KR20200051940A - Ebv 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대극 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 PKC/MEK 경로를 통해 EBV의 용균을 효과적으로 유도함으로써, EBV 양성 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있고, 이를 통해 EBV 관련 질환, 특히 EBV 관련 위암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

EBV 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A Pharmaceutical Composition For Preventing Or Treating EBV-related Disease}
본 발명은 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
전세계 인구의 90%가 감염되어 있는 것으로 알려진 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV)는 허피스 바이러스 과에 속하는 이중가닥(double-stranded) DNA 바이러스로서, 멤브레인, 당 단백질, 외피(tegument) 및 캡시드(capsid)로 이루어져 있다. 이러한 EBV는 주로 버킷 림포마, 호지킨 림포마와 같은 암을 유발할 수 있는 것으로 보고되어 있는데, 최근에는 위암과의 관련성이 보고되면서 그 위험성이 더욱 주목 받고 있다.
이와 같이 EBV와 관련성이 있는 위암을 EBV 관련 위암(EBV-associated gastric carcinoma)이라고 하는데, 전세계의 위암 환자 중 10%에 해당하는 비율이 EBV 관련 위암 환자에 해당한다. 특히 한국은 위암에 의한 사망률이 다른 나라에 비해 훨씬 높은 편인데, 그 중에서도 EBV 관련 위암의 비율이 13%로 다른 나라에 비해 높은 편이어서 이에 대한 효과적인 치료 전략이 필요한 실정이다.
상기와 같은 EBV는 주로 타액을 통해 감염되는데, 주로 인후두 상피세포에서 감염을 일으켜 우선적으로 B 세포를 표적화한다. 상기와 같이 감염이 되더라도, 대부분의 EBV 등의 바이러스는 숙주의 면역체계에 의해 제거되지만, 살아남은 바이러스는 잠복 상태로 전환되어, 제한적인 유전자만을 발현하는 거의 비활성 상태로 존재하면서 숙주의 면역체계에 의한 감시를 회피한다. 그렇기 때문에, 종래 활성화 상태의 바이러스를 공략하는 -간시클로버(ganciclovir; GCV)와 같은 치료제는 비활성화 상태의 EBV를 완전히 제거하는데 한계가 있다. 또한, EVB로 인한 위암의 발병 기전이 명확하게 밝혀지지는 않았으나, 잠복 상태로 존재하는 EBV에서 발현되는 EBER, LMP2A, BARF1, EBNA1 및 EBV miRNA에 의해 위암이 유발될 수 있는 것으로 보고되었다. 따라서 결국 EBV 관련 위암 등과 같이 EBV에 의해 발병하는 질환를 효과적으로 치료하기 위해서는, 잠복 상태로 존재하는 바이러스를 활성화 상태인 용균 상태로 유도하여 숙주의 면역체계나 간시클로버 등과 같은 치료제에 노출될 수 있도록 하는 과정을 동반하여야 한다.
잠복 상태의 EBV를 활성화시키는 것을 용균(lytic) 유도라고 하는데, 아직까지 EBV의 용균을 효과적으로 유도하여 EBV 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질이 없는 실정이다.
본 발명은 EBV의 용균을 유도하여 EBV 관련 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 위와 같이 EBV 관련 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 유효성분을 효과적으로 선별할 수 있는 형질전환된 센서 세포와, 이를 이용한 선별 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대극 속(Euphorbia) 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 EBV(Epstein-Barr virus) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대극 속(Euphorbia) 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 EBV 관련 질환의 치료 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 숙주 세포에, ZTA 프로모터 및 상기 ZTA 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 리포터 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트가 형질도입된, EBV의 용균(lytic) 유도 물질을 선별하기 위한 센서 세포를 제공한다.
