CN111067898B - 盐酸小檗碱在水产养殖中抗鲤疱疹病毒ⅱ型的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鱼类抗病毒药物,公开了盐酸小檗碱在水产养殖中抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的用途,特别是盐酸小檗碱(BBH)在制备鱼类抗鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV‑2)药物中的用途,以盐酸小檗碱为活性成分,且其一次性使用剂量不低于50mg/Kg,给药方式为拌饲投喂。本发明发现盐酸小檗碱具有抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的功能,可用于水产养殖中鱼类预防和控制鲤疱疹病毒Ⅱ型,且效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类抗病毒药物,具体涉及盐酸小檗碱在水产养殖中抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的用途。
背景技术
鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinidherpesvirus2,CyHV-2)是一种引起金鱼和鲫造血器官坏死病的高致病性病毒,严重危害鲫和金鱼养殖业,2012年导致江苏异育银鲫发病面积约3万hm2,发病区域死亡率在50%以上,严重地区达90%,部分养殖池塘绝收,造成严重的经济损失。
目前,防控鲤疱疹病毒Ⅱ型方法主要有:
1)加入免疫抑制剂。如在饲料中拌入酵母多糖,适量添加多种维生素、免疫多糖制剂以及肠道微生态制剂等可明显提高鱼体细胞免疫活性,改善鱼体内代谢环境,提高鱼体健康水平和抗感染能力。
2)改善养殖模式。改善单养异育银鲫为多品种混养,改善养殖环境来减少疾病风险;或使用光合细菌、芽孢杆菌、反硝化细菌等微生态制剂以及底质改良剂和水质调节剂,有效保持养殖水环境的稳定,减少鱼体应激。
3)外用药物防治。如碘制剂用于鱼卵消毒与水体消毒来防治病毒性疾病。
4)利用鲤疱疹病毒Ⅱ型体外细胞感染模型扩增病毒制备灭活疫苗或利用感染鲤疱疹病毒Ⅱ型鲫鱼制备组织灭活的疫苗预防鲫造血器官坏死病。
但是,采用上述免疫抑制剂、改善养殖模式或外用消毒剂防治等方法缺乏特异性,效果不显著;采用灭活疫苗防控鲤疱疹病毒Ⅱ型目前尚没有商品化上市的产品,且研究级的中试产品稳定性较差、保护利率较低,操作复杂。
盐酸小檗碱(Berberine hydrochloride,BBH)是一种异喹啉生物碱,又称为黄连素,是中药黄连、黄柏根茎中的主要成分。研究发现盐酸小檗碱具有广谱抗菌作用,体外对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑制作用,对溶血性琏球菌(Staphylococcus haemolytica)、金色葡萄球菌(Staphk,lococcusaureus)、痢疾杆菌(Shigella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弧菌(Vibrio)等均有较强的抑制作用,水产养殖中多用于治疗细菌性肠炎病、鳗鲡红点病、鳖红脖子病、龟肠胃炎等细菌性疾病目前还未见关于盐酸小檗碱抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的研究报道。
发明内容
本发明提供盐酸小檗碱(BBH)在水产养殖中抗鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的用途,特别是盐酸小檗碱在制备鱼类抗鲤疱疹病毒Ⅱ型药物中的用途。
本发明还提供一种鱼类抗鲤疱疹病毒Ⅱ型药物,以所述的盐酸小檗碱为活性成分,或还包括药学上可接受的辅料或辅助成分。
在优选的实施方案中,所述盐酸小檗碱的一次性使用剂量不低于50mg/Kg;和/或所述药物的剂型为粉剂;和/或所述药物的给药方式为拌饲投喂。
与现有技术相比,本发明发现盐酸小檗碱具有抗鲤疱疹病毒Ⅱ型活性的功能,可用于水产养殖中鱼类预防和控制鲤疱疹病毒Ⅱ型,且效果显著。
附图说明
图1是100%BBH孵育RyuF-2细胞120h后的细胞活性。
图2是CyHV-2感染RyuF-2细胞120h后细胞病变情况的电镜照片。
图3是不同BBH浓度孵育120h后CyHV-2感染RyuF-2细胞感染率。
图4是不同BBH浓度孵育120h后CyHV-2感染RyuF-2细胞中CyHV-2病毒主要基因复制情况。
图5是口灌不同剂量的55.42%BBH后感染CyHV-2异育银鲫的死亡数。
