CN106163553B - 多聚体-多表位流感多肽的组合物及其产生 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含多聚体‑多表位流感多肽的药物悬液，涉及用于产生它们的方法以及涉及它们针对流感免疫接种受试者的用途。特别地，本发明涉及包含多聚体多表位多肽的稳定的水性微粒悬液。
Description
发明领域
本发明涉及基于多聚体多表位肽的流感疫苗的药物组合物及它们的制备方法。特别地，本发明提供了包含多聚体多表位多肽和含胍基的氨基酸的微粒悬液、它们的制剂及它们用于针对流感保护受试者的用途。
发明背景
流感是由迅速突变的流感病毒引起的感染性很强的疾病。流感很容易传播，并以季节性流行病在世界各地扩散，每年感染总人口的5％-20％。根据世界卫生组织(WHO)，每年在季节性爆发期间250,000-500,000人死于流感相关的原因。仅在美国(USA)，在典型年中，多于200,000人因季节性流感住院。流感感染可以是轻度的、中度的或严重的，范围从无症状经由轻度上呼吸道感染和气管支气管炎至严重的、偶尔致死的病毒性肺炎。感染与肺部和心血管并发症相关，所述并发症导致高发病率和死亡率，主要影响处于风险中的人群诸如幼儿、老人及患有慢性医学状况的个体。
在三种类型的流感病毒中，甲型流感病毒和乙型流感病毒分别引起人类中的约80％和20％的流感疾病，而丙型流感病毒不感染人类。由于血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面蛋白的频繁的抗原漂移和转变，甲型流感病毒具有许多子毒株和物种特异性的特点并被认为是广泛季节性流行病和大流行病的主要原因。在抗原变化后，经由未被免疫系统识别的病毒毒株的感染可导致被感染的个体的降低的免疫应答，其中更显著的变化将产生不太有效的对身体免疫防御的刺激。抗原漂移或转变可触发各自的流感流行病或大流行病，如最近的禽流感和猪流感大流行病毒株经历的。
迄今，商购可得的流感疫苗包含每年根据是高峰流感季节期间最普遍的毒株的预测选择的甲型流感抗原和乙型流感抗原。然而，由于包含在疫苗中的毒株和实际上流通的那些之间的错配，这些毒株特异性疫苗通常具有相对差的临床效力。另外，此类免疫接种方法要求在每年的基础上制备新的疫苗制剂。如此，识别多种病毒毒株的疫苗将更具成本效益并且将进一步增加患者依从性且增强全球的健康前景。
目前在使用中的商业流感疫苗组合物是通常包含以下的水性溶液：磷酸盐、钠离子、钾离子和/或钙离子缓冲剂，其中添加Triton、吐温、α-生育酚琥珀酸氢(α-tocopherylhydrogen succinate)和/或其他添加剂或赋形剂。FLUMISTTM(MedImmune)，一种用于流感的递呈季节性流感的表面抗原的活的减毒疫苗作为包含以下的溶液被提供：约0.05M精氨酸、0.188mg谷氨酸一钠、2mg水解猪明胶、13.68mg蔗糖、2.26mg磷酸氢二钾及0.96mg磷酸二氢钾。
属于本发明的一些发明人的PCT国际公布WO 2009/016639公开了流感多表位多肽及包含多种流感病毒肽表位的疫苗，其中每个表位在单个多肽中出现至少两次。
多聚体-001(M-001)疫苗由九种保守的线性表位组成，该九种保守的线性表位按照每种的三次重复来排列并作为表达于大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)中的单个重组多肽来制备。这些表位对于绝大多数流感病毒毒株是共同的，无论它们的抗原漂移和转变。因此，期望M-001还提供针对未来病毒毒株的基于免疫的保护。尽管每种菌株的外蛋白中存在变异，多聚体-001接种导致有效的跨毒株识别和保护。
用多种动物模型获得的显著性结果以及在重复的毒理学研究中观察到的安全性参数已为朝向在人中的临床试验作准备并提供了基础。已完成了评价M-001在成年和老年志愿者中的安全性和免疫原性的阶段I/II和阶段II临床试验(Atsmon等，2014,Vaccine32,5816–5823)。在PBS中的125-500μg剂量的带佐剂或无佐剂的疫苗被证明是安全的和良好耐受的。在GLP毒理学研究中评价了潜在的多聚体-001疫苗相关的毒性。以最大人类剂量反复IM施用两种M-001疫苗制剂(带佐剂的和无佐剂的)被证明是安全的。
属于本发明的一些发明人的WO 2012/114323提供了一种通过在流感疫苗之前或与流感疫苗一起将包含多个拷贝的多种流感病毒肽表位的多聚体流感多肽施用至受试者来改进季节性或大流行性流感疫苗的保护效应的方法。
当异源蛋白被表达于大肠杆菌中时包含体(IB)的形成频繁地发生，并且活性重组蛋白的复原通常要求重折叠成其的活性结构。Wingfield,P.T.(Current Protocols inProtein Science.2003,30:6.1.1–6.1.37)综述了在大肠杆菌中产生的重组蛋白的纯化。
精氨酸被用于重折叠和纯化由IB获得的蛋白，并且表现为对在化学和物理性质方面不同的多种蛋白有效。精氨酸在蛋白重折叠、增溶和纯化中的作用被Tsumoto等综述(BiotechnolProg.2004Sep-Oct；20(5):1301-8；Schneider等，(J PhysChem B.2011Jun 9；115(22):7447-58))。
先前描述了精氨酸的抗聚集效应和稳定化效应。例如，Lyutova等，(BiotechnolProg.2007Nov-Dec；23(6):1411-6)研究了，当蛋白聚集通过加热或通过添加二硫苏糖醇(DTT)从折叠状态转变来诱导时，低浓度的精氨酸(1-10mM)对蛋白聚集的效应。
已提出了，低分子量添加剂，诸如L-精氨酸通过抑制导致沉淀的分子间疏水作用来增强复性产量。Ho等，(Protein Sci.2003,12,708-716)证明了，L-精氨酸通过增加蛋白溶解度抑制聚集。
由于以下原因的一个或更多个，产生呈药物悬液形式的蛋白通常是有利的：多肽的溶解度；多肽的稳定性；控制或改变多肽的释放谱。
蛋白微米颗粒或纳米颗粒的悬液可通过许多方法来产生。此类颗粒可最初作为较大颗粒被产生，随后是通过物理或化学方法的尺寸减小程序。一些其他方法包括结晶、冻干、喷雾干燥及超临界流体颗粒形成或去溶剂化。
WO 2009/015736公开了一种产生纯化的重组GDF-5相关蛋白的方法，所述方法包括用包含L-精氨酸的变性增溶缓冲液处理包含体。
WO 2012/054679公开了用于从包含重组蛋白和包含体的混合物中纯化重组蛋白的方法，所述方法包括：a)用包含乙醇胺、精氨酸、EDTA、尿素和DTE的增溶缓冲液使包含重组蛋白和相关包含体的混合物溶解。
US 2003/0199441涉及一种产生复性的前胶原前肽的方法，其中产生于大肠杆菌中的包含体被溶解于0.5M至8M变性缓冲液中，随后这被逐滴添加进有限稀释缓冲液(是在约中性pH附近的并包含在200nM至1,000nM之间的终浓度的L-精氨酸和二硫键还原性偶联氧化还原系统)，并然后该缓冲液混合物针对以下来透析：针对包含在50nM至200nM的终浓度的L-精氨酸和二硫键还原性偶联氧化还原系统的生理缓冲液，以及稍后针对包含二硫键还原性偶联氧化还原系统的生理缓冲液，以及最后针对生理缓冲液。
US 2004/0137588描述了一种从生物样品纯化多肽的方法，其在精氨酸的存在下使多肽经历重折叠条件。
具有用于在改进的多聚体-多表位流感疫苗中使用的具有均匀粒度分布的微粒多肽的稳定的悬液将是有利的。还需要此类组合物的有效产生方法。
发明概述
本发明提供了改进的流感疫苗悬液，所述改进的流感疫苗悬液包含至少一种多聚体流感多肽和含胍基的氨基酸或其衍生物，所述至少一种多聚体流感多肽包含多个拷贝的多种流感病毒肽表位，本文称为多聚体-多表位多肽。还提供了产生此类悬液组合物的方法。
本发明部分地基于以下发现：在从多聚体-多表位多肽溶液去除离液剂和还原剂期间可控产生蛋白聚集体，连同添加氨基酸精氨酸，导致在期望的蛋白浓度和接近生理pH的pH下的多聚体-多表位多肽的稳定且均匀的微粒悬液，克服对高压均化以将大的无定型聚集体转化为可注射剂型的需求。
根据一个方面，本发明提供了呈水性悬液形式的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种多聚体-多表位多肽、含胍基的氨基酸或其衍生物以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
根据一些实施方案中，药物组合物呈用于针对流感免疫接种受试者的疫苗的形式。
根据一些实施方案，含胍基的氨基酸为精氨酸(Arg)。
根据其他实施方案，含胍基的氨基酸为精氨酸衍生物。
根据本发明，可使用L-精氨酸或D-精氨酸或其衍生物的任何盐或游离的酸、或其混合物。
根据一些实施方案，精氨酸为L-精氨酸(L-Arg)。
根据一些实施方案，Arg化合物选自由以下组成的组：Arg-盐酸盐、Arg-硫酸盐、Arg-磷酸盐、Arg-柠檬酸盐、Arg-乙酸盐及Arg游离酸。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，组合物包含L-Arg盐酸盐(L-Arg HCl)。
根据一些实施方案，药物组合物包含在0.1-2.0M的浓度的含胍基的氨基酸或其衍生物。
根据一些实施方案，药物组合物包含在0.15-0.45M的浓度的L-精氨酸。根据其他实施方案，在药物组合物中的精氨酸浓度为0.15-0.30M。
根据一些实施方案，药物组合物包含具有1-50mM的浓度的另外的缓冲剂。
根据一些实施方案，缓冲剂选自由以下组成的组：柠檬酸盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲剂、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸盐)缓冲剂、赖氨酸缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸盐)缓冲剂、咪唑缓冲剂及MES(2(N-吗啉代)乙磺酸盐)缓冲剂。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据具体的实施方案，组合物包含选自由以下组成的组的缓冲剂：柠檬酸盐缓冲剂、赖氨酸缓冲剂及甘氨酸缓冲剂。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据特定的实施方案，组合物包含柠檬酸盐缓冲剂。
根据一些实施方案，药物组合物的pH在pH 5.0至7.6的范围内。根据特定的实施方案，药物组合物的pH在pH 5.5至7.0的范围内。根据其他特定的实施方案，缓冲剂保持pH在5.7-6.5的范围内。
根据某些具体的实施方案，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含1-5mg/ml多聚体-多表位流感多肽、0.1-0.5M L-精氨酸及10-50mM柠檬酸盐缓冲剂，具有在5.0至7.0的范围内的pH。
根据具体的实施方案，药物组合物包含1-4mg/ml多聚体-多表位流感多肽、0.1-0.3M L-精氨酸及10-30mM柠檬酸盐缓冲剂，具有在5.5至6.5的范围内的pH。
根据具体的实施方案，药物组合物包含约2.5mg/ml多聚体-多表位流感多肽、约0.2M精氨酸、约20mM柠檬酸盐缓冲剂，且pH为约6。
