CN108451905B - 一种藤黄酸纳米乳制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效低毒的藤黄酸纳米乳制剂及其制备方法和应用，这种纳米乳制剂包括表面活性剂，助表面活性剂，油相，藤黄酸和水，使其粒度在1～100nm，电位为‑30～30mV，分散性小于0.3，可能够显著提高藤黄酸的溶解度，具有良好的质量稳定性制剂。体内动物毒性实验和体外细胞毒性均表明藤黄酸纳米乳能够显著降低肝脏和肾脏毒性，具有明显缓释作用，提高生物利用度，增强其抗急性髓系白血病细胞的增殖能力，延长白血病小鼠的存活时间。该新型纳米乳制剂对治疗白血病尤其是急性髓系白血病具有重要现实意义。

Description

一种藤黄酸纳米乳制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于制药领域，涉及难溶性藤黄酸纳米乳制剂，还涉及该制剂的制备方法和应用。

背景技术

白血病(leukemia)又称“血癌”，是造血组织的恶性干细胞恶性克隆性疾病，其特征为白细胞在骨髓及其他造血组织中呈恶性、无限制地增生，进而浸润全身各组织和脏器，对机体产生严重损害。白血病的发病率在世界各国中，欧洲和北美发病率最高，其死亡率为3.2～7.4/10 万人口。亚洲和南美洲发病率较低，死亡率为2.8～4.5/10万人口。其中的急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童发病率最高的恶性肿瘤(占所有癌症病例的26％)。据调查，我国<10岁小儿的白血病发生率为3/10万～4/10万。ALL急性淋巴细胞白血病的总体生存率范围为45％至81％(通常>60％)。急性骨髓性白血病的50～80％的治疗患者容易复发。急性淋巴细胞白血病(ALL，占儿童急性白血病75～80％)的治疗取得显着进展，高收入国家(HICs)的5年总体生存率达到90％，急性骨髓性白血病(AML)5年总体生存率接近70％。大约40～45％的年轻人和10-20％的老年急性骨髓性白血病(AML)患者将通过现行标准化疗来治愈。复发和 /或难治性疾病患者治愈率不高于10％。急性骨髓性白血病(AML)也是老年人的一种疾病，过去几年里，死亡率有所下降，但是、结局仍然很差，5年整体生存率低于20％。这是由于受体酪氨酸激酶3(FLT3)的突变在AML中是常见的，包括25％的患者的并置膜结构域中的内部串联重复，在5％的酪氨酸激酶结构域中的点突变。FLT3在人类白血病细胞中的表达非常广泛，如70％-100％的AML、100％B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、27％的T系急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、混合性白血病(MAL)、慢粒急变期(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)都有FLT3的异常表达。FLT3突变在AML患者的疾病发生、发展中起重要作用，也提示FLT3是AML预后不良的指标。因此，治疗白血病对保障人类身体健康具有十分重要的意义。

目前治疗白血病都以化疗为主，但由于其为无选择性损伤性疗法，故人们都在竭力寻求探索损伤较小的疗法治疗白血病，例如时下比较流行的中药治疗白血病和中西医结合治疗白血病，较化疗都有损伤小、愈后好的优点。经过多年的基础及临床研究，中医药和中西医结合治疗白血病取得了显著成就。中医药不仅可以减轻化疗的毒副作用，而且具有延长或阻止白血病复发、逆转白血病多药耐药和预防白血病相关并发症的优势。藤黄是我国传统医学中治疗肿瘤的一类常用药物，其抗肿瘤的活性成分之一是藤黄酸。藤黄酸作为一种多靶点抗肿瘤药物，能通过多种机制发挥抗肿瘤效应。

藤黄酸(Gambogic acid，GA)分子式为C₃₈H₄₄O₉，相对分子质量为628.34，为橙黄色无定型粉末，具有光学活性。研究表明藤黄酸对于多数肿瘤细胞都具有抑制作用，陆跃鸣等研究发现藤黄酸以及藤黄115℃、1～2h高压蒸制后对K562细胞生长抑制作用最强；Han等也发现藤黄酸对K562细胞和阿霉素抵抗的K562细胞表现出很强的细胞毒性。它抗肿瘤的作用机制是多方面的，包括影响细胞周期调控诱导细胞凋亡和自噬、抗肿瘤血管生成、抑制肿瘤浸润转移、抑制端粒酶对抗肿瘤永生、影响肿瘤基因和蛋白表达等多个方面，并且与其他抗肿瘤药物有协同和增敏作用，并可逆转肿瘤多药耐药。研究均表明藤黄酸具有较为明显的抗肿瘤作用，曾被FDA批准用于癌症治疗的Ⅱ期临床试验结果，其注射用Ⅱa期临床试验表明藤黄酸单药治疗晚期癌症显示出一定的抗肿瘤作用，毒副作用轻微，未发现骨髓抑制和对心肝肾等重要器官的影响，对受试者生活质量无影响。但是该成分稳定性较差，在生产应用过程中易受到溶剂、湿度、温度、光照以及pH值等条件的影响而分解，目前临床使用的藤黄酸常片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂，尤其以注射剂为主，它在醇类、酮类等有机溶剂中溶解度较大，在水中溶解度极低(0.5μg/mL)和稳定性很差，目前报道的藤黄酸原料主要是使用硼砂溶液溶解配制的，该方法稳定性差，临床使用不安全。为增强藤黄酸的开发的可行性，需要解决藤黄酸溶解度差这一问题。

