CN110870862A - 岩白菜素在制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌感染药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种岩白菜素在在制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌药物中的用途，属于生物及医药技术领域。本发明证明了岩白菜素可以通过改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞生存率下降，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞氧化损伤，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的炎症反应，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的肺部损伤，降低肺部的肺炎克雷伯氏菌感染，抑制ERK，JNK，p38磷酸化以及抑制IκB和p65磷酸化来治疗肺炎克雷伯氏菌感染，本发明有助于岩白菜素的进一步开发利用。

Description

岩白菜素在制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌感染药物中的用途
技术领域
本发明属于生物及医药技术领域，尤其涉及岩白菜素在制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌感染药物中的用途。
背景技术
肺炎克雷伯氏菌是一种革兰氏阴性细菌，可以快速适应宿主环境，持续存活很长时间，并诱导抗菌素耐药性。LPS作为革兰氏阴性菌的结构成分，是导致肺损伤和肺炎的主要因素，包括肺泡上皮细胞通透性，炎性细胞因子释放，氧化应激等。
目前，通常采用抗生素来治疗肺炎克雷伯氏菌所引起的肺炎。但是近年来，肺炎克雷伯氏菌引起的感染率逐年增高，且多耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。对于抗生素抗炎药物的过度使用和误用可能是导致肺炎克雷伯氏菌耐药性增加的重要原因。探索治疗动植物感染的良好治疗方法，发现和探索可以替代抗生素的药物已成为目前广大学者和科研人员关注的焦点。中药在我国具有独特的优势，迄今为止，从中药中发现了多种新的治疗分子。最重要的是，由于中药的特殊性质，中药很少产生毒性和耐药性。
岩白菜素(Bergenin monohydrate，Bm)是最早从虎耳草科岩白菜属植物中分离得到而得名的一类异香豆素类化合物；其分子式为C14H16O9，分子量为 328.27，CAS NO.477-90-7，结构式如下图所示：
Figure BDA0002306951100000011
岩白菜具有解热、镇痛、镇咳、祛痰、保护肾脏、抗糖尿病、抗HIV和抗凝血等活性作用。截至目前为止，已有很多有关岩白菜提取物的药理作用的研究，但大部分研究都集中于岩白菜而非岩白菜素单体。目前，岩白菜素在制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌药物中的用途尚无报道。
发明内容
本发明的目的在于丰富岩白菜素的医药用途以及针对现有技术中肺炎克雷伯氏菌治疗中存在不足的问题，提出一种岩白菜素在制备抗体内肺炎克雷伯氏菌活性药物中的新用途。
为实现上述目的，本发明提供了一种岩白菜素在制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌感染药物中的用途。
其次，本发明还提供了岩白菜素在制备治疗肺炎克雷伯氏菌感染引起的肺炎药物中的用途。
优选地，所述用途包括：使用岩白菜素改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞生存率下降。
优选地，所述用途包括，使用岩白菜素改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞氧化损伤。
优选地，所述用途包括，使用岩白菜素改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的炎症反应。
优选地，所述用途包括，使用岩白菜素改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的肺部损伤。
优选地，所述用途包括，使用岩白菜素降低肺部的肺炎克雷伯氏菌感染。
优选地，所述用途包括，使用岩白菜素抑制ERK，JNK，p38磷酸化来改善肺炎克雷伯氏菌感染。
优选地，所述用途包括，使用岩白菜素抑制IκB和p65磷酸化来改善肺炎克雷伯氏菌感染。
优选地，所述岩白素可与药学上可接受的载体混合用于制备抗体内肺炎克雷伯氏菌药物。
本发明的有益效果在于：
1.本发明提供了一种岩白菜素在制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌感染药物以及制备治疗肺炎克雷伯氏菌感染引起的肺炎活性药物中的新用途。
2.本发明发现岩白菜素可以通过改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞生存率下降，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞氧化损伤，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的炎症反应，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的肺部损伤，降低肺部的肺炎克雷伯氏菌感染，抑制ERK，JNK，p38磷酸化，抑制IκB和 p65磷酸化来改善和治疗肺炎克雷伯氏菌感染所引起的肺炎。
