CN110623964B - 麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法、脂质体及用途 - Google Patents

麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法、脂质体及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种RGD环肽R8肽修饰的麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法。该法冻干保护剂以外加法的方式加入到预先制备好的RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP脂质体混悬液中；最后采用冷冻干燥法制备成复方脂质体的冻干粉；所述RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP脂质体混悬液的制备采用以下方法：先制备ERG/GEF‑LIP，后采用后插入法制备。本发明成功构建了RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP主动载药脂质体递药系统；用ERG/GEF‑LIP进行冻干工艺和处方的考察，筛选出最佳处方工艺后将其应用到RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP中进行验证。RGD/R8‑ERG/GEF‑LIP冻干粉的体外试验结果证实其具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用，荧光摄取强度以及良好的细胞凋亡率。

Description

麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法、脂质 体及用途
技术领域
本发明涉及一种脂质体的制备方法，尤其涉及一种麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法、脂质体及用途。
背景技术
由于癌症发病率和死亡率的持续增高，目前仍然是世界上最关注的难题之一。据统计，2015年中国大约新增了约430万例癌症病例，以及有约281万例癌症患者死亡，其中肺癌占据首位。国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer）编制的《2018年全球癌症发病率和死亡率估计》提供了一份全球癌症负担状况报告，预计2018年将有1810万新癌症病例和960万癌症死亡病例。其中肺癌是最常见的癌症（占总病例的11.6%），也是癌症死亡的主要原因（占总癌症死亡人数的18.4%）。临床上发现，肺腺癌已经逐渐替代肺鱗癌成为肺癌发病率最高的病理类型，约占NSCLC的一半，而NSCLC约占全部肺癌的85％。
目前，临床一线化疗用药（铂类，阿霉素，紫杉醇等）在化疗过程中，均会出现多药耐药现象，最终导致疾病进一步进展。GEF是最早用于治疗NSCLC的分子靶向药物，目前常用于二线治疗药物应用于临床。GEF是一种表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，针对EGFR靶点的NSCLC具有较好的临床治疗效果。其作用机制主要通过与三磷酸腺苷（ATP）竞争和EGFR的结合，通过AKT等途径阻断EGFR信号传导通路，抑制自身磷酸化以及活化，阻断表达EGFR的肿瘤细胞生长，阻断 PI3K-AKT等下游信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，起到抗肿瘤作用。对于发生EGFR突变的患者，GEF副作用的发生程度相较于化疗明显减轻。同时研究表明在女性患者、亚裔患者以及不吸烟患者中更多的观察到EGFR基因的突变。报道显示，东方国家的肺癌患者在临床上GEF的疗效往往都要好于西方国家。可见，GEF的深入研究对亚洲NSCLC患者有重要意义。
针对肺癌，寻找一种能够与GEF产生协同作用的药物，拓展GEF的应用范围，改善靶向药物在肺癌治疗方面的临床应用，具有重要价值。
发明内容
本发明要解决上述问题，在探讨了ERG与GEF联用具有协同抗肺癌的作用的基础上；针对ERG与GEF联用的药物制剂进行了脂质体的药物制剂开发。并对该药物制剂的制备方法以及药物制剂的质量、药效（动物实验）等方面进行了多方面的研究。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法：冻干保护剂以外加法的方式加入到预先制备好的RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液中；最后采用冷冻干燥法制备成复方脂质体的冻干粉；所述RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液的制备采用以下方法：先制备ERG/GEF-LIP，后采用后插入法制备。
作为上述技术方案的优选，冷冻干燥法的具体为快冻法，具体为先使设备中的冷阱部分的温度预先降低到最低温度，再将样品置于冷阱中。
作为上述技术方案的优选，冷冻干燥法的预冻时间为4h。
作为上述技术方案的优选，冷冻干燥法的冷冻干燥时间为48h。
作为上述技术方案的优选，冻干保护剂为蔗糖和甘露醇的组合，并且糖脂比为10:1，蔗糖和甘露醇的质量比为1:1。
作为上述技术方案的优选，所述RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液的制备方法具体为：按照SPC、Chole、RGD肽摩尔比5:1: 0.07称取，制备R8-ERG/GEF-LIP；按照SPC、Chole、RGD肽、RGD肽摩尔比5:1:0.07:0.07称取，制备得到RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液。
作为上述技术方案的优选，采用快冻法，在设备冷阱处放置4h后，转移到上层进行冻干干燥，冻干程序：-20~-10℃，15h；-10~0℃，15h；0~10℃，15h；10~20℃，15h；20~30℃，12h。
本发明的另一个目的是提供由上述方法制备得到的脂质体冻干粉。
本发明的在一个目的是提供脂质体冻干粉在制备抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的靶向药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明成功构建了RGD/R8-ERG/GEF-LIP主动载药脂质体递药系统；用ERG/GEF-LIP进行冻干工艺和处方的考察，筛选出最佳处方工艺后将其应用到RGD/R8-ERG/GEF-LIP中进行验证。RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的体外试验结果证实其具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用，荧光摄取强度以及良好的细胞凋亡率。
