CN115025072B - 角鲨烯在制备治疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了所述的角鲨烯在治疗急性肾损伤药物中的应用。急性肾损伤为缺氧复氧产生的肾损伤或肾脏缺血再灌注诱导的急性肾损伤。通过在细胞体外模型上使用角鲨烯进行干预治疗，验证角鲨烯改善缺氧富氧对肾小管上皮细胞的损伤；在小鼠体内模型上使用角鲨烯进行干预治疗，利用生化指标、病理切片、多普勒和激光散斑多维度验证角鲨烯改善肾脏缺血再灌注诱导的急性肾损伤；表明角鲨烯可以抑制缺氧复氧产生的肾损伤，具有良好的防治缺氧诱导肾缺血再灌注的作用。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，涉及角鲨烯在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，具体涉及角鲨烯在制备治疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是肾移植、心脏术后、脓毒血症患者的一种常见且严重的并发症。
肾缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是急性肾损伤最常见的致病因素之一，常见于患者肾移植、心脏手术、创伤和休克等情况。例如，肾移植是目前治疗终末期肾脏病最为有效的手段。然而，肾移植的过程包括从供体切取肾脏、体外肾脏的保存以及供肾植入受者体内的血管重建及血液再灌注，不可避免地会出现供肾获取前在供者体内的热缺血损伤、冷保存过程中的冷缺血损伤、以及移植到受者体内血流恢复后的再灌注损害。
现阶段，能够用于临床肾移植中肾脏IRI保护的有效手段还极为欠缺，中药及天然植物中的活性成分具有广泛的药理学活性。角鲨烯作为烃类化合物，在有机化学中被划入萜类，是一种三萜。角鲨烯除了强力的组织供氧能力外，还具有清除自由基的效果，可以让人体免于自由基的攻击；在增强免疫系统机能及抑制肿瘤细胞生长方面也都有诸多正面的报告。目前，还未见其用于治疗肾缺血再灌注的报道。
发明内容
发明人通过在细胞体外模型上使用角鲨烯进行干预治疗，验证角鲨烯改善缺氧富氧对肾小管上皮细胞的损伤；在小鼠体内模型上使用角鲨烯进行干预治疗，利用生化指标、病理切片、多普勒和激光散斑多维度验证角鲨烯改善肾脏缺血再灌注诱导的急性肾损伤。表明角鲨烯可以抑制缺氧复氧产生的肾损伤，角鲨烯具有良好的防治缺氧诱导肾缺血再灌注的作用，能为临床上运用角鲨烯防治缺氧诱导肾缺血再灌注提供较好的实验依据。
本发明的目的是提供角鲨烯在治疗急性肾损伤药物中的应用。
优选的，角鲨烯在制备治疗缺氧复氧产生的肾损伤药物中的应用。
优选的，角鲨烯在制备治疗肾脏缺血再灌注诱导的急性肾损伤药物中的应用。
进一步优选的，角鲨烯在制备改善肾小管上皮细胞存活率药物的应用。
进一步优选的，角鲨烯在制备改善肾小管上皮细胞活性氧含量药物的应用。
进一步优选的，角鲨烯在制备改善急性肾损伤的生化指标血肌酐、尿素氮和白介素-1β药物的应用。
进一步优选的，角鲨烯在改善急性肾损伤的肾脏组织病理药物的应用。
进一步优选的，角鲨烯在改善急性肾损伤的血流速度药物的应用。
进一步优选的，角鲨烯在改善急性肾损伤的血流量药物的应用。
一种用于治疗急性肾损伤的药物，它是以角鲨烯为有效成分，与药学上可接受的辅料制成的任一药学上可接受的剂型。
所述的剂型为片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、冻干粉针或针剂中的任意一种剂型。
附图说明
图1为角鲨烯对HK-2细胞的细胞毒性结果。
图2为缺氧富氧模型在不同药物干预下的细胞活力图。
图3为缺氧富氧模型在不同药物干预下活性氧含量图。
图4为肾缺血再灌注损伤小鼠在不同药物干预下血清白细胞介素-1β水平。
图5为肾缺血再灌注损伤小鼠在不同药物干预下血清肌酐水平。
图6为肾缺血再灌注损伤小鼠在不同药物干预下血清尿素氮水平。
图7为肾缺血再灌注损伤小鼠在不同药物干预下组织切片图。
图8为肾缺血再灌注损伤小鼠在不同药物干预下激光散斑图。
图9为肾缺血再灌注损伤小鼠在不同药物干预下彩色多普勒超声图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不应视为对本发明保护范围的限制。
NAC指N-乙酰半胱氨酸。
实施例1
所用生物材料、药品和试验方法如下：
细胞株：人肾小管上皮细胞HK-2(HK-2，江苏凯基生物技术股份有限公司)。
