BR112020011962A2

BR112020011962A2 - vacinas contra infecção de vírus hendra e nipah

Info

Publication number: BR112020011962A2
Application number: BR112020011962-8A
Authority: BR
Inventors: Paul Joseph Dominowski; Duncan Mwangi; Dennis L. Foss; Sharath K. Rai; John Morgan Hardham
Original assignee: Zoetis Services Llc
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2020-11-17
Also published as: JP7370983B2; EP3727443A1; CN117323424A; TWI771546B; JP2021506911A; AU2018390817A1; PH12020550948A1; KR20200090836A; WO2019126110A1; KR20230039766A; TW201929658A; CN111511398A; US20210008195A1

Abstract

A presente invenção refere-se a um método de proteção de um animal em sua necessidade de infecção com vírus Hendra ou Nipah compreendendo administração ao dito animal de uma dose simples de uma vacina, a vacina compreendendo um componente antígeno compreendendo um antígeno Hendra ou um antígeno Nipah; e um adjuvante compreendendo óleo, veículo policatiônico e um oligonucleotídeo imunoestimulador contendo CpG, onde a vacina é uma emulsão W/O.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACI- NAS CONTRA INFECÇÃO DE VÍRUS HENDRA E NIPAH".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se genericamente ao campo de vacinas animais contra infecções de vírus Hendra (HeV) e vírus Nipah (NiV).

ANTECEDENTES

[0002] Paramixovírus tais como HeV e NiV possuem duas princi- pais glicoproteínas ancoradas em membrana no envelope da partícula viral. Uma glicoproteína é requerida para ligação de virion a receptores sobre células hospedeiras e é designada tanto como proteína hema- glutinina – neuraminidase (HN) ou proteína hemaglutinina (H), e a ou- tra é glicoproteína (G), que não tem atividades de hemaglutinação nem neuraminidase. As glicoproteínas de ligação são proteínas de mem- brana tipo II, onde o terminus amino (N) de molécula é orientado na direção de citoplasma e o terminus carboxi (C) de proteína é extracelu- lar. A outra glicoproteína principal é a glicoproteína de fusão (F), que é uma glicoproteína de envelope fusogênica classe I trimérica contendo duas regiões de repetição heptavalente (HR) e um peptídeo de fusão hidrofóbico. HeV e NiV infectam células através de um processo de fusão de membrana independente de pH em células hospedeiras re- ceptivas através de ação em concerto de sua ligação de glicoproteína G e glicoproteína F seguindo ligação de receptor. A função primária da glicoproteína G de ligação de HeV e NiV é engajar apropriados recep- tores sobre as superfícies de células hospedeiras, que para a maioria de paramixovírus bem caracterizados são metades ácido siálico. As glicoproteínas G de HeV e NiV utilizam os receptores de proteína de célula hospedeira efrina B2 e/ou efrina B3 e anticorpos foram desen- volvidos os quais bloqueiam ligação viram através de glicoproteína G (WO2006137931, Bishop (2008) J. Virol. 82: 11398-11409). Ainda, fo-

ram desenvolvidas vacinas que também usam a glicoproteína G como um meio para geração de uma resposta imuno protetora contra infec- ção com HeV e NiV (WO2009117035).

[0003] Presentemente existe uma vacina licenciada para a pre- venção de infecção ou doença causada por vírus Hendra (Equivac HeV; Zoetis) aprovada para uso em cavalos, embora não exista vacina licenciada para infecção com vírus Nipah. Ambos, vírus Nipah e vírus Hendra sejam agentes de prioridade categoria C de National Institute of Allergy and Infectious Disease de United States de conceito de bio- defesa. Ainda, na medida em que estes vírus são agentes Nível-4 de Segurança Biológica zoonótica (BSL-4), produção de vacinas e/ou di- agnósticos, com segurança é muito cara e difícil. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos classifica ambos, vírus Nipah e vírus Hendra como Doenças Animais Estrangeiras de Alta Consequência. SUMÁRIO da INVENÇÃO

[0004] No primeiro aspecto, a invenção provê um método de pro- teção de um animal em sua necessidade de infecção de vírus Hendra ou Nipah compreendendo administração ao dito animal de uma dose simples de uma vacina, a vacina compreendendo: um componente an- tígeno compreendendo um antígeno Hendra ou um antígeno Nipah; e um adjuvante compreendendo óleo, veículo policatiônico e um oligo- nucleotídeo imuno estimulador contendo CpG, onde a vacina é uma emulsão W/O.

