CN116059276B - 抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物，涉及医药技术领域。所述抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物包括三七总皂苷和白头翁皂苷B4。本申请的防治猪流行性腹泻病毒病的药物能有效提升动物特异性的抗体效价，降低病毒载量，增强免疫细胞和免疫介质的数量与活性，促进免疫器官的生长发育，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力，克服了疫苗、化药、抗生素的毒副作用与食品安全隐患，研发前景乐观，临床应用广阔。
Description
技术领域
本申请涉及医药技术领域，具体涉及一种抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
猪流行性腹泻，英文缩写为PED(Porcine Epidemic Diarrhea)，由猪流行性腹泻病毒引起的一种接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水。临床变化和症状与猪传染性胃肠炎极为相似。1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。我国多发生在每年12月至翌年1～2月，常发生于寒冷季节，夏季也有发病的报道。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)，属于冠状病毒科冠状病毒属。本病只发生于猪，各种年龄的猪都能感染发病。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15-90％。病猪是主要传染源。病毒存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结，随粪便排出后，污染环境、饲料、水源、交通工具及用具等而传染。主要感染途径是消化道。如果一个猪场陆续有不少窝仔猪出生或断奶，病毒会不断感染失去母源抗体的断奶仔猪，使本病呈地方流行性，在这种繁殖场内，猪流行性腹泻可造成5-8周龄仔猪的断奶期顽固性腹泻。
病毒经口和鼻感染后，直接进入小肠。通过免疫荧光和电子显微镜检查，病毒的复制是在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行。其他脏器内未发现病毒增殖。由于病毒增殖首先造成细胞器的损伤，继而出现细胞功能障碍。肠绒毛萎缩，造成了吸收表面积的减少、小肠黏膜碱性磷酸酶含量显著降低，进而引起营养物质吸收障碍，这是导致腹泻的主要原因，属于渗透性腹泻。严重腹泻引起脱水，是导致病猪死亡的主要原因。
预防措施包括种猪群紧急接种胃流二联苗或胃流轮三联苗。发生呕吐腹泻后立即封锁发病区和产房，尽量做到全部封锁。扑杀10日龄之内呕吐且水样腹泻的仔猪，这是切断传染源、保护易感猪群的做法，但成本较高。本病应用抗生素治疗无效，疫苗效果日益下降。
目前，对PED尚无有效治疗药物。抗病毒化药被禁用，常规抗生素治疗多用于防止细菌继发感染，而对病毒无杀灭作用。干扰素、白细胞介素、卵黄抗体及返饲、紧急接种等疗法，应用效果存在较大差异。应用中药预防与治疗病毒传染病在我国已有数千年的历史，并以确切的疗效和较低的毒副残留及抗药性而广受欢迎。
因此，开发一种能抗猪流行性腹泻病毒的中药药物，是目前急需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于能够提供一种能抗猪流行性腹泻病毒的中药药物，应用该药物组合物可以预防与治疗抗猪流行性腹泻病毒，有效提升动物特异性的抗体效价，降低病毒载量，增强免疫细胞和免疫介质的数量与活性，促进免疫器官的生长发育，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力。
第一方面，本申请实施例公开了一种抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物，所述抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物包括三七总皂苷和白头翁皂苷B4。
