CN110128543A - 一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途,该仿病毒囊泡由双分子层膜和所述双分子层膜内部包裹的分子探针构成,其中所述双分子层膜的表面具有融合基团。该仿病毒囊泡其中之一的制备方法为:先采用基因工程在所述双分子层表面修饰融合基团,然后粉碎双分子层和分子探针混合后,挤压得到仿病毒囊泡。本发明的仿病毒囊泡可与外泌体膜直接融合,从而将仿病毒囊泡内部的分子探针递送到外泌体内,进而检测外泌体内的核酸分子,实现外泌体内核酸分子的原位、准确、快速检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途。
背景技术
外泌体是一种由细胞分泌的、直径在40nm~100nm的细胞外囊泡。外泌体外层是磷脂双分子层,内含丰富的蛋白质、mRNA、miRNA、DNA片段等成分,参与细胞间的物质交换和信息交流。外泌体的形成始于细胞膜内陷发展形成内体,内体膜以向内出芽的形式形成多囊泡内体。一部分多囊泡内体与细胞内溶酶体结合,使其内容物降解;另一部分多囊泡内体与质膜融合,将外泌体释放到胞外空间。外泌体在血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中具有很高的丰度,而不同来源的外泌体具有相应特异的功能,如清除过时分子,免疫调节与监视,细胞程序性死亡、血管生成、炎症、肿瘤细胞和癌基因传播等,在多种生理和病理过程中发挥重要作用,与疾病的发生与进程密切相关。因此,外泌体及其内容物的分析检测对疾病的早期诊断、疗效评估和预后分析具有重要意义。
目前临床疾病的诊断主要依靠影像学技术或组织活检,但是这几个经典的方法都有各自的缺点。通过影像学发现疾病最大的缺点就是滞后性。影像学对疾病有明确的判断和发现时,大多是疾病进展较为严重。实体组织学活检是疾病确诊的重要手段,是目前明确疾病的金标准。但是实体组织活检具有侵入性,而且对于早期疾病而言,也很难通过活检准确地获得病灶组织。因此急需寻找一个可用于肿瘤诊断的高灵敏检测方法。大量研究发现,疾病来源的外泌体中含有大量特异性核酸分子,可以作为重要标志物用于疾病的诊断、疗效评估和预后分析。相比于其他已知的诊断方法,检测外泌体内的核酸分子具有许多独特的优势:(1)外泌体广泛存在于各种体液中,而且含量丰富,例如,每毫升血液中循环肿瘤细胞仅有1~10个,而肿瘤外泌体含量高达109个;(2)外泌体取材方便、创伤小,可以在疾病的诊疗过程中多次取材,病人依从性好;(3)外泌体内核酸分子不是随机进入的,而是通过特殊的分拣机制进入的,因此更具特异性;(4)外泌体内核酸分子具有外泌体膜保护,使其免受体液内核酸酶降解,可以稳定存在。分析检测外泌体内的核酸分子,有利于疾病的诊断及疗效分析,具有极其重要的科研和临床意义。
目前检测外泌体内部核酸分子的主要步骤是先分离外泌体,再检测内部分子。外泌体的分离方法有差速离心法、尺寸排阻法、亲和富集法、超滤法等,但这些方法均存在一定的问题,例如使用差速离心法分离外泌体,虽然获得的囊泡较多,但由于细胞外囊泡种类多样,该方法所得产物中常包含其他类型的囊泡和蛋白质聚集体,而重复的超高速离心步骤又会造成外泌体的破坏;尺寸排阻法利用颗粒大小进行分离,产物纯度高,但是上样量小,不适合大量样品分析;虽然一些新兴的芯片技术也不断出现,但仅适于检测外泌体表面的标志物。此外,最重要的是通过上述几种方法得到外泌体后,在提取核酸分子的过程中均需要对外泌体的结构进行破坏,这一过程容易造成核酸分子的降解和损失,影响最终检测结果的准确性。