图6是口灌不同剂量的55.42%BBH后异育银鲫各组织内的药代动曲线,其中,A:血液,B:肝胰脏,C:肾脏。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
下面实施例中以RyuF-2细胞(金鱼鳍条细胞)验证盐酸小檗碱对鲤疱疹病毒Ⅱ型的作用,所用原料100%纯度的BBH购自selleck公司。其中,盐酸小檗碱(BBH),又名盐酸黄连素、盐酸小檗碱、小檗碱盐酸盐,CAS号为633-65-8,分子式为C20H18NO4.Cl,结构式为
熔点200℃,黄色结晶性粉末,无臭,或微有特异性的气味,味极苦;溶于热水,微溶于冷水或乙醇,极微溶于氯仿,不溶于乙醚。其药理作用:对痢疾杆菌、霍乱菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、变形杆菌有抗菌作用,与肠内的产生吲哚、甲基吲哚等有害氨基物的酶相拮抗,抑制肠内的腐败发酵,抑制离体的肠道蠕动作用,促进肝脏内胆汁的生成,有促进胆汁分泌的作用。
(1)体外抗病毒实验用RyuF-2细胞培养,方法如下:将购得的Medium199培养基,另加入10%胎牛血清、1%青霉素。再将RyuF-2细胞用胰酶消化后,传入T25瓶,待细胞长至95%时更换为维持培养基(内含5%胎牛血清的M199培养基)。
(2)BBH处理RyuF-2细胞,方法如下:
5μg/mLBBH:加入含5μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
10μg/mLBBH:加入含10μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
15μg/mLBBH:加入含15μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
20μg/mLBBH:加入含20μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
25μg/mLBBH:加入含25μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
12.5μLDMSO:加入12.5μLDMSO(抵消同等体积用于溶解BBH给实验带来的影响)处理120h后取样。
NC:空白处理组,120h后取样。
(3)BBH处理鲤疱疹病毒Ⅱ型感染RyuF-2细胞,方法如下:
5μg/mLBBH+CyHV-2:加入含5μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h,然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI=0.001),病毒吸附2h后吸出,更换为含5μg/mLBBH的M199维持培养基,120h后取样。
10μg/mLBBH+CyHV-2:加入含10μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h,然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI=0.001),病毒吸附2h后吸出,更换为含10μg/mLBBH的M199维持培养基,120h后取样。
15μg/mLBBH+CyHV-2:加入含15μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h,然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI=0.001),病毒吸附2h后吸出,更换为含15μg/mLBBH的M199维持培养基,120h后取样。
20μg/mLBBH+CyHV-2:加入含20μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h,然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI=0.001),病毒吸附2h后吸出,更换为含20μg/mLBBH的M199维持培养基,120h后取样。
25μg/mLBBH+CyHV-2:加入含25μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h,然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI=0.001),病毒吸附2h后吸出,更换为含25μg/mLBBH的M199维持培养基,120h后取样。
CyHV-2:加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI=0.001),病毒吸附2h后吸出,更换为M199维持培养基,120h后取样。
