CN1537939A - 生产重组尿激酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供生产正确折叠的重组尿激酶的高效方法。该方法首先通过用高pH离液剂溶解蛋白质，其后通过在低浓度离液剂存在下缓慢降低pH使变性的重组尿激酶原再折叠。

Description

生产重组尿激酶的方法

相关申请的相互引用参考

本申请要求美国临时专利申请60/463,632(2003年4月16日提交)以及美国临时专利申请60/498,134(2003年8月26日提交)的优先权，这两项申请全文引入本文作为参考。

发明背景

尿激酶是一种丝氨酸蛋白酶，该酶切割纤溶酶原产生活性的纤溶酶，因此在纤维蛋白溶解作用中起重要作用。临床上，此活性已被用于活性的治疗血栓形成，包括血栓形成性中风、肺栓塞、深静脉血栓形成等等。

尿激酶最初以411个氨基酸的前体蛋白质形式被合成，其具有12个链内二硫键。尿激酶原通过蛋白水解作用而活化为成熟的尿激酶，在上述蛋白水解作用中主链在Lys₁₅₈后断裂，从而生成由二硫键相连的双链分子。临床应用的尿激酶纯化自收集的尿，这存在安全和再现性方面的忧虑。

尿激酶的重组形式已经有所报道，其包括“低分子量尿激酶”(其氨基末端125个氨基酸被删除)及其它变体。参见Orsini等人(1991，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Bioch.)195：691-97)、Liu等人(2002，循环研究(Circ.Res.)90：757-63)、Tang等人(1997，蛋白质表达纯化(Prot.Express.Purif.)11：279-83)、Winkler等人(1986，生物化学(Biochem.)25：4041-45)以及美国专利号5,188,829、5,219,569和5,472,692。

当在细菌中高水平表达时，尿激酶原以不溶的“包含体”或“折射体”的形式聚积。这些不溶的颗粒中所含的蛋白质系错误折叠，并且其在折叠成正确构象之前必须经过“解折叠”(变性，包括错误配对二硫键的还原)。许多再折叠的“一般”实验方案已有报道，包括美国专利号4,511,503、4,599,197和美国专利公开号2001/0044521(美国专利号6,583,268)。

在此引用的所有专利、专利申请和出版物均全文引入作为参考。需要指出的是，本发明背景部分中参考某一出版物并不表示承认所述出版物构成了本发明所指的现有技术。

发明概述

本发明人发现了生产具酶学活性尿激酶的简单高效的方法。该方法利用粗制的由细菌产生的尿激酶原(例如细胞糊状物或包含体)，并经仅仅几个步骤就生成正确折叠、高活性的尿激酶原或尿激酶。本发明所述的方法可以达到至少20％-40％的总收率，并可用于生产活性至少为每毫克蛋白质约100,000国际单位(IU/mg)的尿激酶。重要的是，本发明人已经发现根据本发明生产的尿激酶在溶液中高度稳定，因此其尤其适用于尿激酶的液体制剂形式。

总的来说，本发明提供从细菌细胞含尿激酶原的包含体生产具酶学活性的尿激酶或尿激酶原的方法，所述方法包括在高pH(即大于约pH9)的缓冲液中溶解包含体蛋白质，并通过减少离液剂浓度和缓慢降低pH至中性(即pH7.5-8.5)使蛋白质再折叠，所述高pH缓冲液含有二硫化物还原剂及高浓度离液剂(例如8M尿素或6M盐酸胍)。然后可以将再折叠尿激酶原纯化。在再折叠蛋白质纯化前或纯化后，利用适当的丝氨酸蛋白酶(如纤溶酶或胰蛋白酶)消化再折叠的尿激酶原，从而得到尿激酶。

本发明提供生产再折叠重组尿激酶原的方法，所述方法包括利用溶解缓冲液溶解变性的尿激酶原蛋白质以产生溶解的尿激酶原溶液，通过将溶解的尿激酶原溶液加入到再折叠缓冲液中将尿激酶原溶液用再折叠缓冲液快速稀释，从而形成稀释的尿激酶原溶液，将尿激酶原溶液的pH降低至约7.5到约8.5，由此产生再折叠的尿激酶原，其中所述的pH降低用至少约20小时的时间来完成，所述的溶解缓冲液含有高浓度离液剂、还原剂并且其pH为约9.0到约11.0。

