CN108026151A

CN108026151A - Pd-1-cd28融合蛋白及其在医学中的用途

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Publication number: CN108026151A
Application number: CN201680048221.3A
Authority: CN
Inventors: 塞巴斯蒂安·科博尔德; 斯特凡·恩德雷斯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2036-06-20
Also published as: WO2016203048A1; JP2018518990A; JP2022084787A; CN115925971A; CN115927474A; DK3310805T3; PT3310805T; FI3909972T3; PL3310805T3; CN108026151B; US20220169699A1; AU2016277883A8; CA2989949A1; EP3909972A1; DK3909972T3; US11192935B2; ES2870174T3; EP3310805A1; US20190010207A1; JP7460675B2

Abstract

本发明涉及PD‑1‑CD28融合蛋白、核酸分子、载体、携带本发明核酸分子或载体或表达本发明融合蛋白的转导细胞、包含本发明的核酸分子、载体和/或融合蛋白的方法和试剂盒。本发明还提供了所述转导细胞在用于治疗特定疾病的方法中的用途，以及包含表达本发明的融合蛋白的所述转导细胞的药物组合物/药物用于治疗疾病的方法中，特别是用于特征在于PD‑L1和/或PD‑L2表达的疾病的医学干预中。

Description

PD-1-CD28融合蛋白及其在医学中的用途

本发明涉及PD-1-CD28融合蛋白、核酸分子、载体、携带本发明的核酸分子或载体或表达本发明的融合蛋白的转导细胞、包含本发明的核酸分子、载体和/或融合蛋白的方法和试剂盒。本发明还提供了所述转导细胞在用于治疗特定疾病的方法中的用途，以及包含表达本发明的融合蛋白的所述转导细胞的药物组合物/药物用于治疗疾病的方法中，特别是用于以PD-L1和/或PD-L2表达为特征的疾病的医学干预中。

过继性T细胞疗法(ACT)是治疗甚至转移性癌症晚期的有效方法(Rosenberg,NatRev Clin Oncol 8(10)(2011),577-585)。对于ACT，将抗原特异性T细胞分离或工程化，并在体外扩充然后回输给患者(Gattinoni等人,Nat Rev Immunol 6(5)(2006),383-393)。在临床试验中，在一些癌症患者中通过ACT与全身照射结合实现了无与伦比的反应率。然而，大多数患者对这种治疗没有反应(Dudley等人,J Clin Oncol 26(32)(2008),5233-5239；Rosenberg等人,Clin Cancer Res 17(13)(2011),4550-4557)。在对该疗法的抗性中牵涉肿瘤诱导的免疫抑制，其不被全身照射消减(Leen等人,Annu Rev Immunol 25(2007),243-265)。最近，已表明在肿瘤环境中激活的T细胞上调的抑制性受体及其各自的表达配体导致T细胞疗法失败(Abate-Daga等人,Blood 122(8)(2013),1399-410)。鉴于最近的研究已经在肿瘤中鉴定了肿瘤抗原特异性T细胞上表达的PD-1，在抑制性受体中程序性死亡受体-1(PD-1)起着关键作用(Gros等人,J Clin Invest(2014),10.1172/JCI73639)。PD-1与其配体PD-L1的相互作用抑制TCR信号传导和T细胞激活，因此阻止靶识别后的有效激活(Gros等人,J Clin Invest(2014),10.1172/JCI73639；Yokosuka等人,J Exp Med 209(6)(2012),1201-1217；Ding等人,CancerRes(2014),10.1158/0008-5472.CAN-13-3596；Karyampudi等人,Cancer Res(2014),10.1158/0008-5472.CAN-13-2564)。通过将ACT或基因修饰的T细胞与基于抗体的PD-1阻断相结合的治疗性研究导致抗肿瘤活性的显著改善，突出了这些机理的临床重量(John等人,Clin Cancer Res 19(20)(2013),5636-5646；Goding等人,JImmunol 190(9)(2013),4899-4909)。PD-1或PD-L1阻断抗体的全身应用具有潜在地靶向任何反应性的T细胞并因此诱导全身副作用的缺点(Topalian等人,N Engl J Med 366(26)(2012),2443-2454；Brahmer等人,N Engl J Med 366(26)(2012),2455-2465)。此外，ACT本身具有相当大的毒性风险，如最近在I期研究中所见(Linette等人,Blood 122(6)(2013),863-871；Morgan等人,J Immunother 36(2)(2013),133-151)。不加区别地与PD-1阻断组合具有增强任意单独疗法的副作用的风险。进行PD-1-PD-L1阻断而没有非选择性T细胞激活的潜在策略是限制其对肿瘤反应性T细胞的作用。已经证实了CD28细胞外和PD-1胞内结构域之间信号传导的主要相容性(Riley和June,Blood(2005),105(1),13-21；Chemnitz等人,J Immunol 173(2)(2004),945-954)。此外，已经利用CTLA-4、PD-1和CD28的相容性来增强T细胞应答并使用刺激性CTLA-4-CD28融合受体并且使用具有PD-1和CTLA-4的信号传导结构域的抑制性受体抑制脱靶T细胞反应性(Morales-Kastresana等人,Clin Cancer Res 19(20)(2013),5546-5548,Yin等人,J Leukoc Biol 73(1)(2003),178-182)。此外，描述了PD-1-CD28融合构建体，其含有PD-1的截短胞外结构域和CD28的跨膜和胞内结构域(Ankri等人,J.Immunol 191(8)(2013),4121-4129)。此外，描述了PD-1-CD28融合蛋白，其含有PD-1的截短胞外结构域和胞内结构域、跨膜结构域以及部分CD28胞外结构域(Prosser等人,Mol.Immunol.51(3-4)(2012),263-272)。

然而，在PD-L1介导的T细胞抑制方面，仍然需要提供具有改善ACT的安全性和功效以及克服以上缺点的潜力的改善手段。

本发明通过提供如权利要求中限定的实施方案来解决这个需要。

本发明涉及包含PD-1多肽和CD28多肽胞内结构域的融合蛋白，其中PD-1多肽包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域。

本文所述的PD-1-CD28融合蛋白的特征在于，包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域的PD-1多肽通过其C-末端有效地连接至CD28多肽的胞内结构域的N末端。

与Prosser等人,Mol.Immunol.51(3-4)(2012),263-272和Ankri等人,J.Immunol191(8)(2013),4121-4129中描述的PD-1-CD28融合蛋白相比，本发明的PD-1-CD28融合蛋白包含PD-1多肽的跨膜结构域。如所附实施例中所示，先前描述的PD-1-CD28融合蛋白的结构显示当转导至原代T细胞中时，仅有适度的细胞因子诱导(2至3倍)、在裂解活性上差异很小或没有差异。这与本发明的融合蛋白形成明显的对比，本发明的融合蛋白在体外和体内实现了高达300倍的IL-2和IFN-γ分泌增加和强的T细胞增殖以及肿瘤细胞裂解活性的增强(参见图2、3、5和9)。因此，令人惊奇地发现，具有PD-1跨膜结构域(PTM)的本发明的PD-1-CD28融合蛋白(涉及具有SEQ ID NO：14(鼠/小鼠)或SEQ ID NO：24(人)所示的氨基酸序列的PD-1-CD28融合蛋白)，优于Prosser等人,Mol.Immunol.51(3-4)(2012),263-272之前描述(涉及具有如本文命名为“CEX”的融合蛋白的结构的PD-1-CD28融合蛋白)和Ankri等人,J.Immunol 191(8)(2013),4121-4129之前描述(涉及具有如本文命名为“CTM”的融合蛋白的结构的PD-1-CD28融合蛋白；参见图2)的PD-1-CD28融合构建体。更确切地说，在所附实施例中表明，胞外结构域和跨膜结构域与CD28的胞内结构域的融合保护了转导细胞免受PD-1-L1诱导的T细胞抑制，并将抑制性信号转变为优化T细胞功能的共刺激信号。如图6E所示(作为作用机理概念的证明)，令人惊奇地发现，PD-1胞外和跨膜结构域与CD28胞内结构域的融合蛋白保护抗原特异性T细胞免受PD-1-PD-L1介导的无反应性，并将抑制性信号转变为共刺激信号。换句话说，用本发明的PD-1-CD28融合蛋白转导的细胞(如T细胞)对PD-1-PD-L1介导的无反应性具有抗性。此外，基于人PD-1和CD28序列的PD-1-CD28融合构建体的功能显示在图8中。

因此，本发明涉及一种融合蛋白，其包含通过其C-末端有效地连接至CD28多肽胞内结构域的N-末端的PD-1多肽，其中所述多肽包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域。

在本发明的上下文中，术语“融合蛋白”涉及由来自不同来源的多肽部分组成的蛋白。因此，它也可以被理解为“嵌合蛋白”。通常，融合蛋白是通过连接最初编码分离的蛋白的两个或更多个基因(或优选cDNA)而产生的蛋白。该融合基因(或融合cDNA)的翻译产生单个多肽，优选具有源自每种原始蛋白质的功能特性。重组融合蛋白通过重组DNA技术人工产生，用于生物学研究或治疗。下文描述了本发明融合蛋白生产的更多细节。

在本发明的上下文中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是人工的化学模拟物或对应的天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。因此，在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及包含由肽(酰胺)键连接的氨基酸单体链的分子或由其组成的分子。肽键是当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时形成的共价化学键。本文中“多肽”不限于具有限定长度的分子。因此，本文中术语“多肽”涉及包含氨基酸链的肽、寡肽、蛋白质或多肽，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。然而，本文中术语“多肽”还包括这样的蛋白/多肽的肽模拟物，其中氨基酸和/或肽键已被功能类似物替换。术语多肽还指并且不排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。这种修饰在现有技术中已被很好的描述。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指与氨基酸的一般化学结构具有不同结构的化学化合物，但其以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用。氨基酸在本文中可以通过其公知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号指代或单字母符号指代。

在本发明的上下文中，融合蛋白可以包含全长PD-1多肽的片段/多肽部分和全长CD28多肽的片段/多肽部分。因此，包含在本文提供的融合蛋白中的“PD-1多肽”是全长PD-1多肽的片段/多肽部分。在本文中鼠/小鼠和人全长PD-1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2(由SEQ ID NO：1所示的cDNA序列编码的鼠/小鼠)和4(由SEQ ID NO:3所示的cDNA序列编码的人)所示(人全长PD-1的Uni Prot Entry号为Q15116(登录号具有入口版本号138和序列版本3)；鼠/小鼠全长PD-1的Uni Prot Entry号是Q02242(登录号具有入口版本号125和序列版本1)。类似地，包含在本文提供的融合蛋白中的“CD28多肽”是全长CD28多肽的片段/多肽部分。在本文中人和鼠/小鼠全长CD28的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：26(由SEQ ID NO：25所示的拷贝DNA(cDNA)序列编码的鼠/小鼠)和28(由SEQ ID NO：27所示的cDNA序列编码的人)所示。如上文所述，本文提供的融合蛋白包含通过其C末端有效地连接至CD28多肽胞内结构域的N末端的PD-1多肽，其中PD-1多肽包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域。

本文提供的融合蛋白可以包含如SEQ ID NO：2(由SEQ ID NO：1所示的cDNA序列编码的鼠/小鼠全长PD-1)所示的PD-1的氨基酸序列的氨基酸1至200、优选氨基酸1至190。此外，在本发明的上下文中，本文提供的PD-1-CD28融合蛋白可包含如SEQ ID NO：2(由SEQ IDNO：1所示的cDNA序列编码)所示的PD-1的氨基酸序列的氨基酸1至180、1至181、1至182、1至183、1至184、1至185、1至186、1至187、1至188、1至189、1至190、1至191、1至192、1至193、1至194、1至195、1至196、1至197、1至198、1至199或1至200。例如，包含在本发明融合蛋白中的PD-1多肽可以包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列(由SEQ ID NO：7所示的cDNA序列编码)(鼠/小鼠)、或由其组成。然而，更优选地，本发明的融合蛋白包含源自人来源的多肽。因此，更优选地，本文提供的融合蛋白包含如SEQ ID NO：4(由SEQ ID NO：3所示的cDNA编码的人全长PD-1)所示的PD-1的氨基酸序列的氨基酸1至200、甚至更优选氨基酸1至191。因此，在本发明的上下文中，本文提供的融合蛋白优选包含如SEQ ID NO：4(由SEQ ID NO：3所示的cDNA编码的人全长PD-1)所示的PD-1的氨基酸序列的氨基酸1至180、1至181、1至182、1至183、1至184、1至186、1至187、1至188、1至189、1至190、1至191、1至192、1至193、1至194、1至195、1至196、1至197、1至198、1至199或1至200。例如，包含在本发明融合蛋白中的PD-1多肽可以包含如SEQ ID NO：16(由SEQ ID NO：15所示的cDNA编码)所示的氨基酸序列、或由其组成。因此，在本发明的上下文中，PD-1-CD28融合蛋白包含如SEQ ID NO：16所示的序列或与SEQ ID NO：16相比具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代、缺失或插入的序列，并且其特征在于具有PD-L1或PD-L2结合活性。

上述取代、缺失、插入/添加可能是保守的突变。“保守的突变”是指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象、刚性等)的其它氨基酸取代蛋白中的氨基酸，使得可以频繁地发生不改变蛋白生物学活性的改变。本领域技术人员认识到，通常，在多肽非重要区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如WatsonMolecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(第四版))(1987)。另外，结构上或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物学活性。本发明的结合化合物的各种实施方案包括当与本文公开的特定氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：6、8、10、16、18或20)相比时，具有包括至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性氨基酸取代的序列的多肽链。

