CN114796183B

CN114796183B - 益母草碱在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN114796183B
Application number: CN202110114530.9A
Authority: CN
Inventors: 郝杰杰; 白董慧; 李海花; 于广利; 管华诗
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2024-01-09
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: CN114796183A

Abstract

本发明提供了益母草碱在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的应用。本发明通过吸烟联合LPS呼吸道滴注、HDM和CTGF诱导并获得了慢阻肺、哮喘以及肺纤维化的动物或细胞模型，验证了益母草碱能够增强动物模型的肺功能，抑制血清中CD48和IgE的分泌，且能够作用于支气管上皮细胞，降低脂氧合酶的含量、抑制PDE酶活性等，进而阻止由多种介质分子引起的高气道反应、过敏反应、气管强直收缩等，有效预防或治疗哮喘、慢阻肺、肺纤维化等多种呼吸系统疾病，且益母草碱无副作用，使用安全。

Description

益母草碱在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及益母草碱的新用途，具体涉及益母草碱在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的应用。

背景技术

呼吸系统疾病是一种常见的多发病，主要病变在气管、支气管、肺部及胸腔，严重者可导致呼吸困难、甚至因呼吸衰竭而亡。呼吸系统疾病中最为常见的是慢阻肺(慢性阻塞性肺病，chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、哮喘、肺纤维化等。

COPD由于其患病人数多、死亡率高，已成为一个重要的公共卫生问题，至今尚无根治方法。目前，COPD居全球死亡原因的第4位，并根据世界卫生组织的公布，2020年COPD位居世界疾病经济负担的第5位。COPD是一组慢性气流阻塞性疾病的统称，包括有气流阻塞的慢性支气管炎和肺气肿等。目前普遍认为COPD以气道、肺实质的慢性炎症为特征，在肺的不同部位有肺泡中性粒细胞、单核细胞以及淋巴细胞的增加。目前治疗慢阻肺的西药主要有支气管扩张剂包括茶碱类、β2激动剂和抗胆碱能药物，并配合氧疗、抗生素、激素及辅助通气等对症处理。但抗菌素长期使用易出现耐药和毒副反应，而反复感染的患者常选用高档抗菌素，其价格昂贵，病者难以承受；而激素则具有较强的副作用。

此外，哮喘也是一种常见呼吸系统疾病，其是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症，已成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。目前西医治疗哮喘的方式多依靠支气管扩张药或吸氧使症状缓解，并没有针对哮喘病的发病原因进行治疗。这种治标不治本的方式容易使人产生依赖性并且反复发作，还具有副作用，会严重影响患者正常生活。

在呼吸系统疾病，特别是COPD、哮喘和支气管炎长期发病过程中，白三烯、组胺、黏附分子以及CD48是最为关键的介质分子，从传统中药中寻找能够有效抑制白三烯、组胺以及黏附分子和CD48形成的中药单体用于防治呼吸系统疾病的药物是目前药物研究的热点。

中草药益母草唇形科植物，最早收载于《神农本草经》、《本草纲目》等古籍中，有活血调经、利尿消肿的功效。益母草常用于月经不调、痛经、经闭、恶露不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿等治疗。益母草碱是传统中药益母草的特异成分，大量文献及专利已报道了益母草碱能够抑制血管平滑肌收缩，对心肌和脑缺血的有效保护作用；还被发现益母草碱可降低血脂，并有效改善血管性痴呆大鼠的认知障碍。

但迄今，尚未见有关益母草碱对呼吸系统疾病影响的相关报道，更未见其对COPD以及支气管哮喘等的研究报道，也未见其对肺纤维化的影响研究。

发明内容

本发明的目的在于提供了益母草碱在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的应用，尤其是对慢阻肺、哮喘、肺纤维化具有显著的预防或治疗作用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了益母草碱或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的应用。

进一步的，所述益母草碱的分子式为C₁₄H₂₁N₃O₅，分子量为311.33，其具体结构式如下：

进一步的，所述呼吸系统疾病为慢阻肺、哮喘、肺纤维化、气管炎或支气管炎。

进一步的，所述益母草碱的每日的小鼠给药剂量为5～100mg/kg。

进一步的，由所述益母草碱预防或治疗小鼠呼吸系统疾病的有效剂量推算至临床每日成人的给药剂量为30mg/d-500mg/d。

本发明利用吸烟联合LPS呼吸道滴注诱导获得小鼠慢阻肺COPD模型，实验验证了所述益母草碱能够有效作用于COPD动物模型的肺部，并能够有效增强慢阻肺动物模型的肺功能，降低其肺泡中的中性粒细胞的数量、白三烯和组胺的含量以及抑制血清中CD48的分泌。