目前，从中药三七中共分离出超过200种化合物，主要成分是三七总皂苷(Panaxnotoginseng saponins，PNS)。通过查阅《中华人民共和国药典》(2020版)及药品说明书，通常用于药理学研究的PNS纯度为90％，包含五种主要成分，三七皂苷R1(7-10％)，人参皂苷Rg1(20％–40％)，人参皂苷Re(3.9％–6％)，人参皂苷Rb1(30％–36％)，以及人参皂苷Rd(5％–8.4％)，而以PNS为主要成分的药物主要有血栓通注射液、血塞通注射液、三七舒通胶囊、三七总苷片、三七总苷胶囊等。PNS能改善细胞能量代谢、清除自由基及抗氧化应激、调控细胞凋亡、抗炎、平衡离子代谢紊乱、改善组织血流供应等，被应用于心脑血管疾病、血液疾病、免疫性疾病、肿瘤等的治疗与研究中。
白头翁皂苷是白头翁中具有生物活性的五环类三萜成分，具有抗血吸虫、抗炎、抗菌、活化血管、抗肿瘤、认知增强等多种药理作用。白头翁皂苷B4(Anemoside B4，AB4)是其中的有效皂苷，含量丰富，价格低廉，容易转化为临床应用药物，也有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、肾损伤保护、镇痛、免疫调节等活性。AB4对肝癌、子宫颈癌、结直肠癌均有一定抑制作用，其机制可能与PI3K/Akt/mTOR途径、细胞周期G2/M、Notch信号通路、P-gp有关；也有一定抗炎作用，主要是通过抑制内皮细胞分泌细胞因子、调节TLR4信号通路来发挥；对于肾保护作用而言，AB4机制可能与抗氧化、调控p53信号通路、减少炎症因子、PI3K、DTH有关。另外，AB4也具有抗病毒、镇痛和免疫调节作用，但其具体机制有待进一步探索。
第二方面，本申请实施例公开了一种第一方面所述的抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：将三七总皂苷和白头翁皂苷B4，加生理盐水制成总浓度为2-6mg/mL的药液。
第三方面，本申请实施例公开了一种第一方面所述的药物组合物在制备治疗猪流行性腹泻病的药物中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请的防治猪流行性腹泻病毒病的药物能有效提升动物特异性的抗体效价，降低病毒载量，增强免疫细胞和免疫介质的数量与活性，促进免疫器官的生长发育，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力，克服了疫苗、化药、抗生素的毒副作用与食品安全隐患，研发前景乐观，临床应用广阔。
附图说明
图1为本申请实施例提供的各组药物抗PEDV的作用图；图中：A，MTT法检测各组药物抗PEDV的作用；B，qPCR法检测各组药物抗PEDV的作用；N.D.，未检测到；a-c，所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)；
图2为本申请实施例提供的IFA法检测各组药物抗PEDV的作用图；
图3为本申请实施例提供的药物对PEDV增殖的影响，图中：A，在先加药后加病毒模式下，药物对PEDV吸附的影响；B，在先加病毒后加药物模式下，药物对PEDV吸附的影响；C，药物对PEDV入侵的影响；D，药物对PEDV复制的影响；N.D.，未检测到；a-b，所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)；
图4为本申请实施例提供的各组药物抗PEDV的腹泻率与腹泻指数检测结果图；图中：a-d，所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)；
图5为本申请实施例提供的各组药物抗PEDV的血清与粪便病毒载量检测结果图；图中：N.D.，未检测到；a-c，所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)；
图6为本申请实施例提供的各组药物抗PEDV的抗体水平检测结果图；图中：a-c，所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本申请实施例提供了一种抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物，所述抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物包括三七总皂苷和白头翁皂苷B4。
