CN116650577B - 一种锦灯笼提取物在抗鸡传染性支气管炎病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于禽病防治技术领域，提供了一种锦灯笼提取物在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎病毒产品中的应用；所述锦灯笼提取物为锦灯笼宿萼的乙醇提取物。本发明提供的锦灯笼提取物可以在抑制鸡传染性支气管炎病毒复制环节发挥明显的抗病毒作用，对感染病毒具有预防和治疗作用，可以在制备抗毒药物中进行应用。锦灯笼提取物原料丰富、低廉、制备工艺简单、成本低，具有良好的开发与应用前景。
Description
技术领域
本发明属于禽病防治技术领域，具体涉及一种锦灯笼提取物在抗鸡传染性支气管炎病毒中的应用。
背景技术
家禽养殖中常见的鸡传染性支气管炎（(Infectious bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的急性呼吸系统疾病。IBV属于冠状病毒科γ-冠状病毒属，其病毒粒子大小约为80-120 nm，外形呈中等多形性的球形或椭圆形。粒子由外层的囊膜和内部的核蛋白核心构成，囊膜上有许多间距比较宽的纤突组成冠状。纤突是IBV感染宿主的重要组成结构，纤突的脱落会导致IBV对宿主细胞的感染性下降。IBV内部核蛋白核心基因组是一条单链正股RNA，全序列长约27.6 kDa，其编码的蛋白是其感染宿主的重要组成。
鸡只感染IBV后主要出现咳嗽、喘鸣、啰音等临床症状，病理剖检发现鸡呼吸系统、消化系统、泌尿系统及生殖系统会出现损伤，是家禽养殖业的重要传染病之一。IBV可以感染各日龄、各品种的鸡，雏鸡更加易感，被感染鸡群的潜伏期在18-36 h，发病后48 h内即可波及全群，患病鸡肉制品产量下降，产蛋率下降，且所产蛋质量降低，严重时诱发其他病原微生物的继发感染或混合感染，导致急性或慢性传染病，造成较高的死亡率。临床上常采用疫苗免疫防治IBV，但由于IBV血清型众多，采用疫苗接种极易造成免疫失败。
锦灯笼[Physalis.alkekengiL.var.franchetii（Mast.）Makino]为茄科酸浆属植物，别名挂金灯、金灯、灯笼草、红菇娘。锦灯笼在我国药用历史悠久，始载于《神农本草经》，气微，味酸、苦，性寒，归肺经，具有清热解毒、利咽喉、通二便之功效。有研究显示锦灯笼提取物可以在体外缓解脂多糖（LPS）和鸡毒支原体（MG）引起的炎症反应，然而，目前锦灯笼在抑制鸡传染性支气管炎病毒方面尚无报道。LPS是内毒素的主要成分，来源于革兰氏阴性菌细胞壁的外膜，其在体内外可以引起多种细胞高表达趋化因子和致炎因子，从而引起炎症反应。MG属于革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧，其主要通过破坏呼吸道纤毛的完整性和游走性，为其他致病菌的侵入创制条件，因此MG多发生继发感染。因此，LPS致炎、MG感染与传染性支气管炎病毒感染是完成不同的病原体感染，探究锦灯笼提取物在抗鸡传染性支气管炎病毒中的应用具有创新性。
发明内容
针对IBV血清型众多，采用疫苗接种易免疫失败等问题，本发明提供一种可用于治疗鸡传染性支气管炎病毒的锦灯笼提取物，该提取物来源于锦灯笼的宿萼，其原料丰富、价格低廉、萃取工艺简单、制备成本低，可以制成多种剂型。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种锦灯笼提取物在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎病毒产品中的应用。
所述锦灯笼提取物为锦灯笼宿萼的乙醇提取物。
具体地，所述锦灯笼提取物的制备方法如下：
（1）称取锦灯笼宿萼粉末按照质量体积比1:8加入90%乙醇超声提取，获得提取液；
（2）将提取液浓缩或干燥，获得锦灯笼提取物。
优选地，步骤（1）中，超声的频率为40 kHz，超声的功率为250 W，超声的时间为30min。
为了提取更加充分，步骤（1）可以重复1-2次。
所述产品可以为药品、饲料或饲料添加剂，可以单独或与其他活性成分共同使用。可以添加其他辅料制备成便于饲喂或使用的剂型，如散剂、颗粒剂、口服液等。
本发明具有以下优点：
本发明提供的锦灯笼提取物可以在抑制鸡传染性支气管炎病毒复制环节发挥明显的抗病毒作用，对感染病毒具有预防和治疗作用，可以在制备抗毒药物中进行应用。锦灯笼提取物原料丰富、低廉、制备工艺简单、成本低，具有良好的开发与应用前景。
附图说明
