JP6550072B2 - 多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドの組成物及びそれらの生成 - Google Patents

Description

本発明は、多量体マルチエピトープペプチドベースのインフルエンザワクチンの医薬組成物及びその調製方法に関する。具体的には、本発明は、インフルエンザに対して対象を保護するための、多量体マルチエピトープポリペプチド及びグアニジニウム含有アミノ酸を含む微粒子懸濁液、それらの調製並びにそれらの使用を提供する。

インフルエンザは、急速に変異しているインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染性の高い疾患である。インフルエンザは、世界中で季節的に流行し、簡単にうつって広がり、年間総人口の５〜２０％が感染する。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、季節的大流行時にインフルエンザ関連の原因で毎年２５０，０００〜５００，０００人が死亡している。米国だけで、２０万人を超える人々が例年の季節性インフルエンザで入院している。インフルエンザ感染は、軽度、中程度又は重度であり、無症候から軽度の上気道感染及び気管気管支炎を経て重度の、時として致死的なウイルス肺炎に及び得る。感染は、高い罹患率及び死亡率につながる肺と心血管の合併症と関連し、主に幼児、高齢者及び慢性の病状を有する個人などのリスク集団に影響を与える。

３種類のインフルエンザウイルスのうち、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢは、それぞれヒトにおけるインフルエンザ疾患の約８０％及び２０％に関与し、インフルエンザＣウイルスはヒトに感染しない。インフルエンザＡウイルスは、多数の亜系及び種特異性によって特徴付けられ、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面タンパク質の抗原の頻繁なドリフト及びシフトにより、広範な季節的流行及びパンデミックの主要原因と考えられている。抗原が変化した後、免疫系によって認識されないウイルス株を介した感染は、感染した個人による免疫応答の低下をもたらし得、さらに著しく変化すると、体の免疫防御刺激が有効でなくなる。最近の鳥及び豚のインフルエンザパンデミック株で経験したように、抗原のドリフト又はシフトは、それぞれのインフルエンザの流行又はパンデミックを引き起こし得る。

現在までに、市販のインフルエンザワクチンは、インフルエンザ季節のピーク中に最も蔓延している株の予測に応じて毎年選択されるインフルエンザＡ抗原及びＢ抗原を含む。しかし、ワクチンに含まれる株と実際に広まっている株間のミスマッチにより、これらの株特異的ワクチンは、臨床効力が比較的低い場合が多い。また、このような免疫方法は、毎年、新しいワクチン製剤の調製を必要とする。したがって、複数のウイルス株を認識するワクチンは、より対費用効果が高く、さらに患者のコンプライアンスを高め、健康のグローバルな見通しを高めるであろう。

現在使用されている市販のインフルエンザワクチン組成物は、典型的には、トリトン、Ｔｗｅｅｎ、コハク酸水素α−トコフェリル（α−ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）及び／又は他の添加剤もしくは賦形剤を添加した、リン酸、ナトリウム、カリウム及び／又はカルシウムの緩衝液を含む水溶液である。季節性インフルエンザの表面抗原を提示するインフルエンザ用の弱毒化生ワクチンであるＦＬＵＭＩＳＴ（商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）は、約０．０５Ｍのアルギニン、０．１８８ｍｇのグルタミン酸一ナトリウム、２ｍｇの加水分解ブタゼラチン、１３．６８ｍｇのスクロース、２．２６ｍｇのリン酸二カリウム、及び０．９６ｍｇのリン酸二水素カリウムを含む溶液として供給される。

本発明の発明者の一部によるＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／０１６６３９は、各エピトープが単一のポリペプチド中に少なくとも２倍存在する、複数のインフルエンザウイルスペプチドエピトープを含むインフルエンザマルチエピトープポリペプチド及びワクチンを開示している。

多量体−００１（Ｍ−００１）ワクチンは、それぞれ３回の反復として配置され、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））内で発現される単一の組換えポリペプチドとして調製される、９種類の保存された直鎖状エピトープからなる。これらのエピトープは、それらの抗原ドリフト及びシフトに関係なく、大半のインフルエンザウイルス株に共通している。したがって、Ｍ−００１は、同様に、将来のウイルス株に対する免疫系の防御を提供することが期待される。多量体−００１のワクチン接種は、各株の外側のタンパク質の多様性にもかかわらず、効率的な交差株の認識及び防御をもたらす。

様々な動物モデル及び反復毒性試験で観察された安全性パラメータを用いて得られた重要な結果は、ヒトでの臨床試験への道を開き、臨床試験の基盤を提供した。成人及び高齢者ボランティアでのＭ−００１の安全性並びに免疫原性を評価する第Ｉ／ＩＩ相及び第ＩＩ相臨床試験が完了した（Ａｔｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｖａｃｃｉｎｅ ３２，５８１６−５８２３）。ＰＢＳ中のアジュバント化又は非アジュバント化ワクチンの１２５〜５００μｇ用量は、安全かつ良好な耐容性を証明した。潜在的な多量体−００１ワクチン関連の毒性が、ＧＬＰ毒性試験で評価された。最大ヒト用量でＩＭ投与を繰り返した両方のＭ−００１ワクチン製剤（アジュバント化及び非アジュバント化）は、安全であることが証明された。

本発明の発明者らの一部によるＷＯ２０１２／１１４３２３は、インフルエンザワクチンの前に、又はそれとともに、複数のインフルエンザウイルスペプチドエピトープを複数コピー含む多量体インフルエンザポリペプチドを対象に投与することにより、季節性又はパンデミックインフルエンザのワクチン防御効果を改善する方法を提供する。

異種タンパク質を大腸菌で発現させたときに、封入体（ＩＢ）の形成が頻繁に生じ、活性のある組換えタンパク質の収集は、その活性のある構造へのリフォールディングを必要とする場合が多い。Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｔ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３，３０：６．１．１−６．１．３７）は、大腸菌内で産生した組換えタンパク質の精製を概説した。

アルギニンは、ＩＢから得られるタンパク質のリフォールディング及び精製に使用され、化学的及び物理的性質が異なる種々のタンパク質に有効であると考えられている。タンパク質のリフォールディング、可溶化及び精製におけるアルギニンの役割は、Ｔｓｕｍｏｔｏら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００４ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２０（５）：１３０１−８；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ．２０１１ Ｊｕｎ ９；１１５（２２）：７４４７−５８））によって概説された。

アルギニンの抗凝集効果及び安定化効果は、以前に説明された。例えば、Ｌｙｕｔｏｖａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００７ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２３（６）：１４１１−６）は、タンパク質凝集が加熱又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添加による折り畳まれた状態からの移行によって誘導される場合の、タンパク質凝集に対する低濃度のアルギニン（１〜１０ｍＭ）の効果を研究した。

Ｌ−アルギニンなどの低分子量の添加剤は、沈殿をもたらす分子間疎水性相互作用を阻害することによって再生収率を向上させることが示唆されている。Ｈｏら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００３，１２，７０８−７１６）は、Ｌ−アルギニンがタンパク質の溶解度を増加させることにより、凝集を抑制することを実証した。

医薬品懸濁液の形態でのタンパク質の生成は、一般的に次の理由：ポリペプチドの溶解性；ポリペプチドの安定性；ポリペプチドの放出プロファイルの制御又は変更のうちの１つ以上の結果として支持される。

タンパク質のマイクロ粒子又はナノ粒子の懸濁液は、いくつかの方法によって生成することができる。このような粒子は、最初により大きな粒子として生成され、その後、物理的又は化学的手段によるサイズ縮小手順を経ることができる。いくつかの他のアプローチには、結晶化、凍結乾燥、噴霧乾燥及び超臨界流体粒子形成又は脱溶媒和が含まれる。

ＷＯ２００９／０１５７３６は、Ｌ−アルギニンを含む変性可溶化緩衝液での封入体の処理を含む、精製した組換えＧＤＦ−５関連タンパク質の生成プロセスを開示している。

ＷＯ２０１２／０５４６７９は、組換えタンパク質及び封入体を含む混合物から組換えタンパク質を精製するための方法であって、ａ）関連封入体と共に組換えタンパク質を含む混合物を、エタノールアミン、アルギニン、ＥＤＴＡ、尿素及びＤＴＥを含む可溶化緩衝液で可溶化することを含む方法を開示している。

ＵＳ２００３／０１９９４４１は、再生プロコラーゲンプロペプチドの生成方法であって、大腸菌で生成した封入体を０．５〜８Ｍの変性緩衝液に溶解し、次いで、ほぼ中性のｐＨに緩衝化し、最終濃度が２００〜１，０００ｎＭのＬ−アルギニン及びジスルフィド架橋還元共役酸化還元系を含む限界希釈緩衝液に滴下し、次いで、緩衝液混合物を、最終濃度が５０〜２００ｎＭのＬ−アルギニン及びジスルフィド架橋還元共役酸化還元系を含む生理的緩衝液に対して透析し、その後、ジスルフィド架橋還元共役酸化還元系を含む生理的緩衝液に対して、最終的には、生理的緩衝液に対して透析する、方法に関する。

ＵＳ２００４／０１３７５８８は、生体試料からポリペプチドを精製し、アルギニンの存在下でのリフォールディング条件にそのポリペプチドを供する方法を開示している。

改善された多量体マルチエピトープインフルエンザワクチンにおいて使用するための、均一なサイズ分布を有する微粒子ポリペプチドの安定な懸濁液を有することは都合がよい。このような組成物の効率的な生成プロセスも必要である。

本発明は、本明細書で多量体マルチエピトープポリペプチドと表される、複数のインフルエンザウイルスペプチドエピトープを複数コピー含む少なくとも１種類の多量体インフルエンザポリペプチド、及びグアニジニウム含有アミノ酸又はその誘導体を含む、改良されたインフルエンザワクチン懸濁液を提供する。そのような懸濁液組成物の生成方法も提供される。

本発明は、多量体マルチエピトープポリペプチド溶液からのカオトロピック剤及び還元剤の除去中に、アルギニンアミノ酸の添加とともに、タンパク質凝集体の生成を調節することにより、所望のタンパク質濃度及び生理学的ｐＨに近いｐＨで多量体マルチエピトープポリペプチドの安定で均一な微粒子懸濁液が得られ、巨大アモルファス凝集体を注射用製剤に変換するための高圧均質化の必要性が克服されるという発見に一部基づいている。

一態様によれば、本発明は、水性懸濁液の形態の医薬組成物であって、少なくとも１種類の多量体マルチエピトープポリペプチド、グアニジニウム含有アミノ酸又はその誘導体、及び薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、インフルエンザに対する対象の免疫化用のワクチンの形態にある。

いくつかの実施形態によれば、グアニジニウム含有アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）である。

他の実施形態によれば、グアニジニウム含有アミノ酸はアルギニン誘導体である。

Ｌ−アルギニンもしくはＤ−アルギニン、もしくはその誘導体の任意の塩もしくは遊離酸、又はそれらの混合物は、本発明に従って使用することができる。

いくつかの実施形態によれば、アルギニンは、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）である。

いくつかの実施形態によれば、Ａｒｇ化合物は、Ａｒｇ塩酸塩、Ａｒｇ硫酸塩、Ａｒｇリン酸塩、Ａｒｇクエン酸塩、Ａｒｇ酢酸塩及びＡｒｇ遊離酸からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの実施形態によれば、該組成物は、Ｌ−Ａｒｇ塩酸塩（Ｌ−Ａｒｇ ＨＣｌ）を含む。

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、グアニジニウム含有アミノ酸又はそれらの誘導体を０．１〜２．０Ｍの濃度で含む。

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、Ｌ−アルギニンを０．１５〜０．４５Ｍの濃度で含む。他の実施形態によれば、該医薬組成物中のアルギニン濃度は０．１５〜０．３０Ｍである。

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、１〜５０ｍＭの濃度を有する追加の緩衝剤を含む。

いくつかの実施形態によれば、該緩衝剤は、クエン酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホネート）緩衝液、リジン緩衝液、グリシン緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホネート）緩衝液、イミダゾール緩衝液及びＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホネート）緩衝液からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

具体的な実施形態によれば、該組成物は、クエン酸緩衝液、リジン緩衝液及びグリシン緩衝液からなる群から選択される緩衝液を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