用于检测核酸分子的分子探针有分子信标、纳耀斑等。以分子信标为例,其是一类具有特殊发夹结构的荧光探针,广泛应用于基因筛查、生物传感器的开发和核苷酸检测等方面。发夹结构的热稳定性和内部信号转移的高效性赋予分子信标优异的灵敏度和选择性,可以在不分离未结合探针的情况下检测目标序列,为核酸的实时检测提供了可能。将分子信标与外泌体共同孵育,通过分子信标被动扩散进入外泌体,可以实现对外泌体内肿瘤标志物miRNA-21的检测。该方法的优点是简便、快捷,在不破坏外泌体的情况下实现了外泌体内核酸分子的原位检测。然而,分子探针裸露在体液中时容易被核酸酶分解,产生非特异信号,因此难以实现外泌体内核酸分子的精准检测。此外,分子探针通过被动扩散跨外泌体膜的效率低,难以实现外泌体内核酸分子的高效检测,因而限制了该方法的应用。基于上述分析,现有利用分子探针检测外泌体内核酸分子的技术中,存在以下问题(1)需要预先分离外泌体,分离步骤繁琐,耗时长,细胞外囊泡种类多样,分离产物中常包含其他类型的囊泡和蛋白质聚集体,分离步骤也会造成外泌体的破坏;(2)分子探针通过被动扩散进入外泌体的效率低,且在体液中容易被核酸酶分解,产生非特异信号,因此难以实现外泌体内核酸分子的精准、高效检测。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种仿病毒囊泡,该仿病毒囊泡可与外泌体膜直接融合,从而将仿病毒囊泡内部的分子探针递送到外泌体内,进而检测外泌体内的核酸分子,实现外泌体内核酸分子的原位、准确、快速检测。该仿病毒囊泡可实现避免分离外泌体以及避免分子探针外漏在体液中。
本发明的第二目的是提供一种仿病毒囊泡的制备方法,实现仿病毒囊泡的大小均一,质量可控。
本发明的第三目的是提供一种仿病毒囊泡的用途,可以用于分析检测外泌体内核酸分子,检测结果可以用于疾病的早期诊断、疗效评估和预后分析。
为解决上述问题,本发明的技术方案为:
一种仿病毒囊泡,所述仿病毒囊泡由双分子层膜和所述双分子层膜内部包裹的分子探针构成,其中所述双分子层膜的表面具有融合基团。
优选地,所述融合基团为正粘病毒的融合蛋白、副粘病毒的融合蛋白、腺病毒的融合蛋白、疱疹病毒的融合蛋白、嗜肝病毒的融合蛋白、乳头瘤病毒的融合蛋白、弹状病毒的融合蛋白、痘病毒的融合蛋白、具有引起膜融合功能的多肽、具有引起膜融合功能的核酸。
优选地,所述双分子层膜为细胞膜、细菌膜、病毒膜、两亲性分子制备的双分子层膜中的任意一种。
优选地,所述分子探针为核酸分子信标、纳耀斑中的一种。
优选地,所述双分子层膜的内部可同时包裹一种或多种所述分子探针。
本发明还提供了一种仿病毒囊泡的制备方法,选自如下之一:
A、双分子层是天然生物膜,首先采用基因工程技术在所述双分子层表面修饰融合基团,然后粉碎修饰后的双分子层与分子探针混合,通过挤压得到所述仿病毒囊泡;或者
B、双分子层是天然生物膜,首先粉碎所述双分子层膜与分子探针混合,通过挤压得到囊泡,然后采用化学修饰在所述囊泡表面修饰融合基团,得到所述仿病毒囊泡;或者
C、双分子层是两亲性分子制备,将所述双分子层直接与分子探针混合,通过挤压得到囊泡,然后采用化学修饰在所述囊泡表面修饰融合基团,得到所述仿病毒囊泡。
优选地,所述天然生物膜为细胞膜、细菌膜、病毒膜中的任意一种。
优选地,所述仿病毒囊泡的粒径为50nm~1.5um。
本发明还提供了一种仿病毒囊泡的用途,所述仿病毒囊泡制备检测外泌体内的核酸分子的产品的用途。
优选地,所述核酸分子为mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA中的任意一种。