而现代新型纳米乳制剂(Nanoemulsion)，属于纳米技术制剂中的一种，它是一个由油、水、表面活性剂和助表面活性剂四部分组成、粒径为1～100nm、液滴多为球形，大小均匀，透明或半透明、具有热力学稳定性和各向同性、热压灭菌或高速离心稳定不分层、制备的条件温和、配方合适就可自发形成的胶体分散系统。它有许多制剂无可比拟的优点：能通过内核的油相和表面活性剂的烃链的增溶，极大地提高难溶性药物在水中的溶解性；减少药物在体内的酶解；为各向同性的透明液体，热力学稳定系统，经热压灭菌或高速离心不分层；工艺简单，制备过程不需特殊设备，可自发形成；黏度低，可减少注射时的疼痛；具一定缓释和靶向作用；又因其粒径小、粘度低，药物在该体系中分散性好，利于机体迅速吸收，提高生物利用度，降低毒副作用等优点。因此，利用纳米技术成功制备藤黄酸纳米乳，有效的解决藤黄酸的难溶问题，同时对其稳定性质量，以及体内外抗急性髓系白血病的增效减毒作用进行研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种藤黄酸纳米乳制剂，本发明的目的之二在于提供藤黄酸纳米乳制剂的制备方法；本发明的目的之三在于提供述藤黄酸纳米乳制剂在制备治疗白血病的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、藤黄酸纳米乳制剂，所述藤黄酸纳米乳制剂按质量比包括如下组分：

所述藤黄酸纳米乳制剂按质量比包括如下组分：

优选的，所述表面活性剂为EL-35、吐温-80或RH40；所述助表面活性剂为丙二醇、甘油或司盘80；所述油相为GTCC、角鲨烯、肉豆蔻酸异丙酯。

更优选的，所述表面活性剂为吐温80；所述助表面活性剂为甘油；所述油相角鲨烯。

更优选的，所述藤黄酸纳米乳制剂按质量比包括如下组分：藤黄酸0.2％，角鲨烯3％，吐温80 9.6％，甘油2.4％，蒸馏水84％。

更优选的，所述纳米乳制剂粒度为1～100nm，电位为-30～30mV。

1、所述藤黄酸纳米乳制剂的制备方法，具体方法如下：将表面活性剂与助表面活性剂混合制成混合表面活性剂，然后向混合表面活性剂中加入藤黄酸、油相混合均匀，再用恒温磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加蒸馏水，直至形成外观澄清透明的纳米乳。

2、所述藤黄酸纳米乳制剂在制备治疗白血病的药物中的应用。

优选的，所述白血病为急性髓系白血病。

本发明的有益效果在于：本发明提供了藤黄酸纳米乳制剂，具有明显的增溶作用，提高溶解度4000倍，且质量稳定，符合纳米乳质量要求的纳米乳制剂；体内急性毒性和体外细胞毒性表明，藤黄酸纳米乳具有明显减毒作用；藤黄酸纳米乳对白血病细胞体外细胞模型HL-60、 Jurkat、MV-4-11有较强的抑制作用，且具有显著增效作用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为空白纳米乳、2mg/ml藤黄酸纳米乳及其水溶液外观比较。

图2为藤黄酸纳米乳(GANE)形态学(×100K)。

图3为藤黄酸纳米乳(GANE)粒度分布。

图4为藤黄酸纳米乳(GANE)电位分布。

图5为藤黄酸纳米乳长期稳定性结果(a：粒度；b：分散指数；c：电位；d：电导；e：电泳迁移率；f：pH)。

图6为藤黄酸纳米乳细胞毒性的形态学变化(a：藤黄酸水溶液对皮肤成纤维细胞具有抑制生长的能力；b：藤黄酸纳米乳作用L929细胞24h后细胞结果)。

图7为藤黄酸纳米乳及水溶液的存活率结果。

图8藤黄酸纳米乳及其水溶液组织病理学HE改变(×100)(图a为藤黄酸纳米乳的心脏切片；图b为藤黄酸水溶液的心脏切片；图c为藤黄酸纳米乳的肝脏切片；图d为藤黄酸水溶液的肝脏切片；图e为藤黄酸纳米乳的脾脏切片；图f为藤黄酸水溶液的脾脏切片；图g为藤黄酸纳米乳的肺脏切片；图h为藤黄酸水溶液的肺脏切片；图i为藤黄酸纳米乳肾脏切片；图j为藤黄酸水溶液肾脏切片)。

图9为藤黄酸纳米乳的腹腔注射的生存曲线图。

图10为藤黄酸纳米乳对HL-60细胞系的增效作用。

图11为藤黄酸纳米乳对Junket细胞系的增效作用。

图12藤黄酸纳米乳对MV-4-11细胞系的增效作用。

图13藤黄酸纳米乳体外释放作用(a：悬浮液的释放率；b：藤黄酸纳米乳释放率)。

图14藤黄酸纳米乳体内药动学曲线。

图15藤黄酸纳米乳对MV-4-11小鼠的体内增效作用。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明实施例中所用的实验细胞株、细胞培养条件如下：

细胞株：人白血病细胞HL-60、Jurkat、MV-4-11来自于本室；L929来源于第三军医大学生物医学测试中心。

其中HL-60、Jurkat、MV-4-11均是用IMDM高糖培养基培养，L929是DMEM高糖培养基培养。所有细胞被冻存(90％胎牛血清+10％DMSO)-196℃液氮罐中。配成含青霉素10 000IU/mL、链霉素10mg/mL的溶液，-20℃保存，用时每100mL培养液加1mL使终浓度为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL。