본 발명의 조성물은 PKC/MEK 경로를 통해 EBV의 용균을 효과적으로 유도함으로써 EBV 양성 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는바, EBV 관련 질환, 특히 EBV 관련 위암을 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 센서 세포를 이용하는 경우, EBV의 용균과 관련된 유전자의 프로모터 활성을 측정하여 EBV의 용균을 유도하는 물질을 효과적으로 선별할 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1의 A는 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템의 벡터 모식도를 나타낸 것이고, B는 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템을 통해 루시퍼라아제의 활성을 측정하여 EBV 용균 유도 효과를 정량적으로 측정할 수 있음을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 A 내지 C는 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템을 이용한 대극 추출물의 EBV의 용균 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고, B는 대극 추출물에 의한 세포 생존도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4 는 위암 세포에서 대극 추출물에 의한 EBV의 용균 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A 및 B는 대극 추출물에 의한 EBV 용균 유도와 관련된 세포 신호전달을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 5의 C 내지 E는 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템을 이용한 PKC/MEK 경로를 통한 EBV의 용균 유도 효과 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 A 및 B는 대극 추출물의 EBV 양성 세포에 대한 선택적 세포 사멸 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. EBV ( Epstein - Barr virus) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명의 일 측면은 EBV 관련 질환(EBV-related disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 대극(Euphorbia) 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 대극(Euphorbia) 속 식물은 대극(Euphorbia pekinensis RUPR .), 유동(Aleurites fordii) 및 감수(Euphorbia kansui)일 수 있고, 바람직하게는 대극일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 대극(Euphorbia pekinensis RUPR .)은 피자식물문 쌍떡잎식물강 쥐손이풀목 대극과 여러해살이풀로서 능수버들, 버들옻 및 우독초의 이명을 가진다. 이러한 대극은 이뇨작용이 있어 전신부종을 가라앉히기 위해 사용되며, 장관을 자극하여 변비에도 효능이 있다.
상기 대극 추출물은 대극의 뿌리, 줄기, 잎으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나로부터 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는 대극의 뿌리 추출물일 수 있다.
상기 대극 속 식물의 추출물은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용매를 이용한 추출법, 이산화탄소에 의한 감압 추출법, 고온에 의한 초임계 추출법, 초음파를 이용한 추출법 및 열수 추출법 등과 같은 방법을 적절하게 선택하여 얻을 수 있고, 바람직하게는 용매를 이용한 추출법을 통해 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매를 이용한 추출법을 이용하는 경우, 예를 들어, 하기와 같은 단계로 제조될 수 있다: 1) 대극 속 식물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축하는 단계; 및 4) 단계 4)의 농축물을 동결 건조하는 단계.
상기 대극 속 식물은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물, 바람직하게는 C1 내지 C6의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용할 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 용매의 양은 대극 속 식물 건조 중량의 2 내지 15배, 또는 3 내지 10배일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 추출 방법은 열수추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 방법에 있어서, 추출 시 온도는 10℃ 내지 100℃인 것이 바람직하며 20℃ 내지 70℃, 또는 40℃ 내지 60℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 추출 시간은 30분 내지 3시간, 또는 1시간 내지 2시간일 수 있고, 상기 추출은 1~5회 또는 3회 반복될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 단계 4)의 건조는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 EBV 관련 질환은 EBV에 의해 야기되거나, 이와 관련된 임의의 질환, 질환의 상태 또는 장애와 관련된 것으로, 바람직하게는 위암, 비인두암, 버킷 림프종, 호지킨 병 중 어느 하나 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 EBV 관련 위암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 상기 대극 속 추출물 외에, 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 '약학적으로 허용가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
본 발명의 상기 대극 속 추출물은 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회 투여 또는 반복 투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효성분과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 상기 과립제는 본 발명의 상기 유효성분, 약학적으로 허용가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 유효성분은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
2. EBV 관련 질환의 치료 보조제.
본 발명의 또 다른 측면은 EBV 관련 질환의 치료 보조제를 제공한다.
본 발명의 상기 치료 보조제는 대극(Euphorbia) 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 치료 보조제에 유효성분으로 포함되는 대극 속 식물 추출물이나, 유효성분과 함께 포함되는 담체나 첨가제 등에 관해서는 상기 "1. EBV ( Epstein - Barr virus) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 "항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 한다.
상기 치료 보조제는 당업계에서 일반적으로 사용되는 EBV 관련 질환 치료제의 효과를 증진시키기 위하여, 병용하여 사용될 수 있는 제재를 의미한다. 본 발명의 치료 보조제의 유효성분은 EBV의 용균을 효과적으로 유도하는 바, 숙주의 면역 체계로부터 회피가 가능한 EBV의 비활성 상태(잠복 상태)를 활성화된 상태로 전환시켜, EBV를 표적하는 약물의 효율을 높일 수 있고, 나아가 잠복 상태에서 발현되는 유전자에 의한 암의 발생을 억제함으로써 EBV 관련 질환의 예방 또는 치료 효과가 증진되도록 할 수 있다.