在一些实施例中，所述抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物中，三七总皂苷和白头翁皂苷B4的质量配比比例为，三七总皂苷:白头翁皂苷B4＝1-7:1。
在一些实施例中，所述抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物中，三七总皂苷和白头翁皂苷B4的质量配比比例为，三七总皂苷:白头翁皂苷B4＝3-5:1。
在一些实施例中，所述抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物中，三七总皂苷和白头翁皂苷B4的质量配比比例为，三七总皂苷:白头翁皂苷B4＝4:1。
本申请实施例提供了一种如上所述的抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：将三七总皂苷和白头翁皂苷B4，加生理盐水制成总浓度为2-6mg/mL的药液。
在一些实施例中，所述药液浓度为4mg/mL。
本申请实施例提供了一种如上所述的药物组合物在制备治疗猪流行性腹泻病的药物中的应用。
在一些实施例中，所述抗猪流行性腹泻病毒的药物剂型为注射液。
下面结合附图对本发明的应用原理做进一步详细说明。
药组组合物的制备：
按质量比4:1称取三七总皂苷和白头翁皂苷B4，然后加生理盐水制成总浓度为4mg/mL的药液，即得药物组合物。
将该药液按照常规方法制成注射液。
利用MTT和qPCR法检测试验检测各组药物抗PEDV的作用，结果如图1所示。
向长有单层Vero细胞的96孔板中加入PEDV病毒100μL(终浓度0.1MOI)，培养2h后弃去病毒液，用PBS反复清洗3遍，弃去清洗液，PNS组加入100μL PNS(终浓度20μg/mL)，AB4组加入100μL AB4(终浓度20μg/mL)，PNS+AB4组加入100μL PNS+AB4(终浓度20μg/mL，PNS:AB4＝4:1)，各组重复6孔。同时设细胞对照和PEDV对照，37℃培养，当PEDV组出现明显病变时，用MTT法检测，读取A570值并计算每孔的细胞活性。由图1可知，当Vero细胞感染PEDV时，细胞的活性显著下降(如图1中A所示)，而各药物组的细胞活性则显著高于PEDV组。
由于MTT法检测的是细胞活性，因而申请人又采用qPCR法直接检测了在Vero细胞内的病毒表达量(如图1中B所示)。向长有单层Vero细胞的24孔板中加入PEDV病毒400μL(终浓度0.1MOI)，孵育2h后弃去病毒液，用PBS反复清洗3遍，弃去清洗液，PNS组加入400μL PNS(终浓度20μg/mL)，AB4组加入400μL AB4(终浓度20μg/mL)，PNS+AB4组加入400μL PNS+AB4(终浓度20μg/mL，PNS:AB4＝4:1)，各组重复4孔。同时设细胞对照和PEDV对照，37℃培养，48h后提取总RNA并立即反转录，同时进行qRT-PCR法检测。检测PEDV基因的前引物为5'-TTTATTCTGTCACGCCAT-3'，如SEQ ID NO:1所示，后引物为5'-AGATTTACAAACACCTATGTTA-3'，如SEQ ID NO:2所示；检测GAPDH基因的前引物为5'-TCATCATCTCTGCCCCTTCT-3'，如SEQ IDNO:3所示，后引物为5'-GTCATGAGTCCCTCCACGAT-3'，如SEQ ID NO:4所示。结果表明，各药物组均能显著降低细胞内的PEDV水平，充分证明PNS+AB4具有抗PEDV的作用。
利用ELISA和IFA法检测试验检测各组药物抗PEDV的作用，结果如表1和图2所示。
向长有单层Vero细胞的96孔板中加入PEDV病毒100μL(终浓度0.1MOI)，培养2h后弃去病毒液，用PBS反复清洗3遍，弃去清洗液，PNS组加入100μL PNS(终浓度20μg/mL)，AB4组加入100μL AB4(终浓度20μg/mL)，PNS+AB4组加入100μL PNS+AB4(终浓度20μg/mL，PNS:AB4＝4:1)，各组重复6孔。同时设细胞对照和PEDV对照，37℃培养，48h后将上述细胞培养板取出，置于-20℃冰箱，反复冻融两次后进行ELISA实验。利用PEDV-N酶联免疫定量试剂盒定量检测细胞样品中PEDV-N的含量，判定药物对病毒的作用。结果如表1所示，本试验得到了与qPCR方法检测结果基本一致的研究结论。
