CN113832111A - 一种类外泌体技术用于制备新型溶瘤病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及溶瘤病毒的制备领域，具体涉及一种类外泌体技术用于制备新型溶瘤病毒的方法。本发明公开了一种利用类外泌体技术制备新型的具有靶向和逃避抗病毒中和抗体功能的溶瘤病毒的方法。具体来说，使用表达特定膜蛋白、如VSV‑G的细胞，病毒感染该细胞并复制之后，利用类外泌体逐级挤压技术，制造由类外泌体包裹的溶瘤病毒，类外泌体的外表面在制备过程中保留了细胞表面的膜蛋白、如VSV‑G。通过该方法制备的新型病毒，可以通过膜蛋白、如VSV‑G实现重靶向，感染表面有对应蛋白、能与膜蛋白结合的细胞系，增加病毒的基因转导效率，而且由于类外泌体膜的存在能逃避抗病毒抗体的中和作用，同时该制备方法还能提高病毒产量。

Description

一种类外泌体技术用于制备新型溶瘤病毒的方法
技术领域
本发明涉及溶瘤病毒制备领域，尤其是利用类外泌体技术制备新型溶瘤病毒领域，具体涉及一种类外泌体技术用于制备新型溶瘤病毒的方法。
背景技术
众多研究证明溶瘤病毒能够打破肿瘤免疫耐受诱导抗肿瘤免疫，使“冷”肿瘤变“热”肿瘤1；同时溶瘤病毒特别是腺病毒还能作为一种基因治疗载体2-5，在肿瘤局部表达目的基因产物。研究证明，OV-Ad5肿瘤局部表达soluble PD-1，anti-PD-1或anti-PD-L1抑制PD-1/PD-L1通路诱导抗肿瘤免疫，显著抑制肿瘤生长延长小鼠生存期，降低PD-1/PD-L1通路阻断治疗的副作用6,7。这种使用溶瘤腺病毒在肿瘤局部表达PD-1/PD-L1抑制剂的治疗策略具有巨大的临床应用前景。
虽然溶瘤腺病毒在肿瘤局部表达PD-1/PD-L1抑制剂的策略有巨大的优势，然而腺病毒的native tropism限制了溶瘤腺病毒的应用8-12。Ad5通过病毒的fiber knob与靶细胞膜上的CAR(the coxsackie and adenovirus receptor)结合进入细胞13,14。大量研究表明，Ad5对细胞表面低表达CAR的肿瘤感染效率差，这也限制了溶瘤腺病毒Ad5介导的肿瘤基因治疗的临床疗效15-17，又由于大部分肿瘤细胞低表达CAR18,19，因此开发增强腺病毒对CAR低表达肿瘤细胞感染效率的方法至关重要。除此之外，人体中广泛存在的腺病毒中和抗体也是限制腺病毒疗法临床疗效的重要因素20-22。
除了腺病毒以外，其他病毒在作为治疗实体的过程也遇到了对目标细胞靶向性低、感染效率低下的问题；同时，和腺病毒类似，其他病毒在使用中也遇到所诱导产生的中和抗体来中和这些病毒的问题，从而也使得这些病毒的治疗效果大打折扣。另外，病毒制备普遍存在成本高的问题。那么有没有什么好的办法来解决这些问题呢？
现已有一些方法用于提高Ad5对CAR低表达细胞的感染效率。第一种方法是使用共价键修饰Ad5的衣壳，主要方式是通过在Ad5衣壳上附加人造的polymers，这些polymer包括polyethylene glycol(PEG)23,24,polyactic glycolic acid (PLGA)25,Polyethyleneimine(PEI)26或lipids 27,28。第二种方法是通过对Ad5的基因改造实现腺病毒的重靶向，如：在Ad5 fiber knob domain的HI loop区插入 Arg-Gly-Asp(RGD)多肽的Ad5-RGD 29；Ad5和Ad35的fiber嵌合型Ad5/3530。这些方式确实能在一定程度上增加病毒感染的效率，但操作上相对繁琐。
近年来一种人造exosome-mimetic nanovesicles药物装载技术(我们称为类外泌体技术)用来替代天然收集外泌体技术。这种exosome-mimetic技术能克服天然外泌体产量低的问题，可以使用不种细胞类型制造出具有不同靶向性的 exosome-mimetic31-33。但是exosome-mimetic技术目前仅仅用于包裹药物实现靶向投送33-35，目前为止使用其包裹病毒还未见有报道。而且，大家普遍认为该技术不太可能用于包裹病毒这么大的治疗实体。
因此，本发明希望通过我们的研究实现突破，用类外泌体技术包裹病毒制备出新型的类外泌体病毒，而且包裹病毒的类外泌体外膜上还引入了我们期望引入、带来靶向性的蛋白、如VSV-G蛋白，这些类外泌体外膜上的靶向性的蛋白、如VSV-G蛋白能够实现病毒的重靶向，感染裸病毒本身不能感染或者低感染的细胞。不仅如此，制备出的新型类外泌体病毒还能够逃避抗病毒中和抗体。那么本发明的技术制备出的新型类外泌体病毒在体内外是不是能展示出出乎我们预料的作用呢？
发明内容
本发明中，我们展示使用一种exosome-mimetic技术(类外泌体技术)来包裹溶瘤病毒，从而制备出类外泌体病毒。具体来说，使用表达特定蛋白(比如 Vesicularstomatitis Indiana virus G protein(VSV-G))的动物细胞(如293T细胞)，利用exosome-mimetic技术(类外泌体技术)，制造出exosome-mimetic (类外泌体)包裹的病毒，比如新型类外泌体腺病毒EM/VSV-G Ad5。我们把利用类外泌体技术制备的病毒称为类外泌体病毒。
本发明所公开的制备新型类外泌体病毒的方法其关键性的技术特征为：感染了病毒的细胞通过挤压的方式依次通过孔径由大到小的滤膜。这个挤压的步骤能够使得病毒表面包裹上一层类似于外泌体或者胞外囊泡的膜。只要滤膜的孔径大小选择的合适，所有的感染了病毒之后的细胞都能提供这种挤压的方式制备获得类外泌体病毒。
也正是因为经过挤压之后病毒表面包裹上一层类似于外泌体或者胞外囊泡的膜，这样的膜是来自于细胞的，因此如果原先细胞的膜上有胞外膜蛋白，经过挤压步骤之后的类外泌体的膜上也能镶嵌有这样的胞外膜蛋白。这样一来我们就可以选择最终出现在类外泌体的膜上的蛋白：让细胞在感染病毒之前就已经可以表达所需要的胞外膜蛋白。
本发明后面的实施例虽然只展示了几种新型类外泌体病毒，但是过程简单、原理明了，因此能够由实施例展示的结果来支持我们在权利要求部分的权利要求。
用类外泌体技术包裹病毒制备新型的类外泌体病毒具有显而易见的益处：
1、类外泌体技术包裹病毒过程中，这些包裹病毒的类外泌体外膜上会引入我们期望引入、可以带来靶向性的蛋白(如VSV-G等蛋白)。这些类外泌体外膜上的靶向性的蛋白(如VSV-G等蛋白)能够实现病毒的重靶向。你的病毒希望用于某种疾病的治疗，而对应的实现该治疗需要感染特定的细胞C(不感染或者低感染不相关的其他细胞)，那么你就可以利用需要感染的特定细胞膜上特有的、或者相对高表达的蛋白(如X蛋白)。在制备类外泌体病毒的第一步，在待挤压的细胞C膜表面表达与X具有高亲和力的蛋白Y，那么经过类外泌体技术制备的病毒外表面就有Y蛋白，这个蛋白就可以帮助该病毒感染X蛋白所在的细胞C，从而实现高靶向性，提高治疗的效果、降低副作用。
2、制备出的新型类外泌体病毒还能够逃避抗病毒中和抗体。病毒在使用之后，正常情况下体内会产生抗体，其中极有可能有中和抗体(能够阻止病毒再次感染的抗体)产生。尤其是，有些病毒在该病毒治疗之前有可能我们就接触过或者感染过，已经产生了中和抗体。无论哪种情况，中和抗体的产生似乎是不可避免的。那么，问题就来了，要想有好的治疗效果，那么就要有较长的治疗窗口期。而用类外泌体技术制备类外泌体病毒，由于有类外泌体膜的存在，改变了中和抗体可能的作用机会，延长了治疗的窗口期，从而能显著提升治疗效果。