예를 들어, 상기 EBV 관련 질환이 EBV 관련 암인 경우, 상기 본 발명의 치료 보조제는 항암제와 함께 병용하여 사용될 수 있다. 상기 항암제는, 예를 들면, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 시타라빈, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 탁소테레, 글리벡, 탁솔, 허셉틴, 타르세바, 아바스틴, 졸라덱스, 아드리아마이신, 이리노데칸(irinotecan), 10058-F4, 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamid), 니트로소 요소-기반 항암제, 메토트렉세이트(Methotrexate), 독소루비신(doxorubicin) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
3. EBV 용균 유도 물질의 선별용 센서 세포 및 이를 이용한 EBV 용균 유도 물질의 선별 방법
본 발명의 또 다른 측면은 EBV의 용균 유도 물질을 선별하기 위한 센서 세포 및 상기 센서 세포를 이용한 EBV 용균 유도 물질을 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 센서 세포는, 숙주 세포에 ZTA 프로모터 및 제1 리포터 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트가 형질도입된 것일 수 있다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 ZTA 프로모터와 제1 리포터 유전자를 포함하는데, 상기 제1 리포터 유전자는 상기 ZTA 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 상기 ZTA 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 ZTA 프로모터의 활성 여부에 따라 제1 리포터 유전자의 발현이 조절되도록, ZTA 프로모터의 하류에 연결된 것을 의미한다. 따라서 상기 ZTA 프로모터가 활성화되는 경우, 상기 제1 리포터 유전자가 발현되도록 구성되고, 결국 상기 제1 유전자 컨스트럭트에서 발현되는 제1 리포터 유전자의 발현 여부나 발현 정도를 확인함으로써 상기 ZTA 프로모터의 활성화 여부나 활성화 된 정도를 확인할 수 있는 것이다.
상기 ZTA 프로모터는 EBV의 용균 유전자인 ZTA의 발현을 조절하는 프로모터로, EBV에서 유래한 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 제1 리포터 유전자는 상기 ZTA 프로모터의 활성화 여부나 활성화된 정도를 확인할 수 있도록 하는 것이라면 제한 없이 이용될 수 있고, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 또는 항생제 저항성 유전자로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 형광 단백질을 암호화하는 유전자나 항생제 저항성 유전자는 당업계에 널리 알려져 있는 것들이 제한 없이 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 단백질을 암호화하는 유전자로는 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 루시페라아제(luciferase), 베타-글루쿠로니다아제(GUS), 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 등이 이용할 수 있고, 상기 항생제 저항성 유전자로는 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린 등 항생제에 저항성인 유전자 등 통상의 항생제 저항성 유전자를 이용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 제1 리포터 유전자는 상기 ZTA 프로모터의 활성화 여부나 활성화된 정도를 시각적으로 즉시 확인할 수 있는 형광 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 상기 숙주 세포 내에서 상기 숙주 세포의 염색체에 포함된 형태로 존재할 수 있고, 또는 벡터에 포함된 형태로 형질도입되어 숙주 세포 내에서 숙주 세포의 염색체와는 별도의 벡터에 포함된 형태로 존재할 수도 있다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트가 벡터에 포함된 형태로 숙주 세포에 형질도입되는 경우, 상기 벡터는 숙주 세포의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있는 것이라면 제한 없이 이용될 수 있고, 예를 들어 플라스미드 벡터가 이용될 수 있다.
상기 숙주 세포는 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포, 동물 세포 등일 수 있다. 상기 센서 세포는 EBV의 게놈 유전자 및 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트가 추가적으로 형질도입된 것일 수 있다.
상기 제2 유전자 컨스트럭트는 EBV 게놈 유전자와 제2 리포터 유전자를 포함하는데, 상기 제2 리포터 유전자는 상기 EBV 게놈 유전자가 발현될 때 함께 발현되도록 구성된다. 따라서 상기 제2 유전자 컨스트럭트에서 발현되는 제2 리포터 유전자의 발현 여부를 확인함으로써 상기 EBV 게놈 유전자의 발현 여부, 나아가 EBV의 용균 유도 여부를 확인할 수 있는 것이다. 상기 EBV 게놈 유전자는 EBV 게놈 유전자의 전부 또는 일부일 수 있고, 특히 EBV의 용균을 일으키는 유전자들의 일부 또는 전부일 수 있다.
