usados ampliamente en campos respectivos se pueden añadir apropiadamente a los productos moldeados producidos usando la composición en partículas al menos parcialmente como un material de la misma. Cuando los productos anteriormente moldeados son cosméticos o sus productos intermedios, se pueden conformar en, por ejemplo, envases, mascarillas, sales de baño o películas de cachou. Uno o más de los siguientes componentes se pueden añadir apropiadamente solos o en combinación a los productos anteriormente formados: Antisépticos tales como ácido paraoxibenzoico, cloruro de benzalconio y pentanodiol; agentes blanqueantes de la piel tales como albutina, ácido elágico, tetrahidrocurcuminoide y vitamina P; antiinflamatorios tales como ácido glicirrícico y extracto de Glycyrrhiza; activadores celulares, tales como lactoferrina, sulfato de condroitina, ácido hialurónico, KANKOSO-101 y KANKOSO-301; humectantes tales como elastina, queratina, urea y ceramida; medicinas basadas en aceite, tales como escualano, vaselina y ácido tri-2-etilhexanoico cetilo; y moléculas muy solubles en agua, tales como carragenina, carboximetilcelulosa, goma de semilla de algarrobo y polímero de carboxivinilo; y alcoholes tales como 1,3-butilenglicol, polietilenglicol, propilenglicol, sorbitol y maltitol.

En el caso de los productos moldeados anteriores están los productos farmacéuticos, productos de parafarmacia o productos intermedios de los mismos, se pueden formular en gránulos, comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, etc. Uno o más de los siguientes componentes pueden ser añadidos apropiadamente solos o en combinación con los productos formulados anteriores: inmunodepresores, tales como azatioprina, ciclosporina, ciclofosfamida, metotrexato, hidrato de tacrolimus y busulfán; agentes antineoplásicos, tales como capecitabina, rituximab, trastuzumab, bevacizumab, docetaxel, mesilato de imatinib, 5-fluorouracilo, anastrozol, taxol, tamoxifeno, docetaxel e hidroxicarbamida; agentes antivíricos, tales como sulfato de abacavir, zalcitabina, didanosina, famciclovir y ribavirina; antibióticos, tales como amoxicilina, talampicilina, cefixima, sulfametizol, hidrato de levofloxacino, clorhidrato hidrato de cefcapeno pivoxilo, cefditoren pivoxilo y claritromicina; analgésicos antipiréticos, tales como acetaminofeno, aspirina, etenzamida y salicilato de metilo; esteroides, tales como prednisolona, dexametasona y betametasona; proteínas o péptidos, tales como interferón-a, interferón-p, insulina, oxitocina y somatropina; fármacos biológicos, tales como vacuna BCG, vacuna para la encefalitis japonesa, vacuna para el sarampión, vacuna para la poliomielitis, vacuna, toxoide tetánico, antitoxina de habu e inmunoglobulina humana; preparaciones de vitamina y derivados de las mismas, tales como retinol, tiamina, riboflavina, piridoxina, cianocobalamina, ácido L-ascórbico, carotenoide, ergosterol, tocoferol, biotina, calcitonina, coenzima Q, ácido a-lipoico, ácido nicotínico, menaquinona, ubiquinona y pirroloquinona quinolina; y extractos en bruto de fármacos, tales como extracto de ginseng coreano, extracto de aloe, extracto de própolis, extracto de Glycyrrhiza, extracto de canela y extracto de Swertia japónica.

Para mejorar la flexibilidad y la resistencia, el producto moldeado anteriormente identificado, tal como cosméticos, productos farmacéuticos, productos de parafarmacia y productos intermedios de los mismos, se puede mezclar arbitrariamente, si fuera necesario, con otras sustancias de alto peso molecular, plastificantes apropiados o cargas/excipientes/adyuvantes, etc., que, en general, se usan en los campos de los cosméticos, los productos farmacéuticos y los productos de parafarmacia, junto con la composición en partículas que contiene pululano. En los productos moldeados que están principalmente compuestos de otras cargas/excipientes/adyuvantes, la composición en partículas que contiene pululano se puede usar como un adhesivo. Los ejemplos de las sustancias de alto peso molecular incluyen polisacáridos o derivados de los mismos, tales como carragenina, goma xantana, carboximetilcelulosa, celulosa, hemicelulosas, goma arábiga, goma guar, carragenina, pectina, agarosa, dextrina, amilosa y almidón que contiene almidón procesado; y proteínas, tales como gelatina y caseína. Los ejemplos de los plastificantes incluyen sacáridos, tales como maltitol, manitol, maltitol, sacarosa, maltosa, lactosa, a,a-trehalosa, a,ptrehalosa, goma arábiga, almidón de maíz y celulosa cristalina; y sustancias inorgánicas tales como hidróxido de aluminio, hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio, hidróxido de bario, sulfato de calcio, sulfito de calcio, carbonato cálcico, sílice, silicato de calcio, carbonato de magnesio básico, caolín y talco. En particular, la a,a-trehalosa se puede usar ventajosamente debido a que inhibe el deterioro de componentes eficaces debido a su descomposición por oxidación y tiene funciones de retener establemente la actividad de los componentes eficaces.

La presente invención se explicará con referencia a los siguientes Experimentos.

Se irradiaron conidióforos de la cepa S-2 de Aureobasidium pullulans con rayos ultravioleta para inducir la mutación y se inocularon en una placa de agar de patata-dextrosa, seguido de la selección como mutante de una colonia que había crecido a 27 °C. La colonia separada y la cepa S-2 como cepa original se inocularon respectivamente en un medio de selección líquido (pH 7,0) que contenía 10,0 % p/vol, b.s.s., de un jarabe de glucosa resuelto por ácido (ED 48, que contiene, en una base de sólidos secos, aproximadamente 27 % de glucosa y aproximadamente 17 % de maltosa, comercializado por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón), 0,2 % p/vol de fosfato de potasio dibásico, 0,2 % p/vol de peptona, 0,2 % p/vol de cloruro sódico, 0,04 % p/vol de sulfato de magnesio heptahidratado y 0,001 % p/vol de sulfato ferroso heptahidratado, y se cultivaron en condiciones de agitación a 27 °C durante tres días. Los sobrenadantes de cultivo, que se habían obtenido por centrifugación de cada cultivo resultante para retirar células, se diluyeron con agua 10 veces. A cada porción se añadió un volumen triple de metanol (un reactivo de calidad especial, comercializado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japón) para preparar una disolución acuosa al 75 % de metanol, y la mezcla resultante se mezcló bien para precipitar pululano, seguido de centrifugación de la mezcla resultante para obtener un sobrenadante que luego se diluyó 10 veces con agua para su uso como una disolución de prueba para ensayar sacáridos concomitantes. La disolución de prueba corresponde a una diluida que se había preparado diluyendo cada sobrenadante 400 veces. Se proporcionó un 0,01 % p/vol de disolución acuosa de glucosa como disolución patrón y se usó agua como un control de blanco, y cada disolución de prueba se sometió a reacción de color basada en el método de antrona-ácido sulfúrico según la descripción de "Japanese Standard of Food Additives", 8a edición, pp. 572-573, 2007, publicado por la Asociación japonesa de aditivos alimentarios, seguido por medición de la absorbancia de la mezcla resultante a una longitud de onda de 620 nm usando un espectrofotómetro y determinando la concentración (%) de sacáridos concomitantes de cada sobrenadante basándose en la siguiente Ecuación 1. Mientras tanto, la dilución de cada sobrenadante que se había diluido 10 veces se diluyó 100 veces más con agua para su uso como una disolución de prueba para medir los sacáridos totales. Similarmente como antes, la disolución de prueba indujo una reacción de color basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico y se midió su absorbancia a una longitud de onda de 620 nm, seguido de la determinación de la concentración (%) de sacáridos totales de cada sobrenadante usando la siguiente Ecuación 2. Se determinó la concentración de pululano (%) restando la concentración de sacáridos concomitantes de la concentración de sacáridos totales usando la siguiente Ecuación 3.

Ecuación 1:

Concentración (%) de sacáridos concomitantes

= [{(Ak-Aü) x 400} / {(As-Aü) x 100} x 100

Ak : Absorbancia de la disolución de prueba para la medición de sacáridos concomitantes;

As : Absorbancia de la disolución patrón

A⁰: Absorbancia de agua (control)

Ecuación 2:

Concentración (%) de sacáridos concomitantes

= [{(Az-A⁰) x 1000} / {(As-A⁰) x 100} x 100

Az : Absorbancia de la disolución de prueba para la medición de sacáridos totales;

As y A0 : Mismo que en la Ecuación 1

Ecuación 3:

Concentración de pululano (%) = (Concentración (%) de sacáridos totales) - (Concentración (%) de sacáridos concomitantes)

La concentración de sacáridos totales en el medio de cultivo antes de la inoculación celular se sometió al método de antrona-ácido sulfúrico para determinar la concentración (%) de fuentes de carbono, seguido de la determinación, como rendimiento (%) de sacáridos concomitantes y rendimiento (%) de pululano con respecto a sacáridos, de la concentración (%) de sacáridos concomitantes y la concentración (%) de pululano con respecto a la concentración (%) de fuentes de carbono en el medio de cultivo, determinado basándose en las siguientes Ecuaciones 4 y 5, respectivamente.

