CN115737661A

CN115737661A - 一种黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用

Info

Publication number: CN115737661A
Application number: CN202211301222.8A
Authority: CN
Inventors: 沈炜; 宋洪元; 李青; 张昊瑞; 桂潇; 聂政; 蔡畅
Original assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Current assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。本发明提供的黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，黄芩苷经体内外药理实验证明，在6μg/ml剂量下，体外能显著抑制人类脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、成管能力，体内能抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型的视网膜新生血管形成，可用于相关视网膜新生血管性疾病的治疗，具有良好的应用前景。

Description

一种黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从传统中药黄芩的根茎中提取分离的黄酮类化合物黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

背景技术

传统中药黄芩应用历史悠久，为唇形科植物黄芩的干燥根，其主要的药效化学成分为黄酮类化合物。黄芩性寒、味苦，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。《本草纲目》记载：可以治头疼热痛、湿热风热、火咳肺痿喉腥、诸失血(高庆，周月红，董威，俞国勋，毛敏婕.黄芩有效成分对糖尿病相关病症影响机制研究进展[J].微量元素与健康研究,2022,39(02):73-74+77)。

黄芩苷是从黄芩根中提取的黄酮类化合物，其药理作用突出，具有抑菌、利尿、抗炎、抗病毒、抗变态反应及解痉等作用(Yang J Y,Li M,Zhang C L,etal.Pharmacological properties of baicalin on liver diseases:a narrativereview.Pharmacol Rep,2021,73(5):1230-1239)。多年来，黄芩苷因其多靶点、副作用小，已得到广泛关注。

研究发现，黄芩苷是一个有效的血管生成抑制剂，具有良好的抑制病理性血管生成的作用。黄芩苷能有效降低基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管紧张素II和血管内皮生长因子(VEGF)的表达，进而明显减少视网膜无灌注区、新生血管簇数量(Jo H,Jung SH,Yim HB,Lee SJ,Kang KD.The effect of baicalin in a mousemodel of retinopathy of prematurity.BMB Rep.2015May；48(5):271-6.)。

视网膜新生血管性疾病是导致失明的主要原因之一。在包括损伤、感染、缺氧等多种刺激的诱导下，血管内皮细胞功能发生紊乱，异常增殖形成新生血管，血管生成失调会破坏氧和营养物质的输送，导致代谢供需失衡，干扰神经视网膜功能，最终导致病理性视网膜新生血管，如糖尿病视网膜病变(DR)、早产儿视网膜病变(ROP)和新生血管年龄相关性黄斑变性(nAMD)等。病理性视网膜新生血管以渗漏和新生血管簇为特征，可造成视网膜出血、视网膜脱离等严重后果(Al-Latayfeh M,Silva PS,Sun JK,Aiello LP.Antiangiogenictherapy for ischemic retinopathies.Cold Spring Harb Perspect Med.2012)。

视网膜新生血管性疾病根治困难、复发率高，相应的药物研究一直是近年来医药研究领域的热点和难点。为抑制病理性新生血管，以VEGF为靶点的抗血管生成治疗已成为主要手段。虽然该疗法对大部分患者有效，但存在一定的局限性，并且逐渐凸显，其中包括耐药性以及由于注射频繁而导致的不依从性。因此，仍然需要新的疗法。

中药及其天然产物可多通道、多靶点治疗治疗视网膜新生血管性疾病，具有毒性低、副作用小等优点，是开发抗病理性视网膜新生血管药物的巨大资源库。粉防己、芒柄花素、雷公藤等已被证明对视网膜新生血管有良好的抑制作用(Wu,J,Ke,X,Ma,N,etal.Formononetin,an active compound of Astragalus membranaceus(Fisch)Bunge,inhibits hypoxia-induced retinal neovascularization via the HIF-1α/VEGFsignaling pathway.Drug Des Devel Ther.2016；103071-3081.Liang,XC,Hagino,N,Guo,SS,et al.Therapeutic efficacy of Stephania tetrandra S.Moore for treatment ofneovascularization of retinal capillary(retinopathy)in diabetes--in vitrostudy.PHYTOMEDICINE.2002；9(5)-377-84)。目前，尚无有关黄芩苷在治疗视网膜新生血管性疾病中的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