3.岩白菜素来源于岩白菜的提取物中，具有毒性小、疗效好的特点，同时，使用岩白菜素治疗肺炎克雷伯氏菌可以减少抗生素的使用。
附图说明
图1岩白菜素对细胞生存率的影响。
图2岩白菜素对ROS含量的影响。
图3岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染小鼠肺灌洗液中炎性细胞因子分泌的影响。
(A)IL-1β(B)IL-6(C)PGE2(D)TNF-α
图4岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染小鼠肺组织氧化应激标志物水平的影响。
(A)MPO(B)MDA(C)SOD(D)GSH
图5岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染小鼠肺病理的影响。
(A)岩白菜素处理对肺炎克雷伯氏菌感染的小鼠的肺菌液含量。(B)HE 染色来自实验小鼠的肺组织(a)PBS阴性对照(b)肺炎克雷伯氏菌组(c)0， (d)75，(e)150(f)300μg/kg和(g)地塞米松处理的肺炎克雷伯氏菌感染的小鼠。黑箭头：病理变化。
图6岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染的小鼠肺组织蛋白中MAPK，NF-κB 通路的影响。
(A)岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染的小鼠肺组织蛋白中p38，ERK和 JNK磷酸化的影响。(B)岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染的小鼠肺组织蛋白中 IκB和NF-κB的磷酸化的影响。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
岩白菜素对细胞生存率的影响
实验方式：
实验分为6组，分别为空白对照组，肺炎克雷伯氏菌组，岩白菜素低剂量组，岩白菜素中剂量组，岩白菜素高剂量组，地塞米松组。
处理方式如下：
将RAW 264.7细胞接种到96孔板(2×106个细胞/孔)中培养24小时，之后加入低、中和高剂量的岩白菜素(1.5，3，6μg/ml)，处理时间1小时；且加入地塞米松(Dexamethasone，Dex)作为阳性对照(100μg/ml)，处理时间1小时；然后将细胞暴露于肺炎克雷伯氏菌环境24小时；空白对照组不进行任何处理；肺炎克雷伯氏菌组仅进行肺炎克雷伯氏菌处理，不添加其他药物。
随后，用PBS将96孔板洗涤两次，将MTT(5mg/ml)加入到细胞中，然后再孵育4小时。加入DMSO溶解，在570nm测定吸光度。
实验结果：
表1岩白菜素对细胞生存率的影响
Figure BDA0002306951100000041
(所有数据均以均值±SEM表示(n＝5)##P<0.01与空白对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与肺炎克雷伯氏菌组比较。)
用岩白菜素(1.5，3，6μg/ml)处理的RAW264.7细胞在肺炎克雷伯氏菌感染后的细胞生存率如图1和表1所示，肺炎克雷伯氏菌组与空白对照组相比，细胞生存率降低至79.28％，差异极其显著(P＜0.01)，证明本发明的造模成功；岩白菜素低，中和高剂量组与肺炎克雷伯氏菌组相比，细胞生存率提高，差异显著(P＜0.05)。且细胞生存率和岩白菜素低，中和高剂量组呈剂量依赖性。表明岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌处理的细胞具有保护作用。
实施例2
岩白菜素对细胞抗氧化作用的影响
实验方式：
实验分为6组，分别是：空白对照组，肺炎克雷伯氏菌组，岩白菜素低剂量组，岩白菜素中剂量组，岩白菜素高剂量组，地塞米松组。
处理方式如下：
1.将RAW 264.7细胞接种到96孔板(2×10 4个细胞/孔)中培养24小时，之后加入低、中和高剂量的岩白菜素(1.5，3，6μg/ml)，处理时间1小时；且加入地塞米松(Dex)作为阳性对照(100μg/ml)，处理时间1小时；然后将细胞暴露于肺炎克雷伯氏菌环境24小时；空白对照组不进行处理，肺炎克雷伯氏菌组仅进行肺炎克雷伯氏菌处理，不添加其他药物。
之后，用冰冷PBS洗涤细胞两次，进行DCFH-DA染色，染色时间20min。
2.测量ROS产生：
通过流式细胞仪和酶标仪在485nm和535nm的激发和发射波长下检测上述6组实验分别的ROS含量。
实验结果
表2岩白菜素对于ROS含量的影响
Figure BDA0002306951100000051
(所有数据均以均值±SEM表示(n＝5)##P<0.01与空白对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与肺炎克雷伯氏菌组比较。)
用岩白菜素(1.5，3，6μg/ml)处理的RAW264.7在肺炎克雷伯氏菌感染后细胞的ROS含量如图2和表2所示，肺炎克雷伯氏菌组与空白对照组相比， ROS含量升高至8.61％，差异极其显著(P＜0.01)，证明本发明的造模成功；岩白菜素低、中和高剂量组与肺炎克雷伯氏菌组相比，ROS含量降低，差异显著(P＜0.05)。且ROS含量和岩白菜素低、中和高剂量组呈剂量依赖性。表明岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌处理的细胞具有抗氧化损伤的作用。
实施例3
