CN106163553A - 多聚体‑多表位流感多肽的组合物及其产生 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含多聚体‑多表位流感多肽的药物悬液,涉及用于产生它们的方法以及涉及它们针对流感免疫接种受试者的用途。特别地,本发明涉及包含多聚体多表位多肽的稳定的水性微粒悬液。

Description

多聚体-多表位流感多化的组合物及其产生 发明领域

[0001] 本发明设及基于多聚体多表位肤的流感疫苗的药物组合物及它们的制备方法。特 别地,本发明提供了包含多聚体多表位多肤和含脈基的氨基酸的微粒悬液、它们的制剂及 它们用于针对流感保护受试者的用途。

[0002] 发明背景

[0003] 流感是由迅速突变的流感病毒引起的感染性很强的疾病。流感很容易传播,并W 季节性流行病在世界各地扩散,每年感染总人口的5%-20%。根据世界卫生组织(WHO),每 年在季节性爆发期间250,000-500,000人死于流感相关的原因。仅在美国(USA),在典型年 中,多于200,000人因季节性流感住院。流感感染可W是轻度的、中度的或严重的,范围从无 症状经由轻度上呼吸道感染和气管支气管炎至严重的、偶尔致死的病毒性肺炎。感染与肺 部和屯、血管并发症相关,所述并发症导致高发病率和死亡率,主要影响处于风险中的人群 诸如幼儿、老人及患有慢性医学状况的个体。

[0004] 在=种类型的流感病毒中,甲型流感病毒和乙型流感病毒分别引起人类中的约 80%和20%的流感疾病,而丙型流感病毒不感染人类。由于血凝素化A)和神经氨酸酶(NA) 表面蛋白的频繁的抗原漂移和转变,甲型流感病毒具有许多子毒株和物种特异性的特点并 被认为是广泛季节性流行病和大流行病的主要原因。在抗原变化后,经由未被免疫系统识 别的病毒毒株的感染可导致被感染的个体的降低的免疫应答,其中更显著的变化将产生不 太有效的对身体免疫防御的刺激。抗原漂移或转变可触发各自的流感流行病或大流行病, 如最近的禽流感和猪流感大流行病毒株经历的。

[0005] 迄今,商购可得的流感疫苗包含每年根据是高峰流感季节期间最普遍的毒株的预 测选择的甲型流感抗原和乙型流感抗原。然而,由于包含在疫苗中的毒株和实际上流通的 那些之间的错配,运些毒株特异性疫苗通常具有相对差的临床效力。另外,此类免疫接种方 法要求在每年的基础上制备新的疫苗制剂。如此,识别多种病毒毒株的疫苗将更具成本效 益并且将进一步增加患者依从性且增强全球的健康前景。

[0006] 目前在使用中的商业流感疫苗组合物是通常包含W下的水性溶液:憐酸盐、钢离 子、钟离子和/或巧离子缓冲剂,其中添加化iton、吐溫、a-生育酪班巧酸氨(a-tocophe巧1 hy化Ogen succinate)和/或其他添加剂或赋形剂。FLUMIST™(MedImmune),一种用于流感的 递呈季节性流感的表面抗原的活的减毒疫苗作为包含W下的溶液被提供:约0.05M精氨酸、 0.188mg谷氨酸一钢、2mg水解猪明胶、13.68mg薦糖、2.26mg憐酸氨二钟及0.96mg憐酸二氨 钟。

[0007] 属于本发明的一些发明人的PCT国际公布WO 2009/016639公开了流感多表位多肤 及包含多种流感病毒肤表位的疫苗,其中每个表位在单个多肤中出现至少两次。

[000引多聚体-OOl(M-OOl)疫苗由九种保守的线性表位组成,该九种保守的线性表位按 照每种的S次重复来排列并作为表达于大肠杆菌化scherichia col i )化.col i)中的单个 重组多肤来制备。运些表位对于绝大多数流感病毒毒株是共同的,无论它们的抗原漂移和 转变。因此,期望M-OOl还提供针对未来病毒毒株的基于免疫的保护。尽管每种菌株的外蛋 白中存在变异,多聚体-OOl接种导致有效的跨毒株识别和保护。

[0009] 用多种动物模型获得的显著性结果W及在重复的毒理学研究中观察到的安全性 参数已为朝向在人中的临床试验作准备并提供了基础。已完成了评价M-OOl在成年和老年 志愿者中的安全性和免疫原性的阶段I/II和阶段II临床试验(Atsmon等,2014 ,Vaccine 32,5816-5823)。在PBS中的125-50化g剂量的带佐剂或无佐剂的疫苗被证明是安全的和良 好耐受的。在GLP毒理学研究中评价了潜在的多聚体-OOl疫苗相关的毒性。W最大人类剂量 反复IM施用两种M-OOl疫苗制剂(带佐剂的和无佐剂的)被证明是安全的。

[0010] 属于本发明的一些发明人的WO 2012/114323提供了一种通过在流感疫苗之前或 与流感疫苗一起将包含多个拷贝的多种流感病毒肤表位的多聚体流感多肤施用至受试者 来改进季节性或大流行性流感疫苗的保护效应的方法。

[0011] 当异源蛋白被表达于大肠杆菌中时包含体(IB)的形成频繁地发生,并且活性重组 蛋白的复原通常要求重折叠成其的活性结构。Wingfield,P.T. (Current Protocols in Protein Science. 2003,30:6.1.1-6.1.37)综述了在大肠杆菌中产生的重组蛋白的纯化。

[0012] 精氨酸被用于重折叠和纯化由IB获得的蛋白,并且表现为对在化学和物理性质方 面不同的多种蛋白有效。精氨酸在蛋白重折叠、增溶和纯化中的作用被Tsumoto等综述 (BiotechnolP;rog.2004S邱-0ct;20(5):1301-8;Schneide;r等,(J F*hysQiem B.2011Jun 9; 115(22):7447-58))〇

[001引先前描述了精氨酸的抗聚集效应和稳定化效应。例如,L y U t O V a等, (BiotechnolP;rog.2007Nov-Dec;23(6): 1411-6)研究了,当蛋白聚集通过加热或通过添加 二硫苏糖醇(DTT)从折叠状态转变来诱导时,低浓度的精氨酸(1 -1 OmM)对蛋白聚集的效应。

[0014] 已提出了,低分子量添加剂,诸如心精氨酸通过抑制导致沉淀的分子间疏水作用 来增强复性产量。化等,(Protein Sci . 2003,12,708-716)证明了,1^-精氨酸通过增加蛋白 溶解度抑制聚集。

[0015] 由于W下原因的一个或更多个,产生呈药物悬液形式的蛋白通常是有利的:多肤 的溶解度;多肤的稳定性;控制或改变多肤的释放谱。

[0016] 蛋白微米颗粒或纳米颗粒的悬液可通过许多方法来产生。此类颗粒可最初作为较 大颗粒被产生,随后是通过物理或化学方法的尺寸减小程序。一些其他方法包括结晶、冻 干、喷雾干燥及超临界流体颗粒形成或去溶剂化。

[0017] WO 2009/015736公开了一种产生纯化的重组GDF-5相关蛋白的方法,所述方法包 括用包含心精氨酸的变性增溶缓冲液处理包含体。

[0018] WO 2012/054679公开了用于从包含重组蛋白和包含体的混合物中纯化重组蛋白 的方法,所述方法包括:a)用包含乙醇胺、精氨酸、EDTA、尿素和DTE的增溶缓冲液使包含重 组蛋白和相关包含体的混合物溶解。

[0019] US 2003/0199441设及一种产生复性的前胶原前肤的方法,其中产生于大肠杆菌 中的包含体被溶解于0.5M至8M变性缓冲液中,随后运被逐滴添加进有限稀释缓冲液(是在 约中性抑附近的并包含在200nM至1 ,OOOnM之间的终浓度的心精氨酸和二硫键还原性偶联 氧化还原系统),并然后该缓冲液混合物针对W下来透析:针对包含在50nM至200nM的终浓 度的心精氨酸和二硫键还原性偶联氧化还原系统的生理缓冲液,W及稍后针对包含二硫键 还原性偶联氧化还原系统的生理缓冲液,W及最后针对生理缓冲液。

[0020] US 2004/0137588描述了一种从生物样品纯化多肤的方法,其在精氨酸的存在下 使多肤经历重折叠条件。

[0021] 具有用于在改进的多聚体-多表位流感疫苗中使用的具有均匀粒度分布的微粒多 肤的稳定的悬液将是有利的。还需要此类组合物的有效产生方法。

[0022] 发明概述

[0023] 本发明提供了改进的流感疫苗悬液,所述改进的流感疫苗悬液包含至少一种多聚 体流感多肤和含脈基的氨基酸或其衍生物,所述至少一种多聚体流感多肤包含多个拷贝的 多种流感病毒肤表位,本文称为多聚体-多表位多肤。还提供了产生此类悬液组合物的方 法。

[0024] 本发明部分地基于W下发现:在从多聚体-多表位多肤溶液去除离液剂和还原剂 期间可控产生蛋白聚集体,连同添加氨基酸精氨酸,导致在期望的蛋白浓度和接近生理pH 的pH下的多聚体-多表位多肤的稳定且均匀的微粒悬液,克服对高压均化W将大的无定型 聚集体转化为可注射剂型的需求。

[0025] 根据一个方面,本发明提供了呈水性悬液形式的药物组合物,所述药物组合物包 含至少一种多聚体-多表位多肤、含脈基的氨基酸或其衍生物W及药学上可接受的稀释剂、 赋形剂或载体。

[0026] 根据一些实施方案中,药物组合物呈用于针对流感免疫接种受试者的疫苗的形 式。

[0027] 根据一些实施方案,含脈基的氨基酸为精氨酸(Arg)。

[0028] 根据其他实施方案,含脈基的氨基酸为精氨酸衍生物。

[0029] 根据本发明,可使用心精氨酸或D-精氨酸或其衍生物的任何盐或游离的酸、或其 混合物。

[0030] 根据一些实施方案,精氨酸为心精氨酸化-Arg)。

[0031] 根据一些实施方案,Arg化合物选自由W下组成的组:Arg-盐酸盐、Arg-硫酸盐、 Arg-憐酸盐、Arg-巧樣酸盐、Arg-乙酸盐及Arg游离酸。每种可能性代表了本发明的单独的 实施方案。

[0032] 根据一些实施方案,组合物包含L-Arg盐酸盐化-Arg肥1)。

[0033] 根据一些实施方案,药物组合物包含在0.1-2. OM的浓度的含脈基的氨基酸或其衍 生物。

[0034] 根据一些实施方案,药物组合物包含在0.15-0.45M的浓度的心精氨酸。根据其他 实施方案,在药物组合物中的精氨酸浓度为0.15-0.30M。

[0035] 根据一些实施方案,药物组合物包含具有I-SOmM的浓度的另外的缓冲剂。

[0036] 根据一些实施方案,缓冲剂选自由W下组成的组:巧樣酸盐缓冲剂、=径甲基氨基 甲烧(Tris)缓冲剂、肥PES(4-(2-^乙基)-1-赃嗦乙横酸盐)缓冲剂、赖氨酸缓冲剂、甘氨酸 缓冲剂、M0PS(3-(N-吗嘟代)丙横酸盐)缓冲剂、咪挫缓冲剂及MES(2(N-吗嘟代)乙横酸盐) 缓冲剂。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0037] 根据具体的实施方案,组合物包含选自由W下组成的组的缓冲剂:巧樣酸盐缓冲 剂、赖氨酸缓冲剂及甘氨酸缓冲剂。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0038] 根据特定的实施方案,组合物包含巧樣酸盐缓冲剂。

[0039] 根据一些实施方案,药物组合物的pH在pH 5.0至7.6的范围内。根据特定的实施方 案,药物组合物的抑在pH 5.5至7.0的范围内。根据其他特定的实施方案,缓冲剂保持抑在 5.7-6.5的范围内。

