KR20200090836A - Hendra 및 Nipah 바이러스 감염을 대비한 백신 - Google Patents

Abstract

Hendra 또는 Nipah 바이러스 감염으로부터 보호를 요하는 동물을 보호하는 방법에 있어서, 이 방법은 상기 동물에게 단일 투여량의 백신을 투여하는 것을 포함하여, 상기 백신은 다음을 포함하고 W/O 에멀젼인, 방법을 개시한다: Hendra 항원 또는 Nipah 항원을 포함하는 항원 성분; 및 오일, 다가양이온 운반체 및 CpG를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드 어쥬번트(adjuvant).

Description

Hendra 및 Nipah 바이러스 감염을 대비한 백신

본 발명은 일반적으로 Hendra 바이러스(HeV) 및 Nipah 바이러스(NiV) 감염에 대비하는 동물 백신 분야에 관한 것이다.

HeV 및 NiV와 같은 파라믹소바이러스는 바이러스 입자의 외피에 2개의 주요 막-고정 당단백질을 보유하다. 숙주 세포의 수용체에 대한 비리온 부착에 하나의 당 단백질이 필요하며, 헤마글루티닌-뉴라미니다제 단백질(HN) 또는 헤마글루티닌 단백질(H)로 지명되고, 다른 하나는 당 단백질(G)인데, 이들은 헤마글루티닌화 또는 뉴라미니다제 활성을 갖지 않는다. 상기 부착 당단백질들은 유형 II 막 단백질로써, 이때 당해 분자의 아미노(N) 말단은 세포질을 향해 배향되며, 당해 단백질의 카르복시(C) 말단은 세포외(extracellular)이다. 다른 주요 당단백질은 융합(F) 당단백질로써, 이는 2개의 헵타드 반복(HR) 영역과 소수성 융합 펩티드를 포함하는 삼량체 분류 I 융합생성(fusogenic) 외피 당단백질이다. HeV 및 NiV는 수용체 결합 후, 그들의 부착 G 당 단백질 및 F 당 단백질의 공동 작용을 통해, 수용적 숙주 세포 안으로의 pH-독립적 막 융합 과정을 통하여 세포를 감염시킨다. HeV 및 NiV 부착 G 당단백질의 주요 기능은 숙주 세포의 표면 상에 있는 적절한 수용체와 결합하는 것이며, 이에 대해 잘 특성화된 파라믹소바이러스의 대부분은 시알산 모이어티이다. HeV 및 NiV G 당단백질은 숙주 세포 단백질 수용체 에프린 B2 및/또는 에프린 B3을 이용하고, G 당단백질에 의한 바이러스 부착을 차단하는 항체가 개발되었다(WO 2006137931, Bishop (2008) J. Virol. 82: 11398-11409). 또한, HeV 및 NiV 감염에 대한 면역보호 반응을 생성하기 위한 수단으로서 G 당단백질을 사용하는 백신이 개발되었다(WO 2009117035).

Hendra 바이러스로 인한 감염 또는 질병 예방을 위하여 말에 사용 승인된 백신(Equivac® HeV; Zoetis)이 현재 하나가 있지만, Nipah 바이러스 감염을 예방하기 위한 허가된 백신은 없다. Nipah 바이러스와 Hendra 바이러스는 모두 미국의 National Institute of Allergy and Infectious Disease에서 생물 방어 우려의 카테고리 C에 속하는 우선 순위 물질이다. 또한, 이들 바이러스는 동물원성 생물학적 안전성 수준-4 제제(BSL-4)이므로, 안정성을 갖는 백신 및/또는 진단제의 생산은 매우 고가이며, 어렵다. 미국 Department of Agriculture는 Nipah 바이러스 및 Hendra 바이러스를 모두 매우-중요한 외래 동물 질병(High-Consequence Foreign Animal Diseases)으로 분류한다.

제 1 측면에서, 본 발명은 Hendra 또는 Nipah 바이러스 감염으로부터 보호를 요하는 동물을 보호하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 동물에게 단일 투여량(dose)의 백신을 투여하는 것을 포함하여, 상기 백신은 다음을 포함하고 W/O 에멀젼이다: Hendra 항원 또는 Nipah 항원을 포함하는 항원 성분; 및 오일, 다가양이온 운반체 및 CpG를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 함유하는 어쥬번트(adjuvant).

특정 구체예들에서, 상기 동물은 돼지(porcine)이며, Nipah 항원은 서열 번호 11에 대하여 최소한 95%(가령, 최소한 98%) 동일한 아미노산 서열 또는 이의 아미노산 71 내지 602를 포함한다.

특정 구체예들에서, 상기 동물은 말(equine)이며, Hendra 항원은 서열 번호 12에 대하여 최소한 95%(가령, 최소한 98%) 동일한 아미노산 서열 또는 이의 아미노산 73 내지 604를 포함한다.