以下培养基均为DMEM培养基：80U/m青霉素和0.08mg/mL链霉素(双抗)、10％的胎牛血清的DMEM培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)。
N-乙酰半胱氨酸购自上海阿拉丁股份有限公司，以DMEM溶解，配成合适的浓度，现用现配。
角鲨烯标准品购自上海源叶生物有限公司，以DMEM溶解，配成合适的浓度，现用现配。
1MTT检测角鲨烯对细胞活力的影响
1.1实验方法
HK-2细胞于含80U/m青霉素和0.08mg/mL链霉素(双抗)、10％的胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5％的CO2培养箱培养；将细胞用胰酶消化后，用血球计数板进行计数，用培养基调整细胞密度为1×105个/mL，接种于96孔板上，每孔加入细胞悬液100μL。于37℃、5％的CO2培养基中培养12h，小心移除孔内培养基，分别设置实验组、对照组和空白组，实验组：分别加入不同浓度梯度的角鲨烯药液(20、50、100、500、1000μM)，每孔180μL，每个药物浓度设置6个复孔，对照组：加入不含药液的培养基180μL，空白组：向不含细胞的孔内加培养基180μL，于37℃、5％的CO2培养基中培养24h，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液(用PBS配制，0.22μm滤膜过滤除菌)，继续在37℃恒温箱中孵育4h；小心移除孔内培养基上清液，每孔加入100μLDMSO，37℃震荡10min，使紫色结晶物充分溶解，采用酶标仪双波长法(570nm，630nm，双波长，前一个指测量波长，后一个指参考波长)，测定各孔的吸光度(OD值)，按以下公式计算细胞存活率。
ODt是实验组的吸光度；ODb是空白组的吸光度；ODc是对照组的吸光度。
1.2实验结果
如图1所示，角鲨烯对HK-2细胞没有细胞毒作用，与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。
2MTT检测角鲨烯改善缺氧-复氧模型对细胞增殖能力的影响
2.1实验方法
HK-2细胞密度为1×105个/mL，接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μL。于37℃、5％的CO2培养箱中培养12h，小心移除孔内培养基后，设置给药组、空白组、对照组和模型组，给药组：分别加入50μM NAC(对应图2中NAC组)和不同浓度梯度的角鲨烯药液(30、60、90μM，分别为LJ组、MJ组、HJ组)，每个药物浓度设置2个复孔，每孔0.9mL，培养24h；空白组：向不含细胞的孔内加培养基0.9mL，对照组和模型组：加不含药液培养基0.9mL，培养24h；模型组和给药组缺氧培养12h(20ml/L O2，930ml/L N2，50ml/LCO2)后复氧(5％O2和95％N2)培养6h，建立缺氧-复氧模型；空白组和对照组于37℃、5％的CO2培养箱中培养18h。所有组每孔加入12μL浓度为5mg/mL的MTT溶液(用PBS配制，0.22μm滤膜过滤除菌)，继续孵育4h；小心移除孔内培养基上清液，每孔加入100μLDMSO，37℃放置10min，使紫色结晶物甲瓒充分溶解，用酶标仪测定各孔的吸光度(OD值)，计算其细胞存活率。
ODt是给药组和模型组的吸光度；ODb是空白组的吸光度；ODc是对照组的吸光度。
2.2实验结果
如图2所示，与空白组比较，缺氧-复氧模型细胞的细胞活力明显降低(P<0.05)；角鲨烯预处理后的细胞活力明显提高(P<0.05)，并且随着角鲨烯剂量的增大，对缺氧诱导损伤的保护作用更加明显。
3 DCFH-DA染色法检测细胞氧化应激(活性氧含量)情况
3.1实验方法
将HK-2细胞接种于6孔板中，每孔5×104个/mL，每孔加入细胞悬液2mL。于37℃、5％的CO2培养箱中培养24h，分别加入50μM NAC和不同浓度梯度的角鲨烯药液(30、60、90μM，分别为LJ组、MJ组、HJ组)，每个药物浓度设置2个复孔，每孔0.9mL，培养24h。空白组和模型组：加不含药液培养基0.9mL，培养24h，模型组和给药组缺氧培养12h(20ml/L O2，930ml/L N2，50ml/L CO2)后复氧(5％O2和95％N2)培养6h，建立缺氧-复氧模型。空白组于37℃、5％的CO2培养箱中培养18h。