所述黄芩苷(Baicalin，5,6-Dihydroxy-4-oxo-2-phenyl-4H-1-benzopyran-7-ylβ-D-Glucopyranosiduronic Acid)是由传统中药黄芩分离纯化得到，其分子式为C₂₁H₁₈O₁₁，黄色针状结晶，熔点231-233℃，具有如下分子结构：

所述黄芩苷的药物剂量在3μg/ml时开始发挥作用，6μg/ml时抑制作用显著且无毒性。

视网膜新生血管性疾病是眼科最常见的眼底病之一，在多种因素的介导下，视网膜血管内皮细胞代谢及功能紊乱，血管生成失调会破坏氧和营养物质的输送，导致代谢供需失衡，最终导致病理性视网膜新生血管。

视网膜新生血管是指在包括损伤、感染、缺氧等多种刺激的诱导下，血管内皮细胞功能发生紊乱，异常增殖形成新生血管，与血管内皮生长因子的生成和释放有关。

所述黄芩苷可以制成药物制剂。

所述药物制剂的剂型为注射剂，给药方式为玻璃体腔注射。

研究发现，黄芩苷能有效降低基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管紧张素II和血管内皮生长因子(VEGF)的表达，进而明显减少视网膜无灌注区、新生血管簇数量。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，黄芩苷经体内外药理实验证明，在6μg/ml剂量下，体外能显著抑制人类脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、成管能力，体内能抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型的视网膜新生血管形成，可用于相关视网膜新生血管性疾病的治疗，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是黄芩苷在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的示意图。

图2是黄芩苷在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的示意图。

图3是黄芩苷在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管的示意图。

图4是黄芩苷在体内抑制氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的视网膜新生血管形成的示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

1.实验方法

1.1受试细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。

1.2试验药物与试剂

黄芩苷购自上海源叶生物科技有限公司(Shanghai yuanye Bio-TechnologyCo.,Ltd)，货号B20570。

1.3分组与造模

称取30mg，溶解于5ml DMSO，使用超声混匀配制成6mg/ml的储存液，-20℃保存。

低浓度药物处理组(3μg/ml)：将黄芩苷储存液(6mg/ml)溶解稀释于内皮细胞培养基(ECM)配置成3μg/ml的工作液(黄芩苷：ECM＝1:2000)；

高浓度药物处理组(6μg/ml)：将黄芩苷储存液(6mg/ml)溶解稀释于内皮细胞培养基(ECM)配置成6μg/ml的工作液(黄芩苷：ECM＝1:1000)；

对照组(0μg/ml)：将DMSO 1:1000溶解稀释于ECM中配置成0μg/ml的对照组。

1.4治疗方法

黄芩苷工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞增殖实验(EDU assay)

第一步，细胞种孔：将密度约为80％～90％的HUVEC细胞进行消化，并细胞计数，每孔取约3×10⁴个细胞种至96孔板中，放置于37℃5％CO₂孵箱中孵育，待细胞贴壁后，弃原培养液，对照组加入新鲜培养基，处理组加入ECM稀释的黄芩苷溶液(6μg/ml)，放置于37℃5％CO₂孵箱中孵育24～48小时。

第二步，Edu标记：将Cell-Light^TM Edu Apollo567试剂盒中试剂A(EdU，5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)与ECM全培培养基按照1:1000的比例稀释；将96孔板中HUVEC原细胞培养基弃掉，并换为上述稀释液，每孔100μl，放置于37℃5％CO₂孵箱中孵育约2小时。