상기에서 기술된 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 추가 구체예들에서, 상기 오일은 대사-불가능한 오일이다.

상기에서 기술된 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 추가 구체예들에서, 상기 다가양이온 운반체는 DEAE 덱스트란이다.

상기에서 기술된 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 추가 구체예들에서, 상기 단일 투여량의 백신은 약 0.125 ml 내지 약 2 ml의 용적을 갖는다.

도 1은 Nipah 바이러스의 G 당단백질인 서열 번호 11을 나타낸다.
도 2는 Hendra 바이러스의 G 당단백질인 서열 번호 12를 나타낸다.

정의

측정 가능한 가변적 수치와 관련하여 사용될 때, "약(about)" 또는 "대략(approximately)"이란 표시된 값의 변수 및 표시된 값의 실험 오차 내(예를 들어, 95% 평균 신뢰 구간 이내), 또는 표시된 값의 10% 이내(어느 것이든 더 큰 것)에 있는 변수의 모든 값을 의미하고, 단, "약"이라는 단어가 "약 3 주"인 주(weeks)의 시간 간격과 관련하여 사용되는 경우, 이는 17 내지 25 일, 그리고 약 2 내지 약 4 주는 10 내지 40 일이다.

"항원" 또는 "면역원"은 동물의 면역계에 의해 인지되고, 면역 반응을 생성하는 임의의 물질을 지칭한다. 이 용어에는 죽은, 비활성화된, 감쇠화된 또는 변형된 살아있는 박테리아, 바이러스 또는 기생충이 포함된다. 용어 "항원"에는 또한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 재조합 단백질, 합성 펩티드, 단백질 추출물, 세포(종양 세포 포함), 조직, 다당류 또는 지질, 또는 이들의 단편들이 개별적으로 또는 이들의 임의의 조합이 포함한다. 당해 용어 항원에는 또한 항-이디오타입(idiotype) 항체 또는 이의 단편과 같은 항체, 그리고 항원 또는 항원 결정기(에피토프)를 모방할 수 있는 합성 펩티드 모방체(mimotopes)를 포함한다.

"완충제"란 다른 화학 물질의 농도 변화를 방지하는 화학 시스템, 예를 들어 양성자 공여체 및 수용체 시스템은 수소 이온 농도(pH)의 현저한 변화를 방지하는 완충제로서 작용한다. 완충제의 추가의 예로는 약산 및 이의 염(콘쥬게이트 염기) 또는 약염기 및 이의 염(콘쥬게이트 산)의 혼합물을 함유하는 용액이다.

"대상체에게 단일 투여량(dose)의 백신 X를 투여하는 것을 포함하는" 방법에는 하나 이상의 투여량의 백신 X가 투여되는 치료 요법은 배제된다.

어쥬번트 제형에 적용되는 "본질적으로 ~로 구성되는"이란 언급되지 않은 추가 보조제 또는 면역조절제를 함유하지 않고, 상기 제제가 측정가능한 보조 또는 면역조절 효과를 발휘하는 양의 제형을 지칭한다.

"단일-투여량 백신으로서 효과적"인 조성물 또는 백신에 대한 언급은 Nipah 또는 Hendra에 대해 면역되지 않은 동물에게 단일 투여 시, Nipah 또는 Hendra 공격에 대해 최소한 5개월의 면역 기간, 가령, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 13 개월 또는 14 개월 동안 면역성을 제공하는 Nipah 또는 Hendra 백신을 지칭한다.

"유화제(emulsifier)"라는 용어는 본 개시에서 광범위하게 사용된다. 여기에는 일반적으로 유화제로 허용되는 물질, 예를 들어 TWEEN® 또는 SPAN® 제품군의 다양한 제품(차례로 폴리에톡실화된 소르비톨의 지방산 에스테르와 지방산-치환된 소르비탄 계면활성제) 그리고 PEG-40 피마자유 또는 또다른 PEG화된 수소화 오일과 같은 상이한 용해도 향상제가 포함된다.

항원의 "면역학적 보호량" 또는 "면역학적 유효량" 또는 "면역반응을 일으키는 유효량"이란 수용체에서 면역원성 반응을 유도하기에 효과적인 양이다. 상기 면역원성 반응은 진단 목적 또는 다른 시험에 충분할 수 있거나, 또는 질병 인자에 의한 감염에 의해 야기되는 건강상의 부작용 또는 그 합병증을 비롯한 질병의 징후 또는 증상을 예방하기에 적합할 수 있다. 체액 면역 또는 세포-매개된 면역 또는 둘 모두 다 유도될 수 있다. 면역원성 조성물에 대한 동물의 면역원성 반응은 예를 들어, 항체 역가, 림프구 증식 검정을 통해 간접적으로, 또는 야생형 균주에 의한 공격 후, 직접적으로 징후 및 증상을 모니터링함으로써 평가될 수 있는 반면, 백신에 의해 부여되는 보호 면역은 예를 들어, 대상체의 사망률, 이환율, 체온 수치, 전반적인 신체 상태, 및 전반적인 건강 및 거동과 같은 임상 징후의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 면역 반응은 세포성 및/또는 체액성 면역의 유도를 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.