[0040] 根据某些具体的实施方案,提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含l-5mg/ ml多聚体-多表位流感多肤、0.1-0.5M心精氨酸及IO-SOmM巧樣酸盐缓冲剂,具有在5.0至 7.0的范围内的抑。

[0041] 根据具体的实施方案,药物组合物包含l-4mg/ml多聚体-多表位流感多肤、0.1- 0.3M心精氨酸及10-30mM巧樣酸盐缓冲剂,具有在5.5至6.5的范围内的抑。

[0042] 根据具体的实施方案,药物组合物包含约2.5mg/ml多聚体-多表位流感多肤、约 0.2M精氨酸、约20mM巧樣酸盐缓冲剂,且抑为约6。

[0043] 根据一些实施方案,药物组合物是包含不溶性聚集体的悬液,所述不溶性聚集体 具有在0.5-50WI1的范围内的粒度分布,其中95 %的聚集体尺寸落入一个数量级的范围内。

[0044] 根据一些实施方案,悬液中的95%的聚集体具有选自由W下组成的组的粒度分 布:0.5-51«11、1-10^11、3-30^11及5-50^11。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0045] 根据一些实施方案,多聚体-多表位流感多肤经重组产生。

[0046] 根据一些具体的实施方案,多聚体-多表位流感多肤被称为具有如在SEQ ID NO: 86中列出的氨基酸序列的M-OOl。

[0047] 根据另一个方面,本发明提供了一种产生纯化的重组多聚体-多表位多肤悬液的 方法,所述方法包括W下步骤:

[004引i .使包含至少一种多聚体-多表位多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所述溶液 包含离液剂、缓冲剂及还原剂,具有在7至11的范围内的抑;W及

[0049] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集,从而形成不溶性聚集体悬液;

[0050] iii.添加精氨酸W获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定且均匀的悬液,其中95% 的聚集体尺寸落入一个数量级的尺寸范围内。

[0051] 根据具体的实施方案,离液剂包含5-8M尿素和1-4M硫脈。

[0052] 根据特定的实施方案,在步骤(ii)中逐渐去除离液剂和还原剂通过超滤进行。

[0053] 根据一些实施方案,在步骤(i)中的CHAPSW0.5 %-2 %的浓度存在。

[0054] 根据一些实施方案,方法包括W下步骤:

[0055] i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肤的大肠杆菌细胞;

[0056] ii .进行裂解和细菌细胞破坏,W提供包含多聚体-多表位流感多肤的包含体; [0化7] i i i .使包含体溶解于运样的溶液中,所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脈、0.5 % - 4%CHAPS(3-[(3-胆酷胺丙基)二甲基胺基]-1-丙横酸盐)、缓冲剂及还原剂,在7至11的范 围内的抑;

[0058] iv.通过逐步去除离液剂和还原剂诱导可控聚集,从而形成不溶性聚集体悬液;

[0059] V.添加精氨酸W获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定且均匀的悬液,其中95%的 聚集体落入一个数量级的尺寸范围内。

[0060] 根据一些实施方案,逐渐去除离液剂和还原剂使用本领域已知的程序通过超滤进 行。

[0061] 根据一些实施方案,在步骤(iii)和(iv)之间进行至少一个色谱分离步骤。根据一 些实施方案,该至少一个色谱分离步骤选自由离子交换色谱和疏水作用色谱组成的组。

[0062] 根据一些实施方案,步骤(V)在步骤(iv)的聚集体形成之前或期间进行。

[0063] 根据又其他实施方案,步骤(V)在步骤(iv)的聚集体形成之后进行。

[0064] 根据一些实施方案,方法包括:

[0065] i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肤的大肠杆菌细胞;

[0066] ii.进行大肠杆菌细胞的裂解、细菌细胞破坏和离屯、,W提供包含多聚体-多表位 流感多肤的包含体;

[0067] iii.进行包含体的至少一次洗涂;

[006引iv.使包含体溶解于运样的溶液中,所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脈、0.5 % -4 % CHAPS(3-[(3-胆酷胺丙基)二甲基胺基]-1-丙横酸盐)、还原剂W及提供pH在7-10的范围内 的缓冲剂;

[0069] V.使溶液经历至少一个色谱步骤;

[0070] Vi.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集,从而形成不溶性聚集体;

[0071 ] Vii .添加含脈基的化合物,W及

[0072] Viii .配制(Vi i)的组合物,W获得最终悬液约0.1-0.4M含脈基的氨基酸和10- 40mM巧樣酸盐缓冲剂的,在4至8的范围内的抑的最终悬液。

[0073] 根据其他实施方案,步骤(Vii)的含脈基的化合物的添加在诱导可控聚集期间逐 渐地进行。

[0074] 根据一些实施方案,裂解在7至9的范围内的pH的缓冲液中进行,所述缓冲液包含 his缓冲剂、邸TA和每Ig细胞糊状物0.1-0.5mg溶菌酶。

[0075] 根据一些实施方案,步骤(Vi)的诱导可控聚集通过超滤进行。

[0076] 根据一些实施方案,超滤包括W下步骤:

[0077] i.缓冲液更换I,用 IO-SOmM MES 缓冲液,pH 4-6.5;

[0078] ii.缓冲液更换II,用20-80mM巧樣酸盐缓冲液、0.1-1M精氨酸,pH 4-6;

[0079] iii .缓冲液更换III,用10-SOmM巧樣酸盐缓冲液、0.1 -0.5M精氨酸,pH 4.0至7.5。

[0080] 根据其他实施方案,超滤包括W下步骤:

[0081 ] i.缓冲液更换I,用IO-SOmM MES缓冲液,pH 4.0至6.5;

[0082] ii.缓冲液更换II,用20-80mM巧樣酸盐缓冲液,pH 4至6;

[0083] iii.用包含精氨酸的溶液稀释至0.1-IM精氨酸浓度。

[0084] 根据一些实施方案,在最终组合物中的多肤浓度为1-lOmg/ml。

[0085] 根据一些实施方案,至少一种多聚体-多表位流感多肤序列在SEQ ID NO.86中列 出。

[0086] 根据一些实施方案,至少一种多聚体-多表位流感多肤由在SEQ ID NO.85中列出 的多核巧酸序列编码。

[0087] 根据一些具体的实施方案,方法包括W下步骤:

[0088] i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所 述溶液包含6M尿素、2M硫脈、1 % CHAPS、SOmMP-琉基乙醇、50mM甘氨酸,具有约9.5的抑;

[0089] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂(尿素、硫脈和0-琉基乙醇)诱导聚集,从而形成 不溶性聚集体的悬液;

[0090] iii.通过包括逐渐添加0.5M精氨酸缓冲液的超滤,使悬液经历浓缩和缓冲液更换 步骤;W及

[0091 ] iv.使悬液经历缓冲液更换,W获得最终组合物,所述最终组合物包含约2.5mg/ml 多肤、约0.2M精氨酸和约20mM巧樣酸盐缓冲剂,具有抑约6。

[0092] 根据又另一个方面,本发明提供了一种产生重组多聚体-多表位多肤的基本上稳 定的水性悬液的方法,所述方法包括W下步骤:

[0093] i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所 述溶液包含6M尿素、2M硫脈、1 % CHAPS、SOmMP-琉基乙醇、5-50mM甘氨酸,具有在7至10的范 围内的抑;

[0094] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集,从而形成不溶性聚集体的悬液;

[00M] iii.通过包括逐渐添加精氨酸缓冲液或巧樣酸盐缓冲液的超滤,使悬液经历浓缩 和缓冲液更换步骤;W及

[0096] iv.使悬液经历缓冲液更换,W获得最终稳定且均匀的悬液,所述最终稳定且均匀 的悬液包含约l-5mg/ml多肤、约0.1-0.5M精氨酸和约IO-SOmM巧樣酸盐缓冲剂,具有在4至7 的范围内的抑。

[0097] 根据一些实施方案,方法包括W下步骤:

[0098] i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所 述溶液包含6M尿素、2M硫脈、1 % CHAPS、SOmMP-琉基乙醇、50mM甘氨酸,具有约9.5的抑;

[0099] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集,从而形成不溶性聚集体的悬液;

[0100] iii.通过包括逐渐添加0.1-IM精氨酸缓冲液的超滤,使悬液经历浓缩和缓冲液更 换步骤;W及

[0101] iv.使悬液经历缓冲液更换,W获得最终悬液,所述最终悬液包含约l-5mg/ml多 肤、约0.1-0.5M精氨酸和约IO-SOmM巧樣酸盐缓冲剂,并具有在4至7的范围内的抑。

[0102] 根据其他实施方案,在步骤(iv)获得最终悬液,所述最终悬液包含约2.5mg/ml多 肤、约0.2M精氨酸和约20mM巧樣酸盐缓冲剂,并具有约6的抑。

[0103] 根据其他实施方案,方法包括W下步骤:

[0104] i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所 述溶液包含6M尿素、2M硫脈、1 % CHAPS、SOmMP-琉基乙醇、50mM肥阳S、5mM甘氨酸,并具有约 8.0的抑;

[0105] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集,从而形成不溶性聚集体的悬液;

[0106] iii.通过包括逐渐添加20-80mM巧樣酸盐缓冲液的超滤,使悬液经历浓缩和缓冲 液更换步骤;W及

[0107] iv.使悬液经历用包含精氨酸的溶液的稀释,W获得最终均匀的微粒悬液,所述最 终均匀的微粒悬液包含约l-5mg/ml多肤、约0.1-0.5M精氨酸和约IO-SOmM巧樣酸盐缓冲剂, 并具有在4至7的范围内的pH。

[0108] 根据其他实施方案,在步骤(iv)中获得最终稳定且均匀的微粒悬液,所述最终稳 定且均匀的微粒悬液包含约2.5mg/ml多肤、约0.2M精氨酸和约20mM巧樣酸盐缓冲剂,并具 有约6的抑。

[0109] 根据一些实施方案,最终微粒悬液包含在0.5-50WI1的范围内的聚集体粒度分布, 其中95 %的聚集体尺寸落入一个数量级的范围内。

[0110] 根据一些实施方案,在最终微粒悬液中的95 %的聚集体具有选自由W下组成的组 的粒度分布:0.5-5皿、1-10皿、3-30皿及5-50皿。每种可能性代表了本发明的单独的实施方 案。

[0111] 本发明还提供了根据本文详述的任一种方法产生的药物组合物。

[0112] 根据本发明的多聚体多肤包含多种流感病毒肤表位,每个表位在单个多肤中出现 至少两次。在本发明的上下文中,"多聚体"多肤是包含多肤的氨基酸段的不一定相邻的多 个重复(至少两个,通常至少=个或更多个)的多肤。因此,术语"多聚体多表位"指包含多种 表位的多个重复的多肤。多聚体多表位多肤可经重组产生,作为分离的多肤或作为融合蛋 白。多肤聚集体可独立使用或与另外的佐剂混合或配制。

[0113] 包含在本发明的药物组合物和疫苗组合物中的多聚体多表位多肤包含流感病毒B 细胞表位、T辅助表位和细胞毒性淋己细胞(CTL)表位的组合。表位优选地选自血凝素蛋白 (HA)肤、基质蛋白(Ml和/或M2)肤及核蛋白(NP)肤的保守的(非高变)区域。表位优选地具有 可证实的针对几种人流感亚型的交叉反应活性,并因它们的诱导细胞和体液免疫应答的改 进的能力被选择。

[0114] 根据其他实施方案,在被包含在根据本发明的组合物中的多聚体多肤内的流感肤 表位选自由SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:82组成的组。每种可能性代表了本发明的单独的实 施方案。