[0005] Em certas modalidades, o animal é um animal suíno e o antígeno Nipah compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 98%) idêntica a SEQ ID NO: 11 ou aos seus aminoácidos 71-602.

[0006] Em certas modalidades, onde o animal é um animal equino e o antígeno Hendra compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 98%) idêntica a SEQ ID

NO: 12 ou aos seus aminoácidos 73-604.

[0007] Ainda em modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades descritas acima, o óleo é um óleo não metabolizável.

[0008] Ainda em modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades descritas acima, o veículo policatiônico é dextrano DEAE.

[0009] Ainda em modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades descritas acima, a dita dose simples de vacina tem volume de cerca de 0,125 mL a cerca de 2 mL.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] As Figuras 1 e 2 ilustram SEQ ID NOs: 11 e 12, que são glicoproteínas G de vírus Nipah e Hendra, respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES SELECIONADAS Definições

[0011] “Cerca” ou “aproximadamente”, quando usados em cone- xão com uma variável numérica mensurável, referem-se ao valor indi- cado da variável e a todos os valores da variável que estão dentro de erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro de intervalo de confiança de 95% para a média) ou dentro de 10 por cento do valor indicado, qual seja maior, a menos que cerca seja usado em referên- cia a intervalos de tempo em semanas onde “cerca de 3 semanas”, significa 17 a 25 dias, e cerca de 2 a cerca de 4 semanas são 10 a 40 dias.

[0012] “Antígeno” ou “imunógeno” referem-se a qualquer substân- cia que é reconhecida pelo sistema imune do animal e gera uma res- posta imune. O termo inclui bactérias, vírus ou parasitas mortos, inati- vados, atenuados, ou modificados. O termo “antígeno” também inclui polinucleotídeos, polipeptídeos, proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, extrato de proteína, células (incluindo células de tumor), te-

cidos, polissacarídeos, ou lipídeos, ou seus fragmentos, individualmen- te ou em qualquer combinação dos mesmos. O termo antígeno tam- bém inclui anticorpos, tais como anticorpos anti-idiotipo ou seus frag- mentos, e a mimotopos de peptídeo sintético que podem imitar um an- tígeno ou determinante antigênico (epítopo).

[0013] “Tampão” significa um sistema químico que previne mu- dança na concentração de uma outra substância química, por exem- plo, sistemas doadores e receptores de prótons servem como tampões evitando acentuadas mudanças em concentração de íon hidrogênio (pH). Ainda um exemplo de um tampão é uma solução contendo uma mistura de um ácido fraco e seu sal (base conjugada) ou uma base fraca e seu sal (ácido conjugado).

[0014] O método “compreendendo administração a um sujeito de uma dose simples de vacina X” exclui regimes de tratamento onde mais de uma dose de vacina X é administrada.

[0015] “Consistindo essencialmente” como aplicado às formula- ções adjuvantes refere-se à formulação que não contém agentes adju- vantes ou de modulação imune adicionais não recitados nas quantida- des nas quais o dito agente exerce mensuráveis efeitos de adjuvante ou modulação imune.

[0016] A referência a uma composição ou vacina sendo “efetiva como uma vacina de dose simples” refere-se a uma vacina Nipah ou Hendra que, com uma administração simples a um animal que não foi imunizado contra Nipah ou Hendra, provê duração de imunidade de pelo menos cinco meses, por exemplo, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze me- ses, ou quatorze meses contra desafio Nipah ou Hendra, respectiva- mente.

[0017] O termo “emulsificante” é usado amplamente na presente exposição. Ele inclui substâncias genericamente aceitas como emulsi-

ficantes, por exemplo, diferentes produtos de linhas de produtos TWEEN ou SPAN (ésteres de ácidos graxos de sorbitol polietoxilado e tensoativos sorbitano substituídos com ácido graxo, respectivamente), e diferentes aperfeiçoadores de solubilidade como Óleo de Mamona PEG-40 ou um outro óleo hidrogenado PEGilado.