Ecuación 4:

Rendimiento (%) de sacáridos concomitantes = { (Concentración (%) de sacáridos concomitantes) / (Concentración (%) de fuentes de carbono del medio de cultivo)} x 100

Ecuación 5:

Rendimiento (%) de pululano con respecto a sacáridos = { (Concentración (%) de pululano) / (Concentración (%) de fuentes de carbono del medio de cultivo)} x 100

Como un índice del porcentaje de sacáridos concomitantes obtenidos similarmente como antes, se seleccionó un grupo de mutantes (aproximadamente el uno por ciento de las cepas aisladas) que tuvo un menor porcentaje de sacáridos concomitantes que los de sus cepas originales. Entre los mutantes seleccionados, se muestran en la Tabla 1 cinco cepas, que tenían un porcentaje de sacáridos concomitantes particularmente bajo y tenían como máximo la mitad de los niveles de sus cepas parentales respectivas. Como se muestra en la Tabla 1, estos mutantes mostraron casi el mismo nivel de rendimiento de pululano con respecto a los sacáridos que el de la cepa S-2 como una cepa original, y el nivel de rendimiento de sacáridos concomitantes de cada una de las cepas es de tan solo 3,0 % o inferior, que es inferior a la mitad de (la concentración de sacáridos concomitantes: 6,6 %) de la cepa S-2 como cepa original, mientras que la relación entre "el rendimiento (%) de sacáridos concomitantes" y "el rendimiento (%) de pululano con respecto a los sacáridos" para cada cepa es respectivamente 0,05 o inferior, que es inferior a la mitad de ese (0,101) de la cepa S-2. Estos mutantes mostrados en la Tabla 1 tienen aproximadamente el mismo nivel de rendimiento de pululano con respecto a los sacáridos que el de sus cepas originales respectivas y tienen un menor rendimiento de sacáridos concomitantes. Por consiguiente, aunque se produjo una composición en partículas que contiene pululano sin emplear una etapa de purificación, tal como separación por precipitación de sus cultivos usando disolventes, se espera en gran medida que se pueda obtener una composición en partículas que contiene pululano con tanto una menor cantidad de sacáridos concomitantes en comparación con la de las convencionales como una composición constante estable. Entre los mutantes así obtenidos, puesto que la cepa MA446 tiene el mínimo nivel del rendimiento de sacáridos concomitantes y tiene un menor nivel del rendimiento de pululano con respecto al sacárido, se seleccionó y se sometió a los siguientes experimentos. Basándose en los métodos de mutación, cultivo y cribado anteriores y usando al menos la cepa S-2 como cepa original, se pueden obtener apropiadamente mutantes deseados, que pueden proporcionar la composición en partículas que contiene pululano, sin la necesidad de un excesivo ensayo y error.

T l 1

Para producir composiciones en partículas que contienen pululano, se cultivó la cepa MA446 en los medios de cultivo 1 a 5 respectivos con fuentes de carbono que tenían diferentes valores de ED, y se examinaron sus propiedades. Las fuentes de carbono usadas en los medios de cultivo 1 a 5 se muestran respectivamente a continuación. El jarabe de almidón preparado por la sacarificación por ácido contiene, en una base de sólidos secos, aproximadamente 25 % en peso de glucosa y aproximadamente 16 % en peso de maltosa.

• Medio de cultivo 1: "Jarabe de almidón" (un jarabe de almidón preparado por sacarificación por ácido, ED de aproximadamente 42, comercializado por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón).

• Medio de cultivo 2 : Que se prepara mezclando glucosa (un reactivo de calidad especial comercializado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japón) (en lo sucesivo el mismo que en los medios 3 a 5), maltosa ("MALTOSA HHH", una pureza del 99 % o superior, comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japón) (mismo que en los medios 3 y 4) y un jarabe de almidón ("MALT-RUP®", ED 47, un jarabe preparado por sacarificación de enzimas, comercializado por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón) en una relación ponderal de 1:1:3 (ED de aproximadamente 58 en una forma de mezcla).

• Medio de cultivo 3: Que se prepara mezclando glucosa, maltosa y un jarabe de almidón ("MALT-RUP®", ED 47, un jarabe de almidón preparado por sacarificación de enzimas) en una relación ponderal de 1:1:1, b.s.s., (la mezcla tiene un ED de aproximadamente 66).

• Medio de cultivo 4: Que se prepara mezclando glucosa, maltosa y jarabe de almidón ("MALT-RUP®", ED 47, un jarabe de almidón preparado por sacarificación de enzimas) en una relación ponderal de 4:1:1, b.s.s., (la mezcla tiene un ED de aproximadamente 83).

• Medio de cultivo 5: Solo glucosa (un ED de aproximadamente 100).

La cepa MA446, que se había cultivado en un agar inclinado de patata-dextrosa a 27 °C, se sometió a cultivo en condiciones de agitación giratoria en un medio de cultivo líquido (pH 7,0) que contenía 10,0 % p/vol de sacarosa, 0,2 % p/vol de fosfato de potasio dibásico, 0,2 % p/vol de peptona, 0,2 % p/vol de cloruro sódico, 0,04 % p/vol de sulfato de magnesio heptahidratado y 0,001 % p/vol de sulfato ferroso heptahidratado a 27 °C a 230 rpm durante 48 horas para su uso como un cultivo inicial.

Como medios productores de pululano, se prepararon los medios de cultivo 1 a 5, que contenían 10,0 % p/vol de de una cualquiera de las fuentes de carbono anteriormente, 0,2 % p/vol de fosfato de potasio dibásico, 0,2 % p/vol de peptona, 0,2 % p/vol de cloruro sódico, 0,04 % p/vol de sulfato de magnesio heptahidratado y 0,001 % p/vol de sulfato ferroso heptahidratado, en un volumen de 20 l por un fermentador de 30 l de cultivo, se ajustó a pH 7,0 y se esterilizó a 121 °C durante 15 min. Los cultivos resultantes se dispusieron respectivamente en un fermentador en un volumen de 1.000 ml y se cultivaron a 27 °C durante tres días a una velocidad de aireación de 5,0 l/min y una velocidad de rotación de 400 rpm.

Cada cultivo resultante se centrifugó a 8.000 rpm para retirar las células para obtener un sobrenadante, seguido de tratamiento de decoloración con filtración usando un carbón activado y tratamiento de desalación con una resina de intercambio catiónico, "DIAION SK1B (forma H+)", Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón, y una resina de intercambio aniónico, "DIAION WA30 (forma OW-)", Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón. Después de la filtración para terminar con un carbón activado, las disoluciones resultantes se concentraron a vacío dando una concentración de aproximadamente 25 % en peso, b.s.s. Cada concentrado resultante se secó por pulverización para obtener una composición en partículas que contenía pululano. La cepa S-2 como cepa original se cultivó en el medio de cultivo 1 similarmente a antes, y se trató similarmente como antes para obtener una composición en partículas que contenía pululano para su uso como una composición en partículas de control que contenía pululano. Para comparación, la cepa S-2 se cultivó similarmente como antes en el medio de cultivo 1, y la composición en partículas resultante que contenía pululano tuvo sustancialmente el mismo contenido de pululano y el contenido de sacáridos concomitantes que el del "Aditivo alimentario Pululano" anteriormente identificado, y el control anterior como la composición en partículas que contiene pululano corresponde a él.

Para la composición en partículas que contiene pululano preparada con los medios de cultivo 1 a 5 anteriores y el control uno, se determinó respectivamente su contenido de sacáridos concomitantes y contenido de pululano por los siguientes métodos según el método desvelado en "Japanese Standard of Food Additives" (8a edición), publicado por la Asociación japonesa de aditivos alimentarios (JAFA), 2007, pp. 572-573 (véase la columna de "Pululano"). Se disolvió 0,8 g de cada una de las composiciones en partículas que contienen pululano en 100 ml de agua para su uso como una disolución de muestra de material. A un mililitro de cada disolución de muestra de material se añadió agua dando un volumen total de 50 ml para su uso como una disolución de material patrón (donde cada disolución de muestra de material se diluyó 50 veces). A un mililitro de cada disolución de muestra de material se añadió 0,1 ml de una disolución saturada de potasio, la mezcla resultante se mezcló bien con tres mililitros de metanol y se centrifugó a 4 °C y 15.700 g x 10 min obteniéndose un sobrenadante para su uso como una disolución de prueba (donde cada disolución de muestra de material se diluyó 4,1 veces). Estas disoluciones de material patrón, disoluciones de muestra y agua de control se sometieron respectivamente al método de antrona-ácido sulfúrico para inducir una reacción esperada, seguido de medición de sus absorbancias (At, As y Ao, respectivamente) a una longitud de onda de 620 nm y determinación con la siguiente ecuación de tanto el contenido de pululano como el contenido de sacáridos concomitantes, es decir, el contenido de sacáridos concomitantes que estaba contenido en la fracción de sacáridos concomitantes solubles en 75 % en volumen de metanol en agua y se determinó basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico. Los resultados medidos están en la Tabla 2. En este experimento, el contenido de sacáridos concomitantes y de pululano se determinó basándose en la relación de la absorbancia de cada disolución de muestra y cada disolución de material patrón, donde la relación no se determinó basándose en la equivalencia de D-glucosa usando D-glucosa como sustancia patrón; sin embargo, el contenido de sacáridos concomitantes y el contenido de pululano coincidieron con los determinados basándose en la equivalencia de D-glucosa, y cada uno de sus contenidos se expresan con "% en peso".