3、类外泌体技术制备类外泌体病毒的简单，类外泌体技术制备类外泌体病毒的产率与传统方法相比提高了数倍，相应的制备成本也得到了显著的降低。
附图说明
图 1.CAR的表达与Ad5-GFP感染效率的关系。构建了表达GFP的非复制型腺病毒Ad5-GFP，用Ad5-GFP感染293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、 B16-F10、CT26.WT、H22、K562和Jurkat细胞72小时后，细胞用于荧光显微镜观察分析或者流式分析。a.相同数量的293T、A549、HCC-LM3、 Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT、H22、K562和Jurkat细胞使用单克隆抗体anti-CAR-PE染色后用于流式分析各个细胞株CAR的表达水平；isotype为使用同源的IgG-PE抗体处理细胞，作为对照。b.腺病毒Ad5-GFP的基因组结构示意图。c.Ad5-GFP病毒感染293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、 CT26.WT细胞72h后典型的荧光照片，柱状图为流式统计GFP阳性细胞比率，以293T感染效率为100％分别计算Ad5在其他各组细胞株中的感染效率。d. Ad5-GFP病毒感染悬浮细胞H22/K562/Jurkat后流式分析典型散点图，柱状图为流式结果统计图。数据呈现为mean±SD.***P＜0.001.
图2.带有VSV-G的exosome-mimetic Ad5(EM/VSV-G Ad5)的制备。a. EM/VSV-GAd5病毒制备示意图。b.Ad5-GFP和EM/VSV-G Ad5-GFP病毒的透射电镜照片。图中箭头所指为膜表面膜蛋白突起。c.Western blot分析经过密度梯度离心纯化收集的Ad5-GFP和EM/VSV-G Ad5-GFP病毒中的 VSV-G含量。d.病毒滴度测定方法分析不同密度梯度对EM/VSV-GAd5-GFP 和Ad5-GFP病毒的收集情况。左侧为EM/VSV-G Ad5-GFP经过密度梯度离心后病毒分布照片，右侧柱状图为Ad5-GFP和EM/VSV-G Ad5-GFP不同密度梯度中病毒所占比例。e.Ad5感染293T-VSV-G细胞，72小时后均分细胞，分别使用Exosome-mimetic(new)和传统冻融裂解法(Traditional)回收病毒，测定病毒滴度计算回收病毒量，以冻融裂解法的病毒量为1计算 Exosome-mimetic回收病毒量增加倍数。f.使用不同稀释度的Ad5中和抗体分别处理Ad5和EM/VSV-G Ad5-GFP，然后分别感染293T细胞，48小时后荧光显微镜分析感染复制情况。左图为3次独立实验中的代表性荧光照片，右图为流式分析病毒感染复制之后GFP阳性细胞比率变化统计图。g.使用不同稀释度的VSV-G中和血清分别处理Ad5-GFP和EM/VSV-GAd5-GFP，然后分别感染293T细胞，48小时后荧光显微镜分析感染复制情况。左图为3次独立实验中代表性荧光照片，右图表为流式分析病毒感染复制之后GFP阳性细胞比率变化统计图。数据为mean±SD，***p＜0.001。
图3.EM/VSV-G Ad5-GFP和Ad5-GFP病毒对CAR高表达和低表达细胞系的感染率。分别使用MOI＝1的Ad5-GFP和EM/VSV-G Ad5-GFP病毒感染293T、 Hepa1-6、B16/F10、CT26.WT和H22，使用MOI＝100的病毒感染Jurkat和K562, 72小时后使用荧光显微镜拍照分析，使用流式分析病毒感染效率。a.图片为3 次独立实验中代表性的荧光照片，柱状图为流式结果统计图。b.图片为3次独立实验中代表性的流式图，柱状图图为流式结果统计图。数据为mean±SD，#p ＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001.
图4.体外研究EM/VSV-G技术制备的溶瘤腺病毒EM/VSV-G Ad5-P的性质。 a.溶瘤腺病毒Ad5-P的结构示意图。EXO PD1胞外区，TM PD1跨膜区，ENDO PD1胞内区，6His 6个his标签序列。b.Ad5-P和EM/VSV-G Ad5-P在293T、 Hepa1-6、B16/F10、CT26.WT、H22细胞株中感染效率的统计。c.Ad5-P和 EM/VSV-G Ad5-P分别感染Hepa1-6、B16/F10、CT26.WT、H22,在12h，24h， 36h，48h，60h，72h收集被感染细胞，使用定量PCR，分析病毒copies变化，曲线为以12小时病毒copies为1，计算各时间点病毒copies变化，获得病毒扩增曲线。d.不同MOI值病毒分别感染不同细胞株，72小时后MTT检测细胞活力。e.MOI＝1的Ad5-P和EM/VSV-G Ad5-P分别感染不同细胞株,72h收集上清， ELISA检测soluble PD1的表达量。数据为mean±SD##p＞0.05，*p≤0.05，** p≤0.01，***p≤0.001.
图5.体内研究EM/VSV-G Ad5-P的抗肿瘤免疫治疗效应。8周龄C57BL6雄性小鼠，分成3组，每组7只，第0天腹腔内注射H22细胞5×106cells，治疗组在第3,9,15,21天每只小鼠分别腹腔注射病毒5×108pfu。对照组(saline组)注射等量的PBS缓冲液。所有小鼠在第11,15,18天抽腹水检测。监测小鼠生存直至小鼠死亡。在第80天对各组存活小鼠,腹腔内注射H22细胞5×106cells进行二次攻击，监测小鼠状态至140天。a.活体实验示意图。b.各组小鼠生存曲线。c. 二次攻击后小鼠生存曲线，
Figure BDA0002552787660000071
组为新的8周龄C57/BL雄性小鼠。**p＜0.01。
图6 EM/VSV-G技术对溶瘤腺病毒抗肿瘤免疫活化及抗肿瘤效果的作用。流式细胞术分析第11天腹水中CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和PD-L1阳性细胞占总细胞的比例。a.流式分析CD4+T细胞占总细胞的比例，CD4+T细胞标记为CD3-APC和CD4-FITC双阳细胞；b.流式分析CD8+T细胞占总细胞的比例，CD8+T细胞标记CD3-APC和CD8-PerCP-CyTM5.5双阳细胞；c.流式分析NK 细胞占总细胞的比例，NK细胞标记为CD3-APC阴性NK1.1-FITC阳性细胞。d.ELISA分析Day 11的腹水中IFN-γ的表达情况。e.流式分析PD-L1阳性细胞占总细胞的比例，PD-L1阳性细胞使用PD-L1-PE标记。f.Elispot分析Day 11 的腹水中表达IFN-γ淋巴细胞数量。图片为每组中3张代表Elispot结果照片，统计图为各组所有Elispot斑点统计。g.台盼蓝染色分析Day 11的腹水中细胞活率。H.ELISA分析Day 11,15和18的腹水中solublePD1的表达量。结果为 mean±SD,#p≥0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001.