根据一些实施方案，药物组合物是包含不溶性聚集体的悬液，所述不溶性聚集体具有在0.5-50μm的范围内的粒度分布，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级的范围内。
根据一些实施方案，悬液中的95％的聚集体具有选自由以下组成的组的粒度分布：0.5-5μm、1-10μm、3-30μm及5-50μm。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，多聚体-多表位流感多肽经重组产生。
根据一些具体的实施方案，多聚体-多表位流感多肽被称为具有如在SEQ ID NO:86中列出的氨基酸序列的M-001。
根据另一个方面，本发明提供了一种产生纯化的重组多聚体-多表位多肽悬液的方法，所述方法包括以下步骤：
i.使包含至少一种多聚体-多表位多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含离液剂、缓冲剂及还原剂，具有在7至11的范围内的pH；以及
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集，从而形成不溶性聚集体悬液；
iii.添加精氨酸以获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定且均匀的悬液，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级的尺寸范围内。
根据具体的实施方案，离液剂包含5-8M尿素和1-4M硫脲。
根据特定的实施方案，在步骤(ii)中逐渐去除离液剂和还原剂通过超滤进行。
根据一些实施方案，在步骤(i)中的CHAPS以0.5％-2％的浓度存在。
根据一些实施方案，方法包括以下步骤：
i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肽的大肠杆菌细胞；
ii.进行裂解和细菌细胞破坏，以提供包含多聚体-多表位流感多肽的包含体；
iii.使包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐)、缓冲剂及还原剂，在7至11的范围内的pH；
iv.通过逐步去除离液剂和还原剂诱导可控聚集，从而形成不溶性聚集体悬液；
v.添加精氨酸以获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定且均匀的悬液，其中95％的聚集体落入一个数量级的尺寸范围内。
根据一些实施方案，逐渐去除离液剂和还原剂使用本领域已知的程序通过超滤进行。
根据一些实施方案，在步骤(iii)和(iv)之间进行至少一个色谱分离步骤。根据一些实施方案，该至少一个色谱分离步骤选自由离子交换色谱和疏水作用色谱组成的组。
根据一些实施方案，步骤(v)在步骤(iv)的聚集体形成之前或期间进行。
根据又其他实施方案，步骤(v)在步骤(iv)的聚集体形成之后进行。
根据一些实施方案，方法包括：
i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肽的大肠杆菌细胞；
ii.进行大肠杆菌细胞的裂解、细菌细胞破坏和离心，以提供包含多聚体-多表位流感多肽的包含体；
iii.进行包含体的至少一次洗涤；
iv.使包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐)、还原剂以及提供pH在7-10的范围内的缓冲剂；
v.使溶液经历至少一个色谱步骤；
vi.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集，从而形成不溶性聚集体；
vii.添加含胍基的化合物，以及
viii.配制(vii)的组合物，以获得最终悬液约0.1-0.4M含胍基的氨基酸和10-40mM柠檬酸盐缓冲剂的，在4至8的范围内的pH的最终悬液。
根据其他实施方案，步骤(vii)的含胍基的化合物的添加在诱导可控聚集期间逐渐地进行。
根据一些实施方案，裂解在7至9的范围内的pH的缓冲液中进行，所述缓冲液包含Tris缓冲剂、EDTA和每1g细胞糊状物0.1-0.5mg溶菌酶。
根据一些实施方案，步骤(vi)的诱导可控聚集通过超滤进行。
根据一些实施方案，超滤包括以下步骤：
i.缓冲液更换I，用10-80mM MES缓冲液，pH 4-6.5；
ii.缓冲液更换II，用20-80mM柠檬酸盐缓冲液、0.1-1M精氨酸，pH 4-6；
iii.缓冲液更换III，用10-50mM柠檬酸盐缓冲液、0.1-0.5M精氨酸，pH 4.0至7.5。
根据其他实施方案，超滤包括以下步骤：
i.缓冲液更换I，用10-80mM MES缓冲液，pH 4.0至6.5；
ii.缓冲液更换II，用20-80mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4至6；
iii.用包含精氨酸的溶液稀释至0.1-1M精氨酸浓度。
根据一些实施方案，在最终组合物中的多肽浓度为1-10mg/ml。
根据一些实施方案，至少一种多聚体-多表位流感多肽序列在SEQ ID NO.86中列出。
根据一些实施方案，至少一种多聚体-多表位流感多肽由在SEQ ID NO.85中列出的多核苷酸序列编码。
根据一些具体的实施方案，方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇、50mM甘氨酸，具有约9.5的pH；
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂(尿素、硫脲和β-巯基乙醇)诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加0.5M精氨酸缓冲液的超滤，使悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使悬液经历缓冲液更换，以获得最终组合物，所述最终组合物包含约2.5mg/ml多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠檬酸盐缓冲剂，具有pH约6。
根据又另一个方面，本发明提供了一种产生重组多聚体-多表位多肽的基本上稳定的水性悬液的方法，所述方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇、5-50mM甘氨酸，具有在7至10的范围内的pH；
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加精氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的超滤，使悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使悬液经历缓冲液更换，以获得最终稳定且均匀的悬液，所述最终稳定且均匀的悬液包含约1-5mg/ml多肽、约0.1-0.5M精氨酸和约10-50mM柠檬酸盐缓冲剂，具有在4至7的范围内的pH。
根据一些实施方案，方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇、50mM甘氨酸，具有约9.5的pH；
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加0.1-1M精氨酸缓冲液的超滤，使悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使悬液经历缓冲液更换，以获得最终悬液，所述最终悬液包含约1-5mg/ml多肽、约0.1-0.5M精氨酸和约10-50mM柠檬酸盐缓冲剂，并具有在4至7的范围内的pH。
根据其他实施方案，在步骤(iv)获得最终悬液，所述最终悬液包含约2.5mg/ml多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠檬酸盐缓冲剂，并具有约6的pH。
根据其他实施方案，方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇、50mM HEPES、5mM甘氨酸，并具有约8.0的pH；
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加20-80mM柠檬酸盐缓冲液的超滤，使悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使悬液经历用包含精氨酸的溶液的稀释，以获得最终均匀的微粒悬液，所述最终均匀的微粒悬液包含约1-5mg/ml多肽、约0.1-0.5M精氨酸和约10-50mM柠檬酸盐缓冲剂，并具有在4至7的范围内的pH。
根据其他实施方案，在步骤(iv)中获得最终稳定且均匀的微粒悬液，所述最终稳定且均匀的微粒悬液包含约2.5mg/ml多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠檬酸盐缓冲剂，并具有约6的pH。
根据一些实施方案，最终微粒悬液包含在0.5-50μm的范围内的聚集体粒度分布，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级的范围内。
根据一些实施方案，在最终微粒悬液中的95％的聚集体具有选自由以下组成的组的粒度分布：0.5-5μm、1-10μm、3-30μm及5-50μm。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
本发明还提供了根据本文详述的任一种方法产生的药物组合物。
根据本发明的多聚体多肽包含多种流感病毒肽表位，每个表位在单个多肽中出现至少两次。在本发明的上下文中，“多聚体”多肽是包含多肽的氨基酸段的不一定相邻的多个重复(至少两个，通常至少三个或更多个)的多肽。因此，术语“多聚体多表位”指包含多种表位的多个重复的多肽。多聚体多表位多肽可经重组产生，作为分离的多肽或作为融合蛋白。多肽聚集体可独立使用或与另外的佐剂混合或配制。
包含在本发明的药物组合物和疫苗组合物中的多聚体多表位多肽包含流感病毒B细胞表位、T辅助表位和细胞毒性淋巴细胞(CTL)表位的组合。表位优选地选自血凝素蛋白(HA)肽、基质蛋白(M1和/或M2)肽及核蛋白(NP)肽的保守的(非高变)区域。表位优选地具有可证实的针对几种人流感亚型的交叉反应活性，并因它们的诱导细胞和体液免疫应答的改进的能力被选择。
根据其他实施方案，在被包含在根据本发明的组合物中的多聚体多肽内的流感肽表位选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:82组成的组。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些具体的实施方案，流感肽表位选自表位E1-E9(SEQ IDNO.82、48、25、52、51、59、89、69和70)。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些具体的实施方案，多聚体多表位多肽包含3-5个重复的以嵌段共聚物结构或以交替顺序聚合结构排列的4-9种表位。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据又其他实施方案，被包含在根据本发明的药物组合物中的多聚体多肽序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:88。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据本发明的药物组合物可经由选自由以下组成的组的途径施用：肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、皮内以及经皮递送。