Ecuación 6:

Contenido de sacáridos concomitantes (%)

= [{(At-Aü) x 4,1} / {(As-Aü) x 50}] x 100

= {(At-A⁰) / (As-A⁰)} x 8,2

At: Absorbancia de la disolución de muestra

As: Absorbancia de la disolución de material patrón

Aa Absorbancia de agua (control)

Ecuación 7:

Contenido de pululano (%) = 100 (%) -(Contenido de sacáridos concomitantes) (%)

T l 2

Como se muestra en la Tabla 2, en el caso de cultivar la cepa MA446 en los medios de cultivo 2 a 4, el contenido de pululano en cada una de las composiciones en partículas que contienen pululano resultantes fue superior al 97 % en peso, que fue inequívocamente superior al 93,2 % en peso para la cepa S-2 como cepa original. El contenido de sacáridos concomitantes fue del 2,2 % en peso o inferior a tan solo el 3 % en peso, que fue inequívocamente inferior al 6,8 % en peso de aquél de la S-2. Mientras que, en el caso de cultivar con medio de cultivo 1, el contenido de sacáridos concomitantes fue del 6,8 % en peso, que fue ligeramente inferior al nivel de aquél de la cepa S-2 como cepa original. Cuando la cepa MA446 se cultivó en el medio de cultivo 5 con ED 100 que consistió en glucosa como fuente de carbono, mostró el contenido de pululano del 95,5 % en peso y el contenido de sacáridos concomitantes del 4,5 % en peso, en donde el contenido de pululano aumentó y el sacárido concomitante disminuyó en comparación con el de la cepa S-2 como cepa original que se cultivó en el medio de cultivo 1. Estas diferencias no fueron tan distintas como en el caso de los medios de cultivo 2 a 4.

Basándose en esto, se reveló que, cuando la cepa MA446 se cultivó en un medio de cultivo con un ED de aproximadamente 50 a aproximadamente 90, preferentemente, un ED de aproximadamente 55 a aproximadamente 85, se obtuvo una composición en partículas que contiene pululano con un contenido de pululano particularmente superior y un contenido de sacáridos concomitantes inequívocamente inferior.

La composición en partículas que contiene pululano y la de control obtenida en los Experimento 2-2 se disolvieron respectivamente en agua desionizada en una disolución acuosa al 20 % p/vol, seguido de reposo a 62,5 °C y se desaireó. Se añadió gota a gota una cantidad adecuada de cada una de las disoluciones acuosas desaireadas resultantes y se coló en una placa lisa de cloruro de vinilo, se secó durante la noche a 25 °C y una humedad relativa del 30 % para formar una película con un espesor de aproximadamente 100 pm. La película formada se desprendió de la placa y se cortó en un círculo con un diámetro de 19 mm para su uso como una muestra de prueba que luego se acondicionó para humedad a temperatura ambiente y una humedad relativa del 22 % durante cinco días antes someterla a una prueba de perforación para la resistencia a la rotura.

La prueba de perforación para la resistencia a la rotura se realizó con "Rheometer CR-500DX" (comercializado por Sun Scientific Co., Ltd., Tokio, Japón), instalado con un adaptador para la prueba de perforación con un área en sección transversal de 1 mm2 de tal manera que se presionara perpendicularmente el adaptador sobre el centro de la película anterior, fijada sobre el aparato a una velocidad de 50 mm/min para causar una fractura secundaria, seguido de determinación del esfuerzo para la resistencia a la rotura por perforación. Para películas formadas respectivamente a partir de las composiciones en partículas que contienen pululano, se determinó 10 hojas de cada una de las películas para la resistencia a la rotura por perforación y se promediaron los valores. Para cada muestra de prueba después de la rotura, la presencia o ausencia de la fisuración se observó macroscópicamente, y se determinó el porcentaje (%) de las muestras de prueba con fisuras con respecto a las 10 hojas probadas de las muestras de prueba. Los resultados están en la Tabla 3.

T l

Como se muestra en la Tabla 3, cualquiera de las películas, que se había formado con la composición en partículas que contiene pululano que se había producido cultivando la cepa MA446 en los medios de cultivo 2 a 4, mostró una resistencia a la rotura por perforación de más de 20 MPa. El nivel fue significativamente superior a 17,1 MPa del formado con la composición en partículas que contenía pululano como control, donde la cepa S-2 se cultivó en el medio de cultivo 1. La incidencia de la fisuración como en el caso de los cultivos con los medios de cultivo 2 a 4 es todos 0 %, que es un nivel extremadamente bajo en comparación con el porcentaje del 50 % del cultivo de la cepa S-2 con el medio de cultivo 1 como control. El hecho de que la incidencia de fisuración fuera baja significa que, aunque ocurre la rotura, dicha rotura se extiende menos alrededor y la película, que tiene 0 % de incidencia de fisuración y que se forma con la composición en partículas producida con cualquiera de los cultivos de la cepa MA446 con los medios de cultivo 2 a 4, tiene una característica ventajosa en términos de resistencia.

Mientras que, en el caso de cultivar la cepa MA446 en el medio de cultivo 1, la resistencia a la rotura de perforación es 16,6 MPa y la incidencia de fisuración es del 40 %, lo que significa que son sustancialmente las mismas que en el caso de cultivar la cepa S-2, como control, en el medio de cultivo 1. Cuando la cepa MA446 se cultivó en el medio de cultivo 5, se encontró una ligera mejora en comparación con la cepa S-2 como control que se cultivó en el medio de cultivo 1 en tanto la resistencia a la rotura por perforación como la incidencia de fisuración; sin embargo, la diferencia no fue tan distinta.

Estos resultados coinciden bien con los de la Tabla 2, donde se determinaron el contenido de pululano y el contenido de sacáridos concomitantes, lo que revela que, en el caso de que el contenido de sacáridos concomitantes sea del 3 % en peso o inferior, es decir, en el caso de que el contenido de pululano sea del 97 % en peso o superior, las películas que superaron significativamente la resistencia a la rotura por perforación de la preparadas con el cultivo de la cepa S-2 como control usando el medio de cultivo 1 tienen una incidencia de fisuración inequívocamente inferior y tienen la posibilidad de obtener películas con una resistencia mejorada. En particular, como se encontró en la cepa MA446 cultivada en los medios de cultivo 3 y 4, se reveló que, en el caso de que el contenido de sacáridos concomitantes fuera del 1 % en peso o inferior, es decir, el contenido de pululano fuera del 99 % en peso o superior, se puede obtener resistencia a la rotura de perforación mejorada, y así es preferible. Todas las películas anteriormente identificadas presentaron una solubilidad en agua satisfactoria a temperatura ambiente.

En el Experimento 2-3, usando los medios de cultivo 2, 3 y 4 que proporcionan una composición en partículas que contiene pululano que tiene un contenido de pululano relativamente alto cuando la cepa MA446 se cultivó en ella, la cepa S-2 y la cepa convencional de Aureobasidium pullulans, la cepa IFO 6353, se cultivaron similarmente como en el Experimento 2-3, y los cultivos resultantes se trataron respectivamente similarmente para obtener una composición en partículas que contiene pululano. El contenido de pululano y el contenido de sacáridos concomitantes de las composiciones en partículas producidas se midieron similarmente como en el Experimento 2-3, y similarmente como en el Experimento 2-4, las películas preparadas con cada una de las composiciones en partículas se determinaron para la resistencia a la rotura por perforación y la incidencia de fisuración. Los resultados están en la Tabla 4. Los valores para la cepa MA446 en la Tabla 4 se transcriben de las columnas correspondientes de las Tablas 2 y 3.

Como se muestra en la Tabla 4, cualquiera de las composiciones en partículas que contienen pululano preparadas a partir de los cultivos, obtenidas cultivando la cepa S-2 o la cepa IFO 6353 en los medios de cultivo 2 a 4, tiene un contenido de pululano inferior al 95 % en peso y un contenido de sacáridos concomitantes de aproximadamente el 6 % en peso o superior, cuyos niveles son respectivamente inequívocamente inferiores y superiores a los de aquellas preparadas a partir del cultivo de la cepa MA446.