实验动物，饲养环境：实验动物：昆明种，洁净，雌雄各半，18～22g，购自第三军医大学实验动物中心。饲养于第三军医大学实验动物中心普通级动物房，温度19℃～22℃，相对湿度40％～70％。实验前禁食12h，不禁水。

实施例1、藤黄酸纳米乳制剂

处方1:藤黄酸0.05g、丙二醇4.8g、吐温-80 19.6g、IPM 6g、蒸馏水69.55g。

制备方法：将表面活性剂与助表面活性剂混合制成混合表面活性剂，然后向混合表面活性剂中加入藤黄酸和油相混合均匀，再用恒温磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加蒸馏水，直至形成外观澄清透明的纳米乳。

处方2：藤黄酸0.05g、丙二醇9g、吐温-80 27g、IPM 9g、蒸馏水54.94g。制备方法同处方1。

处方3：藤黄酸0.5g、吐温-80 27g、司盘-80 9g、角鲨烯9g、蒸馏水54.5g。制备方法同处方1。

处方4：藤黄酸1.0g、甘油3g、EL-35 27g、GTCC 9g、蒸馏水60g。制备方法同处方1。

处方5：藤黄酸0.4g、甘油9g、RH-40 27g、角鲨烯9g、蒸馏水54.6g。制备方法同处方1。

处方6藤黄酸0.1g、丙二醇0.2g、吐温-80 10g、RH40 5g、IPM 0.1g、蒸馏水84.6g。制备方法处方1。

处方7藤黄酸0.02g、EL-35 1g、司盘-80 0.2g、角鲨烯0.1g、蒸馏水98.68g。制备方法同处方1。

处方8藤黄酸0.1g、丙二醇2g、吐温-80 15g、IPM 6g、蒸馏水76.9g。制备方法同处方1。

处方9藤黄酸0.2g、甘油0.2g、EL35 1g、GTCC 2g、蒸馏水96.6g。制备方法同处方1。

处方10藤黄酸0.2g、EL-40 10g、甘油1g、GTCC 0.1g、蒸馏水87.8g。制备方法同处方1。

处方11藤黄酸1g、EL-35 15g、RH-40 10g、司盘-85 9g、IPM 5g、蒸馏水60g。制备方法同处方1。

处方12藤黄酸0.5g、EL-35 20g、斯潘80 0.2g，IPM 9g、蒸馏水70.3g。制备方法同处方1。

处方13藤黄酸0.8g、甘油5g、RH-40 27g、司盘-85 0.2g、GTCC 9g、蒸馏水58g。制备方法同处方1。

处方14藤黄酸1.0g、甘油5g、RH-40 27g、司盘-80 5g、角鲨烯9g、蒸馏水38.9g。制备方法同处方1。

处方15藤黄酸1.0g、吐温80 1g、EL35 20g、司盘-80 2g、GTCC 1g、蒸馏水75g。制备方法处方1。

处方16藤黄酸0.5g、RH-40 1g、吐温80 15g、甘油8g、角鲨烯5g、蒸馏水70.5g。制备方法同处方1。

处方17藤黄酸0.5g、吐温80 15g、丙二醇1g、司盘80 1g、GTCC 4g、蒸馏水81g。制备方法同处方1。

处方18藤黄酸0.3g、EL-35 10g、RH-40 10g、甘油1g、GTCC 0.1g、蒸馏水78.6g。制备方法同处方1。

处方19藤黄酸0.2g、吐温-80 10g、丙二醇1g、司盘85 1g、角鲨烯2g、蒸馏水85.8g。制备方法同处方1。

处方20藤黄酸0.3g、吐温-80 15g、EL35 10g、丙二醇1g、GTCC 3g、蒸馏水69.7g。制备方法同处方1。

实施例2、藤黄酸纳米乳制剂的处方筛选

(1)纳米乳处方的筛选

a.油相的选择：

待选油相GTCC、角鲨烯、肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、石蜡油、花生油，选择对藤黄酸溶解度相对较高的作为油相，然后分别溶解藤黄酸。试验结果表明，室温条件下，藤黄酸在角鲨烯、GTCC、肉豆蔻酸异丙酯的溶解度均较好，油相角鲨烯最好，因此选择角鲨烯、GTCC、肉豆蔻酸异丙酯为油相。

b.表面活性剂的筛选

本试验待选表面活性剂有EL-35、吐温-80、RH40、吐温60、吐温20。将这5种表面活性剂与筛选出的油相，在室温下分别按质量比9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2： 8和：9混合。混匀后，边搅拌边滴加蒸馏水。随着滴加过程的进行，观察体系澄清度，并准确记录用水量，用伪三元相图法，选定表面活性剂。试验结果表明，室温条件下，藤黄酸在吐温80、EL-35、RH40中的溶解度均比在其他待选的溶解度高，吐温80最高，故选择吐温 80、EL-35、RH40为纳米乳的表面活性剂。

c.助表面活性剂的筛选

本试验选取短链醇类作为助表面活性剂。丙二醇、甘油、司盘80、司盘85、乙醇和正丁醇等6种为待选助表面活性剂，分别测试在6种助表面活性剂在其中的溶解度，选择对藤黄酸溶解度相对较高的作为助表面活性剂。上述短链醇在一定配比范围内均可与筛选的表面活性剂形成澄清透明的纳米乳，但藤黄酸在甘油、丙二醇、司盘85、司盘80中溶解性都相对较好，甘油最好。故本试验选择甘油、丙二醇、司盘80、司盘85作为制备藤黄酸纳米乳的助表面活性剂。