[0115] 根据一些具体的实施方案,流感肤表位选自表位E1-E9(SEQ ID N0.82、48、25、52、 51、59、89、69和70)。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0116] 根据一些具体的实施方案,多聚体多表位多肤包含3-5个重复的W嵌段共聚物结 构或W交替顺序聚合结构排列的4-9种表位。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0117] 根据又其他实施方案,被包含在根据本发明的药物组合物中的多聚体多肤序列选 自由W下组成的组:沈Q ID N0:84、沈Q ID N0:86和沈Q ID N0:88。每种可能性代表了本发 明的单独的实施方案。

[0118] 根据本发明的药物组合物可经由选自由W下组成的组的途径施用:肌内、鼻内、口 月良、腹膜内、皮下、局部、皮内W及经皮递送。

[0119] 根据特定的实施方案,药物组合物经鼻内、经肌内或经皮内施用。根据一些实施方 案,被包含在药物组合物中的多聚体多肤不被缀合至载体或融合蛋白并且不含载体或融合 蛋白。在其他实施方案中,被包含在本发明的药物组合物中的多肤还可包含载体序列,即肤 表位被插入在载体多肤的序列内或被偶联至载体序列。

[0120] 根据一些实施方案,根据本发明的药物组合物不包含佐剂。根据其他实施方案,疫 苗还包含药学上可接受的佐剂。

[0121] 药学上可接受的佐剂包括,但不限于,油包水乳液、脂质乳液或亚微米水包油乳液 及脂质体。根据具体的实施方案,佐剂选自由W下组成的组:Montanide™、明抓、胞壁酷二 肤、Gelvac®、几下质微粒、壳聚糖、霍乱毒素 B亚基、Mralipicf、Lipo化ndin ®或细菌脂 质、脂蛋白和/或膜蛋白。

[0122] 在一些实施方案中,疫苗被配制用于肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、皮内和 经皮递送。在一些实施方案中,疫苗经鼻内施用。在其他实施方案中,疫苗经肌内施用。在又 其他实施方案中,疫苗经皮内施用。

[0123] 根据另外的方面,本发明提供了一种在受试者中诱导免疫应答并赋予针对流感的 保护的方法,所述方法包括将W上描述的呈疫苗形式的药物组合物施用至受试者。

[0124] 根据本发明的疫苗组合物用于针对流感免疫接种的用途也在本发明的范围内。根 据本发明的疫苗组合物可被施用,作为单独的疫苗,或作为包括与季节性或大流行流感疫 苗一起共施用的疫苗接种方案的一部分。根据本发明的共施用涵盖,多聚体多肤和季节性 或大流行性疫苗两者被包含在一种组合的组合物中,或它们在两个单独的疫苗接种中W至 少24小时间隔被施用至患者。

[0125] 根据一些实施方案,包含至少一种多聚体-多表位流感多肤的疫苗组合物与季节 性或大流行性流感疫苗一起共施用。

[0126] 被包含在本发明的组合物中的包含多种流感病毒肤表位的多聚体-多表位多肤可 作为重组蛋白、融合蛋白及通过化学合成来产生。

[0127] 本发明还提供了包含至少一种多聚体流感多肤和至少一种常规季节性或大流行 性流感组合物的组合的药物组合物。常规季节性疫苗(TIV)通常包含=种灭活的或活的减 毒流感病毒毒株(每年由WHO选择的),W提供针对预期在即将到来季节感染的毒株的保护。 大流行性疫苗通常包含一种对引起大流行病的相关毒株特异的流感病毒毒株。

[0128] 本发明适用性的另外的实施方案和全部范围将从下文给出的详细描述变得明显。 然而,应当理解,详细描述和具体实施例,尽管指示本发明的特定的实施方案,但仅通过说 明性方式给出,因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改从该详细描述对本领域技 术人员将是明显的。

[0129] 发明详述

[0130] 本文提供了多聚体多表位多肤流感疫苗的改进的药物组合物,W及用于它们产生 的方法。运些药物组合物具有改进的稳定性特性。尽管先前的包含多聚体多表位流感多肤 的组合物是基于憐酸盐缓冲盐水,难W生产,且具有再聚集的趋势,本发明提供了包含氨基 酸精氨酸或其衍生物和巧樣酸盐缓冲剂的稳定的悬液组合物W及用于它们产生的改进的 方法。

[0131] 在先前已知的制备方法中,通过抑从碱性转向至中性pH来诱导多肤聚集,导致创 造大的无定型聚集体,运要求高压均化W将其转化为可注射形式。本发明克服了运些限制, 通过在从多肤溶液去除离液剂和还原剂期间可控产生蛋白聚集体,连同添加氨基酸精氨 酸,导致多聚体-多表位流感多肤的稳定且均匀的微粒悬液。

[0。。多聚体多表位多肤

[0133] 在根据本发明的疫苗和方法中使用的多聚体多肤包含至少两个重复的每个表位。 根据一些特定的实施方案,根据本发明的多聚体多肤包含至少=个重复的每个表位。还提 供了包含季节性或大流行性疫苗和至少一种多聚体多表位多肤的疫苗组合物,所述至少一 种多聚体多表位多肤包含多种流感病毒肤表位。

[0134] 提供了用于包含选自表1的流感表位的多聚体疫苗的多种示例性实施方案,其中 对于每个表位的重复数目相同或不同,且其中多肤可W交替顺序聚合结构或嵌段共聚物结 构排列。术语巧替顺序聚合"结构意指,被包含在多肤中的单拷贝的所有表位顺序排列,并 且该排列被顺序重复等于重复数的次数。例如,如果多聚体多表位多肤包含四个重复的呈 交替顺序结构的S种表位Xl、)(2和X3,多肤具有W下聚合结构:XlX2X3-XlX2X3-XlX2X3-XlX2X3, 还写成[XlX2X3]4。术语"嵌段共聚物"结构意指,被包含在多肤中的所有拷贝的单个表位被 相邻排列。例如,包含四个重复的呈嵌段共聚物结构的立种表位Xl、X2和X3的类似的多聚体 多表位多肤具有W下聚合结构:XlXlXlX广拉拉拉拉-X3X3X3X3,还写成[A]4-[B]4-[C]4。

[0135] 在根据本发明的药物组合物中使用的合成的或重组的流感多表位多肤选自由W 下组成的组:

[0136] i.B(XiZ拉Z-,Xm)nB; W及

[0137] ii.B(Xl)nZ(X2)nZ---(Xm)nB;

[0138] 其中B指示0-4个氨基酸残基的序列;n在每次出现时,独立地为2-50的整数;m为3- 50的整数;XI、拉一Xm的每个为由4-24个氨基酸残基组成的流感肤表位;Z在每次出现时为键 或1-4个氨基酸残基的间隔区;且其中在多肤中的氨基酸残基的最大数目为约1000。每种可 能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0139] 根据一些实施方案,n在每次出现时独立地为2-50的整数;m为3-15的整数;X广Xm的 每个是选自由B细胞型表位、T辅助(Th)型表位和细胞毒性淋己细胞(CTL)型表位组成的组 的由4-24个氨基酸残基组成的流感肤表位。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0140] 根据又其他实施方案,n在每次出现时独立地为2-15的整数,且m为3-12的整数。每 种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0141] 根据一些具体的实施方案,m为4-9的整数,且n为3-5的整数。每种可能性代表了本 发明的单独的实施方案。

[0142] 根据一些具体的实施方案,m为9且n为3。

[0143] 根据其他实施方案,被包含在本发明的药物组合物中的多聚体多肤的流感肤表位 选自由W下组成的组:血凝素化A)肤、Ml肤、M2肤W及核蛋白(NP)肤。每种可能性代表了本 发明的单独的实施方案。

[0144] 根据其他实施方案,在被包含在根据本发明的组合物中的多聚体多肤内的流感肤 表位选自由SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:82(在表1中描述的)组成的组。每种可能性代表了本 发明的单独的实施方案。

[0145] 表1:

[0146]

Figure CN106163553AD00141
Figure CN106163553AD00151

[014 引

[0149] 根据一些具体的实施方案,流感肤表位选自在表2中详述的表位E1-E9(SEQ ID 備82、48、25、52、51、59、89、69和70)。

[0150] 表2:流感肤表位El至E9

[0151]

Figure CN106163553AD00161

[0152] 应该注意,本文列出的肤表位仅作为出于示例性的目的来提供。流感病毒蛋白在 分离株之间变化,从而提供对于每种流感蛋白的多种变体序列。因此,本发明包括具有一个 或更多个氨基酸取代、添加或缺失的肤表位。

[0153] 根据更具体的实施方案,包括在被包含在根据本发明的疫苗药物组合物中的多聚 体多肤中的流感肤表位由W下组成:HA 354-372化1,沈Q ID N0:82)、HA 91-108化2,SEQ ID N0:48)、M1 2-12化3,沈Q ID N0:25)、HA 150-159化4,沈Q ID N0:52)、HA 143-149巧5, SEQ ID N0:51)、NP206-229化6,SEQ ID N0:64)、HA 307-319化7,SEQ ID N0:59或89)、 順335-350化8,569 10備:69)及順 380-393化9,沈9 10備:70)。

[0154] 根据又其他实施方案,被包含在根据本发明的药物组合物中的多聚体多肤序列选 自由W下组成的组:沈Q ID N0:84、沈Q ID N0:86和沈Q ID N0:88。每种可能性代表了本发 明的单独的实施方案。

[0155] 根据又其他实施方案,被包含在根据本发明的药物组合物中的多聚体多肤序列被 选自由W下组成的组的多核巧酸序列编码:SEQ ID N0:83、沈Q ID N0:85和SEQ ID N0:87。 每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0156] 在一些实施方案中,药物组合物包含=至五个重复的W嵌段共聚物结构或W交替 顺序聚合结构排列的五至九种表位。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。

[0157] 根据一些实施方案,本发明的药物组合物包含=个重复的W W下嵌段共聚物结构 [E1E1E1-E 沈沈 2-E3E3E3-E4E4E4-E 祀祀 5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E 犯犯 9]排列的九种不 同的流感病毒肤表位,其中El为HA 354-372(沈Q ID N0:82),E2为HA 91-108(沈Q ID NO: 48),E3为Ml 2-12(SEQ ID N0:25),E4为HA 150-159(沈Q ID N0:52),E5为HA 143-149(沈Q ID N0:51),E6为NP 206-229(SEQ ID N0:64),E7为HA 307-319(沈Q ID N0:59或89),E8为 NP 335-350(沈Q ID NO:69),且E9为NP 380-393(沈Q ID NO:70)。

[0158] 根据其他实施方案,多聚体多肤包含W W下交替顺序聚合结构 [ElE2E3E4E5E6E7E8E9]n排列的九种不同的流感病毒肤表位,其中n为3至5;E1为HA 354- 372(沈Q ID N0:82),E2为HA 91-108(沈Q ID N0:48),E3为Ml 2-12(沈Q ID N0:25),E4为 HA 150-159(沈Q ID N0:52),E5为HA 143-149(沈Q ID N0:51),E6为NP 206-229(沈Q ID ^:64),67为齡307-319(沈9 10^:59或89),68为肥 335-350(沈9 10顯:69),且69为肥 380-393(沈Q ID NO:70)。

[0159] 根据又其他实施方案,多聚体多肤包含六个重复的W W下交替顺序聚合结构 [E1E沈3E4E5]6排列的五种不同的B细胞型流感病毒肤表位,其中El为HA 354-372(SEQ ID N0:82),E2为HA 91-108(沈Q ID N0:48),E3为Ml 2-12(SEQ ID N0:25),E4为HA 150-159 (沈Q ID N0:52),E5为HA143-149(沈Q ID N0:51)。

[0160] 根据其他实施方案,多聚体多肤包含六个重复的W W下交替顺序聚合结构 [E7E8E9E6]6排列的四种不同的T细胞型流感病毒肤表位,其中E6为NP 206-229(SEQ ID N0:64),E7为HA 307-319(SEQ ID N0:59或89),E8为NP 335-350(沈Q ID N0:69),且E9为NP 380-393(沈Q ID NO:70)。