根据特定的实施方案，药物组合物经鼻内、经肌内或经皮内施用。根据一些实施方案，被包含在药物组合物中的多聚体多肽不被缀合至载体或融合蛋白并且不含载体或融合蛋白。在其他实施方案中，被包含在本发明的药物组合物中的多肽还可包含载体序列，即肽表位被插入在载体多肽的序列内或被偶联至载体序列。
根据一些实施方案，根据本发明的药物组合物不包含佐剂。根据其他实施方案，疫苗还包含药学上可接受的佐剂。
药学上可接受的佐剂包括，但不限于，油包水乳液、脂质乳液或亚微米水包油乳液及脂质体。根据具体的实施方案，佐剂选自由以下组成的组：MontanideTM、明矾、胞壁酰二肽、
几丁质微粒、壳聚糖、霍乱毒素B亚基、
或细菌脂质、脂蛋白和/或膜蛋白。
在一些实施方案中，疫苗被配制用于肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、皮内和经皮递送。在一些实施方案中，疫苗经鼻内施用。在其他实施方案中，疫苗经肌内施用。在又其他实施方案中，疫苗经皮内施用。
根据另外的方面，本发明提供了一种在受试者中诱导免疫应答并赋予针对流感的保护的方法，所述方法包括将以上描述的呈疫苗形式的药物组合物施用至受试者。
根据本发明的疫苗组合物用于针对流感免疫接种的用途也在本发明的范围内。根据本发明的疫苗组合物可被施用，作为单独的疫苗，或作为包括与季节性或大流行流感疫苗一起共施用的疫苗接种方案的一部分。根据本发明的共施用涵盖，多聚体多肽和季节性或大流行性疫苗两者被包含在一种组合的组合物中，或它们在两个单独的疫苗接种中以至少24小时间隔被施用至患者。
根据一些实施方案，包含至少一种多聚体-多表位流感多肽的疫苗组合物与季节性或大流行性流感疫苗一起共施用。
被包含在本发明的组合物中的包含多种流感病毒肽表位的多聚体-多表位多肽可作为重组蛋白、融合蛋白及通过化学合成来产生。
本发明还提供了包含至少一种多聚体流感多肽和至少一种常规季节性或大流行性流感组合物的组合的药物组合物。常规季节性疫苗(TIV)通常包含三种灭活的或活的减毒流感病毒毒株(每年由WHO选择的)，以提供针对预期在即将到来季节感染的毒株的保护。大流行性疫苗通常包含一种对引起大流行病的相关毒株特异的流感病毒毒株。
本发明适用性的另外的实施方案和全部范围将从下文给出的详细描述变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实施例，尽管指示本发明的特定的实施方案，但仅通过说明性方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改从该详细描述对本领域技术人员将是明显的。
发明详述
本文提供了多聚体多表位多肽流感疫苗的改进的药物组合物，以及用于它们产生的方法。这些药物组合物具有改进的稳定性特性。尽管先前的包含多聚体多表位流感多肽的组合物是基于磷酸盐缓冲盐水，难以生产，且具有再聚集的趋势，本发明提供了包含氨基酸精氨酸或其衍生物和柠檬酸盐缓冲剂的稳定的悬液组合物以及用于它们产生的改进的方法。
在先前已知的制备方法中，通过pH从碱性转向至中性pH来诱导多肽聚集，导致创造大的无定型聚集体，这要求高压均化以将其转化为可注射形式。本发明克服了这些限制，通过在从多肽溶液去除离液剂和还原剂期间可控产生蛋白聚集体，连同添加氨基酸精氨酸，导致多聚体-多表位流感多肽的稳定且均匀的微粒悬液。
多聚体多表位多肽
在根据本发明的疫苗和方法中使用的多聚体多肽包含至少两个重复的每个表位。根据一些特定的实施方案，根据本发明的多聚体多肽包含至少三个重复的每个表位。还提供了包含季节性或大流行性疫苗和至少一种多聚体多表位多肽的疫苗组合物，所述至少一种多聚体多表位多肽包含多种流感病毒肽表位。
提供了用于包含选自表1的流感表位的多聚体疫苗的多种示例性实施方案，其中对于每个表位的重复数目相同或不同，且其中多肽可以交替顺序聚合结构或嵌段共聚物结构排列。术语“交替顺序聚合”结构意指，被包含在多肽中的单拷贝的所有表位顺序排列，并且该排列被顺序重复等于重复数的次数。例如，如果多聚体多表位多肽包含四个重复的呈交替顺序结构的三种表位X1、X2和X3，多肽具有以下聚合结构：X1X2X3-X1X2X3-X1X2X3-X1X2X3，还写成[X1X2X3]4。术语“嵌段共聚物”结构意指，被包含在多肽中的所有拷贝的单个表位被相邻排列。例如，包含四个重复的呈嵌段共聚物结构的三种表位X1、X2和X3的类似的多聚体多表位多肽具有以下聚合结构：X1X1X1X1-X2X2X2X2-X3X3X3X3，还写成[A]4-[B]4-[C]4。
在根据本发明的药物组合物中使用的合成的或重组的流感多表位多肽选自由以下组成的组：
i.B(X1ZX2Z…Xm)nB；以及
ii.B(X1)nZ(X2)nZ…(Xm)nB；
其中B指示0-4个氨基酸残基的序列；n在每次出现时，独立地为2-50的整数；m为3-50的整数；X1、X2…Xm的每个为由4-24个氨基酸残基组成的流感肽表位；Z在每次出现时为键或1-4个氨基酸残基的间隔区；且其中在多肽中的氨基酸残基的最大数目为约1000。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，n在每次出现时独立地为2-50的整数；m为3-15的整数；X1-Xm的每个是选自由B细胞型表位、T辅助(Th)型表位和细胞毒性淋巴细胞(CTL)型表位组成的组的由4-24个氨基酸残基组成的流感肽表位。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据又其他实施方案，n在每次出现时独立地为2-15的整数，且m为3-12的整数。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些具体的实施方案，m为4-9的整数，且n为3-5的整数。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些具体的实施方案，m为9且n为3。
根据其他实施方案，被包含在本发明的药物组合物中的多聚体多肽的流感肽表位选自由以下组成的组：血凝素(HA)肽、M1肽、M2肽以及核蛋白(NP)肽。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据其他实施方案，在被包含在根据本发明的组合物中的多聚体多肽内的流感肽表位选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:82(在表1中描述的)组成的组。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
表1：
根据一些具体的实施方案，流感肽表位选自在表2中详述的表位E1-E9(SEQ IDNO82、48、25、52、51、59、89、69和70)。
表2：流感肽表位E1至E9
应该注意，本文列出的肽表位仅作为出于示例性的目的来提供。流感病毒蛋白在分离株之间变化，从而提供对于每种流感蛋白的多种变体序列。因此，本发明包括具有一个或更多个氨基酸取代、添加或缺失的肽表位。
根据更具体的实施方案，包括在被包含在根据本发明的疫苗药物组合物中的多聚体多肽中的流感肽表位由以下组成：HA 354-372(E1,SEQ ID NO:82)、HA 91-108(E2,SEQID NO:48)、M1 2-12(E3,SEQ ID NO:25)、HA 150-159(E4,SEQ ID NO:52)、HA 143-149(E5,SEQ ID NO:51)、NP 206-229(E6,SEQ ID NO:64)、HA 307-319(E7,SEQ ID NO:59或89)、NP335-350(E8,SEQ ID NO:69)及NP 380-393(E9,SEQ ID NO:70)。
根据又其他实施方案，被包含在根据本发明的药物组合物中的多聚体多肽序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:88。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据又其他实施方案，被包含在根据本发明的药物组合物中的多聚体多肽序列被选自由以下组成的组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:87。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
在一些实施方案中，药物组合物包含三至五个重复的以嵌段共聚物结构或以交替顺序聚合结构排列的五至九种表位。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，本发明的药物组合物包含三个重复的以以下嵌段共聚物结构[E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3-E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9]排列的九种不同的流感病毒肽表位，其中E1为HA 354-372(SEQ ID NO:82)，E2为HA 91-108(SEQ ID NO:48)，E3为M1 2-12(SEQ ID NO:25)，E4为HA 150-159(SEQ ID NO:52)，E5为HA 143-149(SEQID NO:51)，E6为NP 206-229(SEQ ID NO:64)，E7为HA 307-319(SEQ ID NO:59或89)，E8为NP 335-350(SEQ ID NO:69)，且E9为NP 380-393(SEQ ID NO:70)。
根据其他实施方案，多聚体多肽包含以以下交替顺序聚合结构[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]n排列的九种不同的流感病毒肽表位，其中n为3至5；E1为HA 354-372(SEQ ID NO:82)，E2为HA 91-108(SEQ ID NO:48)，E3为M1 2-12(SEQ ID NO:25)，E4为HA 150-159(SEQ ID NO:52)，E5为HA 143-149(SEQ ID NO:51)，E6为NP 206-229(SEQ IDNO:64)，E7为HA307-319(SEQ ID NO:59或89)，E8为NP 335-350(SEQ ID NO:69)，且E9为NP380-393(SEQ ID NO:70)。