第三步，细胞固定：将96孔板中培养基吸除，PBS溶液清洗细胞，清洗3次，每次5-10分钟。清洗结束后，每孔加入100μl 4％多聚甲醛溶液，室温下固定30分钟，弃细胞固定液；细胞固定完成后每孔加入2mg/ml甘氨酸溶液100μl，室温下脱色摇床5-10分钟，弃甘氨酸溶液；每孔加入100μl PBS溶液清洗细胞，5分钟；每孔加入100μl 0.5％TritonX-100渗透剂，室温摇床清洗5分钟；每孔加入100μl PBS清洗细胞，室温脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。

第四步，Apollo染色：染色前首先将试剂B(

反应缓冲液)、试剂C(

催化剂溶液)、试剂D(

荧光染料溶液)、试剂E(

缓冲添加剂)及ddH₂O按试剂盒说明书配制成1XApollo染液，细胞固定及清洗结束后每孔加入100μl上述染液，室温避光，摇床孵育30分钟，弃染液；每孔加入0.5％TritonX-100渗透剂100μl，室温摇床清洗2～3次，每次10分钟。

第五步，DAPI染色：将DAPI原液与PBS溶液按照1:10000稀释，每孔加入稀释后DAPI染液100μl，室温避光，摇床染色15分钟，弃染液；每孔加入100μl PBS溶液，室温摇床清洗3次，每次5～10分钟，最后一遍不弃PBS。

第六步，观察：使用荧光显微镜，观察并拍摄图像，计算增值期细胞核染色数量与全部细胞核数量及其比值。

2.结果如图1所示，图1是黄芩苷在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的示意图。从图中可以看出，未加药对照组(Ctrl)增值期细胞比例最多，低浓度药物处理组(3μg/ml)次之，高浓度药物处理组(6μg/ml)增值期细胞比例最小。说明黄芩苷在体外可以抑制HUVEC的增殖能力，并呈浓度依赖性。

实施例2

1.实验方法

1.1受试细胞：HUVEC细胞。

1.2试验药物与试剂

1.3分组与造模

1.4治疗方法

黄芩苷工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞迁移实验(Migration assay)

第一步，细胞种孔：将ibidi Culture-insert 2Well放置于干燥的细胞培养皿表面，细胞密度约为80％～90％的HUVEC细胞进行消化，将100μl细胞悬液种于Culture-insert孔中，放置于37℃5％CO₂孵箱中孵育24小时。

第二步，划痕形成：轻柔去除Culture-insert后，未加药对照组(0μg/ml)加入新鲜培养基，低浓度处理组和高浓度处理组分别加入3μg/ml和6μg/ml的黄芩苷溶液(6μg/ml)，放置于37℃5％CO₂孵箱中孵育12～24小时。

第三步，观察：显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。

2.结果如图2所示，图2是黄芩苷在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的示意图。从图中可以看出，未加药对照组(0μg/ml)细胞的迁移距离最大，低浓度药物处理组(3μg/ml)次之，高浓度药物处理组(6μg/ml)细胞的迁移距离最小。说明黄芩苷在体外可以抑制HUVEC的迁移能力，并呈浓度依赖性。

实施例3

1.实验方法

1.1受试细胞：HUVEC细胞。

1.2试验药物与试剂

1.3分组与造模

1.4治疗方法

黄芩苷工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞成管实验(Tube Formation assay)

第一步，铺胶：将96孔板置于冰上，每孔中加入80μl Matrigel胶，放入4℃冷却沉淀10分钟；将96孔板放入37℃5％CO₂孵箱中孵育20分钟。

第二步，细胞种孔：将提前药物处理好的细胞消化重悬，并进行细胞计数，每孔50μl细胞悬液接种于上述预先铺好基质胶的96孔板中，每孔数量为1×10⁴个细胞；将96孔板放置于37℃5％CO₂孵箱中孵育2～4小时。

第三步，观察：利用荧光显微镜观察各组细胞形态及其成管情况。

2.结果如图3所示，图3是黄芩苷在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管的示意图。从图中可以看出，未加药对照组(Ctrl)细胞的成管能力最好，低浓度药物处理组(3μg/ml)次之，高浓度药物处理组(6μg/ml)细胞的成管能力最差。说明黄芩苷在体外可以抑制HUVEC的管样形成能力，并呈浓度依赖性。