[0161] 根据另外的实施方案,多聚体多肤包含六个重复的W W下嵌段共聚物结构 [E2E2E2E2E2E2-E1E1E1E1E1E1-E3E3E3E3E3E3-E4E4E4E4E4E4-E5E5E5E5E5E5- E6E6EE6E6E6-E7E7E7E7E7E7-E8E8E8E8E8E8-E犯犯犯9E犯9]排列的九种不同的流感病毒肤 表位,其中El为HA 354-372(沈Q ID N0:82),E2为HA 91-108(沈Q ID N0:48),E3为Ml 2-12 (沈Q ID N0:25),E4为HA 150-159(沈Q ID N0:52),E5为HA 143-149(SEQ ID N0:51),E6为 NP 206-229(沈Q ID NO:64),E7为HA 307-319(沈Q ID NO:59或89),E8为NP 335-350(沈Q ID NO:69),且E9为NP 380-393(沈Q ID NO:70)。

[0162] 在多种实施方案中,多聚体多肤包含至少两个重复的每个表位,通常至少=个重 复的每个表位,可选地至少四个重复,可选地至少五个重复,可选地至少六个重复的每个表 位,最大至少50个重复的每个表位。为了改进表位对免疫系统的暴露,表位可被间隔区分 离,根据某些实施方案,间隔区由单个氨基酸组成,且根据其他实施方案,间隔区包含2-6个 氨基酸。根据一些具体的实施方案,间隔区由1-4个中性氨基酸残基组成。每种可能性代表 了本发明的单独的实施方案。

[0163] 根据一些实施方案,在被包含在药物组合物中的多聚体多肤内的肤表位被选自由 W下组成的组的间隔区连接:键、氨基酸W及包含2-6个氨基酸的肤。

[0164] 根据一些实施方案,间隔区的至少一个氨基酸在多肤的区段上诱导特定构象(例 如脯氨酸残基)。

[0165] 根据又其他实施方案,间隔区包含可切割序列。根据一个实施方案,可切割间隔区 被胞内酶切割。根据一个更具体的实施方案,可切割间隔区包含蛋白酶特异性可切割序列。

[0166] 用于产生悬液的方法

[0167] '不溶性'包含体的溶解

[0168] 可能由于疏水作用,在大肠杆菌的两种不同的菌株中形成的重组多聚体-多表位 多肤的包含体展现出有限的溶解度。补充有SOmMPME的8M尿素缓冲液的标准程序在中性pH 下不溶解包含体。非离子或两性离子去垢剂的添加未改进缓冲性能。阴离子去垢剂添加(十 二烷基硫酸钢,SDS)能够完成包含体溶解,但由于SDS干扰随后的纯化步骤,该方法是不适 合的。最初,使用碱性(12)抑,W使包含体溶解于8M尿素缓冲液中。稍后,出人意料地发现, 经常用于膜蛋白溶解的缓冲液可被修改并用于在较低抑(8-9.5)下的包含体溶解。包含6M 尿素、2M硫脈、1 % CHAPS (3- [ (3-胆酷胺丙基)二甲基胺基]-1-丙横酸盐)、50mM脚征、50mM甘 氨酸且抑为约9.5的溶液被用来实现完全溶解包含体。

[0側超滤和聚集体形成

[0170] 根据本发明,在多聚体-多表位多肤的产生方法中使用超滤,用于逐渐去除离液剂 (例如尿素和硫脈)和还原剂(例如脚征),W及逐渐添加精氨酸,W用于可控创造在缓冲液更 换之后适合于在最终组合物中使用的在l-50mg/ml的蛋白浓度的蛋白聚集体。

[0171] 精氨酸的稳定作用

[0172] 根据本发明,倘没有蛋白微粒的尺寸减小和增加的均匀性,不使用精氨酸W防止 如本领域中描述的聚集体形成。经由超滤缓冲液更换过程,将高浓度(约0.2-1M)的精氨酸 缓冲液逐渐添加至溶解的包含体。通过进一步的缓冲液更换实现0.1-0.5M的最终精氨酸浓 度。

[OW] 悬液组合物

[0174] 如由Akers等(J.Parenteral Sci .Technol. ,41,88-96,1987)公开的,制备药物悬 液的基本原因包括W下:

[0175] 1.肤或蛋白的溶解度对溶液配制起阻止作用。

[0176] 2.肤或蛋白的稳定性在悬液制剂中被改进。

[0177] 3.期望控制或延迟肤或蛋白的释放谱。

[0178] 存在至少四种用于产生可被考虑用于开发肤或蛋白悬液制剂的颗粒的方法:

[0179] 1.悬液仅包括在媒介物中的结晶材料。

[0180] 2.悬液仅包括在媒介物中的无定型材料。

[0181] 3.悬液包含在媒介物中的结晶和无定型材料的混合物。

[0182] 4.悬液包含在悬液相和溶液相两者中的活性成分。

[0183] 存在至少四种产生无菌粉末的方法:结晶、冻干、喷雾干燥及超临界流体颗粒形 成。考虑到肤和蛋白在高应力条件下变性的倾向,结晶和冻干更通常适用于该类化合物。还 已证明了运两种方法保持干燥的材料的无菌性的能力。在液体-空气界面或由蒸发溶剂所 需的高溫,喷雾干燥过程可能导致变性;然而,该技术可适合于缺乏更高级结构的小肤。

[0184] 从颗粒形成单独地制备包含任何必需赋形剂的水性或非水性的媒介物。非水性媒 介物的实例包括任何高度纯化的天然或合成的油,诸如芝麻油、花生油或其他植物油。取决 于成分的溶解度和媒介物的总粘度,灭菌可W通过过滤或高压灭菌来实现。由于颗粒生长 独立地完成,无菌组合方法提供在选择媒介物(水性或非水性)中的更多灵活性。在每个部 分的处理完成之后,干燥的颗粒和媒介物被无菌组合。要求一些形式的揽拌,W实现颗粒的 均匀分散。在肤或蛋白的情况下,适当的控制应在适当的位置,W确保分散过程不导致变性 或其他物理变化。

[0185] 本发明提供了一种产生纯化的重组多聚体-多表位多肤悬液的方法,所述方法包 括W下步骤:

[0186] i.使包含至少一种多聚体-多表位多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所述溶液 包含离液剂、缓冲剂及还原剂,具有在7-11的范围内的抑;W及

[0187] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集,从而形成不溶性聚集体悬液; [018引iii.添加精氨酸W获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定且均匀的悬液,其中95% 的聚集体尺寸落入一个数量级的尺寸范围内。

[0189] 根据一些实施方案,在步骤(i)中的pH在7-10的范围内。

[0190] 根据一些实施方案,离液剂是尿素、硫脈或其组合。

[0191] 根据具体的实施方案,离液剂包含5-8M尿素和1-4M硫脈。

[0192] 根据特定的实施方案,在步骤(ii)中逐渐去除离液剂和还原剂通过超滤进行。

[0193] 根据一些实施方案,在步骤(i)中的CHAPSW0.5 %-2 %的浓度存在。

[0194] 根据一些实施方案,方法包括W下步骤:

[01M] i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肤的大肠杆菌细胞;

[0196] ii .进行裂解和细菌细胞破坏,W提供包含多聚体-多表位流感多肤的包含体;

[0197] i i i .使包含体溶解于运样的溶液中,所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脈、0.5 % - 4%CHAPS(3-[(3-胆酷胺丙基)二甲基胺基]-1-丙横酸盐)、缓冲剂及还原剂,在7-11的范围 内的pH;

[0198] iv.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集,从而形成不溶性聚集体悬液;

[0199] V.添加精氨酸W获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定且均匀的悬液,其中95%的 聚集体落入一个数量级的尺寸范围内。

[0200] 根据一些实施方案,逐渐去除离液剂和还原剂通过使用本领域已知的程序超滤进 行。

[0201] 根据一些实施方案,至少一个色谱分离步骤在步骤(iii)和(iv)之间进行。根据一 些实施方案,至少一个色谱分离步骤选自由离子交换色谱和疏水作用色谱组成的组。

[0202] 根据一些实施方案,步骤(V)在步骤(iv)的聚集体形成之前进行。

[0203] 根据其他实施方案,步骤(V)在步骤(iv)的聚集体形成期间进行。

[0204] 根据又其他实施方案,步骤(V)在步骤(iv)的聚集体形成之后进行。

[0205] 根据一些实施方案,方法包括:

[0206] i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肤的大肠杆菌细胞;

[0207] ii.进行大肠杆菌细胞的裂解、细菌细胞破坏和离屯、,W提供包含多聚体-多表位 流感多肤的包含体;

[0208] iii.进行包含体的至少一次洗涂;

[0209] iv.使包含体溶解于运样的溶液中,所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脈、0.5 % -4 % CHAPS(3-[(3-胆酷胺丙基)二甲基胺基]-1-丙横酸盐)、还原剂W及提供pH在7-10的范围内 的缓冲剂;

[0210] V.使溶液经历至少一个色谱步骤;

[0211] Vi.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集,从而形成不溶性聚集体;

[0212] Vii.添加含脈基的化合物,W及

[0213] Viii.配制(Vii)的组合物,W获得约0.1-0.4M含脈基的氨基酸和10-40mM巧樣酸 盐缓冲剂的,在4-8的范围内的抑的最终悬液。

[0214] 根据其他实施方案,步骤(Vii)的含脈基的化合物的添加在诱导可控聚集期间逐 渐地进行。

[0215] 根据一些实施方案,步骤(i i)的细菌细胞破坏通过高压均化进行。

[0216] 根据其他实施方案,细菌细胞破坏通过超声处理进行。

[0217]根据一些实施方案,裂解在7-9的范围内的抑的缓冲液中进行,所述缓冲液包含在 his缓冲剂、邸TA和每Ig细胞糊状物0.1-0.5mg溶菌酶。

[0218] 根据一些实施方案,步骤(iv)的尿素在6-7M的浓度。

[0219] 根据一些实施方案,步骤(iv)的缓冲剂为在20-100mM浓度的肥PES。

[0220] 根据其他实施方案,步骤(iv)的缓冲剂为在5-lOOmM浓度的甘氨酸。

[0221] 根据一些实施方案,步骤(iv)的还原剂为在20-80mM浓度的0-琉基乙醇。

[0222] 根据一些实施方案,步骤(Vi)的诱导可控聚集通过超滤进行。

[0223] 本领域中已知的任何超滤方法是适用于根据本发明使用的,包括但不限于,中空 纤维、切向流过滤(TFF)盒W及揽拌槽(Stirred Ce 11)。

[0224] 根据一些实施方案,超滤包括W下步骤:

[0225] i.缓冲液更换I,用 IO-SOmM MES 缓冲液,pH 4-6.5;

[0。6] ii.缓冲液更换II,用20-80mM巧樣酸盐缓冲液、0.1-1M精氨酸,pH 4-6;

[0227] iii .缓冲液更换III,用10-SOmM巧樣酸盐缓冲液、0.1 -0.5M精氨酸,抑4-7.5。

[02%]根据其他实施方案,超滤包括W下步骤:

[0229] i.缓冲液更换I,用 IO-SOmM MES 缓冲液,pH 4-6.5;

[0230] ii.缓冲液更换II,用20-80mM巧樣酸盐缓冲液,pH 4-6;

[0231 ] iii .用包含精氨酸的溶液稀释至0.1-IM精氨酸浓度。

[0232] 根据一些实施方案,在最终组合物中的多肤浓度为1-lOmg/ml。

[0233] 根据又其他实施方案,在最终组合物中的多肤浓度为l-4mg/ml。

[0234] 根据一些实施方案,至少一种多聚体-多表位流感多肤序列在SEQ ID NO.86中列 出。

[0235] 根据一些实施方案,至少一种多聚体-多表位流感多肤由在SEQ ID NO.85中列出 的多核巧酸序列编码。

[0236] 根据一些具体的实施方案,方法包括W下步骤:

[0237] i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所 述溶液包含6M尿素、2M硫脈、1 % CHAPS、SOmMP-琉基乙醇、50mM甘氨酸,具有约9.5的抑;

[0238] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂(尿素、硫脈和0-琉基乙醇)诱导聚集,从而形成 不溶性聚集体的悬液;

[0239] iii.通过包括逐渐添加0.5M精氨酸缓冲液的超滤,使悬液经历浓缩和缓冲液更换 步骤;W及

[0240] iv.使悬液经历缓冲液更换,W获得最终组合物,所述最终组合物包含约2.5mg/ml 多肤、约0.2M精氨酸和约20mM巧樣酸盐缓冲剂,具有抑约6。

[0241] 根据又另一个方面,本发明提供了一种产生重组多聚体-多表位多肤的基本上稳 定的水性悬液的方法,所述方法包括W下步骤:

[0242] i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所 述溶液包含6M尿素、2M硫脈、1 % CHAPS、SOmMP-琉基乙醇、5-50mM甘氨酸,具有在7-10的范围 内的pH;

[0243] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集,从而形成不溶性聚集体的悬液;

[0244] iii.通过包括逐渐添加精氨酸缓冲液或巧樣酸盐缓冲液的超滤,使悬液经历浓缩 和缓冲液更换步骤;W及

[0245] iv.使悬液经历缓冲液更换,W获得最终稳定且均匀的悬液,所述最终稳定且均匀 的悬液包含约l-5mg/ml多肤、约0.1-0.5M精氨酸和约IO-SOmM巧樣酸盐缓冲剂,具有在4-7 的范围内的抑。

[0246] 根据一些实施方案,在步骤(i)中,pH在8-10的范围内。

[0247] 根据一些实施方案,方法包括W下步骤:

[0248] i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所 述溶液包含6M尿素、2M硫脈、1 % CHAPS、SOmMP-琉基乙醇、50mM甘氨酸,具有约9.5的抑;

[0249] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集,从而形成不溶性聚集体的悬液;

[0250] iii.通过包括逐渐添加 0.1-IM精氨酸缓冲液的超滤,使悬液经历浓缩和缓冲液更 换步骤;W及

[0251] iv.使悬液经历缓冲液更换,W获得最终悬液,所述最终悬液包含约l-5mg/ml多 肤、约0.1-0.5M精氨酸和约IO-SOmM巧樣酸盐缓冲剂,并具有在4-7的范围内的抑。

[0252] 根据一些具体的实施方案,在步骤(iii)中,添加0.5M精氨酸缓冲液。

[0253] 根据其他实施方案,在步骤(iv)中获得最终悬液,所述最终悬液包含约2.5mg/ml 多肤、约0.2M精氨酸和约20mM巧樣酸盐缓冲剂,并具有约6的抑。

[0254] 根据其他实施方案,方法包括W下步骤:

[0255] i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肤的包含体溶解于运样的溶液中,所 述溶液包含6M尿素、2M硫脈、1 % CHAPS、SOmMP-琉基乙醇、50mM肥阳S、5mM甘氨酸,并具有约 8.0的抑;

[0256] ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集,从而形成不溶性聚集体的悬液;

[0257] iii.通过包括逐渐添加20-80mM巧樣酸盐缓冲液的超滤,使悬液经历浓缩和缓冲 液更换步骤;W及

[025引iv.使悬液经历用包含精氨酸的溶液的稀释,W获得最终均匀的微粒悬液,所述最 终均匀的微粒悬液包含约l-5mg/ml多肤、约0.1-0.5M精氨酸和约IO-SOmM巧樣酸盐缓冲剂, 并具有在4-7的范围内的抑。

[0259] 根据一些具体的实施方案,在步骤(iii)中,添加50mM巧樣酸盐缓冲液。

[0260] 根据其他实施方案,在步骤(iv)中获得最终稳定且均匀的微粒悬液,所述最终稳 定且均匀的微粒悬液包含约2.5mg/ml多肤、约0.2M精氨酸和约20mM巧樣酸盐缓冲剂,并具 有约6的抑。

[0%1 ]根据一些实施方案,最终微粒悬液包含在0.5-50WI1的范围内的聚集体粒度分布, 其中95 %的聚集体尺寸落入一个数量级的范围内。

[0262 ]根据一些实施方案,在最终微粒悬液中的95 %的聚集体具有0.5-5WI1的粒度分布。

[0263] 根据一些实施方案,在最终微粒悬液中的95%的聚集体具有I-IOwii的粒度分布。

[0264] 根据一些实施方案,在最终微粒悬液中的95 %的聚集体具有3-30WI1的粒度分布。

[0265] 根据一些实施方案,在最终微粒悬液中的95%的聚集体具有5-50WI1的粒度分布。 [0%6] 定义

[0267] 为方便起见,本文描述了在说明书、实施例和权利要求书中采用的某些术语。

[0268] 根据本发明的多聚体-多表位多肤表示包含多个拷贝的多种流感病毒肤表位的多 肤。

[0269] 术语"免疫原性"或"免疫原性的"指物质刺激或引发免疫应答的能力。例如,通过 确定对物质特异的抗体的存在,测量免疫原性。抗体的存在通过本领域已知的方法,例如, 使用化ISA或HAI测定来检测。

[0270] 取决于流感表位引发免疫应答的类型,流感表位可被分类为B细胞型、T细胞型或B 细胞型和T细胞型两者。B细胞或T细胞肤表位的定义是不明确的;例如,肤表位可诱导抗体 产生,但同时表位可具有能够结合人HLA分子的序列,使得它可接近CTL或化细胞,因此,双B 细胞和T细胞分类用于该特定表位。"CTL"、"杀伤T细胞"或"细胞毒性T细胞"是识别并裂解 携带特定外来抗原的祀细胞的、起防御病毒感染和癌细胞作用的一组分化型T细胞。叮辅助 细胞"或"Th"是当被特异性抗原刺激时,释放促进B细胞和杀伤T细胞的活化和功能的细胞 因子的任何T细胞。

[0271] 如本文使用的,"氨基酸序列"指寡肤、肤、多肤或蛋白序列及其片段,W及天然存 在的或合成的分子。

[0272] 在说明书和权利要求书中,术语"间隔区"指示可存在于多肤序列中、在一个末端 处或在两个表位之间的任何化学化合物。根据一些实施方案,间隔区由1-4个氨基酸残基组 成。间隔区可包含可被酶促方式切割的或可自发地分解的序列。间隔区可对多肤强制或诱 导有益的构象。间隔区可任选地包含蛋白酶特异性可切割序列。

[0273] 术语"不溶性"在本文被定义为当在水性悬液中时对肉眼可视化的特性。"不溶性" 颗粒可在离屯、水性悬液之后被沉淀或回收。

[0274] 术语"悬液"在本文被定义为包含如W上定义的"不溶性"颗粒组分的水性介质。 [027引术语"微粒"在本文被定义为0.1-100皿尺寸的"不溶性"蛋白聚集体。根据一些实 施方案,本发明的微粒在0.5-50WI1的尺寸范围内。

[0276] 术语"溶液"在本文被定义为实质上不含作为W上定义的术语的"不溶性"颗粒的 水性介质。

[0277] "均匀性"在本文被定义为如通过例如由LUMiSizer悬液分析仪化UM Gm地)测试的 参数测量的聚集体的粒度分布。均匀悬液在本文被定义为具有其中95%的聚集体尺寸落入 一个数量级范围内的聚集体粒度分布。

[0278] 均匀微粒悬液是包含"不溶性"蛋白聚集体(W上定义为微粒)、具有均匀聚集体粒 度分布的水性介质,其中95%的聚集体尺寸落入一个数量级范围内(例如,0.1 -Iwik 1-1化 111、3-30皿、9-90皿等等)。

[0279] 被包含在根据本发明的均匀微粒悬液中的颗粒的粒度分布是窄的。如本文使用的 术语"窄的粒度分布"指其中多于90%的颗粒具有在平均值(或平均数)粒度0.2-2倍的范围 内的粒度的分布。优选地,多于95%的颗粒具有在该范围内的粒度。甚至更优选地,多于 99 %的颗粒具有在该范围内的粒度。如此,对于扣m的粒度,窄的粒度分布指其中多于90 %、 95 %或99 %的颗粒具有在I-IOmi范围内的粒度的分布。

[0280] 微粒在形状上是基本上球形或球状,但包括不规则形状的非球形颗粒也是可能 的。对于球形颗粒,尺寸代表直径,而对于非球形颗粒,尺寸代表平均颗粒的最长维度。

[0281] 根据本发明的原理,如本文使用的平均粒度指可使用本领域技术人员已知的技术 确定的平均颗粒直径,本领域技术人员已知的技术包括,但不限于沉降流分级 (sedimentation flow fractionation)、光子关联光谱学、光散射、电子散射、磁盘离屯、 (disk cen化ifUgation)等。根据一些实施方案,聚集体粒度分布使用LUMiSizer悬液分析 仪(LUM GmbH)或任何相应设备来确定。

[0282] "稳定性"在本文被定义为聚集体尺寸在其中保持均匀分布的条件。

[0283] 离液剂为变性剂,即,可破坏水分子之间的氨键网络并通过削弱疏水效应降低大 分子(在本发明中例如蛋白)的天然状态的稳定性的化合物。

[0284] 根据本发明的含脈基的氨基酸包括但不限于精氨酸(Arg)氨基酸或其衍生物。根 据本发明,可使用L-Arg、D-Arg或其混合物。

[0285] 根据本发明,可使用心4'旨或D-Arg或其衍生物的任何盐或游离的酸、或其混合物。 运包括但不限于选自由W下组成的组的化合物:Arg-盐酸盐、Arg-硫酸盐、Arg-憐酸盐、 Arg-巧樣酸盐、Arg-乙酸盐及A巧游离酸。

[0286] 根据本发明的Arg衍生物,包括但不限于,甲基化的精氨酸、取代的レ精氨酸、硝 基-精氨酸、N-硝基-k精氨酸甲醋a-NAME)、N-氨基-心精氨酸、N-甲基-k精氨酸、单甲基- 心精氨酸化-NMA)、硝基-心精氨酸化-NNA)、氨基脈、7-硝基吗I挫、S-乙基异硫脈、S-甲基异 硫脈、S-甲硫基瓜氨酸、S-乙硫基瓜氨酸、N-乙基亚氨基-1^-鸟氨酸、鸟氨酸及鸟氨酸衍生 物;k刀豆氨酸;瓜氨酸;L-2-氨基-3-脈基丙酸、4-脈基下酸;a-N-取代的心精氨酸;2-1^-精 氨酷-1,3-苯并嚷挫-6-簇酸;N O -(ADP-D-核糖基)寸-精氨酸;N O -憐酸-心精氨酸;肥-(2- 簇基乙基)寸-精氨酸;N2-班巧酷寸-精氨酸;D-姻脂氨酸;D-章鱼碱精氨酸酷胺;k精氨 酸异径目亏酸;arg喀晚(argpyrimidine);径基-1^-精氨酸;甲基-1^-精氨酸;N-酷基-1^-精氨 酸;N-苯甲酯基-D-精氨酸;N 丫-硝基-心精氨酸;肤基-心精氨酸。

[0287] 根据一些实施方案,低成本的精氨酸或精氨酸衍生物被用于本发明的组合物,W 获得相对便宜的最终产品。

[0288] 针对流感的任何疫苗可连同根据本发明的方法和组合物中的多聚体多肤一起使 用。术语"针对流感的疫苗"包括,但不限于,部分或高纯化的或重组的流感蛋白、灭活的病 毒或"裂解产物"灭活的流感疫苗产品、活的减毒病毒、或者展现流感表位的颗粒或载体,包 括但不限于病毒样颗粒(VLP)和脂质体。将连同多聚体多肤一起使用的流感疫苗可W是季 节性、大流行性或通用疫苗。