(2)纳米乳的制备

在前期溶解度工作基础上，以筛选出的三种表面活性剂、四种为助表面活性剂，三种油相。按表面活性剂与助表面活性剂的质量比(Km值)为2：1、3：1、4：1、5：1混合均匀制成混合表面活性剂。再将表面活性剂、藤黄酸、油相，按质量比9：1、8：2、7：3、6：4、 5：5、4：6、3：7、2：8、1：9精密称取定量的混合表面活性剂和油，置于平底玻璃烧杯中混合均匀，在室温条件下，用恒温磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加蒸馏水，直至形成外观澄清透明的纳米乳。根据绘制的伪三元相图确定纳米乳形成的处方。

根据形成纳米乳伪三元相图，确定出形成纳米乳的如下处方：

(1)藤黄酸0.2％，角鲨烯3％，吐温80为9.6％，甘油2.4％，蒸馏水84％；

(2)藤黄酸0.5％、丙二醇4.8％g、吐温-80 19.6％、IPM 6％、蒸馏水69.55％；

(3)藤黄酸0.5％、吐温-80 27％、司盘-80 9％、角鲨烯9％、蒸馏水54.5％；

(4)藤黄酸1.0％、甘油3g、EL-35 27％、GTCC 9％、蒸馏水60％。

(5)藤黄酸0.1％、丙二醇0.2％、吐温-80 10％、RH40 5％、IPM 0.1％、蒸馏水84.6％。

(6)藤黄酸0.02％、EL-35 1％、司盘-80 0.2％、角鲨烯0.1％、蒸馏水98.68％。

(7)藤黄酸0.2％、甘油0.2％、EL35 1％、GTCC 2％、蒸馏水96.6％。

(8)藤黄酸1％、EL-35 15％、RH-40 10％、司盘-85 9％、IPM 5％、蒸馏水60％。

(9)藤黄酸0.5％、EL-35 20％、司盘80 0.2％，IPM 9％、蒸馏水70.3％。

(10)藤黄酸0.8％、甘油5％、RH-40 27％、司盘-85 0.2％、GTCC 9％、蒸馏水58％。

(11)藤黄酸1.0％、甘油5％、RH-40 27％、司盘-80 5％、角鲨烯9％、蒸馏水38.9％。

(12)藤黄酸1.0％、吐温80 1％、EL35 20％、司盘-80 2％、GTCC 1％、蒸馏水75％。

(13)藤黄酸0.5％、RH-40 1％、吐温80 15％、甘油8％、角鲨烯5％、蒸馏水70.5％。

(14)藤黄酸0.5％、吐温80 15％、丙二醇1％、司盘80 1％、GTCC 4％、蒸馏水81％。

(15)藤黄酸0.3％、EL-35 10％、RH-40 10％、甘油1％、GTCC 0.1％、蒸馏水78.6％。

(16)藤黄酸0.2％、吐温-80 10％、丙二醇1％、司盘85 1％、角鲨烯2％、蒸馏水85.8％。

(17)藤黄酸0.3％、吐温-80 15％、EL35 10％、丙二醇1％、GTCC 3％、蒸馏水69.7％。

上述处方均能形成为黄色、澄清、透明的纳米乳均一液体。根据该配方制备的空白纳米乳(BNE)、2mg/mL的藤黄酸纳米乳(GANE)以及相同浓度藤黄酸水溶液(GA)外观，见图1。

从图1可以看出，空白纳米乳为无色澄清透明的纳米乳，2mg/mL的藤黄酸纳米乳为黄色澄清透明的纳米乳，有蓝色乳光；高速离心(13 000rpm/m，30min)离心后，稳定不分层；纳米乳均伴随丁达尔现象发生。而藤黄酸水溶液呈明显的黄色混悬液，乳滴在1～100nm之间。该结果充分证实，利用纳米乳制剂，可以解决难溶性藤黄酸的溶解度问题，可以极大提高其溶解度4000倍。

(3)藤黄酸纳米乳制剂的形态学和基本特征检测

A、纳米乳的形态学观察

取少量含药纳米乳适量，用水稀释1倍后，滴在覆有支持膜的铜网上，静止10min后用滤纸片吸干，再滴加2％磷钨酸(pH为7.4)溶液于铜网上复染3min，自然挥干，用透射电子显微镜观察并摄制照片，结果如图2所示。结果表明，可以看出藤黄酸纳米在电镜下均呈圆球形，内部为油相，从电镜下随机选取不少于500个液滴测量粒径，得纳米乳液滴粒径范围在1～ 100nm，平均粒径大约为20.0nm。

B、纳米乳的粒径及电位检测

取纳米乳适量，用蒸馏水稀释100倍后用激光粒度测定仪在633nm条件下通过动态光散射检测其粒径及zeta电位分布。测定时，以聚苯乙烯球形小珠(220±6nm)作为外标，光散射测定角度为90°。在样品池中加入藤黄酸纳米乳至3/4处(用水稀释至计数速率在50～200Kcps范围内)，将样品池插入样品槽中，盖上激光粒度分布测定仪的仓盖，依软件包程序进行测定，自动记录粒径分组数据。根据粒径与数目，绘制其分布图。纳米乳的平均粒径＝检测的纳米乳总粒径/纳米乳粒子总数目，结果如图3所示。图3结果表明，实验制备的藤黄酸纳米乳粒径为17.20±0.11nm。小于21.0nm的粒子占70％；小于28.2nm的粒子占95％，可见制得的纳米乳的粒径分布范围窄，粒径比较均匀，所有的纳米乳颗粒粒度均处于1～100nm，充分证明已经成功制备纳米乳。其藤黄纳米乳的分散指数(PDI)为0.152±0.009，其分散指数小于0.3，表明制备的藤黄酸纳米乳分布狭窄。