[0018] “Quantidade imunologicamente protetora” ou “quantidade imunologicamente efetiva” ou “quantidade efetiva para produzir uma resposta imune” de um antígeno é uma quantidade efetiva para induzir uma resposta imunogênica no receptor. A resposta imunogênica pode ser suficiente para propósitos diagnósticos ou outros testes, ou pode ser adequada para prevenir sinais ou sintomas de doença, incluindo efeitos adversos de saúde ou suas complicações, causados por infec- ção com um agente de doença. Tanto imunidade humoral como imuni- dade mediada por célula ou ambas podem ser induzidas. A resposta imunogênica de um animal para uma composição imunogênica pode ser avaliada, por exemplo, indiretamente através de medição de títulos de anticorpos, ensaios de proliferação de linfócitos, ou diretamente através de monitoração de sinais e sintomas após desafio com linha- gem tipo selvagem, enquanto a imunidade protetora conferida por uma vacina pode ser avaliada através de medição, por exemplo, de redu- ção em sinais clínicos tais como mortalidade, morbidez, número de temperatura, condição física total, e saúde e desempenho total do su- jeito. A resposta imune pode compreender, sem limitação, indução de imunidade celular e/ou humoral.

[0019] “Imunogênico” significa provocando uma resposta imune ou antigênica. Assim uma composição imunogênica pode ser qualquer composição que induz uma resposta imune.

[0020] “Lipídeos” refere-se a qualquer de um grupo de compostos orgânicos, incluindo as gorduras, óleos, ceras, esteróis, e triglicerídeos que são normalmente considerados insolúveis (ou pobremente solú-

veis) em água mas solúveis em solventes orgânicos não polares, são oleosos ao toque, e junto com carboidratos e proteínas constituem o principal material estrutural de células vivas.

[0021] “Farmaceuticamente aceitável” refere-se a substâncias, que estão dentro do escopo de som de julgamento médico, apropriadas para uso em contato com os tecidos de sujeitos sem indevida toxidez, irritação, resposta alérgica, e similares, proporcional com uma razoável razão de benefício-para-risco, e efetivas para seu uso pretendido.

[0022] A presente invenção provê um método de vacinação de um animal em sua necessidade contra infecção de Hendra e/ou Nipah através de administração ao animal de uma dose simples da vacina aqui descrita. Em resumo, a vacina contém antígeno Hendra ou Nipah com adjuvante TXO como descrito em maiores detalhes abaixo. Antígeno

[0023] Polipeptídeos de glicoproteína G de vírus Hendra que são úteis na prática da presente invenção, e a sua expressão recombinan- te, é feita referência à inteira exposição de pedidos de patente interna- cionais publicados WO 2012/158643 e WO 2006/085979 onde tal in- formação é claramente mostrada. Exemplos preferidos de específicos polipeptídeos de proteína G de vírus Hendra úteis aqui são mostrados em WO 2012/158643, e incluem, por exemplo: proteína G de inteiro comprimento (SEQ ID NO: 12); um seu fragmento solúvel (codificando aminoácidos 73-604 de SEQ ID NO: 12); e um adicional fragmento ali mostrado tendo uma sequência líder Ig(kappa). Ver, por exemplo, SEQ ID NO: 15 de WO 2012/158643. Genericamente, as formas solúveis da glicoproteína G de vírus Hendra compreendem todo ou parte do ecto- domínio, e são produzidas através de supressão de todo ou parte do domínio transmembrana da glicoproteína G, e toda ou parte da cauda citoplásmica. Preferivelmente, a sequência de gene codificando é có- don otimizada para expressão.

[0024] Em algumas modalidades, a glicoproteína G de Hendra po- de estar em forma dimérica e/ou tetramérica. Tais dímeros dependem da formação de ligações dissulfeto formadas entre resíduos cisteína na glicoproteína G. Tais ligações dissulfeto podem corresponder àque- les formadas na glicoproteína G nativa, ou diferentes ligações dissulfe- to podem ser formadas resultando em diferentes formas diméricas e/ou tetraméricas da glicoproteína G que aperfeiçoam antigenicidade. Adicionalmente, formas não dimerizadas ou tetramerizadas também são úteis de acordo com a prática da presente invenção, novamente levando em conta que glicoproteína G proporciona numerosos epíto- pos dependentes de conformação (isto é, que surgem de uma estrutu- ra tridimensional terciária) e que preservação de numerosos tais epíto- pos naturais é da mesma maneira altamente preferida de modo a pro- porcionar uma resposta de anticorpo neutralizante.

[0025] Genericamente falando, construção de vetores de expres- são para as proteínas G de Hendra pode ser como descrito em Exem- plo 1 de WO 2012/158643, com resultante expressão de proteína a partir de células CHO sendo como descrito em seu Exemplo 2, ou al- ternativamente, usando um sistema Vaccinia (ver seu Exemplo 3) ou células 293 (ver seu Exemplo 4). Em um específico exemplo preferido, a proteína G solúvel é provida como aminoácidos 73-604 da glicopro- teína G de vírus Hendra nativa (ver SEQ ID NO: 2 em WO 2012/158643 que é idêntica a SEQ ID NO: 12. Sua dimerização ocorre espontaneamente, concomitante com expressão a partir de células CHO, e resultante proteína G é aproximadamente 50% dímero e 50% tetrâmero, com pouca permanecendo monômero. Expressão em célu- las 293F conduz a cerca de 70% de dímero.