图7.EM/VSV-G Ad5-P逃避中和抗体促进soluble PD1持续表达。a.Ad5-P和 EM/VSV-G Ad5-P处理组小鼠腹水中soluble PD1时间变化曲线。b.Ad5-P处理组各小鼠腹水中soluble PD1变化曲线。c。EM/VSV-G Ad5-P处理组各小鼠腹水中soluble PD1变化曲线。使用Ad5-P处理组和EM/VSV-G Ad5-P处理组各小鼠在Day 15的腹水分别处理Ad5-P和EM/VSV-G Ad5-P，处理之后的Ad5-P和 EM/VSV-G Ad5-P感染293T细胞，48小时后流式分析病毒感染效率。d.为Ad5-P 处理组腹水处理Ad5-P后，流式统计GFP阳性细胞比率。e.为Ad5-P处理组腹水处理EM/VSV-G Ad5-P后，流式统计GFP阳性细胞比率。f.为EM/VSV-G Ad5-P处理组腹水处理Ad5-P后，流式统计GFP阳性细胞比率。g.为EM/VSV-G Ad5-P处理组腹水处理EM/VSV-GAd5-P后，流式统计GFP阳性细胞比率。h. EM/VSV-G Ad5-P处理组各小鼠在Day 15的腹水，用腹水：DMEM＝1:4稀释，稀释之后的腹水分别处理VSV-Lenti-GFP慢病毒载体，处理之后的VSV-Lenti-GFP慢病毒载体感染293T细胞，48h后流式分析GFP阳性细胞的比率；图表为流式结果统计图。结果为mean±SD,#p＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01， ***p＜0.001.
具体实施方式
实施例部分所涉及到的所有实验材料和方法
1、细胞系和细胞培养方法
人肝细胞癌细胞系HCC-LM3和鼠肝细胞癌细胞系H22购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库并通过STR鉴定和支原体检测。鼠肝细胞癌细胞系Hepa1-6人胚胎肾细胞系293T，人T细胞白血病细胞系Jurkat，人慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺泡腺癌细胞系A549，小鼠黑色素瘤B16-F10，Lewis结肠癌细胞系CT26.WT来自美国ATCC公司。293T-VSV-G是工程化的表达VSV-G的 293T细胞系。Jurkat K562和H22使用含10％胎牛血清2mM谷氨酰胺,100 units/mL青霉素,和0.1mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养。HCC-LM3 Hepa1-6A549 B16-F10和293使用含10％胎牛血清2mM谷氨酰胺,100units/mL 青霉素,和0.1mg/mL链霉素的DMEM培养基培养。所有细胞培养都是在37℃含5％二氧化碳的恒温细胞培养箱中培养。
293T-VSV-G细胞系构建
表达VSV-G的真核表达质粒pCMV-VSV-G、表达REV的真核表达载体 pCMV-REV、表达gag-pol慢病毒骨架蛋白的真核质粒pCMV-gag-pol和表达慢病毒基因组携带有VSV-G基因的真核表达质粒pCMV-CAG-VSV-G-2A-puro共同转染293T细胞，72小时后收集上清，使用0.45微米的针头滤器过滤。使用病毒上清感染293T细胞，48小时后使用含有1微克每毫升的嘌呤霉素维持培养。 CAG-VSV-G-2A-PURO序列如SEQ ID NO:13所示。
2、重组腺病毒的构建
腺病毒载体Ad5和溶瘤腺病毒Ad5-P的构建使用ViraPowerTMAdenoviralExpression System和
Figure BDA0002552787660000091
pENTRTMVectors(all from Life Technologies, GrandIsland,NY)。病毒构建根据制造商说明。首先使用PCR技术扩增E1A， CMV,polyA，GFP,和PD-1胞外区(sPD1)，E1A PCR模板使用293T基因组， PD-1cDNA购自Sino Biological Inc.CMV、GFP和poly A PCR模板使用lenti-GFP 质粒。PD-1胞外区的DNA序列见SEQ ID NO:1，CMV启动子序列见SEQ ID NO:3，E1A的DNA序列见SEQ ID NO:5。通过PCR扩增连接技术获得 CMV-GFP-POLYA和CMV-GFP-CMV-sPD1-POLYA基因片段，使用TOPO隆技术将获得的基因片段克隆至穿所载体adenovirus shuttle plasmid pENTRTMVectors。将克隆后的穿梭质粒与腺病毒骨架pAd/PL-DEST重组获得重组腺病毒载体 pAd5-GFP和pAd5-P。重组病毒拯救：重组后的腺病毒载体pAd5和pAd5-P限制性内切酶PacI线性化并纯化。提前一天准备293T细胞接种6-well plate 50万 cells/well，使用Lipofectamine 2000将1ug线性化的腺病毒载体转染提前准备的 293T细胞。继续培养10-14天，2-3天更换一次含5％FBS的完全培养基，直至70-80％细胞出现细胞病变，收集细胞和上清3次反复冻融后，4000×g离心20min 收集上为病毒种子。Ad5和Ad5-P腺病毒扩增与纯化使用293T-VSV细胞，用MOI 是5的病毒感染细胞72小时，收集细胞后反复冻融4000×g离心20min去除细胞碎片，收集上清即为病毒悬液；病毒的纯化使用碘克沙醇密度梯度离心。病毒滴度测定，使用293T细胞接种96-Wells板，10000cells/well；将病毒10倍稀释； 100ul/Well，培养4天，使用荧光显微镜观察，有绿色荧光细胞孔定义为阳性，每个阳性孔计为0.1，将所所有阳性孔相加为S。病毒TCID50＝102 +(S/10-0.5)/ml, pfu/ml＝0.7×TCID50/ml。
3、exosome-mimetic腺病毒EM/VSV-G Ad5和EM/VSV-G Ad5-P的制作
exosome-mimetic腺病毒制作，使用293T-VSV-G细胞接种6个10cm2的培养皿(1×107cells/plate)，过夜培养后接种5×107pfu的Ad5-GFP或Ad5-P病毒，继续培养72h,收集细胞去除细胞培养上清，使用30ml DMEM重悬，将细胞悬液使用mini-extruder(avanti polarlipids)依次挤压通过10μm 5μm 1μm的polycarbonate membrane filter(whatman)，收集挤压后的病毒悬液，将病毒悬液加入带有15％ 20％和40％碘克沙醇(iodixanol)垫层的离心管中，100000×g离心90min，分别收集15％与20％位之间和20％与40％iodixanol之间的病带。使用5％甘油、1mM MgCl2、150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.6)的透析液透析2次,测定病毒滴度后分装保存至-80℃冰箱。