向长有单层Vero细胞的24孔板中加入PEDV病毒400μL(终浓度0.1MOI)，孵育2h后弃去病毒液，用PBS反复清洗3遍，弃去清洗液，PNS组加入400μL PNS(终浓度20μg/mL)，AB4组加入400μL AB4(终浓度20μg/mL)，PNS+AB4药物组加入400μL PNS+AB4(终浓度20μg/mL，PNS:AB4＝4:1)，各组重复4孔。同时设细胞对照和PEDV对照，37℃培养，24h后弃掉维持液，500μL/孔的PBS连洗2次，加入无水乙醇，500μL/孔，4℃固定约30min；弃去无水乙醇，500μL/孔的PBS连洗3次，加入用PBS稀释的一抗(鼠抗PEDV-N，以1:1000倍稀释)，200μL/孔，37℃孵育1h；弃一抗，200μL/孔的PBS连洗3次，加入用PBS稀释的二抗(FITC标记羊抗鼠IgG，以1:500倍稀释)，200μL/孔，37℃避光作用45min。弃去二抗，200μL/孔的PBS连洗3次；加入用PBS稀释的DAPI(以1:2000倍稀释)，200μL/孔，37℃5min。弃去DAPI，200μL/孔的PBS连洗3次；加入PBS 500μL/孔；倒置荧光显微镜观察，拍照。IFA试验如图2所示，可观察到，相比病毒对照组，三个药物组的绿色荧光明显更弱，而空白对照组无特异性荧光，说明各组药物均一定程度的抑制了PEDV在Vero细胞上的感染增殖。
表1各组ELISA检测结果比较
Tab 1.Comparison of ELISA results for each group
注：与PEDV对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。
检测药物对病毒吸附、入侵和复制的影响，结果如图3所示。
(1)对病毒吸附的影响。先加病毒后加药：在长有单层Vero细胞的24孔板中加入400μLPEDV(终浓度0.1MOI)，4℃孵育2h后弃去病毒液，用PBS清洗3遍。然后加入400μL药物(终浓度20μg/mL，PNS:AB4＝4:1)，4℃培养2h。先加药后加病毒：在长有单层Vero细胞的24孔板中加入400μL药物(终浓度20μg/mL，PNS:AB4＝4:1)，4℃孵育2h后用PBS清洗3遍。然后加入400μL PEDV(终浓度0.1MOI)，4℃孵育2h。用PBS清洗3遍后，采用qPCR法分析病毒的吸附量。(2)对病毒入侵的影响。在长有单层Vero细胞的24孔板中加入400μL PEDV(终浓度0.1MOI)，4℃孵育2h后用PBS清洗3遍。加入400μL药物(终浓度20μg/mL，PNS:AB4＝4:1)，37℃培养2h。用柠檬酸缓冲液清洗3遍后，采用qPCR法分析入侵细胞的病毒量。(3)对病毒复制的影响。在长有单层Vero细胞的24孔板中加入400μL PEDV(终浓度0.1MOI)，37℃孵育2h后用PBS清洗3遍。加入400μL药物(终浓度20μg/mL，PNS:AB4＝4:1)，37℃培养24h。用PBS清洗3遍后，采用qPCR法分析病毒的复制量。通过图3的结果表明，无论是先加药(如图3中A所示)还是先加病毒(如图3中B所示)两种模式下，药物组的PEDV水平和PEDV组之间没有显著性差异，说明药物对PEDV的吸附过程没有影响。同理，药物对PEDV的入侵过程(如图3中C所示)也没有影响。而药物对PEDV的复制过程具有显著的抑制作用(如图3中D所示)。说明药物是通过影响PEDV的复制环节来抑制病毒的增殖。
药物对猪崽的抗病毒作用：
中国食品药品检定研究院购得的三七总皂苷和白头翁皂苷B4按质量比4:1，加生理盐水制成总浓度为4mg/mL的药液，进行仔猪体内实验。同时三七总皂苷加生理盐水制成浓度为4mg/mL的药液，白头翁皂苷B4加生理盐水制成浓度为4mg/mL的药液。
30只3日龄仔猪随机分为5组(攻毒组、药物治疗组、PNS治疗组、AB4治疗组和对照组)，每组6头，公母各半。每只小猪分笼饲养，人工喂食小猪配方乳粉，适应饲养一天后，攻毒组和各治疗组通过经口以106TCID50/mL的PEDV AH2012/12株进行攻毒，每头灌服2.0mL1次，对照组口服生理盐水。攻毒后，每日观察小猪临床表现并对临床症状进行打分，每日固定时间段采集仔猪的肛拭子。于攻毒的第3d各治疗组颈部肌肉注射相应药液每天1次，每次1.0mL，连续用药3日。试验总周期6天。