상기 제2 리포터 유전자는 상기 EBV 게놈 유전자가 발현될 때 함께 발현되는 것으로서, 상기 EBV 게놈 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있도록 하는 것이라면 제한 없이 이용될 수 있고, 예를 들어, 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 루시페라아제(luciferase), 베타-글루쿠로니다아제(GUS), 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 등과 같은 형광 단백질을 암호화하는 유전자나, 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린 등 항생제에 저항성인 유전자 등 통상의 항생제 저항성 유전자를 이용할 수 있다. 특히 상기 제2 리포터 유전자 역시 상기 제1 리포터 유전자와 마찬가지로 상기 EBV 게놈 유전자의 발현 여부를 시각적으로 즉시 확인할 수 있는 형광 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 또한, 상기 제2 리포터 유전자는 상기 제1 리포터 유전자와 동일하거나 상이할 수 있으며, 바람직하게는 상기 제1 리포터 유전자와 상이한 것일 수 있다.
상기 제2 유전자 컨스트럭트는 상기 숙주 세포 내에서 상기 숙주 세포의 염색체에 포함된 형태로 존재할 수 있고, 또는 벡터에 포함된 형태로 형질도입되어 숙주 세포 내에서 숙주 세포의 염색체와는 별도의 벡터에 포함된 형태로 존재할 수 있다. 상기 제2 유전자 컨스트럭트가 벡터에 포함된 형태로 숙주 세포에 형질도입 되는 경우, 상기 제2 유전자 컨스트럭트는 상기 제1 유전자 컨스트럭트와 동일한 벡터에 포함되어 형질도입 될 수도 있고, 상기 제1 유전자 컨스트럭트가 포함된 벡터와 별개의 벡터에 포함되어 형질도입될 수도 있다. 상기 제2 유전자 컨스트럭트가 상기 제1 유전자 컨스트럭트와 별개의 벡터에 포함되어 형질도입 되는 경우, 상기 제2 유전자 컨스트럭트가 포함된 벡터는 숙주 세포의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있는 것이라면 제한 없이 이용될 수 있고, 예를 들어 플라스미드 벡터나 백미드가 이용될 수 있으며, 예컨대 상기 제2 유전자 컨스트럭트가 포함된 벡터는 Son et al., J. Microbiol ., 53(2), 155-165 (2015)의 문헌에서 HEK293-EBV-GFP 세포를 제조함에 이용된 EBV-GFP 백미드일 수 있다.
상기 센서 세포에 EBV 용균 유도 물질이 처리되면, 일단 제1 유전자 컨스트럭트의 ZTA 프로모터가 활성화되고, 그로 인해 제1 리포터 유전자가 발현된다. 나아가 상기 센서 세포에 제2 유전자 컨스트럭트까지 포함되어 있는 경우라면, 상기 EBV 용균 유도 물질에 의해 EBV 게놈 유전자의 발현이 유도되고, 용균 상태로의 전환에 따라 게놈이 증폭되면서 제2 리포터 유전자의 발현도 증가한다. 따라서 본 발명의 상기 센서 세포는 제1 리포터 유전자의 발현을 통해 1차적으로는 ZTA 프로모터 활성화 여부를, 그리고 선택적으로 제2 리포터 유전자의 발현을 통해 2차적으로는 EBV 용균 유도 여부를 한번에 확인할 수 있는 것이다.
따라서 상기와 같은 본 발명의 센서 세포를 이용하는 본 발명의 EBV 용균 유도 물질의 선별 방법은, 상기 센서 세포에 EBV의 용균을 유도할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보 물질의 처리 후, 상기 센서 세포에서 제1 리포터 유전자의 발현 여부 또는 발현 정도를 측정하는 단계;를 포함한다.
또한, 상기 EBV 용균 유도 물질의 선별 방법은, 상기 센서 세포에서 제2 리포터 유전자의 발현 여부를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 EBV 용균 유도 물질의 선별 방법은, 상기 센서 세포에서 제1 리포터 유전자 또는 제2 리포터 유전자의 발현이 측정되는 경우, 상기 후보 물질을 EBV 용균 유도 물질로 판단하는 단계;를 더 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
[ 제조예 1] 대극 추출물의 제조
대극 추출물은 유기용매 추출법을 이용하여 제조하였다. 구체적으로, 세척된 대극의 뿌리를 건조시키고 분쇄하여 분말화된 대극 뿌리 25mg을 100% 메탄올에 침지시킨 후, 가속용매추출장치(accelerated solvent extractor, ASE)를 이용하여 50℃에서 추출하였다. 상기 메탄올 추출액을 여과한 후에 회전증발농축기(Rotary Evaporator, JP-SD1000, Eyela, Tokyo Rikikatai, Japan)로 감압 농축하여 용매를 제거하여, 대극 추출물을 얻었다.
