CN113813368B - 一种抗菌肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及拟穴青蟹阴离子抗菌肽的技术领域，公开了一种抗菌肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用，所述抗菌肽为专利CN201110250662.0所述的拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin，穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin能够明显的抑制草鱼呼肠孤病毒的活性。
Description
技术领域
本发明涉及拟穴青蟹阴离子抗菌肽的技术领域，特别是一种抗菌肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用。
背景技术
目前，我国草鱼养殖量约占总养殖量的20％，每年因病害造成的减产占年度草鱼总养殖量的30％以上。在草鱼病原中，以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)危害最大，其感染导致的草鱼出血病具有高传染性、高致死性，导致大规模减产，一直以来视为我国淡水养殖中最为突出的问题之一。草鱼呼肠孤病毒粒子呈二十面体对称，具有双层衣壳，无囊膜，基因组由11条双链RNA组成，草鱼呼肠孤病毒感染可引起草鱼各器官、组织出现不同程度充血、出血现象，发病死亡率高达80％以上。而目前对于草鱼呼肠孤病毒感染尚无理想的治疗方法，主要以预防工作为主。
抗菌肽被认为是鱼虾蟹贝等防御系统的主要成分之一，是生物体先天免疫系统的重要组成分。已预见到抗菌肽在海水养殖鱼类、蟹类、贝类等的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗耐药性细菌药物和饲料免疫添加剂。研究、开发与应用抗菌肽，对解决海水养殖生产中面临的细菌耐药性和鱼类饲料中滥用抗生素造成的水产品药物残留和水环境污染等问题具有重要的科学意义和实际应用价值，并且将会取得显著的经济效益。
发明内容
为此，需要提供一种抗菌肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用，开拓了拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin在抗草鱼呼肠孤病毒的新应用。
为实现上述目的，本发明提供了一种抗菌肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用，所述抗菌肽为专利CN201110250662.0所述的拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin。拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin 的氨基酸序列为：Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met ProLys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly Val Thr PheLeu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro Asp Gly Phe Tyr Thr AlaLys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg SerArg Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala SerAsn Tyr Lys Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr。
进一步，所述抗菌肽作为抗病毒活性成分用于制备抗草鱼呼肠孤病毒药物，且其应用剂量为1 μg/g-30 μg/g。
进一步，所述抗菌肽的应用剂量为10μg/g-20μg/g。
进一步，所述抗草鱼呼肠孤病毒药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步，所述抗草鱼呼肠孤病毒药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或缓释剂。
进一步，所述抗草鱼呼肠孤病毒药物的给药方式为拌饲投喂。
上述技术方案具有以下有益效果：
本发明创新性的将拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin应用于抗草鱼呼肠孤病毒药物中，能够有效的抑制草鱼呼肠孤病毒感染，且抑制作用强，另外抗菌肽的给药方式为拌饲投喂，给药方便能够极大的方便抗菌肽的市场应用。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
使用专利CN201110250662.0所述的拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin进行以下实验。拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin 的氨基酸序列为：Gly Gln Ala Leu Asn LysLeu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala GlyVal Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro Asp Gly PheTyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp Asn Pro Ile Val Gly GluGly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val GlnThr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala SerTyr。
实施例1，抗菌肽对CIK细胞的安全浓度检测
按常规方法传代培养CIK 细胞，将细胞数目调整至2×105/mL，于96孔微量培养板中每孔添加细胞悬液0.1 mL，置于28℃培养箱中培养过夜。用含有胎牛血清的细胞培养。用细胞培养基配置抗菌肽溶液，试验组浓度分别设为1μg/g、5μg/g、10μg/g、15μg/g、20μg/g、25μg/g、30μg/g，每孔加入0.1ml，设置空白对照组和细胞正常组，至于28℃培养96h，采用MTT比色法测定CIK的细胞存活率。结果表1所示。
细胞存活率=（试验组D490nm值-空白对照组D490nm）/（细胞正常组D490nm值-空白对照组D490nm），确定细胞存活率为95%及以上时的抗菌肽溶液的最高浓度为安全浓度上限。