"면역원성"은 면역 또는 항원성 반응을 유발하는 것을 의미한다. 따라서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하는 임의의 조성물일 수 있다.

"지질"은 일반적으로 물에 불용성(또는 난용성)으로 간주되지만, 비극성 유기 용매에 가용성으로 간주되는 지방, 오일, 왁스, 스테롤 및 트리글리세리드를 비롯한 유기 화합물 군 중 하나를 의미하며, 그리고 탄수화물 및 단백질과 함께 살아있는 세포의 주요 구조 물질을 구성한다.

"약제학적으로 허용되는"이란 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 이와 유사한 것 등이 없이 대상체의 조직과 접촉 사용에 적합하고, 합리적인 유해율에 상응하고, 의도된 용도에 효과적인, 건전한 의료 판단의 범위 안에 있는 물질을 말한다.

본 발명은 본원에 기재된 단일 용량의 백신을 동물에게 투여함으로써, Hendra 및/또는 Nipah 감염으로부터 보호를 요하는 동물을 백신 접종하는 방법을 제공한다. 간략하게 설명하자면, 상기 백신에는 하기에서 상술된 바와 같이, 어쥬번트 TXO로 보조된 Hendra 또는 Nipah 항원이 포함된다.

항원

본 발명의 실시에 유용한 Hendra 바이러스 G 당단백질 폴리펩티드 및 이의 재조합 발현은 공개된 국제 특허 출원 WO 2012/158643 및 WO 2006/085979의 전체 개시 내용을 참조하며, 여기에 이러한 정보는 명확하게 제시되어 있다. 본원에 유용한 특정 Hendra 바이러스 G 단백질 폴리펩티드의 바람직한 예는 WO 2012/158643에 개시되어 있으며, 예를 들어 전장 G 단백질(서열 번호 12); 그의 가용성 단편(서열 번호 12의 아미노산 73 내지 604를 인코딩함)을 포함하며; 그리고 Ig(카파) 리더 서열을 갖는 추가의 단편이 개시되어 있다. 가령, WO 2012/158643의 서열 번호15 참고. 일반적으로, Hendra 바이러스 G 당단백질의 가용성 형태는 엑토도메인(ectodomain)의 전부 또는 일부를 포함하고, G 당단백질의 막횡단(transmembrane) 도메인의 전부 또는 일부, 및 세포질 꼬리의 전부 또는 일부의 결실에 의해 만들어진다. 바람직하게는, 상기 인코딩 유전자 서열은 발현에 최적화된 코돈이다.

일부 구체예들에서, Hendra G 당단백질은 이량체 및/또는 사량체 형태일 수 있다. 이러한 이량체는 G 당단백질에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합의 형성에 의존한다. 이러한 이황화 결합은 고유의 G 당단백질에서 형성된 것과 상응할 수 있거나, 또는 상이한 이황화 결합이 형성되어 항원성이 향상된 상이한 이량체 및/또는 사량체 형태의 G 당 단백질이 만들어질 수 있다. 추가로, G 당단백질이 다수의 입체 형태-의존성 에피토프(즉, 제3의(tertiary) 3 차원 구조로부터 발생함)를 제공하고, 따라서 이러한 다수의 천연 에피토프의 보존이 중화 항체 반응을 부여하기 위해 매우 바람직함을 고려한다면, 비-이량체화 및 사량체화 형태는 또한 본원 실행에 유용하다.

일반적으로 말하자면, Hendra G 단백질에 대한 발현 벡터의 구축은 WO 2012/158643의 실시예 1에 기재된 바와 같고, CHO 세포로부터의 결과적인 단백질 발현은 이의 실시예 2에 기재된 바와 같거나, 또는 대안으로 백시니아 시스템을 사용하여(이의 실시예 3 참조) 또는 293 세포의 사용(이의 실시예 4 참조)하여 구축할 수 있다. 특별히 바람직한 실시예에서, 상기 가용성 G 단백질은 고유의 Hendra 바이러스 G 당단백질의 아미노산 73 내지 604로 제공된다(WO 2012/158643의 서열 번호2는 서열 번호 12와 동일함. 이의 이량체화는 CHO 세포로부터의 발현에 수반하여 자발적으로 발생하며, 생성된 G 단백질은 대략 50% 이량체와 50% 사량체이며, 남아있는 단량체는 거의 없다. 293F 세포에서의 발현은 약 70% 이량체를 유도한다.