[ 제조예 2] HEK - EBV / pZTA -Luc 시스템 제작
반딧불의 발광 효소(firefly luciferase; FLuc)를 암호화하는 유전자를 포함하는 pGL4.14 벡터를 XhoI 제한효소로 절단한 뒤, 절단된 위치에 ZTA 유전자의 프로모터를 암호화하는 염기서열(서열번호 1)을 삽입하여, ZTA 프로모터 어세이 벡터를 제작하였다. 그런 다음, 상기 제작된 프로모터 어세이 벡터를, EBV 게놈 유전자와 GFP(green fluorescence protein)이 포함되어 있는 BACmid가 형질도입되어 있는 Son et al., J. Microbiol ., 53(2), 155-165 (2015)의 문헌의 HEK293-EBV-GFP 세포에 형질전환하여 형질전환체(이하, 'HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템'이라 함)를 제작하였다.
상기 시스템의 검증을 위하여, EBV 용균 유도 물질로 알려진 소듐 부틸레이트(sodium butyrate; SB)를 0, 0.008, 0.004, 0.2, 1 및 5mM의 농도로 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템에 처리한 뒤, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템에 기질(one-glo, promega)을 넣은 후 루미노미터(luminometer) 장비를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, SB가 처리된 농도가 증가될수록 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템에서 측정된 루시퍼라아제의 활성이 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 상기 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템을 사용하는 경우 EBV의 용균을 유도할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 EBV 용균 유도 효과를 정량적으로 측정할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 1] 대극 추출물의 EBV 용균 유도 효과 확인
상기 제조예 1에서 제조된 대극 추출물의 EBV 용균 유도 효과와 그에 따른 세포 사멸 정도를 확인하였다.
상기 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템에 상기 제조예 1에서 제조된 대극 추출물을 0, 0.08, 0.4, 2, 10, 및 50㎍/ml의 농도로 각각 처리하고, 상기 제조예 3에서와 동일한 방법으로 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 또한, 상기 대극 추출물이 10㎍/ml의 농도로 처리된 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템에서, EBV 바이러스의 용균에 의한 복제가 일어나는 경우 증가될 것으로 예상되는 GFP 발현 정도를 형광현미경을 이용하여 확인하였다. 이때, 음성대조군으로 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리하였다.
또한, CellTiter-glo 시약(promega)을 이용하여, 상기와 같은 농도의 대극 추출물이 처리된 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템에서 세포 생존도(cell viability)를 측정하였다.
그 결과, 도 2의 A 및 C에 도시된 바와 같이, 음성 대조군인 DMSO에 비해서 10㎍/ml의 농도로 대극 추출물을 처리한 경우에 루시퍼라아제 활성이 60배 이상 증가되었으며 양성대조군인 SB에 비해서는 3배 이상 증가되었고, EBV 용균이 유도되어 EBV의 복제가 일어나 GFP 형광 신호가 DMSO가 처리된 경우에 비하여 현저하게 증가되었다. 또한, 대극 추출물을 처리한 경우의 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템은 DMSO를 처리한 경우와 비교하여, 세포의 형태가 비 정상적으로 변형되었으며, 바닥에 부착된 정도가 약해져 있는 것이 확인되었다.
또한, 도 2의 B에 도시된 바와 같이, 양성대조군인 SB에 비하여 10㎍/ml의 농도로 대극 추출물을 처리한 경우에 세포 생존도가 약 60%가 감소된 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과로부터, 본 발명에 따른 대극 추출물은 EBV 용균을 유도하여, HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템의 기초가 되는 세포인 HEK293 세포의 형태의 변형과 세포 부착력을 감소시킬 수 있고, EBV 용균 유도에 의한 세포 사멸을 매우 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있다.
[ 실시예 2] EBV 감염 위암 세포에 대한 대극 추출물의 EBV 용균 유도 효과 확인
자연적으로 EBV에 감염되어 있는 위암 세포에서도 상기 대극 추출물에 의한 EBV의 용균 유도 활성이 나타나는지 확인하였다.
한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입한 SNU-719 세포(KCLB no. 00719)에 상기 제조예 1에서 제조된 대극 추출물을 10㎍/ml의 농도로 처리한 뒤, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포로부터 TRI REAGENT®(RNA/DNA/PROTEIN isolation reagent, KOREA)를 이용하여 전체 RNA를 분리한 뒤, Omniscript RT kits (random hexamer primer, Qiagen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성된 cDNA를 주형으로, 아래 표의 서열번호 2 내지 서열번호 9의 프라이머 서열을 이용하여 대표적인 용균 유전자인 Ea-D, ZTA 및 EBNA1 유전자에 대한 RT-PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 도 3의 A에서 보는 바와 같이, DMSO 및 Suberoylanilide Hydroxamic Acid (SAHA), SB를 처리한 경우에 비하여 대극 추출물을 처리한 경우, EBV 용균 유도와 관련된 유전자인 Ea-D, ZTA 및 EBNA1 유전자의 양이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다.