岩白素素对于肺炎克雷伯氏菌感染的肺炎小鼠的抗炎作用
实验分为6组，分别是：空白对照组，肺炎克雷伯氏菌组，岩白菜素低剂量组，岩白菜素中剂量组，岩白菜素高剂量组，地塞米松组。
1.动物模型的建立与攻毒
BALB/c雄性小鼠分为6组分别为空白对照组、肺炎克雷伯氏菌组、地塞米松组(100μg/ml)、岩白菜素低、中和高剂量组(75、150、300μg/kg)，每组各15只。将地塞米松，低、中和高剂量岩白菜素采取皮下注射的方式注射到小鼠体内。一小时后，除空白对照组外，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，鼻内感染30μl克雷伯氏杆菌悬浮液(2×107CFU)，感染后48小时对小鼠进行颈脱位。空白对照组不做任何操作，肺炎克雷伯氏菌组仅进行肺炎克雷伯氏菌感染不进行药物处理。
每组5只处死用于测量肺部菌含量，每组5只处死用于收集肺部洗涤液，每组5只左肺用于做病理学切片和右肺用于制作肺组织匀浆和Western Blot 检测。
2.小鼠肺部洗条液中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、PEG2的检测
将小鼠处死，用手术刀切开胸廓，暴露气管，在气管上开一小口。注射器吸入0.5ml生理盐水，将肺部洗涤硅胶管套上针头，插入气管，注入生理盐水，轻轻按摩胸腔10s，将肺部洗涤液吸出，放入1.5ml离心管，重复上述操作一次，再次将肺部洗涤液放入该1.5ml离心管。使用特异性ELISA试剂盒测量肺部洗条液中炎性细胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β和PEG2的水平。
实验结果
表3岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染小鼠肺灌洗液中炎性细胞因子含量的影响
Figure BDA0002306951100000061
Figure BDA0002306951100000071
(所有数据均以均值±SEM表示(n＝5)##P<0.01与空白对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与肺炎克雷伯氏菌组比较。)
用白菜素(75，150，300μg/ml)处理的肺炎小鼠在肺炎克雷伯氏菌感染后小鼠肺部洗涤液中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2含量如图3和表3所示。肺炎克雷伯氏菌组与空白对照组相比，TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2等炎症介质含量升高至139.90ng/L、16.65ng/L、28.09ng/L、184.18ng/L，差异极其显著(P＜0.01)，证明本发明的造模成功。用药组与肺炎克雷伯氏菌组相比，岩白菜素低、中和高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6、PEG2等炎症因子含量均降低，差异显著(P＜0.05)。且TNF-α、IL-1β、IL-6、PEG2等炎症因子含量和岩白菜素低，中和高剂量组呈剂量依赖性。表明岩白菜素可以降低小鼠的炎症反应来保护肺炎克雷伯氏菌感染的肺炎小鼠。
实施例4
岩白菜素对肺炎小鼠的抗氧化作用
实验方式
分组和处理同实施例3动物模型的建立和攻毒，取各组小鼠的肺组织匀浆进行2500r/min离心10min，取匀浆上清液。为了检查在肺组织中中性粒细胞的积累和脂质过氧化水平，使用市售的测定试剂盒评估MPO和MDA含量。此外，为了进一步测量肺组织中的抗氧化酶活性，使用市售的测定试剂盒评估SOD和 GSH含量。
实验结果
表4岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染小鼠肺组织氧化应激标志物水平的影响
Figure BDA0002306951100000081
(所有数据均以均值±SEM表示(n＝5)##P<0.01与空白对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与肺炎克雷伯氏菌组比较。)
用岩白菜素(75，150，300μg/ml)处理的肺炎小鼠在肺炎克雷伯氏菌感染后小鼠肺部匀浆上清液中MPO、MDA、SOD、GSH含量如图4和表4所示。肺炎克雷伯氏菌组与空白对照组相比，MPO、MDA均升高至3.23U/g、4.52 nmol/mg，SOD、GSH均降低至19.90U/mg、127.80μmol/L，差异极其显著(P ＜0.01)，证明本发明的造模成功。用药组与肺炎克雷伯氏菌组相比，岩白菜素低、中和高剂量组MPO、MDA降低，SOD、GSH的升高，差异显著(P＜0.05)，且MPO、MDA降低和SOD、GSH的升高与岩白菜素低，中和高剂量组呈剂量依赖性。表明岩白菜素可以通过降低肺部氧化损伤来保护肺炎克雷伯氏菌感染的肺炎小鼠。
实施例5
岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染的肺炎小鼠的肺部肺炎克雷伯氏菌菌液含量的影响
实验方式
分组和处理同实施例3动物模型的建立和攻毒，取肺组织匀浆液，并将匀浆液稀释，在MH琼脂糖培养基上划板，在37℃细菌培养箱中培养24小时后进行菌落计数。
实验结果
用低、中和高剂量岩白菜素(75，150，300μg/ml)处理的肺炎小鼠在肺炎克雷伯氏菌感染后小鼠肺部克雷伯氏菌含量如图5-A所示。空白对照组与肺炎克雷伯氏菌组比较，肺炎克雷伯氏菌组的肺部菌液含量高于空白对照组，证明造模成功。用药组与肺炎克雷伯氏菌组相比，岩白菜素低、中和高剂量组的肺部菌液含量降低，差异显著(P＜0.05)。且肺部菌液含量与岩白菜素低、中和高剂量组呈剂量依赖性。表明岩白菜素可以通过降低肺炎克雷伯氏菌的感染来保护肺炎克雷伯氏菌感染的肺炎小鼠。