2、本发明进行了相关体内研究，其中初步药效学试验说明了RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉对裸鼠本身没有大的毒副作用，不会导致裸鼠在给药期间发生精神不良，体重降低等不良反应，并且RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉和RGD/R8-ERG/GEF-LIP相比，体内抑瘤作用相差不大。这表明，将RGD/R8-ERG/GEF-LIP制备成冻干粉形式，并不会影响脂质体对于裸鼠PC-9/GR肺癌移植瘤的抑制作用。靶向性试验也证实了所制备的载药脂质体具有一定的靶向性。
3、本发明建立在GEF联合ERG体外诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的作用机理基础上，构建RGD/R8-ERG/GEF-LIP主动载药靶向脂质体递药系统，并将其制备成冻干粉形式，进行体内外抗肺癌作用初步评价，并建立裸鼠肺癌移植瘤模型进行初步药效学研究和体内靶向性研究。 ERG/GEF-LIP最佳制备工艺及其质量评价表明：ERG/GEF-LIP通过硫酸铵梯度法载药GEF。脂质体形态较圆整，具有双层结构，粒径分布均匀。pH6.4的释放介质下，ERG/GEF-LIP24 h的累积释放率超过80 %。GEF的平均包封率为96.49±1.00%，载药量为5.73±0.62%。ERG的平均包封率为95.33±0.21%，载药量为3.94±0.10%。体外实验表明，PC-9/GR细胞耐药指数为13.90，细胞高度耐药。ERG/GEF-LIP作用于PC-9/GR细胞的增殖抑制作用和荧光摄取强度最强。RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的制备及其质量评价表明：通过后插入法制备RGD/R8-ERG/GEF-LIP，并采用快冻法，预冻4 h，冷冻干燥48 h制备RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉，每支脂质体冻干粉（5 mL）中含有245 mg蔗糖和245 mg甘露醇（糖脂比为10:1，蔗糖与甘露醇质量比为1:1）。脂质体形态较圆整，具有双层结构，粒径分布均匀。pH6.4的释放介质下，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉24 h的累积释放率超过80 %，具有良好的血清稳定性。GEF的平均包封率为80.50±0.98%，载药量为4.67±0.17%。ERG的平均包封率为94.29±1.04%，载药量为3.59±0.41%。体外实验表明，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉作用于PC-9/GR细胞的增殖抑制作用、荧光摄取强度以及细胞凋亡率均较高，和冻干前相差无异。RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉在裸鼠体内抑瘤作用及体内靶向性研究表明：RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉在对PC-9/GR荷瘤裸鼠的初步药效学试验中，各给药组对于裸鼠体重无明显变化，RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组均具有较明显的抑瘤作用。各脂质体给药组的脾脏指数较阳性药组显著升高。模型组的血清IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α水平均高于空白对照组，给药以后各个成分指标均有不用程度的下降，提示药物有一定的抗肺癌作用。病理切片结果显示各给药组的瘤组织坏死面积增大，脾脏和肺脏组织均为正常的形态学特征。体内靶向性研究结果表明显示荧光蓄积在肿瘤部位，所制备的载药脂质体具有一定的靶向性。
附图说明
图1为保护剂加入方式对脂质体冻干效果的影响；
图2为预冻速率对脂质体冻干效果的影响；
图3为预冻时间对脂质体冻干效果的影响；
图4为不同冻干干燥时间下冻干粉的含水量；
图5为不同冻干保护剂对脂质体冻干效果的影响；
图6为不同冻干保护剂加入量和比例情况；
图7为冻干保护剂合用对脂质体冻干效果的影响；
图8为处方优化验证试验；
图9为RGD/R8-ERG/GEF-LIP及其冻干粉在血清中的粒径和电位变化情况；
图10为模型公式；
图11为药物累积释放率拟合结果及相关系数；
图12为PC-9/GR细胞的凋亡率情况；
图13为各组裸鼠体重的变化；
图14为各组裸鼠肿瘤生长曲线；
图15为各组裸鼠平均瘤重及抑瘤率；
图16为各组裸鼠的脾脏指数；
图17为各组裸鼠血清中IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α的含量；
图18为样品及隔板的降温曲线；
图19为各脂质体外观观察；
图20为各脂质体透射电镜图；
图21为各脂质体粒径分布；
图22为各脂质体Zeta电位；
图23为RGD/R8-ERG/GEF-LIP及其冻干粉血清稳定性考察情况；
图24为GEF和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉在不同pH释放介质下的累积释放度；
图25为各脂质体24hMTT试验结果；
图26为各荧光载药脂质体的荧光摄取强度情况；
图27为PC-9/GR细胞凋亡流式图；
图28为各组裸鼠体重的变化；
图29为各组裸鼠肿瘤生长曲线；
图30为各组裸鼠血清中IL-2，TGF-β1，TIMPsC，TNF-α的含量；
图31为各组裸鼠组织病理学特点。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进行进一步的解释说明。
本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制。本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。
环肽/R8肽修饰的ERG联合GEF复方脂质体冻干粉的制备及其质量评价
本部分采用后插入法将DSPE-PEG3400-c(RGDfk）和DSPE-PEG1000-R8嵌入ERG/GEF-LIP的脂质膜，制备出RGD环肽/R8肽修饰的ERG/GEF-LIP（RGD/R8-ERG/GEF-LIP），考虑到脂质体本身稳定性问题，将其制备成冻干粉形式，对其形态、粒径分布、Zeta电位、血清学稳定性、体外释放进行初步考察，并针对耐药细胞PC-9/GR进行体外抗肺癌初步研究。
一、实验材料
（一）所选细胞系
人肺癌PC-9/GR细胞由人肺癌PC-9细胞逐步递增GEF浓度间歇作用的方法构建而成。
（二）实验药品与试剂
吉非替尼原料药（≥99%，南京安格医药化工有限公司，批号：170301）
麦角甾醇原料药（≥95%，美国SIGMA公司，批号：BCBN4049V）
卵磷脂（大豆，>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：G1813018）
高纯胆固醇（注射级，上海艾伟特医药科技有限公司，批号：B01221）