대상 유전자 방향 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
Ea-D 정방향 AGCTCACTATGGAATATGATG 2
역방향 TCAAGATTGGCACGCTAACG 3
ZTA 정방향 TGACCAAGCTACCAGA 4
역방향 ATGTCTGCTAGCTGTTGTCC 5
EBNA1 정방향 TTGAATACCACCAAGAAGGTGGCC 6
역방향 ATGGTGTAAGACGACATTGTGGAAT 7
GAPDH 정방향 GAACGGGAAGCTTGTCATCAATGG 8
역방향 TGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAT 9
그리고, 상기 세포로부터 단백질을 분리하여 Ea-D 및 ZTA 단백질들에 특이적인 항체로 웨스턴 블롯을 수행하여 EBV의 용균과 관련된 단백질의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 도 3의 B에 도시된 바와 같이, SB나 SAHA를 처리한 경우 EBV 용균 유도와 관련된 Ea-D 및 ZTA 단백질의 양은 소폭으로 증가하였다. 그러나, 대극 추출물을 처리한 경우에는 Ea-D 및 ZTA 단백질의 양이 매우 현저하게 증가되는 것을 확인하였다.나아가, 대극 추출물이 처리된 상기 세포에 존재하는 EBV 용균 유도와 관련된 단백질에 대하여 면역 형광법(Immunofluorescence)을 이용하여 그 양의 변화를 확인하였다. 구체적으로, 5 ×105 수의 세포를 커버 슬라이드 (cover slide)가 있는 12-웰 플레이트에 분주하고 충분히 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포에 대극 추출물 2 및 10㎍/ml의 농도로 처리하고 48시간 동안 추가로 배양한 뒤, 세포 배양액(cell medium)을 제거하였다. 이후, 2% 포름알데히드(formaldehyde)를 처리하여 세포를 고정화 시키고 PBS로 세척하였다. 상기 고정화된 세포에 퍼미어빌리제이션 버퍼(permeabilization buffer, 0.4% Triton X-100)를 처리한 뒤 2분간 배양하고, ZTA 단백질에 특이적인 일차 항체를 처리하고 1시간 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, PBS로 세척하고 이차 항체를 처리한 뒤, 실온에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 이차 항체와 충분히 반응이 이루어진 세포를 PBS로 세척하고, Hoechst33258을 이용하여 상기 세포의 핵을 대비염색(Counterstain)한 뒤, 마운팅(Mounting)하고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 도 3의 C에 도시된 바와 같이, 대극 추출물을 처리한 경우, 세포 내 ZTA 단백질에 의해 발현되는 형광의 세기가 증가된 것을 확인하였다.
아울러, 상기 SNU-719 세포에 상기 제조예 1의 대극 추출물을 0, 0.08, 0.4, 2, 10 및 50㎍/ml의 농도로 각각 처리하여 24시간 동안 배양한 다음, 상기와 같은 실험을 반복적으로 수행해 본 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 여러 다양한 농도의 대극 추출물에 대해서도 상기와 비슷한 결과가 다시 한번 확인되었다.
상기와 같은 도 3의 A 내지 C의 결과로부터, 본 발명의 대극 추출물은 자연적으로 EBV가 감염된 위암 세포에서도 EBV 용균 유도 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] 대극 추출물에 의한 EBV 용균 유도 메커니즘 확인
EBV의 용균은 히스톤 단백질을 하이퍼아세틸레이션(hyperacetylation)시키는 HDAC(histone deacetylases) 억제제에 의해서도 유도될 수 있고, 세포 내의 다양한 인산화효소 경로(kinase pathyway)를 통해서도 유도될 수 있는 것으로 알려져 있는데, 과연 본 발명의 대극 추출물은 어떠한 메커니즘을 통해 EBV의 용균을 유도하는 것인지 확인하였다.
[3-1] HDAC 억제를 통한 메커니즘인지 여부 확인
SNU-719 세포에 상기 제조예 1에서 제조된 대극 추출물을 10㎍/ml의 농도로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포들로부터 단백질을 분리하여 아세틸(Acetyl)-H3 및 아세틸(Acetyl)-H4 단백질들에 특이적인 항체로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 대조군으로 SNU-719 세포에 HDAC 억제제인 SAHA 및 SB를 10μM 및 3mM 농도로 처리하였다.