在某些实施方案中，尿激酶原为人尿激酶原。

在某些实施方案中，离液剂为尿素，其浓度可以为约8M。在另外的实施方案中，离液剂为盐酸胍，其浓度可以为约6M。

在某些实施方案中，溶解缓冲液的pH约为10。在某些实施方案中，溶解缓冲液的pH约为10.5。在某些实施方案中，溶解缓冲液的pH约为10.0到10.5。

在某些实施方案中，稀释的溶解的尿激酶原溶液的pH降低至约8.0。

在某些实施方案中，利用再折叠缓冲液将溶解的尿激酶原溶液稀释约20倍。

在某些实施方案中，再折叠缓冲液包含约2.0M尿素和约1M精氨酸。在某些实施方案中，再折叠缓冲液包含约2.0M尿素和约0.2M精氨酸。

本发明在生产工序的开始可以包括附加步骤。因此，在某些实施方案中，本方法包括裂解细菌宿主细胞的预备步骤，该步骤包括将尿激酶原变性并收集所述变性的尿激酶原蛋白质。某些其它实施方案还包括洗涤变性的尿激酶原蛋白质。

本发明在生产工序的最后也可以包括附加步骤。因此，在某些实施方案中也包括再折叠尿激酶原的纯化，诸如利用大小排阻层析(SEC)、离子交换层析(IEC)、肝素亲合层析、羟磷灰石层析或上述步骤的组合，如SEC和IEC、SEC后进行阳离子交换层析以及SEC后进行肝素亲合层析和羟磷灰石层析，其可以以任意顺序使用。

在某些实施方案中，本发明包括切割再折叠尿激酶原以产生尿激酶。由此产生的尿激酶可以具有至少约每毫克蛋白质100,000国际单位(IU/mg)的比活性。

在示例性的实施方案中，将变性的尿激酶原多肽溶解于溶解缓冲液以产生溶解的尿激酶原多肽，将其浓度调整至约3.6mg/mL，利用再折叠缓冲液快速稀释约20倍，用至少约24小时的时间将稀释的溶解的尿激酶原多肽的pH调整至约pH8；其中所述溶解缓冲液含有约8M尿素和约100mMβ-巯基乙醇，其pH约为10；所述再折叠缓冲液含有约2M尿素、约1M精氨酸以及氧化型和还原型谷胱甘肽。

在另一示例性的实施方案中，将变性的尿激酶原多肽溶解于溶解缓冲液以产生溶解的尿激酶原多肽，将其浓度调整至约3.6mg/mL，利用再折叠缓冲液快速稀释约20倍，用至少约24小时的时间将稀释的溶解的尿激酶原多肽的pH调整至约pH8；其中所述溶解缓冲液含有约8M尿素和约100mMβ-巯基乙醇，其pH约为10.5；所述再折叠缓冲液含有约2M尿素、约0.2M精氨酸以及氧化型和还原型谷胱甘肽。

在另一示例性的实施方案中，将变性的尿激酶原多肽溶解于溶解缓冲液以产生溶解的尿激酶原多肽，将其浓度调整至约3.6mg/mL，利用再折叠缓冲液快速稀释约20倍，用至少约24小时的时间将稀释的溶解的尿激酶原多肽的pH调整至约pH8；其中所述溶解缓冲液含有约8M尿素和约100mMβ-巯基乙醇，其pH约为10.5；所述再折叠缓冲液含有约1M盐酸胍、约0.2M精氨酸以及氧化型和还原型谷胱甘肽。

本发明还提供利用本方法生产的正确折叠的尿激酶原和尿激酶。

附图简述

图1a和1b显示在实施例1和2中用于生产尿激酶原蛋白质[SEQ IDNO：2]的人尿激酶原基因的核苷酸序列[SEQ ID NO：1]。核苷酸序列中的斜体碱基表示为增加在大肠杆菌中的表达效率而改变的碱基。蛋白质序列用单字母氨基酸密码表示。

图2显示实施例3所述的尿激酶活性测定的Hanes图。

发明详述

本发明提供生产重组、正确折叠的尿激酶原和尿激酶的简单高效的方法。

除非另有指明，本发明的实施将采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，以上所述均在本领域技术范围之内。参见，例如分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：a laboratorymanual)，第二版，Sambrook等人(1989)；分子生物学最新方法(CurrentProtocols In Molecular Biology)，F.M.Ausubel等人编辑，(1987)；“酶学方法”(Methods In Enzymology)系列，Academic Press，Inc.；PCR 2：实用方法(PCR 2：Practical Approach)，M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)；以及抗体：实验室手册(Antibodies，A LaboratoryManual)，Harlow和Lane编辑(1988)。

需要指出的是，文中使用的单数形式除非特别指明均包括复数形式。此外，文中使用的术语“包含”及其同源词使用的是它们“包括”的含义，即其等同于“包括”及其相应的同源词。