实施例4

1.实验方法

1.1受试动物：

出生后7天的健康C57BL/6J小鼠与母鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司。动物饲养于海军军医大学SPF级动物房，自由饮水饮食，室温23-25℃，相对湿度(44±10)％，维持12h交替光照。

1.2试验药物与试剂

1.3分组与造模

称取2.4g黄芩苷，溶解于0.5ml DMSO，超声混匀配制成4.8g/ml的储存液，-20℃保存。

药物处理组(240mg/ml)：将黄芩苷储存液(4.8g/ml)溶解稀释于PBS配置成240mg/ml的工作液(黄芩苷储存液：PBS＝1:20)。

1.4治疗方法

玻璃体腔注射。

1.5实验步骤

OIR小鼠模型研究

第一步，OIR小鼠模型制作：将出生后7天的健康C57BL/6J小鼠与母鼠一起放置于密闭氧箱中持续哺乳5天，氧箱浓度维持在75±2％，箱内温度控制在25±2℃，定时添加饲料和水，更换垫料，每隔12小时更换哺乳母鼠以保证哺乳母鼠的身体及行为正常；氧箱内饲养5天后，即小鼠出生后第12天时，将小鼠及其哺乳母鼠返回室内标准环境下饲养，正常空气环境氧浓度为21±2％，以诱导小鼠视网膜新生血管产生，自第12天起至第17天，每天对处理组小鼠进行玻璃体腔注射黄芩苷稀释液2μl(240mg/ml)，对照组注射2μl PBS(DMSO:PBS＝1:20)，在第17天颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠眼球进行视网膜荧光染色铺片。

第二步，视网膜荧光染色铺片制作：

视网膜固定：将上述OIR模型及正常对照组小鼠眼球取下，放入4％多聚甲醛中固定30分钟。

视网膜分离：在显微镜下，将固定好的小鼠视网膜放入PBS溶液中，用眼科剪沿眼球角巩膜缘处剪开，取出晶状体和玻璃体，用无齿镊小心剥离巩膜，脉络膜，最后夹出残留玻璃体纤维，即可分离出视网膜组织。

封闭：PBS溶液清洗视网膜3次，每次10分钟；加入5％BSA溶液，封闭1小时，以阻断非特异性染色，小心吸除BSA溶液，PBS溶液清洗3次，每次10分钟。

染色：弃PBS溶液，加入100μl PBS稀释的IB4荧光染料，室温孵育2小时，PBS摇床清洗3次，每次10分钟。

铺片：在显微镜下以视乳头为中心，用显微剪刀做4个放射状切口，在载玻片上铺平视网膜，最终呈四叶草状，滴上封片液，盖上盖玻片。

第三步，观察：在荧光显微镜下观察并拍摄图像。

2.结果如图4所示，图4是黄芩苷在体内抑制氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的视网膜新生血管形成的示意图。从图中可以看出，未加药对照组(Ctrl)可见大片无灌注区及新生血管簇，加药处理组(Baicalin)无灌注区面积及新生血管显著减少。说明黄芩苷在体内情况下可以显著抑制病理性新生血管生成。

以上实验表明，黄芩苷在体内外均能显著抑制病理性新生血管的形成，对视网膜新生血管性疾病有良好的治疗效果，具有良好的药物应用前景。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述黄芩苷是由传统中药黄芩分离纯化得到，其分子式为C₂₁H₁₈O₁₁，黄色针状结晶，熔点231-233℃，具有如下分子结构：

3.根据权利要求1所述的黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述黄芩苷可以制成药物制剂。

4.根据权利要求3所述的黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述药物制剂的剂型为注射剂。

5.根据权利要求4所述的黄芩苷在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述药物制剂的给药方式为玻璃体腔注射。