[0026] Construção de vetores de expressão para proteínas G de Nipah também foi descrita. Ver, por exemplo, Exemplos 1 e 2 em WO 2012/158643. Exemplos preferidos de específicos polipeptídeos de proteína G de vírus Nipah úteis aqui são mostrados em WO 2012/158643, e incluem, por exemplo: proteína G de inteiro compri- mento (SEQ ID NO: 11); um seu fragmento solúvel (codificando ami- noácidos 71-602de SEQ ID NO: 11); e um adicional fragmento ali mos- trado tendo uma sequência líder Ig(kappa). Genericamente, as formas solúveis da glicoproteína G de vírus Hendra compreendem todo ou parte do ectodomínio, e são produzidas através de supressão de todo ou parte do domínio transmembrana da glicoproteína G, e toda ou par- te da cauda citoplásmica. Preferivelmente, a sequência de gene codifi- cante é códon otimizada para expressão.

[0027] O antígeno G de Nipah pode ser produzido similarmente a antígeno G Hendra, por exemplo, como descrito em Exemplo 3 de WO 2012/158643.

[0028] Doses preferidas de antígeno para animais grandes estão na faixa de cerca de 50 a cerca de 200 microgramas por dose, com cerca de 100 microgramas sendo uma dose mais preferida. Para ani- mais menores, tais como cães, quantidades menores são necessárias, tais como 5-50 microgramas, por exemplo, cerca de 10 microgramas, cerca de 15 microgramas, cerca de 20 microgramas, cerca de 25 mi- crogramas, cerca de 30 microgramas, cerca de 35 microgramas, cerca de 40 microgramas, cerca de 45 microgramas.

[0029] Em certas modalidades, o antígeno Nipah e/ou o antígeno Hendra diferem de SEQ ID NOs 11 e 12, respectivamente, por até 5% de aminoácidos. Preferivelmente, os aminoácidos alterados são substi- tuídos conservativamente. Os seguintes oito grupos contêm cada ami- noácidos que são substituições conservativas uns para os outros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleuci- na (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenil alanina (F), Tiro- sina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C),

Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Co., N.Y. (1984)).

[0030] Nas modalidades, onde o antígeno Hendra ou Nipah com- preende um fragmento adicional (por exemplo, etiquetas de purificação ou sequência líder Ig(kappa)), de modo a determinar se o antígeno é pelo menos 95% idêntico a SEQ ID NOs 11 ou 12, tais fragmentos adicionais são excluídos de comparação.

[0031] Ainda em modalidades, o componente antígeno pode com- preender um vetor compreendendo uma sequência de ácidos nucléi- cos que codifica qualquer uma das sequências de aminoácidos descri- tas acima. Vetores apropriados incluem vetores pox (por exemplo, ve- tores vacinia ou vetores canarypox como ALVAC), vetores adenovirais, plataforma SIRNAVAX e similares. Adjuvante

[0032] As vacinas da presente invenção são emulsões água-em- óleo (W/O). Múltiplos óleos e suas combinações são apropriados para uso na presente invenção. Estes óleos incluem, sem limitações, óleos animais, óleos vegetais, assim como óleos não metabolizáveis. Exem- plos não limitantes de óleos vegetais apropriados para a presente in- venção são óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco, e óleo de oliva. Exemplo não limitante de óleo animal é esquala- no. Apropriados exemplos não limitantes de óleos não metabolizáveis incluem óleo mineral leve, óleos saturados de cadeia reta ou ramifica- da, e similares.

[0033] Em um conjunto de modalidades, o óleo usado nas formu- lações adjuvantes da presente invenção é um óleo mineral leve. Como aqui usado, o termo “óleo mineral” refere-se a uma mistura de hidro- carbonetos líquidos obtida de petrolatum via uma técnica de destila- ção. O termo é sinônimo com “parafina liquefeita”, “petrolatum líquido” e “óleo mineral branco”. O termo também é pretendido incluir “óleo mi-

neral leve”, isto é, óleo que é similarmente obtido por destilação de pe- trolatum, mas que tem um peso específico levemente menor que óleo mineral branco. Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Scien- ces, 18 th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, nas páginas 788 e 1323). Óleo mineral pode ser obtido a partir de várias fontes comerciais, por exemplo, J.T. Baker (Phillipsburg, Pa.), USB Corporation (Cleveland, Ohio). Óleo mineral preferido é óleo mineral leve comercialmente disponível sob a marca DRAKEOL.