因此，在本发明的上下文中，包含PD-1(人全长PD-1(SEQ ID NO：4)(由SEQ ID NO：3所示的cDNA序列编码))的胞外结构域和跨膜结构域的PD-1多肽可以包含具有如SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列的序列，其中与如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列相比，该氨基酸序列具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，优选1至8个，更优选1至6个，甚至更优选1至5个，甚至更优选1或2个，或甚至更优选1个取代、缺失或插入。如果在本文提供的融合蛋白中PD-1多肽分别与如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列相比包含一个或多个取代、缺失或插入，那么所述融合蛋白的特征在于具有PD-L1和/或PD-L2结合活性。该结合活性定义为与天然全长PD-1蛋白(例如具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白)相比，以相同的、增强的或降低的亲和力结合PD-L1和/或PD-L2配体的能力。天然全长PD-1蛋白以770nM或更低的平衡解离常数(KD)结合PD-L1配体(Butte等人,Molecular Immunology 45(2008),3567–3572)，天然全长PD-1蛋白以140nM或更低的平衡解离常数(KD)结合PD-L2配体(Butte等人,Molecular Immunology 45(2008),3567–3572)。因此，在本发明的上下文中，包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域的PD-1多肽(例如如SEQ ID NO：16所示或与如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列相比具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代、缺失或插入的其变体)可以与天然全长PD-1蛋白结合PD-L1和/或PD-L2配体相同地结合PD-L1和/或PD-L2配体。或者，在本发明的上下文中，包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域的PD-1多肽(例如如SEQ ID NO：16所示或与如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列相比具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代、缺失或插入的其变体)可以与天然全长PD-1蛋白相比至少1000、100、50、40、30、20、10、5倍更高(即增强)或更低(即降低)的结合亲和力结合PD-L1和/或PD-L2配体。如本文所用，术语“KD”旨在指解离常数并表示为摩尔浓度(M)。例如，可以使用本领域中充分建立的方法测定上文中所述的PD-1多肽与PD-L1和/或PD-L2之间的蛋白-蛋白相互作用的KD值。用于测定对PD-L1和/PD-L2配体的结合亲和力的方法是本领域已知的，在下文中更详细地描述，包括例如表面等离子共振(SPR)、biocore测量、流式细胞术或ELISA。

在本发明的上下文中，PD-1-CD28融合蛋白包含位于如SEQ ID NO：2(由SEQ IDNO：1所示的cDNA编码)所示的小鼠全长PD-1蛋白的氨基酸1至169处的PD-1的胞外结构域。或者，在本发明的上下文中，融合蛋白包含位于如SEQ ID NO：4(由SEQ ID NO：3所示的cDNA编码)所示的人全长PD-1蛋白的氨基酸1-170处的PD-1的胞外结构域。在本发明的上下文中，PD-1-CD28融合蛋白包含如SEQ ID NO：8(由SEQ ID NO：7所示的cDNA序列编码)所示或更优选如SEQ ID NO：18(由SEQ ID NO：17所示的cDNA序列编码)所示的PD-1的胞外结构域或由其组成。PD-1蛋白的胞外结构域(其包含在本文提供的融合蛋白中)的特征在于与天然PD-1蛋白相比以相同的(即等同的)、增强的或降低的(即减弱的)亲和力结合PD-1的天然配体(即(人)PD-L1(Uni Prot Entry：Q9NZQ7(登录号具有入口版本：130和序列版本1)或(人)PD-L2(Unit Prot Entry：Q9BQ51(登录号具有入口版本：115和序列版本2)的能力。可如下所述测定融合蛋白对PD-L1和/或PD-L2的亲和力。人全长PD-L1和人全长PD-L2的氨基酸序列在本文中如SEQ ID NO：34(由SEQ ID NO：33所示的cDNA序列编码的PD-L1)或SEQ ID NO：36(由SEQ ID NO：35所示的cDNA序列编码的PD-L2)所示。可以通过在本文提供的融合蛋白的胞外结构域中的点突变实现对PD-L1或PD-L2的降低的(即减弱的)、相同的(即等同的)或优选增强的亲和力。例如，通过用亮氨酸改变在对应于SEQ ID NO：18的氨基酸位置132的位置上的丙氨酸增强对PD-L1和PD-L2的PD-1亲和力(即结合)。通过增强PD-1多肽(其包含在本文提供的融合蛋白中)对PD-L1和PD-L2的亲和力，在细胞因子分泌、增殖和裂解方面，本文提供的融合蛋白在细胞中的活性增强。

可通过本领域技术人员熟知的方法评估本文提供的融合蛋白对PD-L1或PD-L2的结合亲和力，所述方法包括但不限于流式细胞术、ELISA、免疫沉淀、蛋白印迹、共焦或常规显微镜(Terawaki等人,International Immunology,19(7)(2007),881–890；Cheng等人,JBiol Chem.288(17)(2013),11771-11785；Ghiotto等人,Int Immunol.22(8)(2010),651–660)。特别地，所述融合蛋白与PD-L1或PD-L2的结合导致T细胞在靶细胞周围聚集，所述靶细胞可能是肿瘤或另一免疫细胞，通过融合蛋白的方式激活这些细胞。融合蛋白本身聚集到与靶细胞的接触点。这可以例如通过共焦或常规显微镜来测量和/或可视化。融合蛋白(即包含在融合蛋白中的PD-1多肽)与PD-L1或PD-L2的结合对于通过融合蛋白的CD28信号传导基序的任何后续信号传导以及由其获得的效果是重要的。导致对配体PD-L1和/或PD-L2增强的亲和力的融合蛋白中的突变可增强融合蛋白的功能性。测量一种蛋白与另一种蛋白的亲和力的方法是本领域技术人员熟知的，包括表面等离子体共振(SPR)、biacore测量、流式细胞术或ELISA。

如上所述，本文提供的PD-1-CD28融合蛋白包含位于如SEQ ID NO：2(如由SEQ IDNO：1所示的cDNA编码)所示的小鼠全长PD-1蛋白的氨基酸170-191的PD-1的跨膜结构域。PD-1的跨膜结构域位于人全长PD-1蛋白(如SEQ ID NO：4所示(由SEQ ID NO：3所示的cDNA编码))的氨基酸171-191。PD-1的跨膜结构域是本发明融合蛋白的重要组分，并且在PD-1-受体(即融合蛋白的PD-1多肽)衔接后允许信号传导到CD28的胞内结构域。在本发明的上下文中，包含在PD-1-CD28融合蛋白中的跨膜结构域可以包含如SEQ ID NO：10(由SEQ ID NO：9所示的cDNA序列编码的鼠/小鼠的)或如SEQ ID NO：20(由SEQ ID NO：19所示的cDNA序列编码的人的)所示的氨基酸序列，或由其组成。然而，包含在本发明融合蛋白中的跨膜结构域(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：20)可以包含或由这样的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与如SEQ ID NO：10(鼠/小鼠)或20(人)所示的氨基酸序列相比包括至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、优选1至8、更优选1至6、甚至更优选1至4、甚至更优选1至2、或甚至更优选1个取代、缺失、或插入。如果在本文提供的融合蛋白中，跨膜结构域与如SEQ ID NO：10(鼠/小鼠)或20(人)所示的氨基酸序列相比包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代、缺失或插入，则所述融合蛋白的特征在于显示相同或优选增强的信号传导活性。可以通过流式细胞术、蛋白印迹或基于ELISA的测定检测磷酸化蛋白如V-akt鼠胸腺瘤癌基因同系物1(AKT)来测量信号传导活性。也可以通过下游功能效应来检测信号传导活性，如细胞(如T细胞)的细胞因子释放、增殖或裂解活性(如，例如描述在本文所附实施例中和Krutzik等人,Methods MolBiol.699(2011),179-202；Ekkens等人,Infect Immun.75(5)(2007),2291-2296；Ge等人,Proc Natl Acad Sci U S A.99(5)(2002),2983-2988；Düwell等人,Cell DeathDiffer.21(12)(2014),1825-1837,Erratum in:Cell Death Differ.21(12)(2014),161)。因此，PD-1的跨膜结构域是本发明PD-1-CD28融合蛋白的重要组分，在PD-1-受体结构域(即融合蛋白的PD-1多肽)衔接后，其提供到CD28的胞内结构域的信号传导，该信号传导可以通过例如细胞(如T细胞)的细胞因子产生、增殖或裂解活性来测量。因此，在本发明的上下文中，PD-1的跨膜具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列(由SEQ ID NO：19所示的cDNA编码)。

本发明的PD-1-CD28融合蛋白的胞内结构域来源于(人)CD28基因(Uni ProtEntry No:P10747(登录号具有入口版本：164和序列的版本1)，并提供CD28活性，定义为本文所述的转导细胞(如转导的T细胞)的细胞因子产生、增殖和裂解活性。可以通过细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)或白细胞介素2(IL-2)的ELISA或流式细胞术的细胞因子释放来测量CD28活性(如在下文所附实施例中所述)、通过ki67测量、通过流式细胞术的细胞定量来测量T细胞的增殖(如在下文所附实施例中所述)、或通过靶细胞的实时阻抗测量评估裂解活性(使用例如ICELLligence仪器，如在下面3.1节所付实施例中所述，以及例如在Thakur等人,Biosens Bioelectron.35(1)(2012),503-506；Krutzik等人,Methods Mol Biol.699(2011),179-202；Ekkens等人,Infect Immun.75(5)(2007),2291-2296；Ge等人,Proc NatlAcad Sci U S A.99(5)(2002),2983-2988；Düwell等人,Cell Death Differ.21(12)(2014),1825-1837,Erratum in:Cell Death Differ.21(12)(2014),161中所述)。信号传导结构域PYAP(SEQ ID NO：28(由SEQ ID NO：27所示的cDNA序列编码)的AA 208至211)和YMNM(SEQ ID NO：28的AA 191至194)对于CD28多肽的功能和上面列举的功能效应是有益的。YMNM结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；PYAP结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO：30所示。因此，在本发明的融合蛋白中，CD28多肽优选包含源自CD28多肽的胞内结构域的序列，所述CD28多肽具有序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)。在本发明的上下文中，具有序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)的CD28多肽的胞内结构域的特征在于CD28活性，所述CD28活性定义为本文所述转导细胞(如，例如转导的T细胞)的细胞因子产生、增殖和裂解活性。因此，在本发明的上下文中，本发明的PD-1-CD28融合蛋白的胞内结构域具有SEQ ID NO：22(人)(由SEQ ID NO：21所示的cDNA序列编码)或SEQID NO：12(小鼠/鼠)(由SEQ ID NO：11所示的cDNA序列编码)的氨基酸序列。然而，在本发明的融合蛋白中，这些结构域中的一个或两个可分别突变为FMNM(SEQ ID NO：31)和/或AYAA(SEQ ID NO：32)。这些突变中的任一个降低了融合蛋白释放细胞因子的能力而不影响其增殖能力，可以有利地用于延长转导细胞的生存力，从而延长其治疗潜力。或者换句话说，这样的非功能性突变优选增强用本文提供的融合蛋白体内转导的细胞的持久性。然而，这些信号传导基序可以存在于本文提供的融合蛋白的胞内结构域内的任何位点。

因此，在本发明的上下文中，PD-1-CD28融合蛋白可以包含如SEQ ID NO：26(由SEQID NO：25所示的cDNA序列编码的小鼠全长CD28)所示的CD28的氨基酸序列的氨基酸170-218、优选氨基酸178-218。在本发明的上下文中，胞内CD28多肽可以是任何长度，只要本发明的融合蛋白的胞内结构域包含序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)。因此，在本发明的上下文中，PD-1-CD28融合蛋白的CD28的胞内结构域可以包含源自具有序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)的CD28多肽的胞内结构域的序列。例如，包含在本发明融合蛋白中的CD28多肽可以包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列(由SEQ IDNO：11所示的cDNA序列编码)或由其组成。如上所述，融合蛋白优选包含人来源的多肽。因此，更优选地，本文提供的融合蛋白包含如SEQ ID NO：28(由SEQ ID NO：27所示的cDNA序列编码的人全长CD28)所示的CD28的氨基酸序列的氨基酸170-220、甚至更优选氨基酸180-220。例如，包含在本发明融合蛋白中的CD28多肽可以包含如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列(由SEQ ID NO：21所示的cDNA序列编码)或由其组成。在本发明的上下文中，胞内CD28多肽可以是任何长度，只要本发明融合蛋白的胞内结构域包含序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)。因此，在本发明的上下文中，PD-1-CD28融合蛋白的CD28的胞内结构域可以包含源自具有序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)的CD28多肽的胞内结构域的序列。例如，包含在本发明融合蛋白中的CD28多肽可以包含如SEQ ID NO：12(鼠/小鼠)或22(人)所示的氨基酸序列或由其组成。在本文的上下文中，PD-1-CD28融合蛋白的CD28多肽具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在本文的上下文中，融合蛋白包含具有序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)的CD28多肽的胞内结构域。因此，在本文的上下文中，CD28多肽具有SEQ ID NO：22(人)的氨基酸序列。

此外，本文提供的PD-1-CD28融合蛋白可以包含如SEQ ID NO：14(由SEQ ID NO：13所示的cDNA序列编码的鼠/小鼠PTM(mPTM)融合蛋白)所示的氨基酸序列，或由其组成。最优选地，本文提供的融合蛋白包含如SEQ ID NO：24(由SEQ ID NO：23所示的cDNA序列编码的人PTM(hPTM)融合蛋白)所示的氨基酸序列，或由其组成。因此，本发明涉及具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的PD-1-CD28融合蛋白。

此外，本发明涉及由SEQ ID NO：24组成的蛋白融合物，其中所述融合蛋白具有

(a)包含序列的PD-1多肽，所述序列与如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列相比具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、优选1至8个、更优选1至6个、甚至更优选1个至5个、甚至更优选1或2个、或甚至更优选1个取代、缺失或插入，并且所述PD-1多肽的特征在于具有PD-L1或PD-L2结合活性；

(b)PD-1的跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列；和

(c)CD28多肽，其包含源自具有序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)的CD28多肽的胞内结构域的序列。

如上所述，结合PD-L1和/或PD-L2的结合活性定义为与天然全长PD-1蛋白(例如具有如SEQ ID NO：4(由SEQ ID NO：3所示的cDNA序列编码)所示的氨基酸序列的蛋白)相比，以相同的、增强的或降低的亲和力结合PD-L1和/或PD-L2配体的能力。因此，在本发明的上下文中，包含PD-1胞外结构域的PD-1多肽可以与天然全长PD-1蛋白相同地结合PD-L1和/或PD-L2配体。或者，在本发明的上下文中，包含胞外结构域的PD-1多肽可以以与天然全长PD-1蛋白相比至少1000、100、50、40、30、20、10、5倍更高(即增强的)或更低(即降低的)的结合亲和力结合PD-L1和/或PD-L2配体。此外，用于测定PD-L1和/或PD-L2结合活性的方法对于本领域技术人员来说是公知的，并在上文中进行了描述。