本发明由于采用以上技术方案,使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果:
(1)本发明提供的一种仿病毒囊泡,该仿病毒囊泡由双分子层膜和双分子层膜内部包裹的分子探针构成,其中双分子层膜的表面具有融合基团,融合基团与外泌体膜高效融合,从而将仿病毒囊泡内部的分子探针递送到外泌体内,进而检测外泌体内的核酸分子,实现外泌体内核酸分子的原位、准确、快速检测。可避免预先分离外泌体,并且避免分子探针裸露在体液中被体液中的核酸酶降解,检测速度更快,耗时更短,检测结果更准确。本发明提供的仿病毒囊泡表面具有的融合基团可与外泌体主动融合,融合效率更高,检测效果更好。
(2)本发明优选实施例中,仿病毒囊泡中可包载多种不同的分子探针,可实现多种疾病特异核酸分子的同时检测,获取更丰富的诊断信息。
附图说明
图1为基因工程法制备仿病毒囊泡的示意图;
图2为仿病毒囊泡的透射电镜图;
图3为仿病毒囊泡水合粒径;
图4为仿病毒囊泡Zeta电位;
图5为纳米颗粒跟踪分析仿病毒囊泡的浓度;
图6为仿病毒囊泡在PBS和50%胎牛血清中粒径变化;
图7为免疫印迹实验考察仿病毒囊泡表面HN蛋白和F蛋白的表达;
图8为仿病毒囊泡与外泌体融合实验中外泌体的透射电镜图;
图9为仿病毒囊泡与外泌体融合实验中外泌体的水合粒径;
图10为仿病毒囊泡与外泌体融合实验中外泌体的Zeta电位;
图11为仿病毒囊泡与外泌体融合实验中免疫印迹实验考察外泌体表面CD63、CD9、CD81等标志物的表达;
图12为仿病毒囊泡与外泌体融合的透射电镜图一;
图13为仿病毒囊泡与外泌体融合的透射电镜图二;
图14为仿病毒囊泡与外泌体融合的透射电镜图三;
图15为动态光散射法考察仿病毒囊泡与外泌体融合过程中的粒径变化;
图16为动态光散射法考察对照囊泡与外泌体融合过程中的粒径变化;
图17为流式分析仿病毒囊泡与正常外泌体和肿瘤外泌体的融合产物;
图18为仿病毒囊泡与正常外泌体和肿瘤外泌体的融合产物的荧光强度;
图19为仿病毒囊泡与肿瘤患者血清的融合产物的散点图;
图20为仿病毒囊泡与正常血清的融合产物的散点图;
具体实施方式
自然界中病毒可以通过与细胞膜融合的方式感染细胞。病毒胞膜表面具有融合蛋白,可以引起病毒膜与细胞膜的融合。感染细胞时,病毒与细胞膜表面结合后,融合蛋白变构,暴露出活性位点并嵌入到细胞膜中,引起病毒膜与细胞膜的直接融合,从而将病毒的内容物释放入细胞质内。这种病毒包膜蛋白介导的融合过程发生在细胞膜表面,不需要酸性环境、特定的酶或离子的参与,具有简单、高效的优点。受病毒入侵细胞机制的启发,本发明提供一种仿病毒囊泡,通过仿病毒囊泡膜与外泌体膜融合的方法高效递送分子探针,进而检测外泌体内核酸分子。
一种仿病毒囊泡,仿病毒囊泡由双分子层膜和双分子层膜内部包裹的分子探针构成,其中双分子层膜的表面具有融合基团。
本发明提供的一种仿病毒囊泡,该仿病毒囊泡由双分子层膜和双分子层膜内部包裹的分子探针构成,其中双分子层膜的表面具有融合基团,融合基团与外泌体膜高效融合,从而将仿病毒囊泡内部的分子探针递送到外泌体内,进而检测外泌体内的核酸分子,实现外泌体内核酸分子的原位、准确、快速检测。可避免预先分离外泌体,并且避免分子探针裸露在体液中被体液中的核酸酶降解,检测速度更快,耗时更短,检测结果更准确。本发明提供的仿病毒囊泡表面具有的融合基团可与外泌体主动融合,融合效率更高,检测效果更好。
优选地,融合基团为正粘病毒的融合蛋白、副粘病毒的融合蛋白、腺病毒的融合蛋白、疱疹病毒的融合蛋白、嗜肝病毒的融合蛋白、乳头瘤病毒的融合蛋白、弹状病毒的融合蛋白、痘病毒的融合蛋白、具有引起膜融合功能的多肽、具有引起膜融合功能的核酸。