利用粒度分析检测到藤黄酸纳米乳的粒度分布见图4。结果表明，实验制备的藤黄酸纳米乳电位4.17±0.83mV，其电位位于-30-30mV之间，其结果证明，藤黄酸纳米乳属于稳定体系范围。

C、藤黄酸纳米乳新制剂的稳定性考察

藤黄酸纳米乳制剂高速稳定性检测：将藤黄酸纳米乳和空白纳米乳适量分别于13,000rpm/min，离心30min，肉眼观察其外观变化(有无药物析出、沉淀、絮凝、分层、破乳等现象)，初步判断纳米乳的稳定情况。高速离心后(13,000rpm/min，30min)离心后，纳米乳外观未发生明显药物析出、沉淀、絮凝、分层等现象。结果表明，制备的GA NE质量非常稳定。

长期留样稳定性检测：取空白及纳米乳3批，每批3份在温度40±2℃，相对湿度75±5％的条件下放置12个月，0、3、6、9、12月取样1次，对其pH、粒径及含量、外观变化等进行检测。结果显示，纳米乳在上述所有时间内，在高速离心前后的外观都未发生明显的改变，也无产生发生明显的絮凝、分层和药物析出现象。用粒度分析仪测定其粒度、分散指数、电位、电导率、电泳迁移率、pH测得结果见图5。结果表明，其粒度、分散指数、电位、电导、电泳迁移率、pH都没有发生明显改变。上述结果充分证实，制备藤黄酸纳米乳质量非常稳定。

实施例3、藤黄酸纳米乳的体外L929细胞毒性评价

A、细胞的复苏

1)将细胞从液氮罐中快速取出，立即放入37℃恒温水浴锅中剧烈摇动，使细胞快速解冻；

2)用消毒酒精擦拭冻存管壁，放置于超净工作台中。拧开冻存管盖，用移液器将管内的细胞冻存液转移至一新的离心管中，再向离心管中加入4mL新鲜培养液，1000rpm，离心5分钟；

3)小心弃去上清，加入5mL含有10％FBS的完全培养基，将细胞轻轻吹匀后转移至细胞培养瓶中；

4)小幅度摇动培养瓶使培养液均匀铺满培养瓶底面，拧松瓶盖，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

B、细胞传代培养：

1)倒置显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80％以上时，即可进行细胞传代。

2)吸去培养瓶内的培养液，加入5mL无菌PBS溶液，清洗细胞2次；

3)加入1mL 0.25％的胰酶消化细胞，37℃消化至细胞皱缩，细胞间隙变大，有少量细胞脱落时，立即加入5mL含有10％FBS的DMEM培养液终止消化反应，用移液管轻轻吹打贴壁细胞，将吹下的细胞悬液全部转移至离心管中，1000rpm，离心5分钟；

4)小心弃去上清，加入10mL完全培养基，轻轻吹匀制成单细胞悬液，均分至新的培养瓶中，放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

C、细胞毒性的检测

细胞毒性试验采用参照中国国家标准GB/T1688615-1997“医疗器械生物学评价第五部分：细胞毒性试验体外法”进行的MTT比色法。取对数生长期的L929细胞，加胰蛋白酶消化5min 后，加含有FBS的培养基终止消化，离心，小心弃去上清，用培养液重悬，自动细胞计数仪计数后，以1×10⁵个/孔的密度接种于96孔板中，每孔接种90μL。将已接种细胞的96孔板设置空白组、对照组和药物组，每组设3个复孔。把96孔板置37℃、5％CO₂的培养箱中培养过夜。药物组各孔分别加入10μL用培养基稀释至0.5μM、1.0μM、2.0μM、4.0μM、8.0μM 浓度的藤黄酸水溶液和纳米乳溶液。细胞对照组和空白组加入等体积的培养液。置37℃、5％ CO2的培养箱中分别继续培养24h和48h。在终止培养前4h使用多通道移液器每孔加入10 μL已配制的MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。取出培养板，离心后小心吸弃各孔内培养液，终止培养。每孔加入70μL的DMSO溶解结晶，微量振荡器振荡10分钟，用酶联免疫检测仪测定490nm处各孔的光密度值(OD)。根据测定的吸光度值计算其相对的增殖度(RGR)。RGR(％)＝试样组吸光度值/空白对照组吸光度值×100％。

毒性评价标准：根据细胞相对增殖度，将纳米乳的毒性反应分级：0级：RGR≥100；1级： 75≤RGR<100；2级：50≤RGR<75；3级：25≤RGR<50；4级：1<RGR<25；5级：RGR＝0。结果为0或1级反应，为合格；结果为2级反应，应结合细胞形态分析综合评价；结果为3～5级反应，为不合格。

藤黄酸纳米乳及水溶液作用L929细胞24h后，对细胞的形态学变化见图6。图6中a为藤黄酸水溶液对皮肤成纤维细胞具有抑制生长的能力，对皮肤成纤维细胞有一定明显毒性，细胞发生圆缩、死亡。图6中b为藤黄酸纳米乳作用L929细胞24h后细胞结果，可以看出，在相同浓度的藤黄酸纳米乳作用，细胞形态正常、无变形，并可见大量分裂细胞，细胞核未见异形，细胞数目增多，说明细胞增殖旺盛，不具有明显细胞毒性。细胞毒性的形态学充分证实了制备出藤黄酸纳米乳细胞毒性明显低于藤黄酸水溶液。