4、病毒感染效率检测
病毒感染效率检测首先使用1×105cells/well待检测细胞接种24-well板，按照指定病毒量加入相应的病毒，37℃5％CO2培养48小时，荧光显微镜观察拍照；收集细胞，流式统计GFP阳性细胞比率，以Ad5-GFP或Ad5-P病毒感染293T GFP 阳性细胞比率为1，计算其它细胞病毒的感染效率。
5、透射电子显微镜扫描
将EM/VSV-G Ad5-GFP和Ad5-GFP病毒悬液加到投射电子显微镜磁膜铜网(400mesh,Agar Scientific)在室温环境中晾干。1％磷钨酸染色，使用JEM-200CX 投射电子显微镜(JEOL,Japan)观察。
6、中和试验
腺病毒中和抗体由王世兵(浙江理工大学)馈赠腺病毒免疫兔血清。VSV-G 中和抗体来自经验证的志愿者血清。动物实验腹水样品处理分别使用400×g和 12000×g转速离心10min去除细胞和细胞碎片。中和试验用血清和腹水都使用 56℃灭活处理30min。293T接种24well-plate(1×105cells/well)，37℃培养4h 后，使用100ul含1×105pfu病毒的DMEM与指定稀释度中和血清或腹水37℃共孵育30min，将病毒抗体混合液加入提前接种293T细胞(1×105cells/well)的24孔板37℃培养1小时，去除病毒上清，加入完全培养基继续48h后观察荧光，流式统计GFP阳性细胞比率，以未使用抗体处理组的GFP阳性细胞比率为100％计算各处理组抗体中和比率。
7、MTT细胞活力分析
使用待检测细胞株接种于96-well plate每孔1万个细胞37℃培养4小时，按指定病毒量加入相应病毒，4小时后去除病毒悬液，更换完全培养基继续培养72小时。每孔100ulMTT稀释液(1mg/ml)，继续培养4小时。去除上清，加异丙醇150ul，震荡15min，使用570波长检测吸光度。以未处理细胞培养孔吸光度为细胞活力100％计算其它处理组细胞力。
8、Q-PCR检测virus的复制功能
使用MOI为5的病毒Ad5-P或EM/VSV-G Ad5-P接种Hepa1-6、B16/F10、 CT26.WT和H22细胞处理后分别在6h，24h，36h，48h，60h，72h收细胞，使用基因组提取试剂盒(天根生化)提取总DNA。使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix，以定量后的shuttle-Ad5-P质粒为标准品，以Q-E1A F和Q-EIA R为引物，定量PCR检测病毒各时间点基因组copies。各处理组分别以其6h病毒拷贝数为1,分别计算各时间的病毒拷贝增加倍数。
9、Western Blot检测上清中目的蛋白表达
密度梯度离心纯化后的Ad5-GFP和EM/VSV-G Ad5-GFP病毒悬液，使用 BCA测定蛋白浓度后取80ul加5×上样缓冲液(含β巯基乙醇)(Beyotime， Hangzhou)20ul。100℃处理5min，使用浓度12％SDS-PAGE电泳，电转至 polyvinylidene fluoride membranes(#03010040001；Roche)，使用含10％脱脂牛奶 TBS封闭液，封闭30min。一抗使用Anti-VSV-Gtag antibody(ab1874 abcam 1:2000)，二抗使用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠单克隆抗体(A00160 GenScript Biotech Corp.1:5000)，使用化学发光试剂(WBKLS0500；Millipore,Billerica,MA, USA)曝光，使用化学发光成像仪(ChampChemi 610；SageCreation Science, Beijing,China)，成像获取结果。
10、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)可溶性蛋白SPD1的定量检测
使用2μg/ml的Anti-His-tag单克隆抗体(购于南京金斯瑞生物科技有限公司，南京，中国)包被ELISA 96孔板。加100μl的细胞上清或腹水37℃孵育2 小时；使用含0.1％的吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗去未结合的可溶性蛋白，加检测抗体兔抗鼠PD-1单克隆抗体(购于北京义翘神州生物科技有限公司,北京,中国)37℃孵育1小时；PBS-T清洗5遍，加入100μl生物素标记的山羊抗兔IgG抗体和HRP标记得亲和素稀释液，室温孵育1小时。PBS-T清洗10 遍后加入底物TMB常温反应30分钟，加50μl终止液(2N硫酸)，使用酶标仪检测OD450。
干扰素伽马的检测：小鼠腹水和血清中干扰素伽马的检测使用BD公司的 mouseIFN-γELISA kit(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)，检测过程根据说明书介绍操作。
11、小鼠肿瘤模型
小鼠肝细胞癌腹水瘤模型，使用SPF级8周龄C57BL/6雄性小鼠(购于南京大学模式动物研究中心)。每只小鼠腹腔内注射5×106个H22细胞。分别在第 3,9,15和21天每只小鼠腹腔内注射5×108PFUs的病毒，对照组注射病毒等量的病毒溶质。在肿瘤注射后的第11、15和18天收集腹水进行检测。治愈小鼠在第80天是再次腹腔内注射5×106H22细胞，阴性对照组使用未处理小鼠。监测小鼠生存并记录。
11、流式细胞术分析腹水中免疫细胞亚群检测
按照实验方案抽取小鼠腹水，离心400×g 5分钟收集细胞，使用PBS洗两遍。按照细胞标志物组合在室温避光条件下孵育抗体30min。PBS洗两遍使用500μl PBS重悬，使用流式细胞仪检测分析。T细胞使用CD3-APC、CD4-FITC和 CD8-PerCP-CyTM5.5标记的CD3+CD4+或CD3+CD8+的两个T细胞亚群。NK细胞使用CD3-APC和NK1.1-FITC标记的CD3-NK1.1+的细胞。PD-L1阳性细胞使用 CD274 PE标记。CD3 APC,CD8a PerCP-CyTM5.5,CD4 FITC,NK1.1 FITCand CD274 PE(购于BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)。
肿瘤细胞表面CAR的表达检测
每种细胞系通过离心的方法收集100万细胞，使用PBS洗2遍。使用anti-CAR-PE 抗体室温孵育30min(避光)。使用PBS洗2遍，重悬于500μl的PBS中。使用流式细胞仪检测分析。
13、IFN-γ酶联斑点检测(IFN-γEILSpot assay)腹水中活化淋巴细胞检测