在本发明的上下文中，术语“PD-1”涉及程序性细胞死亡蛋白1，也称为PD-1和CD279(分化簇279)。PD-1是人中由PDCD1基因编码的蛋白。此外，PD-1是属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，并且在T细胞和pro-B细胞上表达。已知PD-1结合两种配体PD-L1和PD-L2。PD-1及其配体通过防止T细胞激活、从而降低自身免疫并促进自身耐受在下调免疫系统中发挥重要作用。PD-1的抑制作用通过促进淋巴结中抗原特异性T细胞凋亡(程序性细胞死亡)、同时降低调节性T细胞(抑制性T细胞)凋亡的双重机理来实现。人和小鼠PD-1的蛋白序列在本文中示于SEQ ID NO：4(由SEQ ID NO：3所示的cDNA序列编码)或SEQ ID NO：2(如由SEQ ID NO：1所示的cDNA序列编码)。人和小鼠PD-1的核酸序列分别示于SEQ ID NO：3(人)和1(鼠/小鼠)。

在本发明的上下文中，术语“CD28”是指受体“分化簇28”。CD28是在T细胞上表达的提供T细胞激活和存活所需的共刺激信号的蛋白质之一。除了T细胞受体(TCR)之外，通过CD28的T细胞刺激可以为各种白细胞介素(例如IL-6)的产生提供有效的信号。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白的受体。人和小鼠CD28蛋白的氨基酸序列在本文中示于SEQ IDNO：28(由SEQ ID NO：27所示的cDNA序列编码)或SEQ ID NO：26(如由SEQ ID NO：25所示的cDNA序列编码)。人和小鼠CD28的核酸序列分别示于SEQ ID NO：27(人)和25(鼠/小鼠)。

在本发明的上下文中，术语“有效地连接”是指至少两个蛋白质序列之间的功能性连接，即在本文所述的包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域的PD-1多肽与CD28的胞内结构域之间的功能性连接。在本发明的上下文中，包含在本发明融合蛋白中的PD-1多肽和CD28多肽可以共价连接。包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域的PD-1多肽与CD28多肽的胞内结构域的共价连接产生融合蛋白，其中所述PD-1多肽通过其C末端连接至CD28多肽的N末端。共价键是特征在于在原子间共享电子对的化学键，尤其是如通过本文示例的化学化合物交叉结合获得的那样。然而，也设想了本文公开的构建体的重组产生，即包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域的PD-1多肽以及共价结合的CD28多肽的胞内结构域。在本发明的上下文中，“有效地连接”是指至少两个多肽之间的功能性连接，这意味着两个多肽保留其功能性。

此外，本文提供的融合蛋白可以包含接头(或“间隔子”)。接头通常是具有高达20个氨基酸的长度的肽。因此，在本发明的上下文中，接头可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。例如，本文提供的融合蛋白可以包含PD-1多肽和CD28多肽之间的接头。这样的接头具有的优点是，它们更可能使得融合蛋白的不同多肽(即PD-1多肽和CD28多肽)独立地折叠并如预期地发挥功能。因此，在本发明的上下文中，PD-1多肽和CD28多肽可以包含在单链多功能多肽中。单链PD-1-CD28融合构建体，例如可以由包含(一个或多个)源自PD-1的结构域和(一个)CD28多肽的胞内结构域的(一个或多个)多肽组成。所述结构域通过多肽接头连接，其中所述接头位于(一个或多个)源自PD-1的结构域和所述胞内CD28多肽结构域之间。

在本发明的上下文中，术语“N-末端”可以与多肽的氨基末端、NH2-末端、N-末端或胺末端互换使用。该术语是指蛋白质或多肽的天然起始。

在本发明的上下文中，术语“C-末端”可以与多肽的羧基末端、羧基末端、羧末端、C-末端尾部、C-末端或COOH-末端互换使用。该术语是指蛋白质或多肽的天然结尾。

文中的术语“胞外结构域”，特别是在PD-1的胞外结构域的上下文中，是指在细胞外部伸出膜的受体(即PD-1)部分。胞外结构域的活性是结合特定配体(例如PD-L1或PD-L2)。在本发明的上下文中，PD-1-CD28融合蛋白的胞外结构域具有SEQ ID NO：18的氨基酸/多肽序列或与SEQ ID NO：18相比具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代、缺失或插入的多肽序列，其特征在于具有如上所述的PD-L1和/或PD-L2结合活性。文中的术语“跨膜结构域”，特别是在PD-1的跨膜结构域的上下文中，是指天然位于细胞(例如T细胞)膜中的受体(即PD-1)部分。在本发明的上下文中，PD-1的跨膜结构域具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：20相比具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代、缺失或插入的氨基酸序列，其特征在于显示与如上文所述相同的或优选增强的信号传导活性。文中的术语“胞内结构域”，特别是在CD28的胞内结构域的上下文中，是指受体(即CD28)的细胞质结构域。在本发明的上下文中，胞内结构域是指源自具有序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ IDNO：30)的CD28多肽的胞内结构域的氨基酸序列，如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。胞内结构域与细胞内部相互作用。

本发明融合蛋白的产生在本领域中是公知的。例如，可以通过融合基因的遗传工程来产生如本文所述的融合蛋白。这通常包括从编码第一多肽(即PD-1多肽)的cDNA序列中除去终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR将第二多肽(即CD28多肽)的cDNA序列附加在阅读框内。然后该DNA序列可以被细胞表达为单个蛋白。例如，可以通过重叠PCR和重组表达克隆到逆转录病毒载体(例如pMP71载体)中来产生本发明的融合蛋白，如在说明性的附加实施例中所述。

本发明还包括编码本发明融合蛋白的一个或多个核酸分子。

术语“核酸分子”涉及包含嘌呤和嘧啶碱基的碱基序列，所述嘌呤和嘧啶碱基包含在多核苷酸中，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构。文中的术语“核酸分子”包括DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、DNA的合成形式以及包含两种或更多种这些分子的混合聚合物。另外，术语“核酸分子”包括正义链和反义链两者。此外，本文所述的“核酸分子”可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员将容易理解的。编码本发明的人和小鼠融合蛋白的示例性核酸分子示于SEQ ID NO：23(人)或SEQ ID NO：13(小鼠)中。

本发明的核酸分子可以处于调控序列的控制之下。例如，可以使用允许诱导表达本发明融合蛋白的启动子、转录增强子和/或序列。在本发明的上下文中，核酸分子在组成型或诱导型启动子的控制下表达。合适的启动子是例如CMV启动子(Qin等人,PLoS One 5(5)(2010),e10611)、UBC启动子(Qin等人,PLoS One 5(5)(2010),e10611)、PGK(Qin等人,PLoS One 5(5)(2010),e10611)、EF1A启动子(Qin等人,PLoS One 5(5)(2010),e10611)、CAGG启动子(Qin等人,PLoS One 5(5)(2010),e10611)、SV40启动子(Qin等人,PLoS One 5(5)(2010),e10611)、COPIA启动子(Qin等人,PLoS One 5(5)(2010),e10611)、ACT5C启动子(Qin等人,PLoS One 5(5)(2010),e10611)、TRE启动子(Qin等人,PLoS One.5(5)(2010),e10611)、Oct3/4启动子(Chang等人,Molecular therapy 9(2004)、S367–S367(doi:10.1016/j.ymthe.2004.06.904))、或Nanog启动子(Wu等人,Cell Res.15(5)(2005),317-24)。

术语“调控序列”是指实现与其连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。这种控制序列的性质根据宿主生物体不同而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，通常控制序列包括启动子、终止子和在一些情况下的增强子、反式激活子或转录因子。术语“控制序列”旨在最少包括其存在对于表达是必需的所有组分，并且还可以包括另外的有利组分。

此外，为了进一步的目的，设想核酸分子可以含有例如硫酯键和/或核苷酸类似物。所述修饰可用于使核酸分子对抗细胞中的内切核酸酶和/或外切核酸酶而稳定。所述核酸分子可以通过含有允许所述核酸分子在细胞中转录的嵌合基因的合适载体转录。在这方面，还应该理解，这种多核苷酸可以用于“基因靶向”或“基因治疗”方法。在另一个实施方案中，所述核酸分子被标记。用于检测核酸的方法在本领域是公知的，例如Southern和Northern印迹、PCR或引物延伸。该实施方案可在基因治疗方法期间用于验证上述核酸分子成功导入的筛选方法。所述核酸分子可以是重组产生的嵌合核酸分子，其包含单独或组合的任何前述核酸分子。在本发明的上下文中，核酸分子是载体的一部分。

因此，本发明还涉及包含本发明所述的核酸分子的载体。文中的术语“载体”涉及可以在已经导入其的宿主细胞中(即在转导细胞中)自主复制的环状或线性核酸分子。文中使用的“载体”特别是指通常用于基因工程的质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体适合于转化细胞，优选T细胞。因此，在本发明的一个方面，本文提供的载体是表达载体。表达载体已经在文献中被广泛描述。特别地，本文提供的载体优选包含重组多核苷酸(即编码本发明融合蛋白的核酸分子)以及与待表达的核苷酸序列有效地连接的表达控制序列。如本文所提供的载体优选进一步包含启动子。本文所述的载体还可以包含选择标记基因和确保在宿主(即转导细胞)中复制的复制起点。此外，本文提供的载体还可以包含用于转录的终止信号。在启动子和终止信号之间，优选存在至少一个能够插入希望表达的核酸分子(例如编码本发明融合蛋白的核酸分子)的限制性位点或多接头。本领域技术人员知道如何实施这种插入。适合于包含本发明的核酸分子以形成本发明载体的载体的实例是本领域已知的。例如，在本发明的上下文中，合适的载体包括并入本发明的核酸分子(即编码本发明融合蛋白的核酸分子)的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。优选地，本发明的载体是病毒载体。更优选地，本发明的载体是慢病毒载体，甚至更优选地，本发明的载体是逆转录病毒载体(例如pMP71载体)。因此，在本发明的上下文中，载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。本发明的载体允许组成型或条件性表达编码本发明PD-1-CD28融合蛋白的核酸分子。在该上下文中，用于表达本发明融合蛋白的合适的逆转录病毒载体在本领域是已知的，如SAMEN CMV/SRa(Clay等人,J.Immunol.163(1999),507-513)、LZRS-id3-IHRES(Heemskerk等人,J.Exp.Med.186(1997),1597-1602)、FeLV(Neil等人,Nature 308(1984),814-820)、SAX(Kantoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986),6563-6567)、pDOL(Desiderio,J.Exp.Med.167(1988),372-388)、N2(Kasid等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990),473-477)、LNL6(Tiberghien等人,Blood 84(1994),1333-1341)、pZipNEO(Chen等人,J.Immunol.153(1994),3630-3638)、LASN(Mullen等人,Hum.Gene Ther.7(1996),1123-1129)、pG1XsNa(Taylor等人,J.Exp.Med.184(1996),2031-2036)、LCNX(Sun等人,Hum.Gene Ther.8(1997),1041-1048)、SFG(Gallardo等人,Blood 90(1997)、LXSN(Sun等人,Hum.Gene Ther.8(1997),1041-1048)、SFG(Gallardo等人,Blood 90(1997),952-957)、HMB-Hb-Hu(Vieillard等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997),11595-11600)、pMV7(Cochlovius等人,Cancer Immunol.Immunother.46(1998),61-66)、pSTITCH(Weitjens等人,Gene Ther 5(1998),1195-1203)、pLZR(Yang等人,Hum.Gene Ther.10(1999),123-132)、pBAG(Wu等人,Hum.Gene Ther.10(1999),977-982)、rKat.43.267bn(Gilham等人,J.Immunother.25(2002),139-151)、pLGSN(Engels等人,Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168)、pMP71(Engels等人,Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168)、pGCSAM(Morgan等人,J.Immunol.171(2003),3287-3295)、pMSGV(Zhao等人,J.Immunol.174(2005),4415-4423)或pMX(de Witte等人,J.Immunol.181(2008),5128-5136)。此外，在本发明的上下文中，用于表达本发明融合蛋白的合适的慢病毒载体是，例如，PL-SIN慢病毒载体(Hotta等人,NatMethods.6(5)(2009),370-376)、p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/NheI(Campeau等人,PLoSOne 4(8)(2009),e6529)、pCMVR8.74(Addgene目录号:22036)、FUGW(Lois等人,Science295(5556)(2002),868-872,pLVX-EF1(Addgene目录号:64368)、pLVE(Brunger等人,ProcNatl Acad Sci U S A 111(9)(2014),E798-806)、pCDH1-MCS1-EF1(Hu等人,Mol CancerRes.7(11)(2009),1756-1770)、pSLIK(Wang等人,Nat Cell Biol.16(4)(2014),345-356)、pLJM1(Solomon等人,Nat Genet.45(12)(2013),1428-30)、pLX302(Kang等人,SciSignal.6(287)(2013),rs13)、pHR-IG(Xie等人,J Cereb Blood Flow Metab.33(12)(2013),1875-85)、pRRLSIN(Addgene Catalogoue No:62053)、pLS(Miyoshi等人,JVirol.72(10)(1998),8150-8157)、pLL3.7(Lazebnik等人,J Biol Chem.283(7)(2008),11078-82)、FRIG(Raissi等人,Mol Cell Neurosci.57(2013),23-32)、pWPT(Ritz-Laser等人,Diabetologia.46(6)(2003),810-821)、pBOB(Marr等人,J Mol Neurosci.22(1-2)(2004),5-11)或pLEX(Addgene目录号:27976)。

本发明还涉及表达由编码本发明融合蛋白的核酸分子编码的融合蛋白的转导细胞。因此，在本发明的上下文中，转导细胞可以包含编码本发明融合蛋白的核酸分子或表达本发明融合蛋白的本发明的载体。

