KR102277013B1 - 아쥬반트화된 비로좀을 제공하는 방법 및 이에 의해 수득가능한 아쥬반트화된 비로좀 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역학 및 백신학 분야에 관한 것이다. (i) 막 융합 단백질을 포함하는, 아쥬반트화되지 않은 비로좀의 수성 조성물을 제공하는 단계; (ii) 물과 균질한 혼합물을 형성할 수 있는 약학적으로 허용가능한 비수성 용매에서 양친매성 아쥬반트를 용해시키는 단계; 및 (iii) 상기 수성 비로좀 조성물에서 상기 아쥬반트 용액을 희석하여 비로좀의 막 융합 활성을 보존하면서 아쥬반트가 비로좀 막의 외부 층내로 삽입되도록 유도하는 단계를 포함하는, 아쥬반트화된 비로좀의 제조 방법이제공된다. 상기 방법에 의해 수득가능한 아쥬반트화된 비로좀 및 비로좀을 포함하는 백신이 또한 제공된다.
Description
본 발명은 면역학 및 백신학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 비로좀(virosome)의 개선된 제공 방법, 비로좀을 포함하는 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.
막-함유(외피보유) 바이러스에 대한 백신은 대부분 사멸되거나 살아있는 약독화된 바이러스 또는 그들의 단백질의 제제(예를 들어, 분할 바이러스 백신 또는 서브유닛 제제)로 이루어진다. 사멸된 바이러스 및 단백질 제제를 이용한 백신접종은 복제성의 살아있는 약독화 또는 재조합 바이러스를 이용한 백신접종보다 안전하며, 이는 후자는 돌연변이를 일으키거나 야생형 바이러스로 되돌아갈 수 있기 때문이다. 서브유닛 백신은 국소 및 전신성 부작용이 더 적으며 또한 그들이 바이러스로부터가 아닌 세포에 의해 발현된 재조합 바이러스 단백질로부터 제조될 수 있어서, 생산을 더 안전하게 하며 살아있는 바이러스를 이용한 백신 제제의 오염 위험을 제거하는 확실한 이점을 가진다. 하지만, 살아있는 바이러스의 주사는 일반적으로 강한 세포 및 항체 면역 반응을 유도하여 바이러스에 의한 미래의 감염으로부터 보호하는 반면, 단백질 제제, 특히 막 단백질 제제와 같은 비복제성 백신은 그렇지 못하여 주로 항체 반응을 유도할 수 있다. 감염된 세포는 그들의 표면 상의 MHC-1 분자 상에 감염 병원균으로부터의 물질을 제시하여, 세포독성 T-세포 반응과 같은 세포 면역 반응을 개시할 수 있다. 세포내에서 생산되지 않는 많은 단백질 제제는 이러한 방식으로 면역계에 제시되지 않을 것이다. 살아있는 또는 사멸 바이러스는 또한 수지상 세포와 같은 면역계의 특화된 식세포에 의해 우선적으로 포식되고, 면역계의 다른 세포들에게 제시되어 면역 반응을 유도할 것이다. 이들 포식 세포는 신체를 순찰하여 바이러스 크기의 입자를 섭취하지만, 그들은 분할 바이러스 또는 서브유닛 백신으로부터의 것들과 같은 정제된 단백질을 효율적으로 포식하지 못한다. 막 단백질에 있어서의 구체적인 문제는 이들이 물에 가용성이 아니라는 것이다. 따라서, 항원-제시 세포에 성공적으로 제시하기 위해서는, 이들 단백질은 그들이 백신에 사용될 수 있도록 하기 위하여 일부 형태의 가용화가 필요하다.
물리적 또는 화학적 수단에 의해 서브유닛 또는 단백질 제제에 대한 면역 반응을 강화하기 위한 다양한 시도가 이루어졌다. 이들 실험으로부터 나타나는 가장 중요한 원칙은 입자가 식세포에 의해 효과적으로 포식되기 위해서는 바이러스 단백질의 다수 카피가 입자 내에 조합되는 것이 필요하다는 것이다. 이들 입자는 비로좀-유사 입자, 비로좀, 면역-자극 복합체(ISCOM), 혼합 미셀(micelle), 프로테오좀 제제 또는 미세입자 담체 상의 단백질일 수 있다. 빈번히, 이들 입자는 또한 식세포 또는 면역계의 이펙터 세포 상의 특정 수용체를 해결하는, 면역계를 자극하기 위한 화학 물질(소위 아쥬반트(adjuvant))을 함유한다.
비로좀은 특히 유용한 종류의 백신 조성물이다. 비로좀은 외피보유 바이러스의 재구성된 막이다. 그들은 일반적으로 세제 또는 단쇄 인지질을 이용하여 외피보유 바이러스로부터 막 단백질과 지질을 추출하고, 추출된 지질과 바이러스 막 단백질로부터 이 세제 또는 단쇄 인지질을 제거하여, 사실상 바이러스 코어 또는 뉴클레오캡시드를 둘러싸는 특징적인 지질 이중층(외피)을 재구성하거나 재형성함으로써 생산된다(국제특허공개 WO2004/071492호, Stegmann T. et al., 1987, EMBO J. 6, 2651-2659). 하지만, 비로좀은 기본적으로 모든 내재 막 단백질(integral membrane protein) 또는 표면 막 단백질(peripheral membrane protein), 또는 지질 앵커(anchor)에 접합된 단백질로부터 조립될 수 있다. 비로좀의 필수 특징은 그들이 면역계의 식세포에 의해 효과적으로 포식되는 크기의 입자이며, 그들이 천연 바이러스 외피의 조성, 표면 구조 및 기능적 활성, 특히 막 융합 활성을 밀접하게 모방한다는 것이다. 지질, 아쥬반트 또는 단백질과 같은 다른 분자가 가용화된 막 물질에 첨가될 수 있다. 이어서 막은 세제 또는 단쇄 인지질의 제거에 의해 재형성되어 비로좀을 생성한다. 막 재형성동안, 추가된 분자는 비로좀 내에 포함되거나 비로좀 막 내에 통합될 것이다. 비로좀은 백신으로 사용되거나 세포내로 분자를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus) (SFV)는 외피보유 바이러스의 전통적인 두 가지 예이다. 외피보유 바이러스는 일반적으로 세포에의 결합과 진입에 필요한 특정 막 단백질("스파이크(spike)")를 보유한다. 이들 단백질은 "프리-융합 형태(pre-fusion form)"로 알려진, 준안정 형태의 성숙 비리온의 표면상에 존재한다. 바이러스가 세포에 결합한 후, 이들 바이러스에 의한 세포의 감염에서 첫번째 단계는 수용체-매개 엔도사이토시스에 의한 그대로의 바이러스 입자의 흡수이다. 이어서 엔도좀 구획이 엔도좀 막에 존재하는 ATP-의존성 양성자 펌프의 활성으로 인해 약간 산성이 된다. 이들 산성 상태(pH 5-6)에 의해 야기되어, 바이러스 스파이크 단백질은 형태 변화("프리-융합"에서 "포스트-융합" 형태로)를 일으켜 바이러스 막과 엔도좀 막의 융합을 야기한다. 그러한 융합의 결과, 바이러스 뉴클레오캡시드와 유전 물질(DNA 또는 RNA)은 세포질로 들어가고, 게놈의 복제는 후손 바이러스를 생산한다.
면역 반응을 유도하는데 있어서 특히 활성인 비로좀은 막 융합, 수용체-결합 및 다른 활성과 같은, 천연 바이러스의 외피 단백질의 적절한 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 비로좀 막 상의 바이러스 스파이크 단백질이 프리-융합 형태임을 나타내는, 수용체-결합 및 막 융합 활성의 보존은 상기 비로좀의 전체 면역원 특성의 발현에 필수적이다. 비로좀의 막 융합 활성으로 인한 세포질 전달 결과로서, 비로좀 단백질로부터의 에피토프의 MHC-1 노출이 입증되어, 보호성 세포독성 T-세포 활성의 유도를 야기하였다(Bungener et al. Vaccine 23 (2005) 1232-1241, Bungener et al., Antiviral Therapy: 111 (6): 717-727). 따라서, 막 융합 활성을 가진 비로좀은 사멸된 백신의 안전성 프로파일을 가지는 한편, 면역계에 살아있는 백신을 나타내는 자극을 제공하여, 백신으로서 유용하다.
비로좀의 주사 또는 비강내 적용 후 면역 반응을 자극하기 위하여 비로좀 백신 제형의 능력을 더 개선하기 위하여 비로좀의 막 내에 양친매성 아쥬반트를 포함시키는 것이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 국제특허공개 WO2004/110486호를 참고하며, 여기서는 바이러스가 세제 또는 단쇄 인지질로 가용화된 후 바이러스 뉴클레오캡시드를 제거한다. 그 후, 동일한 세제 또는 단쇄 인지질에 용해된 아쥬반트가 가용화된 바이러스 막에 추가되어 비로좀 내에 아쥬반트를 통합시킨다. 그 후 세제 또는 단쇄 인지질이 제거되어, 적어도 바이러스 막 단백질과 지질 및 아쥬반트를 포함하는 비로좀이 형성된다. 이러한 방식으로 비로좀 막 내에 통합된 양친매성 아쥬반트는 막내에 안정하게 통합되며(Stegmann, T et al. Vaccine 2010; 28(34): 5543-50; 국제특허공개 WO2004/110486호) 전임상 시험에서 이들 비로좀을 이용한 백신접종 후에 면역 반응을 향상시키거나 변경시키는 것으로 나타났다(Kamphuis, T. et al. Plos One 2012; 7 (5):e36812).
하지만, 막 내의 단백질과 아쥬반트 농도 사이의 비율이 비로좀 막 형성시에 고정되며, 이는 그들이 둘 모두 동일한 막에 존재하기 때문이다. 또한, 아쥬반트는 막 이중층의 두 층 모두에 통합됨에도 불구하고, 외부 층에 존재하는 아쥬반트만이 면역계의 세포 상에 존재하는 수용체와의 상호작용에 이용될 수 있다.
항원/아쥬반트 비율은 백신접종 후 면역 반응에 크게 영향을 미친다. 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A 아쥬반트를 함유한 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 비로좀은 아쥬반트의 역치 농도가 면역반응을 우세한 Th2 반응으로부터 보다 조화를 이룬 Th1/Th2 반응으로 기울어지게 할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Kamphuis, T. et al. Plos One 2012;7 (5):e36812).
아쥬반트를 함유한 백신에 대한 시판 허가를 얻기 위해서는("EMA guidelines on adjuvants in vaccines for human use": EMEA/CHMP/VEG/134716/2004 참고), 항원과 아쥬반트의 적절하고 일관된 결합의 입증이 필요하며, 전임상 및 이어서 임상 시험에서의 백신 후보의 안전성 평가가 요구된다. 동물 실험 결과는 종종 인간에서 백신의 효과를 완전히 예측하지 못한다. 특히, 최적의 항원/아쥬반트 비율은 추정하기 어렵다. 부작용을 최소화하기 위해 낮은 아쥬반트 농도가 바람직한 한편, 아쥬반트는 원하는 방식으로 면역 반응을 향상시키거나 변경시키기 위해 필요하며, 높은 아쥬반트 농도에서는 내성 또는 증가된 반응원성(즉, 백신이 일반적인 "예상되는" 부작용, 특히 지나친 면역 반응 및 관련된 신호 및 증상을 생산할 수 있는 특성)과 같은 다른 효과가 가능하다. 따라서, 최적의 항원/아쥬반트 비율은 시행착오에 의해서만 결정될 수 있다. 더욱이, 노년층 또는 유아와 같은 다른 환자 그룹의 경우, 다른 비율이 적절할 수 있다. 명반에 흡착된 항원과 같은 전통적인 아쥬반트로 제형화된 백신의 경우, 항원은 GMP하에서 생산되고(약물 물질 A), 임상 시험을 위해 방출되고, 이어서 GMP-등급 명반(약물 물질 B)과 혼합되어 병상에서 약품을 형성하여, 다양한 아쥬반트/항원 비율을 용이하게 시험하도록 할 수 있다. 하지만, 이러한 접근은 항원과 아쥬반트 사이의 비율이 막의 재구성시에 이미 고정되기 때문에 양친매성 아쥬반트가 통합된 비로좀에서는 가능하지 않다.