特定の実施形態によれば、該組成物は、クエン酸緩衝液を含む。

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物のｐＨは、ｐＨ５．０〜７．６の範囲内にある。特定の実施形態によれば、該医薬組成物のｐＨは、ｐＨ５．５〜７．０の範囲内にある。他の特定の実施形態によれば、該緩衝剤は、５．７〜６．５の範囲内でｐＨを維持する。

特定の具体的な実施形態によれば、１〜５ｍｇ／ｍｌの多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチド、０．１〜０．５ＭのＬ−アルギニン、及び５．０〜７．０の範囲のｐＨを有する１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む医薬組成物が提供される。

特定の実施形態によれば、該医薬組成物は、１〜４ｍｇ／ｍｌの多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチド、０．１〜０．３ＭのＬ−アルギニン、及び５．５〜６．５の範囲のｐＨを有する１０〜３０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。

特定の実施形態によれば、該医薬組成物は、約２．５ｍｇ／ｍｌの多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチド、約０．２Ｍのアルギニン、約２０ｍＭのクエン酸緩衝液、及び約６のｐＨを含む。

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、０．５〜５０μｍの範囲内のサイズ分布を有する不溶性凝集体を含み、その凝集体の９５％のサイズが一桁の範囲内に入る懸濁液である。

いくつかの実施形態によれば、該懸濁液中の凝集体の９５％は、０．５〜５μｍ、１〜１０μｍ、３〜３０μｍ及び５〜５０μｍからなる群から選択されるサイズ分布を有する。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの実施形態によれば、該多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドは組換え生成される。

いくつかの具体的な実施形態によれば、該多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドは、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有するＭ−００１という名称である。

別の態様によれば、本発明は、精製した組換え多量体マルチエピトープポリペプチドの懸濁液を生成するプロセスであって、以下の工程を含むプロセスを提供する：
ｉ．少なくとも１種類の多量体マルチエピトープポリペプチドを含有する封入体を、カオトロピック剤、緩衝剤、及び還元剤を含み、７〜１１の範囲のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって調節される凝集を誘導し、その結果、不溶性凝集体懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．アルギニンを添加して、凝集体の９５％のサイズが一桁のサイズの範囲内に入る、均一な凝集体サイズ分布を有する安定で均一な懸濁液を得る工程。

具体的な実施形態によれば、該カオトロピック剤は、５〜８Ｍの尿素及び１〜４Ｍのチオ尿素を含む。

特定の実施形態によれば、工程（ｉｉ）のカオトロピック剤及び還元剤の段階的除去は、限外濾過により行われる。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｉ）のＣＨＡＰＳは、０．５〜２％の濃度で存在する。

いくつかの実施形態によれば、該プロセスは、以下の工程を含む：
ｉ．少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを発現する大腸菌細胞を提供する工程；
ｉｉ．溶解及び細菌細胞破壊を行い、多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を提供する工程；
ｉｉｉ．７〜１１の範囲のｐＨで、５〜８Ｍの尿素、１〜４Ｍのチオ尿素、０．５〜４％のＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、緩衝剤、及び還元剤を含む溶液で該封入体を可溶化する工程；
ｉｖ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって調節される凝集を誘導し、その結果、不溶性凝集体懸濁液を形成する工程；
ｖ．アルギニンを添加して、凝集体の９５％が一桁のサイズの範囲内に入る、均一な凝集体サイズ分布を有する安定で均一な懸濁液を得る工程。

いくつかの実施形態によれば、カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去は、当技術分野で公知の手順を用いて、限外濾過により行われる。

いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのクロマトグラフィー分離工程は、工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の間で行われる。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのクロマトグラフィー分離工程は、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）の凝集体形成前又はその間に行われる。

さらに他の実施形態によれば、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）の凝集体形成後に行われる。

いくつかの実施形態によれば、該プロセスは、以下を含む：
ｉ．少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを発現する大腸菌細胞を提供すること；
ｉｉ．大腸菌細胞の溶解、細菌細胞破壊及び遠心分離を行い、多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を提供すること；
ｉｉｉ．該封入体の少なくとも１回の洗浄を行うこと；
ｉｖ．５〜８Ｍの尿素、１〜４Ｍのチオ尿素、０．５〜４％のＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、還元剤及び７〜１０の範囲のｐＨを提供する緩衝剤を含む溶液に該封入体を可溶化すること；
ｖ．少なくとも１つのクロマトグラフィー工程に該溶液を供すること；
ｖｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって調節される凝集を誘導し、その結果、不溶性凝集体を形成すること；
ｖｉｉ．グアニジニウム含有化合物を添加すること；及び
ｖｉｉｉ．（ｖｉｉ）の組成物を製剤化して、４〜８の範囲のｐＨの、約０．１〜０．４Ｍのグアニジニウム含有アミノ酸及び１０〜４０ｍＭのクエン酸緩衝液の最終懸濁液を得ること。

他の実施形態によれば、ステップ（ｖｉｉ）のグアニジニウム含有化合物の添加は、調節された凝集の誘導中に徐々に行われる。

いくつかの実施形態によれば、溶解は、７〜９の範囲のｐＨで、トリス緩衝液、ＥＤＴＡ、及び細胞ペースト１ｇあたり０．１〜０．５ｍｇのリゾチームを含む緩衝液で行われる。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｖｉ）の調節された凝集の誘導は、限外濾過により行われる。

いくつかの実施形態によれば、限外濾過は、以下の工程を含む：
ｉ．ｐＨ４〜６．５の１０〜８０ｍＭのＭＥＳ緩衝液での緩衝液交換Ｉ；
ｉｉ．ｐＨ４〜６の２０〜８０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．１〜１Ｍのアルギニンでの緩衝液交換ＩＩ；
ｉｉｉ．ｐＨ４．０〜７．５の１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．１〜０．５Ｍのアルギニンでの緩衝液交換ＩＩＩ。

他の実施形態によれば、限外濾過は以下の工程を含む：
ｉ．ｐＨ４．０〜６．５の１０〜８０ｍＭのＭＥＳ緩衝液での緩衝液交換Ｉ；
ｉｉ．ｐＨ４〜６の２０〜８０ｍＭのクエン酸緩衝液での緩衝液交換ＩＩ；
ｉｉｉ．アルギニン含有溶液での０．１〜１Ｍのアルギニン濃度までの希釈。

いくつかの実施形態によれば、最終組成物中のポリペプチド濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチド配列は、配列番号８６に記載されている。

いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドは、配列番号８５に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる。

いくつかの具体的な実施形態によれば、該プロセスは、以下の工程を含む：
ｉ．組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０ｍＭのグリシンを含み、約９．５のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤（尿素、チオ尿素及びβ−メルカプトエタノール）の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．０．５Ｍのアルギニン緩衝液を徐々に添加することを含む限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に該懸濁液を供する工程；並びに
ｉｖ．該懸濁液を緩衝液交換に供し、約２．５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．２Ｍのアルギニン及び約２０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、約６のｐＨを有する最終組成物を得る工程。

さらに別の態様によれば、本発明は、組換え多量体マルチエピトープポリペプチドの実質的に安定な水性懸濁液を生成するプロセスであって、以下の工程を含むプロセスを提供する：
ｉ．組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５〜５０ｍＭのグリシンを含み、７〜１０の範囲のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．アルギニン緩衝液又はクエン酸緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に該懸濁液を供する工程；並びに
ｉｖ．該懸濁液を緩衝液交換に供し、約１〜５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．１〜０．５Ｍのアルギニン及び約１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、４〜７の範囲のｐＨを有する安定で均一な最終懸濁液を得る工程。

いくつかの実施形態によれば、該プロセスは、以下の工程を含む；
ｉ．組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０ｍＭのグリシンを含み、約９．５のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．０．１〜１Ｍのアルギニン緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に該懸濁液を供する工程；並びに
ｉｖ．該懸濁液を緩衝液交換に供し、約１〜５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．１〜０．５Ｍのアルギニン及び約１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、４〜７の範囲のｐＨを有する最終懸濁液を得る工程。

他の実施形態によれば、約２．５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．２Ｍのアルギニン及び約２０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、約６のｐＨを有する最終懸濁液が、工程（ｉｖ）において得られる。

他の実施形態によれば、該プロセスは、以下の工程を含む：
ｉ．組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのグリシンを含み、約８．０のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．２０〜８０ｍＭのクエン酸緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に該懸濁液を供する工程；並びに
ｉｖ．該懸濁液をアルギニン含有溶液での希釈に供し、約１〜５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．１〜０．５Ｍのアルギニン及び約１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、４〜７の範囲のｐＨを有する均一な最終微粒子懸濁液を得る工程。

他の実施形態によれば、約２．５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．２Ｍのアルギニン及び約２０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、約６のｐＨを有する安定で均一な最終微粒子懸濁液が、工程（ｉｖ）において得られる。

いくつかの実施形態によれば、該最終微粒子懸濁液は、０．５〜５０μｍの範囲内の凝集体サイズ分布を含み、該凝集体の９５％のサイズは一桁の範囲内に入る。

いくつかの実施形態によれば、最終微粒子懸濁液中の凝集体の９５％は、０．５〜５μｍ、１〜１０μｍ、３〜３０μｍ及び５〜５０μｍからなる群から選択されるサイズ分布を有する。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

本発明はさらに、本明細書に詳述したプロセスのいずれかに従って生成した医薬組成物を提供する。

本発明による多量体ポリペプチドは、複数のインフルエンザウイルスペプチドエピトープを含み、各エピトープは単一ポリペプチド中に少なくとも２倍存在する。本発明の文脈において、「多量体」ポリペプチドは、必ずしも隣接してはいない、ポリペプチドのアミノ酸ストレッチのリピートを複数（少なくとも２個、典型的には、少なくとも３個又はそれ以上）含有するポリペプチドである。したがって、「多量体マルチエピトープ」という用語は、複数のエピトープの複数リピートを含有するポリペプチドに関する。該多量体マルチエピトープポリペプチドは、単離されたポリペプチドとして、又は融合タンパク質として、組換えにより生成することができる。該ポリペプチド凝集体は、それだけで使用するか、又は追加のアジュバントと混合するか、又は追加のアジュバントで製剤化することができる。

本発明の医薬組成物及びワクチン組成物中に含まれる多量体マルチエピトープポリペプチドは、インフルエンザウイルスＢ細胞エピトープ、Ｔヘルパーエピトープ、及び細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）エピトープの組み合わせを含む。該エピトープは、好ましくは、血球凝集素タンパク質（ＨＡ）ペプチド、マトリックスタンパク質（Ｍ１及び／又はＭ２）ペプチド、及び核タンパク質（ＮＰ）ペプチドの保存された（非超可変）領域から選択される。該エピトープは、好ましくは、いくつかのヒトインフルエンザサブタイプに対して実証可能な交差反応活性を有し、細胞性及び体液性免疫応答を誘導するそれらの改善された能力について選択される。

他の実施形態によれば、本発明による組成物中に含まれる多量体ポリペプチド内のインフルエンザペプチドエピトープは、配列番号１〜配列番号８２からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの具体的な実施形態によれば、該インフルエンザペプチドエピトープは、エピトープＥ１〜Ｅ９（配列番号８２、４８、２５、５２、５１、５９、８９、６９及び７０）から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの具体的な実施形態によれば、多量体マルチエピトープポリペプチドは、ブロック共重合体構造又は交互連続重合体構造で配置された４〜９個のエピトープの３〜５個のリピートを含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

さらに他の実施形態によれば、本発明による医薬組成物中に含まれる多量体ポリペプチド配列は、配列番号８４、配列番号８６、及び配列番号８８からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

本発明による医薬組成物は、筋肉内、鼻腔内、経口、腹腔内、皮下、局所、皮内、及び経皮送達からなる群から選択される経路を介して投与することができる。

特定の実施形態によれば、該医薬組成物は、鼻腔内、筋肉内又は皮内に投与される。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物中に含まれる多量体ポリペプチドは、担体又は融合タンパク質と結合しておらず、かつそれらを欠く。他の実施形態において、本発明の医薬組成物中に含まれるポリペプチドは、さらに担体配列を含むことができ、すなわち、該ペプチドエピトープは担体ポリペプチドの配列内に挿入されるか、又は担体配列と結合している。

いくつかの実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、アジュバントを含まない。他の実施形態によれば、該ワクチンは、さらに薬学的に許容されるアジュバントを含む。