La película formada con la composición en partículas que contiene pululano obtenida cultivando la cepa S-2 o la cepa IFO 6353 en los medios de cultivo 2 a 4 se rompió por el esfuerzo por debajo del nivel de 18 MPa en la prueba de perforación para la resistencia a la rotura. La resistencia a la rotura por perforación supera significativamente el nivel de más de 21 MPa que se obtuvo por la película formada con la composición en partículas que contiene pululano obtenida cultivando la cepa MA446 en los medios de cultivo 2 a 4. La película formada con la composición en partículas que contiene pululano, obtenida cultivando la cepa S-2 o la cepa IFO 6353 en cualquiera de los medios de cultivo 2 a 4, muestra una incidencia de fisuración del 30 % o superior, lo que significa que la rotura se extiende fácilmente alrededor una vez se produce.

Como un polvo de prueba, la composición en partículas que contiene pululano, que se había obtenido en los Experimentos 2 a 4 y tenía la mayor resistencia a la rotura por perforación, es decir, la que se había preparado a partir del cultivo que se había obtenido cultivando la cepa MA446 en el medio de cultivo 3, se midió para la distribución de pesos moleculares en GPC. Para el polvo de prueba, sacáridos concomitantes solubles en 75 % en volumen de metanol en agua se prepararon a partir de la misma y se sometieron a análisis de GPC. El contenido de manitol contenido en ella se ensayó por HPL^c. Mientras, se midió y analizó similarmente el "Aditivo alimentario Pululano", como polvo de control, una composición en partículas que contiene pululano comercialmente disponible, comercializada por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón. Para el polvo de control, el contenido de pululano y el contenido de sacáridos concomitantes se midieron por el método de antrona-ácido sulfúrico similarmente a como en el Experimento 2-3, y los resultados están en la Tabla 5. En la Tabla 5, el contenido de pululano y el contenido de sacáridos concomitantes fueron del polvo de prueba transcrito a partir de las columnas correspondientes de la Tabla 2. Los detalles de las mediciones son los siguientes.

<Medición del peso molecular medio y distribución de pesos moleculares>

El polvo de prueba y el polvo de control se prepararon respectivamente en una disolución acuosa al 2 % p/vol y se mezclaron con una cantidad igual de tampón fosfato 20 mM (pH 7,0), y la mezcla resultante se filtró en membrana para su uso en análisis de GPC. Tras el análisis de GPC, se usaron dos columnas rellenas con TSK-GEL a-M (7,8 mm$ de diámetro interno x 300 mm de longitud, Tosoh Corporation, Tokio, Japón) en cascada en serie, tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) como un eluato, y un refractómetro diferencial como detector, y se llevó a cabo a una temperatura de 40 °C y un caudal de 0,3 ml/min. Basándose en el patrón de elución de g Pc , se calcularon el peso molecular medio ponderal y el peso molecular medio numérico del pululano. Se determinó la relación entre el peso molecular y el tiempo de elución del polvo de prueba y se usó el polvo de control usando patrones de glucosa, maltotriosa y pululano para ensayar el peso molecular, es decir, P-2, P-3, P-5, P-10, P-20, P-50, P-100, P-200, P-400, P-800, P-1600 y P-2500 (comercializados por Showa Denko K.K. Tokio, Japón). Las FIG. 1 y 2 son respectivamente los patrones de elución de GPC del polvo de prueba y el polvo de control. La FIG. 5 muestra los valores de peso molecular medio ponderal y Mw/Mn.

Como se muestra en la FIG. 1, el patrón de elución de GPC del polvo de prueba consiste en un único pico de pululano que presenta la parte superior a un tiempo de retención de aproximadamente 50 min, y no contiene sustancialmente los componentes correspondientes a los tiempos de retención de menos de 40 min y más de 60 min, lo que significa que el polvo de prueba tiene un alta pureza de pululano. Mientras que, en el patrón de elución del polvo de control en la FIG. 2, se observa un pico de pululano que tiene la parte superior a un tiempo de retención de aproximadamente 50 min; sin embargo, se pueden observar varios picos en las posiciones correspondientes a los tiempos de retención de más de 60 min, lo que significa que el polvo de control contiene muchos sacáridos concomitantes, distintos de pululano, con un menor peso molecular que el pululano.

<Análisis de GPC de la fracción de sacáridos concomitantes>

Para cada polvo, se prepararon fracciones de sacáridos concomitantes que son solubles en 75 % en volumen de metanol en agua del siguiente modo: Se prepararon respectivamente un polvo de prueba y un polvo de control en una disolución acuosa al 10 % p/vol que luego se mezcló con un volumen triple de metanol, y la mezcla resultante se mezcló bien rápidamente, y se centrifugó a 4 °C y 15.700 g x 10 min. Cada sobrenadante se secó por un evaporador, se mezcló con agua refinada para disolver el contenido, y se secó. Estos procedimientos se repitieron dos veces, seguido por retirada del metanol, redisolución de lo resultante en agua refinada, y filtrado de la disolución con un filtro de membrana de 0,45 pm para obtener una fracción de sacáridos concomitantes soluble en 75 % en volumen de metanol en agua. Cada fracción de sacáridos concomitantes se diluyó convenientemente y se sometió a análisis de GPC en las mismas condiciones, como se usa en el análisis de peso molecular anterior. Las FIG. 3 y 4 son respectivamente los patrones de elución de GPC de las fracciones de sacáridos concomitantes del polvo de prueba y el polvo de control.

Como se encontró en la FIG. 3, se observan varios picos en la fracción de sacáridos concomitantes del polvo de prueba; sin embargo, las áreas de cada pico son pequeñas y despreciables en cantidad. Mientras que como se encuentra en la FIG. 4, en la fracción de sacáridos concomitantes del polvo de control, se observó un pico ancho y grande en tiempos de retención que variaban desde aproximadamente 60 min hasta aproximadamente 70 min, lo que determina que el pico corresponde a los principales componentes de los sacáridos concomitantes. Los tiempos de retención que varían desde aproximadamente 60 min hasta aproximadamente 70 min corresponden a los pesos moleculares que varían desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 15.000 y corresponden aproximadamente a un sacárido que tiene una estructura de tipo pululano, donde las moléculas de maltotriosa se acoplan en serie en un modo de enlace a-1,6, con un grado de polimerización de la glucosa de aproximadamente 3 a aproximadamente 90 (que varía desde 1 (peso molecular de 504) hasta 30 (peso molecular de 14.598) por unidad de maltotriosa).

En las FIG. 3 y 4, el pico observado a un tiempo de retención de aproximadamente 71 min corresponde a manitol como un metabolito de la cepa MA446 y la cepa S-2 usada en la formación de pululano en la producción del polvo de prueba y el polvo de control. De esta forma, las fracciones de sacáridos concomitantes del polvo de prueba y el polvo de control contienen manitol, lo que significa que tanto el polvo de prueba como el polvo de control se producen sin emplear una etapa de retirada para retirar sacáridos concomitantes por la sedimentación con disolvente.

<Medición del contenido de sacáridos con grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90>

Como se ha descrito anteriormente, el manitol no se ensaya en el método de antrona-ácido sulfúrico y no está contenido en sacáridos concomitantes; sin embargo, se detecta como un pico a un tiempo de retención de aproximadamente 71 min en el análisis de GPC de la fracción de sacáridos concomitantes. El área correspondiente al manitol, que se resta del área total de las fracciones de elución obtenidas en las FIG. 3 y 4, se considera el área de sacáridos concomitantes medida en el método de antrona-ácido sulfúrico. Entonces, el porcentaje de área de un pico, correspondiente a los sacáridos con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90, con respecto al área anteriormente identificada de los picos, se determina y se muestra en la Tabla 5 como el contenido de sacáridos con un grado de polimerización (DP) de la glucosa de 3 a 90 ("contenido de sacáridos (%) con un DP de 3 a 90 en sacáridos concomitantes") medido en el método de antrona-ácido sulfúrico. El "contenido de sacáridos (%) con un DP de 3 a 90 en sacáridos concomitantes" anterior se multiplica por el contenido de sacáridos concomitantes (%) con respeto al contenido de sacáridos totales contenidos en todo el polvo que se determina alternativamente en el método de antrona-ácido sulfúrico, y el valor resultante se considera el "contenido de sacáridos (%) con un DP de 3 a 90 en la composición en partículas que contiene pululano" y se muestra en la Tabla 5 en paralelo. En la Tabla 5, el valor de "contenido de sacáridos (%) con un DP de 3 a 90 en la composición en partículas que contiene pululano" se calcula multiplicando el "contenido (%) de sacáridos concomitantes con un DP de 3 a 90", obtenido por análisis de GPC como se muestra en la Tabla 5, por el "contenido (%) de sacáridos concomitantes" obtenido por el método de antrona-ácido sulfúrico en la Tabla 5.