따라서, 아쥬반트화된 비로좀을 제조하기 위해 현재 이용가능한 방법을 이용하여 다양한 아쥬반트/항원 비율을 시험하는 유일한 방법은 상이한 항원/아쥬반트 조합을 가진 매우 다양한 비로좀(각 제제는 약물 물질을 구성함)을 생산하여, 각 제제에 대하여 요구되는 전임상 안전성 및 면역원성 시험을 수행하고, 임상 시험을 위하여 각 제제를 방출하고, 상이한 제제 각각을 별도로 시험하는 것이다. 명백하게, 이는 그러한 시험 비용을 매우 많이 증가시킨다.
이러한 문제들을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 아쥬반트화된 비로좀(adjuvanted virosome)의 임상 시험을 용이하게 하고자 하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 전임상 안전성, 면역원성, 방출, 임상 시험 등을 위한 별도 시험을 요구하는 제제의 수를 최소화하는 것을 목표로 하였다. 추가 목표는 면역원성을 보유하는 한편 사용되는 아쥬반트의 양을 최소화하는 것이었다.
이들 목표 중 적어도 일부가 종래의 방법을 아쥬반트화된 비로좀 제제에 적응시킴으로써 충족될 수 있는 것으로 관찰되었다. 보다 구체적으로, 신규의 방법은 아쥬반트없이 항원을 함유하는 비로좀을 예비형성하고 적합한 용매에 용해된 양친매성 아쥬반트를 첨가하는 것을 포함한다. 용해된 아쥬반트는 예비형성된 비로좀을 함유한 수성 조성물과 혼합되어, 아쥬반트 용매가 물과 혼합되고 아쥬반트는 비로좀 막 내로 통합된다. 따라서, 양친매성 아쥬반트는 비로좀 형성동안이 아니라 비로좀 형성 후에 비로좀 막 내로 포함된다. 본 발명의 이러한 "2단계" 방법은 상이한 아쥬반트/항원 비율을 가진 비로좀-기반 백신의 제형화 및 막의 외부 층에만 아쥬반트가 통합된 비로좀 형성을 촉진한다. 놀랍게도, 아쥬반트 용매에의 (바이러스) 단백질의 노출에도 불구하고, 이러한 신규의 후-삽입 프로토콜에 따라 수득된 비로좀은 전통적인 통합 방법과 유사한 융합 활성을 나타내었다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은
(i) 막 융합 단백질을 포함하는, 아쥬반트화되지 않는 비로좀의 수성 조성물을 제공하는 단계;
(ii) 물과 균질한 혼합물을 형성할 수 있는 약학적으로 허용가능한 비수성 용매에서 양친매성 아쥬반트를 용해시키는 단계, 및
(iii) 상기 수성 비로좀 조성물에서 상기 아쥬반트 용액을 희석하여 비로좀의 막 융합 활성을 보존하면서 아쥬반트가 비로좀 막의 외부 층내로 삽입되도록 유도하는 단계를 포함하는, 아쥬반트화된 비로좀의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 아쥬반트화된 비로좀을 포함하는 백신의 전임상 및 임상 시험을 위해 중요한 효과를 갖는다. 예비형성된 비로좀 조성물은 따라서 "약물 물질 A"를 형성하는 한편, 용매 내의 아쥬반트는 "약물 물질 B"이다. 약물 물질 A와 B를 위한 안전성 및 임상 시험만이 요구된다. 다양한 아쥬반트/항원 비율을 가진 약품으로 물질 A와 B를 조합하는 것은 병상에서 발생할 수 있다.
더욱이, 아쥬반트는 주사 부위에서의 통증으로부터 염증, 벨마비(Bell's Palsy)(Lewis, D.JH. et al., PLoSOne 2009 4(9):e6999) 및 기면증(O Flanagan D. et al. PLoSOne 2014,19(17)pii20789)까지 다양한 부작용을 생성하는 것으로 알려졌다. 따라서, 최저 유효 농도의 아쥬반트를 통합시키는 것이 중요하다. 비로좀 막을 형성하는 종래의 일단계 과정동안 비로좀 막 내로 아쥬반트를 통합시킴에 의해, 아쥬반트는 이중층의 두 층 모두에 통합될 것이다. 하지만, 막의 외부층에 존재하는 절반의 아쥬반트만이 면역계의 세포와 접촉할 수 있어서, 원치않는 부작용에 기여할 수 있는 농도는 유효 농도의 두배이다. 대조적으로, 예비형성된 비로좀 막을 이용하는 본 발명의 방법에서는, 아쥬반트는 막의 외부 층에만 삽입되어 그 모두가 면역계와의 상호작용에 이용가능할 것이다. 이것은 양 층 모두에 아쥬반트화된 종래의 비로좀과 비교하여 유효 아쥬반트 농도를 절반으로 감소시켜, 부작용을 잠재적으로 제한한다.
비로좀 이중층의 외부 층내로 특이적으로 양친매성 아쥬반트를 후-삽입하는 것은 당업계에서 개시되거나 제안되지 않았다. 예를 들어, 국제특허공개 WO2007/099387호는 그 비로좀-유사 소낭의 면역자극 효과가 소낭을 적어도 하나의 아쥬반트와 연합시킴으로써 더 증가될 수 있음을 교시하고 있지만, 아쥬반트가 상기 소낭의 지질 이중층내에 캡슐화되고/되거나 통합되거나, 및/또는 상기 소낭과 자유롭게 조합될 수 있다는 것이 단지 일반적으로 교시된다. 이중층의 외부 층에서의 아쥬반트 후-삽입에 대해서는 언급되거나 제안되지 않는다.
제1 양태에서, 본 발명은 예비형성된 비로좀의 막 내로 양친매성 아쥬반트를 도입하는 방법을 제공한다. 제2 양태에서, 본 발명은 비로좀 막의 외부 층에만 존재하는 아쥬반트화된 비로좀을 제공한다.
용어 "비로좀"은 지질 막 내에 매립된 바이러스 외피 단백질을 함유한 리포좀을 말한다. 비로좀은 인비트로에서 형성되며 바이러스 코어 단백질을 함유하지 않는다. 일반적으로, 비로좀은 평균 직경이 약 150 nm인 구형의 단층 소낭이다. 리포좀과는 대조적으로, 비로좀은 일반적으로 인지질 이중층 막내에 삽입된, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 또는 매트릭스 단백질 2(M2)와 같은 기능성 바이러스 외피 당단백질을 함유한다. 이들 비로좀을 생성하기 위하여, 아쥬반트가 없는 보통의 비로좀의 수성 현탁액을 공지의 방법에 따라 먼저 생성할 수 있다. 제조 프로토콜은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 적합한 프로토콜은 예를 들어, 국제특허공개 WO 2004/045582호 또는 EP 0 538 437호에 개시된다. 실시형태에 따라, 비로좀은 비로좀 소낭 그 자체로부터, 또는 비로좀 소낭과 리포좀 소낭의 융합으로부터 생긴 소낭으로부터 수득될 수 있다.
비로좀 소낭의 제제는 Bron et al., Methods Enzymol. 220: 313-331 (1993)에 의해 개시된 것과 같은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 일 실시형태에서, 비로좀의 제조 단계는 외피보유 바이러스, 바람직하게는 레트로바이러스과(Retroviridae); 풍진바이러스(rubellavirus); 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae); 플라비바이러스과(Flaviviridae); 헤르페스바이러스과(Herpesviridae); 부니아바이러스과(Bunyaviridae); 아레나바이러스과(Arenaviridae); 한타바이러스과(Hantaviridae); 바큘로바이러스과(Baculoviridae); 코로나바이러스과(Coronaviridae); 파포바바이러스과(Papovaviridae); 랍도바이러스과(Rhabdoviridae); 알파바이러스과(Alphaviridae), 알테리바이러스과(Arteriviridae), 피로바이러스과(Filoviridae) 및 폭스바이러스과(Poxviridae)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스의 기능적 재구성을 포함한다.
전형적으로, 외피보유 바이러스를 비로좀으로 기능적으로 재구성하는 것은 외피보유 바이러스를 단쇄 인지질 또는 세제를 함유한 용액과 접촉시켜 상기 바이러스의 바이러스 외피를 가용화시키는 것을 포함하며, 추가로 상기 용액으로부터 단쇄 인지질 또는 세제를 제거하여 기능적으로 재구성된 바이러스 외피를 형성하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 인지질 또는 세제는 투석, 여과 또는 소수성 비드상에의 흡착에 의해 제거된다. 바람직한 소수성 비드는 폴리스티렌 다이비닐벤젠으로 구성되는 비드를 포함한다. 비로좀 제조를 위한 유용한 지질은 임계 미셀 농도(cmc)가 0.1 mM 초과, 바람직하게는 0.3 mM 초과, 더욱 바람직하게는 1 mM 초과인 단쇄 인지질이다. 예를 들어, 인지질이 포스파티딜콜린, 바람직하게는 1,2-다이헵타노일-sn-포스파티딜콜린 또는 1,2-다이카프로일-sn-포스파티딜콜린인 경우에 매우 우수한 결과가 얻어진다. 또한, 국제특허공개 WO2004/071492호를 참고한다. 적합한 세제 또한 당업계에 알려져 있다. 바람직하게는, 세제는 옥타-에틸렌-글리콜 모노(n-도데실)에테르와 같은 비이온성 세제이다.
구체적 실시형태에서, 비로좀은 예를 들어, 그대로의 인플루엔자 바이러스를 옥타에틸렌글리콜 모노(n-도데실)에테르(C12E38)로 가용화시키고, 뉴클레오캡시드를 침강시키고(바이러스 당단백질과 지질은 상등액에 남을 것이다), 소수성 레진(바이오-비드(Bio-Beads) SM2)으로 상등액 내의 세제를 제거한 후, 원래의 바이러스 막 지질 및 스파이크 당단백질로부터 재구성될 수 있다(Stegmann et al., Traffic 1:598-604, 1987). 상이한 바이러스 균주로부터의 HA를 함유한 비로좀 제조는 비이온성 세제 옥타에틸렌글리콜 모노도데실 에테르로 가용화된 이들 바이러스의 단백질 동량으로 수행될 수 있다.
바이오-비드 SM2로 세제를 제거한 후, 상이한 유형의 융합 단백질을 함유한 비로좀이 형성될 수 있다. 일 실시형태에 따라, 본 발명에 따른 비로좀-유사 소낭이 비로좀 소낭과 리포좀 소낭의 융합으로부터 수득될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에 따라, 본 발명의 비로좀-유사 소낭은 비로좀 및 리포좀 지질을 포함할 수 있다.