在本发明的上下文中，术语“转导细胞”涉及遗传修饰的细胞(即其中已经故意导入核酸分子的细胞)。本文提供的转导细胞可以包含本发明的载体。优选地，本文提供的转导细胞包含本发明的核酸分子(编码融合蛋白)和/或本发明的载体。本发明的转导细胞可以是瞬时或稳定表达外源DNA(即已被导入细胞的核酸分子)的细胞。具体而言，通过使用逆转录病毒或慢病毒转导，可以将编码本发明融合蛋白的核酸分子稳定整合到细胞的基因组中。通过使用mRNA转染，可以瞬时表达编码本发明融合蛋白的核酸分子。优选地，通过病毒载体(例如逆转录病毒载体或慢病毒载体)将核酸分子导入细胞中，从而遗传修饰本文提供的转导细胞。该表达可以是组成型(constitutive)或组成的(constitutional)，这取决于所使用的系统。PD-1-CD28融合蛋白在本文提供的转导细胞的表面上表达。可以在细胞表面上检测融合蛋白的PD-1多肽的胞外部分，而胞内(PD-1多肽的跨膜和胞内结构域部分)与膜结合，但不可在细胞表面上检测到。可以通过使用特异性结合PD-1多肽的该胞外结构域的抗体进行PD-1多肽的胞外结构域的检测。此类抗体的实例为本领域所熟知，包括克隆EH12.2H7(可从BioLegend商购，目录号：329911)、克隆J116(可从eBioscience商购，目录号：16-9989-80)、J105(可从eBioscience商购，目录号：8012-2799)或MiH4(可从eBioscience商购，目录号：14-9969)。可以使用这些抗体通过流式细胞术或显微镜来检测胞外结构域。本发明的转导细胞可以是例如CD4+-T细胞、CD8+-T细胞、γδT细胞、天然杀伤(NK)T细胞、天然杀伤(NK)细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞、髓样细胞或间充质干细胞。优选地，本文提供的转导细胞是T细胞(例如自体T细胞)，更优选地，转导细胞是CD8+T细胞。因此，在本发明的上下文中，转导细胞是CD8+T细胞。此外，在本发明的上下文中，转导细胞是自体T细胞。因此，在本发明的上下文中，转导细胞优选为自体CD8+T细胞。除了使用从受试者分离的自体细胞(例如T细胞)之外，本发明还包括使用同种异体细胞。因此，在本发明的上下文中，转导细胞也可以是同种异体细胞，如同种异体CD8+T细胞。可选地或另外地，本发明提供了转导的CD4+T细胞，其可以是自体CD4+T细胞或同种异体CD4+T细胞。可选地或另外地，本发明提供了转导的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的群(包括但不限于包含转导的CD4+T细胞的群，包含转导的CD8+T细胞的群和包含转导的CD4+T细胞和转导的CD8+T细胞的群)，其中转导细胞可以是自体和/或同种异体的(例如，群可以仅包含自体细胞、仅包含同种异体细胞、或者包含自体和同种异体细胞的组合)。如本文所述的本发明的T细胞群可以包含转导的和未转导的T细胞。

同种异体细胞的使用基于如下事实：细胞(优选T细胞)可以识别由外源抗原呈递细胞(APC)呈递的特定抗原表位，只要APC表达I类或II类MHC分子，对于这些MHC分子特定应答细胞群(即T细胞群)与T细胞识别的抗原表位一起受到限制。因此，术语同种异体是指来自无关供体个体/受试者的细胞，其是与将要通过例如本文描述的表达PD-1-CD28融合蛋白的转导细胞治疗的个体/受试者相容的人白细胞抗原(HLA)。自体细胞是指如上文所述从待用本文所述的转导细胞治疗的受试者分离/获得的细胞。

如上所述，用表达本文提供的融合蛋白的核酸分子转导本发明的转导细胞。在具有天然抗肿瘤特异性的细胞如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL,Dudley等人,J Clin Oncol.31(17)(2013),2152-2159(doi:10.1200/JCO.2012.46.6441))或通过流式细胞术从患者的外周血分选其肿瘤特异性的抗原特异性细胞(Hunsucker等人,Cancer Immunol Res.3(3)(2015),228-235(doi:10.1158/2326-6066.CIR-14-0001))的情况下，本文所述的细胞将仅用本发明的融合蛋白转导。然而，本发明的转导细胞可以与另外的核酸分子共转导，例如，与编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸分子共转导。

根据本发明，术语“T细胞受体”在本领域中是公知的。具体而言，本文中术语“T细胞受体”是指任何T细胞受体，只要满足以下三个标准：(i)肿瘤特异性、(ii)识别(大部分)肿瘤细胞，这意味着抗原或靶标应该在(大部分)肿瘤细胞中表达，和(iii)TCR与待治疗的受试者的HLA型匹配。在此上下文中，符合上述三个标准的合适的T细胞受体在本领域是已知的，如识别WT1(Wilms肿瘤特异性抗原1；关于序列信息参见例如Sugiyama,JapaneseJournal of Clinical Oncology 40(2010),377-87)、MAGE(序列参见例如WO-A1 2007/032255和PCT/US2011/57272)、SSX(美国临时申请号61/388,983)、NY-ESO-1(关于序列信息参见例如PCT/GB2005/001924)和/或HER2neu(关于序列信息参见WO-A12011/0280894)的受体。

术语“嵌合抗原受体”或“嵌合受体”是本领域已知的，是指由单链抗体结构域的胞外部分通过间隔子序列融合至CD3z和CD28的信号结构域所构成的受体。同样，这种嵌合抗原受体应提供肿瘤特异性并允许识别大多数肿瘤细胞。合适的嵌合受体包括：抗EGFRv3-CAR(关于序列参见WO-A12012/138475)、抗CD22-CAR(参见WO-A12013/059593)、抗BCMA-CAR(参见WO-A12013/154760)、抗CD19-CAR(参见WO-A12012/079000或US-A12014/0271635)、抗CD123-CAR(参见US-A12014/0271582)、抗CD30-CAR(参见WO-A12015/028444)或抗Mesothelin-CAR(参见WO-A12013/142034)。

本发明还涉及产生表达本发明融合蛋白的转导细胞的方法，包括以下步骤：用本发明的载体转导细胞，在允许融合蛋白在所述转导细胞中或上表达的条件下培养转导细胞，和回收所述转导细胞。

在本发明的上下文中，本发明的转导细胞优选通过以下方法产生：从受试者(优选人患者)中分离/获得细胞(例如T细胞)。用于从患者或从供体分离/获得细胞(例如T细胞)的方法在本领域中是公知的，在本文中，来自患者或来自供体的细胞(例如T细胞)可以通过抽血或去除骨髓分离。在分离/获得作为患者样品的细胞之后，将细胞(例如T细胞)从样品的其它成分分离。从样品中分离细胞(例如T细胞)的几种方法是已知的，包括但不限于例如，用于从患者或供体的外周血液样品中获得细胞的白细胞除去法、通过使用FACSort装置分离/获得细胞、通过手工或通过显微操作器从具有活细胞的新鲜活组织检查样本中挑选死细胞活体(参见例如，Dudley,Immunother.26(2003),332-342；Robbins,Clin.Oncol.29(201 1),917-924或Leisegang,J.Mol.Med.86(2008),573-58)。优选针对CD8+T细胞进行本段落中公开的和本文其它地方公开的方法和过程，但也适用于其它T细胞类型，如CD4+T细胞。

本文中术语“新鲜患者活组织检查”是指通过外科手术或任何其它已知方法从受试者取出的组织(优选肿瘤组织)以及肿瘤细胞系或从肿瘤组织/肿瘤细胞(分离的)细胞。随后培养和扩充分离/获得的细胞T细胞(例如CD8+T细胞)，例如通过使用抗CD3抗体、通过使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体和/或通过使用抗CD3抗体、抗CD28抗体和白细胞介素-2(IL-2)(参见例如Dudley,Immunother.26(2003),332-342或Dudley,Clin.Oncol.26(2008),5233-5239)。

在随后的步骤中，通过本领域已知的方法(参见例如Lemoine,J Gene Med 6(2004),374-386)人工/遗传修饰/转导细胞(例如T细胞)。用于转导细胞(例如T细胞)的方法是本领域已知的，包括但不限于在转导核酸或重组核酸的情况下，例如电穿孔法、磷酸钙法、阳离子脂质法或脂质体法。通过使用商售的转染试剂，例如Lipofectamine(由Invitrogen制造，目录号：11668027)，可以常规且高效地转导待转导的核酸。在使用载体的情况下，载体可以以与上述核酸相同的方式转导，只要该载体是质粒载体(即不是病毒载体的载体)。在本发明的上下文中，用于转导细胞(例如T细胞)的方法包括逆转录病毒或慢病毒T细胞转导以及mRNA转染。“mRNA转染”是指本领域技术人员熟知的在待转导细胞中瞬时表达感兴趣蛋白的方法，如在本发明的情况中，本发明的PD-1-CD28融合蛋白。简言之，通过使用电穿孔系统(如，例如Gene Pulser，Bio-Rad)，可以用编码本发明融合蛋白的mRNA电穿孔细胞，然后如上所述通过标准细胞(例如T细胞)培养方案进行培养(参见Zhao等人，MolTher.13(1)(2006)，151-159)。优选地，本发明的转导细胞是T细胞(最优选是CD8+T细胞)并且由慢病毒产生，或者最优选为逆转录病毒T细胞转导。

在本文中，用于转导细胞(例如T细胞)的合适的逆转录病毒载体在本领域中是已知的，如SAMEN CMV/SRa(Clay等人,J.Immunol.163(1999),507-513)、LZRS-id3-IHRES(Heemskerk等人,J.Exp.Med.186(1997),1597-1602)、FeLV(Neil等人,Nature 308(1984),814-820)、SAX(Kantoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986),6563-6567)、pDOL(Desiderio,J.Exp.Med.167(1988),372-388)、N2(Kasid等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990),473-477)、LNL6(Tiberghien等人,Blood 84(1994),1333-1341)、pZipNEO(Chen等人,J.Immunol.153(1994),3630-3638)、LASN(Mullen等人,Hum.Gene Ther.7(1996),1123-1129)、pG1XsNa(Taylor等人,J.Exp.Med.184(1996),2031-2036)、LCNX(Sun等人,Hum.Gene Ther.8(1997),1041-1048)、SFG(Gallardo等人,Blood 90(1997)、LXSN(Sun等人,Hum.Gene Ther.8(1997),1041-1048)、SFG(Gallardo等人,Blood 90(1997),952-957)、HMB-Hb-Hu(Vieillard等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997),11595-11600)、pMV7(Cochlovius等人,Cancer Immunol.Immunother.46(1998),61-66)、pSTITCH(Weitjens等人,Gene Ther 5(1998),1195-1203)、pLZR(Yang等人,Hum.Gene Ther.10(1999),123-132)、pBAG(Wu等人,Hum.Gene Ther.10(1999),977-982)、rKat.43.267bn(Gilham等人,J.Immunother.25(2002),139-151)、pLGSN(Engels等人,Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168)、pMP71(Engels等人,Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168)、pGCSAM(Morgan等人,J.Immunol.171(2003),3287-3295)、pMSGV(Zhao等人,J.Immunol.174(2005),4415-4423)或pMX(de Witte等人,J.Immunol.181(2008),5128-5136)。在本发明的上下文中，用于转导细胞(例如T细胞)的合适的慢病毒载体是，例如，PL-SIN慢病毒载体(Hotta等人,NatMethods.6(5)(2009),370-376)、p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/NheI(Campeau等人,PLoSOne 4(8)(2009),e6529)、pCMVR8.74(Addgene目录号:22036)、FUGW(Lois等人,Science295(5556)(2002),868-872、pLVX-EF1(Addgene目录号:64368)、pLVE(Brunger等人,ProcNatl Acad Sci U S A 111(9)(2014),E798-806)、pCDH1-MCS1-EF1(Hu等人,Mol CancerRes.7(11)(2009),1756-1770)、pSLIK(Wang等人,Nat Cell Biol.16(4)(2014),345-356)、pLJM1(Solomon等人,Nat Genet.45(12)(2013),1428-30)、pLX302(Kang等人,SciSignal.6(287)(2013),rs13)、pHR-IG(Xie等人,J Cereb Blood Flow Metab.33(12)(2013),1875-85)、pRRLSIN(Addgene目录号:62053)、pLS(Miyoshi等人,J Virol.72(10)(1998),8150-8157)、pLL3.7(Lazebnik等人,J Biol Chem.283(7)(2008),11078-82)、FRIG(Raissi等人,Mol Cell Neurosci.57(2013),23-32)、pWPT(Ritz-Laser等人,Diabetologia.46(6)(2003),810-821)、pBOB(Marr等人,J Mol Neurosci.22(1-2)(2004),5-11)或pLEX(Addgene目录号:27976)。

本发明的转导细胞优选在其天然环境以外的受控条件下生长。具体而言，术语“培养”是指源自多细胞真核生物(优选源自人患者)的细胞(例如本发明的转导细胞)在体外生长。培养细胞是保持与原始组织来源分离的细胞存活的实验室技术。在此，本发明的转导细胞在允许本发明的融合蛋白在所述转导细胞中或上表达的条件下培养。允许转基因(即本发明的融合蛋白)表达的条件是本领域公知的并且包括例如激动性抗CD3和抗CD28抗体以及添加细胞因子如白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)和/或白细胞介素15(IL-15)。在培养的转导细胞中表达本发明的融合蛋白后，从培养物(即从培养基)中回收(即重新提取)转导细胞。

本发明还包括表达通过本发明的方法获得的本发明的核酸分子编码的融合蛋白的转导细胞。

此外，本发明提供了一种药物组合物/药物，其包含表达本发明的融合蛋白的转导细胞或由上述方法获得/产生的转导细胞。在本发明的上下文中，所述组合物是药物组合物，其进一步包含任选地载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。