图1为不同浓度锦灯笼提取物对CEK细胞存活率的影响，其中，*和**分别表示与0µg/mL相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图2为不同处理组CEK细胞病毒及炎症因子mRNA表达量，其中，*和**分别表示与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##分别表示与IBV组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图3为不同处理组预防感染IBV的鸡只血清炎症因子含量，其中，*和**分别表示与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##分别表示与模型组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图4为不同处理组预防感染IBV的鸡只组织中IBV和TNF-α mRNA含量，其中，*和**分别表示与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##分别表示与模型组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图5为不同处理组感染IBV的鸡只血清炎症因子含量，其中，*和**分别表示与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##分别表示与模型组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图6为不同处理组感染IBV的鸡只组织中IBV和TNF-α mRNA含量，其中，*和**分别表示与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##分别表示与模型组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 锦灯笼提取物的制备
（1）将干燥的锦灯笼宿萼剪碎后经粉碎机粉碎30 s，过20目筛获得粉末；
（2）称取一定质量的锦灯笼宿萼粉末，按照质量体积比（1:8）g/mL加入90wt%乙醇，设置超声功率250 W、频率40 kHz，提取2次，每次30 min，过滤后收集上清液，合并获得提取液；
（3）将获得的提取液，旋蒸浓缩至8 g/mL（每毫升浓缩液含原药材8 g），获得锦灯笼提取物，置于-20℃保存备用。
实施例2 锦灯笼提取物体外对鸡传染性支气管炎病毒的影响
1. 锦灯笼提取物作用于CEK细胞最佳用药浓度的筛选
分离鸡胚肾细胞（Chicken embryo kidney cells，CEK）接种于96孔板中，培养至细胞密度达到80%左右时弃掉原培养基，更换分别含有0、60、100、200、400、600、800和1000μg/mL浓度梯度锦灯笼提取物的培养基，每个浓度设置6个平行。待药物作用16 h后，弃掉培养基，用PBS小心清洗2次，加入含10% CCK-8的培养基，37℃避光培养3 h，测定在450 nm波长下的吸光度，通过细胞活性检测获得锦灯笼作用于细胞的安全用药浓度。结果如图1所示：结果表明锦灯笼提取物的浓度200 µg/mL和400 µg/mL时CEK细胞的存活率均极显著升高（P＜0.01），因此选择400 µg/mL的锦灯笼提取物作为IBV感染CEK细胞时的用药浓度。
2. 鸡传染性支气管炎病毒液的制备及病毒滴度检测
将实验室保存的IBV M41株以0.1 mL/胚的接种量经尿囊腔接种至9日龄SPF鸡胚，无菌收集24 h后死亡的鸡胚尿囊液和接种5 d后存活胚的尿囊液，于-80℃保存备用。通过鸡胚半数感染量（EID50）的方法测定病毒滴度，经Reed-Muench法核算IBV M41株的EID50为10-7.625/0.1 mL。
3. 锦灯笼提取物抑制IBV在CEK细胞中的复制及炎症反应
分离CEK细胞，并随机分为对照组、锦灯笼组、IBV组和锦灯笼+IBV组。待细胞密度达80%左右时，弃掉原细胞培养基，对照组和IBV组更换正常培养基，锦灯笼组和锦灯笼+IBV组更换含400 μg/mL锦灯笼提取物的培养基，随后分别向IBV组和锦灯笼+IBV组加入50 μL病毒液，每个分组设置3个平行。给药72 h时收集细胞，采用qPCR方法以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为参照对IBV病毒载量（IBV-N）和细胞炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的mRNA进行检测，引物序列如表1所示。
表1 Real-time PCR引物序列
实验结果如图2所示，结果显示：IBV可以感染CEK细胞，与对照组比呈现呈极显著上调（P＜0.01）；与IBV组相比，锦灯笼+IBV组细胞中IBV的病毒载量呈极显著下调（P＜0.01）（图2a）。与对照组相比，IBV感染会引起CEK细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6转录水平均的极显著性上调（P＜0.01）；添加锦灯笼提取物，会显著抑制IBV引起的IL-1β、TNF-α和IL-6上调（P＜0.05）。