<Medición del contenido de manitol en la composición en partículas que contiene pululano>

El polvo de prueba y el polvo de control se analizaron por HPLC para determinar los contenidos de manitol en las composiciones en partículas que contienen pululano. El análisis de HPLC se realizó usando una columna de MCI GEL CK08EC (8 mm$ de diámetro interno x 300 mm de longitud, Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón), agua refinada como eluyente y un refractómetro diferencial como detector, y las condiciones de elución fueron 75 °C y un caudal de eluyente de 0,6 ml/min. Usando manitol con concentración conocida como patrón, se determinó el contenido de manitol, en una base de sólidos secos, basada en el área de los picos en la composición en partículas que contiene pululano. Los resultados están en la Tabla 5.

T l

Como se muestra en la Tabla 5, el polvo de prueba producido a partir del cultivo de la cepa MA446 no mostró gran diferencia en tanto el peso molecular promedio como en la distribución de pesos moleculares en comparación con los del polvo de control. En el polvo de prueba, el contenido de sacáridos con un grado de polimerización (DP) de la glucosa de 3 a 90 en los sacáridos concomitantes fue del 24,2 % en peso (el contenido de sacáridos con un DP de 3 a 90 en la composición en partículas que contiene pululano es del 0,1 % en peso), que fue inferior al 85,1 % en peso para el polvo de control (el contenido de sacáridos con un DP de 3 a 90 en la composición en partículas que contiene pululano es del 6,5 % en peso). El contenido de manitol en la composición en partículas que contiene pululano del polvo de prueba y el polvo de control fueron respectivamente del 0,35 % en peso y del 0,51 % en peso. En el polvo de prueba con un bajo contenido de sacáridos concomitantes, el contenido de sacáridos con un DP de 3 a 90 en sacáridos concomitantes también es bajo, en comparación con el polvo de control.

El polvo de prueba y el polvo de control, que se habían usado en el Experimento 4, se mezclaron en una relación mostrada en la Tabla 6 para preparar las muestras de prueba 1 a 10 con diferentes contenidos de sacáridos concomitantes. La Tabla 6 muestra el contenido de pululano, el contenido de sacáridos concomitantes y el contenido de sacáridos con un grado de polimerización (DP) de la glucosa de 3 a 90. Usando muestras de prueba, se conformaron películas y se comparó su resistencia. La formación de las películas y la medición de la resistencia a la rotura por perforación de las películas se realizaron de manera similar a la del Experimento 2-4. Los resultados están en la Tabla 7.

T l

T l 7

Como se muestra en las Tablas 6 y 7, las películas, que se habían formado con las muestras de prueba 1 a 4 que tienen un contenido de pululano del 97 % en peso o superior y el contenido de sacáridos concomitantes del 3 % en peso o inferior, mostraron una resistencia a la rotura por perforación superior en comparación con la película que se había formado con la muestra de prueba 10 que consiste en el polvo de control, y no provocó la rotura incluso cuando se sometió a un esfuerzo de 20 MPa. Mientras que en el caso de las muestras de prueba 5 a 9 con un contenido de pululano inferior al 97 % en peso y un contenido de sacáridos concomitantes de más del 3 % en peso, las películas formadas con la misma se rompieron cuando se sometieron a un esfuerzo inferior a 20 MPa. Estos resultados indican que la resistencia a la rotura por perforación tiende a reducirse a medida que aumenta tanto el contenido de sacáridos concomitantes como el contenido de sacáridos con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90 como los componentes principales de los sacáridos concomitantes. En las muestras de prueba 1 a 4 con un contenido de pululano del 97 % en peso o superior y un contenido de sacáridos concomitantes del 3 % en peso o inferior, no se indujo fisuración cuando las películas se rompieron, mientras que en el caso de las muestras de prueba 5 a 10 con un contenido de sacáridos concomitantes del 3 % en peso o superior, se observaron fisuras alrededor de las partes rotas, y se encontró una tendencia hacia el aumento de la frecuencia de causar fisuras a medida que aumenta el contenido de sacáridos concomitantes. En la muestra de prueba 4 con un contenido de sacáridos concomitantes del 2,7 % en peso que es inferior al 3 % en peso, el contenido de sacáridos con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90 es del 2 % en peso o inferior. Para obtener una resistencia a la rotura por perforación superior y una menor incidencia de la fisuración, se determinó que el contenido de sacáridos con un grado de polimerización de la glucosa de 3 a 90 debe tener preferentemente un nivel del 2 % en peso o inferior. <Experimento 6: Análisis de película de pululano sobre la luz de radiación>

Según el método en el Experimento 2, se disolvieron dos gramos de una composición en partículas que contiene pululano, que se había obtenido cultivando la cepa MA446 en el medio de cultivo 3, calentando en 18 g de agua desionizada, y la disolución resultante se coló en una placa lisa, se secó a 30 °C y se dejó reposar a una humedad relativa del 22 % durante 24 horas para formar una película con un espesor de aproximadamente 500 pm. La película así obtenida se sometió a análisis de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) que usa una radiación de sincrotrón como fuente de radiación. La medición se realizó usando "Beam line de Hyogo Prefecture (BL08B2)" ubicado en "SPring-8", una instalación de radiación a gran escala, 1-1-1 Koto, Sayo-cho, Sayo, Hyogo, Japón, en las siguientes condiciones. En particular, para monitorizar la dispersión con un ángulo de dispersión de 0,1° o inferior, se midió en una condición de longitud de cámara más larga (la siguiente <SAXS (larga)>).

Longitud de onda: 1,50 A

Longitud de cámara: 6114 mm

Detector: Placa de obtención de imágenes

Tamaño de píxel: 200 pm

Ángulo medido: 0,001-0,1°

Tiempo de exposición: 300 s

Muestra patrón: Colágeno

Procesador de datos: Rigaku R-AXIS

Longitud de onda: 1,00 A

Longitud de cámara: 1342 mm

Detector: Placa de obtención de imágenes

Tamaño de píxel: 200 pm

Ángulo medido: 0,01-2°

Tiempo de exposición: 300 s

Muestra patrón: Sal de plata de ácido behénico

Procesador de datos: Rigaku R-AXIS

Los patrones de difracción obtenidos del análisis anterior se muestran en las FIG. 5 y 6. Según los patrones de difracción obtenidos del análisis de SAXS, se observa normalmente una curva de dispersión que aumenta vertiginosamente y se atenúa moderadamente a medida que aumenta el ángulo de difracción (20). Se sabe que, cuando existen una estructura periódica de largo intervalo y una fluctuación de densidad en una muestra, una curva de dispersión no se atenúa ni uniformemente ni suavemente debido a las dispersiones así inducidas y, dependiendo de las muestras, se puede llegar a mostrar una curva quebrada. Como se encontró en las FIG. 5 y 6, en uno cualquiera de los patrones de difracción, las curvas de dispersión se atenúan suavemente sin crear vueltas. Estos resultados muestran que, en la película de la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención, que tiene un nivel extremadamente bajo de componentes de bajo peso molecular, es decir, contiene solo menos del 3 % en peso de sacáridos concomitantes obtenidos cultivando la cepa MA446, no existen ni una estructura periódica de intervalo largo ni una fluctuación de densidad. Por tanto, revela que la película es ventajosa en términos de su intensidad en que no tiene falta de uniformidad estructural de forma que la deformación de una parte específica aumentará cuando se someta a esfuerzo.

Una composición en partículas que contiene pululano, que se había obtenido cultivando la cepa MA446 en el medio de cultivo 3 según el método en el Experimento 2, y la composición en partículas que contiene pululano usada como control en el Experimento 4, se prepararon respectivamente en una disolución acuosa al 10 % p/vol que luego se mezcló con un volumen triple de metanol, seguido de mezcla rápida de la mezcla y centrifugación de la mezcla resultante a 4 °C y 15.700 g x 10 min. El precipitado resultante se redisolvió en agua y se volvió a tratar con el procedimiento anterior. El precipitado así obtenido se secó, se disolvió en tampón acetato 20 mM (pH 5,0) para constituir una disolución al 1 % p/vol, que luego se mezcló con "AMANO 3", un espécimen de pululanasa comercializado por Amano Enzyme Inc., Ltd., Aichi, Japón, en una cantidad de 5 unidades/g de composición en partículas, seguido de una reacción enzimática a 53 °C durante 48 horas. La disolución de reacción resultante se desaló, se diluyó apropiadamente y se analizó por HPLC para determinar los rendimientos de maltotriosa y maltotetraosa. El análisis de HPLC se realizó usando una columna de MCI GEL CK04SS (8 mm$ de diámetro interno x 300 mm de longitud, Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón), agua refinada como eluyente y un refractómetro diferencial como detector, y las condiciones de elución fueron 75 °C y un caudal de eluyente de 0,6 ml/min. Basándose en las áreas de los picos de maltotriosa y maltotetraosa obtenidos en el cromatograma, se determinó cada contenido de los sacáridos y, basándose en los datos, se determinó su relación molar. Los resultados están en la Tabla 8.