本发明利用HDM诱导获得了小鼠哮喘模型和哮喘细胞模型，实验验证了所述益母草碱能够显著降低哮喘动物模型中血清中IgE的含量以及气道中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数量，并抑制CD48的分泌；同时所述益母草碱能够作用于支气管上皮细胞，并明显降低哮喘细胞模型中哮喘介质脂氧合酶LOX的含量、增敏介质E-caderin和N-cadherin的表达水平、PDE酶的活性，以及促进细胞内信号分子cAMP的释放，并提高PKA激酶的活性。

本发明利用CTGF诱导获得了肺纤维化细胞模型，实验验证了所述益母草碱能够降低肺纤维化细胞模型中的关键转化生长因子TGF-β、关键蛋白MMP9和TIMP-2的表达水平。

本发明还提供了一种用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物，所述药物含有益母草碱或其药学上可接受的盐。

进一步的，所述药物为单组份或与药学上可接受的载体或赋形剂组合而成的复方制剂。

进一步的，所述药物为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明通过构建多种呼吸系统疾病，比如慢阻肺、哮喘以及肺纤维化的动物或细胞模型，验证了益母草碱能够通过调整与疾病相关的多种介质分子和信号分子的分泌、蛋白的表达或酶活等，进而达到预防或治疗慢阻肺、哮喘以及肺纤维化的目的，且还经过实验验证，在预防或治疗呼吸系统疾病的过程中，所述益母草碱无副作用，安全可靠，因此益母草碱有望成为或用于防治多种呼吸系统疾病的药物或主要功效成分，为呼吸系统疾病提供新的治疗思路。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

益母草碱(市售)，白色粉末，其分子式为C₁₄H₂₁N₃O₅，分子量为311.33，熔点为238℃，具体结构式如下：

实施例1：益母草碱对吸烟联合LPS呼吸道滴注诱导的小鼠慢阻肺COPD模型的肺功能、肺泡中性粒细胞占比、白三烯相关炎症蛋白的影响

将30只小鼠随机分为5组，每组6只，分别为空白组、模型组、低剂量组、高剂量组和阳性药物组。实验前，将香烟放入烟雾发生器中(30支/次)，将所有小鼠放置于染毒箱(尺寸为80厘米×80厘米×80厘米)中。除空白组外，其他组点燃香烟后，通过注射器的自动抽吸作用将烟雾注射进染毒箱内，使小鼠吸烟，每天早晚两次，每次持续30min，间隔4小时以上，连续吸烟40天，在此过程中需确保五分钟内将香烟全部燃完。吸烟的第19天和第38天，除空白组外，其余组小鼠均采用10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，待麻醉后暴露气管，并使用1ml注射器向小鼠气管中快速注入0.75mg/kg的LPS，完成后迅速将小鼠直立旋转20s，使LPS溶液均匀分布于肺叶中，然后将小鼠伤口缝合。低剂量组小鼠每天饲喂10mg/kg(体重)的益母草碱，高剂量组小鼠每天饲喂100mg/kg(体重)的益母草碱，阳性药物组每天饲喂5mg/kg(体重)的罗氟司特，连续饲喂45天。所有小鼠均进行正常喂养。所有受试动物于第45天给药后1h，用戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，迅速剪开颈部皮肤，分离气管，在气管上剪一小口，插入套管，行气管插管术，再连上肺功能测试仪，进行肺功能检测；检测完毕后打开胸腔，进行肺灌流，取灌洗液保存待测。

1、肺功能的测定：以戊巴比妥钠麻醉小鼠后，行气管插管术，用小动物肺功能测试仪对每只小鼠进行用力肺通气相关指标的测量，包括小鼠肺活量(FVC)、小鼠用力肺通气(FEV0.15/FVC％，该值越大，说明呼气越通畅，气流流速越大，单位时间内呼出的气体就多)、用力中期呼气流速(FEF25_75/FVC％，即在小鼠占大部分呼气体积分数段25％-75％内的呼气流速和肺活量之比，该值越大，说明呼气越通畅，气流流速越大)、小鼠用力最大呼气流速(PEF)，测试小鼠的相关肺功能指标。