异硫氰酸荧光素（美国SIGMA公司，批号：SLBV4791）
硫酸铵（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20120313）
柠檬酸（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20110725）
三氯甲烷（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20171017）
无水乙醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20160414）
甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20160908）
甲醇（色谱级，美国天地有限公司，批号：MS1922-801）
石油醚（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20150911）
氢氧化钠（永华化学科技有限公司，批号：20170104）
聚碳酸酯径迹蚀刻膜（型号:0.8、0.4、0.22、0.1 μm，英国Whatman公司）
DSPE-PEG3400-COOH（美国Nanocs公司，批号：140328）
DSPE-PEG1000-COOH（美国Nanocs公司，批号：160331）
葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司，F20090921）
蔗糖（南宁糖业股份有限公司伶俐糖厂，批号171801）
乳糖（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20130120）
甘露醇（青岛明月海藻集团有限公司，批号20180314）
山梨醇（山东绿健生物技术有限公司，批号20171119）
木糖醇（河南千志商贸有限公司，批号20180123）
（三）实验器材
TS-1水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）
JA203H分析电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）
XS105DU分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）
DK-450B电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）
Scientz-ⅡD超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）
RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）
WH-861漩涡混合器（太仓华利达实验设备有限公司）
KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）
UV759S紫外-可见分光光度计（上海精科仪器公司）
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）
DDS-11A型精密数显电导率仪（杭州雷磁分析仪器厂）
PHS-3C型精密数显酸度计（杭州雷磁分析仪器厂）
HOMOEX-25高压膜挤出器（上海赫默仕机电科技有限公司）
Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪/Zeta电位仪（英国马尔文仪器有限公司）
H-7650透射扫描电子显微镜（日本HITACHI公司）
十二通道半自动多肽合仪（上海强耀生物科技有限公司）
FD-1-50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）
ZD-A30J真空冷冻干燥机（南京载智自动化设备有限公司）
DHS20-A水分测定仪（上海精密科学仪器有限公司）
1300 SERIES A2生物安全柜（美国赛默飞世尔公司）
ECLIPSE TS100/100-F倒置生物显微镜（日本尼康公司）
Thermo 3111型CO2培养箱（美国赛默飞世尔公司）
Eppendorf 5427R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）
Eppendorf 5702台式离心机（德国Eppendorf公司）
HH-2数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）
SX-500高压灭菌锅（日本TOMY公司）
冷藏冷冻箱（青岛海尔股份有限公司）
Thermo 905超低温冰箱（美国赛默飞世尔公司）
Cryosystem 750液氮罐（美国MVE公司）
XUEKE全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）
微量移液枪（德国Eppendorf 公司）
Synergy H1MFD多功能酶标仪（美国BioTek公司）
CytoFlex流式细胞分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）
二、方法与结果
（一）RGD环肽与R8肽的合成
DSPE-PEG3400-COOH和DSPE-PEG1000-COOH原料药购自西安瑞禧生物科技有限公司，交至强耀生物科技有限公司合成DSPE-PEG3400-c(RGDfk)肽和DSPE-PEG1000-R8肽。DSPE-PEG3400-c(RGDfk)及DSPE-PEG1000-R8纯化以后，通过MALDI-TOF-MS及H-NMR分析，鉴定出其分子量分别为4751.8及3015.6。
（二）RGD/R8-ERG/GEF-LIP的制备
先制备ERG/GEF-LIP，后采用后插入法（于55℃水浴中孵育1 h）制备。按照SPC、Chole、R8肽摩尔比5:1:0.07精密称取，制备R8-ERG/GEF-LIP；按照SPC、Chole、RGD肽摩尔比为5:1:0.07精密称取，制备RGD-ERG/GEF-LIP；按照SPC、Chole、R8肽、RGD肽摩尔比5:1:0.07: 0.07精密称取，制备RGD/R8-ERG/GEF-LIP。FITC标记的脂质体，即将FITC甲醇溶液加入至脂质材料中共同旋蒸形成薄膜，根据实验室前期考察结果，确定摄取试验中 FITC终质量浓度为25 μg·mL−1。
（三）RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的制备
脂质体混悬液在贮存期间易产生聚集、融合及药物渗漏等问题，再加上磷脂易氧化、水解的特性，难以满足药剂长期稳定性的要求，使其工业生产以及临床应用受到了很大限制[56-58]。水溶性药物与脂质体膜之间的相互作用较弱，长期稳定性问题更加突出。本章采用冷冻干燥法制备冻干粉，考察了冻干工艺，冻干保护剂种类对脂质体形态的影响。并在此基础上，重点考察了冻干保护剂的加入量对脂质体冻干前后外观、形态及包封率变化的影响。