根据本发明，术语“药物”与术语“药物组合物”可互换使用，涉及施用于患者、优选人患者的组合物。在本发明的上下文中，将药物/药物组合物施用给分离/获得转导细胞的患者。在本发明的上下文中，患者是指人患者。此外，在本发明的上下文中，患者患有特征在于表达PD-1配体(即PD-L1和/或PD-L2)的疾病。在本发明的上下文中，特征在于表达PD-1配体(即PD-L1和/或PD-L2)的疾病是本领域已知的，包括例如，肺癌(Dong等人,Nat Med.8(8)(2002),793-800)、卵巢癌(Dong等人,Nat Med.8(8)(2002),793-800)、黑色素瘤(Dong等人,Nat Med.8(8)(2002),793-800)、结肠癌(Dong等人,Nat Med.8(8)(2002),793-800)、胃癌(Chen等人,World J Gastroenterol.9(6)(2003),1370-1373)、肾细胞癌(Thompson等人,104(10)(2005),2084-91)、食管癌(Ohigashi等人,11(8)(2005),2947-2953)、神经胶质瘤(Wintterle等人,Cancer Res.63(21)(2003),7462-7467)、尿路上皮癌(Nakanishi等人,Cancer Immunol Immunother.56(8)(2007),1173-1182)、成视网膜细胞瘤(Usui等人,Invest Ophthalmol Vis Sci.47(10)(2006),4607-4613)、乳癌(Ghebeh等人,Neoplasia 8(3)(2006),190-198)、非霍奇金淋巴瘤(Xerri等人,Hum Pathol.39(7)(2008),1050-1058)、胰腺癌(Geng等人,J Cancer Res Clin Oncol.134(9)(2008),1021-1027)、霍奇金淋巴瘤(Yamamoto等人,Blood111(6)(2008),3220-3224)、骨髓瘤(Liu等人,Blood 110(1)(2007),296-304)、肝细胞癌(Gao等人,Clin Cancer Res.15(3)(2009),971-979)、白血病(Kozako等人,Leukemia 23(2)(2009),375-382)、宫颈癌(Karim等人,Clin Cancer Res.15(20)(2009),6341-6347)、胆管癌(Ye等人,J Surg Oncol.100(6)(2009),500-504)、口腔癌(Malaspina等人,Cancer Immunol Immunother.60(7)(2011),965-974)、头颈部癌症(Badoual等人,Cancer Res.73(1)(2013),128-138)、或间皮瘤(Mansfield等人,J ThoracOncol.9(7)(2014),1036-1040)。

在本发明的上下文中，包含本发明的转导细胞或通过本发明的方法产生的转导细胞的药物组合物与干预治疗方案组合施用。这样的干预治疗方案的实例包括但不限于施用疼痛药物、施用化疗剂、疾病或其症状的手术处理。因此，本文所公开的治疗方案包括单独施用如本文所述的表达融合蛋白的转导细胞、与一种或多于一种本文中描述的或本领域中已知的适合治疗或预防疾病或其症状的治疗方案一起施用如本文所述的表达融合蛋白的转导细胞。

因此，在本发明的上下文中，表达本发明融合蛋白的转导细胞可用于治疗增殖性疾病，优选癌症。更优选地，本文提供的表达本发明融合蛋白的转导细胞用于治疗疾病(优选癌症)，其中肿瘤细胞表达PD-1配体(即PD-L1和/或PD-L2)。上文描述了用本文提供的表达本发明融合蛋白的转导细胞优选治疗的癌症类型。因此，表达由本文所述的核酸分子编码的本发明融合蛋白的转导细胞可用于治疗任何疾病的方法中，在所述疾病中肿瘤细胞表达PD-1配体(即PD-L1和/或PD-L2)。治疗方法优选包括通过上述方法收集细胞，如通过抽血或移除骨髓分离/收集细胞。随后，分离的细胞被病毒修饰或通过用融合受体进行mRNA电穿孔(并且任选地与另外的核酸分子例如与编码T细胞受体或嵌合受体的核酸分子共转导)。如上所述的细胞扩充后，将细胞静脉内转移回患者。此外，本发明提供了用于治疗疾病的方法，其包括以下步骤：从受试者中分离细胞(例如T细胞，优选CD8+T细胞)，用如上文所述的编码PD-1-CD28融合蛋白的核酸转导所述分离的细胞，与另外的核酸分子(例如如上文所述的编码T细胞受体或嵌合受体的核酸分子)共转导所述分离的细胞，扩充转导细胞，和将转导细胞施用回所述受试者。文中描述的这种治疗方法可以重复，例如每周一次或两次。

术语“治疗”、“处置”等在本文中使用通常意指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病所导致的副作用而言所述效果可以是治疗性的。本文使用的术语“治疗”涵盖受试者中疾病的任何治疗，包括：(a)预防和/或减轻可能易患疾病的受试者中发生的增殖性疾病(优选癌症)；(b)抑制疾病，即阻止其发展，如抑制癌症进展；或(c)缓解疾病，即引起疾病消退，如抑制癌症。优选地，本文使用的术语“治疗”涉及已经表现的疾患的医学干预，如治疗被诊断的癌症。

为了本发明的目的，“受试者”(或“患者”)可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括人和其它动物，特别是哺乳动物和其它生物。因此，本文提供的方法适用于人治疗和兽医应用。因此，所述受试者可以是动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、白鼬、猫、狗、鸡、绵羊、牛种、马、骆驼或灵长类动物。优选地，受试者是哺乳动物。最优选地，受试者是人。

如上所述，本发明涉及包含本文提供的表达本发明融合蛋白(由本发明的核酸分子编码)的转导细胞的“药物组合物”。所述药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。合适的药物载体的实例在本领域中是公知的，包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。载体可以是与接受者血液等张的溶液。包含这种载体的组合物可以通过众所周知的常规方法配制。给药方案由主治医师和临床因素决定。如在医学领域中众所周知的，对于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其它药物。例如，本发明的药物组合物可以以10⁴至10¹⁰个细胞/kg体重、优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量施用给受试者。在本发明的上下文中，药物组合物可以以这样的方式施用，即通过以约10⁵至10⁶个细胞/kg体重的受试者剂量开始、然后上升到10¹⁰个细胞/kg体重进行施用细胞的增加。本发明的药物组合物可以静脉内(即通过静脉内输注)施用，但也可以腹膜内、胸膜内、鞘内、皮下或结节内施用。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)，等等，防腐剂和其它添加剂也可以存在于本发明的药物组合物中，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

本发明的药物组合物可以与例如能够为免疫效应细胞、为细胞增殖或为细胞刺激提供激活信号的分子一起用于联合治疗。所述分子可以是例如T细胞的其它主要激活信号(例如其它共刺激分子：B7家族的分子、Ox40L、4.1BBL、CD40L、抗CTLA-4、抗PD-1)或其它细胞因子白细胞介素(例如IL-2)。

在本发明的上下文中，用于治疗性施用的药物组合物的组分优选是无菌的。通过例如无菌过滤膜(例如0.2微米膜)的过滤可以容易地完成无菌化。可以通过使药物组合物的组分与液体载体均匀接触来制备本发明的药物组合物。在其产生之后，可将本发明的药物组合物放入具有无菌入口的容器中，例如具有可用皮下注射针刺穿的塞子的静脉内用溶液袋或小瓶。

本发明还涉及用于治疗特征在于表达PD-1配体(即PD-L1和/或PD-L2)的疾病的方法，所述疾病如，例如肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌、肾细胞癌、食管癌、神经胶质瘤、尿路上皮癌、成视网膜细胞瘤、乳癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、肝细胞癌、白血病、宫颈癌、胆管癌、口腔癌、头颈部癌症或间皮瘤，所述方法包括向受试者施用本文所述的转导细胞。在本发明的上下文中，所述受试者是人(如上所述)。在本发明的上下文中，描述了用于治疗疾病的方法，所述方法包括以下步骤：从受试者分离细胞(例如T细胞，优选CD8+T细胞)，用如上文所述编码PD-1-CD28融合蛋白的核酸转导所述分离的细胞，并将转导细胞施用给所述受试者。在本发明的上下文中，所述转导细胞通过静脉内输注施用给所述受试者。此外，本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括以下步骤：从受试者分离细胞(例如T细胞，优选CD8+T细胞)，用如上文所述编码PD-1-CD28融合蛋白的核酸转导所述分离的细胞，用其它核酸分子(例如如上文所述编码T细胞受体或嵌合受体的核酸分子)共转导所述分离的细胞，扩充转导细胞，并将转导细胞施用回所述受试者。

可以在(刺激)细胞因子如白细胞介素-2(IL-2)和/或白细胞介素-15(IL-15)的存在下进行转导细胞的上述扩充步骤。在本发明的上下文中，也可以在白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-7(IL-7)和/或白细胞介素-21(IL-21)的存在下进行扩充步骤。根据本发明，也可以在抗CD3和/或抗CD28抗体的存在下进行转导细胞的扩充步骤。

本发明的PD-1-CD28融合蛋白也可以与本文公开的或本领域已知的其它工程化多肽组合。这样的组合包括本发明的PD-1-CD28融合蛋白和工程化的多肽在相同细胞群和/或在相同细胞内共表达。因此，在PD1-CD28融合蛋白与另一工程化多肽的上下文中，组合可以指细胞群作为整体表达一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白和一种或多种工程化的多肽，其中根据本领域中已知的或本文描述的标准方法工程化细胞群中的个体细胞，以表达(a)一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白或一种或多种工程化的多肽；或(b)一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白和一种或多种工程化的多肽。

优选地，一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白和一种或多种工程化的多肽的组合在相同细胞内共表达，使得该细胞同时表达一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白和一种或多种工程化的多肽和/或使得一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白和一种或多种工程化的多肽的表达可以在相同细胞内检测到。

可以与一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白共表达的工程化的多肽包括：

·嵌合抗原受体，如Milone等人,Mol.Ther.17(2009),1453–1464；Carpenito等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(2009),3360–3365；Wang等人,Hum.Gene Ther.18(2007),712–725；Pule等人,Mol.Ther.12(2005),933–941；和Wang等人,CancerImmunol.Res.3(2015),815–826中描述的；

·α/βTCR工程化的T细胞，如Rapoport等人,Nature Medicine,21(2015),914–921中提供的；

·在TIL上表达的天然TCR，如Rosenberg等人,Clin.Cancer Res.17(2011),4550–4557中提供的；

·为可溶性多肽表达或作为跨膜蛋白存在于细胞表面上的抗CD3T细胞衔接子(engager)；和

·包含TCR亚基和人或人源化抗体结构域的T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)。例如，如本领域已知的，TCR亚基可以包含TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和/或TCR胞内结构域(所有在上述段落中引述的参考文献以其整体引入作为参考)。

当PD1-CD28融合蛋白和工程化的多肽将在相同细胞中共表达时，本发明的PD-1-CD28融合蛋白和第二多肽可由导入相同细胞的不同核酸编码。因此，本发明提供了一种组合物，其包含编码一种或多种如本文所述的PD1-CD28融合蛋白(例如SEQ ID NO:14或SEQID NO:24，优选SEQ ID NO:24)的核酸和编码一种或多种工程化多肽(本文所包含的第二多肽)的核酸。本发明还提供了包含第一和第二载体的组合物，第一载体包含编码一种或多种本文所述的PD1-CD28融合蛋白(例如，SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24，优选SEQ ID NO：24)的核酸，第二载体包含编码一种或多种工程化多肽(本文所包含的第二多肽)的核酸。第一和第二载体可以相同或不同。例如，如本领域已知的，如果没有插入编码PD1-CD28融合蛋白或工程化的(第二)多肽，第一和第二载体(分别包含编码一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白(例如，SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24，优选SEQ ID NO：24)和一种或多种工程化的(第二)多肽的核酸)可以是相同的载体(例如相同的表达载体)。或者，第一和第二载体可以是不同的载体，例如包含不同的表达启动子。因此，从第一和第二载体表达编码多肽可以由相同或不同的启动子驱动。因此，本发明提供了一种组合物，其包含(a)包含与编码本发明的PD1-CD28融合蛋白的核酸序列有效地连接的第一启动子的第一核酸，和/或包含第一核酸的第一载体；和(b)包含与编码工程化的(第二)多肽的第二核酸序列有效地连接的第二启动子的第二核酸，其中第一和第二载体和/或第一和第二启动子相同或不同。

或者，当PD1-CD28融合蛋白和工程化的多肽将在相同细胞中共表达时，本发明的PD-1-CD28融合蛋白和第二多肽可由相同的核酸编码，即，由包含编码本发明的融合蛋白的序列和编码第二多肽的序列的单个核酸编码。因此，本发明提供了包含如上所述的本发明的PD1-CD28融合蛋白和/或工程化的多肽的单个核酸。可根据本领域已知的或本文描述的核酸和/或其组分复制/复制(例如，编码PD1-CD28和/或工程化多肽的核酸序列的复制)的标准方法使用包含编码本发明PD1-CD28融合蛋白的基因和编码共表达多肽的基因的单个核酸，可用于修饰核酸和/或其组分，或可用于单独或同时表达编码的蛋白。因此，本发明提供了包含编码本发明的PD-1-CD28融合蛋白(例如，SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24，优选SEQID NO:24)的基因和编码工程化多肽(例如，嵌合抗原受体、α/βT细胞受体、天然T细胞受体、作为可溶性多肽表达或在细胞表面上作为跨膜蛋白呈递的抗CD3T细胞衔接子、和/或T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)(例如包含TCR亚基和人或人源化抗体结构域)，如上所述)的基因的核酸。本发明还提供了包含核酸的载体，所述核酸包含编码本发明的PD-1-CD28融合蛋白(例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24，优选SEQ ID NO:24)的基因、编码工程化多肽(例如，嵌合抗原受体、α/βT细胞受体、天然T细胞受体、作为可溶性多肽表达或在细胞表面上作为跨膜蛋白呈递的抗CD3T细胞衔接子、和/或T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)(例如包含TCR亚基和人或人源化抗体结构域)，如上所述)的基因、和/或包含编码本发明的PD-1-CD28融合蛋白的基因和编码工程化(第二)多肽的基因二者，如本文所述。本发明还提供了包含本段所述的一种或多种核酸和/或载体的宿主细胞。

当一种或多种本发明的PD1-CD28融合蛋白(例如，SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24，优选SEQ ID NO：24)和一种或多种工程化(第二)多肽将从单个核酸在相同细胞中共表达，可以由相同或不同的启动子独立驱动PD-1-CD28融合蛋白和第二多肽的表达。启动子可以以不同构型以双向作用方式排列，协调两个或更多个转基因的调控(双向作用启动子载体如本领域已知)。如本领域已知的，启动子也可以单向作用方向(双启动子载体)排列，独立地协调两个或更多个转基因的调控。因此，本发明提供了包含与编码本发明的PD1-CD28融合蛋白的序列有效地连接的第一启动子和与第二多肽有效地连接的第二启动子的核酸，其中第一和第二启动子相同或不同。或者，共表达的PD-1-CD28融合蛋白和第二多肽可在单个(即相同)启动子的控制下。可以使用本领域已知的或本文公开的任何方法工程化不同的蛋白，以在相同启动子的控制下表达。例如，如本领域已知的，编码第一蛋白(例如本发明的PD1-CD28融合蛋白(例如，SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24，优选SEQ ID NO：24))的基因可连接至编码2A肽或2A样序列的序列(例如，Szymczak等人,Nature Biotechnol.22(2004),589-594；Provost等人,Genesis 45(2007),625-629；Diao和White,Genetics 190(2012),1139-1144，其中每一个以其整体引用做参考)，第二多肽跟于其后。或者，本发明的融合蛋白和第二多肽编码序列可以通过IRES(内部核糖体进入位点)连接。