本发明的方法一般利用含有尿激酶原多肽的包含体作为起始材料而实施，所述包含体可以是例如在经改造用于生产尿激酶原的细菌(如大肠杆菌)细胞中形成的包含体，但本发明的方法也可使用任何来源的变性的尿激酶原蛋白质。按照操作者的选择，尿激酶原可以来自任何所需要的物种以及任何天然或非天然尿激酶原序列。许多尿激酶原基因的全长编码序列可以公开地获得(例如人、大鼠、小鼠和兔尿激酶原序列可分别通过保藏号NM002658、NM 013085、NM 008873和AY 122285从Genbank得到)，并且其它物种(例如马、牛、猕猴等)的部分编码序列也可以得到，所述部分编码序列可用于分离全长序列。另外，也可以使用改变的尿激酶原基因，如删除编码分泌信号序列的序列的基因、可提高在宿主生物体中的表达的具有“沉默”改变的基因(“优化”序列)或编码具有一个或多个氨基酸序列改变的尿激酶原突变体的基因。

可以对重组宿主细胞(例如细菌，诸如大肠杆菌)进行改造以利用任何简便的技术来生产尿激酶原多肽。尽管也可使用基于噬菌体基因组DNA的表达载体，但最常见的是将编码所需尿激酶原的DNA序列插入到提供合适的转录和翻译调控序列的质粒表达载体的适当位点。尽管也可使用组成型转录调控序列，但通常优选可被宿主细胞周围环境的改变(例如添加可引起转录调控序列应答的底物或假底物)诱导的转录调控序列。还优选在表达载体中包含正筛选标记(例如β-乳糖酶基因，其可引起氨苄西林抗性)，以便从不含表达载体的细菌宿主细胞中筛选出含表达载体的细菌宿主细胞，这是本领域的标准方法。

细菌宿主细胞一般在适合于宿主细胞和表达载体的条件下、在液体生长培养基中培养以生产尿激酶原多肽。优选将宿主细胞在细菌发酵罐中培养以获得最大产量，但其它任何简便的培养方法也是可接受的(例如摇瓶，尤其是用于少于1升的培养物)。对本领域技术人员而言显而易见的是，精确的生长条件、培养基补料的时间和速率以及诱导剂的添加(如果需要的话)应根据宿主细胞和表达构建体而改变。

将细菌宿主细胞培养至所需要的密度(以及经任何必须的表达诱导)后，收集所培养的细胞。尽管可以采用任何其它便利的技术，但收集一般通过将生长培养基离心而方便地实现。所收集的细菌宿主细胞可以在这一阶段进行洗涤以除去痕量的生长培养基，最常用的方法是在一种简单的缓冲液中重悬然后离心(或其它便利的细胞收集方法)。此后，所收集的细菌宿主细胞(“细胞糊状物”)可以立即按照本发明进行处理，或者可以冰冻贮存至以后处理。

将细胞糊状物中的细胞裂解，使之释放出含尿激酶原多肽的包含体。优选将细胞在一定条件下裂解，在所述条件下细胞残片可以被充分破碎以至于在低速离心时不会在沉淀中出现。通常情况下，将细胞在约pH5到9(优选约6到8)的缓冲液中悬浮，并使用约0.01到2M(优选约0.1到0.2M)的离子强度(使用基本上为0的离子强度显然是不合适的)。可用任何合适的盐(包括NaCl)来维持适当的离子强度水平。悬浮于上述缓冲液后，将细胞利用常规技术裂解，例如机械方法如冻/融循环，使用Manton-Gaulin压碎器、弗氏压碎器或超声震荡器，或者通过化学或酶学方法诸如用溶菌酶处理。通常优选在低温条件下(即低于20℃)进行细胞裂解以及任选地进行细菌细胞收集。

利用任何便利的技术(例如离心)从裂解的细胞糊状物中收集包含体，然后洗涤。如果需要，可以洗涤收集的包含体。包含体的洗涤一般是通过在洗涤缓冲液中重悬，然后再将包含体重新收集来进行，其中所述的洗涤缓冲液一般为裂解缓冲液，优选其中加有去污剂(例如1％TRITONX-100)。其后，将洗涤过的包含体在溶解缓冲液中溶解。溶解缓冲液含有高浓度的离液剂、将溶液缓冲至高pH的pH缓冲剂以及一种或多种还原剂。溶解缓冲液还可以任选含有其它试剂，如氧化还原剂、阳离子螯合剂以及用于中和可破坏蛋白质的自由基的清除剂。

本发明的溶解缓冲液使用尿素作为示例性的离液剂，但也可以使用盐酸胍。溶解缓冲液中尿素的实用浓度包括约7.5M到约9M、约8M到约8.5M或约8M。当离液剂为盐酸胍时，实用浓度包括约5M到约7M，或约5.5M到约6.5M，或约6M。