藤黄酸纳米乳及水溶液作用L929细胞24h和48h后，细胞存活率结果见图7。结果显示，从100μg/mL的藤黄酸倍比稀释至0.391μg/mL的藤黄酸及其水溶液对细胞存活率上升，呈明显的剂量依赖效益。从图7可以看出，当浓度为6.25μg/mL的时候，藤黄酸纳米乳和其水溶液作用L929细胞24h和48h小时后，两者生存率存在极其显著性差异(P＝0.0002,P<0.001； P＝0.0001,P<0.001)。可当细胞存活率超过90％的时看出无明显的细胞毒性，发现藤黄酸纳米乳作用24h的浓度为6.25μg/mL，而藤黄酸水溶液为0.782μg/mL。藤黄酸制备出纳米乳相比其水溶液毒性减低了8倍。当细胞作用48h，细胞的存活率为90％时，我们发现藤黄酸纳米乳作用48h的浓度为6.25μg/mL，而藤黄酸水溶液为0.391μg/mL。藤黄酸制备出纳米乳相比其水溶液毒性减低了16倍。上述细胞形态学和存活率结果充分证实藤黄酸纳米乳明显减毒了藤黄酸的细胞毒性，具有显著减毒作用。

D、藤黄酸纳米乳的体内毒性评价

实验动物分组及处理：昆明种小鼠70只，雌性，体重18-22克，随机分成7组，分别按0.8g/只，0.6g/只，0.4g/只三种剂量分别腹腔注射GA，GANE，BNE于给药后连续观察2h，随后每天早晚各观察一次，连续观察三天，记录各组死亡情况和死亡小鼠体重。

动物行为学变化：用《用啮齿类动物急性中毒症状观察项目表》附录1的项目观察。结果显示，小鼠在藤黄酸纳米乳及其水溶液腹腔给药都后立即开始兴奋、呼吸加速、抓口鼻、被毛竖立、呼吸急促、轻微痉挛、仰头、伸颈、侧卧，然后精神萎靡、眼睛紧闭、身体蜷缩呈现昏迷状态。组织病理学(HE染色)结果见图8，图8中a为藤黄酸纳米乳的心脏切片；图 8中b为藤黄酸水溶液的心脏切片；图8中c为藤黄酸纳米乳的肝脏切片；图8中d为藤黄酸水溶液的肝脏切片；图8中e为藤黄酸纳米乳的脾脏切片；图8中f为藤黄酸水溶液的脾脏切片；图8中g为藤黄酸纳米乳的肺脏切片；图8中h为藤黄酸水溶液的肺脏切片；图8中i为藤黄酸纳米乳的肾脏切片；图8中j为藤黄酸水溶液的肾脏切片。从图可以看出，藤黄酸的毒性器官主要为：肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏。藤黄酸纳米乳在肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏比其水溶液均具有较少的中性粒细胞浸润等炎症反应，具有较轻的病理改变。上述病理切片充分证实，藤黄酸具有明显的减毒作用，且作用毒性靶器官没有发生明显改变。同时上述证实，藤黄酸纳米乳及其水溶液主要通过肝脏和肾脏的排泄，从而对其组织的病理学改变尤其明显。藤黄酸纳米乳及其水溶液对心脏和脾脏的毒性较小。

生存率的计算及生存曲线的绘制(图9)：统计死亡结果，并对其死亡鼠进行病理剖解，统计死亡数目。小鼠最大耐受倍数＝每只小鼠平均给药量/小鼠平均体重。根据Bliss法、SAS6.0 软件，自行编制程序，计算出其的LD₅₀。

藤黄酸纳米乳及其水溶液对昆明中小鼠腹腔注射后，其死亡的结果见表1。

表1、藤黄酸纳米乳的腹腔注射急性毒性结果

对上表的毒性结果进行处理可得：藤黄酸纳米乳及其水溶液的半数致死量LD50分别为： 23.25mg/kg，95％的可信限为21.7～25.16mg/kg；18.59mg/kg，95％的可信限为16.84～20.53 mg/kg。上述研究结果，得出藤黄酸纳米乳其水溶液的1.26倍，证实了制备的藤黄酸纳米乳具有明显的减毒作用。

E、藤黄酸纳米乳对三种急性髓系白血病细胞系体外增效作用评价

HL-60、Jurkat、MV-4-11细胞的复苏：查找细胞冻存记录，找出HL-60、Jurkat、MV-4-11 细胞所对应的位置；将细胞从液氮罐中快速取出，立即放入37℃恒温水浴锅中剧烈摇动，使细胞快速解冻；用消毒酒精擦拭冻存管壁，放置于超净工作台中。拧开冻存管盖，用移液器将管内的细胞冻存液转移至一新的离心管中，再向离心管中加入4mL新鲜培养液，1000rpm，离心5分钟；小心弃去上清，加入5mL含有10％FBS的完全培养基，将细胞轻轻吹匀后转移至细胞培养瓶中；小幅度摇动培养瓶使培养液均匀铺满培养瓶底面，拧松瓶盖，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