根据又其他实施方案，多聚体多肽包含六个重复的以以下交替顺序聚合结构[E1E2E3E4E5]6排列的五种不同的B细胞型流感病毒肽表位，其中E1为HA 354-372(SEQ IDNO:82)，E2为HA 91-108(SEQ ID NO:48)，E3为M1 2-12(SEQ ID NO:25)，E4为HA 150-159(SEQ ID NO:52)，E5为HA 143-149(SEQ ID NO:51)。
根据其他实施方案，多聚体多肽包含六个重复的以以下交替顺序聚合结构[E7E8E9E6]6排列的四种不同的T细胞型流感病毒肽表位，其中E6为NP 206-229(SEQ IDNO:64)，E7为HA 307-319(SEQ ID NO:59或89)，E8为NP 335-350(SEQ ID NO:69)，且E9为NP380-393(SEQ ID NO:70)。
根据另外的实施方案，多聚体多肽包含六个重复的以以下嵌段共聚物结构[E2E2E2E2E2E2-E1E1E1E1E1E1-E3E3E3E3E3E3-E4E4E4E4E4E4-E5E5E5E5E5E5-E6E6EE6E6E6-E7E7E7E7E7E7-E8E8E8E8E8E8-E9E9E9E9E9E9]排列的九种不同的流感病毒肽表位，其中E1为HA 354-372(SEQ ID NO:82)，E2为HA 91-108(SEQ ID NO:48)，E3为M1 2-12(SEQ ID NO:25)，E4为HA 150-159(SEQ ID NO:52)，E5为HA 143-149(SEQ ID NO:51)，E6为NP 206-229(SEQ ID NO:64)，E7为HA 307-319(SEQ ID NO:59或89)，E8为NP 335-350(SEQID NO:69)，且E9为NP 380-393(SEQ ID NO:70)。
在多种实施方案中，多聚体多肽包含至少两个重复的每个表位，通常至少三个重复的每个表位，可选地至少四个重复，可选地至少五个重复，可选地至少六个重复的每个表位，最大至少50个重复的每个表位。为了改进表位对免疫系统的暴露，表位可被间隔区分离，根据某些实施方案，间隔区由单个氨基酸组成，且根据其他实施方案，间隔区包含2-6个氨基酸。根据一些具体的实施方案，间隔区由1-4个中性氨基酸残基组成。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案，在被包含在药物组合物中的多聚体多肽内的肽表位被选自由以下组成的组的间隔区连接：键、氨基酸以及包含2-6个氨基酸的肽。
根据一些实施方案，间隔区的至少一个氨基酸在多肽的区段上诱导特定构象(例如脯氨酸残基)。
根据又其他实施方案，间隔区包含可切割序列。根据一个实施方案，可切割间隔区被胞内酶切割。根据一个更具体的实施方案，可切割间隔区包含蛋白酶特异性可切割序列。
用于产生悬液的方法
‘不溶性’包含体的溶解
可能由于疏水作用，在大肠杆菌的两种不同的菌株中形成的重组多聚体-多表位多肽的包含体展现出有限的溶解度。补充有50mMβME的8M尿素缓冲液的标准程序在中性pH下不溶解包含体。非离子或两性离子去垢剂的添加未改进缓冲性能。阴离子去垢剂添加(十二烷基硫酸钠，SDS)能够完成包含体溶解，但由于SDS干扰随后的纯化步骤，该方法是不适合的。最初，使用碱性(12)pH，以使包含体溶解于8M尿素缓冲液中。稍后，出人意料地发现，经常用于膜蛋白溶解的缓冲液可被修改并用于在较低pH(8-9.5)下的包含体溶解。包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐)、50mMβME、50mM甘氨酸且pH为约9.5的溶液被用来实现完全溶解包含体。
超滤和聚集体形成
根据本发明，在多聚体-多表位多肽的产生方法中使用超滤，用于逐渐去除离液剂(例如尿素和硫脲)和还原剂(例如βME)，以及逐渐添加精氨酸，以用于可控创造在缓冲液更换之后适合于在最终组合物中使用的在1-50mg/ml的蛋白浓度的蛋白聚集体。
精氨酸的稳定作用
根据本发明，精氨酸不是如本领域中描述的被用来防止聚集体形成，而是用于蛋白微粒的尺寸减小和增加的均匀性。经由超滤缓冲液更换过程，将高浓度(约0.2-1M)的精氨酸缓冲液逐渐添加至溶解的包含体。通过进一步的缓冲液更换实现0.1-0.5M的最终精氨酸浓度。
悬液组合物
如由Akers等(J.Parenteral Sci.Technol.,41,88–96,1987)公开的，制备药物悬液的基本原因包括以下：
1.肽或蛋白的溶解度对溶液配制起阻止作用。
2.肽或蛋白的稳定性在悬液制剂中被改进。
3.期望控制或延迟肽或蛋白的释放谱。
存在至少四种用于产生可被考虑用于开发肽或蛋白悬液制剂的颗粒的方法：
1.悬液仅包括在媒介物中的结晶材料。
2.悬液仅包括在媒介物中的无定型材料。
3.悬液包含在媒介物中的结晶和无定型材料的混合物。
4.悬液包含在悬液相和溶液相两者中的活性成分。
存在至少四种产生无菌粉末的方法：结晶、冻干、喷雾干燥及超临界流体颗粒形成。考虑到肽和蛋白在高应力条件下变性的倾向，结晶和冻干更通常适用于该类化合物。还已证明了这两种方法保持干燥的材料的无菌性的能力。在液体-空气界面或由蒸发溶剂所需的高温，喷雾干燥过程可能导致变性；然而，该技术可适合于缺乏更高级结构的小肽。
从颗粒形成单独地制备包含任何必需赋形剂的水性或非水性的媒介物。非水性媒介物的实例包括任何高度纯化的天然或合成的油，诸如芝麻油、花生油或其他植物油。取决于成分的溶解度和媒介物的总粘度，灭菌可以通过过滤或高压灭菌来实现。由于颗粒生长独立地完成，无菌组合方法提供在选择媒介物(水性或非水性)中的更多灵活性。在每个部分的处理完成之后，干燥的颗粒和媒介物被无菌组合。要求一些形式的搅拌，以实现颗粒的均匀分散。在肽或蛋白的情况下，适当的控制应在适当的位置，以确保分散过程不导致变性或其他物理变化。
本发明提供了一种产生纯化的重组多聚体-多表位多肽悬液的方法，所述方法包括以下步骤：
i.使包含至少一种多聚体-多表位多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含离液剂、缓冲剂及还原剂，具有在7-11的范围内的pH；以及
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集，从而形成不溶性聚集体悬液；
iii.添加精氨酸以获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定且均匀的悬液，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级的尺寸范围内。
根据一些实施方案，在步骤(i)中的pH在7-10的范围内。
根据一些实施方案，离液剂是尿素、硫脲或其组合。
根据具体的实施方案，离液剂包含5-8M尿素和1-4M硫脲。
根据特定的实施方案，在步骤(ii)中逐渐去除离液剂和还原剂通过超滤进行。
根据一些实施方案，在步骤(i)中的CHAPS以0.5％-2％的浓度存在。
根据一些实施方案，方法包括以下步骤：
i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肽的大肠杆菌细胞；
ii.进行裂解和细菌细胞破坏，以提供包含多聚体-多表位流感多肽的包含体；
iii.使包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐)、缓冲剂及还原剂，在7-11的范围内的pH；
iv.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集，从而形成不溶性聚集体悬液；
v.添加精氨酸以获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定且均匀的悬液，其中95％的聚集体落入一个数量级的尺寸范围内。
根据一些实施方案，逐渐去除离液剂和还原剂通过使用本领域已知的程序超滤进行。
根据一些实施方案，至少一个色谱分离步骤在步骤(iii)和(iv)之间进行。根据一些实施方案，至少一个色谱分离步骤选自由离子交换色谱和疏水作用色谱组成的组。
根据一些实施方案，步骤(v)在步骤(iv)的聚集体形成之前进行。
根据其他实施方案，步骤(v)在步骤(iv)的聚集体形成期间进行。
根据又其他实施方案，步骤(v)在步骤(iv)的聚集体形成之后进行。
根据一些实施方案，方法包括：
i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肽的大肠杆菌细胞；
ii.进行大肠杆菌细胞的裂解、细菌细胞破坏和离心，以提供包含多聚体-多表位流感多肽的包含体；
iii.进行包含体的至少一次洗涤；
iv.使包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐)、还原剂以及提供pH在7-10的范围内的缓冲剂；
v.使溶液经历至少一个色谱步骤；
vi.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导可控聚集，从而形成不溶性聚集体；
vii.添加含胍基的化合物，以及
viii.配制(vii)的组合物，以获得约0.1-0.4M含胍基的氨基酸和10-40mM柠檬酸盐缓冲剂的，在4-8的范围内的pH的最终悬液。
根据其他实施方案，步骤(vii)的含胍基的化合物的添加在诱导可控聚集期间逐渐地进行。
根据一些实施方案，步骤(ii)的细菌细胞破坏通过高压均化进行。
根据其他实施方案，细菌细胞破坏通过超声处理进行。
根据一些实施方案，裂解在7-9的范围内的pH的缓冲液中进行，所述缓冲液包含在Tris缓冲剂、EDTA和每1g细胞糊状物0.1-0.5mg溶菌酶。
根据一些实施方案，步骤(iv)的尿素在6-7M的浓度。
根据一些实施方案，步骤(iv)的缓冲剂为在20-100mM浓度的HEPES。
根据其他实施方案，步骤(iv)的缓冲剂为在5-100mM浓度的甘氨酸。
根据一些实施方案，步骤(iv)的还原剂为在20-80mM浓度的β-巯基乙醇。
根据一些实施方案，步骤(vi)的诱导可控聚集通过超滤进行。
本领域中已知的任何超滤方法是适用于根据本发明使用的，包括但不限于，中空纤维、切向流过滤(TFF)盒以及搅拌槽(stirred cell)。
根据一些实施方案，超滤包括以下步骤：
i.缓冲液更换I，用10-80mM MES缓冲液，pH 4-6.5；
ii.缓冲液更换II，用20-80mM柠檬酸盐缓冲液、0.1-1M精氨酸，pH 4-6；
iii.缓冲液更换III，用10-50mM柠檬酸盐缓冲液、0.1-0.5M精氨酸，pH 4-7.5。
根据其他实施方案，超滤包括以下步骤：
i.缓冲液更换I，用10-80mM MES缓冲液，pH 4-6.5；
ii.缓冲液更换II，用20-80mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4-6；
iii.用包含精氨酸的溶液稀释至0.1-1M精氨酸浓度。
根据一些实施方案，在最终组合物中的多肽浓度为1-10mg/ml。
根据又其他实施方案，在最终组合物中的多肽浓度为1-4mg/ml。
根据一些实施方案，至少一种多聚体-多表位流感多肽序列在SEQ ID NO.86中列出。
根据一些实施方案，至少一种多聚体-多表位流感多肽由在SEQ ID NO.85中列出的多核苷酸序列编码。