비로좀 막은 바람직하게는 (a) 지질 이중층; (b) 막 단백질; 및 (c) 선택적으로, 추가 항원을 포함한다. 바람직하게는, 막 단백질은 바이러스 막 융합 단백질이다. 바람직하게는, 지질 이중층은 융합 단백질에 의해 유도된, 바이러스의 천연 숙주의 숙주 세포와 바이러스 막의 융합과 양립성인 지질 조성물을 갖는다. 바람직하게는 지질 조성물은 융합의 최적 pH에서의 융합과 양립성이다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 레트로바이러스과; 풍진바이러스; 파라인플루엔자 바이러스, 홍역, 볼거리, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus)와 같은 파라믹소바이러스과; 황열 바이러스, 뎅기바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 진드기-매개 뇌염, 세인트. 루이스(St. Louis) 뇌염 또는 웨스트나일(West Nile) 바이러스와 같은 플라비바이러스과(flaviviridae); 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스와 같은 헤르페스바이러스과; 부니아바이러스과; 아레나바이러스과; 한탄과 같은 한타바이러스과; 코로나바이러스과; 인간 유두종바이러스와 같은 파포바바이러스과; 광견병 바이러스와 같은 랍도바이러스과; 인간 코로나바이러스와 같은 코로나바이러스과; 알파바이러스과, 알테리바이러스과, 에볼라바이러스와 같은 피로바이러스과, 아레나바이러스과, 천연두 바이러스와 같은 폭스바이러스과 또는 아프리카돼지콜레라 바이러스와 같은 다양한 외피보유 바이러스 중 어느 하나를 비로좀 생산을 위해 본 발명에서 제공된 방법에서 사용하는 것이 가능하다.
바이러스의 융합 단백질은 본 명세서에서, 적합한 세포의 표면에서 발현되면, 적절한 pH에서, 바이러스를 위한 천연 숙주인 세포와 상기 세포의 융합을 유도할 수 있는, 바이러스, 보통 외피보유 바이러스의 내재 막 단백질을 의미하는 것으로 이해된다. 재구성된 바이러스 막내로의 통합을 위한 바이러스 융합 단백질의 예는 셈리키 포레스트 바이러스 E1 단백질, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 단백질, HIV gp120/gp41 단백질, 파라믹소바이러스의 F 단백질을 포함한다. 또한 표적 세포와의 융합을 매개할 수 있는 융합 단백질의 (유전적으로 변형된) 변이체가 포함된다. 바이러스 융합 단백질에 의해 유도된 두 가지 유형의 융합은 구별될 수 있다. 예를 들어, HIV gp120/gp41 단백질 또는 파라믹소바이러스 F 단백질에 의해 유도된 것과 같은 첫번째 유형의 융합은 중성 pH에서 보통 표적화된 숙주 세포의 표면에서 발생한다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 단백질에 의해 유도된 것과 같은 두번째 유형의 융합은 숙주 세포의 엔도좀 구획 내에서 더 낮은 pH(5.0-6.5)에서 내재화시에 발생한다. 두 유형의 융합 모두 구체적으로 본 발명에 포함된다.
따라서, 본 발명의 비로좀이 숙주 세포와 융합하는 능력은 적절한 바이러스 융합 단백질의 존재에 의존한다. 하지만, 소정의 합성 지질 및 바이러스 융합 단백질로 구성된 비로좀은 융합할 수 없는 것으로 당업계에서 개시된 바처럼, 이 능력은 추가로 재구성된 바이러스 막의 이중층의 지질 조성에 의존한다. 비로좀의 지질 조성은 따라서 바람직하게는 막이 적절한 pH에서 적절한 숙주 세포와 융합할 수 있도록 선택된다. 비로좀에 융합 활성을 제공하는 한 가지 바람직한 지질 조성은 바이러스의 천연 지질을 포함하는 지질 조성이다. 용어 "바이러스의 천연 지질"은 본 명세서에서 세포, 바람직하게는 포유류, 곤충 또는 식물 세포에서 성장하거나 발육란에서 성장한 바이러스의 막에 존재하는 지질을 의미하는 것으로 이해된다. 바이러스의 천연 지질은 따라서 바람직하게는 합성 지질과는 반대로, 성장된 바이러스 입자로부터 수득되거나 분리된다.
하지만, 본 발명의 기능적으로 재구성된 바이러스 막은 바이러스 지질에 더하여, 다른 공급원으로부터의 정제된 지질, 예를 들어, 정제되거나 합성된 지질을 포함할 수 있다. 다른 지질은 제조동안 비로좀 막에 추가될 수 있다. 비로좀의 융합 활성은 일반적으로 바이러스 기원의 지질과 유사한 지질 또는 바이러스 외피의 지질 조성과 매우 유사한 지질 혼합물이 첨가될 경우 적절하게 유지된다. 따라서, 본 발명에 따라, 광범위한 지질이 상기 비로좀 막에 포함될 수 있다. 지질 그룹은 중성 및 하전된 인지질, 스테로이드-유래 지질, 중성 및 하전된 합성 지질을 포함한다. 비로좀에 융합 활성을 제공하기 위한 지질 조성물은 따라서 바람직하게는 천연 바이러스 막으로부터 수득되거나 수득가능한 조성물이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 지질 조성물은 따라서 바이러스의 천연 지질로만 구성된 조성물, 다른 공급원으로부터의 지질로 보충된 바이러스의 천연 지질로 구성된 조성물, 및 천연 바이러스 막의 지질 조성을 모방하는, 다양한 공급원으로부터의 지질로 구성된 조성물을 포함한다.
이들 지질은 콜레스테롤 및 인지질, 예를 들어, 포스파티딜콜린(PC), 스핑고미엘린(SPM), 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 포스파티딜세린(PS)을 포함할 수 있다. 하지만, 다른 인지질 또한 추가될 수 있다. 이들은 변화하는 지방 아실 조성을 가지며 천연 및/또는 (반)합성 기원인, 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티드산(PA), 카르디오리핀(CL) 및 포스파티딜이노시톨(PI) 및 다이세틸 포스페이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세라마이드 및 다양한 당지질, 예를 들어, 세레브로사이드 또는 강글리오사이드 또한 추가될 수 있다.
본 발명의 비로좀은 바람직하게는 양이온성 지질, 합성 지질, 당지질, 인지질, 스테롤 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 지질을 포함한다. 인지질은 바람직하게는 변화하는 지방 아실 조성을 가진, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 카르디오리핀 및 포스파티딜이노시톨을 포함한다. 양이온성 지질은 바람직하게는 DOTMA (N-[(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, DODAC (N,N-다이올레일-N,N,-다이메틸암모늄 클로라이드), DDAB (다이도데실다이메틸암모늄 브로마이드), TC-Chol (콜레스테릴 N-(트리메틸암모니오에틸)카르바메이트 클로라이드), DC-Chol (콜레스테릴 N-(다이메틸암모니오에틸)카르바메이트 클로라이드) 또는 다른 양이온성 콜레스테롤 유도체 및 스테아릴아민 또는 다른 지방족 아민, DPPE (다이팔미토일포스파티딜에탄올아민), DOGS (다이올레오일-글리세로-석시네이트), DOSPA (2,3-다이올레오일옥시-N-[2(스퍼민카르복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트), DOSPER (1 ,3-다이올레오일옥시-2-(6-카르복시스퍼밀)프로필아미드), THDOB (N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-2,3,-다이올레오일옥시-1,4-부탄다이암모늄 이오다이드), DOPA (다이올레오일-sn-글리세로-포스페이트), DOTP (다이옥틸 테레프탈레이트), DOSC (다이올레오일-석시닐-글리세롤), DOTB (다이올레오일-e-(4'-트리메틸암모니오)-부타노일-sn-글리세롤), DOPC (다이올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린), DOPE (다이올레오일-sn-글리세로-포스파티딜에탄올아민) 등으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 양이온성 지질은 양이온성 콜레스테롤 유도체, 예를 들어, TC-Chol (콜레스테릴 N-(트리메틸암모니오에틸) 카르바메이트) 또는 DC-Chol (콜레스테릴 N-(다이메틸암모니오에틸) 카르바메이트)로부터 선택된다. 그들은 PC(포스파티딜콜린)과의 혼합물 내의 작은 단층 리포좀으로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 비로좀은 바람직하게는 난-유래 PC를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 DOPC (다이올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린), DOPE (다이올레오일-sn-글리세로-포스파티딜에탄올아민)을 포함할 수 있다. 본 발명의 비로좀 내에 통합될 수 있는 콜레스테롤 또는 스테롤 유도체의 예는 콜레스테롤 헤미석시네이트, 피토스테롤, 예를 들어, 라노스테롤, 에르고스테롤 및 비타민 D 및 비타민 D 관련된 화합물을 포함한다.
아쥬반트 없이 예비형성된 비로좀의 외부 층내로 아쥬반트를 도입하기 위하여, 아쥬반트는 물과 혼합될 수 있는 비수성 용매에서 용해된다. 이어서 용액은 아쥬반트가 없는 비로좀의 수성 현탁액에 첨가된다. 용매의 희석은 아쥬반트가 불용성이 되게 하며, 비로좀 막내로의 자발적 통합이 이루어진다.
당업자는 물과의 균질한 혼합물을 형성할 수 있으며 상기 혼합물은 한 가지 상만의 용액으로 설명될 수 있는, 약학적으로 허용가능한 비수성 용매를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업계에서 "약품 내의 잔류 용매"로서 알려진 용매 그룹으로부터 선택된다. 이들은 약물 물질 또는 부형제의 제조에서 또는 약품의 제조에서 사용되거나 생성되는 유기 휘발성 화학물질로서 정의된다. "물과 균질한 혼합물을 형성할 수 있는"이라는 표현은 사용되는 특정 조건하에서 아쥬반트 용매가 그안에 용해된 아쥬반트가 비로좀과 접촉하는 것을 허용하고 아쥬반트가 비로좀 막의 외부 층내로 삽입되도록 유도하기에 충분한 정도로 비로좀 조성물의 수성 상과 혼합하는 것을 나타내는 것이다. 적합한 용매는 아쥬반트를 효과적으로 용해시키고 물과 혼합가능하다. 바람직하게는, 그들은 비로좀, 특히 이들에 존재하는 막 융합 단백질을 손상시키지 않는다. 보다 바람직하게는, 용매는 약학적으로 허용가능하고 비독성이다. 바람직한 용매는 공비 용매, 알콜 및 에스테르이다.
용해된 아쥬반트의 부피는 전형적으로 아쥬반트가 희석되는 수성 비로좀 조성물의 부피에 비하여 작다. 예를 들어, 아쥬반트 용액은 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 더욱 바람직하게는 적어도 20배 희석된다.
따라서, 아쥬반트 용매의 물 용해도는 상대적으로 낮을 수 있다. 일 실시형태에서, 비수성 아쥬반트 용매의 물에서의 용해도는 20℃에서 적어도 5 g/100 mL이다. 바람직하게는, 물에서의 용해도는 20℃에서 적어도 10 g/ 100 mL, 더욱 바람직하게는 적어도 20 g/100 mL이다. 바람직한 실시형태에서, 아쥬반트 용매는 물과 혼합가능한 용매, 즉, 모든 비율로 물과 혼합되어 균질한 용액을 형성하는 용매이다.