由于本文制备了ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP，因采用靶头修饰的脂质体制备成本太高，在后续的冻干工艺考察中，为节约实验成本，用ERG/GEF-LIP进行考察，筛选出最佳处方工艺后将其应用到RGD/R8-ERG/GEF-LIP中进行验证。
1 冻干脂质体的制备
冻干过程产生的冰晶会对脂质体造成损伤，并导致样品不成形，产生皱缩。为了减小其对脂质体的破坏作用以及一定的美观程度，一般需要加入冻干保护剂[59]。冻干保护剂的加入方式分为内加法和外加法。外加法是指将保护剂直接加入已制备好的脂质体混悬液中，内加法是将保护剂加入脂质体的水化介质（195.81 mM的硫酸铵溶液）中共同水化。本实验先采用5%的蔗糖溶液作为冻干保护剂进行实验。图1结果表明，内加法所得脂质体粒径极显著高于外加法（P<0.01），且冻干后的成品外观明显塌陷和皱缩，为了节约实验成本，没有进一步进行包封率的测定。综合以上实验结果，本文选择外加法作为冻干保护剂的加入方式。
2 冻干工艺的考察
2.1 冻干粉共熔点的测定
物料的共熔点是指当温度升至某一数值时，冻实的物料内部冰晶开始熔化的温度。为了保证在开泵抽真空过程中物料不发生喷瓶、升华干燥过程中不发生塌陷变形，需要在达到药液共熔点5~10℃以下。试验中，将制备好的冻干样品置于冷阱中，记录隔板温度和样品温度随时间的变化值，绘制降温曲线。结果见图18。
由图18可知，0~11 min样品温度随着时间延长而一直降低，在11~12 min有一小段升温过程，此时温度由-2.3℃升至0℃，表明样品最低共熔点在-3~1℃之间，所以第一阶段（升华干燥）升温温度不宜超过-3℃。
2.2 预冻速率的考察
预冻速度，是冻干工艺过程中的重要参数之一，直接影响样品的冻干效果。通常有快冻法和慢冻法两种。其中快冻法是先启动冻干设备的降温功能，使冷阱部分的温度降低至最低温度（-56℃）后，再将预冻样品置入冷阱中，这种方法的特点是样品可以很快速降温。慢冻法是先把样品放置于冷阱之中，然后启动设备降温功能，这种方法的特点是样品自身的温度降低得较慢。不同的预冻速率可能引起脂质体的冷冻外相层和分子层之间产生渗透压，从而导致脂质体的药物渗漏出来。因此，本实验采用慢冻法和快冻法分别进行实验。实验结果如图2所示，慢冻法所得脂质体粒径显著高于快冻法（P<0.01），且冻干后的成品外观略微皱缩，不如快冻法外观蓬松。因此本实验采用快冻法，即先使设备中的冷阱部分的温度预先降低到最低温度（-56℃）后，再将样品置于冷阱中。
2.3 预冻时间
预冻时间的长短决定了样品是否完全冻实，这是影响冻干产品质量的关键因素。本实验分别考察了样品在冷阱中，采用快冻法分别预冻1，2，3，4，6，8 h后冻干的样品质量。按程序（-25~-15℃：300 min；-15~-10℃：360 min；-10~0℃：300 min；0~10℃：360 min；10~20℃：300 min；20~30℃：360 min）进行升华干燥。结果如图3所示。结果表明当预冻时间达到4 h时所得的样品外观饱满，粒径变化小，ERG和GEF的包封率均较冻干前变化小。为节约时间及成本,确定预冻时间为4 h。
2.4 冻干干燥时间的考察
冻干粉的储存温度必须低于药品的玻璃化转变温度，否则药品会出现塌陷、表面萎缩、变硬变色、结块等不良症状。而冻干粉中的含水量是影响玻璃化转变温度的一个重要因素。冻干粉中的含水量越高，其玻璃化转变温度越低，冻干粉的稳定性越差，因此水分也是控制冻干产品质量的一个重要因素。本实验分别考察了20，25，30，35，48，72 h的冻干干燥时间下的含水量，确定最佳冻干干燥时间。结果如图4所示，最终选用冻干48h作为冻干干燥时间。
3 冷冻干燥的处方优化
冻干工艺中不可缺少的辅料就是冻干保护剂。冻干保护剂像支架一样保护脂质体膜结构的完整性，防止药物泄露。在冻干前添加冻干保护剂并控制合适的降温速率，能够减少冷冻过程中冰晶对脂质体造成的损伤。在冷冻干燥过程中，如果冻干的温度高于药品的玻璃化转变温度，药品的粘度迅速降低，微观结构破坏，表面萎缩，最终发生塌陷现象。冻干保护剂在脂质体冻干过程中的主要作用就是提高脂质体的玻璃化转变温度，降低冷冻干燥过程中冰晶对脂质体囊泡的机械损伤。
所以，选择合适的冻干保护剂非常重要。常用的冻干保护剂种类有糖类和醇类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇等，本实验拟选用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇作为冷冻保护剂，考察它们在脂质体冷冻干燥的过程中的保护效果。
冻干保护剂考察的主要评价指标：冻干前后ERG和GEF的包封率变化小；外观疏松，无塌陷和皱缩，色泽均匀；冻干前后粒径变化小；冻干粉再复水后溶解完全。
3.1 冻干保护剂单用筛选
本试验设定糖脂比为6:1（即冻干保护剂用量为294 mg），采用上述冻干工艺进行冻干，结果如图5。试验结果表明，甘露醇的成型性较好，冻干后外观饱满，而蔗糖和葡萄糖对脂质体的保护作用较乳糖好，复溶后脂质体包封率较高。但是葡萄糖作为保护剂，复溶以后测粒径的PDI值偏高，分散性不佳。因此考虑用甘露醇作为支撑剂以使冻干产品获得良好的外观，将其与蔗糖进行进一步的合用筛选。
3.2 冻干保护剂的用量以及合用比例的确定
本实验通过改变糖脂比以及蔗糖与甘露醇之间的比例，设计9组试验，具体试验如图6所示。以冻干前后样品的外观，再复水时间，粒径均值，ERG和GEF包封率作为选择指标，考察其对冻干制品的保护作用。试验结果见图7，结果显示，组别1，2，4，7冻干粉的外观均完整疏松，均匀饱满，但是组别1的GEF包封率相较于其他3组较低，猜想可能甘露醇用量较蔗糖偏多导致GEF泄露情况严重。因此最终选用组别2，4，7进行验证试验，重复3次。
3.3 验证试验
制备RGD/R8-ERG/GEF-LIP样品，选用图6中的组别2，4，7进行验证试验，结果见图8。结果显示，各组别的外观均完整疏松，均匀饱满。其中组别2再复水时间最短，15 s，平均粒径137.0±1.3 nm，PDI 0.210±0.003，ERG包封率94.29±1.04%，GEF包封率80.50±0.98%。组别4平均粒径146.5±1.5 nm，PDI 0.214±0.008，ERG包封率89.68±6.87%，GEF包封率75.07±0.85%。组别7平均粒径158.2±1.1 nm，PDI 0.263±0.014，ERG包封率72.65±5.66%，GEF包封率74.69±1.08%。综上所述，最终选用组别2作为最后的的冻干处方工艺。通过以上冻干工艺和处方考察，确定最终冻干工艺如下：采用快冻法，在设备冷阱处放置4 h后，转移到上层进行48 h的冻干干燥（冻干程序：-20~-10℃：15 h；-10~-0℃：15 h；0~10℃：15 h；10~20℃：15 h；20~30℃：12 h）。冻干保护剂处方为：每支脂质体冻干粉（5 mL）中含有245 mg蔗糖和245 mg甘露醇（糖脂比为10:1，蔗糖与甘露醇质量比为1:1）。
（四）RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉质量评价
1 形态观察