根据一些具体的实施方案，方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇、50mM甘氨酸，具有约9.5的pH；
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂(尿素、硫脲和β-巯基乙醇)诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加0.5M精氨酸缓冲液的超滤，使悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使悬液经历缓冲液更换，以获得最终组合物，所述最终组合物包含约2.5mg/ml多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠檬酸盐缓冲剂，具有pH约6。
根据又另一个方面，本发明提供了一种产生重组多聚体-多表位多肽的基本上稳定的水性悬液的方法，所述方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇、5-50mM甘氨酸，具有在7-10的范围内的pH；
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加精氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的超滤，使悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使悬液经历缓冲液更换，以获得最终稳定且均匀的悬液，所述最终稳定且均匀的悬液包含约1-5mg/ml多肽、约0.1-0.5M精氨酸和约10-50mM柠檬酸盐缓冲剂，具有在4-7的范围内的pH。
根据一些实施方案，在步骤(i)中，pH在8-10的范围内。
根据一些实施方案，方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇、50mM甘氨酸，具有约9.5的pH；
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加0.1-1M精氨酸缓冲液的超滤，使悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使悬液经历缓冲液更换，以获得最终悬液，所述最终悬液包含约1-5mg/ml多肽、约0.1-0.5M精氨酸和约10-50mM柠檬酸盐缓冲剂，并具有在4-7的范围内的pH。
根据一些具体的实施方案，在步骤(iii)中，添加0.5M精氨酸缓冲液。
根据其他实施方案，在步骤(iv)中获得最终悬液，所述最终悬液包含约2.5mg/ml多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠檬酸盐缓冲剂，并具有约6的pH。
根据其他实施方案，方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇、50mM HEPES、5mM甘氨酸，并具有约8.0的pH；
ii.通过逐渐去除离液剂和还原剂诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加20-80mM柠檬酸盐缓冲液的超滤，使悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使悬液经历用包含精氨酸的溶液的稀释，以获得最终均匀的微粒悬液，所述最终均匀的微粒悬液包含约1-5mg/ml多肽、约0.1-0.5M精氨酸和约10-50mM柠檬酸盐缓冲剂，并具有在4-7的范围内的pH。
根据一些具体的实施方案，在步骤(iii)中，添加50mM柠檬酸盐缓冲液。
根据其他实施方案，在步骤(iv)中获得最终稳定且均匀的微粒悬液，所述最终稳定且均匀的微粒悬液包含约2.5mg/ml多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠檬酸盐缓冲剂，并具有约6的pH。
根据一些实施方案，最终微粒悬液包含在0.5-50μm的范围内的聚集体粒度分布，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级的范围内。
根据一些实施方案，在最终微粒悬液中的95％的聚集体具有0.5-5μm的粒度分布。
根据一些实施方案，在最终微粒悬液中的95％的聚集体具有1-10μm的粒度分布。
根据一些实施方案，在最终微粒悬液中的95％的聚集体具有3-30μm的粒度分布。
根据一些实施方案，在最终微粒悬液中的95％的聚集体具有5-50μm的粒度分布。
定义
为方便起见，本文描述了在说明书、实施例和权利要求书中采用的某些术语。
根据本发明的多聚体-多表位多肽表示包含多个拷贝的多种流感病毒肽表位的多肽。
术语“免疫原性”或“免疫原性的”指物质刺激或引发免疫应答的能力。例如，通过确定对物质特异的抗体的存在，测量免疫原性。抗体的存在通过本领域已知的方法，例如，使用ELISA或HAI测定来检测。
取决于流感表位引发免疫应答的类型，流感表位可被分类为B细胞型、T细胞型或B细胞型和T细胞型两者。B细胞或T细胞肽表位的定义是不明确的；例如，肽表位可诱导抗体产生，但同时表位可具有能够结合人HLA分子的序列，使得它可接近CTL或Th细胞，因此，双B细胞和T细胞分类用于该特定表位。“CTL”、“杀伤T细胞”或“细胞毒性T细胞”是识别并裂解携带特定外来抗原的靶细胞的、起防御病毒感染和癌细胞作用的一组分化型T细胞。“T辅助细胞”或“Th”是当被特异性抗原刺激时，释放促进B细胞和杀伤T细胞的活化和功能的细胞因子的任何T细胞。
如本文使用的，“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白序列及其片段，以及天然存在的或合成的分子。
在说明书和权利要求书中，术语“间隔区”指示可存在于多肽序列中、在一个末端处或在两个表位之间的任何化学化合物。根据一些实施方案，间隔区由1-4个氨基酸残基组成。间隔区可包含可被酶促方式切割的或可自发地分解的序列。间隔区可对多肽强制或诱导有益的构象。间隔区可任选地包含蛋白酶特异性可切割序列。
术语“不溶性”在本文被定义为当在水性悬液中时对肉眼可视化的特性。“不溶性”颗粒可在离心水性悬液之后被沉淀或回收。
术语“悬液”在本文被定义为包含如以上定义的“不溶性”颗粒组分的水性介质。
术语“微粒”在本文被定义为0.1-100μm尺寸的“不溶性”蛋白聚集体。根据一些实施方案，本发明的微粒在0.5-50μm的尺寸范围内。
术语“溶液”在本文被定义为实质上不含作为以上定义的术语的“不溶性”颗粒的水性介质。
“均匀性”在本文被定义为如通过例如由LUMiSizer悬液分析仪(LUMGmbH)测试的参数测量的聚集体的粒度分布。均匀悬液在本文被定义为具有其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级范围内的聚集体粒度分布。
均匀微粒悬液是包含“不溶性”蛋白聚集体(以上定义为微粒)、具有均匀聚集体粒度分布的水性介质，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级范围内(例如，0.1-1μm、1-10μm、3-30μm、9-90μm等等)。
被包含在根据本发明的均匀微粒悬液中的颗粒的粒度分布是窄的。如本文使用的术语“窄的粒度分布”指其中多于90％的颗粒具有在平均值(或平均数)粒度0.2-2倍的范围内的粒度的分布。优选地，多于95％的颗粒具有在该范围内的粒度。甚至更优选地，多于99％的颗粒具有在该范围内的粒度。如此，对于5μm的粒度，窄的粒度分布指其中多于90％、95％或99％的颗粒具有在1-10μm范围内的粒度的分布。
微粒在形状上是基本上球形或球状，但包括不规则形状的非球形颗粒也是可能的。对于球形颗粒，尺寸代表直径，而对于非球形颗粒，尺寸代表平均颗粒的最长维度。
根据本发明的原理，如本文使用的平均粒度指可使用本领域技术人员已知的技术确定的平均颗粒直径，本领域技术人员已知的技术包括，但不限于沉降流分级(sedimentation flow fractionation)、光子关联光谱学、光散射、电子散射、磁盘离心(disk centrifugation)等。根据一些实施方案，聚集体粒度分布使用LUMiSizer悬液分析仪(LUM GmbH)或任何相应设备来确定。
“稳定性”在本文被定义为聚集体尺寸在其中保持均匀分布的条件。
离液剂为变性剂，即，可破坏水分子之间的氢键网络并通过削弱疏水效应降低大分子(在本发明中例如蛋白)的天然状态的稳定性的化合物。
根据本发明的含胍基的氨基酸包括但不限于精氨酸(Arg)氨基酸或其衍生物。根据本发明，可使用L-Arg、D-Arg或其混合物。
根据本发明，可使用L-Arg或D-Arg或其衍生物的任何盐或游离的酸、或其混合物。这包括但不限于选自由以下组成的组的化合物：Arg-盐酸盐、Arg-硫酸盐、Arg-磷酸盐、Arg-柠檬酸盐、Arg-乙酸盐及Arg游离酸。
根据本发明的Arg衍生物，包括但不限于，甲基化的精氨酸、取代的L-精氨酸、硝基-精氨酸、N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、N-氨基-L-精氨酸、N-甲基-L-精氨酸、单甲基-L-精氨酸(L-NMA)、硝基-L-精氨酸(L-NNA)、氨基胍、7-硝基吲唑、S-乙基异硫脲、S-甲基异硫脲、S-甲硫基瓜氨酸、S-乙硫基瓜氨酸、N-乙基亚氨基-L-鸟氨酸、鸟氨酸及鸟氨酸衍生物；L-刀豆氨酸；瓜氨酸；L-2-氨基-3-胍基丙酸、4-胍基丁酸；α-N-取代的L-精氨酸；2-L-精氨酰-1,3-苯并噻唑-6-羧酸；Nω-(ADP-D-核糖基)-L-精氨酸；Nω-磷酸-L-精氨酸；N2-(2-羧基乙基)-L-精氨酸；N2-琥珀酰-L-精氨酸；D-胭脂氨酸；D-章鱼碱；L-精氨酸酰胺；L-精氨酸异羟肟酸；arg嘧啶(argpyrimidine)；羟基-L-精氨酸；甲基-L-精氨酸；N-酰基-L-精氨酸；N-苯甲酰基-D-精氨酸；Nγ-硝基-L-精氨酸；肽基-L-精氨酸。
根据一些实施方案，低成本的精氨酸或精氨酸衍生物被用于本发明的组合物，以获得相对便宜的最终产品。
针对流感的任何疫苗可连同根据本发明的方法和组合物中的多聚体多肽一起使用。术语“针对流感的疫苗”包括，但不限于，部分或高纯化的或重组的流感蛋白、灭活的病毒或“裂解产物”灭活的流感疫苗产品、活的减毒病毒、或者展现流感表位的颗粒或载体，包括但不限于病毒样颗粒(VLP)和脂质体。将连同多聚体多肽一起使用的流感疫苗可以是季节性、大流行性或通用疫苗。
常规季节性疫苗通常包含三种灭活的或活的减毒流感病毒毒株，并因此还被称为TIV(三价流感疫苗)。三种毒株每年被WHO选择，以提供针对预期在即将到来季节感染的毒株的保护。
可根据本发明使用的特定季节性疫苗的非限制性列表包括：VAXIGRIPTM、AGGRIPALTM、FLUVIRINTM、FLUADTM、MUTAGRIPTM、FLUZONETM、FLUZONE HDTM、INFLUVACTM、FLUARIXTM、FLULAVALTM、FLUMISTTM、AFLURIATM、AGRIFLUTM。