일 실시형태에서, 아쥬반트 용매는 아세토니트릴, 2-부탄올, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 아세트산, 포름산, 메탄올, 에탄올, DMSO, DMF, n-프로판올, 이소-프로판올, 2-메틸-1-프로판올 및 THF, 또는 임의의 그 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 비로좀의 융합유도 활성이 유지되도록 하기 위하여, 선택된 아쥬반트 용매는 막 융합 단백질의 기능을 적어도 부분적으로 보존해야 한다. 용매의 악영향에 대한 융합 단백질의 민감성은 융합 단백질의 구체적인 유형에 의존할 것이다. 일반적으로 말해서, 낮은 pH에서 융합을 유도하는 융합 단백질은 DMSO 또는 DMF와 같은 용매에 매우 민감하지 않지만, 산성 용매에는 매우 민감한 반면, 파라믹소바이러스 F 단백질과 같은 중성 pH에서 기능하는 융합 단백질은 용매의 pH에 훨씬 덜 민감하다. 당업자는 당업계에 알려진 방법을 이용하여 융합 단백질에 대한 주어진 비수성 용매의 효과를 시험하고 평가할 수 있을 것이다. 예를 들어, 후보 용매 집단을 리포좀 표적을 이용하는 무세포 융합 분석에서 주어진 비로좀 제제의 융합유도 활성에 대한 그의 영향에 대해 스크리닝할 수 있다. 융합은 예를 들어, 형광 공명 에너지 전이(FRET) (Struck et al. (1981) Biochemistry 20:4093)에 의해, 인 비트로 융합 측정에 의해 모니터할 수 있다. 아쥬반트 용매가 DMSO, 에탄올 또는 DMF일 때 우수한 결과가 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아쥬반트"는 하나 이상의 항원과 함께 주사될 경우, 그 항원(들)에 대한 면역 반응을 비특이적으로 향상시키는 임의의 물질을 말한다. 아쥬반트의 특성에 따라, 아쥬반트는 세포-매개 면역 반응, 체액성 면역 반응 또는 그 둘의 혼합을 촉진할 수 있다. 면역 반응의 향상이 비특이적이므로, 동일한 아쥬반트가 상이한 표적에 대한 반응을 촉진하기 위하여 상이한 항원과, 예를 들어, 엠. 튜버큘로시스(M. tuberculosis)에 대한 면역성을 촉진하기 위하여 엠. 튜버큘로시스로부터의 항원과 또는 특정 종류의 종양에 대한 면역성을 촉진하기 위하여 그 종양으로부터 유래된 항원과, 이용될 수 있음이 당 분야에서 잘 이해된다. 아쥬반트는 본 명세서에서 인간 또는 동물을 면역시키기 위하여 항원과 조합되어 사용될 경우, 면역계를 자극하여, 바람직하게는 아쥬반트 자체에 대한 특이적 면역 반응 생성없이, 그 항원에 대한 면역 반응에 영향을 주거나, 촉발하거나, 향상하거나 촉진하는 임의의 물질 또는 화합물을 포함하는 것을 의도한다. 용어 "양친매성 아쥬반트"는 소수성 막에 매립되고 주변환경을 향하는 극성 (헤드 기) 모이어티를 가지며 물에서 지질 이중층 소낭 또는 미셀과 연합하거나, 더욱 바람직하게는 그 안에 통합될 수 있는, 리포펩티드, 모노-포스포릴 지질 A 및 그의 유도체와 유사체 및 당지질과 같은 화합물을 비롯한, 임의의 아쥬반트를 포함하는 것을 의도하는 것이다. 바람직하게는, 융합 단백질, 양친매성 아쥬반트 및 바람직하게는 또한 선택적인 추가의 항원은 지질 이중층의 소수성 내부와 상호작용하며, 즉, 이중층의 지질과의 및/또는 서로의 소수성 상호작용을 통해 바이러스 막의 이중층과 연합하거나, 이중층 내에 포함되고/되거나 이중층 내에 매립된다.
본 발명의 비로좀 막은 바람직하게는 지질, 양친매성 아쥬반트, 바이러스 융합 단백질 및 하나 이상의 항원을 포함하는 기능적인 비로좀이며, 양친매성 아쥬반트, 지질, 바이러스 융합 단백질 및 항원은 주로 소수성 상호작용을 통해 상호작용을 하며, 양친매성 아쥬반트의 소수성 부분은 바람직하게는 지질 이층 막의 통합 부분을 형성하며, 이층은 추가로 융합 단백질, 항원(들) 및 지질을 함유한다. 기능적 재구성이란 재구성된 막이 막 융합 활성을 가짐을 의미한다. 바람직한 재구성된 바이러스 막은 소낭 형태이다.
상기 용어는 또한 그 소수성 모이어티가 이중층 막의 내부의 소수성 영역과 접촉하며 그 극성 헤드 기 모이어티는 막의 외부 극성 표면을 향해 배향된 채 지질 이중층(바이러스의 천연 지질을 포함함)내로 안정하게 통합되는 임의의 양친매성 아쥬반트를 포함한다. 하지만, 양친매성이 적으며 보다 소수성인, 즉, 헤드 기 모이어티를 갖지 않거나 단지 약하게 극성인 헤드 기 모이어티를 갖는, 하지만 지질 이중층 소낭과 연합하거나 그 안에 통합될 수 있는 아쥬반트가 구체적으로 본 발명에서 배제되는 것은 아니다.
아쥬반트는 본 명세서에서 인간 또는 동물을 면역시키기 위해 항원과 조합되어 사용될 경우, 면역계를 자극하여, 바람직하게는 아쥬반트 자체에 대한 특이적 면역 반응을 생성하지 않고, 항원에 대한 면역 반응을 촉발하거나, 향상시키거나 촉진하는 임의의 물질 또는 화합물을 포함하는 것을 의도한다. 바람직한 아쥬반트는 면역 반응을 Th2 타입 반응에서 Th1 타입 반응으로 기울어지게 한다. 다른 바람직한 아쥬반트는 동일한 조건이지만 아쥬반트의 부재하에서 항원에 대해 생성된 면역 반응에 비교할 때, 적어도 1.5, 2, 2.5, 5, 10 또는 20배 만큼, 소정의 항원에 대한 면역 반응을 향상시킨다. 다른 바람직한 아쥬반트는 면역 반응의 지속기간을 향상시킨다. 상응하는 대조군에 비하여 동물 또는 인간 그룹에서 아쥬반트에 의해 생산되는 소정의 항원에 대한 면역 반응의 통계적 평균 향상을 결정하기 위한 시험은 당업계에서 이용가능하다. 아쥬반트는 바람직하게는 적어도 두 가지 상이한 항원에 대한 면역 반응에 영향을 미치거나 향상시킬 수 있다. 본 발명의 기능적 비로좀 내에 통합되는 아쥬반트는 바람직하게는 양친매성 아쥬반트이다.
바람직한 실시형태에서, 비로좀내에 존재하는 양친매성 아쥬반트는 인간에서 사용하기 위해 약학적으로 허용가능하다. 본 발명의 양친매성 아쥬반트는 바람직하게는 항원에 공유적으로 연결되지 않지만 재구성된 막의 지질 이중층내에 함께 존재한다. 항원과 아쥬반트가 공유적으로 연결되지 않는다는 사실은 항원의 처리 및 면역계에의 그 에피토프의 제시가 본질적으로 천연 단백질 단독과 동일하여, 천연 병원균에 존재하는 단백질의 우수한 인식을 보장한다. 다른 한편으로, 항원과 아쥬반트의 지질 이중층과의(그리고 서로) 소수성 상호작용은 제제내의 비로좀에 대한 아쥬반트와 항원의 분포를 허용하여 제제 내의 막 소낭의 대부분이 단일 소낭 내에 항원과 아쥬반트 둘 모두를 함유하며, 더욱 바람직하게는 소낭의 적어도 60, 70, 80, 90, 또는 95%가 항원과 아쥬반트 둘 모두를 함유하도록 한다. 단일 막 또는 소낭 내의 항원과 아쥬반트의 조합은 아쥬반트에 의해 활성화되는 항원 제시 세포에의 항원의 전달을 허용하여, 비로좀의 치료 및/또는 예방 효과를 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 양친매성 아쥬반트는 항원 제시 세포 상에 존재하는 톨-유사-수용체(Toll-like-receptor)(TLR)에 의해 인식된다. 대안적으로, 양친매성 아쥬반트는 다른 수용체를 표적으로 할 수 있다. TLR에 의해 인식되는 다양한 화합물이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 리포펩티드, 모노-포스포릴 지질 A 및 모노-포스포릴 지질 A의 유도체 또는 합성 또는 반-합성 유사체, 지질다당류, 펩티도글리칸, 리포테이코산, 지질단백질(마이코플라스마, 마이코박테리아 또는 스피로헤테스로부터), 이중쇄 RNA(폴리 I:C), 비메틸화 DNA, 리포아라비노만난, 플라젤린, CpG-함유 DNA 및 이미다조퀴놀린을 포함한다. 그러한 TLR-인식된 아쥬반트는 그 자체가 양친매성 아쥬반트이거나 또는 대안적으로 그들은 예를 들어, 극성 TLR 리간드에의 소수성 화합물(하기 참고)의 접합에 의해 양친매성 아쥬반트로 변형될 수 있다. 바람직한 양친매성 아쥬반트는 모노-포스포릴 지질 A 및 그 유도체 및 리포펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 비로좀은 PHAD (인산화된 헥사아실 이당류) 및 그의 3-O-데스아실 유도체, 3-D-PHAD로부터 선택된 합성 아쥬반트의 존재를 특징으로 한다. 둘 모두 당업계에서 합성 TLR-4 아고니스트로서 알려져 있다. PHAD는 또한 당업계에서 글리코피라노사이드 지질 A 또는 GLA로도 불린다. Lousada-Dietrich et al., , Vaccine. 2011 Apr 12;29(17):3284-92를 참고한다. 일 실시형태에서, 비로좀은 하기 구조를 갖는 PHAD를 함유한다(표시 14는 각 아실 사슬내의 탄소 원자의 총수를 나타낸다):
다른 바람직한 실시형태에서, 비로좀은 하기 구조를 갖는 3-D-PHAD를 함유한다:
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 양친매성 아쥬반트는 당지질이다. 양친매성 아쥬반트로서 사용하기 위해 바람직한 당지질은 야쥬반트 활성을 가지며 인간에서 사용하기 위해 약학적으로 허용가능하다. 당지질은 하나 이상의 당에 공유적으로 결합된 지질(또는 다른 소수성 화합물)이다. 예시적인 당지질 아쥬반트는 α-갈락토실세라마이드, 포스파티딜이노시톨 만노시드, 내독소 지질다당류의 유도체 및 그 유도체를 포함한다. 매우 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 당지질이 α-갈락토실세라마이드 또는 포스파티딜 이노시톨 만노시드인, 본 발명에 따른 비로좀을 제공한다. 용어 "α-갈락토실세라마이드" 및 "포스파티딜 이노시톨 만노시드"는 어느 하나의 임의의 유도체를 포함함을 의도한다. 아쥬반트 활성을 가지며 본 발명의 내용에서 유용한 이들 분자의 유도체는 예를 들어, 미국 특허 5,936,076호 및 4,542,212호에서 각각 개시된다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 적합한 당지질 아쥬반트는 예를 들어, 유전적으로 변형된 그람 음성 병원균으로부터 입수할 수 있으며 국제특허공개 WO02/09746호에 개시된 바처럼, 지질다당류(LPS)의 지질 A 부분의 독성이 감소되지만 아쥬반트 활성(의 일부)을 보유한 그람-음성 세균의 내독소 LPS의 변형된 형태를 포함한다.