그 결과, 도 5의 A에 도시된 바와 같이, 대조군인 SAHA 및 SB를 처리한 경우, 아세틸(Acetyl)-H3 및 아세틸(Acetyl)-H4 단백질들의 양이 증가되는 반면, 대극 추출물을 처리한 경우에는 하이퍼아세틸레이션된 히스톤 단백질의 양이 증가되지 않음을 확인하였다.
상기와 같은 결과로부터, 대극 추출물에 의한 EBV 용균 유도는 히스톤 단백질이 하이퍼아세틸레이션되는 경로와는 무관한 경로로 유도되는 것임을 알 수 있다.
[3-2] 인산화효소 경로를 통한 메커니즘인지 여부 확인
SNU-719 세포에 상기 제조예 1에서 제조된 대극 추출물을 10㎍/ml의 농도로 처리함과 동시에 카이네이즈 경로의 억제제인 PKC(protein kinase C) 억제제(Enzastaurin), MEK(Mitogen-activated protein kinase) 억제제(GSK1120212), JNK(c-Jun N-terminal kinase) 억제제(SP600125), PI3K(Phosphoinositide 3-kinase) 억제제(ZSTK474), ATM 억제제(KU-60,019) 및 p38 억제제(SB202190)를 각각 1μM의 농도로 처리한 뒤, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포들로부터 단백질을 분리하여 Ea-D 및 ZTA 단백질들에 특이적인 항체로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때, 음성대조군으로 SNU-719 세포에 DMSO를 처리하였다.
그 결과, 도 5의 B에 도시된 바와 같이, 카이네이즈 경로의 억제제 중에서 PKC 억제제와, PCK 경로의 하위 경로인 MEK 억제제가 처리된 경우 Ea-D 및 ZTA 단백질의 양이 감소된 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과로부터, 대극 추출물에 의한 EBV 용균 유도는 PKC/MEK 경로를 통해 EBV의 용균이 유도될 수 있도록 하는 것을 알 수 있다.
[ 실시예 4] HEK - EBV / pZTA -Luc 시스템을 이용한 PKC /MEK 경로를 통한 EBV 용균 유도 효과 검증
상기 [3-2]에서 확인한 바와 같이, HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템을 이용하여 대극 추출물의 EBV 용균 유도 효과가 PKC/MEK 경로를 통해 유도되는 것인지 여부를 추가로 검증하였다.
상기 제조예 3에서 제조된 상기 HEK-EBV/pZTA-Luc 시스템들에 상기 제조예 1에서 제조된 대극 추출물을 10㎍/ml의 농도로 처리함과 동시에 5μM의 농도로 PKC 억제제인 enzastaurin(Enz.) 및 rottlerin(Rott.)와, 1μM의 농도로 MEK 억제제인 PD0325901(PD.), TAK-733(TAK.) 및 GSK1120212(GSK.)를 각각 처리하고, 상기 제조예 3에서와 동일한 방법으로 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 이때, 대조군으로 EBV의 용균을 유도할 수 있는 PMA(Phorbol-12-Myristate-13-Acetate)를 10㎍/ml의 농도로 처리함과 동시에, 5μM의 농도로 enzastaurin 및 rottlerin을 각각 처리하였다.
그 결과, 도 5의 C 내지 E에 도시된 바와 같이, PMA에 의하여 EBV의 용균이 유도되어 증가된 루시퍼라아제 활성은 PKC 억제제가 처리되었을 때 Enz의 경우 약 10%, rottlerin의 경우 약 30%로 감소되었다(도 5의 C). PMA가 처리된 경우와 마찬가지로, 대극 추출물에 의하여 EBV의 용균이 유도되어 증가된 루시퍼라아제 활성은 PKC 억제제가 처리된 경우 약 10% 또는 20%로, MEK 억제제가 처리된 경우 약 40% 이하로 감소되었다(도 5의 D 및 E).
[ 실시예 5] 대극 추출물의 EBV 양성 세포에 대한 선택적 세포 사멸 유도 효과 확인
대극 추출물에 의한 세포 사멸 효과가 EBV가 감염된 EBV 감염 세포에 특이적인지 확인하였다.
SNU-719 세포(EBV 양성 세포)와 MKN-74 세포(EBV 음성 세포; KCLB no.80104)에 상기 제조예 1이 대극 추출물을 0, 0.08, 0.4, 2, 10 및 50㎍/ml의 농도로 각각 처리하고, 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 세포 생존도를 측정하였다. 이때, 양성대조군으로 상기 세포들에 SB를 처리하였다.