可以通过本领域已知的任何方法将本文提供的核酸(包括包含这样核酸的载体)导入靶细胞中。这些方法包括但不限于阳离子脂质法或脂质体法、电穿孔或磷酸钙法。如本文所用，导入核酸和/或载体的细胞也称为“转导细胞”。

根据所使用的系统，PD1-CD28融合蛋白和第二多肽的共表达可以是独立的组成型或组成的。PD-1-CD28融合蛋白和第二多肽可以在本文提供的转导细胞的表面上表达，或者另外地可以根据本领域已知的标准方法在细胞内或细胞上检测到。用于共表达本发明的PD1-CD28和第二多肽的转导细胞可以是例如CD4+-T细胞、CD8+-T细胞、γδT细胞、天然杀伤(NK)T细胞、天然杀伤(NK)细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞、髓样细胞或间充质干细胞。优选地，本文提供的用于共表达的转导细胞是T细胞(例如自体T细胞)，更优选地，转导细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。因此，转导细胞可以是共表达本发明的PD1-CD28融合蛋白(例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24，优选SEQ ID NO:24)和第二多肽(例如嵌合抗原受体、α/βT细胞受体、天然T细胞受体、作为可溶性多肽表达或在细胞表面上作为跨膜蛋白呈递的抗CD3T细胞衔接子、和/或T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)(例如包含TCR亚基和人或人源化抗体结构域的那个)，如上所述)的CD8+T细胞。此外，用于共表达的转导细胞可以是如本文所述的自体T细胞或同种异体T细胞。可选地或另外地，转导细胞可以是共表达本发明的PD1-CD28融合蛋白(例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24，优选SEQ ID NO:24)和第二多肽(例如嵌合抗原受体、α/βT细胞受体、天然T细胞受体、作为可溶性多肽表达或在细胞表面上作为跨膜蛋白呈递的抗CD3T细胞衔接子、和/或T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)(例如包含TCR亚基和人或人源化抗体结构域)，如上所述)的CD4+T细胞。转导的CD4+T细胞可以是自体CD4+T细胞或同种异体CD4+T细胞。可选地或另外地，本发明提供了转导的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞群(包括但不限于包含转导的CD4+T细胞的群、包含转导的CD8+T细胞的群和包含转导的CD4+T细胞和转导的CD8+T细胞的群)，其中各转导细胞表达本发明的PD1-CD28融合蛋白、如上所述的工程化(第二)多肽、或表达本发明的PD1-CD28融合蛋白和如上所述的工程化(第二)多肽。共表达转导的CD4+和/或CD8+T细胞的群可以是自体和/或同种异体的(例如，群可以仅包含自体细胞、仅包含同种异体细胞、或包含自体和同种异体细胞的组合)。如本文所述的本发明的共表达T细胞群可以包含转导的和未转导的T细胞，使得群作为整体表达或群的代表性样品表达本发明的PD1-CD28融合蛋白和工程化(第二)多肽，如上所述。

如本文所述，本发明涉及包含本发明的核酸分子、本发明的载体和/或本发明的融合蛋白的试剂盒。因此，可以通过使用该试剂盒来实现本文提供的治疗方法。有利地，本发明的试剂盒进一步包含任选地(a)反应缓冲液、储存溶液(即防腐剂)、洗涤溶液和/或进行如本文所述测定法所需的其余试剂或物质。此外，本发明试剂盒的各部件可以独立包装在小瓶或瓶子中，或组合在容器或多容器单元中。另外，试剂盒可能包含使用说明书。本发明试剂盒的制造优选遵循本领域技术人员已知的标准步骤。如上所述，本文提供的试剂盒可用于治疗患有特征在于表达PD-1配体(即PD-L1和/或PD-L2)的疾病的受试者(优选人患者)，所述疾病如，例如肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌、肾细胞癌、食管癌、神经胶质瘤、尿路上皮癌、成视网膜细胞瘤、乳癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、肝细胞癌、白血病、宫颈癌、胆管癌、口腔癌、头颈部癌症或间皮瘤。

附图说明

图1：PD-1-CD28融合蛋白(PD-1跨膜结构域、PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))和14(蛋白质))的体外表征

(A)用抗CD3抗体、抗CD3加抗CD28抗体或抗CD3抗体加重组PD-L1(SEQ ID NO：37(核酸(cDNA))；38(蛋白质))刺激PTM融合蛋白(如SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质)所示)转导的或未转导的原代鼠/小鼠T细胞，并通过ELISA测量所得的IFN-γ释放。(B)将PTM融合蛋白转导的或未转导的原代鼠T细胞保持未刺激或者用抗CD3抗体或者用抗CD3抗体加重组PD-L1刺激，通过流式细胞术测量AKT的磷酸化。(C)用抗CD3抗体、抗CD3加抗CD28抗体或用抗CD3抗体加重组PD-L1(SEQ ID NO：37(核酸)；38(蛋白质))刺激PTM融合蛋白转导的或未转导的原代鼠T细胞，细胞数归一化到标准计数珠。(D)用抗CD3抗体、抗CD3加抗CD28抗体或用抗CD3抗体加重组PD-L1(SEQ ID NO：(SEQ ID NO：37(核酸(cDNA))；38(蛋白质))刺激PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))或未转导的原代鼠T细胞24小时，并细胞内染色有丝分裂标记物ki67。(E)在存在或不存在抗PD-1抗体或抗小鼠H2kbSIINFEKL抗体的情况下，与Panc02-OVA-PD-L1共同培养PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸)；14(蛋白质))或未转导的OT-1T细胞，通过ELISA测量所得的IFN-γ产生。(F)用抗CD3抗体和用重组PD-L1预刺激PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))或未转导的OT-1T细胞。同时在添加预刺激的T细胞之前接种Panc02-OVA-PD-L1细胞并使其生长(箭头)。条件如下：仅Panc02-OVA-PD-L1(1)、Panc02-OVA-PD-L1+预刺激的未转导T细胞(2)、Panc02-OVA-PD-L1+预刺激的PTM融合蛋白转导的T细胞(3)、PTM融合蛋白(4)、和未转导的T细胞(5)、和培养基(6)。通过基于阻抗的测量来测量Panc02-OVA细胞生存力。实验A至E代表每个实验一式三份进行的至少三个独立实验。实验F代表由于技术原因一式两份进行的三个独立实验。条代表SD，显示了来自学生t检验的p值。所有检验都是双侧的。

图2：不同PD-1-CD28融合蛋白的功能比较

(A)不同PD-1-CD28融合蛋白结构的示意图：PTM(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))：PD-1胞外结构域(PD-1-ex)和跨膜结构域(PD-1-跨膜)(如SEQ ID NO:5(核酸)；6(蛋白质))融合至CD28胞内结构域(CD28-胞内；SEQ ID NO：11(核酸)；12(蛋白质))。CTM(SEQ ID NO:43(核酸(cDNA))；44(蛋白质)):PD-1胞外结构域(SEQ ID NO:39(核酸(cDNA))；40(蛋白质))融合至CD28跨膜(CD28-trans)和胞内结构域(SEQ ID NO:41(核酸)；42(蛋白质))；和CEX(SEQ ID NO:49(核酸(cDNA))；50(蛋白质)):PD-1胞外结构域(SEQ IDNO:45(核酸(cDNA))；46(蛋白质))融合至CD28胞外区段(CD28-ex)和CD28跨膜和胞内结构域(SEQ ID NO:47(核酸(cDNA))；48(蛋白质))。(B)用抗CD3抗体、抗CD3加抗CD28抗体或抗CD3抗体加重组PD-L1(SEQ ID NO：37(核酸)；38(蛋白质))刺激PTM(SEQ ID NO：49、50)、CTM(SEQ ID NO：43、44)、CEX(SEQ ID NO：49、50)或未转导的原代鼠T细胞，并通过ELISA测量IFN-γ产生。(C)用抗CD3抗体、抗CD3加抗CD28抗体或抗CD3抗体加重组PD-L1 37(核酸)；38(蛋白质))刺激PTM、CTM、CEX融合蛋白转导的或未转导的原代鼠T细胞，并将得到的细胞数归一化到计数珠。(D)将PTM、CTM、CEX融合蛋白转导的或未转导的T细胞与重组PD-L1 37(核酸)；38(蛋白质))一起孵育，并通过流式细胞术测量PD-L1结合。(E)代表的PTM、CTM、CEX或未转导的T细胞的CD8和PD-1表达的共染色。所有实验代表至少三个独立实验，每个实验一式三份。条代表SD，显示了来自学生t检验的p值。所有检验都是双侧的。

图3：不同突变的PTM融合蛋白在其推定信号传导结构域中的功能比较。

(A)不同PTM融合蛋白突变体的示意图：PTM(YMNM-PYAP,野生型(SEQ ID NO:13(核酸(cDNA))；14(蛋白质)),PTM-FMNM(酪氨酸突变,Y至F(SEQ ID NO:51(核酸(cDNA))；52(蛋白质)),PTM-AYAA(脯氨酸突变,P至A(SEQ ID NO:53(核酸(cDNA))；54(蛋白质))和PTM-FMNM-AYAA(脯氨酸和酪氨酸突变(SEQ ID NO:55(核酸(cDNA))；56(蛋白质))。(B)用抗CD3抗体或抗CD3抗体加重组PD-L1(SEQ ID NO：37(核酸(cDNA))；38(蛋白质))刺激PTM(SEQ IDNO:13,14)、PTM-酪氨酸突变(PTM-FMNM；SEQ ID NO:51,52))、PTM-脯氨酸突变(PTM-AYAA；SEQ ID NO:53,54))和PTM-酪氨酸和脯氨酸突变(PTM-FMNM-AYAA；SEQ ID NO:55,56)或未转导的T细胞，并通过ELISA测量IFN-γ产生。(C)用抗-CD3抗体或抗-CD3抗体加重组PD-L1刺激未转导的、PTM、PTM-FMNM、PTM-AYAA或PTM-FMNM-AYAA转导的T细胞，并通过归一化到计数珠来定量活细胞的量。(D)用抗CD3抗体加重组PD-L1(SEQ ID NO：37(核酸(cDNA))；38(蛋白质))刺激未转导的、PTM(SEQ ID NO:13(核酸)；14(蛋白质))、PTM-FMNM(SEQ ID NO:51(核酸(cDNA))；52(蛋白质))、PTM-AYAA(SEQ ID NO:53(核酸(cDNA))；54(蛋白质))、或PTM-FMNM-AYAA(SEQ ID NO:55(核酸(cDNA))；56(蛋白质))转导的T细胞，并用鼠细胞因子阵列半定量分析细胞因子的释放。阵列筛选40个细胞因子的宽范围组的表达。低于0.05的P值在图3D中用*标记。实验B和C代表一式三份进行的至少三个独立实验。由于技术原因，实验C一式两份地进行三次。条代表SD，显示了来自学生t检验的p值。所有检验都是双侧的。

图4：PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞在体内的疗效和免疫记忆的诱导

(A)18只小鼠皮下注射Panc02-OVA细胞。一旦肿瘤建立，将各6只小鼠随机分组为不治疗、未转导的OT-1T细胞的过继转移或PTM蛋白转导的OT-1T细胞的过继转移。每隔一天以盲法方式测量肿瘤大小。实验代表每组6只小鼠的三个独立实验。(B)同时用Panc02-OVA细胞再攻击来自两个独立实验的存活小鼠(n＝12)与肿瘤未治疗的野生型小鼠(n＝7)。(C)用亚致死剂量的Panc02细胞再攻击第一次再攻击后的存活小鼠(n＝11，来自图B中描绘的实验)和肿瘤未治疗的野生型小鼠(n＝6)。(D)使用对照肽TRP2、P15E肽或SIINFEKL(SEQ ID NO：65，参照鸡卵白蛋白的氨基酸(AA)258-265(UniProt Entry：P01012(入口版本147和序列版本2)))肽在体外器官培养物中刺激来自Panc02再攻击(图C中描绘的实验)中存活的小鼠的淋巴结。针对各小鼠TRP2刺激后通过流式细胞术分析产生IFN-γ的CD8+-T细胞数，归一化到产生IFN-γ的CD8+-T细胞数。(E)将转移PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞后具有清除的Panc02-OVA肿瘤的小鼠或野生型小鼠的脾细胞过继转移到野生型小鼠上。用Panc02-OVA细胞攻击这些小鼠。无肿瘤小鼠脾细胞的转移在9只小鼠中的3只中防止了肿瘤生长。使用对数秩检验进行生存分析。使用Mann-Whitney检验比较个体小鼠的实验条件。所有检验都是双侧的。