所有组结束后吸弃上清，使用胰酶消化，2500rpm离心5min收集细胞，加入1×PBS重悬细胞再次离心，再次加入1×PBS重悬细胞再次离心。DCFH-DA染色液使用无血清培养基进行适当稀释，使其细胞密度为1.0×106～2.0×107个/mL，每组细胞加入1mL染色液，吹悬细胞，放置于恒温箱37℃孵育20min。染色结束后，2500rpm离心5min，使用1×PBS重悬细胞再次离心，离心结束后1×PBS重悬细胞，使用荧光酶标仪检测(Ex/Em＝488/525nm)。绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，以空白组荧光信号强度作为对照，设置为基准1，分析实验各组活性氧水平。
3.2实验结果
如图3所示，空白组与缺氧复氧模型组比较，具有统计学意义(P<0.05)，表明缺氧复氧模型会导致细胞内发生氧化应激。与缺氧复氧模型组比较，角鲨烯预处理组不会导致明显的细胞氧化应激(P<0.05)，表明不同浓度的角鲨烯保护HK-2细胞24h后，抑制了缺氧导致的细胞氧化应激。
综合上述实验结果，表明：角鲨烯可以抑制缺氧复氧产生的肾损伤，角鲨烯具有良好的防治缺氧诱导肾缺血再灌注的作用，能为临床上运用角鲨烯防治缺氧诱导肾缺血再灌注提供较好的实验依据。
实施例2
1材料
1.1动物
成年健康小鼠66只，雄性，体重(22±2g)，购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SYXK(苏)2017-0007。
1.2药品与试剂
角鲨烯标准品上海源叶生物有限公司，以大豆油溶解，配成合适的浓度，现用现配。
N-乙酰半胱氨酸购自上海阿拉丁股份有限公司，以生理盐水溶解，配成合适的浓度，现用现配。
1.2仪器
激光散斑血流成像系统(FLP12)，LAZR多模式、超高分辨率小动物光声/超声成像系统。
2.方法及结果
2.1动物分组与实验方案
小鼠48只，适应性饲养1周后，随机分为6组，每组8只，分别为：正常对照组(Control)、肾缺血再灌注模型组(Model)、N-乙酰半胱氨酸组(NAC)、角鲨烯低剂量组(LJ)、角鲨烯中剂量组(MJ)、角鲨烯高剂量组(HJ)。正常对照组(Control)每天腹腔注射生理盐水；肾缺血再灌注模型组(Model)采用单侧背部切口，钝性分离肾蒂，用微型动脉止血夹将肾蒂夹闭，缺血45min后撤除止血夹，复位肾脏，缝合双侧背部创口，恢复肾脏灌注24h。NAC组每天灌胃N-乙酰半胱氨酸100mg/kg，每天1次，连续灌胃10天，在第8天时构建肾缺血再灌注模型；角鲨烯低、中、高剂量组每日分别灌胃角鲨烯20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg，每天1次，连续灌胃10天，在第8天时构建肾缺血再灌注模型；每天对实验动物进行称重，以调整药物用量。
2.2样本采集
最后一次给药后，禁食12h，摘眼球取血，离心收集血清后置-80℃冰箱冻存。摘取肾脏，部分-80℃保存，4％多聚甲醛固定常温保存。
采用SPSS 20.0统计软件，实验中各计量参数均以均数±标准差形式表示，多组间数据使用单因素方差分析比较。
2.3 ELISA检测小鼠血清血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和白细胞介素-1β(IL-1β)
根据试剂盒说明书操作，在酶标仪450nm处读取吸光值并计算标准曲线回归方程式，求得样品浓度。
角鲨烯对急性肾损伤小鼠血清肌酐、尿素氮和白细胞介素-1β水平的影响如图4-图6所示。与正常组比较，模型型组小鼠血清肌酐、尿素氮和白细胞介素-1β含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，角鲨烯组及N-乙酰半胱氨酸组均均可不同程度降低小鼠血清肌酐、尿素氮和白细胞介素-1β含量(P<0.05)。
2.4 HE染色观察肾脏组织病理结构变化
取肾组织4％多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、石蜡包埋、切片及苏木素－伊红染色，在光学显微镜下观察正常对照组、肾缺血再灌注模型组及给药组之间肾脏病理学变化。
如图7所示，角鲨烯对急性肾损伤小鼠肾脏病理学改变的影响：正常对照组肾小管清晰可见上皮细胞刷状内缘，上皮细胞排列整齐，肾小球血管网结构清晰。模型组肾小管上皮细胞刷状内缘全部消失，上皮细胞肿胀坏死，空泡变性，近曲小管管腔扩张，不成形，肾小球血管网结构不清晰。角鲨烯组、N-乙酰半胱氨酸组肾脏组织形态较模型组均有一定改善。