薬学的に許容されるアジュバントとしては、油中水型エマルジョン、脂質エマルジョン、又はサブミクロンの水中油型エマルジョン及びリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態によれば、アジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）、ミョウバン、ムラミルジペプチド、Ｇｅｌｖａｃ（登録商標）、キチン微粒子、キトサン、コレラ毒素サブユニットＢ、イントラリピド（登録商標）、リポフンディン（登録商標）もしくは細菌脂質、リポタンパク質、及び／又は膜タンパク質からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、該ワクチンは、筋肉内、鼻腔内、経口、腹腔内、皮下、局所、皮内及び経皮送達用に製剤化される。いくつかの実施形態において、該ワクチンは、鼻腔内に投与される。他の実施形態において、該ワクチンは筋肉内に投与される。さらに他の実施形態において、該ワクチンは、皮内に投与される。

本発明は、さらなる態様によると、対象において免疫応答を誘導し、インフルエンザに対する防御を付与する方法であって、上記の医薬組成物をワクチン形態で該対象に投与することを含む方法を提供する。

インフルエンザに対する免疫のための、本発明によるワクチン組成物の使用も、本発明の範囲内である。本発明によるワクチン組成物は、独立型ワクチンとして、又は季節性もしくはパンデミックインフルエンザワクチンとの同時投与を含むワクチン接種レジメンの一部として投与することができる。本発明による同時投与は、多量体ポリペプチドと季節性もしくはパンデミックワクチンの両方が１種類の組み合わせ組成物中に含まれるか、又はそれらが２つの別々の予防接種で、少なくとも２４時間の間隔をあけて患者に投与されるかのいずれかを包含する。

いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含むワクチン組成物は、季節性又はパンデミックインフルエンザワクチンと同時投与される。

本発明の組成物中に含まれる複数のインフルエンザウイルスペプチドエピトープを含む多量体マルチエピトープポリペプチドは、組換えタンパク質として、融合タンパク質として、及び化学合成により生成することができる。

本発明は、さらに、少なくとも１種類の多量体インフルエンザポリペプチド及び少なくとも１種類の従来の季節性又はパンデミックインフルエンザ組成物の組み合わせを含む医薬組成物を提供する。従来の季節性ワクチン（ＴＩＶ）は、典型的には、これからの季節に感染することが期待される株に対する防御を提供するために、ＷＨＯが毎年選択する３種類の不活性化又は生きている弱毒化インフルエンザウイルス株を含有している。パンデミックワクチンは、典型的には、パンデミックを引き起こす関連株に特異的な１種類のインフルエンザウイルス株を含む。

本発明のさらなる実施形態及び適用性の完全な範囲は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の趣旨及び範囲内の種々の変更及び修正は、この詳細な説明から当業者に明らかとなるので、本発明の特定の実施形態を示す発明を実施するための形態及び具体的な実施例は、単なる例示として与えられることを理解されたい。

多量体マルチエピトープポリペプチドインフルエンザワクチンの改良された医薬組成物及びそれらの生成方法を本明細書に提供する。これらの医薬組成物は、安定性が改善されている。多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む以前の組成物は、リン酸緩衝生理食塩水をベースにしていたが、生成が困難であり、再凝集する傾向があったが、本発明は、アルギニンアミノ酸又はその誘導体、及びクエン酸緩衝液を含む安定な懸濁液組成物及びそれらの生成のための改善されたプロセスを提供する。

以前から知られている調製方法では、ポリペプチドの凝集は、塩基性から中性のｐＨへのｐＨシフトによって誘導され、巨大アモルファス凝集物の生成をもたらし、これは注射可能な形態に変換するのに高圧均質化を必要としていた。本発明は、アルギニンアミノ酸を添加するとともに、ポリペプチド溶液からカオトロピック剤及び還元剤を除去する間に、タンパク質凝集体の生成を調節することによってこれらの制限を克服し、多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドの安定で均一な微粒子懸濁液を得るというものである。

多量体マルチエピトープポリペプチド
本発明によるワクチン及び方法で使用される多量体ポリペプチドは、各エピトープの少なくとも２個のリピートを含む。本発明による多量体ポリペプチドは、いくつかの特定の実施形態によれば、各エピトープの少なくとも３個のリピートを含む。季節性又はパンデミックワクチンと、複数のインフルエンザウイルスペプチドエピトープを含む少なくとも１種類の多量体マルチエピトープポリペプチドを含むワクチン組成物も提供される。

表１から選択されるインフルエンザエピトープを含む多量体ワクチンであって、各エピトープのリピートの数が同一か又は異なっており、該ポリペプチドを交互連続重合体構造又はブロック共重合体構造で配置することができる多量体ワクチンについての種々の例示的な実施形態が提供される。「交互連続重合体」構造という用語は、ポリペプチドに含まれる全てのエピトープの単一コピーが連続配置されており、この配置がリピート数に等しい回数分連続して繰り返されることを意味する。例えば、該多量体マルチエピトープポリペプチドは、交互連続構造中に３つのエピトープＸ_１、Ｘ_２及びＸ_３の４個のリピートを含む場合、該ポリペプチドは、以下の重合体構造：［Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３］_４とも書かれるＸ_１Ｘ_２Ｘ_３−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３を有する。「ブロック共重合体」構造という用語は、ポリペプチド中に含まれる単一エピトープの全コピーが隣接して配置されることを意味する。例えば、ブロック共重合体構造中の３つのエピトープＸ_１、Ｘ_２及びＸ_３の４個のリピートを含む類似の多量体マルチエピトープポリペプチドは、以下の重合体構造：［Ａ］_４−［Ｂ］_４−［Ｃ］_４とも書かれるＸ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１−Ｘ_２Ｘ_２Ｘ_２Ｘ_２−Ｘ_３Ｘ_３Ｘ_３Ｘ_３を有する。

本発明による医薬組成物に使用される合成又は組換えインフルエンザマルチエピトープポリペプチドは、以下からなる群から選択される：
ｉ．Ｂ（Ｘ_１ＺＸ_２Ｚ…Ｘ_ｍ）_ｎＢ；及び
ｉｉ．Ｂ（Ｘ_１）_ｎＺ（Ｘ_２）_ｎＺ…（Ｘ_ｍ）_ｎＢ；
式中、Ｂは０〜４個のアミノ酸残基の配列を表し；ｎは、各出現時に、独立に２〜５０の整数であり；ｍは３〜５０の整数であり；Ｘ_１、Ｘ_２…Ｘ_ｍの各々は、４〜２４個のアミノ酸残基からなるインフルエンザペプチドエピトープであり；Ｚは、各出現時に、結合又は１〜４アミノ酸残基のスペーサーであり；該ポリペプチド中のアミノ酸残基の最大数は約１０００である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの実施形態によれば、ｎは、各出現時に、独立に２〜５０の整数であり；ｍは３〜１５の整数であり；Ｘ_１〜Ｘ_ｍの各々は、４〜２４個のアミノ酸残基からなる、Ｂ細胞型エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）型エピトープ、及び細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）型エピトープからなる群から選択されるインフルエンザペプチドエピトープである。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

さらに他の実施形態によれば、ｎは、各出現時に、独立に２〜１５の整数であり、ｍは３〜１２の整数である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの具体的な実施形態によれば、ｍは４〜９の整数であり、ｎは３〜５の整数である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの具体的な実施形態によれば、ｍは９であり、ｎは３である。

他の実施形態によれば、本発明の医薬組成物中に含まれる多量体ポリペプチドのインフルエンザペプチドエピトープは、ヘマグルチニン（ＨＡ）ペプチド、Ｍ１ペプチド、Ｍ２ペプチド、及び核タンパク質（ＮＰ）ペプチドからなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

他の実施形態によれば、本発明による組成物中に含まれる多量体ポリペプチド内のインフルエンザペプチドエピトープは、配列番号１〜配列番号８２（表１に示されている）からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの具体的な実施形態によれば、該インフルエンザペプチドエピトープは、表２に詳述するエピトープＥ１〜Ｅ９（配列番号８２、４８、２５、５２、５１、５９、８９、６９及び７０から選択される。

本明細書に記載のペプチドエピトープは、単なる例示目的のために提供されることに留意されたい。インフルエンザウイルスタンパク質は、単離体間で変化し、それによって各インフルエンザタンパク質に多数の変異型配列を提供する。したがって、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を有するペプチドエピトープを包含する。

より具体的な実施形態によれば、本発明によるワクチン医薬組成物中に含まれる多量体ポリペプチド中に含まれるインフルエンザペプチドエピトープは、ＨＡ ３５４〜３７２（Ｅ１、配列番号８２）、ＨＡ ９１〜１０８（Ｅ２、配列番号４８）、Ｍ１ ２〜１２（Ｅ３、配列番号２５）、ＨＡ １５０〜１５９（Ｅ４、配列番号５２）、ＨＡ １４３〜１４９（Ｅ５、配列番号５１）、ＮＰ ２０６〜２２９（Ｅ６、配列番号６４）、ＨＡ ３０７〜３１９（Ｅ７、配列番号５９又は８９）、ＮＰ ３３５〜３５０（Ｅ８、配列番号６９）、及びＮＰ ３８０〜３９３（Ｅ９、配列番号７０）からなる。

さらに他の実施形態によれば、本発明による医薬組成物中に含まれる多量体ポリペプチド配列は、配列番号８４、配列番号８６、及び配列番号８８からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

さらに他の実施形態によれば、本発明による医薬組成物中に含まれる多量体ポリペプチド配列は、配列番号８３、配列番号８５、及び配列番号８７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、ブロック共重合体構造又は交互連続重合体構造に配置された５〜９個のエピトープの３〜５個のリピートを含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

本発明の医薬組成物は、以下のブロック共重合体構造［Ｅ１Ｅ１Ｅ１−Ｅ２Ｅ２Ｅ２−Ｅ３Ｅ３Ｅ３−Ｅ４Ｅ４Ｅ４−Ｅ５Ｅ５Ｅ５−Ｅ６Ｅ６Ｅ６−Ｅ７Ｅ７Ｅ７−Ｅ８Ｅ８Ｅ８−Ｅ９Ｅ９Ｅ９］に配置された９種類の異なるインフルエンザウイルスペプチドエピトープの３個のリピートを含み、その中で、Ｅ１はＨＡ ３５４〜３７２（配列番号８２）であり、Ｅ２はＨＡ ９１〜１０８（配列番号４８）であり、Ｅ３はＭ１ ２〜１２（配列番号２５）であり、Ｅ４はＨＡ １５０〜１５９（配列番号５２）であり、Ｅ５はＨＡ １４３〜１４９（配列番号５１）であり、Ｅ６はＮＰ ２０６〜２２９（配列番号６４）であり、Ｅ７はＨＡ ３０７〜３１９（配列番号５９又は８９）であり、Ｅ８はＮＰ ３３５〜３５０（配列番号６９）であり、かつＥ９はＮＰ ３８０〜３９３（配列番号７０）である。

他の実施形態によれば、該多量体ポリペプチドは、以下の交互連続重合体構造［Ｅ１Ｅ２Ｅ３Ｅ４Ｅ５Ｅ６Ｅ７Ｅ８Ｅ９］_ｎに配置された９種類の異なるインフルエンザウイルスペプチドエピトープを含み、ｎは３〜５であり、Ｅ１はＨＡ ３５４〜３７２（配列番号８２）であり、Ｅ２はＨＡ ９１〜１０８（配列番号４８）であり、Ｅ３はＭ１ ２〜１２（配列番号２５）であり、Ｅ４はＨＡ １５０〜１５９（配列番号５２）であり、Ｅ５はＨＡ １４３〜１４９（配列番号５１）であり、Ｅ６はＮＰ ２０６〜２２９（配列番号６４）であり、Ｅ７はＨＡ ３０７〜３１９（配列番号５９又は８９）であり、Ｅ８はＮＰ ３３５〜３５０（配列番号６９）であり、かつＥ９はＮＰ ３８０〜３９３（配列番号７０）である。