表1.抗菌肽对CIK细胞的安全浓度试验
| 抗菌肽浓度 | 1μg/g | 5μg/g | 10μg/g | 15μg/g | 20μg/g | 25μg/g | 30μg/g |
| 细胞存活率 % | 99.8% | 99.1% | 98.3% | 96.1% | 95.7% | 94.3% | 91.7% |
由表1可知，抗菌肽在20μg/g及以下浓度范围时对CIK细胞活性影响较小，浓度在25μg/g及以上时对细胞活力影响较大，细胞存活力小于95％。
实施例2 抗菌肽的离体抗病毒效果。
将CIK细胞传到24孔板，28℃培养箱中培育12h，加入GCRV病毒，孵育48h后去除上清，分别加入1μg/g、5umg/g、10μg/g、15μg/g、20μg/g的抗菌肽细胞培养基溶液，空白对照组加入细胞培养基。检测感染24h和48h后我们通过荧光定量PCR来确定各个浓度的病毒滴度，结果如表2所示。
表2抗菌肽的离体抗病毒效果
由表2可知，在安全浓度范围内抗菌肽对GCRV病毒具有有效的抑制作用，并随着剂量的加大，抑制效果增强。
实施例3抗菌肽拌饲料投喂抗GCRV病毒的效果。
实验材料：试验用草鱼300尾，体长8±1cm，体重6±1g，平均分成6组，每组50尾。于试验池适应一周后进行试验。饲养及试验条件为，水温26-28℃，每日喂食两次。
健康对照组：未进行处理，饲喂普通市售鱼饲料。
PBS对照组：腹腔注射100uL的PBS溶液，饲喂普通市售鱼饲料。
攻毒对照组：腹腔注射100uL的GCRV病毒，饲喂普通市售鱼饲料。
10μg/g抗菌肽组：腹腔注射100uL的GCRV病毒，饲喂混含10μg/g抗菌肽的鱼饲料。
15μg/g抗菌肽组：腹腔注射100uL的GCRV病毒，饲喂混含15μg/g抗菌肽的鱼饲料。
20μg/g抗菌肽组：腹腔注射100uL的GCRV病毒，饲喂混含20μg/g抗菌肽的鱼饲料。
试验至连续7d不出现死亡鱼为止，统计各组存活个体数，统计结果如表3所示。
表3 抗菌肽对感染GCRV病毒草鱼的存活率影响。
| 项目 | 死亡个体数 | 存活个体数 | 存活率 |
| 健康对照组 | 0 | 50 | 100% |
| PBS对照组 | 1 | 49 | 98% |
| 攻毒对照组 | 43 | 7 | 14% |
| 10μg/g抗菌肽组 | 9 | 41 | 82% |
| 15μg/g抗菌肽组 | 7 | 43 | 86% |
| 20μg/g抗菌肽组 | 6 | 44 | 88% |
由表3可知，拟穴青蟹阴离子抗菌肽在应用到鱼饲料进行投喂时，对感染GCRV的草鱼有明显的提高存活率的效果，说明抗菌肽在体内有显著的抗GCRV病毒的作用，且随着抗菌肽浓度的增加，感染GCRV病毒草鱼的存活率越高。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (3)
1.一种抗菌肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用，其特征在于，所述抗菌肽为拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin；拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin 的氨基酸序列为：
Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr MetVal Gly Gln Pro Asn Ala Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu SerThr Arg Gln Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr HisAsp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys GlySer Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys Phe Thr Ile Asp GluVal Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr；
所述抗菌肽作为抗病毒活性成分用于制备抗草鱼呼肠孤病毒药物，且其应用剂量为10μg/g-20μg/g；
所述抗草鱼呼肠孤病毒药物的给药方式为拌饲投喂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗草鱼呼肠孤病毒药物还包括药学上可接受的辅料。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗草鱼呼肠孤病毒药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或缓释剂。
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| CN202111225469.1A CN113813368B (zh) | 2021-10-21 | 2021-10-21 | 一种抗菌肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用 |
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| CN102304536A (zh) * | 2011-08-29 | 2012-01-04 | 厦门大学 | 两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物及制备方法 |
| CN102304516A (zh) * | 2011-08-29 | 2012-01-04 | 厦门大学 | 拟穴青蟹阴离子抗菌肽的毕赤酵母表达产物及其制备方法 |
| CN109134635A (zh) * | 2018-08-07 | 2019-01-04 | 内蒙古科技大学 | 一种具有复合生物活性的抗菌肽及其制备方法与应用 |
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- 2021-10-21 CN CN202111225469.1A patent/CN113813368B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
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| 拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin及联合多肽Scy-hepc的表达和抗菌、抗病毒功能研究;彭会;万方学位论文数据库;1-147 * |
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