如表1所示，和空白组相比，模型组小鼠的FVC、FEV0.15/FVC％、FEF25_75/FVC％和PEF均显著下降；各给药组小鼠的肺功能指标与模型组相比均显著上升，而且益母草碱的高剂量组的增长效果要优于阳性药物罗氟司特，且化合物益母草碱存在量效关系，说明益母草碱能够有效增强COPD小鼠模型的肺功能。

表1：益母草碱对COPD小鼠肺功能检测结果

注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与空白组相比较：#P＜0.05。

2、支气管肺泡灌洗液中性粒细胞百分比检测：小鼠处死后仰卧于手术操作台上，固定四肢，使用75％酒精对其颈部消毒，然后充分暴露小鼠气管，在喉部附近插入18g气管插管针(针头稍磨平)，针头插入一定位置，切勿超过气管分叉处；用4℃无菌生理盐水反复灌洗3次，收集灌洗液，1800rpm/min离心5min后，沉淀用PBS悬浮，涂片，用瑞氏-吉姆斯染色，用显微镜对中性粒细胞进行观察计数，观察100个有核细胞中中性粒细胞的个数，计算中性粒细胞的百分比。

在COPD的发病过程中，各种介质因子可促进中性粒细胞的迁移和聚集，同时中性粒细胞释放氧化代谢产物、蛋白酶、细胞因子，这些物质对局部组织造成损失从而引起末梢气道的慢性损伤，同时导致蛋白酶-抗蛋白酶失衡而引起气肿，从而促进COPD的发生和发展，因此中性粒细胞是评价慢阻肺的重要指标。

如表2所示，与空白组相比，模型组小鼠肺组织灌洗液中的中性粒细胞百分比明显上升，高低剂量的益母草碱均可显著回调中性粒细胞的比例，阳性药物组也可显著降低其比例，三组药物处理中以高剂量组为最优，说明益母草碱能够显著降低COPD动物模型肺泡灌洗液的中性粒细胞的数量。

表2：益母草碱对COPD小鼠中性粒细胞的影响

注：与模型组相比较：**p＜001；与空白组相比较：##P＜0.01。

3、取上述收集的灌洗液检测其中白三烯和组胺的含量。

白三烯和组胺以及黏附分子介导了高气道反应，可诱导支气管平滑肌收缩，使微静脉及毛细血管扩张，通透性增加。而高气道反应是指气道对各种刺激因子出现过强或过早的收缩反应，是诱发呼吸道疾病的重要因素之一。

从表3中可以看出，与空白组相比，模型组小鼠体内的白三烯和组胺的水平显著升高，药物处理均可以有效逆转气管对香烟和LPS的敏感性，且益母草碱具有一定的量效关系，其中以益母草碱高剂量组效果最优，说明益母草碱能够降低COPD动物模型中导致气管收缩及肿痛的白三烯和组胺的分泌。

表3：益母草碱对COPD小鼠肺泡分泌白三烯和组胺的影响：

与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与空白组相比较：#P＜0.05

实施例2：益母草碱对吸烟联合LPS呼吸道滴注诱导的小鼠慢阻肺COPD模型动物中CD48因子的影响

将30只小鼠随机分为5组，每组6只，分别为空白组、模型组、低剂量组、高剂量组和阳性药物组。实验前，将香烟放入烟雾发生器中(30支/次)，将所有小鼠放置于染毒箱(尺寸为80厘米×80厘米×80厘米)中。除空白组外，其他组点燃香烟后，通过注射器的自动抽吸作用将烟雾注射进染毒箱内，使小鼠吸烟，每天早晚两次，每次持续30min，间隔4小时以上，连续吸烟40天，在此过程中需确保五分钟内将香烟全部燃完。吸烟的第19天和第38天，除空白组外，其余组小鼠均采用10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，待麻醉后暴露气管，并使用1ml注射器向小鼠气管中快速注入0.75mg/kg的LPS，完成后迅速将小鼠直立旋转20s，使LPS溶液均匀分布于肺叶中，然后将小鼠伤口缝合。低剂量组小鼠每天饲喂10mg/kg(体重)的益母草碱，高剂量组小鼠每天饲喂100mg/kg(体重)的益母草碱，阳性药物组每天饲喂5mg/kg(体重)的罗氟司特，连续饲喂45天。所有小鼠均进行正常喂养。所有受试动物于第45天给药后1h，用戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，从小鼠眼底静脉丛取血，4000rpm低温离心20min后取上清，检测加重气道变态反应的CD48因子的表达水平。