优选地,双分子层膜为细胞膜、细菌膜、病毒膜、两亲性分子制备的双分子层膜中的任意一种。
优选地,分子探针为核酸分子信标、纳耀斑中的一种。
优选地,双分子层膜的内部可同时包裹一种或多种分子探针,可实现多种疾病特异核酸分子的同时检测,获取更丰富的诊断信息。
本发明提供了一种仿病毒囊泡的制备方法,选自如下之一:
A、双分子层是天然生物膜,首先采用基因工程技术在双分子层表面修饰融合基团,然后研磨法破坏修饰后的双分子层的膜结构,离心获得膜碎片,将膜碎片与分子探针混合后,通过挤压得到仿病毒囊泡;或者
B、双分子层是天然生物膜,首先研磨法破坏双分子层膜的膜结构,离心获得膜碎片,将膜碎片与分子探针混合后,通过挤压得到囊泡,然后采用化学修饰在所述囊泡表面修饰融合基团,得到仿病毒囊泡;或者
C、双分子层是两亲性分子制备,将双分子层直接与分子探针混合,通过挤压得到囊泡,然后采用化学修饰在囊泡表面修饰融合基团,得到仿病毒囊泡。
优选地,天然生物膜为细胞膜、细菌膜、病毒膜中的任意一种。
优选地,挤压得到囊泡时可采用聚碳酸酯膜,聚碳酸酯膜的孔径为50nm~1.5um,因此仿病毒囊泡的粒径为50nm~1.5um,由此可实现仿病毒囊泡的大小均一,质量可控。
本发明还提供了一种仿病毒囊泡的用途,仿病毒囊泡制备检测外泌体内的核酸分子的产品的用途,检测结果可以用于疾病的早期诊断、疗效评估和预后分析。
优选地,核酸分子为mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA中的任意一种。
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书,本发明的优点和特征将更清楚。
一、以下将具体描述利用基因工程技术制备仿病毒囊泡以及性能表征
1、基因工程法制备具有融合基团的细胞
如图1所示,非洲绿猴肾细胞CV-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,37℃、5%CO2条件下培养至细胞汇合度达80%~90%。为避免仿病毒囊泡之间互相融合,使用含神经氨酸酶的培养液处理,除去细胞膜表面的唾液酸受体。构建表达人副流感病毒III胞膜蛋白血球凝集素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutininneuraminidase,HN蛋白)和融合蛋白(fusion protein,F蛋白)的质粒,采用转染试剂Lipofectamine 2000将上述质粒转染进入CV-1细胞,37℃、5%CO2条件下培养过夜,得到表达HN蛋白和F蛋白的CV-1细胞。
2、具有HN蛋白和F蛋白的CV-1细胞与分子探针融合制备仿病毒囊泡
收集表达HN蛋白和F蛋白的CV-1细胞,1000rpm离心5min收集细胞沉淀,加入pH7.4的含有20mmol/L Tris-HCl,10mmol/L KCl,2mmol/L MgCl2,和蛋白酶抑制剂的研磨缓冲溶液,采用杜恩斯匀浆器上下研磨30次。上述溶液3200g离心5min,收集上清液,沉淀加入研磨缓冲液后再次采用杜恩斯匀浆器上下研磨30次,3200g离心5min,合并上清液,20000g离心20min,收集上清液,100000g离心70min,收集底部沉淀即为细胞膜。上述细胞膜用杜恩斯匀浆器上下研磨30次重新混悬,与分子探针混合后,采用脂质体挤出器依次通过800nm、400nm、200nm的聚碳酸脂膜,每个孔径聚碳酸脂膜反复挤出,即得表面具有人副流感病毒III包膜蛋白HN蛋白和F蛋白的仿病毒囊泡。
3、仿病毒囊泡的表征