1.1 外观形态
RGD-ERG/GEF-LIP溶液，R8-ERG/GEF-LIP溶液，RGD/R8-ERG/GEF-LIP溶液以及RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉复溶后均呈现乳白色，色泽均匀，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉外观完整疏松，均匀饱满，如图19所示。
1.2 显微形态（透射电镜观察脂质体）
采用负染法制备样品。在室温条件下，取RGD-ERG/GEF-LIP，R8-ERG/GEF-LIP，RGD/R8-ERG/GEF-LIP，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉样品，滴至电镜专用铜网上，用滤纸吸干多余样品，静置1 min。后用1 %磷钨酸负染，静置30s后用滤纸吸取铜网多余染液，自然挥干后电镜观察并照相。透射电镜结果表明，各脂质体形态较圆整，粒径分布均匀（图20）。
2 粒径及其分布
室温条件下，取ERG/GEF-LIP，RGD-ERG/GEF-LIP，R8-ERG/GEF-LIP，RGD/R8-ERG/GEF-LIP，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉样品，用纯水稀释20倍后注入样品池，采用激光粒度仪测定平均粒径及其分布。结果见图21。结果表明，ERG/GEF-LIP的平均粒径为142.8±2.8nm，多分散系数PDI为0.194±0.021，小于0.3，RGD-ERG/GEF-LIP的平均粒径为147.0±0.7nm，PDI为0.166±0.018，小于0.3，R8-ERG/GEF-LIP的平均粒径为148.5±2.5 nm，PDI为0.184±0.021，小于0.3，RGD/R8-ERG/GEF-LIP的平均粒径为149.6±1.9 nm，PDI为0.191±0.027，小于0.3，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉复溶后的平均粒径为132.8±1.2 nm，PDI为0.181±0.012，小于0.3，可见各脂质体的粒径分布较集中。
3 Zeta电位测定
室温条件下，取ERG/GEF-LIP，RGD-ERG/GEF-LIP，R8-ERG/GEF-LIP，RGD/R8-ERG/GEF-LIP，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉样品，用纯水稀释20倍后采用Zeta电位仪测定电位，结果见图22。结果显示ERG/GEF-LIP的Zeta电位为-18.9±0.6 mV，RGD-ERG/GEF-LIP的Zeta电位为-12.2±0.5 mV，R8-ERG/GEF-LIP的Zeta电位为0.769±0.037 mV，RGD/R8-ERG/GEF-LIP的Zeta电位为1.87±0.09 mV，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉复溶后的Zeta电位为5.61±0.22 mV。
4 血清学稳定性考察
取RGD/R8-ERG/GEF-LIP及其冻干粉各1 mL ，与滤过的胎牛血清以体积比1:1 混合，分别于0、0.5、1、 2、 4、 8 和 24 h 取 100 μL，用纯水稀释10倍后采用激光粒度仪/zeta 电位分析仪对其粒径及Zeta电位进行测定，结果见图9和图23。实验结果表明，RGD/R8-ERG/GEF-LIP在前4 h，粒径均在160 nm左右。在24 h时，粒径降为143.1 nm。而RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉复溶后在24h以内粒径稳定在140 nm左右，说明其具有良好的血清稳定性。
5 包封率与载药量
3批RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉样品，其中GEF的平均包封率为80.50±0.98%，载药量为4.67±0.17%。ERG的平均包封率为94.29±1.04%，载药量为3.59±0.41%。
6 释放度
本实验考察在不同pH条件下GEF药物的体外释放情况。分别精密吸RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉 4 mL，及GEF的柠檬酸溶液4 mL，具体操作详见第二部分中的“5.7释放度”。
由图24结果表明，GEF的体外释放具有显著的pH依赖性。在pH7.4下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，24 h内GEF原料药累积释放百分率为81.10%，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的累积释放百分率为73.34%。在pH6.4下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，24 h内GEF原料药累积释放百分率为99.12%，几乎完全释放。0.5 h内RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的累积释放百分率为25.60%<40%，6 h内RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的累积释放百分率为88.55%>80%，直至24 h，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的累积释放百分率为92.80%。2015版《中国药典》关于脂质体突释效应的要求：开始0.5 h的释放量应≤40%[49]，且24 h的累积释放百分率超过80 %。在释放介质为pH6.4的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液下，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉符合该要求。双靶头载药脂质体在弱酸性环境下更易释放，这将有利于脂质体选择性的在肿瘤酸性环境下释放出内容物，起到双重靶向的作用。
本文分别对GEF溶液和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的体外累积释放百分率（前4h）按零级、一级和Higuchi方程拟合，模型公式见图10，拟合结果和相关系数见图11。
图11 药物累积释放率拟合结果及相关系数。拟合结果表明，在pH7.4的释放介质下，GEF柠檬酸溶液和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的体外释放均更符合Higuchi模型。在pH6.4的释放介质下，GEF柠檬酸溶液和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的体外释放均更符合一级模型。
7 体外耐药细胞增殖抑制试验