Nipah G 단백질에 대한 발현 벡터의 구축이 또한 설명되었다. 가령, WO 2012/158643의 실시예 1과 2 참고. 본원에 유용한 특정 Nipah 바이러스 G 단백질 폴리펩티드의 바람직한 예는 WO 2012/158643에 개시되어 있으며, 예를 들어 전장 G 단백질(서열 번호 11); 그의 가용성 단편(서열 번호 11의 아미노산 71 내지 602를 인코딩함)을 포함하며; 그리고 Ig(카파) 리더 서열을 갖는 추가의 단편이 개시되어 있다. 일반적으로, Hendra 바이러스 G 당단백질의 가용성 형태는 엑토도메인(ectodomain)의 전부 또는 일부를 포함하고, G 당단백질의 막횡단(transmembrane) 도메인의 전부 또는 일부, 및 세포질 꼬리의 전부 또는 일부의 결실에 의해 만들어진다. 바람직하게는, 상기 인코딩 유전자 서열은 발현에 최적화된 코돈이다.

Nipah G 항원은 예를 들어, WO 2012/158643의 실시예 3에 기재된 바와 같이 Hendra G 항원과 유사하게 생성될 수 있다.

덩치 큰 동물에 대한 바람직한 항원 투여량(doses)은 투여당(per dose) 약 50 내지 약 200 마이크로그램(μg)의 범위이고, 약 100 μg이 가장 바람직한 투여량이다. 더 작은 동물, 이를 테면 개는 더 적은 양, 이를 테면, 5 내지 50 μg, 가령, 약 10 μg, 약 15 μg, 약 20 μg, 약 25 μg, 약 30 μg, 약 35 μg, 약 40 μg, 약 45 μg을 필요로 한다.

특정 구체예들에서, Nipah 항원 및/또는 Hendra 항원은 차례로 서열 번호 11과 서열 번호 12와 최대 아미노산의 5%까지 상이하다. 바람직하게는, 변경된 아미노산은 보존적으로 치환된다. 다음의 8개 각 군은 서로에 대하여 보존적 치환이 되는 아미노산들을 포함한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르지닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 그리고 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(가령, Creighton, 단백질, W. H. Freeman and Co., N. Y. (1984) 참고).

구체예들에서, 이때 Hendra 또는 Nipah 항원은 당해 항원이 서열 번호 11 또는 12에 최소한 95% 동일한지를 결정하기 위하여 추가 단편(가령, 정제 테그 또는 Ig(카파) 리더 서열)을 포함하는데, 이러한 추가 단편은 비교에서 배제된다.

추가 구체예들에서, 상기 항원 성분은 상기에서 기술된 아미노산 서열의 임의의 것을 인코드하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 적합한 벡터에는 폭스 벡터(예를 들어, 백시니아 벡터 또는 카나리아폭스 벡터, 예컨대 ALVAC), 아데노바이러스 벡터, SIRNAVAX^SM 플랫폼 등이 포함된다.

어쥬번트

본 발명의 백신은 유-중-수(water-in-oil)(W/O) 에멀젼이다. 다수의 오일 및 이의 조합이 본 발명의 사용에 적합하다. 이러한 오일에는 동물성 오일, 식물성 오일 및 대사 불가능한 오일이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명에 적합한 식물유의 비-제한적인 예는 옥수수유, 땅콩유, 대두유, 코코넛유 및 올리브유이다. 동물 오일의 비-제한적 예는 스쿠알렌이다. 대사-불가능한 오일의 적합한 비-제한적 예에는 경질 미네랄 오일, 직쇄 또는 분지형 포화 오일 및 이와 유사한 것 등이 포함된다.

일련의 구체예들에서, 본 발명의 어쥬번트 제형에 사용되는 오일은 경질 미네랄 오일이다. 본원에 사용된 용어 "미네랄 오일"은 증류 기술을 통해 광유로부터 수득된 액체 탄화수소의 혼합물을 지칭한다. 이 용어는 "액화 파라핀", "액체 바셀린" 및 "백색 광유"와 동의어다. 이 용어는 또한 "경질 미네랄 오일(light mineral oil)", 즉 광유의 증류에 의해 유사하게 수득되지만, 백색 미네랄 오일보다 비중이 약간 더 낮은 오일을 포함하는 것을 의미한다. 가령, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, at pages 788 and 1323) 참고. 미네랄 오일은 다양한 상업적 공급원, 예를 들어 J. T. Baker (Phillipsburg, Pa.), USB Corporation (Cleveland, Ohio)에서 구할 수 있다. 바람직한 미네랄 오일은 DRAKEOL®이라는 이름으로 시판되는 경질 미네랄 오일이다.