IFN-γEILSpot检测板的准备：按照Mouse IFN-γEILSpot PLUS kit(购于 3321-2AW-Plus；Mabtech,Nacka Strand,Sweden)说明书要求准备IFN-γEILSpot 检测板。按照实验方案指定时间点抽取小鼠腹水，通过离心的方法去出腹水收集腹水中细胞。使用PBS洗两遍后使用胎盘蓝染色后计数。准备1×106cells/ml的细胞悬液。按照每孔200μl体积把细胞悬液加入提前准备的IFN-γEILSpot检测板。放置于37℃5％二氧化碳的细胞培养箱中过夜培养20小时。去除细胞悬液，按照说明书要求处理并显色。使用ELISpot读板机进行检测分析。
实施例1腺病毒Ad5对CAR低表达的细胞感染效率低
CAR(the coxsackie and adenovirus receptor)是腺病毒Ad5感染细胞的主要受体。早期研究已证明腺病毒Ad5对CAR低表达的细胞感染效率低。13,19我们通过流式分析发现293T、A549、HCC-LM3和Hepa1-6细胞使用anti-CAR-PE染色后，与isotype处理组相比荧光强度显著增加，说明293T、A549、HCC-LM3和Hepa1-6 细胞表面CAR高表达(图1a)；而B16-F10、CT26.WT和H22细胞表面使用CAR 抗体染色后，与isotype处理组相比荧光强度无明显变化；说明这些细胞株不表达 CAR；而K562和Jurkat细胞使用CAR抗体染色后，与isotype处理组相比荧光强度仅少量增加，远低于293T等细胞株，说明这些细胞株低表达CAR(图1a)。接下来，为了验证CAR的表达与Ad5感染效率之间的关系，我们构建了表达GFP的非复制型腺病毒Ad5-GFP，(图1b)，使用MOI为1的Ad5-GFP处理293T、A549、 HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT和H22细胞，72h后发现，CAR高表达的293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6细胞有50％-60％的细胞被Ad5-GFP感染并表达GFP，这几株细胞之间Ad5-GFP的感染效率无显著差异；然而CAR低表达的贴壁细胞B16-F10、CT26.WT、H22被Ad5-GFP感染的效率低于5％，极显著的低于293T等CAR高表达细胞株(P＜0.001)(图1c，d)。悬浮细胞株K562和Jurkat 在使用MOI为100的Ad5-GFP病毒感染72h，K562和Jurkat分别只有8.26％±0.64％和12.08％±0.81％的细胞被感染，极显著的低于MOI为1的Ad5-GFP病毒对293T的感染效率(52.3％±2.61％)(P＜0.001)(图1d)。以上结果证明，腺病毒Ad5对细胞的感染效率与细胞表面表达CAR的量相关，腺病毒Ad5对CAR高表达的细胞感染效率高，腺病毒Ad5对CAR低表达的细胞感染效率低。
实施例2带有VSV-G的Exosome-mimetic Ad5(EM/VSV-G Ad5)的制备
Vesicular stomatitis Indiana virus G protein(VSV-G)能够介导病毒进入迄今为止所测试的所有细胞类型，被广泛用于基因转导和基因治疗26。本研究希望借助Exosome-mimetic技术，利用VSV-G对细胞的广嗜性，实现Ad5的重靶向，增加Ad5对CAR低表达细胞系的感染效率。
首先我们构建了表达VSV-G的293T细胞(293T-VSV-G)，使用MOI为5的 Ad5-GFP感染293T-VSV-G细胞，37℃培养72h后收集细胞，收集的细胞分成两部分，一部分使用传统方案冻融3次后，碘克沙醇密度梯度离心纯化病毒；另一部份制作带有VSV-G的Exosome-mimetic Ad5-GFP(EM/VSV-G Ad5-GFP)，通过反复挤压依次通过孔径10μm、5μm、1μmpolycarbonate膜，使用15％， 20％，40％碘克沙醇密度梯度离心，EM/VSV-G Ad5-GFP位于20％-40％密度梯度之间(图2a)。后面的实施例中所有EM/VSV-G病毒都是使用本实施例的方法制备的。
我们使用透射电镜对裸露的Ad5-GFP和EM/VSV-G Ad5-GFP进行表征分析。裸露病毒大小70-90nm；而EM/VSV-G Ad5-GFP病毒颗粒的直径在100-200 nm之间，大小与细胞外囊泡类似，膜表面膜蛋白突起清晰可见(图2b)。为了进一步确认所制备的EM/VSV-G Ad5-GFP上有VSV-G膜蛋白，我们使用western blot方法检测EM/VSV-G Ad5上的VSV-G蛋白，westernblot的结果显示在 EM/VSV-G Ad5-GFP蛋白提取液中含有VSV-G蛋白，而对照Ad5-GFP病毒(裸露的AD5-GFP病毒)的蛋白提取液中未检测到VSV-G蛋白(图2C)。这说明 EM/VSV-G Ad5病毒颗粒上存在VSV-G膜蛋白但不能完全说明VSV-G就在 EM/VSV-G Ad5-GFP病毒的表面。我们又对不同密度梯度的EM/VSV-G Ad5-GFP和Ad5-GFP病毒的收集情况进行分析，密度梯度20％-40％收集的 EM/VSV-G Ad5-GFP病毒量占EM/VSV-G Ad5-GFP总病毒量的96±1.32％，密度梯度20％-40％收集的Ad5-GFP病毒量占Ad5-GFP总病毒量的97.3±1.92％，由此可见EM/VSV-G Ad5-GFP与Ad5-GFP病毒主要集中密度梯度20％-40％之间，两种病毒密度无显著差异(P＝0.43)(图2d)。为了进一步研究Exosome-mimetic方法对病毒回收产量的影响，我们检测了Exosome-mimetic方法的病毒回收产量以及传统冻融方案的病毒回收产量，发现与传统冻融方案比， Exosome-mimetic方法能够将病毒产量提高6.4±0.68倍(P＝0.0002)(图2e)。以上结果表明，Exosome-mimetic技术可以装载腺病毒，该技术制备的EM/VSV-G Ad5-GFP其外层包裹有一层类外泌体膜，EM/VSV-G Ad5-GFP上存在VSV-G 蛋白，EM/VSV-G Ad5-GFP与AD5-GFP的密度类似；并且使用该技术制备病毒，病毒的回收产量显著增多。
实施例3 EM/VSV-G Ad5-GFP可以抵制anti-Ad5中和抗体的作用并且所带的 VSV-G介导其进入细胞
为进一步证明EM/VSV-G Ad5-GFP是被包裹在囊泡中，并且这样的包裹带来新的属性，我们分别使用anti-Ad5中和抗体和VSV-G中和血清对 EM/VSV-G Ad5-GFP进行处理并做后续分析。使用1/32、1/64和1/128稀释倍数的anti-Ad5中和抗体分别处理EM/VSV-G Ad5-GFP和Ad5-GFP病毒后，Ad5-GFP病毒的感染效率仅为PBS处理对照组的5.66±2.1％、9.3±2.02％和12.6±3.84％，而EM/VSV-G Ad5-GFP的感染效率分别为61.0±3.10％、 71.3±3.7％和81.6±1.2％(图2f)；由此可见anti-Ad5中和抗体处理之后 Ad5-GFP病毒几乎丧失了感染能力，而EM/VSV-G Ad5-GFP由于类外泌体外膜的包裹以及VSV-G的存在，其感染能力能够被极显著的拯救。使用 1/4、1/8和1/16稀释倍数的VSV-G中和血清分别处理两种病毒后，Ad5的感染效率为PBS对照组的97.66±4.97％、97.33±1.76％和97±3.78％，而 EM/VSV-G Ad5-GFP的感染效率分别为24.66±2.6％、26.33±2.6％和 67.33±5.45％(图2g)；由此可见通过VSV-G介导了EM/VSV-G Ad5病毒进入被感染细胞。以上结果表明EM/VSV-GAd5-GFP可以抵制anti-Ad5中和抗体的作用并且所带的VSV-G能够帮助其获得对裸病毒不能感染或者低感染细胞的感染能力。
