CN112755012A - S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药物中的应用 - Google Patents

S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开S‑甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药物中的应用，试验证明，在细胞水平，化合物S‑甲基异硫脲硫酸盐可显著抑制混合感染情况下大肠杆菌的增殖；在动物水平，通过滴鼻的方式给小鼠滴入S‑甲基异硫脲硫酸盐(20mg/kg/只)后，小鼠对H9N2亚型流感病毒与大肠杆菌混合感染的抵抗力增强，表现为比未滴鼻S‑甲基异硫脲硫酸盐的感染H9N2亚型流感病毒与大肠杆菌的小鼠的存活率提高，且肺脏中流感病毒与大肠杆菌的载量均明显减少。本发明发现该化合物在抗流感病毒与大肠杆菌混合感染中的有效应用，可作为新的抗流感病毒与大肠杆菌混合感染的候选药物，为临床上流感病毒与大肠杆菌混合感染的治疗提供更多的选择。

Description

S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药 物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种化合物在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药物中的应用，主要涉及iNOS高度选择性抑制剂S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药物中的应用。
背景技术
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)属于甲型流感病毒，可以引起禽类从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状；禽大肠杆菌病是由多种血清型的致病性大肠杆菌所引起的不同类型禽病的总称。包括大肠杆菌性气囊炎、败血症、脐炎、输卵管炎、腹膜炎及大肠杆菌肉芽肿等，对养禽业危害严重。大肠杆菌病是一种条件性疾病，不良的饲养管理、应激或并发其它病原感染都可成为大肠杆菌病的诱因。各种年龄的鸡都可感染大肠杆菌病，发病率和死亡率受各种因素影响有所不同。在雏鸡和青年鸡多呈急性败血症，而成年鸡多呈亚急性气囊炎和多发性浆膜炎。
H9N2亚型禽流感病毒虽然单独感染家禽时致死率不高，但当与大肠杆菌混合感染时，可显著提高家禽的死亡率。1977年，Nivas在火鸡中发现病原性大肠杆菌分离株介入火鸡支原体和低致病性禽流感的感染中，则可引起较高死亡率的急性大肠杆菌病的暴发。刘香敏等对山东省鸡源大肠杆菌与低致病性H9N2亚型禽流感病毒混合感染进行了调查，发现临床上H9N2 亚型禽流感病毒与大肠杆菌混合感染现象比较普遍，且在第一和第四季度检出率较高，这可能是因为流感在冬春季节发病率高，对呼吸系统造成损伤，从而使大肠杆菌容易侵入造成继发感染。齐茜等用H9亚型禽流感病毒分别与不同血清型的大肠杆菌感染肉仔鸡，结果表明：分别用O4、O78、O107不同血清型的大肠杆菌与H9亚型禽流感病毒分离株共同感染肉仔鸡，死亡率分别为65％、90％和70％，而这些不同血清型的大肠杆菌单独感染肉仔鸡时的死亡率分别为55％、70％和60％，明显高于H9亚型禽流感病毒单独感染的死亡率10％。曹丽萍等将病原性大肠杆菌经气管接种试验鸡后发现细菌主要存在于肺中并大量繁殖，通过血液引起全身反应。将大肠杆菌和H9N2亚型禽流感病毒混合感染试验鸡后，发现大肠杆菌在肺中定居时间会显著延长，且肺和气管的病变更为严重。
目前临床上H9N2亚型禽流感病毒与大肠杆菌混合感染的现象非常多见，混合感染导致疾病的进程、预后及治疗较单一病原感染者均发生显著改变。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明的S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药物中的应用，所述化合物S-甲基异硫脲硫酸盐结构式如式(I)所示：
Figure RE-GDA0003003008620000021