CD48因子是一种与淋巴细胞的黏附、激活以及聚集有关的一种以糖基磷脂酰肌醇为靶点的蛋白质，与高气道反应密切相关。

如表4所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中的CD48的表达水平显著上升，高低剂量的益母草碱和阳性药物组均可显著降低CD48的表达水平，且各种药物处理中以益母草碱高剂量组降低效果为最优，因此说明益母草碱能够显抑制COPD动物模型体内的CD48因子的表达，从而抑制由CD48诱导的相关呼吸道疾病的发生。

表4：益母草碱对COPD小鼠血清中CD48表达水平的影响

实施例3：益母草碱对HDM诱导的小鼠哮喘模型中诱导哮喘的血清IgE的影响

通过对实验C57BL/6小鼠哮喘造模及用药、气管和肺泡灌洗液收集和检测、血清生化检测以评价益母草碱对小鼠哮喘模型气道舒张和收缩功能、气道重塑的影响，具体方法如下：将30只小鼠适应性喂养7天后，随机分为空白组、模型组、低剂量组(5mg/kg益母草碱)、高剂量组(30mg/kg益母草碱)、阳性药物组(1.0mg/kg的罗氟司特)，每组6只。除空白组外，其他组别的小鼠在第0、3、5、10、12、14天用HDM诱导哮喘模型，具体操作为于小鼠腹腔注射100μl麻醉剂，待小鼠麻醉后，取50μl致敏剂HDM(House dust mite，屋尘螨)，进行滴鼻和气管滴注双效致敏。低剂量组小鼠每天灌胃给药5mg/kg(体重)的益母草碱，高剂量组小鼠每天灌胃给药30mg/kg(体重)的益母草碱，阳性药物组每天灌胃给药1.0mg/kg的roflumilast，连续喂药45天。在实验期间，所有小鼠均进行正常喂养，并每天观察小鼠的呼吸状态。检测前，小鼠禁食12h后，采用摘眼球取血来收集小鼠血液，血液静置30min后，3800rpm低温离心10min取上清，用ELISA检测血液中IgE的含量。

IgE是免疫球蛋白的一种，哮喘病理生理的整个过程都与循环血中IgE的升高存在明显的关系。

如表5所示，与空白组相比，模型组中IgE的含量明显上升，而高低剂量组以及阳性药物组均可以显著减少循环血中的IgE含量，且在三组中，高剂量组的降低IgE含量的效果最好，说明益母草碱能够显著降低哮喘动物模型血清中关键致敏蛋白IgE的含量，进而降低哮喘的发生可能；并起到防止IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的高亲和力受体结合的作用，进而避免了与过敏原接触后的介质释放；同时还减少了嗜碱性粒细胞和肥大细胞的存活；阻止IgE促进的过敏反应；减少白三烯和组胺释放等一系列缓解哮喘的作用。

表5益母草碱对哮喘模型动物血清中IgE含量的影响

实施例4：益母草碱对HDM诱导的小鼠哮喘模型气道中嗜酸性过敏炎症反应指标CD48的影响

将30只小鼠适应性喂养7天后，随机分为空白组、模型组、低剂量组(5mg/kg益母草碱)、高剂量组(30mg/kg益母草碱)、阳性药物组(1.0mg/kg的罗氟司特)，每组6只。除空白组外，其他组别的小鼠在第0、3、5、10、12、14天用HDM诱导哮喘模型，具体操作为于小鼠腹腔注射100μl麻醉剂，待小鼠麻醉后，取50μl致敏剂HDM，进行滴鼻和气管滴注双效致敏。低剂量组小鼠每天灌胃给药5mg/kg(体重)的益母草碱，高剂量组小鼠每天灌胃给药30mg/kg(体重)的益母草碱，阳性药物组每天灌胃给药1.0mg/kg的roflumilast，连续喂药45天。在实验期间，所有小鼠均进行正常喂养，并每天观察小鼠的呼吸状态。