[0034] Tipicamente, a fase óleo está presente em uma quantidade de 50% a 95% em volume; preferivelmente, em uma quantidade maior que 50% a 85%; mais preferivelmente, em uma quantidade de maior que 50% a 60%, e mais preferivelmente na quantidade de maior que 50-52% v/v da composição vacina. A fase oleosa inclui óleo e emulsifi- cantes (por exemplo, SPAN 80, TWEEN 80, etc.), se quaisquer tais emulsificantes estão presentes. O volume da fase oleosa é calculado como uma soma de volumes do óleo e o emulsificante(s). Assim, por exemplo, se o volume do óleo é de 40% e o volume do emulsifican- te(s) é 12% de uma composição, então a fase oleosa pode estar pre- sente em 52% v/v da composição. Similarmente, se o óleo está pre- sente na quantidade de cerca de 45% e o emulsificante(s) está pre- sente na quantidade de cerca de 6% de uma composição, então a fase oleosa está presente em cerca de 51% v/v da composição .

[0035] Em um subconjunto de modalidades, aplicável a todos ad- juvantes / vacinas da presente invenção, a porcentagem em volume do óleo e o emulsificante solúvel em óleo juntos é pelo menos 50%, por exemplo, 50% a 95% em volume; preferivelmente, em uma quantidade maior que 50% a 85%; mais preferivelmente, em uma quantidade de 50% a 60%, e mais preferivelmente na quantidade de 50-52% v/v da composição vacina. Assim, por exemplo e sem limitações, o óleo pode estar presente na quantidade de 45% e o emulsificante solúvel em li-

pídeo pode estar presente na quantidade maior que 5% v/v. Assim, a porcentagem em volume do óleo e o emulsificante solúvel em óleo jun- tos pode ser pelo menos 50%.

[0036] Ainda em um outro subconjunto, aplicável a todas as vaci- nas da invenção, porcentagem em volume do óleo está acima de 40%, por exemplo, 40% a 90% em volume; 40% a 85%; 43% a 60%, 44- 50% v/v da composição vacina.

[0037] Emulsificantes apropriados para uso nas presentes emul- sões incluem emulsificantes biologicamente compatíveis naturais e tensoativos sintéticos não naturais. Emulsificantes biologicamente compatíveis incluem compostos fosfolipídeos ou uma mistura de fosfo- lipídeos. Fosfolipídeos preferidos são fosfatidil colinas (lecitina), tais como lecitina de soja ou ovo. Lecitina pode ser obtida como uma mis- tura de fosfatídeos e triglicerídeos através de lavagem com água de óleos vegetais crus, e separação e secagem de resultantes gomas hi- dratadas. Um produto refinado pode ser obtido através de fraciona- mento de mistura para fosfolipídeos insolúveis em acetona e glicolipí- deos restantes após remoção dos triglicerídeos e óleo vegetal através de lavagem com acetona. Alternativamente, lecitina pode ser obtida a partir de várias fontes comerciais. Outros fosfolipídeos apropriados in- cluem fosfatidil glicerol, fosfatidil inositol, fosfatidil serina, ácido fosfatí- dico, cardiolipina, e fosfatidil etanol amina. Os fosfolipídeos podem ser isolados a partir de fontes naturais ou sintetizados convencionalmente.

[0038] Em modalidades adicionais, os emulsificantes aqui usados não incluem lecitina, ou usam lecitina em uma quantidade que não é imunologicamente efetiva.

[0039] Emulsificantes sintéticos, não naturais apropriados para uso nas formulações adjuvantes da presente invenção incluem tensoativos não iônicos baseados em sorbitano, por exemplo, tensoativos sorbita- no substituídos com ácido graxo (comercialmente disponíveis sob a marca SPAN ou ARLACEL), ésteres de ácido graxo de sorbitol polie- toxilado (TWEEN), ésteres de polietileno glicol de ácidos graxos de fontes tais como óleo de mamona (EMULFOR); ácido graxo polietoxi- lado (por exemplo, ácido esteárico disponível sob a marca SIMULSOL M-53), polímero isooctil fenol / formaldeído polietoxilado (TYLOXA- POL), éteres de álcool graxo de polioxietileno (BRIJ); polioxietileno no- nil fenil éteres (TRITON N), polioxietileno isooctil fenil éteres (TRITON X). Tensoativos sintéticos preferidos são os tensoativos disponíveis sob a marca SPAN e TWEEN, tais como TWEEN-80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano) e SPAN-80 (monooleato de sorbitano).