T l

Como se encontró en la Tabla 8, la relación (G4/G3) existente del componente con la estructura de maltotetraosa en una molécula de pululano contenida en la composición en partículas que contiene pululano, que se había obtenido cultivando la cepa MA446, fue sustancialmente la misma que en la molécula de pululano en la composición en partículas que contiene pululano como control (un polvo de control). En el pululano formado por la cepa S-2 y su mutante, la estructura de maltotetraosa está presente en una relación molar del 1 % al 3 % con respecto a la estructura de maltotriosa. Como se ha descrito anteriormente, la composición en partículas que contiene pululano obtenida a partir del cultivo de la cepa MA446 no supone gran diferencia en términos de la relación de la estructura de maltotetraosa con respecto a la estructura de maltotriosa, en comparación con la composición en partículas que contiene pululano como polvo de control. Esto revela el hecho de que, en comparación con las películas convencionales de composiciones en partículas que contienen pululano, la película de la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención tiene una resistencia a la rotura por perforación superior y una menor incidencia de la fisuración no es debida a la diferencia estructural, sino debida al contenido de sacáridos concomitantes.

El proceso de producción de la composición en partículas que contiene pululano de la presente invención, la composición en partículas obtenida con la misma y los productos moldeados producidos usando la composición en partículas como un material o una parte del mismo se explican con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

<Composición en partículas que contiene pululano>

A 1.000 partes en peso de un medio de cultivo (pH 7,0), que se había enrasado finalmente con agua y que contenía como fuentes de carbono 50 partes en peso de glucosa, 50 partes en peso de maltosa y 50 partes en peso de un jarabe de almidón ("MALT-RUP®", un jarabe de almidón enzimáticamente sacarificado, un contenido de sólidos de 80 %, un ED de aproximadamente 47, comercializado por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón) (un ED de aproximadamente 67 como fuentes de carbono) y dos partes en peso de hidrogenofosfato de dipotasio, dos partes en peso de peptona, dos partes en peso de cloruro sódico, 0,4 partes en peso de sulfato de magnesio heptahidratado y 0,01 partes en peso de sulfato ferroso heptahidratado, se inoculó un cultivo inicial de la cepa MA446 de Aureobasidium pullulans, que se había cultivado en una preparación reciente del mismo medio de cultivo como antes a 27 °C durante 48 horas, seguido por el cultivo de las células a 27 °C durante 72 horas en condiciones de aireación y de agitación. El rendimiento de pululano con respecto a los sacáridos, que se habían usado como fuentes de carbono, fue del 72,1 % en peso. Las células se retiraron del cultivo resultante por centrifugación, y el sobrenadante se decoloró / filtró con un carbón activado, se purificó por desalación con una resina de intercambio iónico, se concentró, se secó y se pulverizó obteniéndose una composición en partículas que contenía pululano como un polvo blanco que tiene una capacidad satisfactoria para fluir.

La composición en partículas tuvo un contenido de pululano del 99,2 % en peso, un contenido de sacáridos concomitantes del 0,8 % en peso y un contenido de sacáridos con grados de polimerización de glucosa de 3 a 90 del 0,3 % en peso. Por tanto, la composición en partículas contiene 0,2 % en peso de manitol, b.s.s. Además, el peso molecular medio de la composición en partículas fue 428.000 dáltones y la relación Mw/Mn fue 35,3. La composición en partículas se puede conformar en una película con una resistencia a la rotura satisfactoria. En particular, la composición en partículas tiene una menor cantidad de sacáridos concomitantes, y la relación Mw/Mn como índice para una anchura de distribución de pesos moleculares es de 35,3 como en el intervalo de 10 a 70, que indica que se espera que tenga propiedades estables satisfactorias en términos de propiedades físicas, tales como la resistencia de productos formados, así como sus tasas de disolución y disgregación. Debido a esto, la composición en partículas se puede usar en productos alimenticios, así como cosméticos, productos farmacéuticos, productos de parafarmacia, etc. En particular, en dichos productos farmacéuticos, la composición en partículas se puede usar preferentemente como un aditivo farmacéutico debido a que no afecta la disposición de componentes eficaces debido a la dispersión de la solubilidad y la desintegrabilidad.

Ejemplo 2

<Composición en partículas que contiene pululano>

Excepto por el uso, como fuentes de carbono, de 20 partes en peso de glucosa, 20 partes en peso de maltosa y 100 partes en peso de un jarabe de almidón (un jarabe de almidón sacarificado con ácido, contenido de sólidos del 75 %, ED de aproximadamente 42, comercializado por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón) (ED de aproximadamente 54 como fuentes de carbono), se obtuvo una composición en partículas que contenía pululano similarmente como en el Ejemplo 1. El rendimiento del pululano con respecto a los sacáridos, que se habían usado como fuentes de carbono, fue del 70,4 % en peso. Las células se retiraron del cultivo resultante por centrifugación, y el sobrenadante se decoloró / filtró con un carbón activado, se purificó por desalación con una resina de intercambio iónico, se concentró, se secó y se pulverizó para obtener una composición en partículas que contenía pululano como un polvo blanco que tiene una capacidad satisfactoria para fluir.

La composición en partículas tuvo un contenido de pululano del 97,9 % en peso, un contenido de sacáridos concomitantes del 2,1 % en peso y un contenido de sacáridos con grados de polimerización de glucosa de 3 a 90 del 0,7 % en peso. Por tanto, la composición en partículas contiene 0,6 % en peso de manitol, b.s.s. Además, el peso molecular medio de la composición en partículas fue 401.000 dáltones y la relación Mw/Mn fue 41,1. La composición en partículas se puede conformar en una película con una resistencia a la rotura satisfactoria. En particular, la composición en partículas tiene una menor cantidad de sacáridos concomitantes, y la relación Mw/Mn como índice para la anchura de la distribución de pesos moleculares es 41,1 como en el intervalo de 10 a 70, que indica que se espera que tenga propiedades estables satisfactorias en términos de propiedades físicas, tales como la resistencia de productos conformados, así como sus velocidades de disolución y disgregación. Debido a esto, la composición en partículas se puede usar en productos alimenticios, así como cosméticos, productos farmacéuticos, productos de parafarmacia, etc. En particular, en dichos productos farmacéuticos, la composición en partículas se puede usar preferentemente como un aditivo farmacéutico debido a que no afecta la disposición de componentes eficaces debido a la dispersión de la solubilidad y la desintegrabilidad.

Ejemplo 3

<Película de pululano>

En 750 partes en peso de agua desionizada se disolvieron 250 partes en peso de la composición en partículas que contiene pululano preparada en el Ejemplo 1, y 0,5 partes en peso de un tensioactivo (monolaurato de sacarosa) como un eliminador para obtener una disolución acuosa de material para película de pululano que entonces se desaireó a vacío. La disolución acuosa de material se coló sobre una película de plástico y se secó a 35 °C y una humedad relativa del 33 % para obtener una película de pululano con un espesor de 50 pm. La película de pululano así obtenida tuvo un contenido de humedad del 3,5 % en peso.

La película de pululano tiene una tolerancia mejorada frente al esfuerzo de rotura y una alta resistencia, tiene una solubilidad en agua satisfactoria, tiene una velocidad de disolución estable con una menor dispersión independientemente de su lote de producción y, por lo tanto, se puede usar ventajosamente en productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos, etc.

Ejemplo 4

<Película refrescante para la boca>

Según el modo convencional, a 69,25 partes en peso de agua desionizada se añadieron 22 partes en peso de una composición en partículas que contenía pululano obtenida por el método en el Ejemplo 1, una parte en peso de carragenina, 0,15 partes en peso de goma xantana, 0,15 partes en peso de goma de semilla de algarrobo, 0,8 partes en peso de maltitol, tres partes en peso de "aG-HESPERIDIN", una glucosil hesperidina comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japón, 2,6 partes en peso de aceite de menta emulsionado, 0,5 partes en peso de un extracto de própolis, 0,3 partes en peso de sucralosa y 0,25 partes en peso de ácido cítrico. La mezcla resultante se disolvió agitando a 90 °C durante tres horas, se coló en una placa de acero inoxidable de 2 x 10 m y se secó a 60 °C durante cuatro horas para obtener una producto en forma de película con un espesor de aproximadamente 200 pm, aproximadamente 200 cm de ancho, 10 m de longitud, aproximadamente 8 % de contenido de humedad y aproximadamente 2,2 g por 100 cm2. El producto conformado en película se cortó en un tamaño de 1 x 2 cm, y 20 hojas del mismo se envasaron en un recipiente portátil para obtener una película refrescante para la boca.

Puesto que el producto es una película comestible que tiene una resistencia apropiada y una rápida solubilidad en la boca y contiene glucosil hesperidina y extracto de própolis, es una película de cachou que se puede usar con el fin de mantener / promover la salud en la boca. El producto es una película comestible que se produce con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención como un material que tiene una composición de sacáridos aproximadamente constante que varía menos entre lotes y, por lo tanto, la velocidad de disolución en la boca es aproximadamente constante, y la velocidad de disolución de los componentes eficaces, tales como la glucosil hesperidina, es normalmente estable.