实施例6
岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染小鼠肺病理的影响
实验方式
分组和处理同实施例3动物模型的建立和攻毒，之后通过免疫组化分别对每组小鼠的肺部组织切片进行染色。
实验结果
用岩白菜素(75，150，300μg/ml)处理的肺炎小鼠在肺炎克雷伯氏菌感染后小鼠肺部病理切片如图5-B所示，空白对照组与肺炎克雷伯氏菌组比较，肺炎克雷伯氏菌组的肺部损伤程度高于肺炎克雷伯氏菌组，差异显著(P＜ 0.05)，证明造模成功。岩白菜素低、中和高剂量组和阳性对照组的肺部损伤程度和炎症反应均比肺炎克雷伯氏菌组低，且肺部损伤程度和炎症反应与岩白菜素低、中和高剂量组呈剂量依赖性。表明岩白菜素可以通过降低肺部损伤来保护肺炎克雷伯氏菌感染的肺炎小鼠。
实施例7
岩白菜素对肺炎克雷伯氏菌感染小鼠的肺组织蛋白中MAPK，NF-κB通路的影响
实验方式
实验分为5组，分别是空白对照组，肺炎克雷伯氏菌组，岩白菜素低、中和高剂量组(75，150，300μg/ml)
处理同实施例3动物模型的建立和攻毒，提取每组小鼠的肺组织蛋白，之后使用Western blot技术检测每组小鼠的肺组织蛋白中P-ERK,ERK,P-JNK, JNK,P-P38,P38，IκB，p65，P-IκB,P-P65,β-actin蛋白的表达情况。
实验结果
用岩白菜素(75，150，300μg/ml)处理的肺炎小鼠在肺炎克雷伯氏菌感染后小鼠肺部ERK、JNK、p38磷酸化程度如图6-A所示，肺炎克雷伯氏菌组与空白对照组相比，ERK、JNK、p38磷酸化程度均升高，差异极其显著(P＜0.01) 证明造模成功；用药组与肺炎克雷伯氏菌组相比，岩白菜素低、中和高剂量组 ERK、JNK、p38磷酸化程度均降低，岩白菜素I高、中剂量组差异显著(P＜0.05)。且ERK、JNK、p38磷酸化降低程度与岩白菜素低、中和高剂量组呈剂量依赖性。
用岩白菜素(75，150，300μg/ml)处理的肺炎小鼠在肺炎克雷伯氏菌感染后小鼠肺部IκB和p65磷酸化程度如图6-B所示，肺炎克雷伯氏菌组与空白对照组相比，IκB和p65磷酸化程度均升高，差异极其显著(P＜0.01) 证明造模成功；用药组与肺炎克雷伯氏菌组相比，岩白菜素低、中和高剂量组 IκB和p65磷酸化程度均降低，岩白菜素低、中和高剂量组差异显著(P＜ 0.05)。且IκB和p65磷酸化降低程度与岩白菜素低、中和高剂量组呈剂量依赖性。
综上所述，岩白菜素可以通过改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞生存率下降，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞氧化损伤，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的炎症反应，改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的肺部损伤，降低肺部的肺炎克雷伯氏菌感染，抑制ERK，JNK，p38磷酸化以及抑制IκB和p65 磷酸化来治疗肺炎克雷伯氏菌感染。

Claims (10)

1.岩白菜素在制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌感染药物中的用途。
2.岩白菜素在制备治疗肺炎克雷伯氏菌感染引起的肺炎药物中的用途。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包括：使用岩白菜素改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞生存率下降。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包括，使用岩白菜素改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的细胞氧化损伤。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述用途包括，使用岩白菜素改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的炎症反应。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述用途包括，使用岩白菜素改善肺炎克雷伯氏菌感染所引起的肺部损伤。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述用途包括，使用岩白菜素降低肺部的肺炎克雷伯氏菌感染。
8.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述用途包括，使用岩白菜素抑制ERK，JNK，p38磷酸化来改善肺炎克雷伯氏菌感染。
9.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述用途包括，使用岩白菜素抑制IκB和p65磷酸化来改善肺炎克雷伯氏菌感染。
10.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述岩白菜素可与药学上可接受的载体混合用于制备治疗体内肺炎克雷伯氏菌感染药物。
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