さらに他の実施形態によれば、該多量体ポリペプチドは、以下の交互連続重合体構造［Ｅ１Ｅ２Ｅ３Ｅ４Ｅ５］_６で配置された５種類の異なるＢ細胞型インフルエンザウイルスペプチドエピトープの６個のリピートを含み、Ｅ１はＨＡ ３５４〜３７２（配列番号８２）であり、Ｅ２はＨＡ ９１〜１０８（配列番号４８）であり、Ｅ３はＭ１ ２〜１２（配列番号２５）であり、Ｅ４はＨＡ １５０〜１５９（配列番号５２）であり、Ｅ５はＨＡ １４３〜１４９（配列番号５１）である。

他の実施形態によれば、該多量体ポリペプチドは、以下の交互連続重合体構造［Ｅ７Ｅ８Ｅ９Ｅ６］_６で配置された４種類の異なるＴ細胞型インフルエンザウイルスペプチドエピトープの６個のリピートを含み、Ｅ６はＮＰ ２０６〜２２９（配列番号６４）であり、Ｅ７はＨＡ ３０７〜３１９（配列番号５９又は８９）であり、Ｅ８はＮＰ ３３５〜３５０（配列番号６９）であり、かつＥ９はＮＰ ３８０〜３９３（配列番号７０）である。

追加の実施形態によれば、該多量体ポリペプチドは、以下のブロック共重合体構造［Ｅ２Ｅ２Ｅ２Ｅ２Ｅ２Ｅ２−Ｅ１Ｅ１Ｅ１Ｅ１Ｅ１Ｅ１−Ｅ３Ｅ３Ｅ３Ｅ３Ｅ３Ｅ３−Ｅ４Ｅ４Ｅ４Ｅ４Ｅ４Ｅ４−Ｅ５Ｅ５Ｅ５Ｅ５Ｅ５Ｅ５−Ｅ６Ｅ６ＥＥ６Ｅ６Ｅ６−Ｅ７Ｅ７Ｅ７Ｅ７Ｅ７Ｅ７−Ｅ８Ｅ８Ｅ８Ｅ８Ｅ８Ｅ８−Ｅ９Ｅ９Ｅ９Ｅ９Ｅ９Ｅ９］に配置された９種類の異なるインフルエンザウイルスペプチドエピトープの６個のリピートを含み、Ｅ１はＨＡ ３５４〜３７２（配列番号８２）であり、Ｅ２はＨＡ ９１〜１０８（配列番号４８）であり、Ｅ３はＭ１ ２〜１２（配列番号２５）であり、Ｅ４はＨＡ １５０〜１５９（配列番号５２）であり、Ｅ５はＨＡ １４３〜１４９（配列番号５１）であり、Ｅ６はＮＰ ２０６〜２２９（配列番号６４）であり、Ｅ７はＨＡ ３０７〜３１９（配列番号５９又は８９）であり、Ｅ８はＮＰ ３３５〜３５０（配列番号６９）であり、かつＥ９はＮＰ ３８０〜３９３（配列番号７０）である。

様々な実施形態において、該多量体ポリペプチドは、各エピトープの少なくとも２個のリピート、典型的には、各エピトープの少なくとも３個のリピート、あるいは各エピトープの少なくとも４個のリピート、あるいは少なくとも５個のリピート、あるいは少なくとも６個のリピート、各エピトープの最大少なくとも５０個のリピートを含む。免疫系へのエピトープの暴露を改善するために、該エピトープは、特定の実施形態によれば、単一のアミノ酸からなり、他の実施形態によれば、２〜６個のアミノ酸を含むスペーサーによって分離することができる。いくつかの具体的な実施形態によれば、該スペーサーは、１〜４個の中性アミノ酸残基からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

いくつかの実施形態によれば、医薬組成物中に含まれる多量体ポリペプチド内のペプチドエピトープは、結合、アミノ酸、及び２〜６個のアミノ酸を含むペプチドからなる群から選択されるスペーサーによって連結されている。

いくつかの実施形態によれば、該スペーサーの少なくとも１個のアミノ酸は、該ポリペプチドのセグメント（例えば、プロリン残基）上での特定のコンホメーションを誘導する。

さらに他の実施形態によれば、該スペーサーは、切断可能な配列を含む。一実施形態によれば、該切断可能なスペーサーは、細胞内酵素によって切断される。より具体的な実施形態によれば、該切断可能なスペーサーは、プロテアーゼ特異的切断可能配列を含む。

懸濁液を生成するプロセス
「不溶性」封入体の可溶化
２種類の異なる大腸菌株内で形成された組換え多量体マルチエピトープポリペプチドの封入体は、おそらく疎水性相互作用のために、限られた溶解性を示した。８Ｍの尿素緩衝液に５０ｍＭのβＭＥを補う標準的な手順は、中性ｐＨで封入体を可溶化しなかった。非イオン性又は両性イオン性界面活性剤の添加は、緩衝液の性能を改善しなかった。アニオン性界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）の添加は、封入体の完全な可溶化を可能にしたが、この方法は、以下の精製工程でＳＤＳ干渉により不向きである。最初に、８Ｍの尿素緩衝液で封入体を可溶化するために、塩基性（１２）のｐＨを使用した。その後、驚くべきことに、膜タンパク質の可溶化のために通常使用される緩衝液を変更し、より低いｐＨ（８〜９．５）で封入体を可溶化するために使用できることが判明した。６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、５０ｍＭのβＭＥ、５０ｍＭのグリシン、及び約９．５のｐＨを含む溶液を用いて、封入体の完全な可溶化を達成した。

限外濾過及び凝集体形成
本発明によれば、該多量体マルチエピトープポリペプチドの生成プロセスにおいて、緩衝液交換後に最終組成物中で使用するのに適する１〜５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でタンパク質凝集体の生成を調節するための、カオトロピック剤（例えば、尿素及びチオ尿素）及び還元剤（例えば、βＭＥ）の段階的除去、並びにアルギニンの段階的添加のために限外濾過が使用される。

アルギニン安定化効果
アルギニンは、本発明によれば、当技術分野で説明されているように、凝集体形成を防止することには使用されないが、タンパク質微粒子のサイズの低下及び均一性の増加のために使用される。限外濾過緩衝液交換プロセスを介して封入体を可溶化するために、高濃度（約０．２〜１Ｍ）のアルギニン緩衝液が徐々に添加される。０．１〜０．５Ｍの最終アルギニン濃度は、さらなる緩衝液交換によって達成される。

懸濁液組成物
Ａｋｅｒｓら（Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，４１，８８〜９６，１９８７）によって開示されているように、医薬品懸濁液を調製する基本的な理由は次のとおりである：
１．ペプチド又はタンパク質の溶解度は、溶液製剤を妨げる。
２．ペプチド又はタンパク質の安定性は、懸濁液製剤中で改善される。
３．ペプチドもしくはタンパク質の放出プロファイルを調節するか、又は遅延することが望ましい。

ペプチド又はタンパク質懸濁液製剤の開発のために考慮することができる、粒子生成のための少なくとも４つのアプローチがある：
１．懸濁液は、排他的にビヒクル中の結晶性材料で構成される。
２．懸濁液は、排他的にビヒクル中のアモルファス材料で構成される。
３．懸濁液は、ビヒクル中の結晶性材料とアモルファス材料の混合物を含有する。
４．懸濁液は、懸濁液相と溶液相の両方に有効成分を含有する。

無菌の粉末を生成する少なくとも４つの方法として、結晶化、凍結乾燥、噴霧乾燥、及び超臨界流体粒子形成が挙げられる。高負荷条件下で変性するペプチド及びタンパク質の傾向を考慮すると、結晶化及び凍結乾燥は、より一般的に、このクラスの化合物に適用可能である。これら２つの方法はまた、乾燥した材料の無菌性を維持する能力が証明されている。噴霧乾燥法は、液体−空気界面で、又は溶媒蒸発させるのに必要な高い温度から変性をもたらし得るが、この技術は、高次構造を欠く小ペプチドに適し得る。

任意の必要な賦形剤を含有する水性又は非水性ビヒクルは、粒子形成から別々に調製される。非水性ビヒクルの例としては、ゴマ油、ピーナッツ、又は他の植物油などの、任意の高度に精製された天然又は合成の油が挙げられる。成分の溶解性及びビヒクルの全体的な粘度に応じて、滅菌は、濾過又はオートクレーブのいずれかによって達成することができる。無菌の組み合わせアプローチは、粒子成長が独立して達成されるので、ビヒクル（水性又は非水性）の選択においてより高い順応性を提供する。各部の処理が完了すると、乾燥粒子及びビヒクルは無菌的に組み合わされる。ある形態の攪拌が、粒子の均一な分散を達成するのに必要とされる。ペプチド又はタンパク質の場合には、分散プロセスが変性又は他の物理的変化をもたらさないことを保証するために、適切な調節が実施されるべきである。

本発明は、精製された組換え多量体マルチエピトープポリペプチド懸濁液の生成プロセスであって、以下の工程を含むプロセスを提供する：
ｉ．少なくとも１種類の多量体マルチエピトープポリペプチドを含有する封入体を、カオトロピック剤、緩衝剤、及び還元剤を含み、７〜１１の範囲のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって調節される凝集を誘導し、その結果、不溶性凝集体懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．アルギニンを添加して、凝集体の９５％のサイズが一桁のサイズの範囲内に入る、均一な凝集体サイズ分布を有する安定で均一な懸濁液を得る工程。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｉ）のｐＨは７〜１０の範囲内にある。

いくつかの実施形態によれば、該カオトロピック剤は、尿素、チオ尿素、又はそれらの組み合わせである。

具体的な実施形態によれば、該カオトロピック剤は、５〜８Ｍの尿素及び１〜４Ｍのチオ尿素を含む。

特定の実施形態によれば、工程（ｉｉ）のカオトロピック剤及び還元剤の段階的除去は、限外濾過により行われる。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｉ）のＣＨＡＰＳは、０．５〜２％の濃度で存在する。

いくつかの実施形態によれば、該プロセスは、以下の工程を含む：
ｉ．少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを発現する大腸菌細胞を提供する工程；
ｉｉ．溶解及び細菌細胞破壊を行い、多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を提供する工程；
ｉｉｉ．７〜１１の範囲のｐＨで、５〜８Ｍの尿素、１〜４Ｍのチオ尿素、０．５〜４％のＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、緩衝剤、及び還元剤を含む溶液で該封入体を可溶化する工程；
ｉｖ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって調節される凝集を誘導し、その結果、不溶性凝集体懸濁液を形成する工程；
ｖ．アルギニンを添加して、凝集体の９５％が一桁のサイズの範囲内に入る、均一な凝集体サイズ分布を有する安定で均一な懸濁液を得る工程。

いくつかの実施形態によれば、カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去は、当技術分野で公知の手順を用いて限外濾過により行われる。

いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのクロマトグラフィー分離工程は、工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の間で行われる。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのクロマトグラフィー分離工程は、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）の凝集体形成前に行われる。

他の実施形態によれば、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）の凝集体形成中に行われる。

さらに他の実施形態によれば、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）の凝集体形成後に行われる。

いくつかの実施形態によれば、該プロセスは、以下を含む：
ｉ．少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを発現する大腸菌細胞を提供する工程；
ｉｉ．大腸菌細胞の溶解、細菌細胞破壊及び遠心分離を行い、多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を提供する工程；
ｉｉｉ．該封入体の少なくとも１回の洗浄を行う工程；
ｉｖ．５〜８Ｍの尿素、１〜４Ｍのチオ尿素、０．５〜４％のＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、還元剤及び７〜１０の範囲のｐＨを提供する緩衝剤を含む溶液で該封入体を可溶化する工程；
ｖ．少なくとも１つのクロマトグラフィー工程に該溶液を供する工程；
ｖｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって調節される凝集を誘導することによって、不溶性凝集体を形成する工程；
ｖｉｉ．グアニジニウム含有化合物を添加する工程；並びに
ｖｉｉｉ．（ｖｉｉ）の組成物を製剤化して、４〜８の範囲のｐＨの、約０．１〜０．４Ｍのグアニジニウム含有アミノ酸及び１０〜４０ｍＭのクエン酸緩衝液の最終懸濁液を得る工程。

他の実施形態によれば、ステップ（ｖｉｉ）のグアニジニウム含有化合物の添加は、調節された凝集の誘導中に徐々に行われる。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｉｉ）の細菌細胞破壊は、高圧均質化により行われる。