溶解缓冲液的pH很高，即超过pH9.0。溶解缓冲液的实用pH水平为约9.0到约11.0、约9.5到约10.5、约10.0到约10.5、约10或约10.5。对本领域技术人员显而易见的是，尽管可以在约pH8到约pH9或10之间起缓冲作用的pH缓冲剂尤其有用，但任何其它在高pH下能有效起缓冲作用的pH缓冲剂(或缓冲剂的组合)也是有用的。有用的pH缓冲剂包括Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、Bicine(N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、HEPBS(2-羟基-1，1-双[羟甲基]乙基)氨基]-1-丙磺酸)、TAPS([(2-羟基-1，1-双[羟甲基]乙基)氨基]-1-丙磺酸)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸)等等。加入的pH缓冲剂的浓度应提供有效的pH缓冲作用，例如从约50到约150mM、约75到约125mM、或约100mM。

溶解缓冲液中包含还原剂以还原二硫键并维持半胱氨酸残基的还原形式。可以使用的还原剂包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等等。此外，溶解缓冲液可以含有二硫化物相互转变(reshuffling)或“氧化还原”试剂(例如氧化型和还原型谷胱甘肽的组合)。当氧化还原试剂为氧化型和还原型谷胱甘肽(分别为GSSG和GSH)时，本发明人发现其实用的浓度包括约0.1mM到约11mM，并且其实用的比例包括约10∶1，约5∶1以及约1∶1(GSSG∶GSH)。

溶解缓冲液可以包含其它成分。例如，溶解缓冲液可以含有阳离子螯合剂，诸如二价阳离子螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)。溶解缓冲液中加入的EDTA或EGTA的浓度为约0.5至约5mM，且一般为约1mM。另外，还可以加入自由基清除剂以减少或消除自由基介导的蛋白质破坏，尤其当使用尿素作为离液剂且预期将含有尿素的蛋白质溶液贮存相当长的时间时。适宜的自由基清除剂包括甘氨酸(例如，浓度约为0.5至约2mM，或约1mM)以及其它氨基酸和胺类化合物。

将包含体/溶解缓冲液混合物温育以使其完全溶解。温育时间通常从约6小时到约24小时，且更惯常地从约8小时到约14小时或者约12小时。包含体/溶解缓冲液混合物的温育可以在低温下进行，通常在约4℃到约10℃下进行。

待温育完成后，将包含体/溶解缓冲液混合物澄清以除去不溶性残渣。混合物的澄清可以通过任意一项便利的方法完成，例如过滤(如通过使用深芯滤器)或离心。澄清应在低温下进行，例如在约4℃至约10℃下进行。

随后将澄清的混合物稀释至合适的蛋白质浓度以利于再折叠。蛋白质浓度可以利用任意一项便利的技术确定，所述技术为例如Bradford测定法、280nm光吸收(A₂₈₀)等等。本发明人已经发现在本发明的方法中使用A₂₈₀为约5.0(约3.6mg/mL)至约10.0的溶液是合适的。尽管混合物一般不会保存超过约4周，但如果需要，该混合物可以冷藏(例如在4℃下)保存等待以后处理。

将调整浓度后的包含体溶液首先利用再折叠缓冲液快速稀释20倍。稀释通过向再折叠缓冲液中加入包含体溶液来进行。可将包含体溶液用再折叠缓冲液稀释约10到约100倍，约10到约50倍，约10到约25倍，约15到约25倍。稀释包含体溶液是为了降低尿素和蛋白质浓度。稀释后的蛋白质终浓度可以为约0.01mg/mL到约1mg/mL，约0.1mg/mL到约0.5mg/mL。再折叠缓冲液含有低浓度离液剂、pH缓冲剂、二硫化物相互转变试剂以及二价阳离子螯合剂。再折叠缓冲液也可以包含其它试剂，如自由基清除剂和去污剂。文本中所谓的“快速”稀释是指稀释过程在小于约25分钟的时间内进行，并且稀释过程通常在约2分钟到约25分钟，或约5分钟到约20分钟内进行。在快速稀释过程完成后，通常将稀释的溶解的尿激酶原溶液保持1到2小时。

可用于再折叠缓冲液的离液剂包括尿素、胍和精氨酸，但本发明人发现单独使用尿素无效。然而，发明人还发现在再折叠缓冲液中将尿素和精氨酸联合使用是有效的。当尿素和精氨酸联合使用时，尿素可以从约0.8到约2.5M，约0.9到约2M，约1到约2.5M，或约2.0M，或1.0M，且精氨酸可以从约0.05M到约1.5M，约0.2M到约1.0M，约0.5M到约1.5M，约0.75M到约1.25M，约0.2M，或约1.0M。本发明人还发现在再折叠缓冲液中将盐酸胍和精氨酸联合使用也是有效的。当盐酸胍和精氨酸联合使用时，盐酸胍可以从约1mM到约1.5M，或约0.05M到约1.5M，或约1M，且精氨酸可以从约0.05M到约1.5M，约0.2M到约1.0M，约0.5M到约1.5M，约0.75M到约1.25M，约0.2M，或约1M。