본 발명에서 양친매성 아쥬반트로서 사용하기 위한 변형 LPS는 바람직하게는 독성이 감소된 변형 지질 A 모이어티를 갖는다. 변형 LPS의 독성은 바람직하게는 상응하는 야생형 LPS의 독성보다 적으며, 더욱 바람직하게는 변형 LPS의 독성은 야생형 LPS의 독성의 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 또는 0.2% 미만이다. 야생형 및 독성이 감소된 다양한 변형 LPS의 독성은 당업계에 알려진 임의의 적합한 분석으로 결정할 수 있다. 다른 한편으로, 독성이 감소된 변형 LPS는 여전히 충분한 면역자극 활성, 즉, 아쥬반트 활성을 가져야 한다. 독성이 감소된 변형 LPS는 바람직하게는 상응하는 야생형 LPS의 면역자극 활성의 적어도 10, 20, 40, 80, 90 또는 100%를 갖는다. 면역자극 활성은 상술한 대로 실험 동물에서 인 비보( in vivo)에서, 또는 예를 들어, LPS-자극된 수지상 세포에 의한 적어도 하나의 사이토카인(예를 들어, IL-12, IL-10, TNF-알파, IL-6 및 IL-1-베타 중 하나)의 생산을 측정함으로써 또는 LPS-자극된 수지상 세포 상의 적어도 하나의 공자극 분자(예를 들어, CD40 또는 CD86)의 발현을 측정함으로써, 시험될 LPS와의 항온처리에 의해 자극된 수지상 세포의 성숙을 결정함으로써 인 비트로(in vitro)에서 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명에 따른 비로좀에 존재하는 양친매성 아쥬반트는 펩티드이며 바람직하게는 양친매성 펩티드이다. 양친매성 아쥬반트로 사용하기 위해 바람직한 펩티드는 아쥬반트 활성을 가지며, 인간에서 사용하기 위해 약학적으로 허용가능하다. 아쥬반트 활성을 가진 펩티드, 구체적으로 극성 펩티드는 그들을 적합한 소수성 화합물(상기 참고)에 (공유적으로) 연결시킴으로써 양친매성 아쥬반트가 될 수 있다. 대안적으로, 양친매성 펩티드는 후술하는 바처럼 막관통 서열과 같은 일련의 소수성 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직한 펩티드는 노치 리간드 재기드-1(Notch ligand Jagged-1)로부터의 서열(Weijzen et al., 2002 참고; Genbank 기탁 번호 AAC 52020) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A로부터의 서열을 포함한다. 재기드-1 또는 단백질 A로부터의 서열을 가진 펩티드는 바람직하게는 적합한 소수성 화합물(상기 참고)에 공유적으로 결합되고/되거나 막관통 서열(하기 참고)을 포함한다. 지질 이중층으로부터 돌출되는, 재기드-1 또는 단백질 A 유래 펩티드의 (극성) 부분은 바람직하게는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 이하의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 비로좀은 융합 단백질 및 선택적으로 추가 항원을 포함한다. 따라서, 바이러스 융합 단백질만을 포함하며 추가의 항원을 포함하지 않는 비로좀은 본 발명의 일부이며, 이 경우 바이러스 융합 단백질은 또한 융합 단백질로서의 그 기능에 더하여 항원으로서의 기능을 가짐이 이해되어야 한다. 다른 한편으로, 비로좀은 따라서 바이러스 융합 단백질에 더하여 하나 이상의 추가 항원을 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 비로좀은 적어도 하나의 추가 항원, 바람직하게는 종양-항원 또는 바이러스, 기생충, 진균 또는 세균으로부터 기원하는 항원을 포함한다.
본 발명에 따른 재구성된 바이러스 막의 일부인 항원은 바람직하게는 재구성된 바이러스 막 소낭의 지질 이중층 막내에 삽입될 수 있는 소수성 부분을 갖는다. 바이러스, 세균, 효모 및 기생충과 같은 많은 병원균은 그들의 캡시드, 세포벽 또는 세포막에 숙주에서 면역 반응을 유발시키는 단백질을 보유한다. 예를 들어, 막관통 분절과 같은 소수성 요소를 가지며 본 발명에 따른 재구성된 바이러스 막의 일부가 되기에 적합한 항원의 예는 병원균의 막(바이러스의 경우에는 외피로도 불림)에 존재하는 단백질이다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 재구성된 바이러스 막에 존재하는 항원은 내재 막 단백질이다. 본 발명의 비로좀내의 항원성 단백질은 그들이 바이러스 또는 세포 막 상에 나타나는 것과 동일한 방식으로 배향되지만, 막 지질 이중층에 존재할 경우, 정상적으로는 부분적으로 또는 적어도 일시적으로 숨겨지는 에피토프를 제시할 수 있다. 이들 항원-제시 비로좀에 의한 면역계의 자극은 면역계의 세포, 그들의 구체적 특징, 단백질의 제시 및 숨겨진 에피토프의 드러남에 의한 그들의 특이적 인식의 조합으로 인한 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 비로좀에서 사용되는 항원성 단백질은 하나 이상의 보호성 에피토프, 즉, 항원이 유래되는 병원균에 의한 감염으로부터 보호하거나 항원을 발현하는 종양으로부터 보호하는 면역 반응을 포유류에서 유발할 수 있는 에피토프를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 항원은 바이러스, 기생충, 진균 또는 세균으로부터 유래된다. 본 발명에 따른 비로좀의 형성에 적용되고 사용될 수 있는 항원은 모든 종류의 바이러스로부터 유래될 수 있으며, 그러한 바이러스의 비제한적인 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 레트로바이러스과; 풍진바이러스; 파라인플루엔자 바이러스, 홍역, 볼거리, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스와 같은 파라믹소바이러스과; 황열 바이러스, 뎅기바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 진드기-매개 뇌염, 세인트. 루이스 뇌염 또는 웨스트나일 바이러스와 같은 플라비바이러스과; 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바 바이러스와 같은 헤르페스바이러스과; 부니아바이러스과; 아레나바이러스과; 한탄과 같은 한타바이러스과; 코로나바이러스과; 인간 유두종바이러스와 같은 파포바바이러스과; 광견병 바이러스와 같은 랍도바이러스과; 인간 코로나바이러스와 같은 코로나바이러스과; 알파바이러스과, 알테리바이러스과, 에볼라바이러스와 같은 피로바이러스과, 아레나바이러스과, 천연두 바이러스와 같은 폭스바이러스과 및 아프리카돼지콜레라 바이러스이다. 특히 바람직한 것은 상기 항원이 인플루엔자 바이러스 또는 RSV로부터 유래되는 비로좀이다. 본 발명의 비로좀에 사용될 수 있는 인플루엔자 바이러스로부터의 단백질은 바람직하게는 단독의 또는 조합된, 헤마글루티닌(HA) 단백질, 뉴라미니다제(NA) 단백질 및/또는 M2 단백질이다. 본 발명의 비로좀에 사용될 수 있는 RSV로부터의 단백질은 융합(F), 당단백질(G) 및/또는 매트릭스(M) 단백질이다.
유사하게 그러한 항원은 병원성 세균, 진균(효모 포함) 또는 기생충으로부터 유래될 수 있다. 그러한 항원은 예를 들어, 헬리코박터(Helicobacter), 예를 들어, 에이치. 파일로리(H. pylori), 나이세리아(Neisseria), 예를 들어, 엔. 멘지티디스(N. mengitidis), 해모필루스(Haemophilus), 예를 들어, 에이치. 인플루엔자(H. influenza), 보르데텔라(Bordetella), 예를 들어, 비. 페르투시스(B. pertussis), 클라미디아(Chlamydia), 스트렙토코커스(Streptococcus), 예를 들어, 스트렙토코커스 종, 혈청타입 A, 비브리오(Vibrio), 예를 들어, 브이. 콜레라(V. cholera), 그람-음성 장내 병원균 - 예를 들어, 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter) 및 에스케리치아(Escherichia) 포함-의 세균 항원 및 탄저병, 한센병, 결핵, 디프테리아, 라임병, 매독, 장티푸스 및 임질을 야기하는 세균으로부터의 항원을 포함한다. 기생충으로부터의 항원은 예를 들어, 원생동물, 예를 들어, 바베오시스 보비스(Babeosis bovis), 말라리아원충(Plasmodium), 레이쉬마니아(Leishmania) 속, 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) 및 트리파노소마(Trypanosoma), 예를 들어, 티. 크루지(T. cruzi)로부터의 항원을 포함한다. 진균 항원은 진균류, 예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus) 종, 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코커스(Cryptococcus), 예를 들어, 씨. 네오포르만스(C. neoformans) 및 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)으로부터의 항원을 포함할 수 있다.
백신접종은 일반적으로 병원균으로부터 예방적 보호를 위해 또는 병원균 감염 후 질병 치료를 위해 적용되고 있지만, 당업자는 종양-치료를 위한 백신의 용도를 알고 있다. 더욱이, 증가하는 수의 종양-특이적 단백질이 인간 또는 인간화 항체에 의해 표적화될 수 있는 적절한 실체인 것으로 밝혀진다. 그러한 종양-특이적 단백질은 또한 본 발명의 범위내이다. 많은 종양 특이적 항원이 당업계에 알려져 있다. 따라서, 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명은 종양-특이적 항원을 포함하는 비로좀을 제공한다. 적합한 종양 항원은 예를 들어, 암배아 항원, 전립선-특이적 막 항원, 절단된 상피 성장 인자 수용체(EGRF), 톰센-프리덴리히(Thomsen-Friedenreich)(T) 항원, GM-2 및 GD-2 강글리오시드, Ep-CAM, 뮤신-1, 상피 당단백질-2 및 결장 특이적 항원을 포함한다.
이들 병원균으로부터의 바람직한 항원은 내재 막 단백질이다. 하지만, 비-막 단백질 항원 또는 보호성 에피토프를 함유한 그의 일부는 또한 그들을 막관통 서열에 융합시켜 본 발명에 사용하기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 항원은 내재 막 단백질이거나 막 고정 모이어티에 부착된 항원이다. 예를 들어, 항원은 막관통 도메인 또는 막-고정 아미노산 서열에 부착될 수 있다. 막관통 서열 또는 막-고정 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며 포유류 막관통 분자의 유전적 기하학에 기초한다. 막관통 서열은 보통 그 대부분이 소수성 측쇄를 갖는, 약 10-30, 보통 약 20 아미노산의 스트레치로 이루어진다. 막관통 서열은 매우 다양한 단백질에 대해 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 막-고정 서열의 예는 예를 들어, CD8, ICAM-2, IL-8R, CD4 및 LFA-1로부터 유래된 것들을 포함한다. 바람직하게는, 막관통 서열은 바이러스 막에 자연적으로 존재하는 바이러스 내재 막 단백질로부터 유래된다. 그 예는 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 당단백질 G의 막관통 영역(예를 들어, 아미노산 38 내지 63) 또는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제의 막관통 영역(예를 들어, 아미노산 7 내지 27)을 포함한다. 소수성 상호작용은 수성 환경에서 존재하는 소수성 물질 사이의 비-공유적, 비-정전기적인 끌어당기는 힘으로부터 생겨난다. 일 실시형태에서, 막 고정 모이어티는 지질 모이어티, 바람직하게는 인지질 또는 아실 사슬이다. 따라서, 추가로 바람직한 항원은 인지질 또는 아실 사슬과 같은 소수성 물질에 공유적으로 연결되어, 비로좀 막 내로 그들이 통합되도록 하는 가용성 단백질 또는 펩티드이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 신규한 "후-삽입" 방법에 의해 수득할 수 있는 아쥬반트화된 비로좀을 제공한다. 그러한 아쥬반트화된 비로좀은 무엇보다도 아쥬반트가 비로좀 막의 외부 층에 본질적으로 한정되는 양친매성 아쥬반트라는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 아쥬반트화된 비로좀은 상술한 양친매성 아쥬반트 중 하나 이상을 포함한다. 특히 바람직한 비로좀은 외피보유 바이러스, 바람직하게는 레트로바이러스과; 풍진바이러스; 파라믹소바이러스과; 플라비바이러스과; 헤르페스바이러스과; 부니아바이러스과; 아레나바이러스과; 한타바이러스과; 바큘로바이러스과; 코로나바이러스과; 파포바바이러스과; 랍도바이러스과; 알파바이러스과, 알테리바이러스과, 피로바이러스과 및 폭스바이러스과로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 것들이다.