图5：PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞的体内作用模式

(A)18只小鼠皮下注射Panc02-OVA细胞。一旦建立肿瘤，将小鼠随机分为未转导的OT-1T细胞或用缺失PD-1受体(SEQ ID NO：57(核酸(cDNA))；58(蛋白质))转导的T细胞或用未修饰的PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))转导的T细胞的过继转移。每隔一天以盲法方式测量肿瘤大小。实验代表每组6只小鼠的三个独立实验。(B)用PTM融合蛋白转导来自CD45.1-OT-1小鼠的T细胞，来自CD90.1-OT-1小鼠的T细胞不转导。以相等的量在野生型小鼠(n＝2)或携带Panc02-OVA肿瘤的小鼠中(n＝6)共注射T细胞。四天后，在不同区室中分析T细胞，比较PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸)；14(蛋白质))转导的与未转导的OT-1-T细胞的比率。实验代表三个独立实验，每个肿瘤组有6只小鼠。(C)从实验(B)中获得的肿瘤、脾和淋巴结中分离未转导的CD90.1-OT-1-T细胞和PTM融合蛋白(SEQ IDNO：13(核酸)；14(蛋白质))转导的CD45.1-OT-1T细胞，通过流式细胞术分析IFN-γ表达。实验代表三个独立实验，每个肿瘤组有6只小鼠。(D)用PTM融合蛋白转导CD45.1-OT-1T细胞，用突变融合蛋白PTM-FMNM(SEQ ID NO:52(蛋白质),51(cDNA))、PTM-AYAA(SEQ ID NO:54(蛋白质),53(cDNA))或PTM-FMNM-AYAA(SEQ ID NO:56(蛋白质),55(cDNA))中的任意转导CD90.1OT-1T细胞，以相等的量与PTM转导的CD45.1OT-1T细胞混合，然后转移到携带Panc02-OVA肿瘤的小鼠(每组n＝3)。转移四天后，通过流式细胞术分析PTM受体转导的T细胞与突变融合蛋白转导的T细胞的比率。实验代表三个独立实验，每个肿瘤携带组3只小鼠。(E)将PTM融合蛋白转导的或未转导的OT-1T细胞过继转移到携带Panc02-OVA肿瘤的小鼠(分别为n＝17)中。一周后，分析肿瘤浸润性MDSC(CD45⁺、CD11b⁺、Ly6⁺、Gr-1中间体⁺)数。数据表示来自三个独立实验的汇集小鼠的结果。条代表SD。使用对数秩检验进行生存分析。为了比较个体小鼠的实验条件，使用Mann-Whitney检验。所有的测试都是双侧的。

图6：使用PD1-CD28融合蛋白(PTM；SEQ ID NO：13(cDNA)，14(蛋白质)的基本原理：通过瘤内T细胞的PD1上调和肿瘤细胞上的PD-L1表达

(A)将GFP转导的OT-1T细胞过继转移到携带Panc02-OVA肿瘤的小鼠中。一周后，通过流式细胞术分析GFP+OT-1T细胞的肿瘤以及脾的浸润和浸润T细胞的PD-1表达。与脾中的OT-1T细胞相比，几乎所有肿瘤浸润OT-1T细胞都是PD-1阳性。(B)肿瘤浸润OT-1-T细胞(深灰色)上和脾浸润OT-1-T细胞(浅灰色)上的PD-1表达的示例性直方图。(C)在体外用IFN-γ(2、20和100ng/ml)刺激Panc02-OVA细胞，48小时后通过流式细胞术分析PD-L1的表达。IFN-γ剂量依赖地上调PD-L1表达。(D)用100ng/ml IFN-γ刺激后(深灰色)和无刺激(浅灰色)的Panc02-OVA肿瘤细胞上的PD-L1表达的示例性直方图。(E)作用机理的示意性概述：PD-1胞外和跨膜结构域与CD28胞内结构域的融合蛋白保护抗原特异性T细胞免受PD-1-PD-L1介导的无反应性，并将抑制信号转换成共刺激信号。(F)用抗CD3抗体、重组PD-L1(SEQ ID NO：37(cDNA)，38(蛋白质))或二者刺激PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸)；14(蛋白质))转导的T细胞。48小时后通过ELISA分析IL-2诱导。两种化合物的组合刺激导致IL-2的强诱导。

图7：PD1-CD28融合蛋白(PTM；SEQ ID NO：13(cDNA)，14(蛋白质))转导的T细胞在过表达PD-L1的Panc02-OVA模型中的疗效以及治疗效果对IFN-γ的依赖性。

(A)用抗CD3抗体、抗CD28抗体、重组PD-L1(SEQ ID NO：37(核酸)；38(蛋白质))、抗CD3抗体和重组PD-L1或全部三种刺激物刺激PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸)；14(蛋白质))转导的T细胞。48小时后通过ELISA分析IFN-γ诱导。用所有化合物的组合刺激导致IFN-γ的强诱导。(B)在存在或不存在抗CD3抗体(1μg/ml)的情况下，将PTM融合蛋白(SEQID NO：13(cDNA)，14(蛋白质))转导的OT-1T细胞与Panc02-PD-L1共培养48小时，并定量上清液中的IFN-γ。(C)24只小鼠皮下注射Panc02-OVA-PD-L1细胞。一旦建立肿瘤，将小鼠(每组n＝8)随机分为未处理的或用未转导的OT-1T细胞或PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(cDNA)，14(蛋白质))转导的OT-1T细胞处理两次的组。每隔一天以盲法方式测量肿瘤大小。与两个对照组相比，PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞显著增加无肿瘤小鼠的数量。(D)10只小鼠皮下注射Panc02-OVA细胞。一旦建立肿瘤，将小鼠(每组n＝5)随机分为用PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞与200μg IFN-γ中和抗体一起处理的组或同种型对照组。腹腔内施用抗体，从随机化分组的时间点每三天施用，持续四个剂量。每隔一天以盲法方式测量肿瘤大小。IFN-γ中和抗体消除了PTM转导的OT-1T细胞的治疗影响。(E)将PTM融合蛋白转导的或未转导的OT-1T细胞过继转移到携带Panc02-OVA肿瘤的小鼠(分别为n＝17)。一周后，定量肿瘤中的肿瘤浸润调节性T细胞的数量和PD-1-CD8T细胞的数量。用PTM融合蛋白转导的T细胞处理的小鼠比用未转导的T细胞处理的小鼠具有更高的PD-1-CD8T细胞比Treg的比率。条代表SEM。

图8：人PD-1-CD28融合蛋白(hPTM；SEQ ID NO：23(核酸)，24(蛋白质))的功能分析

用抗CD3抗体、抗CD3加抗CD28抗体或抗CD3抗体加重组PD-L1(购自R&D，目录号：156-B7-100)刺激hPTM(SEQ ID NO：23(核酸)；24(蛋白质))或未转导的原代人T细胞，并通过ELISA测量IFN-γ产生。通过不配对学生t-检验来评估刺激组之间的差异。箭头代表SEM，精确的p值如图所示。

图9：PD-1-CD28融合蛋白(PD-1跨膜结构域、PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))和14(蛋白质))转导的CD4+T细胞的体外表征

用抗CD3抗体、抗CD3加抗-CD28抗体或用抗CD3抗体加重组PD-L1(SEQ ID NO：37(核酸(cDNA))；38(蛋白质))刺激PTM融合蛋白(如SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质)所示)转导的或未转导的原代鼠/小鼠CD4+T细胞。

(A)通过ELISA测量IFN-γ释放。

(B)通过活细胞/珠来测定增殖。细胞数归一化至标准的计数珠。

(C)生存力，通过流式细胞术的Fixable Viability Dye(AmCyan,BioLegend)。

(D)有丝分裂标记物ki67的细胞内染色。

(E)转录/激活标记物EOMES的细胞内染色。

实验A至E代表至少两个独立实验，每个实验一式三份地进行。条代表SD。所有的测试都是双侧的。

图10：PD-1-CD28融合蛋白(PD-1跨膜结构域、PTM融合蛋白(SEQID NO：13(核酸(cDNA))和14(蛋白质))转导的CD4+T细胞的体外表型特征

(A)IL-17表达通过抗IL17染色(FITC，克隆TC11-18H10.1，BioLegend)评估并通过流式细胞术测量。

(B)FoxP3表达通过抗FoxP3染色(PE，克隆150D，BioLegend)评估并通过流式细胞术测量。

实验A和B代表至少两个独立实验，每个实验一式三份地进行。条代表SD。所有的测试都是双侧的。

图11：PD-1-CD28融合蛋白(PD-1跨膜结构域、PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))和14(蛋白质))转导的T细胞的体外表型表征

抗原(OVA)特异性、预刺激的PTM(如SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质)所示)转导的或未转导的原代鼠T细胞与PancOVA肿瘤细胞共培养。时间点1是用激动性抗CD3e抗体和重组鼠PD-L1刺激36小时后。时间点2是与PancOVA细胞共培养12小时之后。

(A)活CD8+CD62L-CCR7-细胞的百分比。

(B)活CD8+CD62L+CCR7+细胞的百分比。

(C)活CD4+CD62L-CCR7-细胞的百分比。

(D)活CD4+CD62L+CCR7+细胞的百分比。

(E)活CD8+CD69+细胞的百分比。

(F)活CD4+CD69+细胞的百分比。

(G)活CD8+PD1+细胞的百分比。

在实验A至G中，通过流式细胞术测定所有值，并且值代表至少两个独立实验，每个实验一式三份地进行。条代表SD。所有的测试都是双侧的。

图12：在EG7-PD-L1肿瘤模型中PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞体内疗效

14只小鼠皮下注射EG7-PD-L1细胞。一旦建立肿瘤，分别将6只、3只和5只小鼠随机分为未处理(PBS)、未转导的OT-1T细胞的过继转移和PTM-蛋白转导的OT-1T细胞的过继转移的组。这些图代表3个独立实验，每组3至6只小鼠。(A)每2至3天以盲法方式测量肿瘤大小。(B)来自图12A的实验的生存曲线。(C)与肿瘤未治疗的野生型小鼠(n＝2)同时用EG7-PD-L1细胞再攻击存活的小鼠(n＝2)。

使用对数秩检验进行生存分析。使用对多重检验校正的肿瘤生长two-way ANOVA进行比较。所有的测试都是双侧的。

以下实施例说明了本发明

说明性地，在以下实施例1至3和5中，用PD-1多肽和CD28多肽的鼠序列构建融合蛋白。实施例4涉及含有PD-1多肽的人PD-1-CD28融合蛋白(SEQ ID NO：23(核酸(cDNA))；24(蛋白质)的功能分析，所述PD-1多肽通过其C末端有效地连接/融合至人CD28多肽胞内结构域(SEQ ID NO：21(核酸(cDNA))；22(蛋白质))的N-末端，其中PD-1多肽包含PD-1的胞外结构域(SEQ ID NO：17(cDNA)，18(蛋白质))和PD-1的跨膜结构域(SEQ ID NO：19(cDNA)，20(蛋白质)，如SEQ ID NO:15(核酸)和16(蛋白质)所示。如实施例4中制备的PD-1-CD28融合蛋白具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列(由SEQ ID NO：23所示的cDNA编码)。

实施例1：PD-1-CD28融合蛋白的产生

实施例1.1鼠PD-1-CD28融合蛋白PTM(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))和14(蛋白质)、CTM(SEQ ID NO：43(核酸(cDNA))和44(蛋白质))、CEX(SEQ ID NO：49(核酸(cDNA))和50(蛋白质))、PTM-FMNM(SEQ ID NO：51(核酸(cDNA))和52(蛋白质))、PTM-AYAA(SEQ ID NO：53(核酸(cDNA))；54(蛋白质))和PTM-FMNM-AYAA(SEQ ID NO：55(核酸(cDNA))；56(蛋白质))

通过重叠延伸PCR和重组表达克隆入逆转录病毒pMP71载体(Schambach等人，MolTher 2(5)(2000)，435-45；EP-B1 0 955 374)产生PD-1-CD28融合蛋白。扩增通过三步完成：首先，用与CD28胞内结构域部分重叠的(5′-ATAGCGGCCG CGCCACCATG TGGGTCCGG-3′(SEQ ID NO：59)；5′-CCTTCTACTA TTGCAGAAGA CAG-3′(SEQ ID NO：60))扩增PD-1-胞外结构域和跨膜结构域。同时，用与PD-1-跨膜结构域部分重叠的(5′-CTGTCTTCTG CAATAGTAGAAGG-3′(SEQ ID NO：61)；5′-TATGAATTCT CAGGGGCGGT ACGCTGCA-3′(SEQ ID NO：62))扩增CD28胞内结构域。在第三个反应步骤中，将二产物用作模板使用5′-PD-1-引物(5′-ATAGCGGCCG CGCCACCATG TGGGTCCGG-3′(SEQ ID NO：63)和3′-CD28引物(5′-TATGAATTCTCAGGGGCGGT ACGCTGCA-3′(SEQ ID NO：64))扩增。扩增后，使用EcoRI和NotI限制酶切割和DNA连接将插入片段连接到pMP71载体中。

所得的鼠PD-1跨膜融合蛋白(PTM；SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))和14(蛋白质))由鼠PD-1(mPD-1)(Uniprot Entry Q02242(登录号具有版本号：125和序列版本1)氨基酸(AA)1-190；SEQ ID NO：5(核酸(cDNA))和6(蛋白质))和鼠CD28(mCD28)(Uniprot Entry No：P31041(登录号具有版本号：127和序列版本2)AA178-218；SEQ ID NO：11(核酸(cDNA))和12(蛋白质))组成。

所得的鼠CD28-跨膜融合蛋白(CTM(SEQ ID NO：43(核酸(cDNA))和44(蛋白质))由鼠PD-1(AA1-169；SEQ ID NO：39(核酸cDNA))和SEQ ID NO：40(蛋白质))和鼠CD28(AA 151-218(SEQ ID NO：41(核酸(cDNA))和42(蛋白质))组成。

得到的鼠CD28胞外和跨膜融合蛋白(CEX(SEQ ID NO：49(核酸(cDNA))和SEQ IDNO：50(蛋白质))由鼠PD-1(AA 1-169(SEQ ID NO:45(核酸(cDNA))和SEQ ID NO:46(蛋白质))和鼠CD28(AA 115-218(SEQ ID NO:47(核酸(cDNA))和SEQ ID NO:48(蛋白质))组成。

通过如下的点突变从PTM融合受体(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))产生鼠PTM变体：YMNM(AA 189-192；SEQ ID NO:29)至FMNM(SEQ ID NO:31)的突变产生构建体PTM-FMNM(SEQ ID NO:51(核酸(cDNA))；52(蛋白质))；PYAP(AA 206-209；SEQ ID NO:30))至AYAA(SEQ ID NO:32)的突变产生构建体PTM-AYAA(SEQ ID NO:53(核酸(cDNA))；54(蛋白质))；和双突变体PTM-FMNM-AYAA(SEQ ID NO:55(核酸(cDNA))；56(蛋白质))。通过使用野生型构建体的定点诱变、使用Gene Art定点诱变试剂盒(Life Technologies)交换一个(YMNM(SEQ ID NO:29)至FMNM(SEQ ID NO:31))或两个(PYAP(SEQ ID NO:30)至AYAA(SEQID NO:32))碱基对生成鼠PTM融合蛋白的变体。