实施例3 锦灯笼提取物对鸡只感染鸡传染性支气管炎病毒的预防作用
将17日龄SPF鸡随机分为空白对照组、模型组、1 g/kg锦灯笼组和3 g/kg锦灯笼组，每组10只。锦灯笼组的鸡只按照早晚两次的给药方式，按照体重分别灌服1 g/kg/d和3g/kg/d的锦灯笼提取物，于第一次给药后除对照组外的鸡只采用滴鼻点眼的方式感染IBV病毒液400 μL/只。在IBV感染96 h后剖杀所有鸡只，采集血液、肺脏和肾脏样品。采集的血液样品立刻分离血清，采用ELISA检测试剂盒（上海劲马实验设备有限公司）检测血清中炎症因子IL-6、TNF-α和IL-10的水平。采集的组织样品置于-80℃保存，用于qPCR检测组织中的IBV载量及TNF-α的含量。
血清中炎症因子的检测结果如图3所示，结果显示：IBV感染鸡只可显著上调血清中炎症因子TNF-α（P＜0.01）和IL-6（P＜0.05）的水平，下调抑炎因子IL-10的水平（P＜0.05）；添加1 g/kg/d和3 g/kg/d剂量的锦灯笼提取物均可以显著抑制IBV感染鸡只血清中炎症因子TNF-α和IL-6的上调（P＜0.05），而极显著恢复IBV感染引起的抑炎因子IL-10的降低（P＜0.01）。
肺脏和肾脏组织中IBV载量和TNF-α的含量如图4所示，结果显示：IBV感染鸡只后，IBV病毒可以在肺脏和肾脏中增殖，在感染后96 h呈现极显著性差异（P＜0.01），以1 g/kg/d和3 g/kg/d剂量给药均可以极显著抑制IBV在肺脏和肾脏中的增殖（图4a，图4c）。IBV感染鸡只，可以引起鸡只肺脏和肾脏中TNF-α的升高（P＜0.01），以1 g/kg/d和3 g/kg/d剂量给药可以有效抑制IBV感染引起的TNF-α升高（图4b，图4d）。
实施例4 锦灯笼提取物对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡只的治疗作用
将17日龄SPF鸡随机分为空白对照组、模型组和锦灯笼组，每组10只。模型组和锦灯笼组的鸡只采用滴鼻点眼的方式感染IBV病毒液400 μL/只，在感染IBV 60 h时根据体重按照1 g/kg剂量腹腔注射LPS。注射LPS后，锦灯笼组的鸡只按照早晚两次的给药方式，灌服3 g/kg/d的锦灯笼提取物，在连续给药72 h后剖杀所有鸡只，采集血液、肺脏和肾脏样品。采集的血液样品立刻分离血清，采用ELISA检测试剂盒（上海劲马实验设备有限公司）检测血清中炎症因子IL-6、TNF-α和IL-10的水平。采集的组织样品置于-80℃保存，用于qPCR检测组织中的IBV载量及TNF-α的含量。
血清中炎症因子的检测结果如图5所示，结果显示：IBV+LPS感染鸡只可极显著上调血清中炎症因子TNF-α和IL-6的水平（P＜0.05），下调抑炎因子IL-10的水平（P＜0.05）；采用3 g/kg/d剂量的锦灯笼提取物均进行治疗可以显著抑制IBV感染鸡只血清中炎症因子TNF-α和IL-6的上调（P＜0.05），而显著恢复IBV感染引起的抑炎因子IL-10的降低（P＜0.05）。
肺脏和肾脏组织中IBV载量和TNF-α的含量如图6所示。结果显示，IBV+LPS感染鸡只后，IBV病毒可以在肺脏和肾脏中增殖，且呈现极显著性差异（P＜0.01），以3 g/kg/d剂量给药进行可以极显著抑制IBV在肺脏和肾脏中的增殖（P＜0.01，见图6a，图6c）。IBV感染鸡只，可以引起鸡只肺脏（P＜0.05）和肾脏中TNF-α的升高（P＜0.01），以3 g/kg/d剂量给药治疗可以有效抑制IBV感染引起的TNF-α升高（P＜0.01，见图6b，图6d）。
Claims (4)
1.一种锦灯笼提取物在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎病毒产品中的应用，其特征在于，所述锦灯笼提取物为锦灯笼宿萼的乙醇提取物；
所述锦灯笼提取物的制备方法如下：
（1）称取锦灯笼宿萼粉末按照质量体积比1:8加入90%乙醇超声提取，获得提取液；
（2）将提取液浓缩或干燥，获得锦灯笼提取物；
步骤（1）中，超声的频率为40 kHz，超声的功率为250 W，超声的时间为30 min；
步骤（1）重复1-2次。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为药品、饲料或饲料添加剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品中还包含辅料。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品的剂型选自散剂、颗粒剂或口服液。
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