小鼠眼球取血后，采用脱颈椎处死，小鼠仰卧于手术操作台上，固定四肢，使用75％酒精对颈部消毒，充分暴露小鼠气管，在喉部附近插入18g气管插管针(针头稍磨平)，针头插入一定位置，切勿超过气管分叉处；用0.8mL预冷的PBS反复灌洗3次，收集肺泡灌洗液到2mL的EP管中，1000rpm、4℃离心，收集细胞检测CD48的表达水平。

CD48除了在COPD中，在人类哮喘中也至关重要，CD48通过其配体CD244介导了肥大细胞和嗜酸性粒细胞导致的哮喘，且远高于在COPD中的作用。

如表6所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中的CD48显著上升，高低剂量的益母草碱和阳性药物组均可显著降低CD48的表达水平，且在各种药物处理中以益母草碱高剂量组的效果为最优，说明益母草碱著降低哮喘动物模型血清中CD48的表达，进而降低哮喘的发生。

表6：益母草碱对哮喘模型小鼠血清中CD48表达水平的影响

实施例5：益母草碱对HDM诱导的小鼠哮喘模型气道中白细胞分类的影响

将30只小鼠适应性喂养7天后，随机分为空白组、模型组、低剂量组(5mg/kg益母草碱)、高剂量组(30mg/kg益母草碱)、阳性药物组(1.0mg/kg的罗氟司特)，每组6只。除空白组外，其他组别的小鼠在第0、3、5、10、12、14天用HDM诱导哮喘模型，具体操作为于小鼠腹腔注射100μl麻醉剂，待小鼠麻醉后，取50μl致敏剂HDM，进行滴鼻和气管滴注双效致敏。低剂量组小鼠每天灌胃给药5mg/kg(体重)的益母草碱，高剂量组小鼠每天灌胃给药30mg/kg(体重)的益母草碱，阳性药物组每天灌胃给药1.0mg/kg的罗氟司特，连续喂药45天。在实验期间，所有小鼠均进行正常喂养，并每天观察小鼠的呼吸状态。

小鼠眼球取血后，采用脱颈椎处死，小鼠仰卧于手术操作台上，固定四肢，使用75％酒精对颈部消毒，充分暴露小鼠气管，在喉部附近插入18g气管插管针(针头稍磨平)，针头插入一定位置，切勿超过气管分叉处；用0.8mL预冷的PBS反复灌洗3次，收集肺泡灌洗液到2mL的EP管中，1000rpm、4℃离心，收集细胞，经瑞氏-吉姆萨染色，在显微镜下进行细胞分类计数。

白细胞是免疫进程中至关重要的一类细胞，细胞分类计数可以有效分析肺泡灌洗液BALF中白细胞比例的变化。在哮喘的发病过程中，浸润其支气管的炎症细胞主要是淋巴细胞和嗜酸性细胞。淋巴细胞能够扩大支气管粘膜上嗜酸性细胞的炎症反应，并且随着嗜酸性粒细胞的增多，会增加其在肺内聚集、活化以及与其它炎性细胞、炎性介质、细胞因子的相互作用，进而加重哮喘。

如表7所示，在肺泡灌洗液中，模型组淋巴细胞百分比较空白组显著增加，益母草碱低剂量和高剂量组均可显著降低淋巴细胞百分比；这与嗜酸性粒细胞结果相一致，模型组较空白组的嗜酸性粒细胞百分比显著上升，用药处理可显著抑制嗜酸性粒细胞的数量，说明益母草碱可以显著降低淋巴细胞、嗜酸性细的胞数量，从而起到减少炎症浸润、缓解哮喘的作用。

表7：益母草碱对HDM诱导小鼠哮喘模型气道中白细胞分类的影响：

实施例6：益母草碱对正常小鼠血清中肝脏转氨酶活性的影响

因为在上述研究的过程中发现阳性药物罗氟司特在1.0mg/kg时可引起小鼠毛发的打结以及不光滑现象，而且对小鼠的食欲有降低的趋势，但是益母草碱组却没有观察到同样的现象。因此，我们进一步通过检测肝脏转氨酶的活性评价益母草碱与罗氟司特的副作用。

将小鼠适应性喂养7天后，随机分为空白组、高剂量组(100mg/kg益母草碱)、阳性药物组(5.0mg/kg的罗氟司特)，每组5只。高剂量组小鼠每天灌胃给药100mg/kg(体重)的益母草碱，阳性药物组每天灌胃给药1.0mg/kg的罗氟司特，灌胃给药7天后，摘眼球取血，收集的血液静置30min后，3800rpm低温离心10min取上清，检测血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性。