아쥬반트화된 비로좀은 적어도 하나의 추가 항원, 바람직하게는 종양-항원 또는 바이러스, 기생충, 진균 또는 세균으로부터 기원하는 항원을 포함할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 항원은 바이러스 항원이며, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 또는 RSV로부터 유래된 항원이다.
상술한 대로, 항원은 내재 막 단백질 또는 막 고정 모이어티에 부착된 항원일 수 있으며, 바람직하게는 막 고정 모이어티는 막관통 도메인, 막-고정 아미노산 서열 또는 지질 모이어티이다.
다른 구체적으로 바람직한 비로좀은 인간 메타뉴모바이러스, 파라믹소바이러스 F 단백질, 단순포진 바이러스 gD 및 gB 단백질, HIV gp41 단백질로부터 유래된 단백질 또는 펩티드를 부가적으로 함유하는 인플루엔자 비로좀, CS 및 AMA와 같은 말라리아 단백질로부터의 단백질과 펩티드를 함유하는 인플루엔자 비로좀 또는 유방암 백신에서 유용한 항원을 부가적으로 함유하는 인플루엔자 비로좀으로부터의 항원을 포함하는 것들이다.
본 발명에 따른 비로좀은 표적 세포에 물질(예를 들어, 면역원성 분자, 약물 및/또는 유전자)을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 리포좀과는 달리, 비로좀은 바이러스 외피 단백질에 의해 야기된 세포내로의 효율적인 진입 및 이어지는 비로좀 내용물의 세포내 방출의 효과를 제공한다. 더욱이, 만일 소정의 활성 바이러스 외피 단백질이 그들의 막 내로 통합되면, 비로좀은 세포막과의 융합 후에 즉시 그들의 내용물을 세포질 내로 방출하고, 예를 들어, 이에 의해 엔도좀의 산성 환경에서 치료 물질의 분해를 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 비로좀은 특정 질병 또는 질환과 관련된 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 것이 필요한 백신접종 분야에서 특히 유용하다. 그러한 경우에, 항원은 전형적으로 비로좀에 캡슐화되거나 결합된 후, 비로좀은 이 항원을 백신접종될 숙주 면역계로 전달한다. 전달된 구체적 항원에 의해, 야기되는 예방 및/또는 치료는 필수적으로 항원과 관련된 질병 또는 질환에 대해 특이적이다.
따라서 추가 양태에서, 본 발명은 활성 성분으로서의 본 발명에 따른 비로좀, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 제제를 제공한다. 약학적으로 허용가능한 안정화제, 삼투압제, 완충제, 분산제 등이 또한 약학 조성물내로 통합될 수 있다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식 및 치료 용도에 따라 달라진다. 약학적 담체는 환자에게 비로좀을 전달하기에 적합한 임의의 양립성 비독성 물질일 수 있다.
비강내 전달을 위한 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 물, 완충된 염류 용액, 글리세린, 폴리소르베이트 20, 크레모포어 EL 및 카프릴/카프릭 글리세리드의 수성 혼합물을 들 수 있으며, 중성 pH 환경을 제공하기 위해 완충될 수 있다. 비경구 전달을 위한 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 선택적으로 20% 알부민으로 보충된 멸균 완충 0.9% (w/v) NaCl 또는 5% (w/v) 글루코스를 들 수 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균되어야 한다. 폴리펩티드 또는 항체의 비경구 투여 경로는 공지 방법, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입에 따른다.
근육내 주사를 위한 전형적인 약학 조성물은 예를 들어, 1-10 ml의 포스페이트 완충 염수 및 1 내지 100 ㎍, 바람직하게는 15-50 ㎍의 본 발명의 비로좀(의 항원 단백질)을 함유하도록 구성될 것이다.
경구 투여의 경우, 활성 성분은 엘릭시르, 시럽 및 현탁액과 같은 액체 투여 형태로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 환자 수용을 증가시키기 위해 착색제 및 향료를 함유할 수 있다. 비경구, 경구 또는 비강내 투여용 조성물의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 포함됨)을 비롯한 다양한 공급원에서 보다 상세히 개시된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 비로좀은 면역원성 조성물 또는 백신에 포함된다. 용어 "백신"은 세포 및/또는 항체 면역 반응을 유도하기 위하여 숙주에게 투여될 수 있는 제제를 말한다. 백신은 추가의 아쥬반트, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 예시적인 추가의 아쥬반트는 완전 프로인트(Freund's) 아쥬반트, 불완전 프로인트 아쥬반트, 게르부(Gerbu) 아쥬반트(GMDP; 씨.씨. 바이오텍 코포레이션(C.C. Biotech Corp.)), RIBI 가금류 아쥬반트(MPL; RIBI 임뮤노케미컬 리서치, 인크.(Immunochemical Research, Inc.)), 칼륨 명반, 암모늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, QS21(캠브리지 바이오텍(Cambridge Biotech)), 타이터 맥스(Titer Max) 아쥬반트(CytRx) 및 퀼(Quil) A 아쥬반트를 포함한다. 아쥬반트 특성을 가질 수 있는 다른 화합물은 결합제, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어, 전분, 락토스 또는 덱스트린, 붕해제, 예를 들어, 알긴산, 소듐 알지네이트, 프리모젤(Primogel), 옥수수 전분 등; 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스(Sterotex); 활택제, 예를 들어, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예를 들어, 수크로스 또는 사카린, 향료, 예를 들어, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료 및 착색제를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 비로좀은 동결건조되거나 동결건조 후 재수화될 수 있다. 동결건조된 비로좀은 건조 분말로서 또는 재수화 후에 백신으로서 사용될 수 있다.
또한 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 아쥬반트화된 비로좀이 제공된다. 예를 들어, 암 또는 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법에 사용하기 위한 아쥬반트화된 비로좀이 본 발명에서 제공된다. 일 실시형태에서, 아쥬반트화된 비로좀은 면역원성이다. 용어 "면역원성"은 항체 반응 및/또는 세포 매개 면역 반응(예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL) 관련됨)을 생산하는 것을 비롯하여, 숙주 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 분자를 말한다.
아쥬반트화된 비로좀 또는 백신의 투여량은 예를 들어, 먼저 예방 및/또는 치료 면역 반응을 유발하는데 효과적인 투여량을 확인함으로써 결정될 수 있다. 이것은 바이러스 특이적 면역글로불린의 혈청 역가를 측정함으로써 및/또는 혈청 샘플, 소변 샘플 및/또는 점막 분비물에서 항체의 억제비를 측정함으로써 이루어질 수 있다. 투여량은 RSV에 천연 숙주가 아닌 동물을 비롯한 동물 연구로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 동물은 유도되는 면역 반응을 부분적으로 특성규명하기 위하여 및/또는 임의의 중화 항체가 생산되었는지를 결정하기 위하여, 백신 후보가 투여될 수 있다. 또한, 일상적인 인간 임상 연구를 수행하여 인간을 위한 유효 투여량을 결정할 수 있다. 유효 투여량은 인 비트로 및/또는 인 비보 동물 모델에서 유도된 투여량-응답 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따라 제조된 의약의 일일 투여량은 10 ng/kg 내지 약 10 g/kg 비로좀/성인/일의 범위에 걸쳐 변한다. 경구 투여의 경우, 의약은 바람직하게는 치료 과정에서 환자의 신호 및 증상에 따른 증상적 조정을 위해 0.001 내지 1,000 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 50 mg, 그리고 가장 바람직하게는 0.1 내지 20 mg의 비로좀을 함유하는 정제 형태로 제공된다. 정제는 예를 들어, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 10, 20, 50 또는 100 mg의 비로좀을 함유할 수 있다. 실시형태에 따라 제조된 의약에서 비로좀의 유효량은 보통 약 0.0001 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 체중/투여량 단위의 투여량 수준으로 공급된다. 보다 구체적으로, 범위는 약 0.0001 mg/kg 내지 7 mg/kg 체중/일이다. 아동에게 주어진다면, 투여량은 적절하게 감소될 수 있다.
일 실시형태에서, 백신은 희석제를 이용하여 제형화될 수 있다. 예시적인 "희석제"는 물, 생리 식염수, 인간 혈청 알부민, 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매, 항균제, 예를 들어, 벤질 알콜, 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 소듐 비설파이트, 킬레이팅제, 예를 들어, 에틸렌 디아민-테트라-아세트산, 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 삼투압 조절제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스를 포함한다. 예시적인 "담체"는 액체 담체(예를 들어, 물, 염수, 배양 배지, 염수, 수성 덱스트로스 및 글리콜) 및 고형 담체(예를 들어, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스 및 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 및 글루타치온과 같은 항산화제 및 가수분해된 단백질)을 포함한다.
일 실시형태에서, 백신은 부형제를 함유할 수 있다. 용어 "부형제"는 본 명세서에서 항원의 전달을 위한 비히클을 형성하는 임의의 불활성 물질(예를 들어, 검 아라빅, 시럽, 라놀린, 전분 등)을 말한다. 용어 부형제는 충분한 액체의 존재하에서 알약 또는 정제의 제조를 위해 필요한 접착제 특성을 조성물에 부여하는 물질을 포함한다.
일 실시형태에서, 면역 반응은 비로좀에 포함되는 관심 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 포함한다. 항체 또는 세포(예를 들어, 림프구 세포)의 다른 분자(예를 들어, 단백질 또는 펩티드)와의 상호작용을 언급하면서 사용될 경우 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합"은 상호작용이 분자 상의 특정 구조(즉, 항원 결정자 또는 에피토프)의 존재에 의존함을 의미한다.
다른 실시형태에서, 면역 반응은 관심 단백질에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수를 증가시키는 것을 포함한다. 용어 "T 림프구"는 세포독성 T 세포(CTL), 헬퍼 T 세포 및 억제자 T 세포 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. T 림프구는 MHC 분자와 복합된 펩티드 단편 형태의 항원을 인식하는 수용체를 발현한다.