实施例4 EM/VSV-G Ad5-GFP对CAR低表达的细胞系具有高感染效率
前面的研究已经发现腺病毒Ad5对CAR低表达的细胞感染效率低，这里我们想通过实验观察，EM/VSV-G Ad5-GFP病毒是否与Ad5-GFP病毒不同，对 CAR低表达的细胞系具有高感染效率。这里我们检测了EM/VSV-G Ad5-GFP和 Ad5-GFP病毒对CAR低表达细胞的感染效率。令人惊奇的是，与Ad5-GFP相比，在CAR低表达的细胞株B16/F10，CT26.WT，H22，K562和Jurkat中， EM/VSV-G Ad5-GFP的感染效率得到了极其显著的增加，分别增加到8.00±0.54倍、2.83±0.04倍、14.99±1.09倍、11.35±0.37倍和6.25±0.58倍(图3a,b)。除了检测了EM/VSV-G Ad5-GFP和Ad5-GFP病毒对CAR低表达细胞的感染效率，我们也检测了EM/VSV-GAd5-GFP和Ad-GFP病毒对CAR高表达细胞的感染效率，结果显示在CAR高表达细胞株293T、A549(数据未出示)和LM3-HCC (数据未出示)上，感染效率无显著性差异；但是令人惊奇的是，与Ad5-GFP 病毒相比，EM/VSV-G Ad5-GFP对Hepa1-6细胞的感染效率极显著性的增加到了1.253±0.028倍(图3a)。以上结果表明，EM/VSV-G技术完全改变了Ad5-GFP 病毒对CAR低表达细胞系低感染的属性，EM/VSV-G技术制备得到的 EM/VSV-G Ad5-GFP病毒对CAR低表达的细胞系具有极高的感染效率，而且 EM/VSV-G技术也能够提高AD5-GFP对个别CAR高表达细胞系的感染效率，这也一定程度上扩展了EM/VSV-G技术可能的应用范围。。
实施例5 EM/VSV-G技术制备的EM/VSV-G Ad5-P在体外具有更高的感染效率、表达分泌soluble PD1的能力和溶瘤能力
溶瘤腺病毒Ad5-P是一个表达soluble PD1的溶瘤腺病毒Ad5(命名为 Ad5-P)，溶瘤腺病毒Ad5-P的基因组结构示意图如图4a所示。溶瘤腺病毒Ad5-P 对CAR低表达肿瘤类型的低感染率严重限制了Ad5-P的转化应用。在已经确认 EM/VSV-G技术可以完全改变Ad5病毒对CAR低表达细胞系低感染性的基础上，我们将EM/VSV-G技术应用到溶瘤腺病毒Ad5-P上，期望通过EM/VSV-G 技术显著增加其对CAR低表达肿瘤细胞系的感染效率，提升溶瘤腺病毒Ad5-P 的治疗效应和扩展其应用范围。溶瘤腺病毒Ad5-P经过EM/VSV-G技术制备所获得的病毒我们命名为EM/VSV-G Ad5-P。
与Ad5-P病毒相比，EM/VSV-G Ad5-P对CAR低表达肿瘤细胞系的感染效率极显著的提高(图4b)，在B16/F10、CT26.WT和H22细胞株上分别提高到了8.7±0.62、2.948±0.039和14.596±1.56。
我们又在不同细胞株中对比了EM/VSV-G Ad5-P和Ad5-P的复制效率，发现EM/VSV-G Ad5-P和Ad5-P在CAR高表达细胞株Hepa1-6和CAR低表达细胞株B16/F10、CT26.WT和H22复制效率无显著差异(图4c)。结果说明 EM/VSV-G技术只增加病毒感染效率并不影响病毒复制。
接下来我们又分析了不同病毒滴度的EM/VSV-G Ad5-P和Ad5-P在 Hepa1-6、B16/F10、CT26.WT和H22细胞中的溶瘤作用。在CAR高表达细胞株Hepa1-6中病毒的溶瘤作用无显著差异，也许是因为两种病毒感染和复制效率无明显差异；在B16/F10、CT26.WT和H22细胞株，在高病毒量时EM/VSV-G Ad5-P的溶瘤效应显著增加(图4d)，也许是由于EM/VSV-G Ad5-P感染效率显著高于Ad5-P，虽然病毒复制效率无增加但进入细胞病毒量会显著增加。
接下来我们用相同病毒滴度的EM/VSV-G Ad5-P和Ad5-P感染细胞，然后检测病毒感染的细胞上清中分泌的可溶性PD1的含量，结果表明，与Ad5-P相比，B16/F10、CT26.WT和H22细胞的培养基上清中soluble PD1表达，在 EM/VSV-G Ad5-P感染之后，呈现极显著的提高(图4e)。
总的来说，利用EM/VSV-G技术制备的EM/VSV-G Ad5-P能够提高溶瘤腺病毒Ad5-P在低CAR表达细胞株中感染效率，增加溶瘤作用和soluble PD1的表达量，这些体外研究结果提示我们EM/VSV-G技术也许能够提高溶瘤腺病毒 Ad5-P在体内的抗肿瘤作用。
实施例6 EM/VSV-G Ad5-P诱导更强的抗肿瘤作用和免疫记忆，极显著的延长小鼠生存期。
我们使用H22细胞系建立了小鼠腹水瘤模型研究EM/VSV-G Ad5-P在活体内的抗肿瘤作用。实验方案如图图5a所示。动物结果发现EM/VSV-G Ad5-P处理组和Ad5-P处理组与saline对照组相比，小鼠生存期显著延长，EM/VSV-G Ad5-P与Ad5-P组各有5只和2只小鼠被治愈，分别占71.4％和28.5％(图5b)； EM/VSV-G Ad5-P处理组与Ad5-P处理组相比，小鼠生存期也极显著延长(图5b)。并且在对治愈小鼠进行2次攻击，Naive组小鼠在第26天全部死亡； EM/VSV-G Ad5-P与Ad5-P组治愈小鼠观察60天无肿瘤生长(图5c)。这些结果表明，溶瘤病毒Ad5-P经过EM/VSV-G技术处理之后得到的EM/VSV-G Ad5-P，抗肿瘤作用显著增强；二次攻击实验证明EM/VSV-G Ad5-P诱导的肿瘤清除具有免疫记忆。
为了探明EM/VSV-G Ad5-P抗肿瘤作用的增强机制，我们检测了H22腹水癌模型第11天腹水中的免疫状态。流式分析发现，与对照组(Saline组)相比， EM/VSV-G Ad5-P病毒处理组腹水中CD4+T、CD8+T和NK细胞都极显著升高(P＝0.009，P＝0.003，P＝0.0002)；不仅如此，与Ad5-P病毒处理组相比， EM/VSV-G Ad5-P处理组不能升高腹水中CD4+T细胞，能够极显著的升高 CD8+T和NK细胞(P＝0.012，P＝0.0042)(图6a,b,c)。IFN-γelispot方法对腹水中活化的淋巴细胞进行检测，发现EM/VSV-G Ad5-P组腹水中IFN-γ阳性细胞显著的高于Ad5-P组(P＝0.0128)、极显著的高于saline组(P＝0.0007)(图6f)，而Ad5-P组与saline组相比并无显著性差异。ELISA方法检测腹水中IFN-γ浓度， EM/VSV-G Ad5-P组腹水中IFN-γ浓度极显著的高于Ad5-P组(P＝0.004)和saline 组(P＝0.0016)(图6d)，而Ad5-P组与saline组相比并无显著性差异。以上结果表明EM/VSV-G Ad5-P比Ad5-P能够诱导更强的抗肿瘤免疫。