他の実施形態によれば、細菌細胞破壊は、超音波処理することにより行われる。

いくつかの実施形態によれば、溶解は、７〜９の範囲のｐＨで、トリス緩衝液、ＥＤＴＡ、及び細胞ペースト１ｇあたり０．１〜０．５ｍｇのリゾチームを含む緩衝液で行われる。

いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｉｖ）の尿素は６〜７Ｍの濃度である。

いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｉｖ）の緩衝剤は、２０〜１００ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳである。

他の実施形態によれば、ステップ（ｉｖ）の緩衝剤は、５〜１００ｍＭの濃度のグリシンである。

いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｉｖ）の還元剤は、２０〜８０ｍＭの濃度のβ−メルカプトエタノールである。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｖｉ）の調節された凝集の誘導は、限外濾過により行われる。

本発明によれば、中空糸タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）カセット、及び攪拌セルを含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の任意の限外濾過法が、使用に適している。

いくつかの実施形態によれば、限外濾過は、以下の工程を含む：
ｉ．ｐＨ４〜６．５の１０〜８０ｍＭのＭＥＳ緩衝液での緩衝液交換Ｉ；
ｉｉ．ｐＨ４〜６の２０〜８０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．１〜１Ｍのアルギニンでの緩衝液交換ＩＩ；
ｉｉｉ．ｐＨ４〜７．５の１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．１〜０．５Ｍのアルギニンでの緩衝液交換ＩＩＩ。

他の実施形態によれば、限外濾過は以下の工程を含む：
ｉ．ｐＨ４〜６．５の１０〜８０ｍＭのＭＥＳ緩衝液での緩衝液交換Ｉ；
ｉｉ．ｐＨ４〜６の２０〜８０ｍＭのクエン酸緩衝液での緩衝液交換ＩＩ；
ｉｉｉ．アルギニン含有溶液での０．１〜１Ｍのアルギニン濃度までの希釈。

いくつかの実施形態によれば、最終組成物中のポリペプチド濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。

さらに他の実施形態によれば、最終組成物中のポリペプチド濃度は１〜４ｍｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチド配列は、配列番号８６に記載されている。

いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドは、配列番号８５に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる。

いくつかの具体的な実施形態によれば、該プロセスは、以下の工程を含む：
ｉ．組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβメルカプトエタノール、５０ｍＭのグリシンを含み、約９．５のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤（尿素、チオ尿素及びβ−メルカプトエタノール）の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．０．５Ｍのアルギニン緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に該懸濁液を供する工程；並びに
ｉｖ．該懸濁液を緩衝液交換に供し、約２．５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．２Ｍのアルギニン及び約２０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、約６のｐＨを有する最終組成物を得る工程。

さらに別の態様によれば、本発明は、組換え多量体マルチエピトープポリペプチドの実質的に安定な水性懸濁液を生成するプロセスであって、以下の工程を含むプロセスを提供する：
ｉ．組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５〜５０ｍＭのグリシンを含み、７〜１０の範囲のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．アルギニン緩衝液又はクエン酸緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に該懸濁液を供する工程；並びに
ｉｖ．該懸濁液を緩衝液交換に供し、約１〜５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．１〜０．５Ｍのアルギニン及び約１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、４〜７の範囲のｐＨを有する安定で均一な最終懸濁液を得る工程。

いくつかの実施形態によれば、工程（ｉ）においてｐＨは８〜１０の範囲にある。

いくつかの実施形態によれば、該プロセスは、以下の工程を含む；
ｉ．組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０ｍＭのグリシンを含み、約９．５のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．０．１〜１Ｍのアルギニン緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に該懸濁液を供する工程；並びに
ｉｖ．該懸濁液を緩衝液交換に供し、約１〜５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．１〜０．５Ｍのアルギニン及び約１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、４〜７の範囲のｐＨを有する最終懸濁液を得る工程。

いくつかの具体的な実施形態によれば、工程（ｉｉｉ）において、０．５Ｍのアルギニン緩衝液が添加される。

他の実施形態によれば、約２．５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．２Ｍのアルギニン及び約２０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、約６のｐＨを有する最終懸濁液は、工程（ｉｖ）において得られる。

他の実施形態によれば、該プロセスは、以下の工程を含む：
ｉ．組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのグリシンを含み、約８．０のｐＨを有する溶液で可溶化する工程；
ｉｉ．カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
ｉｉｉ．２０〜８０ｍＭのクエン酸緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に該懸濁液を供する工程；並びに
ｉｖ．該懸濁液をアルギニン含有溶液での希釈に供し、約１〜５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．１〜０．５Ｍのアルギニン及び約１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、４〜７の範囲のｐＨを有する均一な最終微粒子懸濁液を得る工程。

いくつかの具体的な実施形態によれば、工程（ｉｉｉ）において、５０ｍＭのクエン酸緩衝液が添加される。

他の実施形態によれば、約２．５ｍｇ／ｍｌの該ポリペプチド、約０．２Ｍのアルギニン及び約２０ｍＭのクエン酸緩衝液を含み、約６のｐＨを有する安定で均一な最終微粒子懸濁液は、工程（ｉｖ）において得られる。

いくつかの実施形態によれば、最終微粒子懸濁液は、０．５〜５０μｍの範囲内に凝集体サイズ分布を含み、該凝集体の９５％のサイズは一桁の範囲内に入る。

いくつかの実施形態によれば、最終微粒子懸濁液中の凝集体の９５％は、０．５〜５μｍのサイズ分布を有する。

いくつかの実施形態によれば、最終微粒子懸濁液中の凝集体の９５％は、１〜１０μｍのサイズ分布を有する。

いくつかの実施形態によれば、最終微粒子懸濁液中の凝集体の９５％は、３〜３０μｍのサイズ分布を有する。

いくつかの実施形態によれば、最終微粒子懸濁液中の凝集体の９５％は、５〜５０μｍのサイズ分布を有する。

定義
便宜上、本明細書、実施例及び特許請求の範囲において使用するいくつかの用語を、ここに記載する。

本発明による多量体マルチエピトープポリペプチドは、複数のインフルエンザウイルスペプチドエピトープの複数コピーを含むポリペプチドを意味する。

「免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」又は「免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）」という用語は、免疫応答を刺激するか、又は誘発する物質の能力に関する。免疫原性は、例えば、物質に特異的な抗体の存在を決定することによって測定される。抗体の存在は、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＨＡＩアッセイを使用して、当技術分野で公知の方法によって検出される。

インフルエンザエピトープは、それらが誘発する免疫応答のタイプに応じて、Ｂ細胞型、Ｔ細胞型又はＢ細胞型とＴ細胞型の両方に分類することができる。Ｂ細胞又はＴ細胞のペプチドエピトープの定義は明確ではなく、例えば、ペプチドエピトープは、抗体産生を誘発することができるが、同時にそのエピトープは、ヒトＨＬＡ分子に結合可能な配列を有し、その分子をＣＴＬ又はＴｈ細胞にアクセスさせることで、その特定のエピトープについてのデュアルＢ細胞及びＴ細胞分類を可能にする。「ＣＴＬ」、「キラーＴ細胞」又は「細胞傷害性Ｔ細胞」は、ウイルス感染及び癌細胞に対する防御において機能する特定の外来抗原を有する標的細胞を認識し、溶解する分化したＴ細胞のグループである。「Ｔヘルパー細胞」すなわち「Ｔｈ」は、特異的抗原によって刺激された場合に、Ｂ細胞及びキラーＴ細胞の活性化並びに機能を促進するサイトカインを放出する任意のＴ細胞である。

本明細書で使用される「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列、及びその断片、並びに天然に存在するか、又は合成の分子を指す。

本明細書及び特許請求の範囲において、「スペーサー」という用語は、末端の一方又は２つのエピトープ間において、ポリペプチド配列中に存在し得る任意の化学化合物を意味する。いくつかの実施形態によれば、該スペーサーは１〜４個のアミノ酸残基からなる。該スペーサーは、酵素的手段によって切断され得る配列を含むことができるか、又は自然に分解することができる。該スペーサーは、ポリペプチドを有益なコンホメーションにするか、又はそのコンホメーションを誘導することができる。該スペーサーは、必要に応じて、プロテアーゼ特異的に切断可能な配列を含むことができる。

「不溶性」という用語は、本明細書では、水性懸濁液中に存在する場合に肉眼で見えるという特性として定義される。「不溶性」粒子は、沈殿させるか、又は水性懸濁液の遠心分離の際に回収することができる。

「懸濁液」という用語は、本明細書では、上記で定義されるような「不溶性」粒子成分を含む水性媒体として定義される。

「微粒子」という用語は、本明細書では、０．１〜１００μｍサイズの「不溶性」タンパク質凝集体として定義される。いくつかの実施形態によれば、本発明の微粒子は、０．５〜５０μｍのサイズの範囲内にある。

「溶液」という用語は、本明細書では、上記で定義されるような「不溶性」粒子を実質的に含まない水性媒体として定義される。

「均一性」は、本明細書では、例えば、ＬＵＭｉＳｉｚｅｒ懸濁液アナライザー（ＬＵＭ ＧｍｂＨ）によって試験されるパラメータによって測定されるように、凝集体のサイズ分布によって定義される。均一な懸濁液は、本明細書では、凝集体の９５％のサイズが一桁の範囲内に入る凝集体サイズ分布を有するものとして定義される。

均一な微粒子懸濁液は、凝集体の９５％のサイズが一桁の範囲内（例えば、０．１〜１μｍ、１〜１０μｍ、３〜３０μｍ、９〜９０μｍなど）に入る均一な凝集体サイズ分布を有する、「不溶性」タンパク質凝集体（微小粒子として上記で定義される）を含む水性媒体である。

本発明による、均一な微粒子懸濁液中に含まれる粒径分布は狭い。本明細書で使用する「狭い粒径分布」という用語は、粒子の９０％超が平均（ｍｅａｎ）（すなわち平均（ａｖｅｒａｇｅ））粒径の０．２〜２倍の範囲に粒径を有する分布を指す。好ましくは、粒子の９５％超がこの範囲内に粒径を有する。さらにより好ましくは、粒子の９９％超がこの範囲内に粒径を有する。したがって、５μｍの粒径では、狭いサイズ分布は、粒子の９０％、９５％又は９９％超が１〜１０μｍの範囲に粒径を有する分布を指す。

微粒子は、形状が実質的に球状又は楕円体であるが、不規則な形状を含む粒子の非球形状もあり得る。球状粒子では、サイズは直径を表し、非球状粒子では、サイズは平均粒子の最長寸法を表す。

本発明の原理によれば、本明細書中で使用される平均粒径は、沈降流分画、光子相関分光法、光散乱、電子散乱、及びディスク遠心分離などを含むが、これらに限定されない当業者に公知の技術を用いて決定することができる平均粒子径を指す。いくつかの実施形態によれば、凝集体サイズ分布はＬＵＭｉＳｉｚｅｒ懸濁液アナライザー（ＬＵＭ ＧｍｂＨ）又は任意の対応する装置を用いて決定される。

「安定性」は、本明細書では、凝集体サイズが均一に分布したままの状態として定義される。

カオトロピック剤は、変性剤、すなわち、疎水性効果を弱めることにより、水分子間の水素結合ネットワークを破壊し、高分子（例えば、本発明中のタンパク質）の天然状態の安定性を低下させることができる化合物である。

本発明によるグアニジニウム含有アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸又はその誘導体を含むが、これらに限定されない。Ｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ又はそれらの混合物は、本発明に従って使用することができる。

Ｌ−ＡｒｇもしくはＤ−Ａｒｇ、もしくはその誘導体の任意の塩もしくは遊離酸、又はそれらの混合物は、本発明に従って使用することができる。これは、Ａｒｇ塩酸塩、Ａｒｇ硫酸塩、Ａｒｇリン酸塩、Ａｒｇクエン酸塩、Ａｒｇ酢酸塩及びＡｒｇ遊離酸からなる群から選択される化合物を含むが、これに限定されない。