Ejemplo 5

Trescientas partes en peso de la composición en partículas que contiene pululano preparada en el Ejemplo 2, 30 partes en peso de carboximetilcelulosa, 10 partes en peso de 2-glucósido de ácido L-ascórbico, 0,1 partes en peso de KANKOs O-401, tres partes en peso de a-glucosil-rutina, cinco partes en peso de 1,2-pentanodiol, 2,5 partes en peso de glutamato de acil-L-sodio de ácido graso de N-aceite de coco, una parte en peso de hidróxido potásico, 0,3 partes en peso de edetato de trisodio, 0,3 partes en peso de citrato de trisodio, 0,2 partes en peso de ácido cítrico y 1.000 partes en peso de agua de intercambio iónico se prepararon en una disolución acuosa de material para hoja de pululano que luego se espumó. La disolución acuosa de material así obtenida se coló continuamente sobre una película de plástico sintético y se secó pasando a través de una corriente de aire a 50 °C para obtener una hoja de pululano con 100 pm de espesor.

Puesto que la hoja de pululano se produce con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención como un material que tiene una composición de sacáridos aproximadamente constante que varía menos entre lotes y, por lo tanto, tiene una resistencia a la rotura mejorada, una capacidad de manipulación satisfactoria y una velocidad de disolución constante esperada, independientemente de su lote de producción. Así, el producto se puede usar adecuadamente como un material de procesamiento para un envase cosmético que permita que componentes eficaces, tales como el 2-glucósido de ácido L-ascórbico y la a-glucosilrutina, actúen sobre la piel a una velocidad constante estable.

Ejemplo 6

Se preparó una disolución acuosa disolviendo en 100 partes en peso de agua una parte en peso de una composición en partículas que contenía pululano obtenida por el método en el Ejemplo 1 y 0,2 partes en peso de goma arábiga. Se sumergió un huevo fresco en las 10 horas después de ser puesto en la disolución acuosa durante 30 s, se sacó de la disolución, se secó a 30 °C durante dos horas para formar una membrana de pululano sobre la cáscara de huevo.

El huevo recubierto con la membrana de pululano se almacenó a temperatura ambiente (15 a 25 °C), y se comparó el periodo comestible con un huevo sin tratar como control (sin membrana de pululano), que reveló que el periodo comestible del huevo recubierto con la membrana de pululano se prolongó incluso por aproximadamente 5 a aproximadamente 10 veces. La membrana de pululano se puede usar ventajosamente para almacenar huevos para su uso en materiales para la industria alimentaria, etc.

Ejemplo 7

Se recubrió 150 mg de agente en bruto como un agente de absorción capilar con una disolución de recubrimiento que contenía 50 partes en peso de maltitol cristalino, 20 partes en peso de una disolución acuosa al 10 % p/p preparada con una composición en partículas que contenía pululano producida por el método en el Ejemplo 2, 15 partes en peso de agua, 25 partes en peso de talco y tres partes en peso de óxido de titanio hasta que alcanzó aproximadamente 230 mg de peso. El agente resultante se recubrió adicionalmente con otra disolución que contenía 65 partes en peso de una preparación fresca del mismo maltitol cristalino que se usó en lo anterior, 10 partes en peso de una preparación reciente de la misma disolución acuosa de pululano al 10 % p/p que se usó en lo anterior y 25 partes en peso de agua, y se recubrió sucesivamente con una cera líquida para obtener un comprimido brillante recubierto de azúcar con un aspecto satisfactorio.

El producto es un comprimido recubierto de azúcar que está recubierto con una membrana que contiene pululano, tiene una tolerancia mejorada contra la resistencia a la rotura, tiene un menor daño cuando se transporta o envasa, y retiene la calidad de componentes eficaces contenidos en el agente de absorción capilar durante un periodo relativamente largo de tiempo. Puesto que el producto se produce con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención como un material que retiene la composición de sacáridos de tal forma que varíe menos entre lotes y sea aproximadamente coherente, tanto la velocidad de disolución después de la administración como la unión con el agente de absorción capilar aproximadamente constante y los componentes eficaces contenidos en el agente de mecha son absorbidos por el cuerpo a un velocidad constante estable.

Ejemplo 8

Se mezclaron cinco partes en peso de una composición en partículas que contenía pululano obtenida por el método en el Ejemplo 1, 30 partes en peso de un extracto de própolis, 20 partes en peso de "NYUKAOLIGO" LS-55P, una marca comercial de un polvo que contiene lactosacarosa, comercializado por Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Japón, 10 partes en peso de lactato de calcio, cinco partes en peso de ácido L-ascórbico, una parte en peso de a-glucosil-rutina, una parte en peso de fosfato de calcio tribásico, una parte en peso de éster de ácido graso de sacarosa y una cantidad adecuada de un aroma en polvo hasta la homogeneidad, y se comprimieron con una prensa para comprimidos equipada con un punzón que tenía un diámetro de 6 mm para obtener un comprimido (aproximadamente 300 mg/comprimido).

El producto se usa adecuadamente como un producto administrable por vía oral para promover la salud debido a que es un comprimido que no induce la fisuración cuando se comprime, tiene una resistencia adecuada, presenta una disolvabilidad satisfactoria en agua para facilitar que sea tragado y contiene a-glucosil-rutina y extracto de própolis, así como lactosacarosa y pululano. La fuerza adhesiva inherente a la composición en partículas que contiene pululano es aproximadamente constante debido a que el producto se produce con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención como un material que retiene la composición de sacáridos de tal modo que varíe menos entre lotes y sea aproximadamente coherente. Mediante la compresión de los componentes recomendados en condiciones constantes, se puede obtener un comprimido satisfactorio, que tiene una forma normalmente estable y resistencia. El producto es un comprimido, que tiene una velocidad de disolución y desintegrabilidad constantes después de la administración y que los componentes eficaces son absorbidos por el cuerpo a una velocidad constante estable.

Ejemplo 9

Según el modo convencional, se mezclaron 68 partes en peso de maltosa, 15 partes en peso de a,a-trehalosa, cinco partes en peso de una composición en partículas que contiene pululano obtenida por el método en el Ejemplo 2, cinco partes en peso de palmitato de retinol, cinco partes en peso de ergocalciferol, 10 partes en peso de clorhidrato de fursultiamina, cinco partes en peso de riboflavina, 10 partes en peso de clorhidrato de piridoxina, 10 partes en peso de acetato de tocoferol, 30 partes en peso de amida de ácido nicotínico, 0,01 partes en peso de cianocobalamina, 40 partes en peso de pantotenato de calcio, 60 partes en peso de "AA2G", una marca comercial de 2-glucósido de ácido ascórbico, comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japón, una parte en peso de un aroma y una parte en peso de monofluorofosfato de sodio hasta la homogeneidad y se comprimieron para obtener un comprimido (200 mg/comprimido).

Puesto que el producto no induce la fisuración cuando se comprime, tiene una resistencia adecuada y tiene una solubilidad en agua satisfactoria, se usa adecuadamente como un agente de vitamina. La fuerza adhesiva inherente a la composición en partículas que contiene pululano es aproximadamente constante debido a que el producto se produce con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención como un material que retiene la composición de sacáridos de tal forma que varíe menos entre lotes y sea aproximadamente constante. Mediante la compresión de los componentes recomendados en condiciones constantes, se puede obtener un comprimido satisfactorio, que tiene una forma y resistencia normalmente estables. El producto es un comprimido, que tiene una velocidad de disolución y desintegrabilidad constantes después de la administración y que los componentes eficaces son absorbidos por el cuerpo a una velocidad constante estable.

Ejemplo 10

Según el modo convencional, se mezclaron 450 partes en peso de etenzamida, 300 partes en peso de acetaminofeno, 50 partes en peso de cafeína, 25 partes en peso de maltitol, 25 partes en peso de a,a-trehalosa, 200 partes en peso de sacarosa, 400 partes en peso de xilitol, 500 partes en peso de almidón de maíz, 20 partes en peso de polietilenglicol, seis partes en peso de una composición en partículas que contiene pululano preparada por el método en el Ejemplo 1 y seis partes en peso de goma arábiga, una parte en peso de "aG-SWEET", una marca comercial de a-glucosil esteviósido comercializado por Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokio, Japón, y se amasaron con 40 ml de agua y se comprimieron con una máquina de comprimidos para obtener un comprimido (aproximadamente 300 mg/comprimido).

Puesto que el producto no induce la fisuración cuando se comprime, tiene una resistencia adecuada y tiene una solubilidad en agua satisfactoria, se puede usar como una medicina fría de tipo sublingual que es inyectable mientras que se disuelve en la boca. La fuerza adhesiva inherente a la composición en partículas que contiene pululano es aproximadamente constante debido a que el producto se produce con la composición en partículas que contiene pululano producida por el método de la presente invención como un material que retiene la composición de sacáridos de tal forma que varíe menos entre lotes y sea aproximadamente constante. Mediante la compresión de los componentes recomendados en condiciones constantes, se puede obtener un comprimido satisfactorio, que tiene una forma y resistencia normalmente estables. Puesto que el producto tiene una velocidad de disolución constante en la boca, las velocidades de disolución de los componentes eficaces, tales como la etenzamida y el acetaminofeno, son estables y se puede permitir que actúen sobre el cuerpo a una eficiencia superior.