[0289] 常规季节性疫苗通常包含=种灭活的或活的减毒流感病毒毒株,并因此还被称为 TIV(=价流感疫苗)。=种毒株每年被WHO选择,W提供针对预期在即将到来季节感染的毒 株的保护。

[0290] 可根据本发明使用的特定季节性疫苗的非限制性列表包括:VAXIGRIP™、 AGGRIPAL™、化UVIRIN™、FLUAD™、MUTAGRIP™、FLUZ0W™、FLUZ0WHD™、IWLUVAC™、 FLUARIX™、FLULAVAL™、化UMI ST™、AFLURI A™、AGRI FLU™。

[0291] 大流行性疫苗通常包含一种对引起大流行病的相关毒株特异的流感病毒毒株。例 如,用于在2009/2010季节期间的猪流感大流行的A/H1N1毒株然后被包含在W后的季节性 TIV制剂中,诸如2010/2011季节。

[0292] 根据其他实施方案,大流行性疫苗是针对人、猪或禽流感毒株。可根据本发明使用 的特定大流行性疫苗的非限制性列表包括:PANENZA™、PANDEMRIX™、HUMENZA™、FOCETRI A™、 CELVAPAN、CELTURA™ 及 FLUMIST™。

[0293] 重组多肤

[0294] 本发明的多聚体-多表位多肤可通过在表达载体中自身或作为嵌合蛋白表达来制 备。产生包含一种或更多种流感肤表位的重组蛋白或嵌合蛋白(或在本文可互换使用的多 肤)的方法是本领域技术人员已知的,并详细描述于,例如WO 2009/016639中。编码一种或 更多种流感肤表位的核酸序列可被插入进表达载体中用于制备多核巧酸构建体,W用于在 宿主细胞中繁殖和表达。编码包含几种表位的多个重复的多肤,诸如多聚体多表位多肤的 核酸构建体可通过在其3'末端和5'末端处携带适当的限制性酶切位点的较小多核巧酸构 建体的连接来制备。

[02M]多聚体多肤的产生

[0296] 在被宿主细胞表达之后,多聚体多肤可通过许多蛋白纯化方法与不需要的组分分 离。一种此类方法是通过产生包含体,包含体是当重组多肤被表达于原核生物中时可形成 的蛋白的无活性聚集体。尽管CDNA可适当地编码可翻译的mRNA,所得的蛋白可能不正确折 叠,或添加的肤表位的疏水性可导致重组多肤变成不溶性的。通过本领域熟知的方法容易 地纯化包含体。用于包含体的纯化的多种程序是本领域已知的。在一些实施方案中,包含体 通过离屯、从细菌裂解物回收并用去垢剂和馨合剂洗涂,W从聚集的重组蛋白去除尽可能多 的细菌蛋白。为获得可溶性蛋白,通常将洗涂过的包含体溶解于变性剂中,并且然后释放的 蛋白由通过稀释或透析逐渐去除变性试剂来重折叠(例如,MoIecular cloning : a laboratory manual,第3版,Sambrook,J.和Russel1,D.W.,2001;CSHL Press)。

[0297] 另一种任选的方法使用在重组蛋白上的聚组氨酸标签。聚组氨酸标签由添加至重 组蛋白的通常N-末端或C-末端处的至少六个组氨酸化is)残基组成。聚组氨酸标签通常用 于亲和纯化加聚组氨酸标签的被表达于在大肠杆菌或其他原核表达系统中的重组蛋白。细 菌细胞通过离屯、收获,并且所得的细胞沉淀可通过物理方法或用去垢剂或酶诸如溶菌酶裂 解。在该阶段,原始裂解物包含在来源于细菌的几种其他蛋白中的重组蛋白,并且与亲和介 质诸如NTA-琼脂糖、His化r树脂或化Ion树脂一起解育。运些亲和介质包含W微摩尔亲和力 结合聚组氨酸标签的结合的金属离子儀或钻。然后,树脂用憐酸盐缓冲液洗涂W去除与钻 或儀离子不特异性地相互作用的蛋白。洗涂效率可通过添加20mM咪挫来改进,且然后,蛋白 通常用150-300mM咪挫洗脱。聚组氨酸标签可随后使用限制性内切酶、内切蛋白酶或外切蛋 白酶去除。用于纯化加组氨酸标签的蛋白的试剂盒可例如从Qiagen购买。

[0298] 疫苗配制及施用

[0299] 本发明的疫苗包含多表位多肤,和任选地佐剂。疫苗可被配制,用于W许多不同模 式中的一种来施用。在一个实施方案中,疫苗被配制用于肠胃外施用。在一些实施方案中, 疫苗被配制用于大规模接种,例如用于用喷射注射器或单次使用盒。根据本发明的一个实 施方案,疫苗施用为肌肉内施用。根据另一个实施方案,施用为皮内施用。专口设计成存储 疫苗的、经皮注射的针是本领域已知的,如例如在6,843,781和7,250,036 W及其他中公开 的。根据其他实施方案,施用用无针注射器进行。

[0300] 根据又另一个实施方案,疫苗被配制用于粘膜递送,特别地经鼻递送(Arnon等, Biologicals.2001;29(3-4):237-42;Ben-Yedidia等,IntImmunol.1999;11(7):1043-51)。 疫苗制剂可WW任何方便的方式被应用至鼻的淋己组织。然而,将它作为液体流或液滴应 用至鼻腔通道的壁是优选的。鼻内组合物可例如W液体形式来配制,作为滴鼻剂、喷雾剂及 气雾剂,或者适合于吸入,作为粉末,作为乳膏或作为乳液,且任选地在适合于分配多肤的 容器来提供。组合物可包含多种添加剂,诸如佐剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂或防腐剂。

[0301 ]本发明的制剂可任选地包含增强粘膜递送的试剂,诸如,例如,如在US 2004/ 0077540中描述的通过调制上皮交界结构和/或生理学可逆地增强粘膜上皮细胞旁路运输 的透化肤。

[0302] 在本发明的另一个实施方案中,施用是口服,且疫苗可W,例如,片剂的形式呈现 或者被包封在明胶胶囊或微胶囊中。运些形式的制剂是本领域技术人员的一般知识。

[0303] 脂质体提供了用于抗原递送和抗原递呈的另一递送系统。脂质体是包含通常围绕 水性中屯、的憐脂和其他酱醇类的双层囊泡,抗原或其他产物可被包封于其中。脂质体结构 是高度通用的,具有范围在从约25nm至约500皿的纳米至微米尺寸的许多类型。已发现脂质 体在递送治疗剂至皮肤和粘膜表面方面是有效的。完整脂质体结构的平均存活时间或半衰 期可通过包含允许延长体内释放的某些聚合物,例如聚乙二醇来被延长。脂质体可W是单 层或多层。

[0304] 聚合物微粒和纳米颗粒采用充当用于疫苗递送的储库的小的生物可降解的球体。 聚合物微球具有相比于其他实现储库的佐剂的主要优势是,它们是非常安全的,并已被批 准用作生物可降解的药物递送系统。共聚物水解的速率被非常良好表征,其又允许制造具 有经延长的时间段持续抗原释放的微粒(〇'化gen,等,Vaccine. 1993,11,965)。特别是如果 微粒渗入延长的释放特性,它们的肠胃外施用引起持久免疫。释放速率可通过将经不同时 间段水解的聚合物的混合物和它们的相对分子量进行调节。不希望受限于理论,由于大颗 粒在可用于巨隧细胞摄取之前必须分解成较小颗粒,不同大小的颗粒(Iwii至200]im)的制剂 还可有助于持久的免疫应答。W运种方式,单注射疫苗可通过整合多种粒度来开发,从而延 长抗原递呈且大大有益于家畜生产者。在一些应用中,佐剂或赋形剂可被包括在疫苗制剂 中。佐剂的选择部分地由该疫苗的施用方式来决定。例如,非注射的疫苗接种将导致更好的 总体依从性并降低总体成本。施用途径的一个模式为肌内施用。鼻内佐剂的非限制性实例 包括壳聚糖粉末、PLA和化G微球、QS-21、憐酸巧纳米颗粒(CAP)和mCTA/LTB(具有热不稳定 肠毒素的五聚体B亚基的突变的霍乱毒素 E112K)。

[0305] 理论上,使用的佐剂还可W是已知用于基于肤或蛋白的疫苗的任何佐剂。例如:呈 凝胶形式的无机佐剂(氨氧化侣/憐酸侣、憐酸巧),细菌佐剂诸如单憐酷脂质A和胞壁酷肤, 颗粒佐剂诸如所谓的ISCOMSr免疫刺激复合物"),脂质体和生物可降解的微球,基于油乳 液和乳化剂的佐剂诸如IFA("不完全弗氏佐剂"),SAF,皂角巧(诸如QS-21),角整締/角整 烧,合成的佐剂诸如非离子型嵌段共聚物,胞壁酷肤类似物,合成的脂质A,合成的多核巧酸 和聚阳离子佐剂。

[0306] 用于与本发明的免疫原一起使用的另一种佐剂是乳液。预期的乳液可W是水包油 乳液或油包水乳液。除了免疫原性多肤W外,此类乳液包含如熟知的角整締、角整烧、花生 油等的油相W及分散剂。非离子分散剂是优选的,且此类材料包括,例如,脱水山梨糖醇和 二缩甘露醇的单-和二-C12-C24-脂肪酸醋诸如脱水山梨糖醇单硬脂酸醋、脱水山梨糖醇单 油酸醋和二缩甘露醇单油酸醋。

[0307] 此类乳液是例如油包水乳液,所述油包水乳液包含角整締、甘油和表面活性剂诸 如二缩甘露醇单油酸醋(Arlacel™ A),任选地具有用在水相的嵌合体蛋白颗粒乳化的角整 烧。可选的油相组分包括O-生育酪、混合链二-和S-酸甘油醋及脱水山梨糖醇醋。此类乳液 的熟知实例包括Mon1:anide™lSA-720和Montanide™ ISA 703(Seppic ,(^istres ,France)。 水包油乳液佐剂包括,例如,在WO 95/17210和EP 0 399 843中公开的那些。

[0308] 小分子佐剂的使用也被本文预期。在本文有用的一种类型的小分子佐剂是如在W 下中描述的7-取代-8氧代-或8-横基-鸟巧衍生物:美国专利号4,539,205、美国专利号4, 643,992、美国专利号5,011,828W及美国专利号5,093,318。7-締丙基-8-氧代鸟巧(洛索立 宾(Ioxoribine))已被证明在诱导抗原-(免疫原-)特异性应答中是特别有效的。

[0309] 有用的佐剂包括由Corixa Co巧制造的单憐酷脂质A(MPL@)、3-脱酷基单憐酷 脂质A ( 3D-MPL⑧)。该佐剂包含从细菌提取的S种组分:在2%角整締/Tween™ 80乳液 中的单憐酷脂质(M化)A、海藻糖二霉菌酸醋(trehalosedimycolate) (TDM)和细胞壁骨架 (CWS) (MPL+TDM+CWS)。该佐剂可通过GB 2122204B中教导的方法来制备。

[0310] 其他化合物与称为氨基烷基葡萄糖酷胺憐酸盐(AGP)的MPL驚佐剂结构上相关, 诸如W名称RC-529™佐剂{2-[(R)-3-四-癸酷基氧基四癸酷基氨基]-乙基-2-脱氧-4-0-麟- 酷基-3-0-[(R)-3-四癸酷基氧基四-癸酷基]-2-[(R)-3-四-癸酷基氧基四-癸酷基-氨基]- p-D-Ii比喃葡萄糖巧S乙基锭盐}从〔〇1';[皿Co;rp可得的那些。RC-529佐剂W从Corixa Co;rp 作为RC-529SE出售的角整締乳液和作为RC-529AF可得的水性制剂可得(例如在美国专利号 6,355,257;美国专利号6,303,347;^及美国专利号6,113,918中公开的)。