[0040] Genericamente falando, o emulsificante(s) pode estar pre- sente na composição vacina em uma quantidade de 0,01% a 40% em volume, preferivelmente, 0,1% a 15%, mais preferivelmente 2% a 10%.

[0041] Adicionais ingredientes presentes nas presentes formula- ções adjuvantes incluem veículos catiônicos e oligonucleotídeos imu- noestimuladores contendo CpG. Tais adjuvantes formando composi- ções de vacina W/O compreendendo o oligonucleotídeo imunoestimu- lador e o veículo policatiônico são referidos como “TXO”.

[0042] Apropriados veículos catiônicois incluem, sem limitações, dextrano, DEAE (dietil amino etil) dextrano (e seus derivados), PEGs, gomas guar, derivados de quitosano, derivados de policelulose como hidroxi etil celulose (HEC) polietileno imina, poli aminas como polilisina e similares.

[0043] Oligonucleotídeos CpG são uma classe de agentes fármaco terapêuticos que são caracterizados pela presença de um dinucleotí- deo CG não metilado em específicos contextos base – sequência (mo- tivo CpG). (Hansel TT, Barnes PJ (eds.): New Drugs for Asthmna, Al- lergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, que é aqui incorporado por referência). Estes motivos CpG não são vistos em DNA eucariótico, onde dinucleotídeos CG são su-

primidos e, quando presentes, usualmente metilados, mas estão pre- sentes em DNA bacteriano ao qual eles conferem propriedades imuno estimuladoras.

[0044] Em modalidades selecionadas, os adjuvantes da presente invenção utilizam um assim chamado oligonucleotídeo imuno estimu- lador classe-P, mais preferivelmente, oligonucleotídeos imuno estimu- ladores classe-P modificados, mesmo mais preferivelmente, oligonu- cleotídeos classe-P modificados-E. Oligonucleotídeos imuno estimula- dores classe-P são oligonucleotídeos CpG caracterizados pela pre- sença de palíndromos, genericamente de 6-20 nucleotídeos de com- primento. Os oligonucleotídeos classe-P têm a habilidade para auto- montagem espontânea em concatâmeros tanto in vitro e/ou in vivo. Estes oligonucleotídeos são, em um senso restrito, de fita simples, mas a presença de palíndromos permite a formação de concatâmeros ou possivelmente estruturas tronco-e-laço, assim como estruturas se- cundárias e terciárias. O comprimento total de oligonucleotídeos imuno estimuladores classe-P está entre 19 e 100 nucleotídeos, por exemplo, 19-30 nucleotídeos, 30-40 nucleotídeos, 40-50 nucleotídeos, 50-60 nucleotídeos, 60-70 nucleotídeos, 70-80 nucleotídeos, 80-90 nucleotí- deos, 90-100 nucleotídeos.

[0045] Em um aspecto da invenção o oligonucleotídeo imuno esti- mulador contém um domínio de ativação TLR 5’ e pelo menos duas regiões palindrômicas, uma região palindrômica sendo uma região pa- lindrômica 5’ de pelo menos 6 nucleotídeos em comprimento e conec- tada a uma região palindrômica 3’ de pelo menos 8 nucleotídeos em comprimento tanto diretamente como através de um espaçador.

[0046] Os oligonucleotídeos imuno estimuladores classe-P podem ser modificados de acordo com técnicas conhecidas. Por exemplo, modificação-J refere-se a nucleotídeos modificados-iodo. Modificação- E refere-se a nucleotídeo(s) modificado-etila. Assim, oligonucleotídeos imuno estimulador classe-P modificado-E são oligonucleotídeos imu- noestimuladores classe-P, onde pelo menos um nucleotídeo (preferi- velmente nucleotídeo 5’) está etilado. Adicionais modificações incluem ligação de 6-nitro benzimidazol, O-metilação, modificação com propi- nil-dU, modificação inosina, ligação de 2-bromo vinila (preferivelmente a uridina).

[0047] Os oligonucleotídeos imuno estimuladores classe-P tam- bém podem conter uma ligação inter-nucleotídeo modificada incluindo, sem limitações, ligações fosfo diéster e ligações fósforotioato. Os oli- gonucleotídeos da presente invenção podem ser sintetizados ou obti- dos de fontes comerciais.