그 결과, 도 6의 A 및 B에 도시된 바와 같이, 50㎍/ml의 농도로 대극 추출물이 처리된 SNU-719 세포에서 세포 생존도가 80% 감소된 반면, MKN-74 세포에서는 세포 생존도의 감소가 거의 나타나지 않았다.
상기 결과로부터, EBV 양성 위암 세포에 존재하는 EBV를 대극 추출물을 이용하여 선택적으로 용균을 유도함으로써, 위암 세포의 선택적 사멸을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> A Pharmaceutical Composition For Preventing Or Treating EBV-related Disease <130> 2018DPA2680 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 233 <212> DNA <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 1 gccatgcata tttcaactgg gctgtctatt tttgacacca gcttatttta gacacttctg 60 aaaactgcct cctcctcttt tggaaactat gcatgagcca caggcattgc taatgtgcct 120 cagagacaca cctaaattta gcacgtccca aaccatgaca tcacagagga ggctggtgcc 180 ttggctttaa aggggagatg ttagacaggt aactcactaa acattgcacc ttg 233 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Ea-D <400> 2 agctcactat ggaatatgat g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Ea-D <400> 3 tcaagattgg cacgctaacg 20 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ZTA <400> 4 tgaccaagct accaga 16 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ZTA <400> 5 atgtctgcta gctgttgtcc 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for EBNA1 <400> 6 ttgaatacca ccaagaaggt ggcc 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for EBNA1 <400> 7 atggtgtaag acgacattgt ggaat 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 8 gaacgggaag cttgtcatca atgg 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 9 tgtggtcatg agtccttcca cgat 24

Claims (12)

  1. 대극(Euphorbia) 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 EBV(Epstein-Barr virus) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 대극 속 식물 추출물은 대극(Euphorbia pekinensis RUPR .) 추출물인 것인, EBV 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 대극 추출물은 대극의 뿌리, 줄기, 잎으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나로부터 추출된 것인, EBV 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 EBV 관련 질환은 위암, 비인두암, 버킷 림프종, 호지킨 병 중 어느 하나 이상인, EBV 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 대극(Euphorbia) 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 EBV 관련 질환의 치료 보조제.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 대극 속 식물 추출물은 대극(Euphorbia pekinensis RUPR .) 추출물인 것인, EBV 관련 질환의 치료 보조제.
  7. 청구항 5 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 EBV 관련 질환은 위암, 비인두암, 버킷 림프종, 호지킨 병 중 어느 하나 이상인, EBV 관련 질환의 치료 보조제.
  8. 숙주 세포에, ZTA 프로모터 및 상기 ZTA 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 리포터 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트가 형질도입된, EBV의 용균(lytic) 유도 물질을 선별하기 위한 센서 세포.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 숙주 세포에, EBV의 게놈 유전자 및 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트가 추가적으로 형질도입된, EBV의 용균 유도 물질을 선별하기 위한 센서 세포.
  10. 청구항 8 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 리포터 유전자 또는 상기 제2 리포터 유전자는 녹색형광단백질(GFP), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 루시페라제(luciferase), 베타-글루쿠로니다아제(GUS) 및 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 암호화하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, EBV의 용균 유도 물질을 선별하기 위한 센서 세포.
  11. 청구항 8 내지 청구항 9 중 어느 하나의 센서 세포에 EBV의 용균을 유도할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보 물질의 처리 후, 상기 센서 세포에서 제1 리포터 유전자의 발현 여부 또는 발현 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 EBV의 용균 유도 물질을 선별하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 센서 세포에서 제1 리포터 유전자의 발현이 측정되는 경우, 상기 후보 물질이 EBV 용균 유도 물질인 것으로 판단하는 단계;를 더 포함하는, EBV의 용균 유도 물질을 선별하는 방법.
KR1020180134886A 2018-11-06 2018-11-06 Ebv 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR20200051940A (ko)

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KR1020180134886A KR20200051940A (ko) 2018-11-06 2018-11-06 Ebv 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20210146765A (ko) * 2020-05-27 2021-12-06 부산대학교 산학협력단 장 상피세포에서 8-케토-트리코테센의 염증 작용을 예측하는 세포 기반 생체 분석 시스템

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KR20210146765A (ko) * 2020-05-27 2021-12-06 부산대학교 산학협력단 장 상피세포에서 8-케토-트리코테센의 염증 작용을 예측하는 세포 기반 생체 분석 시스템

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