따라서, 일 실시형태에서 본 발명의 비로좀은 백신 내에 통합될 수 있으며, 백신의 면역학적 유효량이 동물에게 투여되어 면역 반응을 생성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원적 유효량" 및 "면역학적 유효량"은 백시접종시에 숙주에서 면역 반응(특이적 항체의 생산 및/또는 TCL 반응의 유도를 포함)의 생성을 유발하고/하거나 증가시키는 분자의 양을 말한다. 필요한 것은 아니지만, 면역학적-유효(즉, 면역원적-유효)량은 "보호성" 양인 것인 바람직하다. 용어 조성물의 "보호성" 및 "치료" 양은 질병의 하나 이상의 증상을 지연, 감소, 증상 완화, 경감, 안정화 및/또는 역전시키는 조성물 양을 말한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 비로좀 또는 백신은 예방적으로(즉, 감염성 제제의 감염 전 및/또는 질병 증상의 관찰 전) 및/또는 치료적으로(즉, 감염성 제제의 감염 후 및/또는 질병 증상의 관찰 후) 투여될 수 있다. 투여는 또한 하나 이상의 질병 증상의 징후에 수반될 수 있다(즉, 동시에 또는 그동안에). 또한, 본 발명의 비로좀 또는 백신은 다른 유형의 약물 투여 또는 치료 절차(예를 들어, 수술, 화학요법, 방사선요법 등) 전에, 함께, 및/또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 투여하는 방법은 비경구, 경구, 복강내, 비내, 국소(예를 들어, 직장 및 질내) 및 설하 형태의 투여를 제한없이 포함한다. 비경구 투여 경로는 예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 스템내(intrastemal) 주사 및 주입 경로를 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 비로좀(을 포함하는 약학 조성물)의 치료적 또는 예방적 유효량을 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여함으로써 감염성 질병 또는 종양에 대한 백신접종하거나 또는 예방 또는 치료를 하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약으로서, 바람직하게는 감염성 질병 또는 종양에 대한 백신접종 또는 예방 또는 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 비로좀에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 감염성 질병 또는 종양에 대한 백신접종 또는 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 비로좀의 용도에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 면역 반응을 생성하기 위하여 본 발명의 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 바이러스 질병에 대하여 개체를 면역시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 바이러스 질병은 RSV, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스에 의해 야기된다.
추가의 양태는 약물 개발, 특히 백신 최적화 분야에 관련된다. 본 발명에 따른 아쥬반트화된 비로좀을 포함하며 각 제제는 구별되는 아쥬반트/항원 비율을 갖는 적어도 두 개의 제제를 제조하고/하거나 본 발명에 따른 "후-삽입" 방법을 이용하고, 면역 반응 유도에 있어서 그 효능에 대해 시험 개체에서 각 제제를 평가하는 것을 포함하는, 비로좀-기반 백신의 아쥬반트/항원 비율을 최적화하는 방법이 제공된다. 상기에서 설명된 바처럼, 이 방법은 아쥬반트화된 비로좀을 포함하는 백신의 전임상 및 임상 시험을 위해 중요한 효과를 갖는다. 예비형성된 비로좀 조성물이 "약물 물질 A"를 형성하는 한편, 용매 내의 아쥬반트는 "약물 물질 B"이므로, 약물 물질 A 및 B를 위한 안전성 및 임상 시험만이 요구된다. 구별되는 아쥬반트/항원 비율을 가진 적어도 두 가지 약품 제제로 물질 A와 B를 조합하는 것은 병상에서 이루어질 수 있으며, 따라서 전임상 및 이어서 임상 시험에서 각각의 개별 아쥬반트/항원 비율의 비싼 안전성 평가를 피할 수 있다. 더욱이, 이 방법은 상이한 아쥬반트가 임의의 비로좀과 시험되거나, 임의의 아쥬반트가 상이한 비로좀과 경제적으로 시험되도록 한다.
도 1: RSV 비로좀내의 후-삽입된 아쥬반트 3-D-PHAD의 평형 밀도 구배 분석. 패널 a는 하부에서 상부까지 연속적으로 1.1, 1.2 내지 1.11까지 번호가 붙은 분획에서 단백질, 포스페이트(인지질 및 3-D-PHAD 둘 모두로부터) 및 밀도를 보여준다; 패널 b는 DMSO에 용해된 3-D-PHAD만의 유사한 구배를 보여준다.
도 2 : 도 1a의 구배로부터의 샘플의 TLC 플레이트 분석. 레인 1: RSV 바이러스 지질 추출물; 레인 2: 사용된 PC 및 PE; 레인 3: 3D-PHAD 아쥬반트; 레인 4-8: 구배의 분획 1.5-1.9. 에탄올 염색 후 스팟에 동그라미로 표시하였으며 플레이트를 포스포몰리브데이트 시약으로 현상하였다.
도 3: DMF 중의 용액으로부터 RSV 비로좀내로의 아쥬반트 3-D-PHAD의 후-삽입의 평형 밀도 구배 분석. 분획은 하부에서 상부까지 번호를 붙인다. 도 1에서와 같은 분석.
도 4: DMSO 중의 용액으로부터 RSV 비로좀내로의 아쥬반트 MPLA의 후-삽입의 평형 밀도 구배 분석. 분획은 하부에서 상부까지 번호를 붙인다. 도 1에서와 같은 분석.
도 5: DMSO 중의 용액으로부터 RSV 비로좀내로의 리포펩티드 아쥬반트의 후-삽입의 평형 밀도 구배 분석. 분획은 하부에서 상부까지 번호를 붙인다. 도 1에서와 같은 분석.
도 6: 도 5에서의 구배의 분획들로부터의 샘플의 은-염색된 SDS-PAGE 젤. 바이러스 막 단백질 F (F1 서브유닛) 및 G가 표시된다. 리포펩티드는 화살표로 표시된다.
도 7: ELISA에 의해 결정된 항-RSV IgG. 기하학적 평균 역가의 로그(밑 10) 도시이며, 선은 평균을 나타냄.
도 8: 엑스-비보 중화 항체. 역가의 로그(밑 2) 도시이며, 선은 평균을 나타냄.
도 2 : 도 1a의 구배로부터의 샘플의 TLC 플레이트 분석. 레인 1: RSV 바이러스 지질 추출물; 레인 2: 사용된 PC 및 PE; 레인 3: 3D-PHAD 아쥬반트; 레인 4-8: 구배의 분획 1.5-1.9. 에탄올 염색 후 스팟에 동그라미로 표시하였으며 플레이트를 포스포몰리브데이트 시약으로 현상하였다.
도 3: DMF 중의 용액으로부터 RSV 비로좀내로의 아쥬반트 3-D-PHAD의 후-삽입의 평형 밀도 구배 분석. 분획은 하부에서 상부까지 번호를 붙인다. 도 1에서와 같은 분석.
도 4: DMSO 중의 용액으로부터 RSV 비로좀내로의 아쥬반트 MPLA의 후-삽입의 평형 밀도 구배 분석. 분획은 하부에서 상부까지 번호를 붙인다. 도 1에서와 같은 분석.
도 5: DMSO 중의 용액으로부터 RSV 비로좀내로의 리포펩티드 아쥬반트의 후-삽입의 평형 밀도 구배 분석. 분획은 하부에서 상부까지 번호를 붙인다. 도 1에서와 같은 분석.
도 6: 도 5에서의 구배의 분획들로부터의 샘플의 은-염색된 SDS-PAGE 젤. 바이러스 막 단백질 F (F1 서브유닛) 및 G가 표시된다. 리포펩티드는 화살표로 표시된다.
도 7: ELISA에 의해 결정된 항-RSV IgG. 기하학적 평균 역가의 로그(밑 10) 도시이며, 선은 평균을 나타냄.
도 8: 엑스-비보 중화 항체. 역가의 로그(밑 2) 도시이며, 선은 평균을 나타냄.
실시예
실시예
1 : 후-삽입에 의한
RSV
비로좀
내로의
아쥬반트
MPL의
통합.
비로좀은 당업계에 개시된 대로 정제된 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 균주 A2로부터 제조하였다. 요약하면, 바이러스를 30분동안 얼음상에서 50 mM 디-카프로일포스파티딜콜린(DCPC)에서 가용화시키고, 120,000g에서 30분동안 원심분리하여 바이러스 뉴클레오캡시드를 제거하였다. 상등액을 수집하고 0.1 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 용매(클로로포름/메탄올 2:1 v/v)의 증발에 의해 2:1 몰비의 포스파티딜콜린(PC)과 포스파티딜에탄올아민(PE)(공급원: 계란, 각각 계란으로부터 트랜스포스파티딜화됨)의 혼합물로부터 지질 박막을 제조하였다. 바이러스 막 상등액(2.35 ml)을 850 nmol의 인지질 당 1 mg의 단백질의 비율로 지질 박막에 첨가하였다. 혼합물을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 감마 조사에 의해 멸균되고 10 kDa 분자량 컷오프를 가진 슬라이드-에이-라이저(slide-a-lyzer) 투석 카세트에서 2리터의 HNE 버퍼의 7번 교환에 대하여 48시간 동안 4℃에서 투석시켰다. 비로좀을 수집하고 비로좀내의 인지질 농도를 측정하였다.
DMSO중의, 양친매성 아쥬반트인 합성 모노-포스포릴 지질 A 유사체 3-D-PHAD (국제특허공개 WO2013/155448호에 개시됨)의 저장 용액을 제조하였다. 850 nmol의 인지질을 함유한 975 ㎕의 비로좀에, 153 nmol의 3-D-PHAD를 함유한 25 ㎕의 DMSO 용액을 볼텍스 혼합기에서 샘플을 교반하면서 신속하게 첨가하였다. 4 ℃에서 밤새 저장한 후, 50 krpm에서 소르발(Sorvall) AH 650 로터에서 66시간동안 회전시킨, 10-60% 수크로스 구배상에 로딩된 평형 밀도 구배 원심분리에 의해 비로좀의 밀도를 분석하였다. 대조군으로서, 153 nmol의 3 D-P-HAD 단독 또한 유사한 구배에서 러닝시켰다. 구배로부터의 샘플을 굴절률 측정에 의해 수크로스 농도에 대해 분석하여, 밀도, 포스페이트(지질 및 3-D-PHAD 둘 모두) 및 단백질을 측정하였다. 도 1에 나타난 바처럼, 비로좀은 모든 포스페이트를 함유한, 1.054-1.0759 g/ml 주위의 단일 밴드를 형성하는 한편, 유리 3-D-PHAD는 1.12 g/ml 주위에서 밴드를 형성하였다. 따라서, DMSO 용액으로부터 비로좀에 추가된 3-D-PHAD의 대부분은 비로좀내에 통합되었다.
구배의 분획들을 폴치(Folch)에 따라 클로로포름/메탄올로 추출하고, 머크(Merck) HP TLC 60 플레이트에서 박층크로마토그래피에 의해 분석하였다. 플레이트를 클로로포름:메탄올:물 100:75:15 (v/v)에서 러닝시켰다. 지질 및 3 DPHAD를 연속적인 에탄올, 요오드, 닌히드린 및 포스포몰리브데이트 염색에 의해 가시화하였다. 대조군으로서, RSV 바이러스 지질의 폴치 추출물, 비로좀을 제조하기 위해 사용된 PC 및 PE, 및 유리 3 DPHAD를 또한 동일한 플레이트에서 러닝시켰다. 도 2에 나타난 대로, 3-D-PHAD는 비로좀-함유 분획에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
실시예
2 : 여러 용매를 이용한,
RSV
비로좀
내로의 여러
아쥬반트의
후-삽입
실시예 1에 개시된 대로, 정제된 RSV 바이러스 균주 A2로부터 비로좀을 제조하였다. 비로좀을 수집하고 비로좀 내의 인지질 농도를 측정하였다.