每天定时观察仔猪粪便情况，记录腹泻头数，计算腹泻率，腹泻率(％)＝总腹泻次数/(总头数×试验天数)×100。腹泻指数＝粪便评分之和/供试猪总头数(评分标准见表2)，该指数越高，表示腹泻程度越严重。
表2腹泻评分标准
Tab 2.The standard scores of diarrhea in weaned piglets
结果发现，PEDV组仔猪攻毒后2天开始发病，出现糊状粪便，个别猪有半水样腹泻，腹泻率为26.48，药物治疗组给药1天后，粪便状态好转，腹泻率为10.15，两者差异极显著。空白组的仔猪未出现腹泻，食欲正常、粪便状态正常，腹泻率为9.07。PNS组的腹泻率为15.06，AB4组的腹泻率为21.33(如图4中A所示)。PEDV组的腹泻指数为0.91，治疗组的腹泻指数为0.34，两者差异极显著，空白组的腹泻指数为0.19，PNS组的腹泻指数为0.52，AB4组的腹泻指数为0.83(如图4中B所示)。实验表明，该药物能显著下调动物机体的腹泻率和腹泻指数，治疗该病毒病的最主要临床症状，从而改善机体脱水状态，增进健康。
试验最后1d仔猪清晨空腹前腔静脉采血，实时荧光定量PT-PCR法检测血清中PEDV的抗原含量，及粪便中的PEDV病毒载量。结果发现，PEDV组的血清抗原含量为6.44(lg)/μL，药物治疗组的血清抗原含量为2.39(lg)/μL，两者差异极显著，PNS组的血清抗原含量为3.51(lg)/μL，AB4组的血清抗原含量为4.98(lg)/μL(如图5中A所示)。PEDV组的粪便病毒载量为9.73(lg)/mL，药物治疗组的粪便病毒载量为4.90(lg)/mL，两者差异极显著，PNS组的粪便病毒载量为6.81(lg)/mL，AB4组的粪便病毒载量为7.75(lg)/mL(如图5中B所示)。空白组的血清和粪便PEDV抗原均未检测到。实验表明，该药物组合能显著降低机体内的病毒含量，抑制病毒血症的产生，及排毒现象，具有明显的抗PEDV作用。
试验最后1d仔猪清晨空腹前腔静脉采血，酶联免疫吸附法检测血清中PEDV的抗体水平。结果发现，PEDV组的抗体水平OD值为0.552，药物治疗组的抗体水平OD值为0.873，两者差异极显著，PNS组的抗体水平OD值为0.690，AB4组的抗体水平OD值为0.548，空白组的抗体水平OD值为0.107(图6)。实验表明，该药物组合可以大幅上调仔猪PEDV的抗体水平，特异性的中和、消灭PEDV病原，从而增强机体免疫功能，预防该疫病的发生。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物，所述抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物由三七总皂苷和白头翁皂苷B4组成，三七总皂苷和白头翁皂苷B4的质量配比比例为三七总皂苷: 白头翁皂苷B4=3-5:1。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，三七总皂苷和白头翁皂苷B4的质量配比比例为4:1。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：将三七总皂苷和白头翁皂苷B4，加生理盐水制成总浓度为2-6 mg/mL的药液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，所述药液浓度为4 mg/mL。
5.一种如权利要求1-2任一项所述的药物组合物在制备治疗猪流行性腹泻病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述抗猪流行性腹泻病毒的药物剂型为注射液。
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Non-Patent Citations (2)
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| 浅谈畜禽病毒病的治疗;韩开顺;中国动物检疫;第29卷(第04期);70-71 * |
| 猪流行性腹泻防治;王袁斐懿;四川畜牧兽医;第45卷(第09期);55-56 * |
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