将仿病毒囊泡滴在封口膜上,铜网漂浮在液滴上吸附20min,醋酸双氧铀液染色10min,采用透射电镜检测大小及形态。结果如图2所示,仿病毒囊泡分散均匀,为茶托型或一侧凹陷的半球形,粒径大小约为180nm。
采用动态光散射测定仿病毒囊泡的粒径和Zeta电位。结果如图3和图4所示,仿病毒囊泡的水合粒径约为199nm,Zeta电位约为-19.4mV。
采用马尔文纳米颗粒跟踪分析仪可以测定仿病毒囊泡的浓度,结果如图5所示,仿病毒囊泡的浓度约为5.1×108个/mL。
将仿病毒囊泡分别分散于0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS)和50%胎牛血清中,采用动态光散射法测定仿病毒囊泡粒径的变化,考察其在PBS溶液及胎牛血清中的稳定性。结果如图6所示,在两种溶液中,仿病毒融合囊泡的粒径均维持稳定,未出现明显的变化,说明仿病毒囊泡在生理溶液中稳定性良好。
采用免疫印迹实验考察仿病毒囊泡表面HN蛋白和F蛋白的表达情况。结果如图7所示,在仿病毒囊泡上可以发现明显的HN蛋白和F蛋白的条带,说明经过一系列的挤出过程,HN蛋白和F蛋白依然存在于仿病毒融合囊泡上。
4、仿病毒囊泡与外泌体融合实验
如若使用仿病毒囊泡检测外泌体内的核酸分子,是不需要提前提取外泌体的,但在实验室条件有限,先提取出外泌体,然后再模拟人体内的外泌体环境。以此来证明仿病毒囊泡与外泌体的融合。
4.1、外泌体的提取分离与鉴定
采用人乳腺癌MCF-7细胞外泌体和人正常乳腺MCF-10A细胞作为研究对象。培养皿中的MCF-7或MCF-10A细胞生长至70%时,PBS清洗2次,用去除外泌体的培养基培养48h后,收集上清液,于4℃,2000g离心10min,去除培养液中的细胞及细胞碎片。上清液20000g离心30min,进一步去除培养液中的大粒径囊泡。上清液110000g离心70min,除去上清液,用PBS重悬底部沉淀,110000g离心70min。弃上清液,PBS重悬沉淀即得肿瘤或正常细胞外泌体。通过纳米颗粒跟踪分析仪测定外泌体浓度,配置外泌体标准溶液。
采用透射电镜检测外泌体的大小及形态。结果如图8所示,外泌体分散均匀,为茶托型或一侧凹陷的半球形,粒径大小约为80nm。
采用动态光散射测定外泌体的粒径和Zeta电位。结果如图9和10所示,外泌体的水合粒径为92.5nm,Zeta电位为-34.6mV。
采用免疫印迹实验考察外泌体表面CD63、CD9、CD81等标志物的表达。结果如图11所示,在外泌体上可以发现明显的CD63、CD9、CD81等标志物的条带,说明所得囊泡确实为外泌体。
4.2、透射电镜观察仿病毒融合囊泡与外泌体融合效果
仿病毒囊泡和外泌体按适当比例室温共同孵育,通过透射电镜观察融合效果。结果如图12、图13、图14所示,在透射电镜图中可以观察到处于两种囊泡结合、囊泡部分融合和完全融合等不同融合状态的产物。
4.3、动态光散射法考察仿病毒融合囊泡与外泌体融合效果
仿病毒囊泡和外泌体按适当比例室温共同孵育,通过动态光散射法测定融合产物的粒径。不具备融合功能的普通囊泡和外泌体按适当比例室温共同孵育,作为对照组。结果如图15所示,仿病毒囊泡和外泌体孵育后,产物的粒径由190nm逐步增加到361.5nm。如图16所示,而普通囊泡和外泌体孵育后,粒径基本没有发生变化。上述结果说明病毒融合蛋白可以引起囊泡和外泌体的有效融合。
5、仿病毒囊泡原位检测外泌体内核酸分子
采用miRNA-21为检测目标,仿病毒囊泡内包载可检测miRNA-21的分子信标。仿病毒囊泡分别与正常外泌体和肿瘤外泌体按适当比例室温共同孵育,融合产物通过流式细胞仪测定荧光强度。结果如图17和图18所示,仿病毒囊泡的荧光信号较弱,肿瘤外泌体的融合产物的荧光强度明显高于正常外泌体组,定量结果显示肿瘤外泌体的融合产物的荧光强度是正常外泌体组的7.4倍。上述结果可以解释为肿瘤外泌体内miRNA-21含量显著高于正常外泌体。