여러 용매 내의 여러 아쥬반트의 저장 용액을 제조하였다:
1) 50 ㎕ DMF 내의 100 nmol 3-D-PHAD
2) 50 ㎕ DMSO 내의 100 nmol 모노-포스포릴 지질 A (MPLA)
3) 50 ㎕ DMSO 내의 0.3 mg N-팔미토일-S-2,3(비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신(리포펩티드)
상기 아쥬반트 용액을, 850 nmol의 인지질을 함유하는 비로좀 950 ㎕를 각각 가진 4개의 튜브에, 볼텍스에서 빠르게 혼합하면서 첨가하였다. 4℃에서 밤새 저장 후, 120,000 g에서 소르발 AH 650 로터에서 66시간동안 회전시킨, 10-60% 수크로스 구배상에서의 평형 밀도 구배 원심분리에 의해 비로좀의 밀도를 분석하였다. 구배로부터의 샘플을 밀도, 포스페이트(지질 및 3-D-PHAD 둘 모두) 및 단백질에 대해 분석하였다. 도 3-5에 나타난 대로, 모든 구배 상에서, 단백질 또한 함유한 (인지질, 3-D-PHAD 또는 MPLA로부터)포스페이트의 단일 피크가 있는 한편, SDS-PAGE 전기영동에 의해 리포펩티드는 분획 4-7에 존재하며 분획 6(최고 농도의 비로좀 함유)에서 피크를 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 7). 이것은 아쥬반트가 모든 경우에 비로좀 내에 통합되었음을 입증한다. 리포펩티드-함유 비로좀은 1.1 g/ml 주위에서 피크 밀도를 갖는 한편, 다른 비로좀은 1.04-1.06 g/ml 주위에서 밴드를 나타냈다. 따라서, 비로좀에 첨가된 상이한 아쥬반트는 비로좀의 밀도에 상이하게 영향을 미쳐 그들의 통합의 추가 증거를 제공한다.
실시예
3 :
비로좀
형성동안
또는 형성 후 통합된 3-D-
PHAD를
함유한
RSV
비로좀을
이용한 마우스의 백신접종
두 가지 상이한 비로좀 제제를 정제된 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 균주 A2로부터 제조하였다. 요약하면, 바이러스를 30분동안 얼음상에서 50 mM 디-카프로일포스파티딜콜린(DCPC)에서 가용화시키고, 120,000g에서 30분동안 원심분리하여 바이러스 뉴클레오캡시드를 제거하였다. 상등액을 수집하고 0.1 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 용매(클로로포름/메탄올 2:1 v/v)의 증발에 의해 2:1 비의 PC와 PE의 혼합물로부터 하나(시험 샘플)와 추가로 3-D-PHAD를 함유한 다른 하나(비교예)의 두 가지 지질 박막을 제조하였다.
바이러스 막 상등액을 850 nmol의 인지질(시험 샘플) 또는 850 nmol의 인지질 + 200 nmol 3-D-DPHAD(비교예) 당 1 mg의 단백질의 비율로 지질 박막에 첨가하였다. 혼합물을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 감마 조사에 의해 멸균되고 10 kDa 분자량 컷오프를 가진 슬라이드-에이-라이저 투석 카세트에서 2리터의 HNE 버퍼의 7번 교환에 대하여 48시간 동안 4℃에서 투석시켰다. 비로좀을 수집하고 비로좀내의 인지질 농도를 측정하였다. 850 nmol의 인지질을 함유하고 3-D-PHAD를 함유하지 않는 수성 비로좀 조성물 975㎕에 153 nmol의 3-D-PHAD를 함유한 DMSO 용액 25㎕를, 볼텍스 혼합기에서 샘플을 교반하면서 신속하게 첨가하였다. 따라서, 비교 비로좀 제제는 비로좀 형성동안 통합된 200 nmol의 3-D-PHAD를 함유한 한편("통합됨"), 시험 비로좀 제제는 비로좀 형성 후 용매로부터 첨가된 3-D-PHAD 100 nmol을 함유하였다("후-삽입됨").
각각 10마리 Balb/C 마우스의 세 그룹을 1일과 15일에, 비히클 대조군(HNE 버퍼, 145 mM NaCl, 5 mM HEPES, 1 mM EDTA, pH 7.4)으로 백신접종하거나, 5 ㎍ 바이러스 단백질 및 1㎍ 3-D-PHAD/마우스/주사로 "통합된" 비로좀 제제로 백신접종하거나, "후-삽입된" 비로좀 제제를 5 ㎍ 바이러스 단백질 및 0.5 ㎍ 3-D-PHAD/마우스/주사로 백신접종하였다.
바이러스 단백질에 대한 IgG 역가를 이전에 개시된 대로(Kamphuis, T. et al. Plos One 2012;7 (5):e36812) 28일에 결정하였다. 도 7에 나타난 대로, 3-D-PHAD 후-삽입된 비로좀에 의해 유도된 IgG 역가는 통합된 3-D-PHAD 비로좀의 역가와 동등하였으나, 후자 비로좀은 2배의 양의 아쥬반트를 함유하였다.
살아 있는 바이러스에 대한 중화 항체 역가는 이전에 개시된 대로(Kamphuis, T. et al. Plos One 2012;7 (5):e36812) 28일에 엑스-비보에서 결정하였다. 도 8에 나타난 대로, 3-D-PHAD 후-삽입된 비로좀에 의해 유도된 IgG 역가는 통합된 3-D-PHAD 비로좀의 역가와 적어도 동등하였으나, 후자 비로좀이 2배의 양의 3-D-PHAD를 함유하였다.
Claims (43)
- (i) 막 융합 단백질을 포함하는, 아쥬반트화되지 않은 비로좀(virosome)의 수성 조성물을 제공하는 단계;
(ii) 물과 균질한 혼합물을 형성할 수 있는 약학적으로 허용가능한 비수성 용매에서 양친매성 아쥬반트를 용해시켜 아쥬반트 용액을 얻는 단계; 및
(iii) 상기 비로좀의 막 융합 활성을 보존하면서 비로좀 막의 외부 층으로 아쥬반트의 삽입을 유도하기 위해서, 상기 아쥬반트 용액을 상기 아쥬반트화되지 않은 비로좀의 수성 조성물 내에서 희석하는 단계;를 포함하는, 아쥬반트화된 비로좀의 제조 방법. - 제1항에 있어서, 상기 비수성 아쥬반트 용매는 20℃에서 적어도 5 g/100 mL의 물에서의 용해도를 갖는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 비수성 아쥬반트 용매는 20℃에서 적어도 10 g/100 mL의 물에서의 용해도를 갖는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비수성 아쥬반트 용매는 물 혼화성 용매인 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 비수성 아쥬반트 용매는 아세토니트릴, 2-부탄올, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 아세트산, 포름산, 메탄올, 에탄올, DMSO, DMF, n-프로판올, 이소프로판올, 2-메틸-1-프로판올 및 THF, 또는 임의의 그 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 비수성 아쥬반트 용매는 DMSO 또는 DMF인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 막 융합 단백질은 바이러스 융합 단백질인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 바이러스 융합 단백질은 HIV gp120/gp41 단백질, 파라믹소바이러스(paramixovirus) F 단백질 및 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 헤마글루티닌(HA) 단백질, 바큘로바이러스(baculovirus)의 gp64 단백질, 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus)의 E 단백질 및 그의 융합 활성 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 막 융합 단백질은 RSV F 단백질 또는 융합 활성 변이체인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비로좀은, 레트로바이러스과(Retroviridae);풍진바이러스(rubellavirus); 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae); 플라비바이러스과(Flaviviridae); 헤르페스바이러스과(Herpesviridae); 부니아바이러스과(Bunyaviridae); 아레나바이러스과(Arenaviridae); 한타바이러스과(Hantaviridae); 바큘로바이러스과(Baculoviridae); 코로나바이러스과(Coronaviridae); 파포바바이러스과(Papovaviridae); 랍도바이러스과(Rhabdoviridae); 알파바이러스과(Alphaviridae), 알테리바이러스과(Arteriviridae), 피로바이러스과(Filoviridae) 및 폭스바이러스과(Poxviridae)로 이루어진 군으로부터 선택된 외피보유 바이러스를 원료로 하여 제조된 것을 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 비로좀은, 상기 외피보유 바이러스를 단쇄 인지질 또는 세제를 함유한 용액과 접촉시켜 상기 바이러스의 바이러스 외피를 가용화시키는 것을 포함하며, 추가로 상기 용액으로부터 단쇄 인지질 또는 세제를 제거하여 기능적으로 재구성된 바이러스 외피를 형성하여 제조되는 것을 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 단쇄 인지질 또는 세제는 투석, 여과, 또는 소수성 비드 상에의 흡착에 의해 제거되는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 단쇄 인지질은 임계 미셀 농도(cmc)가 0.1 mM 초과인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 단쇄 인지질은 임계 미셀 농도(cmc)가 0.3 mM 초과인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 단쇄 인지질은 포스파티딜콜린인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 1,2-다이헵타노일-sn-포스파티딜콜린 또는 1,2-다이카프로일-sn-포스파티딜콜린인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 세제는 옥타-에틸렌-글리콜 모노 N 도데실 에테르인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 소수성 비드는 폴리스티렌 다이비닐벤젠으로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양친매성 아쥬반트는 톨-유사-수용체(Toll-like receptor)(TLR)에 의해 인식되는 화합물인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 양친매성 아쥬반트는 모노-포스포릴 지질 A 및 리포펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양친매성 아쥬반트는 당지질인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 당지질은 α-갈락토실세라마이드, 포스파티딜이노시톨 만노시드, 내독소 지질다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양친매성 아쥬반트는 양친매성 펩티드인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 양친매성 펩티드는 재기드-1(Jagged-1) 또는 아쥬반트 활성을 갖는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비로좀은 적어도 하나의 추가 항원을 포함하고, 상기 항원은 종양-항원 또는 바이러스, 기생충, 진균 또는 세균으로부터 기원하는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 바이러스 또는 RSV로부터 유래된 바이러스 항원인 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 항원은 내재 막 단백질 또는 막 고정 모이어티에 부착된 항원인 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 막 고정 모이어티는 막관통 도메인 또는 막-고정 아미노산 서열인 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 막 고정 모이어티는 지질 모이어티인 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 지질 모이어티는 인지질 또는 아실 사슬인 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제7항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 아쥬반트화된 비로좀.
- 아쥬반트가 비로좀 막의 외부 층에 한정되어 존재하는 양친매성 아쥬반트인 것을 특징으로 하는, 아쥬반트화된 비로좀.
- 제32항에 있어서, 상기 양친매성 아쥬반트는 제19항 내지 제24항 중 어느 항의 양친매성 아쥬반트인, 아쥬반트화된 비로좀.
- 제32항에 있어서, 적어도 하나의 추가 항원, 상기 항원은 종양-항원 또는 바이러스, 기생충, 진균 또는 세균으로부터 기원하는 것을 포함하는, 아쥬반트화된 비로좀.
- 제34항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 바이러스 또는 RSV로부터 유래되는 바이러스 항원인, 아쥬반트화된 비로좀.
- 제34항에 있어서, 상기 항원은 내재막 단백질 또는 막 고정 모이어티에 부착된 항원이며, 상기 막 고정 모이어티는 막관통 도메인, 막-고정 아미노산 서열 또는 지질 모이어티인, 아쥬반트화된 비로좀.
- 제32항 및 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 아쥬반트화된 비로좀 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암 또는 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제37항에 있어서, 비강내 전달, 비경구 전달 또는 경구 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제32항 및 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 아쥬반트화된 비로좀을 포함하는 면역원성 조성물.
- 제39항에 있어서, 비강내 전달, 비경구 전달 또는 경구 투여를 위해 제형화되는 조성물.
- 제32항 및 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한, 아쥬반트화된 비로좀.
- 제32항 및 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법에 사용하기 위한, 아쥬반트화된 비로좀.
- 제32항 및 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 아쥬반트화된 비로좀을 포함하며 각 제제는 구별되는 아쥬반트/항원 비율을 갖는 적어도 두 개의 제제를 제조하고/하거나 제1항 내지 제3항 및 제7항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법을 이용하고, 면역 반응 유도에 있어서 그 효능에 대해 시험 개체에서 각 제제를 평가하는 것을 포함하는, 비로좀-기반 백신의 아쥬반트/항원 비율을 최적화하는 방법.
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