大流行性疫苗通常包含一种对引起大流行病的相关毒株特异的流感病毒毒株。例如，用于在2009/2010季节期间的猪流感大流行的A/H1N1毒株然后被包含在以后的季节性TIV制剂中，诸如2010/2011季节。
根据其他实施方案，大流行性疫苗是针对人、猪或禽流感毒株。可根据本发明使用的特定大流行性疫苗的非限制性列表包括：PANENZATM、PANDEMRIXTM、HUMENZATM、FOCETRIATM、CELVAPAN、CELTURATM及FLUMISTTM。
重组多肽
本发明的多聚体-多表位多肽可通过在表达载体中自身或作为嵌合蛋白表达来制备。产生包含一种或更多种流感肽表位的重组蛋白或嵌合蛋白(或在本文可互换使用的多肽)的方法是本领域技术人员已知的，并详细描述于，例如WO 2009/016639中。编码一种或更多种流感肽表位的核酸序列可被插入进表达载体中用于制备多核苷酸构建体，以用于在宿主细胞中繁殖和表达。编码包含几种表位的多个重复的多肽，诸如多聚体多表位多肽的核酸构建体可通过在其3'末端和5'末端处携带适当的限制性酶切位点的较小多核苷酸构建体的连接来制备。
多聚体多肽的产生
在被宿主细胞表达之后，多聚体多肽可通过许多蛋白纯化方法与不需要的组分分离。一种此类方法是通过产生包含体，包含体是当重组多肽被表达于原核生物中时可形成的蛋白的无活性聚集体。尽管cDNA可适当地编码可翻译的mRNA，所得的蛋白可能不正确折叠，或添加的肽表位的疏水性可导致重组多肽变成不溶性的。通过本领域熟知的方法容易地纯化包含体。用于包含体的纯化的多种程序是本领域已知的。在一些实施方案中，包含体通过离心从细菌裂解物回收并用去垢剂和螯合剂洗涤，以从聚集的重组蛋白去除尽可能多的细菌蛋白。为获得可溶性蛋白，通常将洗涤过的包含体溶解于变性剂中，并且然后释放的蛋白由通过稀释或透析逐渐去除变性试剂来重折叠(例如，Molecular cloning:alaboratory manual，第3版，Sambrook,J.和Russell,D.W.,2001；CSHL Press)。
另一种任选的方法使用在重组蛋白上的聚组氨酸标签。聚组氨酸标签由添加至重组蛋白的通常N-末端或C-末端处的至少六个组氨酸(His)残基组成。聚组氨酸标签通常用于亲和纯化加聚组氨酸标签的被表达于在大肠杆菌或其他原核表达系统中的重组蛋白。细菌细胞通过离心收获，并且所得的细胞沉淀可通过物理方法或用去垢剂或酶诸如溶菌酶裂解。在该阶段，原始裂解物包含在来源于细菌的几种其他蛋白中的重组蛋白，并且与亲和介质诸如NTA-琼脂糖、HisPur树脂或Talon树脂一起孵育。这些亲和介质包含以微摩尔亲和力结合聚组氨酸标签的结合的金属离子镍或钴。然后，树脂用磷酸盐缓冲液洗涤以去除与钴或镍离子不特异性地相互作用的蛋白。洗涤效率可通过添加20mM咪唑来改进，且然后，蛋白通常用150-300mM咪唑洗脱。聚组氨酸标签可随后使用限制性内切酶、内切蛋白酶或外切蛋白酶去除。用于纯化加组氨酸标签的蛋白的试剂盒可例如从Qiagen购买。
疫苗配制及施用
本发明的疫苗包含多表位多肽，和任选地佐剂。疫苗可被配制，用于以许多不同模式中的一种来施用。在一个实施方案中，疫苗被配制用于肠胃外施用。在一些实施方案中，疫苗被配制用于大规模接种，例如用于用喷射注射器或单次使用盒。根据本发明的一个实施方案，疫苗施用为肌肉内施用。根据另一个实施方案，施用为皮内施用。专门设计成存储疫苗的、经皮注射的针是本领域已知的，如例如在6,843,781和7,250,036以及其他中公开的。根据其他实施方案，施用用无针注射器进行。
根据又另一个实施方案，疫苗被配制用于粘膜递送，特别地经鼻递送(Arnon等，Biologicals.2001；29(3-4):237-42；Ben-Yedidia等，IntImmunol.1999；11(7):1043-51)。疫苗制剂可以以任何方便的方式被应用至鼻的淋巴组织。然而，将它作为液体流或液滴应用至鼻腔通道的壁是优选的。鼻内组合物可例如以液体形式来配制，作为滴鼻剂、喷雾剂及气雾剂，或者适合于吸入，作为粉末，作为乳膏或作为乳液，且任选地在适合于分配多肽的容器来提供。组合物可包含多种添加剂，诸如佐剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂或防腐剂。
本发明的制剂可任选地包含增强粘膜递送的试剂，诸如，例如，如在US 2004/0077540中描述的通过调制上皮交界结构和/或生理学可逆地增强粘膜上皮细胞旁路运输的透化肽。
在本发明的另一个实施方案中，施用是口服，且疫苗可以，例如，片剂的形式呈现或者被包封在明胶胶囊或微胶囊中。这些形式的制剂是本领域技术人员的一般知识。
脂质体提供了用于抗原递送和抗原递呈的另一递送系统。脂质体是包含通常围绕水性中心的磷脂和其他甾醇类的双层囊泡，抗原或其他产物可被包封于其中。脂质体结构是高度通用的，具有范围在从约25nm至约500μm的纳米至微米尺寸的许多类型。已发现脂质体在递送治疗剂至皮肤和粘膜表面方面是有效的。完整脂质体结构的平均存活时间或半衰期可通过包含允许延长体内释放的某些聚合物，例如聚乙二醇来被延长。脂质体可以是单层或多层。
聚合物微粒和纳米颗粒采用充当用于疫苗递送的储库的小的生物可降解的球体。聚合物微球具有相比于其他实现储库的佐剂的主要优势是，它们是非常安全的，并已被批准用作生物可降解的药物递送系统。共聚物水解的速率被非常良好表征，其又允许制造具有经延长的时间段持续抗原释放的微粒(O’Hagen，等，Vaccine.1993,11,965)。特别是如果微粒掺入延长的释放特性，它们的肠胃外施用引起持久免疫。释放速率可通过将经不同时间段水解的聚合物的混合物和它们的相对分子量进行调节。不希望受限于理论，由于大颗粒在可用于巨噬细胞摄取之前必须分解成较小颗粒，不同大小的颗粒(1μm至200μm)的制剂还可有助于持久的免疫应答。以这种方式，单注射疫苗可通过整合多种粒度来开发，从而延长抗原递呈且大大有益于家畜生产者。在一些应用中，佐剂或赋形剂可被包括在疫苗制剂中。佐剂的选择部分地由该疫苗的施用方式来决定。例如，非注射的疫苗接种将导致更好的总体依从性并降低总体成本。施用途径的一个模式为肌内施用。鼻内佐剂的非限制性实例包括壳聚糖粉末、PLA和PLG微球、QS-21、磷酸钙纳米颗粒(CAP)和mCTA/LTB(具有热不稳定肠毒素的五聚体B亚基的突变的霍乱毒素E112K)。
理论上，使用的佐剂还可以是已知用于基于肽或蛋白的疫苗的任何佐剂。例如：呈凝胶形式的无机佐剂(氢氧化铝/磷酸铝、磷酸钙)，细菌佐剂诸如单磷酰脂质A和胞壁酰肽，颗粒佐剂诸如所谓的ISCOMS(“免疫刺激复合物”)，脂质体和生物可降解的微球，基于油乳液和乳化剂的佐剂诸如IFA(“不完全弗氏佐剂”)，SAF，皂角苷(诸如QS-21)，角鲨烯/角鲨烷，合成的佐剂诸如非离子型嵌段共聚物，胞壁酰肽类似物，合成的脂质A，合成的多核苷酸和聚阳离子佐剂。
用于与本发明的免疫原一起使用的另一种佐剂是乳液。预期的乳液可以是水包油乳液或油包水乳液。除了免疫原性多肽以外，此类乳液包含如熟知的角鲨烯、角鲨烷、花生油等的油相以及分散剂。非离子分散剂是优选的，且此类材料包括，例如，脱水山梨糖醇和二缩甘露醇的单-和二-C12-C24-脂肪酸酯诸如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯。
此类乳液是例如油包水乳液，所述油包水乳液包含角鲨烯、甘油和表面活性剂诸如二缩甘露醇单油酸酯(ArlacelTM A)，任选地具有用在水相的嵌合体蛋白颗粒乳化的角鲨烷。可选的油相组分包括α-生育酚、混合链二-和三-酸甘油酯及脱水山梨糖醇酯。此类乳液的熟知实例包括MontanideTMISA-720和MontanideTM ISA 703(Seppic,Castres,France)。水包油乳液佐剂包括，例如，在WO 95/17210和EP 0 399 843中公开的那些。
小分子佐剂的使用也被本文预期。在本文有用的一种类型的小分子佐剂是如在以下中描述的7-取代-8氧代-或8-磺基-鸟苷衍生物：美国专利号4,539,205、美国专利号4,643,992、美国专利号5,011,828以及美国专利号5,093,318。7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾(loxoribine))已被证明在诱导抗原-(免疫原-)特异性应答中是特别有效的。
有用的佐剂包括由Corixa Corp制造的单磷酰脂质A
3-脱酰基单磷酰脂质A
该佐剂包含从细菌提取的三种组分：在2％角鲨烯/TweenTM 80乳液中的单磷酰脂质(MPL)A、海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedimycolate)(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)。该佐剂可通过GB 2122204B中教导的方法来制备。
其他化合物与称为氨基烷基葡萄糖酰胺磷酸盐(AGP)的
佐剂结构上相关，诸如以名称RC-529TM佐剂{2-[(R)-3-四-癸酰基氧基四癸酰基氨基]-乙基-2-脱氧-4-O-膦-酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰基氧基四-癸酰基]-2-[(R)-3-四-癸酰基氧基四-癸酰基-氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙基铵盐}从Corixa Corp可得的那些。RC-529佐剂以从Corixa Corp作为RC-529SE出售的角鲨烯乳液和作为RC-529AF可得的水性制剂可得(例如在美国专利号6,355,257；美国专利号6,303,347；以及美国专利号6,113,918中公开的)。
胞壁酰二肽佐剂也被预期并且包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[CGP 11637，也称为去甲-MDP]和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-s-n-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)乙胺[(CGP)1983A，也称为MTP-PE]。所谓的胞壁酰二肽类似物被描述于美国专利号4,767,842中。
包含toll样受体-4(TLR-4)的一种或更多种激动剂的佐剂，诸如
佐剂或结构上相关的化合物诸如
佐剂或脂质A模拟物单独的或连同TLR-9的激动剂诸如含非甲基化的寡脱氧核苷酸的CpG基序一起的使用也是任选的。
另外预期的佐剂包括合成的含CpG核苷酸基序一次或更多次(加上侧翼序列)的寡核苷酸佐剂，从Coley Pharmaceutical Group可得。从Aquila Biopharmaceuticals,Inc.可得的命名为QS21的佐剂是具有来源于南美洲树南美皂皮树(Quillaja SaponariaMolina)的树皮的佐剂活性的免疫活性的皂苷级分(例如QuilTM A)，并且其的产生方法被描述于美国专利号5,057,540中。还公开了QuilTM A的衍生物，例如QS21(QuilTM A的HPLC纯化的级分衍生物，也称为QA21)，以及其他级分诸如QA17。南美皂皮树皂苷的半合成和合成的衍生物也是有用的，诸如描述于美国专利号5,977,081以及美国专利号6,080,725中的那些。从Chiron Corp.可得的命名为MF59的佐剂被描述于美国专利号5,709,879以及美国专利号6,086,901中。