6、仿病毒囊泡检测临床样本外泌体内的核酸分子
为进一步考察仿病毒囊泡原位检测临床样本外泌体内核酸分子的效果,我们收集了乳腺癌病人和正常人的血液样品。经过初步的超滤和过滤除去多余的蛋白和大的胞外囊泡后,仿病毒囊泡加入到病人和志愿者的血浆中,共同孵育一定时间后,通过流式细胞仪测定荧光强度。结果如图19、20所示,正常组仅有一个群落存在于荧光较弱的区域,推测为正常来源外泌体,而肿瘤患者组,在荧光较弱的区域和荧光较强的区域各存在一个群落,推测分别为正常来源的外泌体和肿瘤来源的外泌体,定量结果显示肿瘤来源的外泌体的荧光强度是21782,而正常来源的外泌体的荧光强度为273。上述结果说明,仿病毒囊泡有望通过检测外泌体内核酸分子诊断肿瘤病人。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明作出各种变化,倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则仍落入在本发明的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种仿病毒囊泡,其特征在于,所述仿病毒囊泡由双分子层膜和所述双分子层膜内部包裹的分子探针构成,其中所述双分子层膜的表面具有融合基团。
2.根据权利要求1所述的仿病毒囊泡,其特征在于,所述融合基团为正粘病毒的融合蛋白、副粘病毒的融合蛋白、腺病毒的融合蛋白、疱疹病毒的融合蛋白、嗜肝病毒的融合蛋白、乳头瘤病毒的融合蛋白、弹状病毒的融合蛋白、痘病毒的融合蛋白、具有引起膜融合功能的多肽、或具有引起膜融合功能的核酸。
3.根据权利要求1所述的仿病毒囊泡,其特征在于,所述双分子层膜为细胞膜、细菌膜、病毒膜、两亲性分子制备的双分子层膜中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的仿病毒囊泡,其特征在于,所述分子探针为核酸分子信标、纳耀斑中的一种。
5.根据权利要求1所述的仿病毒囊泡,其特征在于,所述双分子层膜的内部可同时包裹一种或多种所述分子探针。
6.一种仿病毒囊泡的制备方法,其特征在于,选自如下之一:
A、双分子层是天然生物膜,首先采用基因工程技术在所述双分子层表面修饰融合基团,然后粉碎修饰后的双分子层,与分子探针混合,通过挤压得到所述仿病毒囊泡;或者
B、双分子层是天然生物膜,首先粉碎所述双分子层膜与分子探针混合,通过挤压得到囊泡,然后采用化学修饰在所述囊泡表面修饰融合基团,得到所述仿病毒囊泡;或者
C、双分子层是两亲性分子制备,将所述双分子层直接与分子探针混合,通过挤压得到囊泡,然后采用化学修饰在所述囊泡表面修饰融合基团,得到所述仿病毒囊泡。
7.根据权利要求6所述的仿病毒囊泡的制备方法,其特征在于,所述天然生物膜为细胞膜、细菌膜、病毒膜中的任意一种。
8.根据权利要求6所述的仿病毒囊泡的制备方法,其特征在于,所述仿病毒囊泡的粒径为50nm~1.5um。
9.一种仿病毒囊泡的用途,其特征在于,所述仿病毒囊泡制备检测外泌体内的核酸分子的产品的用途。
10.根据权利要求11所述的仿病毒囊泡的用途,其特征在于,所述核酸分子为mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA中的任意一种。
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