EM/VSV-G Ad5-P比Ad5-P能够诱导更强免疫反应，意味着可能会诱导更强的免疫负调控反应，因此我们又检测了腹水中免疫抑制分子PD-L1阳性细胞。结果表明，EM/VSV-GAd5-P组腹水中PD-L1阳性细胞显著的高于Ad5-P组 (P＝0.036)、极显著的高于saline组(P＝0.0023)(图6e)。由此可见，EM/VSV-G Ad5-P比Ad5-P能够诱导更强的免疫反应，使得更多的肿瘤细胞表达PD-L1，因此只有阻断PD-1/PD-L1通路才能确保EM/VSV-G Ad5-P抗肿瘤作用。
溶瘤病毒所诱导的抗肿瘤免疫反应与其诱导的肿瘤细胞死亡相关6，在体外研究中我们发现EM/VSV-G Ad5-P增强病毒对H22感染效率后显著增强病毒溶瘤作用，为研究EM/VSV-G Ad5-P在体内是否具有相同的作用。我们使用台盼蓝染色法对第11天腹水中细胞活率分析，发现EM/VSV-G Ad5-P组腹水中活细胞比率为65.9±5.36％极显著的低于Ad5-P组的74.45±3.38％(P＝0.0032)和saline 组的90.15±5.71％(P＜0.001)(图6g)。ELISA检测第11、15、18天腹水中 soluble PD1的表达量，发现EM/VSV-G Ad5-P组soluble PD1的表达量都显著高于Ad5-P组；而Ad5-P组中部分小鼠在Day15/18腹水中soluble PD1的量低于检测线。以上结果表明EM/VSV-G Ad5-P抗肿瘤作用的增强可能与EM/VSV-G Ad5-P溶瘤作用的增强诱导大量肿瘤细胞的ICD，刺激小鼠免疫系统产生更强的抗肿瘤免疫反应；与此同时EM/VSV-G Ad5-P感染效率的增加引起soluble PD1 表达量的增加，更多的soluble PD1能够被利用来阻断PD1/PD-L1免疫抑制通路从而抑制PD1/PD-L1免疫抑制通路引起T细胞衰竭，这种共同作用增加 EM/VSV-G Ad5-P的抗肿瘤作用。
实施例7 EM/VSV-G Ad5-P逃避抗Ad5的中和抗体，延长病毒治疗时间
溶瘤病毒能诱导机体产生抗病毒免疫，产生中和抗体，清除病毒。中和抗体不仅阻断了病毒在肿瘤组织中的播散而且还限制病毒的再次应用。在Ad5-P 治疗组中第18天soluble PD1的浓度为27.59±27.59pg/ml，第15天soluble PD1 的浓度为58.68±20.75pg/ml、显著低于第11天的130.2±7.77pg/ml(图7a)；虽然在第15天注射一次病毒，但是第18天仅有1只小鼠soluble PD1为110.36 pg/ml，剩余小鼠腹水中soluble PD1都低于检测线(图7b)。形成鲜明对比的是， EM/VSV-G Ad5-P组第11、15、18天soluble PD1的浓度分别为276.4±28.34pg/ml、 132±19.55pg/ml和166.4±26.66pg/ml，虽然第15(p＝0.0018)和18天(p＝0.023) soluble PD1较第11天有显著降低，但第18与15天相比有所上升、能够持续表达分泌(P＝0.641)(图7a)。独立分析EM/VSV-G Ad5-P组每只小鼠solublePD1 的时间变化曲线，第15天注射病毒后，EM/VSV-G Ad5-P组腹水中soluble PD1 表达量有1只小鼠明显升高,其余3只没有显著改变(图7c)。以上结果提示， Ad5-P组腹水中病毒可能诱导小鼠产生中和抗体，导致病毒不能再感染肿瘤细胞。
为了探明Ad5-P处理组腹水中是否有中和抗体产生，我们通过中和试验对第 15天腹水检测发现，Ad5-P处理组所有小鼠的腹水都能显著阻断Ad5-P病毒感染293T细胞(p＜0.001)，但对于EM/VSV-G Ad5-P感染293T细胞基本没有阻断作用(图7d)；结果说明Ad5-P组诱导产生了针对Ad5-P的中和抗体，所产生的中和抗体能够中和Ad5-P，但不能中和EM/VSV-G Ad5-P。我们又使用 EM/VSV-G Ad5-P组中4只小鼠的腹水做了中和试验，结果显示EM/VSV-G Ad5-P组中4只小鼠腹水都能阻断Ad5-P病毒感染293T细胞，但对EM/VSV-G Ad5-P感染293T细胞有一定的阻断效果、但是不显著(图7e)；结果说明 EM/VSV-G Ad5-P组也诱导产生了针对Ad5-P的中和抗体，所产生的中和抗体能够中和Ad5-P，但不能中和EM/VSV-G Ad5-P。
我们构建了VSV-lenti-GFP病毒，使用EM/VSV-G Ad5-P组中4只小鼠的腹水来中和VSV-lenti-GFP病毒，然后观察VSV-lenti-GFP病毒的感染能力，结果显示NO 4和5小鼠腹水能显著阻断VSV-lenti-GFP感染，但是与前面阻断Ad5-P 相比阻断作用要弱太多；NO2和7小鼠腹水对VSV-lenti-GFP病毒感染具有阻断作用、但不显著(图7f)。以上结果表明EM/VSV-GAd5-P能诱导产生Ad5-P 的中和抗体，仅诱导产生少量VSV-G中和抗体产生。其原因可能是EM/VSV-G Ad5-P感染细胞后，能够在细胞中复制扩增，病毒作为异源抗原诱导小鼠产生中和抗体，而VSV-G蛋白虽然是异源蛋白，但仅存在类外泌体上随病毒注射有少量进入小鼠体内，低蛋白量导致诱导小鼠产生抗VSV-G中和抗体的能力较弱，所以EM/VSV-G Ad5-P腹水中VSV-G中和抗体较低。
综上所述，Ad5-P治疗之后，产生大量的抗Ad5-P的中和抗体，从而阻断 Ad5-P的感染、影响了Ad5-P的治疗效果；而EM/VSV-G Ad5-P治疗之后，虽然能产生大量的抗Ad5-P的中和抗体，但由于EM/VSV-G Ad5-P包裹在类外泌体当中、这些中和抗体不能有效的阻断EM/VSV-G Ad5-P的感染，因此，治疗效果与Ad5-P相比得到显著提升。虽然EM/VSV-G Ad5-P带有异源蛋白 VSV-G，但是由于VSV-G量比较少，所以诱导小鼠产生的抗VSV-G中和抗体也少，所以对EM/VSV-G Ad5-P的影响较小、EM/VSV-G Ad5-P呈现出比Ad5-P 显著增强的治疗效果。
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gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 3600
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 3660
ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 3720
ggaaagaacc agctgccac 3739
<210> 9
<211> 1687
<212> DNA
<213> 人工序列(.)