再折叠缓冲液中的pH缓冲剂可以是任何在pH约为8至9或10的水平下有效的缓冲剂或缓冲剂的组合。有用的pH缓冲剂包括Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、Bicine(N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、HEPBS(2-羟基-1，1-双[羟甲基]乙基)氨基]-1-丙磺酸)、TAPS([(2-羟基-1，1-双[羟甲基]乙基)氨基]-1-丙磺酸)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸)。加入的pH缓冲剂的浓度应提供有效的pH缓冲作用，例如从约50到约150mM、约75到约125mM、或约100mM。

再折叠缓冲液中的氧化还原剂必须在将半胱氨酸的巯基在其氧化和还原态之间“相互转变”中有作用。再折叠反应的氧化还原环境通过氧化还原剂的浓度来调节。当氧化还原剂为氧化型和还原型谷胱甘肽(分别为GSSG和GSH)时，本发明人发现其实用的浓度包括约0.1mM到约11mM，且实用的比例包括约10∶1，约5∶1以及约1∶1(GSSG∶GSH)。

二价阳离子螯合剂可以为任何能有效螯合Ca⁺⁺和其它二价阳离子的分子。在再折叠缓冲液中使用的示例性阳离子螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)。当用EDTA或EGTA作为二价阳离子螯合剂时，其加至再折叠缓冲液中的浓度为约0.5至约5mM，且一般为约1mM。

可用于再折叠缓冲液中的其它成分包括自由基清除剂和去污剂。可以加入自由基清除剂以减少或消除自由基介导的蛋白质破坏，尤其当使用尿素作为离液剂且预期将含有尿素的蛋白质溶液贮存相当长的时间时。合适的自由基清除剂包括甘氨酸(例如大约0.5至约2mM，或约1mM)。再折叠缓冲液中也可以加入低浓度的去污剂，如约0.01％至约0.1％的TWEEN20。

其后，利用适当的酸将再折叠溶液的pH从高pH缓慢降低至约中性pH。降低pH所用的时间为约20-24小时到约10天，约20到约50小时，约20到约40小时，约20到约30小时，约24到约40小时。降低pH所用的时间至少为约20小时，约24小时，约30小时，约40小时，约50小时。用于调节pH的合适的酸取决于再折叠缓冲液中使用的pH缓冲剂。例如，当pH缓冲剂为Tris时，pH应使用盐酸(HCl)调节。

pH调节完成后，将再折叠反应保温约1至2个小时到约18至24个小时。根据操作者的选择和可得到的条件，再折叠反应可以在室温(例如约18-20℃)或稍低的温度(例如约14-16℃)下进行。

再折叠反应后，将正确再折叠的尿激酶原浓缩，进一步纯化，和/或将蛋白质进行蛋白水解处理(例如用纤溶酶处理)以产生成熟的尿激酶。再折叠蛋白质的浓缩可以利用任何便利的技术完成，例如超滤、透析、层析(如离子交换层析、疏水相互作用或亲合层析)等等。如果需要，浓缩步骤也可以包括缓冲液交换处理。在实践中，浓缩优选在低温(例如约4-10℃)下进行。

尽管可以使用任何便利的纯化方案，但本发明人采用了一种利用两步层析步骤的简单方法。所述两步层析包括开始的大小排阻层析步骤和最后的离子交换层析步骤。在一些实施方案中，利用肝素亲合层析进行纯化。肝素亲合层析涉及将再折叠蛋白质结合至固定化肝素。在其它实施方案中，利用羟磷灰石层析进行纯化。羟磷灰石层析可以在肝素亲合层析后使用。与浓缩(以及任选的缓冲液交换)一样，纯化步骤可以在低温(如4℃)下进行。

大小排阻层析(SEC)可以利用任何能够将正确折叠的尿激酶原与未折叠尿激酶原和多聚体尿激酶原分离的层析介质进行。本发明人发现，在这一步骤中可以使用能够分离约10⁴至约6×10⁵道尔顿蛋白质(球状蛋白质)的介质。示例性的SEC介质包括Sephacryl300和Superdex^TM 200。如果需要，这一步骤也可以用于进行缓冲液交换。SEC的精确条件取决于所选择的特定层析介质、是否进行缓冲液交换、任何后续纯化步骤的要求以及本领域技术人员所公知的其它因素。