结果如表8所示：益母草碱组对小鼠肝脏的谷丙转氨酶和谷草转氨酶没有影响；而药物罗氟司特却能够显著增加谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性，这可能是阳性药物引起的副作用的原因所在，也同时说明益母草碱使用安全，无肝脏副作用。

表8：益母草对正常小鼠血清肝脏ALT和AST活性的影响

注：与空白组相比较：*P＜0.05。

实施例7：益母草碱对支气管肺泡上皮细胞粘液中的脂氧合酶LOX的影响

MLE-12细胞接种于MEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，以每孔6000个细胞的量种植于96孔板中。以未加HDM诱导损伤的细胞作为空白组，添加HDM诱导损伤的细胞作为模型组，观察益母草碱低剂量(5μM)和高剂量(20μM)处理组对HDM诱导肺上皮细胞哮喘相关重要蛋白酶和细胞因子的影响，同时选用药物罗氟司特(1μM)作为阳性药物组。方法为：将培养的MLE-12细胞分别使用各种药物孵育24h后，用HDM诱导支气管肺泡上皮粘液分泌的增加而建立支气管哮喘细胞模型，药物与诱导剂和细胞共孵育24小时之后，用PBS清洗细胞3次，然后加入RIPA裂解液体并提取可溶性蛋白，用BCA定量后分装，采用生化检测试剂以及ELISA试剂测定脂氧合酶LOX的含量。

结果如表9所示，与空白组相比，模型组的LOX含量显著增加，高低剂量的益母草碱和阳性药物组可显著降低LOX的水平，且各种药物处理中以益母草碱高剂量组的效果最佳，并显著优于阳性药物罗氟司特效果，说明益母草碱能够作用于支气管上皮细胞并有效降低支气管肺泡上皮细胞中脂氧合酶的含量。

表9：益母草碱对HDM诱导的关键致哮喘介质脂氧合酶的影响

注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与空白组相比较：#P＜0.05。实施例8：益母草碱对支气管肺泡上皮细胞粘液中哮喘增敏介质E-caderin和N-cadherin的影响

MLE-12细胞接种于MEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，以每孔6000个细胞的量种植于96孔板中。以未加HDM诱导损伤的细胞作为空白组，添加HDM诱导损伤的细胞作为模型组，观察益母草碱低剂量(5μM)和高剂量(20μM)处理组对HDM诱导肺上皮细胞哮喘相关重要蛋白酶和细胞因子的影响，同时选用药物罗氟司特(1μM)作为阳性药物组。方法为：将培养的MLE-12细胞分别使用各种药物孵育24h后，用HDM诱导支气管肺泡上皮粘液分泌的增加而建立支气管哮喘细胞模型，药物与诱导剂和细胞共孵育24小时之后，用PBS清洗细胞3次，然后加入RIPA裂解液体并提取可溶性蛋白，用BCA定量后分装，通过Wester blot方法检测哮喘增敏介质E-cadherin(上皮细胞钙连蛋白)和N-cadherin(神经钙粘素)在支气管上皮细胞内的表达分布。

结果如表10所示，与空白组相比，模型组的E-caderin和N-cadherin的表达量显著增加，高低剂量的益母草碱和阳性药物组均可显著降低两者的表达水平，且各种药物处理中以益母草碱高剂量组的作用效果最佳，说明益母草碱能够作用于支气管上皮细胞，并能有效抑制哮喘增敏介质E-caderin和N-cadherin的增加，进而降低哮喘的发病几率。