细胞传代培养：倒置显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80％以上时，即可进行细胞传代。将培养基转移至离心管中，1000rpm，离心5min；小心弃去上清，加入10ml完全培养基，轻轻吹匀制成单细胞悬液，均分至新的培养瓶中，放入37℃、5％CO₂的培养箱培养。

细胞存活率的检测：取对数生长期的HL-60、Jurkat、MV-4-11细胞，加培养液混悬，自动细胞计数仪计数后，以1×10⁵个/孔的密度接种于96孔板中，每孔接种90μL。将已接种细胞的96孔板设置空白组、对照组和药物组，每组设3个复孔。把96孔板置37℃、5％CO₂的培养箱中培养过夜。药物组各孔分别加入10μL用培养基稀释至0.5μM、1.0μM、2.0μM、 4.0μM、8.0μM浓度的藤黄酸水溶液和纳米乳溶液。细胞对照组和空白组加入等体积的培养液。置37℃、5％CO₂的培养箱中分别继续培养24h和48h。在终止培养前4h使用多通道移液器每孔加入10μL已配制的MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。取出培养板，离心后小心吸弃各孔内培养液，终止培养。每孔加入70μl的DMSO溶解结晶，微量振荡器振荡10分钟，用酶联免疫检测仪测定490nm处各孔的光密度值(OD)。

统计分析：本文中所有数据均用统计学软件SPSS13.0分析，采用非配对T检验分析数据的统计学差异。所有图示均使用GraphPad Prism 5软件制作。P<0.05代表有统计学差异，用 *表示；P<0.01代表有显著统计学差异，用**表示；P<0.001代表有极显著统计学差异，用 ***表示。

1)藤黄酸纳米乳对HL-60细胞系的增效作用

藤黄酸纳米乳作用与HL-60细胞24h后，用MTT测定其吸光度，计算出死亡率。计算公式如下：细胞增死亡率(％)＝(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值×100％。根据不同浓度的藤黄酸纳米乳及其水溶液的死亡率结果，绘制成柱形图，见图10。从图10可以看出，终浓度为80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL的藤黄酸纳米乳对HL-60的抑制作用明显强于比其相同浓度的水溶液。而相同浓度阿胞糖苷和藤黄酸水溶对HL-60的抑制作用的差异不明显。从图10中还可以看出，当浓度为40μg/mL时，藤黄酸纳米乳对HL-60的抑制作用(死亡率)明显高于相同浓度藤黄酸水溶液和阿胞糖苷(P＝0.0003，P<0.0001和 P＝0.0072，P<0.001)。当浓度为40μg/mL时，藤黄酸纳米乳对HL-60的抑制作用(死亡率) 明显高于相同浓度藤黄酸水溶液(P＝0.0055,P<0.01)。上述结果充分证实，藤黄酸纳米乳能够有效增强抑制HL-60细胞的存活,与目前医院大规模临床使用的化学药物阿胞糖苷相比，相同浓度的藤黄酸纳米乳及其水溶液均显示出较好的抑制作用。

2)藤黄酸纳米乳对Junket细胞系的增效作用

藤黄酸纳米乳作用与Junket细胞24h后，用MTT测定其吸光度，计算出死亡率。计算公式如下：细胞增死亡率(％)＝(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值×100％。根据不同浓度的藤黄酸纳米乳及其水溶液的死亡率结果，绘制成柱形图，见图11。从图11可以看出，终浓度为80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL的藤黄酸纳米乳对Junket细胞系的抑制作用明显强于比其相同浓度的水溶液。从图11中还可以看出，当浓度为40μg/mL时，藤黄酸纳米乳对Junket的抑制作用(死亡率)明显高于相同浓度藤黄酸水溶液和阿胞糖苷 (P＝0.0009,P<0.0001和P＝0.0001,P<0.001)。当浓度为40μg/mL时，阿胞糖苷对Junket细胞系的抑制作用(死亡率)高于相同浓度藤黄酸水溶液(P＝0.0395,P<0.05)。上述结果充分证实，藤黄酸纳米乳能够有效增强抑制Junket细胞的存活，与目前医院大规模临床使用的化学药物阿胞糖苷相比，相同浓度的藤黄酸纳米乳显示出较好的抑制作用。

3)藤黄酸纳米乳对MV-4-11细胞系的增效作用

藤黄酸纳米乳作用与MV-4-11细胞24h后，用MTT测定其吸光度，计算出死亡率。计算公式如下：细胞增死亡率(％)＝(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值×100％。根据不同浓度的藤黄酸纳米乳及其水溶液的死亡率结果，绘制成柱形图，见图12。从图12可以看出，终浓度为80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL的藤黄酸纳米乳对MV-4-11 细胞系的抑制作用明显强于比其相同浓度的水溶液。从图12中还可以看出，当浓度为40μg/mL时，藤黄酸纳米乳对HL-60的抑制作用(死亡率)明显高于相同浓度藤黄酸水溶液和阿胞糖苷(P＝0.0024,P<0.001和P＝0.0001,P<0.001)。当浓度为40μg/ml时，阿胞糖苷对MV-4-11细胞系的抑制作用(死亡率)低于相同浓度藤黄酸水溶液(P＝0.0016，P<0.01)。

上述结果充分证实，藤黄酸纳米乳能够有效增强抑制MV-4-11细胞的存活，与目前医院大规模临床使用的化学药物阿胞糖苷(100μg/ml)相比，相同浓度的藤黄酸纳米乳和其水溶液均显示出较好的抑制作用。