Ejemplo 11

<Gránulo>

Se mezcló una parte en peso de "LS-90P", una marca comercial de sacáridos que contiene lactosacarosa con un contenido de lactosacarosa de aproximadamente el 90 % en peso, b.s.s., comercializada por Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd., Tokio, Japón, 0,1 partes en peso de una composición en partículas que contiene pululano obtenida por el método en el Ejemplo 2, 0,5 partes en peso de "aG-HESPERIDIN", una marca comercial de glucosil hesperidina, comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japón, y 0,2 partes en peso de "aG-SWEET", una marca comercial de un espécimen de glucosil hesperidina comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japón, hasta homogeneidad y se sometieron a un granulador para obtener una preparación en polvo granulada.

Puesto que el producto contiene pululano, tiene una unidad satisfactoria como gránulo, una seguridad y disolvabilidad mejoradas, y capacidad para ser tragado. El producto puede ser útil como un alimento natural para mantener/promover la salud debido a que contiene glucosil hesperidina. La fuerza adhesiva inherente a la composición en partículas que contiene pululano es aproximadamente constante debido a que el producto se produce con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención como un material que retiene la composición de sacáridos de tal forma que varíe menos entre lotes y es aproximadamente coherente. Sometiendo a una máquina granular los componentes recomendados que incluyen la composición en partículas en condiciones constantes, se puede obtener un gránulo satisfactorio, que tiene una forma y resistencia normalmente estable. El producto es un gránulo, que tiene una velocidad de disolución constante y que los componentes eficaces, tales como la glucosil-hesperidina, son establemente absorbidos por el cuerpo. Ejemplo 12

<Fibra>

Una composición en partículas que contiene pululano obtenida en el Ejemplo 1 se disolvió en agua para obtener una disolución acuosa al 40 % p/p, en la que entonces se disolvieron 1,5 % p/p, b.s.s., de ácido algínico y 0,02 % p/p, b.s.s., de goma de semilla de algarrobo, y la disolución resultante se ajustó a 60 °C, seguido de compresión de la disolución en aire atmosférico a través de una boquilla cilíndrica, 0,3 mm de diámetro, 1 mm de longitud, a una presión de 3 kg/cm2, para formar una hebra y bobinarla por un rodillo, mientras que se seca para evaporar la humedad.

La fibra así obtenida tiene un tamaño de aproximadamente 25 pm, y puede ser retorcida, tricotada y tejida. Por tanto, la fibra tiene una resistencia e hidrofilia adecuadas y es de forma característica básicamente inocua y no estimulante para la piel debido a que está hecha de pululano, puede ser, por ejemplo, adecuada para hilos quirúrgicos, gasas, etc. La fuerza adhesiva y la disolvabilidad inherentes a la composición en partículas que contiene pululano es aproximadamente constante debido a que el producto se produce con la composición en partículas que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención como un material que retiene la composición de sacáridos de tal manera que varíe menos entre lotes y sea aproximadamente coherente. Por consiguiente, el producto es una fibra ventajosa que puede formar productos moldeados fibrosos que tienen una calidad constante, tal como resistencia y capacidad de disolución en condiciones de hilado recomendadas.

Ejemplo 13

A una parte en peso de una disolución al 0,01 % p/p de interferón-a con una actividad específica de 1,5 x 108 unidades se añadió 100 partes en peso de una composición en partículas que contenía pululano obtenida por el método en el Ejemplo 1, y la disolución resultante se filtró en membrana asépticamente, se liberó de pirógenos en el modo usual y se distribuyó en viales de 2 ml por 3.000.000 unidades por vial, seguido de liofilización.

El producto tiene una estabilidad en almacén relativamente larga incluso cuando se almacena a temperatura ambiente. El producto se disuelve rápidamente en agua y no afecta la disposición del interferón-a como componente eficaz y lo retiene constantemente debido a que el producto contiene la composición en partículas que contiene pululano de la presente divulgación, en donde la composición de sacáridos menos la composición que contiene pululano producida por el proceso de la presente invención, en donde la composición de sacáridos varía menos entre lotes y se mantiene aproximadamente de forma coherente. Así, el producto se puede usar como una inyección, reactivo para prueba, etc.

Aplicabilidad industrial

Como es evidente de la explicación anterior, según la presente invención, se puede producir una composición en partículas que contiene pululano con características mejoradas a partir de un cultivo obtenido cultivando un mutante de Aureobasidium pullulans sin emplear una etapa de purificación complicada, tal como precipitación con disolvente. La composición en partículas se puede producir sin una etapa de purificación complicada, tiene un nivel extremadamente bajo de sacáridos concomitantes en los sacáridos totales, tiene una pureza relativamente alta de pululano, tiene una composición estable y tiene una distribución de pesos moleculares de pululano dentro de un intervalo constante recomendado. Los cuerpos formados, tales como las películas formadas con la composición en partículas que contiene pululano, tienen una resistencia, disolvabilidad y disgregación satisfactorias, son constantemente estables, independientemente de sus lotes de producción, así la composición en partículas contribuirá enormemente a la expansión del uso de pululano en los campos de productos alimenticios, así como productos farmacéuticos, productos de parafarmacia y cosméticos, como una composición en partículas que contiene pululano de alta calidad, de precio relativamente bajo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de producción de una composición en partículas que consiste en pululano y sacáridos concomitantes que contienen manitol, que comprende las etapas de:

cultivar un microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans en un medio de cultivo que comprende una mezcla de sacáridos que contiene glucosa y maltosa como fuentes de carbono;

retirar las células del cultivo resultante; y

decolorar, desalar, concentrar y pulverizar lo resultante;

en donde dicho microorganismo tiene la propiedad de que el rendimiento (%) de sacáridos concomitantes no es superior al 3 %;

en donde dicha mezcla de sacáridos que contiene glucosa y maltosa tiene el equivalente de dextrosa de 50 a 90; en donde dicho microorganismo tiene la propiedad de que la relación entre "el rendimiento (%) de sacáridos concomitantes" y "el rendimiento (%) de pululano con respecto a sacáridos" es 0,05 o inferior;

en donde dicho "rendimiento (%) de sacáridos concomitantes" se define por la siguiente ecuación: rendimiento (%) de sacáridos concomitantes = { (Concentración (%) de sacáridos concomitantes) / (Concentración (%) de fuentes de carbono del medio de cultivo) } x 100;

en donde dicho "rendimiento (%) de pululano con respecto a sacáridos" se define por la siguiente ecuación: rendimiento (%) de pululano con respecto a sacáridos = { (Concentración (%) de pululano) / (Concentración (%) de fuentes de carbono del medio) } x 100;

en donde dicho proceso no contiene una etapa de retirar sacáridos concomitantes; y

en donde dicha composición en partículas tiene las siguientes características (1) a (4):

(1) dicho pululano y dichos sacáridos concomitantes son respectivamente insoluble y solubles en 75 % en volumen de metanol en agua;

(2) el contenido de dicho pululano con respecto al contenido de los sacáridos totales en toda dicha composición en partículas es del 97 % en peso o superior, cuando se determina basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico;

(3) el contenido de dichos sacáridos concomitantes con respecto al contenido de los sacáridos totales en toda dicha composición en partículas es del 3 % en peso o inferior, cuando se determina basándose en el método de antrona-ácido sulfúrico; y

(4) el contenido de dicho manitol no supera el 2 % en peso, en una base de sólidos secos.

2. El proceso de la reivindicación 1, en donde dicho microorganismo de la especie Aureobasidium pullulans es un mutante de la cepa S-2 de Aureobasidium pullulans (depositada en el Depósito internacional de organismos de patente, el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada con el número de acceso de FERM BP-11261).

3. El proceso de la reivindicación 2, en donde dicho mutante es una cepa MA446 mutante (depositada en el Depósito internacional de organismos de patente, el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada con el número de acceso de FERM BP-11250).

4. El proceso de la reivindicación 1, en donde dicha composición en partículas tiene las siguientes características (5) a (7):

(5) el peso molecular medio ponderal de dicho pululano es 50.000 a 1.000.000 dáltones;

(6) la relación entre peso molecular medio ponderal y peso molecular medio numérico de dicho pululano es 10 a 70; y

(7) contiene una estructura de maltotetraosa con respecto a una estructura de maltotriosa en una relación molar del 1 % al 3 % en la molécula de dicho pululano.

5. El proceso de la reivindicación 1, en donde dicha composición en partículas adicional tiene la siguiente característica (8):

(8) una película con un espesor de 100 pm obtenida por colada de una disolución acuosa al 20 % p/vol de la composición en partículas sobre una placa lisa, secado de la disolución colada a 25 °C y dejando que el producto secado repose a una humedad relativa del 22 % presenta una resistencia a la rotura por perforación de 20 MPa o superior cuando se analiza la resistencia a la perforación para la resistencia a la rotura usando un adaptador para la prueba de perforación con un área en sección transversal de 1 mm2