采用体外培养PC-9/GR细胞，给予空白脂质体（LIP）、 ERG-LIP、ERG/GEF-LIP、RGD-ERG/GEF-LIP、R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉刺激24h后，测定不同浓度给药后的细胞增殖抑制率。具体操作详见第一部分中的“（四）ERG联合GEF对A549以及PC-9细胞的增殖抑制作用研究（MTT试验）”。本实验平行3次测定，结果见图25。结果表明，药物作用24 h时，LIP组各浓度下的抑制率均小于15%，表明在该浓度范围内，辅料对耐药细胞无抑制作用。在相同给药浓度下，双靶头修饰的脂质体的抑制率显著高于单靶头修饰的脂质体（P<0.01），且RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组的抑制率相差不大，没有显著性差异（P>0.05），表明将双靶头脂质体制备成冻干粉形式，不会减弱其对PC-9/GR细胞的增殖抑制作用。
8 体外耐药细胞摄取试验
将FITC甲醇溶液与SPC，Chole，ERG共同旋蒸形成薄膜，所制备的脂质体中的FITC浓度为137.5 μg· mL-1。定量将所制备的FITC标记的ERG/GEF-LIP、RGD-ERG/GEF-LIP、R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉用完全1640培养基稀释至FITC终浓度为25 μg·mL-1。具体操作详见第二部分“5.10 ERG/GEF-LIP体外耐药细胞摄取试验”。本实验平行3次测定，结果见图26。试验结果表明，荧光摄取强度依次为RGD/R8-ERG/GEF-LIP≈ RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉> R8-ERG/GEF-LIP > RGD-ERG/GEF-LIP > ERG/GEF-LIP，表明双靶头脂质体相较于单靶头脂质体具有较好的荧光摄取作用，且将RGD/R8-ERG/GEF-LIP制备成冻干粉，对PC-9/GR细胞的荧光摄取作用并没有减弱。
9 体外耐药细胞凋亡试验
采用体外培养PC-9/GR细胞，给予ERG/GEF-LIP、RGD-ERG/GEF-LIP、R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组刺激24 h，具体操作详见第一部分“1.细胞率凋亡测定”。本实验平行3次测定，试验结果见图27和图12。结果表明，各给药组的细胞凋亡率均极显著高于空白对照组（P<0.01）。其中，RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组的细胞凋亡率相对于单靶头修饰脂质体，均有极显著性差异（P<0.01）。RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组之间的凋亡率没有显著性差异（P>0.05），表明将RGD/R8-ERG/GEF-LIP制备成冻干粉，对PC-9/GR细胞的凋亡作用并不会减弱。
三、分析与讨论
本部分试验在第二部分试验基础上，将RGD环肽与R8肽通过PEG连接在DSPE 上，修饰肽作为磷脂材料直接修饰在脂质体表面，避免其在进入人体循环系统后脱离脂质体表面，从而增加共修饰脂质体的稳定性。考虑到RGD肽可以特异性结合细胞表面上的整合素受体，而这种受体又在活化的内皮细胞和肿瘤细胞的表面上高度表达[60-63]，增加穿膜肽R8肽的修饰能增加脂质体入胞的几率。再加上脂质体本身稳定性问题，本章对RGD/R8-ERG/GEF-LIP进行冷冻干燥工艺和处方的考察，以冻干粉的外观，粒径，再复水时间，包封率为评价指标。
查阅相关文献发现，脂质体悬浮液的结晶属均相成核，即温度的下降会导致液相内的热起伏随机涨落，使其内的分子聚集成核。采用快冻法，成核几率高，单位体积内生成的晶核多，从而形成细腻的冰晶结构，最终得到的产品外观完整，疏松易溶。相反，慢冻法形成的表面浓缩层较厚，阻止水蒸气的逸出，使冻干时间延长，样品升华后留下的孔洞较大，所得冻干品易塌陷[64]。该理论与本实验得出的结果相一致，因此确定最终冻干工艺如下：采用快冻法，在设备冷阱处放置4 h后，转移到上层进行48 h的冻干干燥（冻干程序：-20~-10℃：15 h；-10~-0℃：15 h；0~10℃：15 h；10~20℃：15 h；20~30℃：12 h）。冻干保护剂处方为：每支脂质体冻干粉（5 mL）中含有245 mg蔗糖和245 mg甘露醇（糖脂比为10:1，蔗糖与甘露醇质量比为1:1）。冻干后的制品中，GEF的平均包封率为80.50±0.98%，略微下降。血清学稳定性试验表明，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉具有良好的血清稳定性。体外耐药细胞增殖抑制试验，摄取试验以及凋亡试验均证实了RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉与冻干前的作用效果相差无异。
四、小结
本部分成功构建了RGD/R8-ERG/GEF-LIP主动载药脂质体递药系统。为节约实验成本，用ERG/GEF-LIP进行冻干工艺和处方的考察，筛选出最佳处方工艺后将其应用到RGD/R8-ERG/GEF-LIP中进行验证。RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉的体外试验结果证实其具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用，荧光摄取强度以及良好的细胞凋亡率。
RGD环肽/R8肽修饰的ERG联合GEF复方脂质体冻干粉在裸鼠体内抑瘤作用及体内靶向性研究
本部分选用BABL/C裸鼠，在其背侧接种PC-9/GR细胞[65-66]，待肿瘤生长至体积为200 mm3时，尾静脉注射给药两周，以裸鼠体重，瘤体积变化情况，瘤重，抑瘤率，脾脏指数，血清中IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α水平，脾脏及瘤组织病理特点为指标，进行初步药效学研究（即体内抑瘤作用的研究）。采用小动物活体荧光成像系统[67-70]，观察给药后不同时间点下脂质体的体内分布，并于第二天解剖取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾观察离体组织的荧光分布情况。
一、实验材料
（一）细胞与动物
人肺癌PC-9/GR细胞由人肺癌PC-9细胞逐步递增GEF浓度间歇作用的方法构建而成。34只BABL/C裸鼠，雄性，SPF级，3~4周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）2013-0016。裸鼠在浙江中医药大学动物实验中心的动物实验房饲养，温度21~25 ℃, 湿度为55 %~65 %。
（二）试剂与仪器
小鼠白细胞介素-2（IL-2）酶联免疫试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号：20181223791）