本発明によるＡｒｇ誘導体としては、メチル化アルギニン、置換されたＬ−アルギニン、ニトロ−アルギニン、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、Ｎ−アミノ−Ｌ−アルギニン、Ｎ−メチル−Ｌ−アルギニン、モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＡ）、ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ）、アミノグアニジン、７−ニトロインダゾール、Ｓ−エチルイソチオ尿素、Ｓ−メチルイソチオ尿素、Ｓ−メチルチオシトルリン、Ｓ−エチルチオシトルリン、Ｎ−エチルイミノ−Ｌ−オルニチン、オルニチン及びオルニチン誘導体；Ｌ−カナバニン；シトルリン；Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、４−グアニジノブチル酸；α−Ｎ−置換Ｌ−アルギニン；２−Ｌ−アルギニル−１，３−ベンゾチアゾール−６−カルボン酸；Ｎω−（ＡＤＰ−Ｄ−リボシル）−Ｌ−アルギニン；Ｎω−ホスホ−Ｌ−アルギニン；Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−Ｌ−アルギニン；Ｎ２−スクシニル−Ｌ−アルギニン；Ｄ−ノパリン；Ｄ−オクトピン；Ｌ−アルギニンアミド；Ｌ−アルギニンヒドロキサム酸塩；アルグピリミジン；ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン；メチル−Ｌ−アルギニン；Ｎ−アシル−Ｌ−アルギニン；Ｎ−ベンゾイル−Ｄ−アルギニン；Ｎγ−ニトロ−Ｌ−アルギニン；ペプチジル−Ｌ−アルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態によれば、低コストのアルギニン又はアルギニン誘導体は、比較的低価格の最終生成物を得るために、本発明の組成物のために使用される。

インフルエンザに対する全てのワクチンは、本発明による方法及び組成物において多量体ポリペプチドと組み合わせて使用することができる。「インフルエンザに対するワクチン」という用語には、部分的にもしくは高度に精製されるかもしくは組換え型のインフルエンザタンパク質、不活性化ウイルスもしくは「スプリット生成物」不活性化インフルエンザワクチン生成物、生きている弱毒化ウイルス、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びリポソームを含むが、これらに限定されないインフルエンザエピトープを提示する粒子もしくは担体が含まれるが、これらに限定されない。多量体ポリペプチドと組み合わせて使用されるインフルエンザワクチンは、季節性、パンデミック又はユニバーサルワクチンであり得る。

従来の季節性ワクチンは、典型的には、３種類の不活性化又は生きている弱毒化インフルエンザウイルス株を含み、したがって、ＴＩＶ（三価インフルエンザワクチン）とも呼ばれる。３種類の株は、これからの季節に感染すると予想される株に対する防御を提供するために、ＷＨＯが毎年選択する。

本発明に従って使用することができる特定の季節性ワクチンの非限定的なリストとしては、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（商標）、ＡＧＧＲＩＰＡＬ（商標）、ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＦＬＵＡＤ（商標）、ＭＵＴＡＧＲＩＰ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ ＨＤ（商標）、ＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＬＡＶＡＬ（商標）、ＦＬＵＭＩＳＴ（商標）、ＡＦＬＵＲＩＡ（商標）、ＡＧＲＩＦＬＵ（商標）が挙げられる。

パンデミックワクチンは、典型的には、パンデミックを引き起こす関連株に特異的な１種類のインフルエンザウイルス株を含んでいる。例えば、２００９／２０１０シーズン中に、豚インフルエンザのパンデミックに使用されたＡ／Ｈ１Ｎ１株は、その後、２０１０／２０１１シーズンなどの後の季節性ＴＩＶ製剤に含められた。

他の実施形態によれば、パンデミックワクチンは、ヒト、ブタ又は鳥インフルエンザ株に対するものである。本発明に従って使用することができる特定のパンデミックワクチンの非限定的なリストとしては、ＰＡＮＥＮＺＡ（商標）、ＰＡＮＤＥＭＲＩＸ（商標）、ＨＵＭＥＮＺＡ（商標）、ＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標）、ＣＥＬＶＡＰＡＮ、ＣＥＬＴＵＲＡ（商標）、及びＦＬＵＭＩＳＴ（商標）が挙げられる。

組換えポリペプチド
本発明の多量体マルチエピトープポリペプチドは、発現ベクターでの発現によってそれ自体又はキメラタンパク質として調製することができる。１種類以上のインフルエンザペプチドエピトープを含む組換え又はキメラタンパク質（すなわちポリペプチド、本明細書において互換的に使用される）を生成する方法は、当業者に公知であり、例えば、ＷＯ２００９／０１６６３９に詳述されている。１種類以上のインフルエンザペプチドエピトープをコードする核酸配列は、宿主細胞における増殖及び発現用ポリヌクレオチド構築物の調製のための発現ベクターに挿入することができる。多量体マルチエピトープポリペプチドなどのいくつかのエピトープの複数リピートを含むポリペプチドをコードする核酸構築物は、それらの３’及び５’末端に適切な制限部位を保有するより小さいポリヌクレオチド構築物のライゲーションによって調製することができる。

多量体ポリペプチドの生成
宿主細胞に発現させると、該多量体ポリペプチドは、いくつかのタンパク質精製法によって望ましくない成分から分離することができる。そのような方法の１つは、組換えポリペプチドを原核生物中で発現させた場合に形成し得る、タンパク質の不活性凝集体である封入体の生成を介するものである。ｃＤＮＡは翻訳可能なｍＲＮＡを適切にコードしているが、結果として正しく折り畳まれ得ないタンパク質、又は添加されるペプチドエピトープの疎水性が、組換えポリペプチドを不溶性にさせる可能性がある。封入体は、当技術分野で周知の方法によって容易に精製される。封入体の精製のための種々の手順が当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、該封入体は、遠心分離により細菌溶解物から回収され、凝集した組換えタンパク質からできるだけ多くの細菌タンパク質を除去するために、界面活性剤及びキレート剤で洗浄される。可溶性タンパク質を得るために、洗浄した封入体は、典型的には、変性剤に溶解され、次いで、放出タンパク質は、希釈又は透析によって変性試薬の段階的除去によってリフォールディングされる（例えば、分子クローニング：実験室マニュアル、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，２００１；ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）。

別の任意の方法は、組換えタンパク質上のポリヒスチジンタグを使用する。ポリヒスチジンタグは、多くの場合、Ｎ末端又はＣ末端において組換えタンパク質に付け加えられる少なくとも６個のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基からなる。ポリヒスチジンタグは、多くの場合、大腸菌又は他の原核生物の発現系で発現するポリヒスチジンタグ組換えタンパク質のアフィニティー精製のために使用される。細菌細胞を遠心分離によって収集し、得られた細胞ペレットは、物理的手段によって、又はリゾチームなどの界面活性剤もしくは酵素を用いて溶解することができる。粗製溶解物は、この段階で、細菌に由来するいくつかの他のタンパク質と共に組換えタンパク質を含み、ＮＴＡ−アガロース、ＨｉｓＰｕｒ樹脂又はタロン樹脂などのアフィニティー担体とインキュベートされる。これらのアフィニティー担体は、ポリヒスチジンタグがマイクロモルの親和性で結合するニッケル又はコバルトのいずれかの結合金属イオンを含む。次いで、この樹脂は、コバルト又はニッケルイオンと特異的に相互作用しないタンパク質を除去するためにリン酸緩衝液で洗浄される。洗浄効率は、２０ｍＭのイミダゾールを添加することによって向上させることができ、次いで、タンパク質は、通常１５０〜３００ｍＭのイミダゾールで溶出される。その後、ポリヒスチジンタグは、制限酵素、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼを用いて除去することができる。ヒスチジンタグ付きタンパク質の精製用キットは、例えば、キアゲン社から購入することができる。

ワクチン製剤及び投与
本発明のワクチンは、マルチエピトープポリペプチド、及び必要に応じて、アジュバントを含む。ワクチンは、多くの異なるモードの１つで、投与用に製剤化することができる。一実施形態において、該ワクチンは非経口投与用に製剤化される。いくつかの実施形態において、該ワクチンは、例えば、ジェット注射器又は単回使用カートリッジを用いて使用するための大量接種用に製剤化される。本発明の一実施形態によれば、ワクチン投与は筋肉内投与である。別の実施形態によれば、投与は皮内投与である。ワクチンを皮内に堆積させるために特別に設計された針は、例えば、とりわけ米国特許第６，８４３，７８１号及び同第７，２５０，０３６号に開示されているように、当技術分野で公知である。他の実施形態によれば、投与は無針注射器を用いて行われる。

さらに別の実施形態によれば、該ワクチンは、粘膜送達、特に、経鼻送達用に製剤化される（Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．２００１；２９（３−４）：２３７−４２；Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１１（７）：１０４３−５１）。該ワクチン製剤は、任意の便利な方法で鼻のリンパ組織に適用することができる。しかし、鼻通路の壁には、液体の流れ又は液滴としてそれを適用することが好ましいである。鼻腔内用組成物は、例えば、点鼻薬、スプレーとして液体形態で製剤化されるか、又は吸入に適するエアロゾルとして、粉末として、クリームとして、又はエマルジョンとして製剤化されるか、必要に応じて、ポリペプチドの分散に適する容器で提供することができる。該組成物は、アジュバント、賦形剤、安定化剤、緩衝剤、又は保存剤などの様々な添加剤を含むことができる。

本発明の製剤は、必要に応じて、例えば、ＵＳ２００４／００７７５４０に記載されているように、上皮接合構造及び／又は生理機能を調節することにより、可逆的に粘膜上皮傍細胞輸送を高める透過性ペプチドなどの粘膜送達増強剤を含んでもよい。

本発明の別の実施形態において、投与は経口投与であり、該ワクチンは、例えば、錠剤の形態で提示されるか、又はゼラチンカプセルもしくはマイクロカプセル中に入れられてもよい。これらの様式の製剤は、当業者に一般的に知られている。

リポソームは、抗原送達及び提示のための別の送達システムを提供する。リポソームは、抗原又は他の生成物をカプセル化することができる、典型的には水性中心を囲むリン脂質及び他のステロールで構成される二層小胞である。リポソーム構造は汎用性が高く、多くの種類がナノメートルからマイクロメータのサイズ、約２５ｎｍ〜約５００μｍの範囲である。リポソームは、皮膚及び粘膜表面に治療薬を送達するのに有効であることが明らかになっている。無傷のリポソーム構造の平均生存期間又は半減期は、インビボでの持続放出を可能にする特定の重合体、例えば、ポリエチレングリコールを含めると延長できる。リポソームは、単層又は多層であり得る。

重合体微粒子及びナノ粒子は、ワクチン送達のためのデポとして機能する小さな生分解性の球を利用する。デポ効果のある他のアジュバントを上回る、重合体微小球が有する主な利点は、それらが極めて安全であり、生分解性の薬物送達システムとして使用することが承認されていることである。共重合体の加水分解の速度は非常によく特徴付けられており、ひいては、長期間にわたって抗原の持続放出を有する微粒子の製造を可能にする（Ｏ’Ｈａｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９３，１１，９６５）。微粒子の非経口投与は、特に、微粒子が持続放出特性を取り込む場合は、長期的な免疫を誘発する。放出速度は、時間が変化するにつれて加水分解する重合体の混合物及びそれらの相対分子量によって調節することができる。理論に束縛されることを望まないが、巨大粒子は、マクロファージの取り込みに利用可能になる前に、より小さな粒子に分解されなければならないので、異なるサイズの粒子（１μｍ〜２００μｍ）の製剤は、長期持続性免疫応答にも寄与し得る。このように、単一の注射ワクチンは、様々な粒径を統合することにより、それによって抗原提示を延長することにより開発され、家畜生産者に大幅に利益を与えることができた。いくつかの用途において、アジュバント又は賦形剤は、ワクチン製剤に含まれてもよい。アジュバントの選択は、ワクチンの投与様式によって部分的に決定される。例えば、非注射ワクチン接種は、全体的により良好なコンプライアンス及び全体的により低いコストにつながる。投与経路の一態様は、筋肉内投与である。鼻腔内用アジュバントの非限定的な例としては、キトサン粉末、ＰＬＡ及びＰＬＧミクロスフェア、ＱＳ−２１、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＡＰ）並びにｍＣＴＡ／ＬＴＢ（熱不安定性エンテロトキシンの五量体Ｂサブユニットを有する突然変異体コレラ毒素Ｅ１１２Ｋ）が挙げられる。