另一种类型的佐剂混合物包括诸如描述于美国专利号6,113,918中的另外包含氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯的稳定的油包水乳液。另一种油包水乳液被描述于WO 99/56776中。
佐剂以佐剂量使用，佐剂量可随着佐剂、宿主动物和免疫原而变化。典型的量可从每免疫接种约1微克至约1mg变化。本领域技术人员知道，适当的浓度或量可容易地确定。
根据本发明的一些实施方案，佐剂作为包含能够使疫苗等渗或低渗的一种或更多种水溶性或水可乳化物质的溶液或乳液而存在。水溶性或水可乳化物质可，例如，选自由以下组成的组：麦芽糖；果糖；半乳糖；蔗糖；糖醇；脂质；以及其组合。
肽表位及类似物
本发明的多聚体多肽可使用本领域已知用于合成肽、肽多聚体和多肽的方法化学合成。这些方法通常依赖于肽合成的已知原理；最方便地，程序可根据固相肽合成的已知原理来进行。
本文所用的“肽”指示被肽键连接的一系列氨基酸。根据本发明的具体实施方案，肽表位包含4个至24个氨基酸残基的序列。多聚体多肽包含至少两个重复和最大50个重复的肽表位。
当采用化学合成时，肽类似物和肽模拟物也包括在本发明的范围内。根据本发明的肽类似物可任选地包含至少一个非天然的氨基酸和/或在C末端或N末端处的至少一个阻断基团。
术语“氨基酸”指具有氨基基团和羧酸基团，优选地以碳主链上的1,2-、1,3-或1,4-取代模式的化合物。α-氨基酸是最优选的，并且包括在蛋白中发现的20种天然氨基酸(除了甘氨酸以外，其是L-氨基酸)。当合成是通过化学方法时，术语氨基酸还包括20种天然氨基酸的对应的D-氨基酸、对应的N-甲基氨基酸、侧链修饰的氨基酸、在蛋白中未发现的生物合成可得的氨基酸(例如，4-羟基-脯氨酸、5-羟基-赖氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸(djenkolic acid)、β-氰丙氨酸(cyanolanine))以及合成来源的α-氨基酸，诸如氨基-异丁酸、正亮氨酸、正缬氨酸、高半胱氨酸和高丝氨酸。β-丙氨酸和γγ氨基丁酸分别是1,3和1,4氨基酸的实例，并且许多其他的是本领域熟知的。抑胃酶氨酸-样等排体(包含两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CHOH代替)、羟基乙烯等排体(包含两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CHOHCH2代替)、还原酰胺等排体(包含两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CH2NH键代替)和硫酰胺等排体(包含两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CSNH键代替)也是对本发明有用的残基。
对于化学合成，在本发明中使用的氨基酸为商购可得或通过常规合成方法可得的那些。某些残基可要求特定方法用于掺入进肽，且对肽序列的顺序、发散或收敛的合成方法在本发明中是有用的。天然编码的氨基酸及其衍生物根据IUPAC命名法由三字母代码表示。当没有指明时，使用L异构体。
如本领域技术人员已知的氨基酸的保守性取代在本发明的肽表位的范围内。保守性氨基酸取代包括用另一个具有相同类型的官能团或侧链的氨基酸，例如脂肪族、芳香族、带正电荷、带负电荷的氨基酸代替一个氨基酸。这些取代可增强口服生物可利用度、向中枢神经系统的渗入、靶向特异性细胞群等等。技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对肽、多肽或蛋白序列的单独的取代、缺失或添加是“保守性修饰的变体”，其中该改变导致氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性取代表格是本领域熟知的。
以下六组各包括对彼此是保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
以下实施例是为了更充分地说明本发明的一些实施方案而呈现。然而，其不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设计本文公开的原理的许多变化和修改而不背离本发明的范围。
实施例
材料和方法
多聚体多表位多肽：
产生并测试包含在表2中列出的流感病毒肽表位E1至E9的多聚体多表位多肽。除了肽表位，多肽包括氨基酸和短肽作为间隔区。多肽被以交替顺序聚合结构或嵌段共聚物结构排列。多肽通过在来自包含用于进一步操作多肽的多种限制性酶切位点的多核苷酸构建体的表达载体中表达来制备。多核苷酸构建体由商业来源提供。
由多聚体-多表位多肽制备的疫苗被用于多种小鼠模型的免疫接种研究及在人受试者的临床试验中。
具有三个重复的以嵌段共聚物结构[E1]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3-[E6]3-[E7]3-[E8]3-[E9]3排列的九种不同表位的每个的多聚体多肽被产生并称为M-001。估计的M-001分子量为48kD。M-001多聚体多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:86中列出。
用来制备M-001多聚体肽的多核苷酸构建体的DNA序列在SEQ ID NO:85中列出。
另外的多聚体-多表位多肽序列选自由分别被包含选自由以下组成的组的序列的多核苷酸序列编码的SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:88组成的组：SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:87。
根据本发明的疫苗组合物可被施用，而无需佐剂。可选地，组合物可包含佐剂。在此类情况下，在临床试验中使用的任选地佐剂在动物研究中为IFA且在人试验中为MontanideTM ISA 51VG(Seppic,France)。MontanideTM为已在测试疫苗效力的许多临床试验中采用的通常使用的免疫调节剂，能够诱导细胞和体液免疫应答两者(Peek等，Adv DrugDeliv Rev.2008；60,915-928)。
实施例1：M-001的产生过程-选项A
发酵方法：发酵过程使用重组表达M-001多肽的热休克诱导的大肠杆菌来进行。将过夜接种物添加至10L细菌生长培养基。补料分批过程在36℃下进行。诱导通过将温度提高至42℃引发。在诱导两小时之后，批次在15L的终体积终止。然后将细胞离心，并将回收的细胞沉淀存储于-70℃。
细胞裂解、包含体回收和洗涤：将冷冻的细胞沉淀解冻并分散于裂解缓冲液(50mMTris、10mM EDTA、溶菌酶)中。在混合并Ultra Turrax处理之后，将细胞通过Gaulin匀浆仪(700-800栅门x3个循环)。裂解物用50mM Tris、0.1M NaCl、2％Triton X-100稀释，并然后用0.5M Tris、1M NaCl稀释。最后，粗制包含体(IB)通过离心回收，并然后储存在-70℃。
然后，将IB沉淀在1％Triton；50mM HEPES、1M NaCl，pH 8；5M尿素，5mM甘氨酸，1％吐温80，pH 8中连续洗涤，最后用50mM HEPES,pH 8洗涤，并然后储存在-70℃。
包含体溶解：将洗涤过的包含体在包含6M尿素、2M硫脲、50mM甘氨酸、1％CHAPS、50mMβ-巯基乙醇，pH 9.5的缓冲液中溶解。
蛋白纯化：使用AKTApilot色谱系统(GE Healthcare)进行纯化。将溶解的蛋白通过膜过滤澄清，并且首先负载于阳离子交换SP Sepharose FF柱(GE Healthcare)上。柱用洗涤缓冲液I(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巯基乙醇，pH 8)，然后用洗涤缓冲液II(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巯基乙醇，200mM NaCl，pH 8)连续洗涤，并且然后用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巯基乙醇、250mM NaCl，pH 8洗脱。收集在280nm吸收时检测到的洗脱峰。
然后，将洗脱物(elute)用1M硫酸铵稀释至0.5M硫酸铵，然后负载到第二色谱柱，疏水作用苯基Sepharose FF(HS)树脂(GE Healthcare)上。柱用8M尿素、5mM甘氨酸、50mMHEPES、50mMβ-巯基乙醇、0.5M硫酸铵，pH 8洗涤，然后用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巯基乙醇，pH 8洗脱。然后，将洗脱物穿过Sartobind STIC(Sartorius)过滤器，用于减少DNA和内毒素。以吐温80：重组蛋白的1:5(w/w)的比率添加吐温80。将蛋白溶液无菌过滤(0.2μm)。所有的随后步骤无菌地操作。
超滤和配制：洗脱物使用具有10kDa临界值(cut off)的中空纤维组件(GEHealthcare)进行浓缩。为了形成具有可控粒度分布的蛋白微粒，缓冲液连续更换为50mMMES缓冲液，pH 5.5，然后为50mM柠檬酸盐缓冲液、0.5M精氨酸，pH 5.5，并且最后为20mM柠檬酸盐缓冲液、0.2M精氨酸，pH 6，这代表原料药(Drug Substance)。药物组合物-药物产品通过在20mM柠檬酸盐缓冲液、0.2M精氨酸，pH 6中将原料药稀释至2.5mg/mL的蛋白浓度来获得。填充的小瓶储存在+4℃。
实施例2：M-001的产生过程-选项B
发酵方法：与在实施例1中的相同。
细胞裂解、包含体回收和洗涤：与在实施例1中的相同。
包含体溶解：将洗涤过的包含体在包含6M尿素、2M硫脲、5mM甘氨酸、1％CHAPS、50mM HEPES、50mMβ-巯基乙醇，pH 8.0的缓冲液中溶解。
蛋白纯化：使用AKTApilot色谱系统(GE Healthcare)进行纯化。将溶解的蛋白通过膜过滤澄清，并且负载于阳离子交换SP Sepharose FF柱(GE Healthcare)上。柱用洗涤缓冲液I(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巯基乙醇，pH 8)，然后用洗涤缓冲液II(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巯基乙醇，200mM NaCl，pH 8)连续洗涤，并且然后用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巯基乙醇、250mM NaCl，pH 8洗脱。收集在280nm吸收时检测到的洗脱峰。
以吐温80：重组蛋白的1:5(w/w)的比率添加吐温80。将蛋白溶液无菌过滤(0.2μm)。所有的随后步骤无菌地操作。