正确折叠的尿激酶原可以利用阳离子交换层析进一步纯化。示例性的阳离子交换层析步骤利用磺丙基(一种强阳离子交换剂)衍生化的交换树脂进行。在低盐条件下装柱，在低盐条件下洗涤，并在高盐条件下洗脱。当使用盐酸胍作为离液剂时，从SEC柱上洗脱的材料应进行稀释以减少盐酸胍的浓度至小于约0.2M。与SEC一样，IEC的精确条件取决于所选择的特定层析介质、是否进行缓冲液交换、任何后续纯化步骤的要求以及本领域技术人员所公知的其它因素。一般地，上柱条件应具有低的离子强度和低的pH(例如pH为约6到7)，并且应该避免高浓度的离液剂。

正确折叠的尿激酶原可以进一步利用肝素亲合层析和/或羟磷灰石层析进行纯化。肝素亲合层析可以利用任何固定化的肝素进行。示例性的介质包括Haparin Hyper^TM M、HiTrap^TM Heparin HP等等。羟磷灰石层析的示例性介质为CHT-II羟磷灰石(BioRad)。

在一些实施方案中，利用25mM HEPES pH7.0将再折叠尿激酶原(存在于再折叠缓冲液中)稀释5倍，并将其直接装入含有固定化肝素如肝素-琼脂糖(Pharmacia/Amersham)的层析柱中。在将再折叠尿激酶原装柱之前，首先用不合螯合剂或者伯胺或仲胺的低盐缓冲液平衡层析柱，所述缓冲液为例如50mM Hepes，25mM NaCl，pH7.0。待尿激酶原结合至层析柱后，用10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱。其后，用NaCl浓度升至125mM的相同缓冲液洗涤层析柱以洗脱杂质。最后，用50mM Hepes，500mM NaCl，pH7.0将尿激酶原从层析柱上洗脱。肝素亲合层析中使用的缓冲液可以任选含有0.1mM苄脒。收集含有尿激酶原的柱洗脱级分，并将其上样至羟磷灰石层析柱上。在装柱之前，首先用50mM HEPES，pH7.0，150mM NaCl平衡羟磷灰石层析柱。将尿激酶原上样到层析柱上后，用平衡缓冲液洗涤层析柱至无蛋白质流出。其后，用50mM HEPES pH7.0，150mM NaCl，100mM磷酸钠pH7.0洗涤直至无蛋白质流出。最后，用含有50mM HEPES pH7.0，150mM NaCl，500mM磷酸钠pH7.0的缓冲液将尿激酶原从层析柱上洗脱。

可以利用本领域已知的任何方法(例如用纤溶酶消化)，从通过本发明方法生产的再折叠尿激酶原生产尿激酶。用纤溶酶处理尿激酶原的方法为本领域公知，并且可以利用任何便利的方法进行。本发明的实施例3描述了一种利用纤溶酶的实用方法(与纤溶酶(0.1μg/mL)一起在37℃温育60分钟，然后加入过量的蛋白酶抑制剂如12,500IU/mL抑酶肽)。或者，也可以利用结合至固相的纤溶酶将尿激酶原加工成尿激酶。

由按照本发明方法生产的正确折叠的重组尿激酶原生产的尿激酶的活性可以利用任何可接受的测定方法进行测定。测定尿激酶活性的示例性方法为本发明实施例3所用的方法，该方法通过纤溶酶消化将尿激酶原活化为尿激酶，并随后利用颜色底物S-2444测定尿激酶的活性(Wang等人，2000，血栓形成研究(Thromb.Res.)100：461-467；Orsini等人，1991，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Bioch.)195：691-97)。

本领域技术人员可以理解，所有浓度和pH值均无需精确，并且对某一给定值的参考反应了本领域的标准用法，并不意味着该数值不能改变。

下述实施例提供了按照本发明方法生产正确折叠重组尿激酶原及其鉴定的详尽叙述。这些实施例无意以任何方式限制本发明。

                             实施例

实施例1：重组尿激酶原的再折叠和纯化

利用PCR扩增肾cDNA文库产生编码人尿激酶原的DNA片断，上述PCR反应所用引物为UK-1(5’-CATATGTCCAACGAACTGCACCAGGTTCCATCGAACTGTGACTGTC-3’[SEQ ID NO：3])和UK-2(5’-CTCGAGTTAGAGGGCCAGGCCATTCTCTTC-3’[SEQ ID NO：4])。引物UK-1用于向尿激酶原基因引入6个沉默突变，这可以增加在大肠杆菌中的表达效率。

将全长PCR产物克隆至pCR2.1TOPO(Invitrogen)并利用M13F和M13R引物从两端测序。图1中显示了该核苷酸和其编码的蛋白质序列。利用NdeI-XhoI限制性消化将插入片断切割、凝胶纯化，然后将其克隆至NdeI-XhoI消化的pET43(Novagen)。