S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌混合感染的药物中的应用。
S-甲基异硫脲硫酸盐在制备治疗和/或预防流感病毒和大肠杆菌混合感染的药物的应用。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述流感病毒为H9N2亚型流感病毒，所述细菌为大肠杆菌。
一种抗流感病毒和大肠杆菌混合感染的药物，其活性成分为S-甲基异硫脲硫酸盐。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述流感病毒为H9N2亚型流感病毒，所述细菌为大肠杆菌。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述药物包括药物的直接粉碎物和药学上可以接受的载体。
本发明采用以上技术方案，具有以下有益效果：
实验证明，式I所示的化合物S-甲基异硫脲硫酸盐处理H9N2亚型流感病毒和大肠杆菌混合感染的MLE12细胞后，大肠杆菌的增殖速度受到明显抑制。将S-甲基异硫脲硫酸盐通过滴鼻的方式给H9N2亚型流感病毒和大肠杆菌共感染的小鼠模型使用后，小鼠对病毒和细菌混合感染的抵抗力有所增强，比未注射S-甲基异硫脲硫酸盐的感染病毒和细菌的小鼠存活率提高，肺脏病毒和细菌载量减少。本发明发现该化合物在抗流感病毒和大肠杆菌共感染中的有效应用，为临床上流感病毒和大肠杆菌共感染的治疗提供更多的选择。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步详细的说明：
图1为在细胞水平S-甲基异硫脲硫酸盐对大肠杆菌增殖的影响。
图2为对照组和试验组小鼠的生存曲线图。
图3为对照组和试验组肺脏中流感病毒和大肠杆菌载量的比较。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MLE12细胞(小鼠肺泡上皮细胞)：美国标准生物品收藏中心(American typeculture collection,ATCC)，编号为CRL-2110。
H9N2亚型流感病毒株：中国兽医微生物菌种保藏中心(China VeterinaryCulture Center,CVCC)，编号为AV1534。
大肠杆菌：中国兽医微生物菌种保藏中心(China Veterinary Culture Center,CVCC)，编号为CVCC1490。
S-甲基异硫脲硫酸盐[S-Methylisothiourea Sulfate(SMT)]:Boc Sciences 公司，编号为2260-00-6。
实施例1：化合物S-甲基异硫脲硫酸盐可在细胞水平抑制混合感染情况下大肠杆菌的增殖
接种适量MLE12细胞于9个T25细胞瓶中，至细胞汇合度为90％-100％时感染H9N2流感病毒。先用PBS清洗细胞2-3次，再加入2mL病毒维持液(无血清无双抗DMEM中含2μg/mL的胰酶)，其中6个细胞瓶中加入30μLH9N2亚型流感病毒(MOI＝1)。然后置于37℃，饱和湿度，5％CO2 浓度的细胞培养箱中培养1h，期间每隔15min摇晃一次细胞瓶。1h后，将病毒维持液弃去，再次用PBS清洗细胞3次后，向细胞瓶内加入8ml新鲜无双抗的病毒维持液，感染H9N2流感病毒的其中3个细胞瓶加入终浓度为1mM的S-甲基异硫脲硫酸盐，然后继续置于细胞培养箱中培养。培养 12h后取出，9个细胞瓶同时接种10μL大肠杆菌(1.5×109CFU/mL)，S-甲基异硫脲硫酸盐组的3个细胞瓶再次加入终浓度为1mM的S-甲基异硫脲硫酸盐，然后置于摇床上37℃，60rpm/min培养。细胞瓶于摇床培养至 6h取出，将细胞全部刮下吹打混匀，取1mL倍比稀释后滴10μL于麦康凯琼脂平板上，每个浓度梯度做3个重复，观察并记录菌落个数，对比三组细胞瓶中的细菌数目。如图1所示，与仅感染大肠杆菌组(对照组)相比，H9N2和大肠杆菌混合感染组在没有S-甲基异硫脲硫酸盐(SMT)药物加入时(S-甲基异硫脲硫酸盐(SMT)未处理组)可以显著促进大肠杆菌的增殖，而S-甲基异硫脲硫酸盐(SMT)药物处理(S-甲基异硫脲硫酸盐处理组)则使混合感染情况下大肠杆菌的数量明显减少。
实施例2：化合物S-甲基异硫脲硫酸盐(SMT)可增强小鼠对H9N2 亚型流感病毒与大肠杆菌混合感染的抵抗力