[0311] 胞壁酷二肤佐剂也被预期并且包括N-乙酷基-胞壁酷-心苏氨酷基-D-异谷氨酷胺 (thur-MDP)、N-乙酷基-去甲胞壁酷-L-丙氨酷-D-异谷氨酷胺[CGP 11637,也称为去甲- MD門和N-乙酷基胞壁酷丙氨酷-D-异谷氨酷胺基A-丙氨酸-2-( 1'-2'-二栋桐酷-s-n- 甘油基-3-¾基憐酷基氧基)乙胺[(CGPH983A,也称为MTP-阳]。所谓的胞壁酷二肤类似物 被描述于美国专利号4,767,842中。

[0312] 包含toll样受体-4(TLR-4)的一种或更多种激动剂的佐剂,诸如MPL饭佐剂或结 构上相关的化合物诸如民C-529⑩佐剂或脂质A模拟物单独的或连同TLR-9的激动剂诸如含 非甲基化的寡脱氧核巧酸的CpG基序一起的使用也是任选的。

[0313] 另外预期的佐剂包括合成的含CpG核巧酸基序一次或更多次(加上侧翼序列)的寡 核巧酸佐剂,从Coley Pharmaceutical Group可得。从Aquila Biopharmaceuticals,Inc. 可得的命名为QS21的佐剂是具有来源于南美洲树南美皂皮树(QuiIlaja Saponaria Molina)的树皮的佐剂活性的免疫活性的皂巧级分(例如Quil ™ A),并且其的产生方法被 描述于美国专利号5,057,540中。还公开了Quil™ A的衍生物,例如QS21(Quil ™ A的HPLC 纯化的级分衍生物,也称为QA21),W及其他级分诸如QA17。南美皂皮树皂巧的半合成和合 成的衍生物也是有用的,诸如描述于美国专利号5,977,081W及美国专利号6,080,725中的 那些。从化iron Corp.可得的命名为MF59的佐剂被描述于美国专利号5,709,879W及美国 专利号6,086,901中。

[0314] 另一种类型的佐剂混合物包括诸如描述于美国专利号6,113,918中的另外包含氨 基烷基葡萄糖胺憐酸醋的稳定的油包水乳液。另一种油包水乳液被描述于WO 99/56776中。

[0315] 佐剂W佐剂量使用,佐剂量可随着佐剂、宿主动物和免疫原而变化。典型的量可从 每免疫接种约1微克至约Img变化。本领域技术人员知道,适当的浓度或量可容易地确定。

[0316] 根据本发明的一些实施方案,佐剂作为包含能够使疫苗等渗或低渗的一种或更多 种水溶性或水可乳化物质的溶液或乳液而存在。水溶性或水可乳化物质可,例如,选自由W 下组成的组:麦芽糖;果糖;半乳糖;薦糖;糖醇;脂质;W及其组合。

[0317] 肤表位及类似物

[0318] 本发明的多聚体多肤可使用本领域已知用于合成肤、肤多聚体和多肤的方法化学 合成。运些方法通常依赖于肤合成的已知原理;最方便地,程序可根据固相肤合成的已知原 理来进行。

[0319] 本文所用的"肤"指示被肤键连接的一系列氨基酸。根据本发明的具体实施方案, 肤表位包含4个至24个氨基酸残基的序列。多聚体多肤包含至少两个重复和最大50个重复 的肤表位。

[0320] 当采用化学合成时,肤类似物和肤模拟物也包括在本发明的范围内。根据本发明 的肤类似物可任选地包含至少一个非天然的氨基酸和/或在C末端或N末端处的至少一个阻 断基团。

[0321] 术语"氨基酸"指具有氨基基团和簇酸基团,优选地W碳主链上的1,2-、1,3-或1, 4-取代模式的化合物。a-氨基酸是最优选的,并且包括在蛋白中发现的20种天然氨基酸(除 了甘氨酸W外,其是k氨基酸)。当合成是通过化学方法时,术语氨基酸还包括20种天然氨 基酸的对应的D-氨基酸、对应的N-甲基氨基酸、侧链修饰的氨基酸、在蛋白中未发现的生物 合成可得的氨基酸(例如,4-径基-脯氨酸、5-径基-赖氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸、黎豆 氨酸(djenkolic acid)、0-氯丙氨酸kyanolanine))W及合成来源的a-氨基酸,诸如氨基- 异下酸、正亮氨酸、正鄉氨酸、高半脫氨酸和高丝氨酸。e-丙氨酸和丫丫氨基下酸分别是1,3 和1,4氨基酸的实例,并且许多其他的是本领域熟知的。抑胃酶氨酸-样等排体(包含两个氨 基酸的二肤,其中CONH键被CHOH代替)、径基乙締等排体(包含两个氨基酸的二肤,其中CONH 键被C册肥此代替)、还原酷胺等排体(包含两个氨基酸的二肤,其中CONH键被C此NH键代替) 和硫酷胺等排体(包含两个氨基酸的二肤,其中CONH键被CSNH键代替)也是对本发明有用的 残基。

[0322] 对于化学合成,在本发明中使用的氨基酸为商购可得或通过常规合成方法可得的 那些。某些残基可要求特定方法用于渗入进肤,且对肤序列的顺序、发散或收敛的合成方法 在本发明中是有用的。天然编码的氨基酸及其衍生物根据IUPAC命名法由=字母代码表示。 当没有指明时,使用L异构体。

[0323] 如本领域技术人员已知的氨基酸的保守性取代在本发明的肤表位的范围内。保守 性氨基酸取代包括用另一个具有相同类型的官能团或侧链的氨基酸,例如脂肪族、芳香族、 带正电荷、带负电荷的氨基酸代替一个氨基酸。运些取代可增强口服生物可利用度、向中枢 神经系统的渗入、祀向特异性细胞群等等。技术人员将认识到,改变、添加或缺失编码的序 列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对肤、多肤或蛋白序列的单独的取代、缺失或添 加是"保守性修饰的变体",其中该改变导致氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供功能 上相似氨基酸的保守性取代表格是本领域熟知的。

[0324] W下六组各包括对彼此是保守性取代的氨基酸:

[0325] 1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);

[0326] 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸化);

[0327] 3)天冬酷胺(N)、谷氨酷胺(Q);

[03%] 4)精氨酸(R)、赖氨酸化);

[0329] 5)异亮氨酸(I)、亮氨酸化)、甲硫氨酸(M)、鄉氨酸(V); W及

[0330] 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

[0331] W下实施例是为了更充分地说明本发明的一些实施方案而呈现。然而,其不应W 任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可W容易地设计本文公开的原理 的许多变化和修改而不背离本发明的范围。 实施例

[0332] 材料和方法

[0333] 多聚体多表位多肤:

[0334] 产生并测试包含在表2中列出的流感病毒肤表位El至E9的多聚体多表位多肤。除 了肤表位,多肤包括氨基酸和短肤作为间隔区。多肤被W交替顺序聚合结构或嵌段共聚物 结构排列。多肤通过在来自包含用于进一步操作多肤的多种限制性酶切位点的多核巧酸构 建体的表达载体中表达来制备。多核巧酸构建体由商业来源提供。

[0335] 由多聚体-多表位多肤制备的疫苗被用于多种小鼠模型的免疫接种研究及在人受 试者的临床试验中。

[0336] 具有S个重复的 W嵌段共聚物结构[E1]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3-[E6]3- [E7]3-[E引3-[E9]3排列的九种不同表位的每个的多聚体多肤被产生并称为M-001。估计的 M-OOl分子量为48kDDM-001多聚体多肤的氨基酸序列在SEQ ID N0:86中列出。

[0337] 用来制备M-OOl多聚体肤的多核巧酸构建体的DNA序列在SEQ ID N0:85中列出。

[0338] 另外的多聚体-多表位多肤序列选自由分别被包含选自由W下组成的组的序列的 多核巧酸序列编码的沈Q ID NO:84和沈Q ID NO:88组成的组:SEQ ID NO:83和沈Q ID NO: 87。

[0339] 根据本发明的疫苗组合物可被施用,而无需佐剂。可选地,组合物可包含佐剂。在 此类情况下,在临床试验中使用的任选地佐剂在动物研究中为IFA且在人试验中为 Montanide™ ISA 51VG(Seppic ,France) sMontanide™为已在测试疫苗效力的许多临床试 验中采用的通常使用的免疫调节剂,能够诱导细胞和体液免疫应答两者(Peek等,Adv Drug Deliv Rev.2008;60,915-928)〇

[0340] 实施例1 :M-001的产生过程-选项A

[0%1]发酵方法:发酵过程使用重组表达M-OOl多肤的热休克诱导的大肠杆菌来进行。将 过夜接种物添加至IOL细菌生长培养基。补料分批过程在36°C下进行。诱导通过将溫度提高 至42°C引发。在诱导两小时之后,批次在1化的终体积终止。然后将细胞离屯、,并将回收的细 胞沉淀存储于-70°C。

[0342]细胞裂解、包含体回收和洗涂:将冷冻的细胞沉淀解冻并分散于裂解缓冲液(50mM Tris、IOmM EDTA、溶菌酶)中。在混合并叫化a化rrax处理之后,将细胞通过Gaulin匀浆仪 (700-800栅口x3个循环)。裂解物用50mM Tris、0.1M 化Cl、2%lYiton X-IOO稀释,并然后 用0.5M Tris、lM NaCl稀释。最后,粗制包含体(IB)通过离屯、回收,并然后储存在-70°C。 [0;343]然后,将IB沉淀在l%Triton;50mM 肥阳S、1M 化Cl,pH 8;5M尿素,5mM甘氨酸,1% 吐溫80,pH 8中连续洗涂,最后用50mM肥阳S,抑8洗涂,并然后储存在-70°C。

[0344] 包含体溶解:将洗涂过的包含体在包含6M尿素、2M硫脈、50mM甘氨酸、1 % CHAPS、 SOmMP-琉基乙醇,pH 9.5的缓冲液中溶解。

[0345] 蛋白纯化:使用AKTApilot色谱系统(GE Healthcare)进行纯化。将溶解的蛋白通 过膜过滤澄清,并且首先负载于阳离子交换SP Sepharose FF柱(GE Healthcare)上。柱用 洗涂缓冲液I(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM肥阳S、5OmM0-琉基乙醇,pH 8),然后用洗涂缓冲液 II(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM肥阳S、50m]\也-琉基乙醇,200mM化Cl,pH8)连续洗涂,并且然 后用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM皿PES、50mM(6-琉基乙醇、250mM化Cl,pH8洗脱。收集在 280nm吸收时检测到的洗脱峰。

[0346] 然后,将洗脱物(elute)用IM硫酸锭稀释至0.5M硫酸锭,然后负载到第二色谱柱, 疏水作用苯基Se地arose FF化S)树脂(GE胎althcare)上。柱用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM 皿PES、5OmM0-琉基乙醇、0.5M硫酸锭,pH 8洗涂,然后用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM皿PES、 5OmM0-琉基乙醇,pH 8洗脱。然后,将洗脱物穿过Sadobind STIC(Sadorius)过滤器,用于 减少DNA和内毒素。W吐溫80:重组蛋白的l:5(w/w)的比率添加吐溫80。将蛋白溶液无菌过 滤(0.2皿)。所有的随后步骤无菌地操作。 惦47]超滤和配制:洗脱物使用具有IOkDa临界值(cut of f )的中空纤维组件(GE Healthcare)进行浓缩。为了形成具有可控粒度分布的蛋白微粒,缓冲液连续更换为50mM MES缓冲液,pH 5.5,然后为50mM巧樣酸盐缓冲液、0.5M精氨酸,pH 5.5,并且最后为20mM巧 樣酸盐缓冲液、0.2M精氨酸,pH 6,运代表原料药(Drug Substance)。药物组合物-药物产品 通过在20mM巧樣酸盐缓冲液、0.2M精氨酸,pH 6中将原料药稀释至2.5mg/mL的蛋白浓度来 获得。填充的小瓶储存在+4 °C。