将尿激酶原表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株内并铺在含有氨苄西林的ZB平板上。选择单个菌落并用其接种含氨苄西林的100mL ZB培养基(10g/l NZ胺A(sigma)和5g/l NaCl)，并在37℃生长过夜(约16小时)。将100mL起始培养物中的20mL再接种至1L含氨苄西林的ZB培养基，并将其在37℃震摇温育至600nm的光密度(OD₆₀₀)达到0.4-0.6。然后加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至0.5mM以诱导尿激酶原表达，并将培养物继续摇动3小时。

通过离心收集细胞，然后在含有1％TRITON X-100的20mL TN(150mM NaCl，50mM tris，pH8.0)中重悬。向其中加入10mg溶菌酶，并将细胞悬液在-20℃冰冻过夜。然后将裂解物融化并加入20μl 1M硫酸镁和100μg DNase。搅动细胞，并将其温育至释放的细菌DNA完全溶解。

其后用250mL含有1％TRITON X-100的TN稀释裂解物并搅动混合物2-4小时。通过离心收集包含体，并将其洗涤3次(通过重悬和离心)。

将洗涤过的包含体溶于10mL尿素溶液(8M尿素，100mM tris，1mM甘氨酸，pH10)，并向其中加入β-巯基乙醇(BME)至100mM。所得溶液通过超速离心(30分钟×66,000g)澄清，其后用于再折叠。在另一实验中，尿素溶液的pH为10.5。

再折叠通过首先快速稀释澄清的溶液，最初调节pH至10，然后逐渐降低pH至8.0来进行，上述稀释通过将澄清的溶液加至20倍体积的20mMTris，0.2M精氨酸，1M盐酸胍，1mM EDTA中来进行。pH降低通过用6M盐酸每4小时减小0.2个pH单位来进行。

再折叠产物通过超滤(Millipore Pellicon，10,000Da截留膜)浓缩，然后进行SEC，SEC使用经10mM tris，0.4M尿素，1M盐酸胍，0.2M精氨酸和1mM EDTA，pH8.0平衡的SEPHACRYLS-300层析柱。

通过IEC进一步纯化，使用经磷酸盐缓冲液平衡的SP琼脂糖FF层析柱并采用从0到1M NaCl的梯度洗脱。

终产物在20mM tris，0.4M尿素，1mM EDTA和20％甘油，pH8.0中冷冻(4℃)和冷藏(-20℃)保存。

实施例2：通过肝素亲合层析和羟磷灰石层析纯化重组尿激酶原

将按照实施例1所述生产的再折叠尿激酶原通过超滤(MilliporePellicon，10,000Da截留膜)浓缩，然后进行SEC，SEC使用经10mM tris，0.4M尿素，1M盐酸胍，0.2M精氨酸和1mM EDTA，pH8.0平衡的SEPHACRYLS-300层析柱。通过该层析将再折叠尿激酶原从错误折叠的高分子量聚集物中分离出来。

从S-300层析柱收集含有尿激原酶的级分，用25mM HEPES pH7.0稀释5倍，并将其上样至HiTrap^TM Heparin HP琼脂糖亲合层析柱(Pharmacia/Amersham)上。肝素亲合层析柱首先用25mM HEPES pH7.0，25mM NaCl平衡。待样品上柱后，用平衡缓冲液洗涤层析柱至流出液中无蛋白质检出。其后，用25mM HEPES pH7.0，125mM NaCl洗涤层析柱至流出液中无蛋白质检出。最后，用含25mM HEPES pH7.0，500mM NaCl的缓冲液将尿激酶原从层析柱上洗脱。然后收集含有尿激酶原的级分并将其直接上样到BioRad CHT II羟磷灰石层析柱上。羟磷灰石层析柱事先用50mM HEPES pH7.0，100mM NaCl，10mM磷酸钠pH7.0平衡。待尿激酶原上柱后，用平衡缓冲液洗涤层析柱至流出液中不再有蛋白质检出。其后再用50mM HEPES pH7.0，100mM NaCl，100mM磷酸钠pH7.0洗涤层析柱至流出液中不再有蛋白质检出。最后，用含50mM HEPES pH7.0，100mM NaCl，500mM磷酸钠，pH7.0的缓冲液将尿激酶原从层析柱上洗脱。收集含有尿激酶原的级分并随后将其在50mM HEPES pH7.0，150mMNaCl，0.1mM苄脒，10％(v/v)甘油中透析并且在4℃贮存。

实施例3：重组尿激酶的鉴定

将按照实施例1生产的纯化的人尿激酶原用50mM tris，50mM NaCl，0.01％TWEEN20，pH8.9稀释至1μM，并通过与纤溶酶(0.1μg/mL)在37℃温育60分钟而转变为尿激酶。反应通过加入过量(12,500IU/mL)抑酶肽终止。