[0048] Oligonucleotídeos classe-P e oligonucleotídeos classe-P modificados ainda são mostrados em pedido PCT publicado no. WO 2008/068638, publicado em 12 de junho de 2008. Apropriados exem- plos não limitantes de oligonucleotídeos imuno estimuladores classe-P modificados são providos abaixo (em SEQ ID NOs 1-10, “*” refere-se a uma ligação fósforotioato e “_” refere-se a uma ligação fosfodiéster).

[0049] Em adjuvantes TXO, o oligonucleotídeo imuno estimulador, preferivelmente um ODN, preferivelmente contendo uma sequência palindrômica, e opcionalmente com uma cadeia principal modificada, pode estar presente na quantidade de 0,5-400 ug por dose, e o veículo policatiônico pode estar presente na quantidade de 0,5-400 mg por dose. Variam dependendo das espécies objetos.

[0050] Por exemplo, em certas modalidades mais apropriadas pa- ra suínos adultos, uma dose de TXO pode compreender entre cerca de 50 e 400 microgramas (por exemplo, 50-300, ou 100-250 micro- gramas, ou cerca de 50 a cerca de 100 microgramas para porcos adul- tos) do oligonucleotídeo imuno estimulador, e o veículo policatiônico pode estar presente na quantidade de entre cerca de 5 e cerca de 500 mg por dose (por exemplo, 10-500 mg, ou 10-300 mg, ou 50-200 mg por dose). Em modalidades mais apropriadas para porcos jovens, uma dose de TXO pode compreender entre cerca de 5 e 100 microgramas (por exemplo, 10-80 microgramas, ou 20-50 microgramas) do oligonu- cleotídeo imuno estimulador, enquanto o veículo policatiônico pode estar presente na quantidade de 1-50 mg por dose (por exemplo, 1-25 mg por dose, ou 10-25 mg por dose).

[0051] Adjuvantes TXO podem ser preparados como se segue:

[0052] a) Mono oleato de sorbitano é dissolvido em óleo mineral leve. A resultante solução de óleo é filtrada estéril;

[0053] b) O oligonucleotídeo imuno estimulador, DEAE dextrano e monooleato de polioxietileno (20) sorbitano são dissolvidos em fase aquosa, assim formando a solução aquosa; e

[0054] c) A solução aquosa é adicionada à solução de óleo sob homogeneização contínua assim formando a formulação adjuvante TXO.

[0055] O antígeno pode ser adicionado na etapa de preparação da fase aquosa – na mistura do oligonucleotídeo imuno estimulador e o veículo policatiônico.

[0056] A vacina ainda pode compreender adicionais moléculas imuno moduladoras incluindo sem limitações, saponinas (por exemplo, Quil A ou suas frações purificadas), glicolipídeos, por exemplo, BAY R1005 (se em uma forma de sal ou uma base), MPLA, esteróis (por exemplo, colesterol), esteróis cationizados (por exemplo, 3β-[N-(N’,N’-

dimetil amino etano) carbamoil] colesterol, também conhecido como DC-colesterol), fosfolipídeos (por exemplo, lecitina), alúmen, aminas quaternárias, por exemplo, DDA (dimetil dioctadecil amônio) e simila- res.

[0057] A vacina ainda pode compreender diferentes excipientes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, tampões, ajustadores de pH e/ou osmolaridade, e/ou preservativos. Por exemplo, cloro cresol pode ser usado como um preservativo, na quantidade de 0,01 a 0,5% peso / volume por dose, mais preferivelmente 0,05 a 0,2%, mais prefe- rivelmente, cerca de 0,1%. Outros excipientes apropriados incluem: ácido acético e um sal (1-2% peso / volume); ácido cítrico e um sal (1- 3% peso / volume); ácido bórico e um sal (0,5-2,5% peso / volume); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2% peso / volume). Apropriados preserva- tivos incluem cloreto de benzalcônio (0,003-0,03% peso / volume); clo- ro butanol (0,3-0,9% peso / volume); parabenos (0,01-0,25% peso / volume) e timerosal (0,004-0,02% peso / volume), e suas combina- ções.