전형적으로, 오일상(oily phase)은 백신 조성물의 50 부피% 내지 95 부피%의 양으로 존재하고; 바람직하게는 50% 내지 85% 초과 양으로; 더욱 바람직하게는, 50% 초과 내지 60% 초과의 양으로, 그리고 더욱 바람직하게는 50 내지 52% v/v 초과의 양으로 존재한다. 상기 오일상에는 이러한 유화제가 존재하는 경우, 오일 및 유화제(가령, SPAN® 80, TWEEN® 80 등)가 포함된다. 오일상의 부피는 오일과 유화제의 부피의 합계로 계산된다. 따라서, 예를 들어, 오일의 부피가 40%이고, 유화제(들)의 부피가 조성물의 12%인 경우, 오일상은 조성물의 52% v/v로 존재할 것이다. 유사하게, 상기 오일이 약 45%의 양으로 존재하고, 유화제(들)이 조성물의 약 6%의 양으로 존재하면, 오일상은 조성물의 약 51% v/v로 존재한다.

본 발명의 모든 어쥬번트/백신에 적용 가능한 구체예들의 하위집단에서, 오일과 지용성-유화제의 함께한 부피 백분율은 50% 이상, 예를 들어 50% 내지 95 부피%; 바람직하게는 50% 내지 85% 초과의 양; 더욱 바람직하게는 백신 조성물의 50% 내지 60%, 그리고 더욱 바람직하게는 50 내지 52% v/v의 양으로 존재한다. 따라서, 예를 들어, 그리고 이에 국한되지 않게, 오일은 45%의 양으로 존재할 수 있고, 지용성-유화제는 5% v/v 초과의 양으로 존재할 것이다. 따라서, 오일과 지용성-유화제의 부피 백분율은 최소한 50%일 것이다.

본 발명의 모든 백신에 적용 가능한 또 다른 하위 집단에서, 오일의 부피 백분율은 백신 조성물의 40% 초과, 예를 들어, 40% 내지 90 부피%; 40% 내지 85%; 43% 내지 60%, 44 내지 50% v/v이다.

본 발명의 에멀젼에 사용하기에 적합한 유화제는 천연 생물학적으로 적합한 유화제 및 비-천연 합성 계면 활성제를 포함한다. 생물학적으로 적합한 유화제는 인지질 화합물 또는 인지질의 혼합물을 포함한다. 바람직한 인지질은 대두 또는 난 레시틴과 같은 포스파티딜콜린(레시틴)이다. 레시틴은 미정제(crude) 식물성 오일을 물로 세척하고, 생성된 수화된 검을 분리 및 건조함으로써, 포스페이트와 트리글리세리드의 혼합물로서 수득될 수 있다. 정제된 산물은 아세톤 세척에 의해 트리글리세리드 및 식물성 오일을 제거한 후, 남은 아세톤 불용성 인지질과 당지질의 혼합물을 분획(fractionating)함으로써 얻을 수 있다. 대안적으로, 레시틴은 다양한 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 다른 적합한 인지질은 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 카디오리핀 및 포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 인지질은 천연 공급원으로부터 단리되거나 또는 통상적으로 합성될 수 있다.

추가의 구체예들에서, 본원에 사용된 유화제는 레시틴을 포함하지 않거나, 또는 면역학적으로 효과를 가지지 않은 양의 레시틴을 사용한다.

본 발명의 어쥬번트 제형에 사용하기에 적합한 비-천연 합성 유화제는 소르비탄-계 비-이온성 계면 활성제, 예를 들어 지방산-치환된 소르비탄 계면 활성제(상표명 SPAN® 또는 ARLACEL®로 시판됨), 폴리에톡실화 소르비톨(TWEEN®)의 지방산 에스테르, 피마자유와 같은 공급원으로부터의 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 에스테르(EMULFOR®); 폴리에톡실화된 지방산(예를 들어, SIMULSOL® M-53이라는 명칭으로 입수할 수 있는 스테아르 산), 폴리에톡실화된 이소옥틸페놀/포름알데히드 중합체(TYLOXAPOL®), 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르(BRIJ®); 폴리옥시에틸렌 비-페닐 에테르(TRITON®N), 폴리옥시에틸렌 이소옥틸페닐 에테르(TRITON®X)를 포함한다. 바람직한 합성 계면 활성제는 TWEEN®-80(폴리 옥시 에틸렌(20) 소르비탄 모노올레 에이트) 및 SPAN®-80(소르비탄 모노올레 에이트)과 같은 SPAN® 및 TWEEN® 이름으로 이용가능한 계면 활성제이다.

일반적으로 말하자면, 유화제(들)는 백신 조성물에 0.01 부피% 내지 40 부피%, 바람직하게는 0.1% 내지 15%, 보다 바람직하게는 2% 내지 10%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 아주 반트 제형에 존재하는 추가 성분은 양이온성 운반체 및 CpG를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온성 운반체를 포함하는 W/O 백신 조성물을 형성하는 이러한 보조제는 "TXO"로 지칭된다.