上述图10至图12，藤黄酸纳米乳对三种急性髓系白血病细胞系抑制作用结果证实，藤黄酸纳米乳能显著抑制三种急性髓系白血病细胞系的存活，显著提高藤黄酸水溶液增效作用。

F、藤黄酸纳米乳在体外的缓释作用评价

藤黄酸混悬液及其和纳米乳(2mg/mL)的2mL样品分别加入透析袋(SP132574，MWCO10,000g/mol，上海生工生物技术有限公司)。将样品浸入200mL不同的PBS释放介质(pH2,5.8, 7.4)中并以100rpm混合。纳米乳在释放0，0.16，0.33，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，10，12，24，48，72，96和120小时后，HPLC检测其介质中藤黄酸浓度。

藤黄酸纳米乳及其悬浮液的释放研究在不同pH值的PBS(pH＝2,5.8和7.4)结果，如图 13中a和图13中b所示，在1小时，6小时和4小时内运输约90％的藤黄酸，而在48小时，72小时和72小时结束时90％的药物从藤黄酸纳米乳剂释放。另外，与不同pH值的PBS的悬浮液相比， GA NE的几乎完全释放(90％释放速率)时间延迟了48倍，12倍和18倍。

G、藤黄酸纳米乳在家兔体内的药动学

雄性新西兰家兔6只，禁食12h后随机分成2组(给药剂量为3mg/kg)，称体质量标记后计算给药体积，以耳静脉方式给药。分别于给药后0，0.16，0.33，0.50，0.75，1.0，2.0，4.0，6.0和8.0小时，对侧耳静脉采血0.5ml，滴加到肝素处HPLC检测其药物浓度。

图14和表2的显示，藤黄酸纳米乳在家兔体内的药动学结果。

表2藤黄酸纳米乳的药代动力学参数

图注：a,***P<0.001，表示差异极其显著；b,**P<0.01表示差异极显著；c,*P<0.05表示差异显著。

从图14和表2可看出，藤黄酸纳米乳液的AUC(1037.28±40.18)比其悬浮液(342.81±14.12)高3.18倍，表明纳米乳液的相对生物利用度与悬浮液制剂相比为318％。藤黄酸纳米乳的Cmax(269.54±3.21μg/L)比悬浮液(135.1±2.98μg/L)高1.99倍，藤黄酸纳米乳(5.181±0.139h)的MRT(0～∞)也显着延长(1.52倍)与水溶液(3.419±0.161h)相比。结果表明纳米乳可以促进GA的吸收并维持其释放。

H、藤黄酸纳米乳对白血病细胞系MV4-11体内增效作用评价

通过参考描述的方法(Wang等人，2018)描述了MV4-11异种移植小鼠模型。简而言之，将来自MV4-11移植的NSG小鼠的脾细胞(5×10 ⁶个/小鼠)通过尾静脉静脉注射到NSG小鼠中。肿瘤接种1周后，将小鼠随机分为5组(n＝10)，并在尾静脉注射3mg/kg悬浮液和 GA水溶液和纳米乳、Ara-C(阿糖胞苷)。对照PBS和空白纳米乳(BNE)每天施用持续 14天。在观察的98天期间，记录小鼠的存活时间和数量。

结果存活曲线见图15显示，在98天的实验期内用纳米乳剂和GA混悬液处理的小鼠(图 15)。与PBS和BNE组(0％和0％存活率)相比，用纳米乳剂和GA，Ara-C混悬液处理的小鼠显示出更高的存活率(分别在98天90％，50％和30％)。该数据表明纳米乳剂治疗显着提高MV4-11小鼠的存活率。因此，这种新型纳米乳剂可以显着提高小鼠存活率。这些结果表明，装载有水溶性差的藤黄酸的新型纳米乳剂在体外和体内抑制急性骨髓性白血病细胞增殖，提高了溶解度水和增强抗急性骨髓性白血病细胞对MV4-11的作用。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种藤黄酸纳米乳制剂，其特征在于：所述藤黄酸纳米乳制剂按质量比由如下组分组成：

表面活性剂 1~27%；

助表面活性剂 0.2~9%；

油相 0.1~9%；

藤黄酸 0.02~1%；

余量为蒸馏水；

所述表面活性剂为EL-35、吐温-80或RH40；所述助表面活性剂为丙二醇、甘油、司盘85或司盘80；所述油相为GTCC、角鲨烯、肉豆蔻酸异丙酯。

2.根据权利要求1所述藤黄酸纳米乳制剂，其特征在于：所述藤黄酸纳米乳制剂按质量比由如下组分组成：

表面活性剂 9.6~25%；

助表面活性剂 1~9%；

油相 3~6%；

藤黄酸 0.2~1%；

余量为蒸馏水。

3.根据权利要求1所述藤黄酸纳米乳制剂，其特征在于：所述表面活性剂为吐温80；所述助表面活性剂为甘油；所述油相角鲨烯。

4.根据权利要求1~3任一项所述藤黄酸纳米乳制剂，其特征在于：所述纳米乳粒度在1~100nm，电位为-30~30mV范围内，分散指数小于0.3的藤黄酸纳米乳。

5.权利要求1~4任一项所述藤黄酸纳米乳制剂的制备方法，其特征在于：具体方法如下：将表面活性剂与助表面活性剂混合制成混合表面活性剂，然后向混合表面活性剂中加入藤黄酸和油相混合均匀，再用恒温磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加蒸馏水，直至形成外观澄清透明的纳米乳。

6.权利要求1~4任一项所述藤黄酸纳米乳制剂在制备治疗白血病的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述白血病为急性髓系白血病。

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