小鼠转化生长因子β1 (TGF-β1)酶联免疫试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号：20181225531）
小鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)酶联免疫试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号：20181224915）
小鼠肿瘤坏死因子α (TNF-α)酶联免疫试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号：20181228335）
DiR细胞膜深红色荧光探针（上海元升生物科技有限公司，批号：D9812190）
IVIS Lumina K Series Ⅲ小动物活体成像系统（IVIS Lumina K Series Ⅲ，浙江中医药大学动物实验研究中心）
二、方法与结果
（一）初步药效学试验
1 动物分组
将PC-9/GR肺癌细胞株从培养瓶中消化后用0.9 %生理盐水重悬，调整细胞浓度至2.5×107个·mL-1接种于BABL/C裸鼠左侧腋下。每只裸鼠接种0.2 mL细胞悬液。待肿瘤体积长至200 mm3时，采用随机数字表法将裸鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性药组、ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组，每组5只。
2 给药方法
各组裸鼠均采用尾静脉注射的方法给药。正常对照组及模型对照组给予生理盐水，0.4 mL/只；阳性药组给予与脂质体等浓度的GEF溶液，0.4 mL/只；ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP组，0.4 mL/只；隔天注射，共注射7次。
3 观测指标
3.1 各组裸鼠体重、肿瘤体积变化及抑瘤率
开始给药后，定期测定一次裸鼠体重，同时用游标卡尺测量肿瘤最长及最短直径，计算肿瘤的体积。连续给药7次后，测量各组肿瘤体积并计算各给药组抑瘤率。
3.2 各组裸鼠脾脏指数
完整取出裸鼠脾脏并称重，计算脾脏指数。
3.3 测定裸鼠血清IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α水平
测量裸鼠体重、瘤径后，对裸鼠摘眼球取血，置于抗凝管中，并迅速颈椎脱臼处死。4000 rpm·min-1离心15 min取血清，严格按照试剂盒说明操作，测定各组IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α的含量。
3.4 各组裸鼠瘤组织、脾脏、肺脏病理改变
采用HE染色，取出瘤组织、脾脏以及肺脏置于福尔马林中固定，取样制成切片后进行病理学观察。
3.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理，采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P< 0.05表示有显著性差异，P< 0.01表示有极显著性差异。
4 实验结果
4.1各组裸鼠体重、肿瘤体积及抑瘤率
4.1.1 裸鼠体重变化
开始给药后，于第1、3、5、9、11、13、15天测定裸鼠体重。各组裸鼠的体重变化曲线如图13和图28所示。结果表明，给药期间各组裸鼠体重并无下降现象，均呈现稳步上升趋势，每个组别第15天的体重均较第1天显著增加（P<0.05，P<0.01），这说明各组给药前后，药物对于裸鼠的体重影响不大。第15天，通过单因素方差分析得出各组别之间体重没有差异（P>0.05）。
4.1.2 肿瘤体积变化
开始给药后，于第1、3、5、9、11、13、15天测定裸鼠肿瘤的长短径，计算肿瘤体积。测定结果如图14和图29所示，结果表明，给药后各组移植瘤均表现为体积增大，呈局部结节状生长。阳性药组在给药第9天以后，肿瘤体积呈现快速增长趋势，猜测可能针对于PC-9/GR耐药移植瘤，吉非替尼原料药在前9天，能在一定程度上抑制肿瘤体积的增加，但是9天后，吉非替尼原料药可能对该移植瘤产生一定的耐药性，最终导致肿瘤体积快速增长。RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组在15天给药结束后，肿瘤体积变化最小。第15天的肿瘤体积，与模型对照组相比，ERG/GEF-LIP的肿瘤体积显著减少（P<0.05），RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组的肿瘤体积极显著减少（P<0.01）。
4.1.3 各组裸鼠抑瘤率
从图15中数据可知，对于PC-9/GR荷瘤裸鼠，与模型组对照组相比，阳性药、ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组的平均瘤重均具有极显著性差异（P<0.01），其抑瘤率分别为21.91%，26.41%，35.09%，33.58%。RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组的平均瘤重无显著性差异（P>0.05）。这表明，将RGD/R8-ERG/GEF-LIP制备成冻干粉形式，并不会影响脂质体对于裸鼠PC-9/GR肺癌移植瘤的抑制作用。
4.2 各组裸鼠脾脏指数
图16中数据显示，与正常对照组和模型对照组相比，阳性药组脾脏指数降低，差异均有显著性(P< 0.05)，表明在阳性药作用下，裸鼠的免疫力有一定的下降。与阳性药组相比，ERG/GEF-LIP，RGD/R8-ERG/GEF-LIP，RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组脾脏指数均升高（P<0.01，P< 0.01，P< 0.05）。其中，ERG/GEF-LIP组的脾脏指数出现异常增高现象，原因可能是在尾静脉注射过程中，ERG/GEF-LIP药物对于裸鼠的刺激性较强，导致最终出现脾脏肿大的异常现象。空白对照组，模型对照组，RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组之间的脾脏指数并没有显著性差异（P>0.05）。
4.3裸鼠血清IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α水平
结果如图17和图30所示。与空白对照组相比，模型对照组的血清IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α水平极显著升高（P<0.01）。与模型组相比，各给药组的血清IL-2、TGF-β1、TIMPs水平均极显著降低（P<0.01），RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组的血清TNF-α水平显著降低（P<0.05）。与阳性药组相比，RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组的血清TGF-β1、TIMPs水平极显著降低（P<0.01）。对于血清IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α水平，RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组之间没有显著性差异（P>0.05）。