<400> 9
ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 60
ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 120
ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 180
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 240
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 300
cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 360
ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 420
aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 480
taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 540
ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgactct agaggatccg 600
ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 660
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 720
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 780
ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 840
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 900
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 960
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1020
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 1080
agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1140
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 1200
accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 1260
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 1320
agtaatggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc agatatccag 1380
cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg 1440
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 1500
aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 1560
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 1620
aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 1680
ccagctg 1687
<210> 10
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列(.)
<400> 10
atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60
gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120
ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180
atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240
gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc 300
ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360
ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420
gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480
gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540
acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600
gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660
ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720
aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780
tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840
acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900
caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960
cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020
tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080
ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140
gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200
tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260
ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320
tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380
tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440
gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500
tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtaa 1536
<210> 11
<211> 934
<212> DNA
<213> 人工序列(.)
<400> 11
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240
taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 300
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 360
gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 420
gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 480
gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg 540
ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 600
gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 660
gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 720
ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 780
ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 840
cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 900
ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aatt 934
<210> 12
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(.)
<400> 12
atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60
cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120
cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180
atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gcggccgtgg cggtctggac cacgccggag 240
agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300
tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360
cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420
agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480
gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540
gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600
<210> 13
<211> 3136
<212> DNA
<213> 人工序列(.)
<400> 13
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240
taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 300
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 360
gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 420
gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 480
gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg 540
ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 600
gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 660
gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 720
ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 780
ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 840
cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 900
ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattgccacc atgaagtgcc ttttgtactt 960
agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata gtttttccac acaaccaaaa 1020
aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc ccgtcaagct cagatttaaa 1080
ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa atgcccaaga gtcacaaggc 1140
tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg gtcactactt gtgatttccg 1200
ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc ttcactccat ctgtagaaca 1260
atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg ctgaatccag gcttccctcc 1320
tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca gtgattgtcc aggtgactcc 1380
tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt gattcacagt tcatcaacgg 1440
aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct acaacctggc attctgacta 1500
taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg gacatcacct tcttctcaga 1560
ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg ttcagaagta actactttgc 1620
ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc aagcattggg gagtcagact 1680
cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc tttgctgcag ccagattccc 1740
tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag acctcagtgg atgtaagtct 1800
aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc caagaaacct ggagcaaaat 1860
cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat cttgctccta aaaacccagg 1920
aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa tactttgaga ccagatacat 1980
cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc ggaatgatca gtggaactac 2040
cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa gacgtggaaa ttggacccaa 2100
tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta tacatgattg gacatggtat 2160
gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg ttcgaacatc ctcacattca 2220
agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt tttggtgata ctgggctatc 2280
caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt tggaaaagct ctattgcctc 2340
ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg gttctccgag ttggtatcca 2400
tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt tatacagaca tagagatgaa 2460
ccgacttgga aagagcggcg ccaccaactt cagcctgctg aagcaggccg gcgacgtgga 2520
ggagaacccc ggccccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga 2580
cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca 2640
caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac 2700
gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgcgg ccgtggcggt 2760
ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat 2820
ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc 2880
gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca 2940
gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg 3000
ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg 3060
cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg 3120
caagcccggt gcctga 3136
<210> 14
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列(.)
<400> 14
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn
20 25 30
Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp
35 40 45
His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu Gln Val Lys Met Pro Lys Ser
50 55 60
His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp
65 70 75 80
Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His
85 90 95
Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile
100 105 110
Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln
115 120 125
Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln
130 135 140
Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val
145 150 155 160
Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr
165 170 175
Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu
180 185 190
Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp
195 200 205
Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn
210 215 220
Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys
225 230 235 240
Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe Glu Met Ala
245 250 255
Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly
260 265 270
Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile
275 280 285
Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp
290 295 300
Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr
305 310 315 320
Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn
325 330 335
Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala
340 345 350
Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr
355 360 365
Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile
370 375 380
Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu
385 390 395 400
Tyr Met Ile Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser
405 410 415
Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln
420 425 430
Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys
435 440 445
Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser
450 455 460
Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu
465 470 475 480
Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys
485 490 495
Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
500 505 510
<210> 15
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(.)
<400> 15
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val
165 170

Claims (5)

1.一种类外泌体技术用于制备新型类外泌体病毒的方法，其特征为：感染了病毒的细胞通过挤压的方式依次通过孔径由大到小的滤膜。
2.如权利要求1所述的一种类外泌体技术用于制备新型类外泌体病毒的方法，其特征为：所述的感染了病毒的细胞在被病毒感染前在细胞外膜上表达有特定的蛋白；所述特定的蛋白具有靶向特定细胞的能力；且经过挤压之后在病毒外面包裹有类外泌体膜，所包裹的类外泌体膜上还镶嵌有所述的特定的蛋白。
3.如权利要求2所述的一种类外泌体技术用于制备新型类外泌体病毒的方法，其特征为步骤如下：
(1)制备细胞，该细胞外膜上镶嵌具有重靶向功能的蛋白Y，我们命名为Y-C细胞，制备Y-C细胞的方法可以是慢病毒转染表达Y蛋白，也可以是腺相关病毒，质粒转染或者基因编辑技术转染表达Y蛋白；蛋白Y可以根据靶向特定细胞的需要进行选择；细胞可以根据需要进行选择，能满足后续病毒感染复制即可；
(2)然后向Y-C细胞接种可感染该细胞的病毒，培养后收集细胞；
(3)液体重悬收集的感染了病毒之后的Y-C细胞，将Y-C细胞悬液使用挤压器，依据病毒的大小，依次挤压通过孔径由大到小的膜滤纸；
(4)收集挤压后的病毒悬液，将病毒悬液加入带有不同比例的多层的密度梯度离心液垫层的离心管中，高速离心，收集新型类外泌体病毒所在密度梯度带即获得新型类外泌体病毒。
4.如权利要求3所述的一种类外泌体技术用于制备新型溶瘤病毒的方法，其特征为步骤如下：
(1)制备细胞外膜上镶嵌VSV-G蛋白的293T细胞，我们将此细胞命名为293T-VSV-G细胞，所述VSV-G蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:10所述，所述VSV-G蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:14所述；
(2)293T-VSV-G细胞过夜培养，然后向293T-VSV-G细胞接种腺病毒，继续培养，然后收集细胞；
(3)使用培养基、PBS或者其他缓冲液重悬收集的感染腺病毒之后的293T-VSV-G细胞，将细胞悬液使用挤压器依次挤压通过孔径为10μm 5μm 1μm的膜滤纸；
(4)收集挤压后的病毒悬液，将病毒悬液加入带有15％、20％和40％碘克沙醇垫层的离心管中，100000×g离心一段时间，收集新型类外泌体病毒所在密度梯度带；
(5)透析液透析去除杂质，获得新型类外泌体病毒。
5.如权利要求4所述的一种类外泌体技术用于制备新型溶瘤病毒的方法，其特征为：所述向293T-VSV-G细胞接种腺病毒用到的腺病毒为Ad5-P；所述Ad5-P是可以表达可溶性PD1胞外结构域的腺病毒，所述可溶性PD1胞外结构域的DNA序列如SEQ ID NO:1所述，所述可溶性PD1胞外结构域的蛋白序列如SEQ ID NO:15所述；所述制备的新型溶瘤病毒其内部为Ad5-P，外面为类外泌体膜包裹层、且膜上有VSV-G蛋白。
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