表10：益母草碱对支气管肺泡上皮细胞中E-cad和N-cad的影响

实施例9：益母草碱对CTGF诱导的肺纤维化关键转化生长因子TGF-β、MMP9以及关键蛋白TIMP-2表达的影响

结缔组织生长因子(CTGF)是肺纤维化的关键蛋白。CTGF位于TGF-β信号的下游，目前纤维化模型多采用CTGF诱导而非TGF-β。

MLE-12细胞接种于MEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，以每孔6000个细胞的量种植于96孔板中。以未加CTGF诱导损伤的细胞作为空白组，添加CTGF诱导损伤的细胞作为模型组，观察益母草碱低剂量(5μM)和高剂量(20μM)处理组对CTGF诱导肺纤维化的重要蛋白和细胞因子的影响，其中阳性药物选择氯沙坦(2.5μM)。方法为：将培养的MLE-12细胞分别使用各种药物孵育24h后，用CTGF诱导支气管肺泡上皮纤维化疾病进展，药物与诱导剂和细胞共孵育24小时之后，用PBS清洗细胞3次，然后加入RIPA裂解液体并提取可溶性蛋白，用BCA定量后分装，通过ELISA方法检测转化生长因子TGF-β和基质金属蛋白酶MMP9以及TIMP-2在支气管上皮细胞内的表达分布。

结果如表11表明，与空白组相比，模型组TGF-β和MMP9以及TIMP-2的表达量显著增加，这是由于结缔组织生长因子CTGF可刺激I、III型胶原和纤维连接蛋白的合成，促进纤维化细胞外基质的沉积，同时也激活TGF-β和MMP9的信号途径，进一步加重肺纤维化；而高低剂量的益母草碱以及阳性药物可显著降低三者的水平，且各种药物处理中以益母草碱高剂量组效果最佳，并显著优于阳性药物氯沙坦的效果，说明所述的益母草碱能够作用于肺上皮细胞，有效逆转肺纤维化转化因子TGF-β的水平，并抑制细胞中MMP9和TIMP-2的表达。

表11：益母草碱对主导肺纤维化关键转化生长因子TGF-β、MMP9和TIMP-2表达的影响

注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与空白组相比较：#P＜0.05。实施例10：益母草碱对HDM诱导支气管肺泡上皮细胞哮喘模型中PDE酶活性、细胞内信号分子cAMP和PKA激酶的影响

本发明通过HDM刺激MLE-12细胞建立支气管哮喘细胞模型，这与多项研究报道的HDM可诱导并加重哮喘气道重塑结果相一致。具体实施如下：MLE-12细胞接种于MEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，将每孔6000个细胞种植于96孔板中，以未加HDM诱导损伤的细胞作为空白组，添加HDM诱导损伤的细胞作为模型组，观察益母草碱低剂量(5μM)和高剂量(20μM)处理组对HDM诱导肺上皮细胞的保护作用，同时选用药物罗氟司特(1μM)作为阳性药物组。进一步为：将培养的MLE-12细胞分别使用各种药物孵育24h后，用HDM诱导支气管肺泡上皮粘液分泌的增加而建立支气管哮喘细胞模型，药物与诱导剂和细胞共孵育24小时之后，用PBS清洗细胞3次，细胞消化离心之后分为2份，其中一份加入RIPA裂解液体并提取可溶性蛋白，用BCA定量后检测PDE的酶活性；另一份采用生化检测试剂测定cAMP的含量和PKA激酶活性。

结果如表12表明，与空白组相比，模型组PDE酶活性显著增加，而cAMP含量和PKA激酶活性显著下降，这是因为PDE酶作为细胞内降解cAMP的唯一蛋白酶，其活性的上调必然会导致cAMP降解的加速，而cAMP的下降引起PKA的磷酸化减少；而高低剂量的益母草碱和阳性药物均可显著抑制PDE酶活性，有效增加细胞内cAMP的水平和PKA酶活性；且各种药物处理中以益母草碱高剂量组的效果最佳，说明益母草碱能够作用于支气管上皮细胞，并且有效抑制PDE酶的活性来增加cAMP的含量，从而有效增加cAMP下游PKA激酶的活性，从而有效缓解或防止COPD和支气管哮喘症状或降低哮喘的发生，以及有效缓解肺的呼吸困难和气管的痉挛症状。

表12：益母草碱对HDM诱导哮喘细胞模型中PDE酶活性和细胞内信号分子cAMP的影响

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.益母草碱或其药学上可接受的盐作为唯一活性成分在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的应用，其特征在于：所述呼吸系统疾病为慢阻肺、哮喘；所述益母草碱的每日成人给药剂量为30 mg/kg/d -500 mg/kg/d。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述益母草碱能够增强肺功能，并降低肺泡中的中性粒细胞的数量、白三烯和组胺的含量。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述益母草碱能够显著降低血清中IgE的含量和气道中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数量，以及抑制血清中CD48的分泌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为分散片、含片、口崩片、缓释片、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、粉针剂或气雾剂。