1.试验动物分组与处理
选取6周龄SPF级BALB/c母鼠60只(购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，随机分成3组，分别为正常不攻毒组(对照组)；H9N2亚型流感病毒与大肠杆菌混合感染-S-甲基异硫脲硫酸盐未处理组(试验Ⅰ组)； H9N2亚型流感病毒与大肠杆菌混合感染-S-甲基异硫脲硫酸盐处理组(试验Ⅱ组)，每组20只。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠分别滴鼻超纯水和S-甲基异硫脲硫酸盐(20mg/kg/只)预处理24h后，每组再滴鼻H9N2亚型流感病毒(5×104PFU)和大肠杆菌(1.5×107CFU)进行混合感染，置于相同环境中饲养。另外，试验Ⅱ组小鼠每天按照20mg/kg/只的剂量滴鼻S-甲基异硫脲硫酸盐处理，试验Ⅰ组每天滴入相同体积的超纯水作为对照。
每组的20只小鼠，其中15只按以下步骤2进行，另外5只按步骤3 进行。
2.检测S-甲基异硫脲硫酸盐对小鼠生存情况的影响
每天观察小鼠的精神状态及发病等情况，记录各组小鼠的存活时间，绘制存亡曲线。对照组小鼠在试验过程中均健康生长，未有死亡。试验Ⅰ组小鼠在H9N2亚型流感病毒与大肠杆菌混合感染后的第2d开始死亡，第 2d、3d、4d、的生存率分别为80％、67％、33％，至第5d时全部死亡；试验Ⅱ组小鼠在H9N2亚型流感病毒与大肠杆菌混合感染后第3d开始死亡，第3d、4d、5d和6d的生存率分别为87％、73％、66.7％和40％，至第8d 时试验Ⅱ组小鼠仍有40％存活(如图2所示)。通过对试验小鼠生存时间的比较，可以证明本发明中的化合物S-甲基异硫脲硫酸盐可延长H9N2亚型流感病毒与大肠杆菌混合感染小鼠的生存时间，对小鼠有明显保护作用。
3.检测S-甲基异硫脲硫酸盐处理对小鼠肺脏中流感病毒与大肠杆菌载量的影响
试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠在第3d时各取出5只断颈处死，取肺脏组织 60mg，置于1mL液体LB中，用组织研磨仪充分研磨，混匀后倍比稀释滴 10μL于麦康凯琼脂平板上，每个浓度梯度做3个重复，观察并记录菌落个数，对比两组小鼠肺脏中的细菌载量。另外称取肺脏组织60mg，置于1mL PBS中，用组织研磨仪充分研磨，-80℃冰箱反复冻融3次，4℃，2000g离心10min取上清液进行空斑实验，对比两组小鼠肺脏组织中病毒载量差异。结果显示，经S-甲基异硫脲硫酸盐处理的试验Ⅱ组小鼠肺脏中流感病毒与大肠杆菌载量都比试验Ⅰ组低，且差异极显著(如图3所示)。
综合2个实施例的结果，可证明化合物S-甲基异硫脲硫酸盐能抑制混合感染情况下H9N2亚型流感病毒与大肠杆菌的增殖，对动物具有显著的保护作用。
以上所述为本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理和精神的情况下凡依本发明申请专利范围所做的均等变化、修改、替换和变型，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌共感染药物中的应用，所述化合物S-甲基异硫脲硫酸盐结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002881828560000011
2.S-甲基异硫脲硫酸盐在制备抗流感病毒和大肠杆菌混合感染的药物中的应用。
3.S-甲基异硫脲硫酸盐在制备治疗和/或预防流感病毒和大肠杆菌混合感染的药物的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为H9N2亚型流感病毒，所述细菌为大肠杆菌。
5.一种抗流感病毒和大肠杆菌混合感染的药物，其活性成分为S-甲基异硫脲硫酸盐。
6.根据权利要求权利要求5所述的药物，其特征在于：所述流感病毒为H9N2亚型流感病毒，所述细菌为大肠杆菌。
7.根据权利要求5所述的一种抗流感病毒和大肠杆菌混合感染的药物，其特征在于：所述药物包括药物的直接粉碎物和药学上可以接受的载体。
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