[0058] Formulações parenterais são tipicamente soluções aquosas que contêm excipientes tais como sais, carboidratos e agentes tampo- nantes (preferivelmente para um pH de cerca de 3 a cerca de 9, ou de cerca de 4 a cerca de 8, ou de cerca de 5 a cerca de 7,5, ou de cerca de 6 a cerca de 7,5, ou cerca de 7 a cerca de 7,5), mas, para algumas aplicações, elas podem ser mais apropriadamente formuladas como uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca para ser usada em conjunção com um apropriado veículo tal como água livre de pirogênio, estéril.

[0059] A preparação de formulações parenterais sob condições estéreis, por exemplo, através de liofilização, pode ser facilmente rea- lizada usando-se técnicas farmacêuticas bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

[0060] O volume da vacina pode ser variado. Genericamente, dose padrão para suíno é de cerca de 2 mL da vacina por administração. Em diferentes modalidades, o volume pode ser variado, por exemplo, de 0,125 mL a cerca de 5 mL, por exemplo, 2 mL, 1 mL, 0,5 mL, 0,25 mL, etc. O volume diminuído ainda pode ser uma emulsão água-em- óleo, preferivelmente contendo 50% ou mais de fase oleosa. As quan- tidades do antígeno, o veículo policatiônico e um oligonucleotídeo imuno estimulador contendo CpG preferivelmente podem ser as mes- mas como na dose padrão de 2 mL. Tal microdosagem é vantajosa pelo menos em dois aspectos. Primeiro, ela é menos dolorosa para um animal e segundo, particularmente importante para animais de criação, diminuída quantidade de óleo pode metabolizar mais rápido e assim diminuir retenção em matadouro (isto é, o tempo entre a vacinação e matadouro permitido por agências reguladoras).

[0061] Correntemente, não existem vacinas no mercado contendo antígeno Nipah e somente uma vacina contendo antígeno Hendra. EQUIVAC Hendra (Zoetis) contém um antígeno derivado de proteína G Hendra e tem adjuvante ISCOMs (complexo imuno estimulante). EQUIVAC Hendra é administrada intramuscularmente. Próprio regime de tratamento requer ambas administrações primeira e de reforço (com administração de reforço cerca de três semanas após a primeira administração), e revacinações anuais. Em contraste, as vacinas aqui descritas são administradas somente uma vez (como opostas a uma primeira administração e administração de reforço) com revacinações anuais.

[0062] Todas as publicações citadas no relatório descritivo, am- bas, publicações de patentes e publicações não patentes, são indicati- vas do nível de conhecimento daqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas estas publicações são aqui inteiramen- te incorporadas por referência para a mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada por referência.

[0063] Embora a presente invenção tenha sido descrita com refe- rência a particulares modalidades, é para ser entendido que estas mo- dalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Por isso é para ser entendido que numerosas mo- dificações podem ser feitas para as modalidades ilustrativas e que ou- tros arranjos podem ser imaginados sem se fugir do espírito e escopo da presente invenção como definido pelas reivindicações que se se- guem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de proteção de um animal em sua necessidade a partir de infecção com vírus Hendra ou Nipah, caracterizado pelo fato de compreender administração para o dito animal de uma dose sim- ples de uma vacina, a vacina compreendendo: a) um componente antígeno compreendendo um antíge- no Hendra ou um antígeno Nipah; e b) um adjuvante compreendendo óleo, veículo policatiô- nico e um oligonucleotídeo imuno estimulador contendo CpG, em que a vacina é uma emulsão W/O.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o animal ser um animal suíno e o antígeno Nipah compre- ender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 11 ou aos seus aminoácidos 71-602.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a sequência de aminoácidos ser pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 11 ou aos seus aminoácidos 71-602.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o animal ser um animal equino e o antígeno Hendra com- preender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idên- tica a SEQ ID NO: 12 ou aos seus aminoácidos 73-604.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a sequência de aminoácidos ser pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 12 ou aos seus aminoácidos 73-604.

6. Método de acordo com qualquer uma de reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de o óleo ser um óleo não metabolizável.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o óleo não metabolizável ser óleo mineral leve.

8. Método de acordo com qualquer uma de reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de o veículo policatiônico ser selecionado de dextrano, DEAE dextrano, PEGs, gomas guar, derivados de quito- sano, derivados de policelulose como hidroxi etil celulose (HEC) polie- tileno imina, poli aminas (aminos) e polilisina.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o veículo policatiônico ser DEAE Dextrano.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de o dito animal não ter sido previ- amente vacinado contra vírus Hendra ou Nipah.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de a dita dose simples de vacina ter volume de cerca de 0,125 mL a cerca de 2 mL.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de a dita dose simples de vacina ter um volume de cerca de 0,25 mL a cerca de 1 mL.