超滤和配制：洗脱物使用具有10kDa临界值的中空纤维组件(GEHealthcare)进行浓缩。为了形成可控微粒(即，可控蛋白聚集体)，缓冲液连续更换为50mM MES缓冲液，pH5.5，然后为50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 5.5，这代表原料药。将精氨酸溶液添加至0.5M的最终精氨酸浓度。药物组合物-药物产品通过在50mM柠檬酸盐缓冲液、0.5M精氨酸，pH 5.5中将原料药稀释至2.5mg/mL的蛋白浓度来获得。填充的小瓶储存在+4℃。
实施例3：测试PBS作为原料药缓冲液的M-001的产生过程
发酵方法：与在实施例1中的相同。
细胞裂解、包含体回收和洗涤：与在实施例1中的相同。
包含体溶解：与在实施例2中的相同。
蛋白纯化：与在实施例2中的相同。
超滤和配制：将洗脱物用50mM MES缓冲液，pH 5.5，1:40稀释。所得的溶液使用具有10kDa临界值的中空纤维组件(GE Healthcare)进行浓缩。为了创造蛋白微粒，缓冲液被更换为PBS缓冲液，pH 7.0。与在实施例1&2中获得的悬液相比，该蛋白悬液的外观是劣质的，如由增加凝絮和沉淀视觉上评价的。将精氨酸盐酸盐添加至0.1-1.5M的最终精氨酸浓度。精氨酸添加导致以剂量依赖性方式的直接颗粒解凝絮，较高的精氨酸浓度创造较显著的效果。
Claims (28)
1.一种药物组合物，所述药物组合物呈微粒的水性悬液形式，所述药物组合物包含1-10mg/ml的至少一种多聚体-多表位多肽、0.1-0.5M的含胍基的氨基酸或其衍生物以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，所述至少一种多聚体-多表位多肽包含多个拷贝的多种流感病毒肽表位，其中在所述水性悬液中的微粒具有均匀的聚集体粒度分布，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级的尺寸范围内，其中所述含胍基的氨基酸或其衍生物包括精氨酸(Arg)或其衍生物，其中所述多聚体-多表位流感多肽为M-001，并且其中M-001的氨基酸序列由SEQ ID NO:86中列出的氨基酸序列组成，其中所述药物组合物包含浓度为1-50mM的柠檬酸盐缓冲剂，并且其中所述药物组合物具有在5.5至6.5的范围内的pH。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有在5.5至6的范围内的pH。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中在所述水性悬液中的95％的聚集体具有以下的尺寸范围分布：0.5-5μm、0.6-6μm、0.7-7μm、0.8-8μm、0.9-9μm、1-10μm、2-20μm、3-30μm、4-40μm或5-50μm。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述含胍基的氨基酸为精氨酸(Arg)。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述含胍基的氨基酸为L-Arg盐酸盐(L-ArgHCl)。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物包含1-10mg/ml多聚体-多表位流感多肽、0.1-0.5M L-精氨酸及10-50mM柠檬酸盐缓冲剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，所述药物组合物包含0.1-0.3ML-精氨酸及10-30mM柠檬酸盐缓冲剂。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，所述药物组合物包含约2.5mg/ml多聚体-多表位流感多肽、约0.2M精氨酸及约20mM柠檬酸盐缓冲剂。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物用于针对流感免疫接种受试者。
10.一种产生纯化的重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
i.提供在水性溶液中在1.5-5mg/ml的浓度的至少一种多聚体-多表位流感多肽，所述水性溶液包含离液剂、去垢剂、还原剂以及提供在7-10的范围内的pH的缓冲剂；
ii.通过逐渐去除所述离液剂和所述还原剂诱导可控聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；以及
iii.添加含胍基的化合物，以获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定的微粒悬液，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级的尺寸范围内
其中所述含胍基的化合物包括精氨酸(Arg)或其衍生物，其中所述多聚体-多表位流感多肽为M-001，并且其中M-001的氨基酸序列由SEQ ID NO:86中列出的氨基酸序列组成，其中所述稳定的微粒悬液包含1-10mg/ml的多聚体-多表位流感多肽、0.1-0.5M的所述含胍基的化合物以及浓度为1-50mM的柠檬酸盐缓冲剂并具有在5.5至6.5的范围内的pH。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述离液剂为5-8M尿素和1-4M硫脲，所述去垢剂为0.5％-4％3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐，且所述缓冲剂为5-100mM甘氨酸。
12.根据权利要求10所述的方法，其中逐渐去除离液剂和还原剂通过超滤进行。
13.根据权利要求10所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
i.提供表达至少一种多聚体-多表位流感多肽的大肠杆菌细胞；
ii.进行所述大肠杆菌细胞的裂解、细菌细胞破坏和离心，以提供包含多聚体-多表位多肽的包含体；
iii.进行所述包含体的至少一次洗涤。
14.根据权利要求13所述的方法，所述方法包括以下步骤：
iv.将所述包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐、还原剂以及5-100mM甘氨酸，所述甘氨酸作为缓冲剂提供在7-10的范围内的pH；
v.通过逐渐去除所述离液剂和所述还原剂诱导可控聚集，连同添加含胍基的缓冲剂，从而形成不溶性聚集体的悬液；以及
vi.通过缓冲液更换配制所述悬液，以获得0.1-0.4M含胍基的氨基酸和10-40mM柠檬酸盐缓冲剂的、具有在5.5-6.5的范围内的pH的最终悬液。
15.根据权利要求14所述的方法，其中添加含胍基的缓冲剂在步骤(v)的聚集体形成之前进行。
16.根据权利要求14所述的方法，其中添加含胍基的缓冲剂在步骤(v)的聚集体形成之后进行。
17.根据权利要求14所述的方法，其中在步骤(iv)和(v)之间进行至少一个色谱分离步骤。
18.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(ii)的所述细菌细胞破坏通过高压均化进行。
19.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(ii)的裂解在具有在7-9的范围内的pH的缓冲液中进行，所述缓冲液包含Tris缓冲剂、EDTA和每1g细胞糊状物0.1-0.5mg溶菌酶。
20.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(iv)的所述还原剂为在20-80mM的浓度的β-巯基乙醇。
21.根据权利要求14所述的方法，其中在步骤(iv)的诱导可控聚集通过超滤进行。
22.根据权利要求14所述的方法，所述方法包括以下步骤：
i.将包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐、50mMβ-巯基乙醇以及提供约9.5的pH的50mM甘氨酸；
ii.通过逐渐去除所述离液剂和所述还原剂诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加0.5M精氨酸缓冲液的超滤，使所述悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使所述悬液经历缓冲液更换，以获得最终组合物，所述最终组合物包含约2.5mg/ml所述多聚体-多表位流感多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠檬酸盐缓冲剂，具有在5.5至6的范围内的pH。
23.一种产生重组多聚体-多表位多肽的基本上稳定的水性悬液的方法，所述方法包括以下步骤：
i.使包含重组产生的多聚体-多表位流感多肽的包含体溶解于这样的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸盐、50mMβ-巯基乙醇以及提供约9.5的pH的50mM甘氨酸，其中所述多聚体-多表位流感多肽为M-001，并且其中M-001的氨基酸序列由SEQ ID NO:86中列出的氨基酸序列组成；
ii.通过逐渐去除所述尿素、所述硫脲和所述β-巯基乙醇诱导聚集，从而形成不溶性聚集体的悬液；
iii.通过包括逐渐添加0.1-1M精氨酸缓冲液的超滤，使所述悬液经历浓缩和缓冲液更换步骤；以及
iv.使所述悬液经历缓冲液更换，以获得最终悬液，所述最终悬液包含1-5mg/ml所述多聚体-多表位流感多肽、0.1-0.5M精氨酸和10-50mM柠檬酸盐缓冲剂以获得具有均匀聚集体粒度分布的稳定的微粒悬液，其中95％的聚集体尺寸落入一个数量级的尺寸范围内，其中所述稳定的微粒悬液具有在5.5-6.5的范围内的pH。
24.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(iii)中添加0.5M精氨酸缓冲液并在步骤(iv)中获得最终悬液，所述最终悬液包含约2.5mg/ml所述多聚体-多表位流感多肽、约0.2M精氨酸和约20mM柠檬酸盐缓冲剂，且pH为在5.5-6的范围内。
25.一种药物组合物，所述药物组合物通过根据权利要求10-24中任一项所述的方法来产生。
26.根据权利要求1-9和25中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物被配制用于经由选自由以下组成的组的途径施用：肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、皮内和经皮。
27.根据权利要求1-9和25-26中任一项所述的药物组合物在制备用于在受试者中诱导免疫应答并赋予针对流感的保护的疫苗中的用途，当使用所述疫苗时，将所述疫苗施用至所述受试者。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述疫苗作为包括与季节性或大流行性流感疫苗一起共施用的疫苗接种方案的一部分被施用。
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