使用されるアジュバントはまた、理論的には、ペプチド又はタンパク質ベースのワクチン用の公知のアジュバントのいずれかであり得る。例えば：ゲル形態の無機アジュバント（水酸化アルミニウム／リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、モノホスホリルリピドＡ及びムラミルペプチドなどの細菌アジュバント、いわゆるＩＳＣＯＭＳ（「免疫賦活複合体」、リポソーム及び生分解性ミクロスフェア）などの粒子状アジュバント、ＩＦＡ（「不完全フロイントアジュバント」）、ＳＡＦ、サポニン（ＱＳ−２１など）、スクアレン／スクアランなどの、油エマルジョン及び乳化剤に基づくアジュバント、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチド類似体、合成リピドＡ、合成ポリヌクレオチドなどの合成アジュバント並びにポリカチオン性アジュバント。

本発明の免疫原と共に使用するための別のアジュバントは、エマルジョンである。企図されるエマルジョンは、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンであり得る。該免疫原性ポリペプチドに加えて、そのようなエマルジョンは、周知のスクアレン、スクアラン、又はピーナッツ油などの油相、及び分散剤を含む。非イオン性分散剤が好ましく、そのような材料には、例えば、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート及びマンニドモノオレエートなどのソルビタン及びマンニドのモノ−並びにジ−Ｃ_１２〜Ｃ_２４脂肪酸エステルが含まれる。

そのようなエマルジョンは、例えば、スクアレン、グリセロール及びマンニドモノオレエート（Ａｒｌａｃｅｌ（商標）Ａ）などの界面活性剤を含み、必要に応じて、スクアランを有し、水相中のキメラタンパク質粒子で乳化された油中水型エマルジョンである。油相の他の成分には、α−トコフェロール、混合鎖のジグリセリド及びトリグリセリド、並びにソルビタンエステル類が含まれる。そのようなエマルジョンの周知の例としては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ−７２０、及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７０３（Ｓｅｐｐｉｃ社、カストル、フランス）が挙げられる。水中油型エマルジョンアジュバントには、例えば、ＷＯ９５／１７２１０及びＥＰ ０ ３９９ ８４３に開示されているものが含まれる。

小分子アジュバントの使用も本明細書で企図される。本明細書で有用な小分子アジュバントの１種は、米国特許第４，５３９，２０５号、同第４，６４３，９９２号、同第５，０１１，８２８号及び同第５，０９３，３１８号に記載の７−置換−８−オキソ−グアノシン誘導体又は８−スルホ−グアノシン誘導体である。７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）は、抗原（免疫原）特異的応答を誘導するのに特に有効であることが示されている。

有用なアジュバントとしては、Ｃｏｒｉｘａ社が製造するモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（登録商標））、３−デアシルモノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標））が挙げられる。アジュバントは、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（商標）８０エマルジョン中に、細菌から抽出された３つの成分：モノホスホリルリピド（ＭＰＬ）Ａ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する。このアジュバントは、ＧＢ２１２２２０４Ｂに教示されている方法により調製することができる。

他の化合物は、ＲＣ−５２９（商標）アジュバント｛２−［（Ｒ）−３−テトラ−デカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−エチル−２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホン−ｏ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラ−デカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラ−デカノイルオキシテトラ−デカノイル−アミノ］−ｐ−Ｄ−グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩｝の名称で、Ｃｏｒｉｘａ社から入手可能なものなどの、アミノアルキルグルコサミドホスフェート（ＡＧＰ）と呼ばれるＭＰＬ（登録商標）アジュバントに構造的に関連している。ＲＣ−５２９アジュバントは、ＲＣ−５２９ＳＥとして販売されているスクアレンのエマルジョン及びＣｏｒｉｘａ社から入手可能なＲＣ−５２９ＡＦとして水性製剤で利用できる（例えば、米国特許第６，３５５，２５７号；同第６，３０３，３４７号；及び同第６，１１３，９１８号に開示されている）。

ムラミルジペプチドアジュバントも企図され、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｕｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン［ＣＧＰ １１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる］、及びＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミチオール（ｄｉｐａｌｍｉｔｙｏｌ）−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン［（ＣＧＰ）１９８３Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる］を含む。いわゆるムラミルジペプチド類似体は、米国特許第４，７６７，８４２号に記載されている。

ＭＰＬ（登録商標）アジュバントなどのｔｏｌｌ様受容体−４（ＴＬＲ−４）又はＲＣ−５２９（登録商標）アジュバントもしくはリピドＡ模倣物などの構造的に関連する化合物に対する１種類以上のアゴニストを単独で、あるいはＣｐＧモチーフを含有する非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドなどのＴＬＲ−９に対するアゴニストと共に含有するアジュバントの使用も任意選択である。

さらに企図されるアジュバントには、Ｃｏｌｅｙ製薬グループから入手可能なＣｐＧヌクレオチドモチーフを一回以上（プラス隣接配列）含有する合成オリゴヌクレオチドのアジュバントが含まれる。Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から入手可能なＱＳ２１と命名されたアジュバントは、南米の木のキラヤ・サポナリア・モリナ（例えば、Ｑｕｉｌ（商標）Ａ）の樹皮に由来するアジュバント活性を有する免疫学的に活性のあるサポニン画分であり、その生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。Ｑｕｉｌ（商標）Ａの誘導体、例えば、ＱＳ２１（ＱＡ２１としても知られるＱｕｉｌ（商標）ＡのＨＰＬＣ精製画分誘導体）、及びＱＡ１７などの他の画分も開示されている。米国特許第５，９７７，０８１号及び同第６，０８０，７２５号に記載されているものなどの、キラヤ・サポナリア・モリナのサポニンの半合成及び合成誘導体も有用である。Ｃｈｉｒｏｎ社から入手可能なＭＦ５９と命名されたアジュバントは、米国特許第５，７０９，８７９号及び同第６，０８６，９０１号に記載されている。

別の種類のアジュバント混合物は、さらに、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されるようなアミノアルキルグルコサミンホスフェートを含有する安定な油中水型エマルジョンを含む。別の油中水型エマルジョンは、ＷＯ９９／５６７７６に記載されている。

アジュバントは、アジュバント、宿主動物及び免疫原によって変化し得るアジュバント量で利用される。典型的な量は、１回の免疫当たり約１μｇ〜約１ｍｇで変化し得る。当業者なら、適切な濃度又は量を容易に決定することができることを知っている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、アジュバントは、ワクチンを等張性もしくは低張性にさせることができる１種類以上の水溶性もしくは水乳化可能物質を含有する溶液又はエマルジョンとして存在する。水溶性又は水乳化可能物質は、例えば、マルトース；フルクトース；ガラクトース；サッカロース；糖アルコール；脂質；及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。

ペプチドエピトープ及び類似体
本発明の多量体ポリペプチドは、ペプチド、ペプチド多量体及びポリペプチドの合成について当技術分野で公知の方法を用いて化学的に合成することができる。これらの方法は、一般に、ペプチド合成の公知の原理に依存する。最も好都合なことには、これらの手順は、固相ペプチド合成の公知の原理に従って行うことができる。

本明細書で使用する「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸配列を示す。本発明の具体的な実施形態によるペプチドエピトープは、４〜２４個のアミノ酸残基の配列を含む。多量体ポリペプチドは、ペプチドエピトープの少なくとも２個のリピート及び最大５０個のリピートを含む。

ペプチド類似体及びペプチド模倣体も、化学合成を利用した場合、本発明の範囲内に含まれる。本発明によるペプチド類似体は、必要に応じて、Ｃ末端又はＮ末端のいずれかにおいて少なくとも１つの非天然アミノ酸及び／又は少なくとも１つの保護基を含んでよい。

「アミノ酸」という用語は、好ましくは、炭素主鎖上の１，２−、１，３−、又は１，４−置換パターンで、アミノ基及びカルボン酸基を有する化合物を指す。α−アミノ酸は、最も好ましく、タンパク質に見出される（グリシン以外はＬ−アミノ酸である）２０個の天然アミノ酸を含む。合成が化学手段によるものである場合には、アミノ酸という用語は、２０個の天然のアミノ酸の対応するＤ−アミノ酸、対応するＮ−メチルアミノ酸、側鎖が修飾されたアミノ酸、タンパク質中に見られない生合成で入手可能なアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシ−プロリン、５−ヒドロキシ−リジン、シトルリン、オルニチン、カナバニン、ジエンコル酸、β−シアノールアニン（ｃｙａｎｏｌａｎｉｎｅ））、並びにアミノ−イソ酪酸、ノルロイシン、ノルバリン、ホモシステイン及びホモセリンなどの合成により誘導されたα−アミノ酸も含む。β−アラニン及びγ−アミノ酪酸は、それぞれ、１，３及び１，４−アミノ酸の例であり、他の多くが当技術分野で周知である。スタチンのようなアイソスター（ＣＯＮＨ結合がＣＨＯＨで置換されている２つのアミノ酸を含むジペプチド）、ヒドロキシエチレンアイソスター（ＣＯＮＨ結合がＣＨＯＨＣＨ_２で置換されている２つのアミノ酸を含むジペプチド）、還元アミドアイソスター（ＣＯＮＨ結合がＣＨ_２ＮＨ結合で置換されている２つのアミノ酸を含むジペプチド）及びチオアミドアイソスター（ＣＯＮＨ結合がＣＳＮＨ結合で置換されている２つのアミノ酸を含むジペプチド）も本発明に有用な残基である。

化学合成のために、本発明で使用されるアミノ酸は、市販されているか、又はルーチンな合成法によって入手可能なものである。特定の残基は、ペプチドへの組み込みのための特別な方法を必要とし得、ペプチド配列に対する連続的で、多様な又は収束性の合成アプローチが本発明において有用である。天然コードのアミノ酸及びそれらの誘導体は、ＩＵＰＡＣの規則に従って、３文字コードで表される。指示されない場合、Ｌ異性体を用いた。

当業者に公知のアミノ酸の保存的置換は、本発明のペプチドエピトープの範囲内である。保存的アミノ酸置換には、同じ種類の官能基又は側鎖、例えば、脂肪族、芳香族、正に帯電したもの、負に帯電したものを有する別のアミノ酸との１個のアミノ酸置換が含まれる。これらの置換は、経口バイオアベイラビリティ、中枢神経系への浸透、及び特定の細胞集団に対する標的化などを高めることができる。当業者なら、コード配列中の単一アミノ酸もしくはわずかな比率のアミノ酸を変化させるか、付加するか、又は除去する、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失あるいは付加は、その改変が化学的に似たアミノ酸とのアミノ酸置換をもたらす「保存的修飾変異体」であることを認識するであろう。機能的に似たアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。

以下の６つの群は、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に例示するために提示されている。しかし、それらは、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者なら、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形及び修正を容易に考案することができる。

実施例
材料及び方法
多量体マルチエピトープポリペプチド：
表２に示すインフルエンザウイルスペプチドエピトープのＥ１〜Ｅ９のいくつかのリピートを含む多量体マルチエピトープポリペプチドを生成し、試験した。ペプチドエピトープに加えて、該ポリペプチドは、スペーサーとしてアミノ酸及び短いペプチドを含む。該ポリペプチドは、交互連続重合体構造又はブロック共重合体構造で配置されている。該ポリペプチドを、該ポリペプチドのさらなる操作のために、種々の制限部位を含むポリヌクレオチド構築物からの発現ベクターでの発現によって調製する。該ポリヌクレオチド構築物は、商業的供給源から供給される。

多量体マルチエピトープポリペプチドから調製されたワクチンは、種々のマウスモデルの免疫研究のため、及びヒト対象における臨床試験において使用されている。

ブロック共重合体構造に配置された９種類の異なるエピトープの各々３個のリピートを有する多量体ポリペプチド［Ｅ１］_３−［Ｅ２］_３−［Ｅ３］_３−［Ｅ４］_３−［Ｅ５］_３−［Ｅ６］_３−［Ｅ７］_３−［Ｅ８］_３−［Ｅ９］_３を生成し、Ｍ−００１と命名した。Ｍ−００１の推定分子量は４８ｋＤである。Ｍ−００１多量体ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号８６に記載されている。

Ｍ−００１多量体ペプチドを調製するために使用されるポリヌクレオチド構築物のＤＮＡ配列は、配列番号８５に記載されている。

追加の多量体マルチエピトープポリペプチド配列は、配列番号８３及び配列番号８７からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる配列番号８４及び配列番号８８からなる群から選択される。