적합한 양이온성 운반체는 덱스트란, DEAE(디에틸-아미노에틸) 덱스트란(및 이의 유도체), PEG, 구아르검, 키토산 유도체, 하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC)와 같은 폴리셀룰로오스 유도체들, 폴리에틸렌이멘(polyethylenimene), 폴리리신과 같은 폴리아미노스 및 이와 유사한 것들이 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

CpG 올리고뉴클레오티드는 특정 염기-서열 상황에서 메틸화되지 않은 CG 디뉴클레오티드(CpG 모티프)의 존재를 특징으로 하는 약물치료(pharmacotherapeutic) 제제의 부류이다(Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, 이는 본원에 참조로 편입된다). 이들 CpG 모티프는 CG 디뉴클레오티드가 억제되는 진핵 생물 DNA에서 볼 수 없고, 그러나 존재하는 경우 일반적으로 메틸화되지만, 면역자극 특성을 부여하는 박테리아 DNA에는 존재한다.

선택된 구체예들에서, 본 발명의 어쥬번트는 소위 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 변형된 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오티드, 더욱더 바람직하게는 E-변형변 P-클래스 올리고뉴클레오티드를 이용한다. P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오티드는 팔린드롬(palindromes), 일반적으로 6 내지 20개의 뉴클레오티드 길이의 존재를 특징으로 하는 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 상기 P-클래스 올리고뉴클레오티드는 생체내 및/또는 시험관에서 자발적으로 자가-어셈블리하여 콘카타머(concatamers)로 될 수 있는 능력을 갖는다. 이들 올리고뉴클레오티드는 엄밀한 의미에서 단일-가닥이지만, 팔린드롬(palindromes)의 존재는 이차 및 삼차 구조 뿐만 아니라 콘카타머(concatamers) 또는 가능하게는 줄기-루프(stem-and-loop) 구조의 형성을 허용한다. P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오티드의 전체 길이는 19 내지 100개 뉴클레오티드, 가령, 19 내지 30개 뉴클레오티드, 30 내지 40개 뉴클레오티드, 40 내지 50개 뉴클레오티드, 50 내지 60개 뉴클레오티드, 60 내지 70개 뉴클레오티드, 70 내지 80개 뉴클레오티드, 80 내지 90개 뉴클레오티드, 90 내지 100개 뉴클레오티드 범위이다.

본 발명의 한 측면에서, 상기 면역자극 올리고뉴클레오티드는 5' TLR 활성화 도메인과 최소한 2개의 팔린드롬성 영역을 포함하는데, 하나의 팔린드롬성 영역은 길이가 최소한 6개 뉴클레오티드의 5' 팔린드롬성 영역이며, 길이가 최소한 8개 뉴클레오티드인 3' 팔린드롬성 영역에 직접적으로 연결되거나, 또는 스페이스를 통하여 연결된다.

상기 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오티드는 당분야에 공지된 기술에 따라 변형될 수 있다. 예를 들면, J-변형이란 요오드-변형된 뉴클레오티드를 지칭한다. E-변형은 에틸-변형된 뉴클레오티드(들)을 지칭한다. 따라서, E-변형된 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오티드는 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오티드이며, 이때 최소한 하나의 뉴클레오티드(바람직하게는 5' 뉴클레오티드)는 에틸화된다. 추가 변형에는 6-니트로-벤지이미다졸의 부착, O-메틸화, 프로닐-dU을 이용한 변형, 이노신 변형, 2-브로모비닐 부착(바람직하게는 우리딘에)이 포함된다.

상기 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오티드는 또한 포스포디에스테르 링키지 및 포스포티오에이트 링키지를 포함하나, 이에 국한되지 않는, 변형된 뉴클레오티드간 링키지(linkage)를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 합성되거나, 또는 시판되는 원료로부터 구할 수 있다.

P-클래스 올리고뉴클레오티드 및 변형된 P-클래스 올리고뉴클레오티드는 2008년 6월 12일자로 공개된 공개 PCT 출원 번호 WO 2008/068638에 더 기술된다. 변형된 P-클래스 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 적합한 예는 하기에 제시되지만, 이에 국한되지 않는다(서열 번호 1 내지 10에서, "*"는 포스포로티오에이트 결합을 나타내며, "_"는 포스포디에스테르 결합을 나타낸다).

서열 번호 1: 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'

서열 번호 2: 5' T*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

서열 번호 3: 5' T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'

서열 번호 4: 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

서열 번호 5: 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'

서열 번호 6: 5' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'

서열 번호 7: 5' EU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

서열 번호 8: 5' JU*C_G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'

서열 번호 9: 5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'

서열 번호 10: 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'

TXO 어쥬번트에서, 바람직하게는 팔린드롬성 서열과, 임의선택적으로 변형된 백본(backbone)을 함유하는 상기 면역자극 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 ODN은 투여당(per dose) 0.5 내지 400 μg의 양으로 존재할 수 있으며, 그리고 상기 다가양이온 운반체는 투여당 0.5 내지 400 mg의 양으로 존재할 수 있다. 상기 용량(dosages)은 대상체 종에 따라 가변적이다.