[034引 实施例2:M-001的产生过程-选项B [0349]发酵方法:与在实施例1中的相同。

[0巧0] 细胞裂解、包含体回收和洗涂:与在实施例1中的相同。

[0巧1 ]包含体溶解:将洗涂过的包含体在包含6M尿素、2M硫脈、5mM甘氨酸、1 % CHAPS、 SOmM肥阳S、5OmM0-琉基乙醇,pH 8.0的缓冲液中溶解。

[0352] 蛋白纯化:使用AKTApilot色谱系统(GE Healthcare)进行纯化。将溶解的蛋白通 过膜过滤澄清,并且负载于阳离子交换SP Se地arose FF柱(GE Healthcare)上。柱用洗涂 缓冲液I(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM皿阳S、5OmM0-琉基乙醇,pH 8),然后用洗涂缓冲液II (8M尿素、5mM甘氨酸、50mM皿阳S、50mM(6-琉基乙醇,200mM化Cl,pH8)连续洗涂,并且然后 用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM肥PES、50m]\也-琉基乙醇、250mM化Cl,pH8洗脱。收集在280nm 吸收时检测到的洗脱峰。

[0353] W吐溫80:重组蛋白的l:5(w/w)的比率添加吐溫80。将蛋白溶液无菌过滤(0.2y m)。所有的随后步骤无菌地操作。

[0354] 超滤和配制:洗脱物使用具有IOkDa临界值的中空纤维组件(GE Healthcare)进行 浓缩。为了形成可控微粒(即,可控蛋白聚集体),缓冲液连续更换为50mM MES缓冲液,pH 5.5,然后为50mM巧樣酸盐缓冲液,抑5.5,运代表原料药。将精氨酸溶液添加至0.5M的最终 精氨酸浓度。药物组合物-药物产品通过在50mM巧樣酸盐缓冲液、0.5M精氨酸,pH 5.5中将 原料药稀释至2.5mg/mL的蛋白浓度来获得。填充的小瓶储存在+4°C。

[0巧引 实施例3:测试PBS作为原料药缓冲液的M-OOl的产生过程 [0356]发酵方法:与在实施例1中的相同。

[0巧7]细胞裂解、包含体回收和洗涂:与在实施例1中的相同。

[0358] 包含体溶解:与在实施例2中的相同。

[0359] 蛋白纯化:与在实施例2中的相同。

[0360] 超滤和配制:将洗脱物用50mM MES缓冲液,pH 5.5,1:40稀释。所得的溶液使用具 有IOkDa临界值的中空纤维组件(GE Healthcare)进行浓缩。为了创造蛋白微粒,缓冲液被 更换为PBS缓冲液,pH 7.0。与在实施例1&2中获得的悬液相比,该蛋白悬液的外观是劣质 的,如由增加凝絮和沉淀视觉上评价的。将精氨酸盐酸盐添加至0.1-1.5M的最终精氨酸浓 度。精氨酸添加导致W剂量依赖性方式的直接颗粒解凝絮,较高的精氨酸浓度创造较显著 的效果。

Claims (35)

1. 一种药物组合物,所述药物组合物呈微粒的水性悬液形式,所述组合物包含至少一 种多聚体-多表位多肽、含胍基的氨基酸或其衍生物以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或 载体,所述至少一种多聚体-多表位多肽包含多个拷贝的多种流感病毒肽表位,其中在所述 水性悬液中的微粒具有均匀的聚集体粒度分布,其中95%的聚集体尺寸落入一个数量级的 尺寸范围内。
2. 根据权利要求1所述的药物组合物,其中在所述悬液中的95%的聚集体具有选自由 以下组成的组的尺寸范围分布:0.5-5以111、0.6-64111、0.7-74111、0.8-84111、0.9-94111、1-1(^111、2-20μηι、3-30μηι、4-40μηι 及 5_50ym。
3. 根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述含胍基的氨基酸为精氨酸(Arg)。
4. 根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述含胍基的氨基酸为L-Arg盐酸盐(L-Arg HCl)〇
5. 根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述含胍基的氨基酸或衍生物处于0.1-2.0M的浓度。
6. 根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述组合物包含在1-50M的浓度的缓冲剂。
7. 根据权利要求6所述的药物组合物,其中所述缓冲剂选自由以下组成的组:柠檬酸盐 缓冲剂、赖氨酸缓冲剂及甘氨酸缓冲剂。
8. 根据权利要求6所述的药物组合物,其中所述缓冲剂保持pH在5.0至7.6的范围内。
9. 根据权利要求1所述的药物组合物,所述药物组合物包含l-10mg/ml多聚体-多表位 流感多肽、0.1-0.5M L-精氨酸及10-50mM梓檬酸盐缓冲剂,并具有在4至7的范围内的pH。
10. 根据权利要求9所述的药物组合物,所述药物组合物包含0.1-0.3ML-精氨酸及10-30mM梓檬酸盐缓冲剂,并具有在5.5至6.5的范围内的pH。
11. 根据权利要求9所述的药物组合物,所述药物组合物包含约2.5mg/ml多聚体-多表 位流感多肽、约0.2M精氨酸及约20mM梓檬酸盐缓冲剂,并具有约6的pH。
12. 根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述多聚体-多表位多肽包含3-5个重复的 4-9种肽表位,每个表位选自由以下组成的组:HA354-372(E1,SEQ ID NO:82)、HA 91-108 (E2,SEQ ID N0:48)、M1 2-12(E3,SEQ ID NO:25)、HA 150-159(E4,SEQ ID NO:52)、HA 143-149(E5,SEQ ID NO:51)、NP 206-229(E6,SEQ ID N0:64)、HA 307-319(E7,SEQ ID NO: 59S89)、NP 335-350(E8,SEQIDN0:69)&NP 380-393(E9,SEQIDN0:70)。
13. 根据权利要求12所述的药物组合物,其中所述多聚体-多表位流感多肽为具有如在 SEQ ID N0:86中列出的氨基酸序列的M-001。
14. 根据权利要求1所述的药物组合物,所述药物组合物用于针对流感免疫接种受试 者。
15. -种产生纯化的重组多肽的方法,所述方法包括以下步骤: i .提供在水性溶液中在1.5-5mg/ml的浓度的至少一种多聚体多表位流感多肽,所述水 性溶液包含离液剂、去垢剂、还原剂以及提供在7-10的范围内的pH的缓冲剂; ii .通过逐渐去除所述离液剂和所述还原剂诱导可控聚集;以及 iii.添加含胍基的化合物,以获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定的微粒悬液,其中 95%的聚集体尺寸落入一个数量级的尺寸范围内。
16. 根据权利要求15所述的方法,其中所述离液剂为5-8M尿素和1-4M硫脲,所述去垢剂 为0.5%-4%CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐),且所述缓冲剂为5-lOOmM甘氨酸。
17. 根据权利要求15所述的方法,其中逐渐去除离液剂和变性剂通过超滤进行。
18. 根据权利要求15所述的方法,所述方法还包括以下步骤: i. 提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肽的大肠杆菌细胞; ii. 进行所述大肠杆菌细胞的裂解、细菌细胞破坏和离心,以提供包含多聚体-多表位 多肽的包含体; iii .进行所述包含体的至少一次洗涤。
19. 根据权利要求18所述的方法,所述方法包括以下步骤: i v.将所述包含体溶解于这样的溶液中,所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5 % -4 % CHAPS、还原剂以及5-100mM甘氨酸,所述甘氨酸作为缓冲剂提供在7-10的范围内的pH; v.通过逐渐去除所述离液剂和所述还原剂诱导可控聚集,连同添加含胍基的缓冲剂, 从而形成不溶性聚集体的悬液;以及 vi .通过缓冲液更换配制所述悬液,以获得约0.1-0.4M含胍基的氨基酸和10-40mM柠檬 酸盐缓冲剂的、具有在4-8的范围内的pH的最终悬液。
20. 根据权利要求19所述的方法,其中添加含胍基的缓冲剂在步骤(v)的聚集体形成之 前进行。
21. 根据权利要求19所述的方法,其中添加含胍基的缓冲剂在步骤(v)的聚集体形成之 后进行。
22. 根据权利要求19所述的方法,其中在步骤(iv)和(v)之间进行至少一个色谱分离步 骤。
23. 根据权利要求18所述的方法,其中步骤(ii)的所述细菌细胞破坏通过高压均化进 行。
24. 根据权利要求18所述的方法,其中步骤(ii)的裂解在具有在7-9的范围内的pH的缓 冲液中进行,所述缓冲液包含Tris缓冲剂、EDTA和每lg细胞糊状物0.1-0.5mg溶菌酶。
25. 根据权利要求19所述的方法,其中步骤(iv)的所述还原剂为在20-80mM的浓度的β- 巯基乙醇。
26. 根据权利要求19所述的方法,其中在步骤(iv)的诱导可控聚集通过超滤进行。
27. 根据权利要求19所述的方法,其中在最终组合物中的多肽浓度为l-10mg/ml。
28. 根据权利要求19所述的方法,其中所述至少一种多聚体-多表位流感多肽序列在 SEQ ID N0.86中列出。
29. 根据权利要求19所述的方法,所述方法包括以下步骤: i.将包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中,所述溶 液包含6M尿素、2M硫脲、1 % CHAPS、50mMf3-巯基乙醇以及提供约9.5的pH的50mM甘氨酸; ii .通过逐渐去除所述离液剂和所述还原剂诱导聚集,从而形成不溶性聚集体的悬液; i ii .通过包括逐渐添加0.5M精氨酸缓冲液的超滤,使所述悬液经历浓缩和缓冲液更换 步骤;以及 iv.使所述悬液经历缓冲液更换,以获得最终组合物,所述最终组合物包含约2.5mg/ml 所述多肽、约0.2M精氨酸和约20mM梓檬酸盐缓冲剂,具有约6的pH。
30. -种产生重组多聚体-多表位多肽的基本上稳定的水性悬液的方法,所述方法包括 以下步骤: i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中,所述溶 液包含6M尿素、2M硫脲、1 % CHAPS、50mMf3-巯基乙醇以及提供约9.5的pH的50mM甘氨酸; i i .通过逐渐去除所述尿素、所述硫脲和所述β-巯基乙醇诱导聚集,从而形成不溶性聚 集体的悬液; iii. 通过包括逐渐添加0.1-1Μ精氨酸缓冲液的超滤,使所述悬液经历浓缩和缓冲液更 换步骤;以及 iv. 使所述悬液经历缓冲液更换,以获得最终悬液,所述最终悬液包含约l_5mg/ml所述 多肽、约0.1-0.5M精氨酸和约10-50mM梓檬酸盐缓冲剂,具有在4-7的范围内的pH。
31. 根据权利要求30所述的方法,其中在步骤(i i i)中添加0.5M精氨酸缓冲液并在步骤 (iv)中获得最终悬液,所述最终悬液包含约2.5mg/ml所述多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠 檬酸盐缓冲剂,且pH为约6。
32. -种药物组合物,所述药物组合物通过根据权利要求16-31中任一项所述的方法来 产生。
33. 根据权利要求1-15和32中任一项所述的药物组合物,所述药物组合物被配制用于 经由选自由以下组成的组的途径施用:肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、皮内和经皮。
34. -种在受试者中诱导免疫应答并赋予针对流感的保护的方法,所述方法包括将呈 疫苗形式的根据权利要求1-15和32中任一项所述的药物组合物施用至所述受试者。
35. 根据权利要求34所述的方法,其中所述疫苗作为包括与季节性或大流行性流感疫 苗一起共施用的疫苗接种方案的一部分被施用。
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