本発明によるワクチン組成物は、アジュバントを必要とせずに投与することができる。あるいは、該組成物はアジュバントを含んでもよい。このような場合、臨床試験で使用される任意のアジュバントは、動物実験ではＩＦＡ及びヒトでの試験ではＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ５１ ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ社、フランス）である。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）は、ワクチンの有効性を試験する多くの臨床試験で用いられており、細胞性及び体液性免疫応答の両方を誘導することが可能な一般的に使用されている免疫調節物質である（Ｐｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００８；６０，９１５−９２８）。

実施例１：Ｍ−００１の生成プロセス−オプションＡ
培養プロセス：培養プロセスは、Ｍ−００１ポリペプチドを組換え発現する熱ショック誘導性大腸菌を用いて行った。一晩の接種菌液を１０Ｌの細菌増殖培地に添加した。流加プロセスを３６℃で実施した。４２℃まで温度を上げることによって誘導を開始した。誘導後２時間の時点で、バッチを１５Ｌの最終体積で終了した。次いで、これらの細胞を遠心分離し、回収した細胞ペレットを−７０℃で保存した。

細胞の溶解、封入体の回収及び洗浄：凍結細胞ペレットを解凍し、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、リゾチーム）に分散させた。混合及びウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ）処理の後に、細胞を、ゴーリンホモジナイザー（７００〜８００バール×３サイクル）に通した。溶解物を、５０ｍＭのトリス、０．１ＭのＮａＣｌ、２％トリトンＸ−１００で希釈し、次いで、０．５Ｍのトリス、１ＭのＮａＣｌで希釈した。最終的に、粗製封入体（ＩＢ）を、遠心分離により回収し、次いで、−７０℃で保存した。

次いで、ＩＢペレットを、１％のトリトン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８；５Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ８で連続洗浄し、最後に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で洗浄し、次いで、−７０℃で保存した。

封入体の可溶化：洗浄した封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、５０ｍＭのグリシン、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ９．５を含有する緩衝液で可溶化した。

タンパク質の精製：精製を、ＡＫＴＡｐｉｌｏｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて実施した。可溶化したタンパク質を、膜濾過によって清澄化し、最初に陽イオン交換ＳＰセファロースＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。このカラムを、洗浄緩衝液Ｉ（８Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８）、次いで、洗浄緩衝液ＩＩ（８Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）で連続洗浄し、次いで、８Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で溶出した。２８０ｎｍの吸収で検出された溶出ピークを収集した。

次いで、溶出液を、１Ｍの硫酸アンモニウム〜０．５Ｍの硫酸アンモニウムで希釈し、次いで、第２のクロマトグラフィーカラムの疎水性相互作用フェニルセファロースＦＦ（ＨＳ）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上にロードした。このカラムを、８Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ８で洗浄し、次いで、８Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８で溶出した。次いで、溶出液を、ＤＮＡ及びエンドトキシンの低減のためにＳａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フィルターに通した。Ｔｗｅｅｎ−８０を、１：５（ｗ／ｗ）のＴｗｅｅｎ８０：組換えタンパク質の割合で添加した。タンパク質溶液を無菌的に濾過した（０．２μｍ）。後続の全てのステップを無菌的に処理した。

限外濾過及び製剤：溶出液を、１０ｋＤａカットオフの中空糸モジュール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて濃縮した。サイズ分布を調節したタンパク質微粒子を形成するために、緩衝液を、連続して、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．５に交換し、次いで、５０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．５Ｍのアルギニン、ｐＨ５．５に交換し、最終的に、２０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．２Ｍのアルギニン、ｐＨ６に交換し、これが薬物物質となる。該医薬組成物−薬物生成物を、２０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．２Ｍのアルギニン、ｐＨ６中２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで該薬物物質を希釈することによって得る。充填したバイアルを＋４℃で保存する。

実施例２：Ｍ−００１の生成プロセス−オプションＢ
培養プロセス：実施例１と同じ。

細胞の溶解、封入体の回収及び洗浄：実施例１と同じ。

封入体の可溶化：洗浄した封入体を、６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、５ｍＭのグリシン、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８．０を含有する緩衝液で可溶化した。

タンパク質の精製：精製を、ＡＫＴＡｐｉｌｏｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて実施した。可溶化したタンパク質を、膜濾過によって清澄化し、陽イオン交換ＳＰセファロースＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。このカラムを、洗浄緩衝液Ｉ（８Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８）、次いで、洗浄緩衝液ＩＩ（８Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）で連続洗浄し、次いで、８Ｍの尿素、５ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で溶出した。２８０ｎｍの吸収で検出された溶出ピークを収集した。

Ｔｗｅｅｎ−８０を、１：５（ｗ／ｗ）のＴｗｅｅｎ８０：組換えタンパク質の割合で添加した。タンパク質溶液を無菌的に濾過した（０．２μｍ）。後続の全てのステップを無菌的に処理した。

限外濾過及び製剤：溶出液を、１０ｋＤａカットオフの中空糸モジュール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて濃縮した。調節された微粒子（すなわち、調節されたタンパク質凝集体）を形成するために、緩衝液を、連続して、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．５に交換し、次いで、５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５に交換し、これが薬物物質となる。アルギニン溶液を、０．５Ｍの最終アルギニン濃度まで添加した。該医薬組成物−薬物生成物を、５０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．５Ｍのアルギニン、ｐＨ５．５中２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで該薬物物質を希釈することによって得た。充填したバイアルを＋４℃で保存した。

実施例３：薬物物質緩衝液としてのＭ−００１試験ＰＢＳの生成プロセス
培養プロセス：実施例１と同じ。

細胞の溶解、封入体の回収及び洗浄：実施例１と同じ。

封入体の可溶化：実施例２と同じ。

タンパク質の精製：実施例２と同じ。

限外濾過及び製剤：溶出液を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．５で１：４０希釈した。得られた溶液を、１０ｋＤａカットオフの中空糸モジュール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて濃縮した。タンパク質微粒子を作製するために、緩衝液をＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０に交換した。凝塊及び沈殿の増加によって視覚的に評価されるように、タンパク質懸濁液の外観は、実施例１及び２で得られた懸濁液に比べて劣っていた。アルギニンＨＣｌを０．１〜１．５Ｍの最終アルギニン濃度まで添加した。アルギニン添加により、用量依存的に粒子がすぐに脱凝集し、アルギニン濃度が高いほど、効果がより高まった。

Claims (15)

1. 複数のインフルエンザウイルスペプチドエピトープを複数コピー含む少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドとグアニジニウム含有アミノ酸と薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体とを含む、微粒子の水性懸濁液の形態の医薬組成物であって、
   前記水性懸濁液中の微粒子が、均一な凝集体サイズ分布を有し、前記凝集体の９５％のサイズが、一桁のサイズ範囲内に入り、
   前記グアニジニウム含有アミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ）であり、
   前記多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドが、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有するＭ−００１である、
   医薬組成物。
2. 前記懸濁液中の凝集体の９５％が、０．５〜５μｍ、０．６〜６μｍ、０．７〜７μｍ、０．８〜８μｍ、０．９〜９μｍ、１〜１０μｍ、２〜２０μｍ、３〜３０μｍ、４〜４０μｍ及び５〜５０μｍからなる群から選択されるサイズ範囲分布を有する、請求項１記載の医薬組成物。
3. 前記グアニジニウム含有アミノ酸が、０．１〜２．０Ｍの濃度である、請求項１記載の医薬組成物。
4. ５．０〜７．６の範囲内でｐＨを維持する１〜５０ｍＭの濃度の緩衝剤を含む、請求項１記載の医薬組成物。
5. １〜１０ｍｇ／ｍｌの多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドと０．１〜０．５ＭのＬ−アルギニンと１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液とを含み、４〜７の範囲のｐＨを有する、請求項１記載の医薬組成物。
6. インフルエンザに対する対象の免疫化のための、請求項１記載の医薬組成物。
7. 精製された組換えポリペプチドを生成するプロセスであって、
   （ｉ）カオトロピック剤と界面活性剤と還元剤と７〜１０の範囲のｐＨを提供する緩衝剤とを含む水溶液に、１．５〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを提供する工程；
   （ｉｉ）前記カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって、調節された凝集を誘導する工程；及び
   （ｉｉｉ）グアニジニウム含有アミノ酸を添加して、凝集体の９５％のサイズが一桁のサイズの範囲内に入る、均一な凝集体サイズ分布を有する安定な微粒子懸濁液を得る工程、
   を含み、
   前記グアニジニウム含有アミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ）であり、
   前記多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドが、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有するＭ−００１である、
   プロセス。
8. 前記カオトロピック剤が、５〜８Ｍの尿素及び１〜４Ｍのチオ尿素であり、前記界面活性剤が、０．５〜４％のＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）であり、前記緩衝剤が５〜１００ｍＭのグリシンである、請求項７記載のプロセス。
9. さらに以下の工程を含む、請求項７記載のプロセス：
   （ｉ）少なくとも１種類の多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを発現する大腸菌細胞を提供する工程；
   （ｉｉ）大腸菌細胞の溶解、細菌細胞破壊及び遠心分離を行い、多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を提供する工程；
   （ｉｉｉ）前記封入体の少なくとも１回の洗浄を行う工程。
10. 以下の工程を含む、請求項９記載のプロセス：
    （ｉｖ）５〜８Ｍの尿素と１〜４Ｍのチオ尿素と０．５〜４％のＣＨＡＰＳと還元剤と７〜１０の範囲のｐＨを提供する緩衝剤としての５〜１００ｍＭのグリシンとを含む溶液で前記封入体を可溶化する工程；
    （ｖ）アルギニン緩衝液の添加と共に前記カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって、調節された凝集を誘導し、それによって、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；及び
    （ｖｉ）緩衝液交換により前記懸濁液を製剤化して、約０．１〜０．４Ｍのアルギニン及び４〜８の範囲のｐＨを有する１０〜４０ｍＭのクエン酸緩衝液の最終懸濁液を得る工程。
11. 少なくとも１つのクロマトグラフィー分離工程が、工程（ｉｖ）と（ｖ）の間で行われる、請求項１０記載のプロセス。
12. 工程（ｉｖ）における調節された凝集の誘導が限外濾過により行われる、請求項１０記載のプロセス。
13. 最終組成物中のポリペプチド濃度が、１〜１０ｍｇ／ｍｌである、請求項１０記載のプロセス。
14. 以下の工程を含む、請求項１０記載のプロセス：
    （ｉ）組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素と２Ｍのチオ尿素と１％のＣＨＡＰＳと５０ｍＭのβ−メルカプトエタノールと約９．５のｐＨを提供する５０ｍＭのグリシンとを含む溶液で可溶化する工程；
    （ｉｉ）前記カオトロピック剤及び還元剤の段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
    （ｉｉｉ）０．５Ｍのアルギニン緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に前記懸濁液を供する工程；並びに
    （ｉｖ）前記懸濁液を緩衝液交換に供し、約２．５ｍｇ／ｍｌの前記ポリペプチドと約０．２Ｍのアルギニンと約２０ｍＭのクエン酸緩衝液とを含み約６のｐＨを有する最終組成物を得る工程。
15. 組換え多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドの実質的に安定な水性懸濁液を生成するプロセスであって、
    （ｉ）組換え生成した多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドを含む封入体を、６Ｍの尿素と２Ｍのチオ尿素と１％のＣＨＡＰＳと５０ｍＭのβ−メルカプトエタノールと約９．５のｐＨを提供する５０ｍＭのグリシンとを含む溶液で可溶化する工程；
    （ｉｉ）尿素、チオ尿素及びβ−メルカプトエタノールの段階的除去によって凝集を誘導することにより、不溶性凝集体の懸濁液を形成する工程；
    （ｉｉｉ）０．１〜１Ｍのアルギニン緩衝液を徐々に添加することを含む、限外濾過による濃縮工程及び緩衝液交換工程に前記懸濁液を供する工程；並びに
    （ｉｖ）前記懸濁液を緩衝液交換に供し、約１〜５ｍｇ／ｍｌの前記ポリペプチドと約０．１〜０．５Ｍのアルギニンと約１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液とを含み４〜７の範囲のｐＨを有する最終懸濁液を得る工程、
    を含み、
    前記多量体マルチエピトープインフルエンザポリペプチドが、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有するＭ−００１である、
    プロセス。