12.5μLDMSO+CyHV-2:加入12.5μLDMSO(抵消同等体积用于溶解BBH给实验带来的影响),加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI=0.001),病毒吸附2h后吸出,更换为M199维持培养基,120h后取样。
12.5μLDMSO:加入12.5μLDMSO(抵消同体积用于溶解BBH给实验带来的影响),120h后取样。
NC:空白处理组,120h后取样。
通过显微镜观察并拍照,100%BBH孵育RyuF-2细胞120h后的细胞活性如图1所示,可见不同浓度细胞活性均适用于以下实施例试验。
如图2所示,CyHV-2感染细胞120h后细胞病变情况可以看出:CyHV-2处理组、12.5μLDMSO+CyHV-2处理组出现明显CPE;5μg/mLBBH+CyHV-2处理组出现明显CPE,但CPE数量随着BBH浓度增大而减少;NC组、12.5μLDMSO组、10μg/mLBBH+CyHV-2处理组、15μg/mLBBH+CyHV-2处理组、20μg/mLBBH+CyHV-2、25μg/mLBBH+CyHV-2未出现CPE。
通过荧光定量检测不同BBH浓度孵育120h后CyHV-2感染RyuF-2细胞,感染率和病毒基因复制情况分别如图3(荧光定量分析病毒ORF54基因从而定量检测细胞上清中病毒的滴度)和4(荧光定量分析细胞中病毒关键基因的复制情况,评估BBH对病毒复制的抑制作用)所示,验证CyHV-2的ORF54、ORF121、ORF141、ORF147、ORF155极早期基因,CyHV-2处理组、12.5μLDMSO+CyHV-2处理组、5μg/mLBBH+CyHV-2处理组感染率达100%以上,10μg/mLBBH+CyHV-2处理组、15μg/mLBBH+CyHV-2处理组、20μg/mLBBH+CyHV-2、25μg/mLBBH+CyHV-2处理组感染率都低于50%。100%BBH孵育120h后对极早期基因和晚期基因ORF54,121,141,147,155,72有显著性的抑制作用。
以下通过药理药效学试验对本发明进一步解释说明。
实施例1
BBH体外抗病毒实验。分别设置为如下五个实验组,每组有15条鱼,开展为期15天的实验:
NC:空白处理组;
0mg/kg+CyHV-2:注射400μL CyHV-2;
10mg/kg+CyHV-2:注射400μL CyHV-2 24h后口灌10mg/kg55.42%BBH;
30mg/kg+CyHV-2:注射400μL CyHV-2 24h后口灌30mg/kg55.42%BBH;
50mg/kg+CyHV-2:注射400μL CyHV-2 24h后口灌50mg/kg55.42%BBH。
上述各组分别口灌不同剂量的55.42%BBH后感染CyHV-2异育银鲫后,观察病记录每天每组异育银鲫死亡数量如表1和图5所示,NC组、0mg/kg+CyHV-2组、10mg/kg+CyHV-2组、30mg/kg+CyHV-2、50mg/kg+CyHV-215天内累计死亡率分别为0%,100%,100%,73.3%,60%。
表1:口灌不同剂量的55.42%BBH后感染CyHV-2异育银鲫的死亡数。
实施例2
药代动力学实验。分别设置为如下三个实验组:
10mg/kg组:口灌10mg/kg55.42%BBH后分别取1,1.5,4,6,8,12,24,48,72h的血液、肝胰脏、肾脏组织;
30mg/kg组:口灌30mg/kg55.42%BBH后分别取1,1.5,4,6,8,12,24,48,72h的血液、肝胰脏、肾脏组织;
50mg/kg组:口灌50mg/kg55.42%BBH后分别取1,1.5,4,6,8,12,24,48,72h的血液、肝胰脏、肾脏组织。
如表2、表3和图6所示,可以看出在肝胰脏内的BBH含量>肾脏内BBH含量>血液内BBH含量。
表2:鲫鱼血液、肝胰脏及肾脏中BBH的回收率和变异系数
表3:不同剂量盐酸小檗碱口灌剂量在异育银鲫各组织内的药代动力学参数
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中,而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理,不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.盐酸小檗碱在制备鱼类抗鲤疱疹病毒Ⅱ型药物中的用途,所述盐酸小檗碱的一次性使用剂量不低于50mg/kg,给药方式为拌饲投喂。
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