예를 들면, 특정 구체예들에서, 성체 돼지(swine)에게 더 적합하게는, TXO의 하나의 투여량은 약 50 내지 400 μg(가령, 성체 돼지(pigs)의 경우 50 내지 300, 또는 100 내지 250 μg, 또는 약 50 내지 약 100 μg)의 면역자극 올리고뉴클레오티드이며, 상기 다가양이온 운반체는 투여당 약 5 내지 약 500 mg(가령, 투여당 10 내지 500 mg, 또는 10 내지 300 mg, 또는 50 내지 200 mg)이다. 새끼돼지(piglets)에 더 적합한 구체예들에서, TXO의 하나의 투여량은 약 5 내지 100 μg(가령, 10 내지 80 μg, 또는 20 내지 50 μg)의 면역자극 올리고뉴클레오티드이며, 한편 상기 다가양이온 운반체는 투여당 1 내지 50 mg의 양(가령, 투여당 1 내지 25 mg, 또는 투여당 10 내지 25 mg)이다.

TXO 어쥬번트는 다음과 같이 준비될 수 있다:

a) 소르비탄 모노올레이트는 경질 미네랄 오일에 용해된다. 생성된 오일 용액은 멸균 여과된다;

b) 면역자극 올리고뉴클레오티드, DEAE 덱스트란 및 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트는 수성 상(phase)에 용해되며, 따라서 수성 용액이 형성된다; 그리고

c) 상기 수성 용액은 연속적 균질화 조건하에 상기 오일 용액에 추가되어, 어쥬번트 제형 TXO이 형성된다.

상기 항원은 수성 상의 제조 단계에서 면역자극 올리고 뉴클레오티드와 다가양이온성 운반의 혼합물에 첨가될 수 있다.

상기 백신은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는 추가 면역조절 분자를 더 포함할 수 있다: 사포닌(가령, Quil A 또는 이의 정제된 분획), 당지질, 가령, BAY®R1005(염 또는 염기 형태이건), MPLA, 스테롤(가령, 콜레스테롤), 양이온화된 스테롤(가령, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤, 일명 DC-콜레스테롤), 인지질(가령, 레시틴), 명반, 4가 아민, 가령, DDA(디메틸 디옥타데실 암모니움) 및 이와 유사한 것들.

상기 백신은 상이한 약제학적 수용가능한 부형제들, 가령, 완충제, pH 및/또는 삼투성 조절제, 및/또는 보존제를 추가 포함할 수 있다. 예를 들면, 클로로크레솔은 보존제로써 투여당 0.01 내지 0.5% w/v, 더 바람직하게는 0.05 내지 0.2%, 가장 바람직하게는, 약 0.1%의 양으로 이용될 수 있다. 다른 적합한 부형제는 아세트산 및 염(1 내지 2% w/v); 시트르산 및 염(1 내지 3% w/v); 붕산 및 염(0.5 내지 2.5% w/v); 그리고 인산 및 염(0.8 내지 2% w/v)을 포함한다. 적합한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드(0.003 내지 0.03% w/v); 클로로부탄올(0.3 내지 0.9% w/v); 파라벤(0.01 내지 0.25% w/v) 그리고 티메로살(0.004 내지 0.02% w/v) 및 이들의 조합을 포함한다.

비경구 제형은 전형적으로 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 약 3 내지 약 9, 또는 약 4 내지 약 8, 또는 약 5 내지 약 7.5, 또는 약 6 내지 약 7.5, 또는 약 7 내지 약 7.5의 pH)의 부형제를 함유할 수 있는 수용액이지만, 그러나, 일부 적용의 경우, 이들은 멸균 비-수성 용액으로 또는 건조된 형태로 더 적합하게 제형화되어, 멸균된 발열 물질이 없는 물과 같은 적합한 비히클과 함께 사용된다.

멸균 조건 하에서, 예를 들어, 동결 건조에 의한 비경구 제형의 제조는 당업자에게 널리 공지된 표준 제약 기술을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다.

상기 백신의 용적은 가변적일 수 있다. 일반적으로, 돼지의 표준 투여량은 투여 당 백신의 약 2 ml이다. 상이한 구체예들에서, 상기 용적은 가령, 0.125 ml 내지 약 5 ml, 가령, 2 ml, 1 ml, 0.5, ml, 0.25 ml 등등으로 가변적일 수 있다. 감소된 용적은 여전히 바람직하게는 50% 이상의 오일상을 함유하는 유-중-수(water-in-oil) 에멀젼일 것이다. 상기 항원, 다가양이온 운반체 및 CpG를 함유하는 면역자극 올리고뉴클레오티드의 양은 표준 2 ml 용량과 동일한 것이 바람직하다. 이러한 미세투여(microdosing)는 적어도 두 가지 측면에서 유리하다. 첫째, 동물에게는 덜 고통스럽고, 둘째는 특히 가축 동물에게 중요한데, 기름의 양이 줄어들면 대사가 더 신속해지고, 따라서 도축 보류(즉, 관리기관에서 허용하는 예방 접종과 도축 시점 간 시간)이 감소된다.