2.5用于激光散斑血流图观察的肾脏模型制备
小鼠9只，适应性饲养1周后，随机分为3组，每组3只，分别为：正常对照组(Control)、肾缺血再灌注模型组(Model)、角鲨烯高剂量组(HJ)。按照“2.1动物分组与实验方案”项下所述方法建立实验模型。每组小鼠空腹状态下以水合氯醛溶液(10％，3mL/kg)腹腔麻醉，待小鼠充分麻醉后，将小鼠仰卧固定在托板上，暴露腹部，在剑突下沿腹中线纵向向下切开皮肤约2cm，再分别沿左、右肋骨下缘剪开皮肤各约1cm，分离皮下组织，再按上述手术路径剪开腹部肌肉，打开腹腔，暴露左、右肾脏，剥离肝脏，置于腹部外周的托架平面上，使肾脏完全暴露。肾脏激光散斑血流图采集被检测肾脏与血流仪检测镜头间距离为28～30cm，调整检测仪的焦距至图像清晰，设定仪器参数为低密度，25帧/s，20帧图片连续采集模式，时间间隔为1s，曝光时为20ms。将各组每只动物每幅图像编号存盘。
激光散斑图像分析用激光散斑血流成像系统软件分析各组散斑血流图。观察实验性小鼠肾脏表面血流值变化，用图像分析中的不规则区域选择工具选取的面积可从软件中直接读取，每帧图像选取面积一致)，分析各组图片小鼠肾脏皮层表面血流值。
角鲨烯对急性肾损伤小鼠血流速的影响如图8所示。正常对照组与缺氧复氧模型组比较，具有统计学意义(P<0.05)，表明缺氧导致细胞发生血流速减慢。与正常对照组比较，角鲨烯干预肾缺血再灌注不会导致明显的血流速度的减慢(P<0.05)，表明不同浓度的角鲨烯保护肾缺血再灌注的血流速。
2.6用于彩色多普勒超声观察的肾脏模型制备
小鼠9只，适应性饲养1周后，随机分为3组，每组3只，分别为：正常对照组(Control)、肾缺血再灌注模型组(Model)、角鲨烯高剂量组(HJ)。按照“2.1动物分组与实验方案”项下所述方法建立实验模型。麻醉每组小鼠，裸露小鼠背部皮肤。彩色多普勒超声在二维模式显示小鼠左侧肾脏的最大冠状切面；彩色多普勒模式观察小鼠左侧肾脏血流分布情况，切换至频谱多普勒模式下，测量位于最大冠状切面上中央的相当于肾段动脉水平的肾动脉血流频谱，连续显示至少五个心动周期以上的肾动脉血流频谱，检查过程中记录并储存数据。
角鲨烯对急性肾损伤小鼠血流量的影响如图9所示。小鼠肾脏血流彩色多普勒超声观察动态观察，正常对照组小鼠肾脏血流丰富，主肾动脉、段动脉及叶间动脉清晰可见，部分弓形动脉可见，彩色多普勒血流呈树枝状分布。模型组大鼠肾脏主肾动脉、段动脉血流信号清晰可见，部分叶间或弓形动脉粗细不等或血流信号减少，彩色多普勒血流呈非典型树支状分布。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，这些改进和变换应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.角鲨烯在制备治疗肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用为角鲨烯在制备治疗缺氧复氧产生的肾损伤药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：角鲨烯在制备改善肾小管上皮细胞存活率药物的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：角鲨烯在制备改善肾小管上皮细胞活性氧含量药物的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：角鲨烯在制备改善急性肾损伤的生化指标血肌酐、尿素氮和白介素-1β药物的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：角鲨烯在制备改善急性肾损伤的肾脏组织病理药物的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：角鲨烯在制备改善急性肾损伤的血流速度药物的应用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：角鲨烯在制备改善急性肾损伤的血流量药物的应用。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是以角鲨烯为有效成分，与药学上可接受的辅料制成的任一药学上可接受的剂型。
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