酶学活性通过如下描述的方法测定：将尿激酶稀释10倍并与不同浓度的产色底物S-2444(pyro-Glu-Gly-Arg-pNA，DiaPharma)一起温育，然后通过检测450nm的吸收值(A450)来测定游离pNA的产量。结果利用Hanes作图法作图。用尿激酶国际标准品样品(获得自NIBSC/SHO)进行平行测定以便于以国际单位(IU)的形式计算活性。

Hanes作图显示在图2中。纯化的尿激酶的活性为100,000IU/mg(±9.5％)，Kcat/Km(min μM)^-1为中2.9，Kcat(min)^-1为196以及Km(μM)为68。

尽管为了清楚和易于理解的目的已通过图解和实施例的方式对前述发明进行了详细描述，但是，对本领域技术人员显而易见的是，该发明可以进行某些改变和修饰。因此，上述描述和实施例不应理解为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附的权利要求书定义。

Claims (22)

1.生产再折叠重组尿激酶原的方法，其包括：

用溶解缓冲液溶解变性的尿激酶原蛋白质，所述溶解缓冲液包含高浓度的离液剂、还原剂，并且其具有约9.0到约11.0的pH，由此产生溶解的尿激酶原溶液；

通过将上述溶解的尿激酶原溶液加至再折叠缓冲液中将上述溶解的尿激酶原溶液用再折叠缓冲液快速稀释，由此产生稀释的溶解的尿激酶原溶液；

将稀释的溶解的尿激酶原溶液的pH降低至约7.5到约8.5，其中所述pH的降低用至少约20小时的时间完成，由此产生再折叠的尿激酶原。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的尿激酶原为人尿激酶原。

3.权利要求1-2任意一项所述的方法，其中所述的离液剂为尿素。

4.权利要求3所述的方法，其中所述尿素的浓度为约8M。

5.权利要求1-2任意一项所述的方法，其中所述的离液剂为盐酸胍。

6.权利要求5所述的方法，其中所述盐酸胍的浓度为约6M。

7.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述溶解缓冲液的pH为约10.0到约10.5。

8.前述权利要求任意一项所述的方法，其中将所述稀释的溶解的尿激酶原溶液的pH降低至约8.0。

9.前述权利要求任意一项所述的方法，其还包括调节变性的尿激酶原溶液的A280到约5.0至约10.0。

10.前述权利要求任意一项所述的方法，其中用再折叠缓冲液将变性的尿激酶原溶液稀释约20倍。

11.前述权利要求任意一项所述的方法，其中用再折叠缓冲液稀释变性的尿激酶原溶液，所述再折叠缓冲液包含约0.8M到约2.5M的尿素和约0.05M到约1.5M的精氨酸。

12.权利要求11所述的方法，其中所述的再折叠缓冲液包含约2.0M的尿素和约0.2M的精氨酸。

13.权利要求1所述的方法，其中所述的溶解缓冲液包含约8M的尿素和约100mM的β-巯基乙醇，并且其pH约为10.5；将所述溶解的尿激酶原溶液调节至A₂₈₀为约5.0，然后在再折叠缓冲液中快速稀释约20倍，并且所述再折叠缓冲液包含约2M尿素、约0.2M精氨酸、氧化型和还原型谷胱甘肽。

14.权利要求1所述的方法，其中所述的溶解缓冲液包含约8M的尿素和约100mM的β-巯基乙醇，并且其pH约为10.5；将所述溶解的尿激酶原溶液调节至A₂₈₀为约5.0，然后在再折叠缓冲液中快速稀释约20倍，并且所述再折叠缓冲液包含约1M盐酸胍、约0.2M精氨酸、氧化型和还原型谷胱甘肽。

15.前述权利要求任意一项所述的方法，其还包括裂解含有变性尿激酶原蛋白质的细菌宿主细胞以及收集所述变性的尿激酶原蛋白质。

16.权利要求15所述的方法，其还包括洗涤所述变性的尿激酶原蛋白质。

17.前述权利要求任意一项所述的方法，其还包括纯化所述再折叠的尿激酶原。

18.权利要求17所述的方法，其中，将所述再折叠的尿激酶原通过大小排阻层析(SEC)纯化。

19.权利要求17或18所述的方法，其中，将所述再折叠的尿激酶原通过离子交换层析(IEC)纯化。

20.权利要求17或18所述的方法，其中，将所述再折叠的尿激酶原通过肝素亲合层析纯化。

21.权利要求17、18和20中任意一项所述的方法，其中，将所述再折叠的尿激酶原通过羟磷灰石层析纯化。

22.利用前述任意一项权利要求所述的方法生产的再折叠的尿激酶原。

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