현재, Nipah 항원을 포함하는 백신은 없고, Hendra 항원을 포함하는 백신은 하나만 있다. EQUIVAC® Hendra(Zoetis)는 Hendra G 단백질에서 유래된 항원을 포함하며, ISCOM(면역 자극 복합체)로 어쥬번트화된다. EQUIVAC® Hendra는 근육내로 투여된다. 적절한 치료 요법은 일차접종(prime) 및 추가접종(boost)(일차접종 후 약 3 주 후 추가접종) 및 매년 재접종을 필요로 한다. 대조적으로, 본원에 기술된 백신은 단지 1 회 접종(일차접종과 추가접종과는 대조적)투여하고, 매년 재접종한다.

명세서에서 언급된 모든 공개 자료, 특허 공보 및 비-특허 공보는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가의 수준을 나타낸다. 이러한 모든 간행물은 각각의 개별 간행물이 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 편입된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 전적으로 포함된다.

본 발명이 특정 실시예들을 참조하여 설명되었지만, 이들 실시예들은 단지 본 발명의 원리 및 응용을 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 그러므로, 예시적인 실시예들에 대해 다수의 수정이 이루어질 수 있고, 하기 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 다른 구성이 고안될 수 있음을 이해해야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Zoetis Services LLC <120> VACCINES AGAINST HENDRA AND NIPAH VIRUS INFECTION <130> ZP000221A <140> PCT/US2018/066145 <141> 2018-12-18 <150> US 62/608,092 <151> 2017-12-20 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> immunostimulatory oligonucleotide <220> <221> misc_structure <222> (1)..(1) <223> phosphorothioate bond <220> <221> misc_structure <222> (3)..(4) <223> phosphorothioate bond <220> <221> misc_structure <222> (6)..(7) <223> phosphorothioate bond <220> <221> misc_structure <222> (9)..(11) <223> phosphorothioate bond <220> <221> misc_structure <222> (13)..(16) <223> phosphorothioate bond <220> <221> misc_structure <222> (18)..(22) <223> phosphorothioate bond <400> 1 tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> immunostimulatory oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> phosphorotioate bond <220> <221> misc_feature <222> (3)..(22) <223> phosphorotioate 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295 300 Leu Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala 305 310 315 320 Val Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala 325 330 335 Ile Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly 340 345 350 Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly 355 360 365 Phe Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile 370 375 380 Ile His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly 385 390 395 400 Val Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr 405 410 415 Asn Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala 420 425 430 Asp Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu 435 440 445 Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile 450 455 460 Lys Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg 465 470 475 480 Asn Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe 485 490 495 Asn Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe 500 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Claims (12)

1. Hendra 또는 Nipah 바이러스 감염으로부터 보호를 요하는 동물을 보호하는 방법에 있어서, 이 방법은 상기 동물에게 단일 투여량의 백신을 투여하는 것을 포함하며, 상기 백신은 다음을 포함하고 W/O 에멀젼인, 방법:
   a) Hendra 항원 또는 Nipah 항원을 포함하는 항원 성분; 및
   b) 오일, 다가양이온 운반체 및 CpG를 함유하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하는 어쥬번트.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 동물은 돼지(porcine)이며, Nipah 항원은 서열 번호 11에 대하여 최소한 95% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 아미노산 71 내지 602를 포함하는, 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열 번호 11에 대하여 최소한 98% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 아미노산 71 내지 602를 포함하는, 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 동물은 말(equine)이며, Hendra 항원은 서열 번호 12에 대하여 최소한 95% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 아미노산 73 내지 604를 포함하는, 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열 번호 12에 대하여 최소한 98% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 아미노산 73 내지 604를 포함하는, 방법.
6. 청구항 1 내지 5중 어느 한 항에 있어서, 상기 오일은 대사-불가능한 오일인, 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 대사-불가능한 오일은 경질 미네랄 오일인, 방법.
8. 청구항 1 내지 7중 어느 한 항에 있어서, 상기 다가양이온 운반체는 덱스트란, DEAE 덱스트란, PEG, 구아르검, 키토산 유도체, 하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC)와 같은 폴리셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌이멘(polyethylenimene), 폴리 아미노스 및 폴리리신으로부터 선택되는, 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 다가양이온 운반체는 DEAE 덱스트란인, 방법.
10. 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 Hendra 또는 Nipah 바이러스에 대하여 기존에 백신접종을 맞지 않았던, 방법.
11. 청구항 1 내지 10중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 투여량의 백신은 약 0.125 ml 내지 약 2 ml의 용적을 갖는, 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 단일 투여량의 백신은 약 0.25 ml 내지 약 1 ml의 용적을 갖는, 방법.

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