4.4 各组裸鼠肿瘤、脾脏、肺组织病理特点
结果如图31所示，各组脾脏和肺脏组织均为正常的形态学特征，并无明显病理变化，表明药物对脾脏和肺脏没有毒性。模型组肿瘤组织癌细胞丰富，排列紧密，细胞间质少，核大深染。给药各组肿瘤组织数目减少，密度降低，细胞皱缩导致间隙出现，细胞核固缩、碎裂，均有明显的细胞坏死，呈分隔状。组织间出现区域性坏死现象，淡红色胞浆的面积增大。
取体重约为25 g，已建立PC-9/GR荷瘤裸鼠模型的雄性裸鼠，分别尾静脉注射0.2mL的DiR原料药、包裹DiR的RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉（DiR浓度为7.5 μg·mL-1），采用异氟烷分别于不同时间点将裸鼠麻醉，置于活体成像仪下观察脂质体的体内分布（Ex=748 nm，Em=780 nm，曝光时间2 s）。24 h后，最后一次活体成像结束后处死，取出心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤，置于活体成像仪中观察脂质体在离体组织中的分布情况。DiR原料药进入裸鼠体内后，荧光在24h内在肿瘤部位均没有蓄积，离体组织分布表明荧光大部分在肝脏和脾部位。RGD/R8-ERG/GEF-LIP和冻干粉组在实时体内荧光成像试验中，荧光均被观察到在肿瘤部位蓄积。在离体组织中也观察到冻干粉组在肿瘤部位的荧光强度要略高于RGD/R8-ERG/GEF-LIP组。我们推测，冻干粉的粒径相较于RGD/R8-ERG/GEF-LIP的粒径小，一定程度上增加了其进入肿瘤细胞的概率，增加了在体内的肿瘤靶向效果。
三、分析与讨论
肿瘤炎症微环境的产生是在慢性炎症的长期刺激下，导致肿瘤释放许多促进其自身生长的细胞因子，这些细胞因子介导的信号通路又参与了肿瘤细胞的恶性发展，从而构成了肿瘤炎症微环境，有利于肿瘤的发生和进一步发展。IL-2是参与免疫调节的细胞炎症因子，当体内存在肿瘤炎症微环境，IL-2会发生过表达现象[71-72]。TGF-β1是一类多肽酶生长抑制因子，TGF-β1的过度表达导致平衡被打破，可影响肿瘤免疫功能的正常发挥，使肿瘤细胞逃脱了免疫系统监测[73-74]。TIMPs是一种抑制基质金属蛋白酶（MMPs）活性的细胞因子。在肿瘤的发生发展过程中，MMPs常过度表达，导致肿瘤的侵袭转移及血管形成[75-76]。TNF-α是一种能够促进肿瘤生长的细胞因子。慢性长期分泌TNF-α为肿瘤的生长和进展提供了条件，恶性肿瘤患者血清TNF-α升高的原因可能与肿瘤细胞在转移过程中肿瘤浸润细胞接受肿瘤抗原刺激，产生TNF-α增多有关[77-79]。这四个细胞因子在抑制肿瘤生长等方面具有重要作用，均与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，其表达水平可间接反映机体免疫功能状态和肿瘤进展情况。
本部分试验首先以裸鼠瘤体积变化情况，抑瘤率，脾脏指数，血清中IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α水平，脾脏及瘤组织病理特点为指标，进行初步药效学研究。初步药效学研究表明，给药期间药物对于裸鼠的体重影响不大，且给药组的肿瘤体积生长速度均小于模型组。阳性药、ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP、RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组抑瘤率分别为21.91%，26.41%，35.09%，33.58%。阳性药组的脾脏指数相较于模型组有一定的降低（P<0.05），提示原料药具有降低免疫力的副作用。从血清中IL-2、TGF-β1、TIMPs、TNF-α水平可以看出，模型组的各个成分指标均高于空白对照组，表明模型建立成功。给药以后，各个成分指标均有不用程度的下降，其中RGD/R8-ERG/GEF-LIP和RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉组的效果最佳。病理切片结果显示，给药组的瘤组织坏死面积增大，脾脏和肺脏组织均为正常的形态学特征。
采用有效的技术来标记和示踪主动靶向制剂靶向性的效果将对其动物实验研究和临床上应用起到促进作用。荧光染料DiR性质稳定，没有毒性，示踪期长，逐渐成为示踪的常用染料。活体荧光成像试验表明载药脂质体在肿瘤部位的荧光能产生蓄积现象，证实了其具有一定的靶向性。离体取裸鼠肿瘤组织和其余各组织，发现药物在肝脏、脾脏和肿瘤组织部位均有荧光蓄积，也从另一方面佐证了载药脂质体具有一定的靶向性。
四、小结
本部分进行了相关体内研究，其中初步药效学试验说明了RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉对裸鼠本身没有大的毒副作用，不会导致裸鼠在给药期间发生精神不良，体重降低等不良反应，并且RGD/R8-ERG/GEF-LIP冻干粉和RGD/R8-ERG/GEF-LIP相比，体内抑瘤作用相差不大。这表明，将RGD/R8-ERG/GEF-LIP制备成冻干粉形式，并不会影响脂质体对于裸鼠PC-9/GR肺癌移植瘤的抑制作用。靶向性试验也证实了所制备的载药脂质体具有一定的靶向性。

Claims (2)

1.麦角甾醇联合吉非替尼复方脂质体冻干粉的制备方法：冻干保护剂以外加法的方式加入到预先制备好的RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液中；最后采用冷冻干燥法制备成复方脂质体的冻干粉；所述RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液的制备采用以下方法：先制备ERG/GEF-LIP，后采用后插入法制备；
所述冷冻干燥法为快冻法，具体为先使设备中的冷阱部分的温度预先降低到最低温度-56℃，再将样品置于冷阱中；预冻时间为4h；冷冻干燥时间为48h；冻干保护剂为蔗糖和甘露醇的组合，并且糖脂比为10:1，蔗糖和甘露醇的质量比为1:1；所述RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液的制备方法具体为：按照SPC、Chole、RGD肽摩尔比5:1: 0.07称取，制备R8-ERG/GEF-LIP；按照SPC、Chole、RGD肽、RGD肽摩尔比5:1:0.07:0.07称取，制备得到RGD/R8-ERG/GEF-LIP脂质体混悬液；
所述快冻法，具体为在设备冷阱处放置4h后，转移到上层进行冻干干燥，冻干程序：-20~-10℃，15h；-10~0℃，15h；0~10℃，15h；10~20℃，15h；20~30℃，12h。
2.根据权利要求1所述的方法制备得到的脂质体冻干粉。
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