实施例1.2 PD-1-缺失突变体(SEQ ID NO：57(核酸(cDNA))和58(蛋白质))

先前Okazaki T等人,Proc Natl Acad Sci USA 98(24)(2001),13866-13871已经描述了PD-1缺失突变体。PD-1缺失突变体含有如SEQ ID NO：57(核酸(cDNA))和58(蛋白质)所示的序列。

实施例2：T细胞的转导和细胞毒性杀伤测定

2.1细胞系

先前已经描述了鼠胰腺癌细胞系Panc02及其卵白蛋白转染的对应物Panc02-OVA(Jacobs等人,Int J Cancer 128(4)(2011),897-907)。通过将致癌物Methycholantren A注射到野生型C57Bl/6小鼠的胰腺中以诱导致癌作用而产生Panc02细胞系。通过用含有全长鼠PD-L1(SEQ ID NO:29(核酸(cDNA))和30(蛋白质))的pMXs-puro(Kitamura等人,Exp.Hematol.31(2003),1007-1014)转导并用终浓度为10μg/ml的嘌呤霉素选择产生Panc02-OVA-PD-L1和Panc02-PD-L1。包装细胞系Plat-E先前已被Morita等人,Gene Ther 7(2000),1063-6)描述。将所有细胞在含有10％胎牛血清(FBS，Life Technologies，USA)、1％青霉素和链霉素(PS)和1％L-谷氨酰胺(均来自德国PAA)的DMEM中培养。将10μg/ml嘌呤霉素和1μg/ml杀稻瘟素(Sigma，德国)加入到Plat-E(Platinum-E)培养基中。在含有10％FBS、1％PS和1％L谷氨酰胺的RPMI 1640中培养原代鼠T细胞(参见以下2.5节的培养)，将1％丙酮酸钠、1mM HEPES和50μMβ-巯基乙醇加入到T细胞培养基中。

2.2动物

从美国Jackson实验室获得卵白蛋白特异性T细胞受体(OT-1)转基因的小鼠(库存号003831)，并且在无特定病原体(SPF)条件下在我们的动物设施中饲养。将OT-1小鼠与CD45.1同源标记小鼠(获自Jackson实验室，库存号002014)和CD90.1同源标记小鼠(库存号：000406)杂交以分别产生CD45.1-OT-1和CD90.1-OT-1。野生型C57Bl/6小鼠购自法国Janvier。通过皮下注射2x 10⁶个肿瘤细胞诱导肿瘤，并通过静脉注射如所示的T细胞治疗小鼠。对于再攻击实验，在与小鼠之前排斥(rejected)肿瘤的位点相对的胁腹侧皮下注射0.5x 10⁶个细胞。所有实验随机和盲法进行。对于中和实验，以200μg的剂量腹腔内应用抗IFN-γ抗体R4-6A2(BioXcell，USA)或同种型对照(BioXcell，USA)，每只动物每三天一次，持续四个剂量。每隔一天监测小鼠的肿瘤生长和状况。

2.4 T细胞转导

使用逆转录病毒载体pMP71(Schambach等人,Mol Ther 2(5)(2000),435-45；EP-B1 0 955 374)转染营养缺陷型(ecotrophic)包装细胞系Plat-E(Platinum-E)。根据Leisegang等人,J Mol Med 86(2008),573-83；Mueller等人,J Virol.86(2012),10866-10869；Kobold等人,JNatl Cancer Inst(2014)(正在出版)所述的方法进行转导。简言之，将包装细胞系Plat E(如Morita等人,Gene Ther 7(2000),1063-6所述)接种在6孔板中并过夜生长至70-80％汇合。在第一天，将16μg DNA与100mM CaCl2(Merck，德国)和126.7μMChloroquin(Sigma，USA)一起混合。Plat-E细胞在低血清培养基(3％)中饥饿30分钟，然后与沉淀的DNA孵育6小时。然后除去培养基并交换培养基。在第二天，从C57Bl/6小鼠(Harlan实验室，The Netherlands)收获原代脾细胞。在T细胞培养基中用抗CD3(克隆145-2c11BDPharmingen，美国)、抗CD28(克隆37.51，BD Pharmingen，USA)和重组鼠IL-2(Peprotech，德国)过夜刺激脾细胞的单细胞悬液。在第3天，在室温下用12.5μg/ml重组纤维连接蛋白(retronectin)(Takara Biotech，日本)包被24孔板2小时，用2％牛血清白蛋白(Roth，德国)在37℃封闭30分钟并用PBS洗涤。收获Plat E的上清液并通过过滤器(40μm，Milipore，USA)。然后将新鲜T细胞培养基加入Plat E细胞中。将1ml过滤的上清液分配到每个孔中，并在4℃下涡旋(spinoculate)2小时。然后从24孔板上移除上清液。将10⁶个T细胞接种于每孔补充有10U IL-2和400000抗CD3和抗CD28珠(Invitrogen，德国)的1ml T细胞培养基中，在32℃以800g涡旋30分钟。在第四天，再次收获Plat E上清液并过滤。将1ml加入到24孔板的每个孔中，并在32℃下以800g涡旋90分钟。随后将细胞在37℃再孵育6小时。用含有IL-2的T细胞培养基代替1ml上清液。第五天，收获细胞、计数并在补充有10ng IL-15/ml(Peprotech，德国)的T细胞培养基中以10⁶个细胞/ml密度再接种。将T细胞保持在该密度直到第10天，进行细胞分析或功能测定。

2.5 T细胞和肿瘤细胞的共培养

在存在或不存在抗PD-1阻断抗体(10μg/ml，克隆RPM1-14，Biolegend)或抗小鼠H2kb SIINFEKL抗体(20μg/ml，克隆25.D1-16，Miltenyi Biotech，德国)的情况下，将T细胞和肿瘤细胞以10：1的比率共培养48小时。通过ELISA(BD)分析上清液中的IFN-γ。

实施例3：细胞因子释放、T细胞增殖和杀伤测定

3.1功能性T细胞测定

用抗CD3e抗体(100ng/ml，克隆145-2C11，eBioscience)、抗CD28抗体(2μg/ml，克隆37.51，eBioscience)或重组PD-L1Fc嵌合体(5μg/ml，R&D Systems)或这些的组合刺激T细胞48小时。通过ELISA(IL-2和IFN-γ，均为BD；目录号分别为DY402和DY485)定量在上清液中的细胞因子或通过免疫印迹(来自R&D的鼠细胞因子阵列；目录号：ARY006)定性检测。对于增殖测定，如上所述在所述的染色前刺激细胞24小时。通过添加计数珠(LifeTechnologies，德国；目录号；C36950)计数细胞并随后通过流式细胞术进行分析。对于杀伤测定，如上所述，用抗CD3e抗体和重组PD-L1(R&D，目录号：1019-B7-100)刺激用融合蛋白转化的300.000个T细胞40小时。同时，将Panc-OVA-肿瘤细胞以8孔板每孔15000个的密度接种并过夜生长。16小时后，将刺激的T细胞加入到含有肿瘤细胞的孔中，使用ICELLigence仪器(ACEA Bioscience，USA)通过阻抗测量连续监测细胞数。

3.2人T细胞的刺激

用人PTM(hPTM)融合蛋白(SEQ ID NO：23(核酸(cDNA))和24(蛋白质))逆转录病毒转导人CD3⁺PBMC，并使用IL-2(Peprotech)和IL-15(Peprotech)扩充4天。进行刺激测定，测定T细胞刺激。因此，将平底96孔板用含有0.1μg/ml抗人CD3抗体(克隆：HIT3a；eBioscience)、或0.1μg/ml抗人CD3抗体和5μg/ml重组人Fc B7-H1嵌合体(R&D)、或0.1μg/ml抗人CD3抗体和2μg/ml抗人CD28抗体(克隆：cd28.2；eBioscience)的PBS在4℃过夜包被。将每孔3.0x 10⁵个转导细胞置于包被的96孔板中。在37℃、5％CO₂孵育48小时后，收集细胞上清液。根据制造商指导，使用人IFN-γ-ELISA(BD Bioscience)对人IFN-γ释放进行定量。

3.3脾细胞的再刺激

将来自肿瘤排斥之后的小鼠或对照小鼠的脾细胞孵育4小时(ICS)，1μg/ml的肽SIINFEKL(SEQ ID NO：65)、TRP2或P15E(均来自JPT Peptides，德国)，然后通过流式细胞术分析。通过计算活性与对照肽TRP2的刺激比率进行背景归一化：用下式计算：来自靶标条件的CD8+IFNγ+细胞％/TRP2条件的CD8+IFNγ+％。

3.4流式细胞术

BD FACS Canto II(BD bioscience，德国)中的多色流式细胞术使用以下抗体组：对于过继转移的OT-1T细胞的分析，抗PD-1(PE-Cy7，克隆29F.1A12)和抗CD8(APC，克隆53.6-7，均来自Biolegend，USA)；对于p-Akt分析，抗小鼠CD8a(Pacific Blue,克隆53-6.7)和抗小鼠PD-1(PeCy7,克隆29F.1A12,均来自Biolegend,USA)，随后使用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience，USA)进行固定和透化，使用抗-Akt(pS473)(AlexaFluor 647，克隆M89-61，eBioscience)染色。对于ki67和增殖分析，细胞用Fixable Viability Dye(eFluorTM 780，eBioscience)、抗小鼠CD8a和抗小鼠PD-1(APC克隆29F.1A12，Biolegend)染色，随后固定和透化。用抗Ki67(PE，克隆16A8，Biolegend)进行胞内染色后，洗涤细胞并重悬于含有Count Bright Absolute计数珠(Life Technologies)的PBS中。为了跟踪实验，将细胞用抗小鼠CD8a(APC-Cy7，克隆53-6.7，Biolegend)、抗小鼠CD45.1(APC，克隆A20，eBioscience)或抗小鼠CD90.1(PeCy7或Pacific BlueTM，Biolegend克隆OX7)染色。对于共同追踪实验，计算CD45.1和CD90.1细胞之间的比率。将细胞固定/透化并用抗小鼠IFN-γ抗体(FITC，克隆XMG1.2，Biolegend)胞内染色。对于体外再刺激，将细胞用抗CD3e-APC(克隆145-2C11，Biolegend)、抗CD8-PerCP(克隆53-6.7，Biolegend)和抗-IFN-γ-FITC(克隆XMG1.2，Biolegend)抗体染色。对于PD-L1结合能力，将细胞与5μg/ml重组PD-L1-Fc(R&D)孵育并用抗人IgG-APC抗体(克隆HP6017，Biolegend)染色。对于PD-L1表达分析，如所述用重组IFN-λ(Peprotech，德国)刺激肿瘤细胞48小时。细胞用抗PD-L1-APC抗体(克隆10F.9G2，Biolegend)染色。使用抗CD45(PacBlue，克隆30F11，Biolegend)、抗CD11b(Percp-Cy5.5，克隆M1/70，Biolegend)、抗Ly6(APC-Cy7，HK1.4,Biolegend)和抗Gr1(FITC,克隆RB6-8C5,Biolegend)进行髓源性抑制细胞染色。通过抗CD4(APC-Cy7，克隆GK1.5，Biolegend)、抗CD8(Percp，53-6.7，Biolegend)抗体和胞内Foxp3染色(eFluor450，克隆FJK-16s，eBioscience)检测调节性T细胞。

3.5统计分析

对于统计，使用GraphPad Prism软件版本5.0b。所有报告的变量是连续的。使用非配对双侧学生t检验分析实验条件之间的差异。为了比较个体小鼠的实验条件，使用Mann-Whitney检验。p值<0.05被认为是显著的。对于体内实验，使用two-way ANOVA分析组间差异，并通过Bonferroni方法进行多重检验的校正。

总生存率通过对数秩检验分析。存活定义为从肿瘤诱导直至自然死亡或直到小鼠因达到以下预定义标准之一安乐死的天数：肿瘤大小>225mm²，体重减轻>15％或严重痛苦。如所示，数据显示为最少三个生物学重复或独立实验的平均值±SEM。

3.6结果

3.6.1新的PD-1-CD28融合受体的基本原理和设计

在携带建立的表达OVA的Panc02(Panc02-OVA)肿瘤的小鼠中评估过继转移OVA特异性CD8⁺T细胞的功效。转移的T细胞在大多数动物中不能排斥肿瘤。这与在转移的浸润肿瘤的T细胞上PD-1的上调平行(图5A和5B)。鉴于Panc02-OVA细胞表达PD-1的配体(PD-L1)，其被IFN-γ上调(图5C和5D)，这表明PD-1-PD-L1轴在抑制肿瘤中抗原特异性T细胞应答中的相关作用。不受理论束缚，假设转移的T细胞对免受PD-1介导的抑制的保护可以增强过继性T细胞疗法的功效。因为PD-1是CD28/CTLA-4家族的成员，受体信号传导似乎可能是相容的，并且融合PD-1-CD28受体构建体可以使通过PD-L1的PD-1衔接(engagement)转变为CD28共刺激活性(图5E中的方案)。因此，设计了由PD-1的胞外和跨膜部分与CD28胞内结构域组成的融合受体，用于在原代鼠T细胞中进行转导。

3.6.2转导的T细胞的体外功能分析

为了测试鼠PD-1-跨膜PD-1-CD28融合蛋白(PTM，SEQ ID NO：13(cDNA)和14(蛋白质))的功能，转导原代鼠T细胞并用激动性抗CD3抗体和重组PD-L1(SEQ ID NO：29和30)刺激。与未转导的T细胞相比，PTM转导的T细胞显示显著增加的IFN-γ(170+/-26vs 0.5+/-0.5ng/ml，p＝0.003，图1A)和IL-2诱导(图6F)。用抗CD28抗体另外的刺激进一步增强了细胞因子的产生(图7A)。细胞因子诱导与PD-L1衔接后下游的AKT磷酸化平行(图1B)，证明了转导的T细胞中的CD28信号传导。与未转导的T细胞相比，PTM受体的激活统计学上显著增加活细胞数(42+/-4vs 6+/-1个细胞每珠，p＝0.001，图1C)。细胞数的这种增加与转导的T细胞的强ki67上调相关(图1D)，表明强的有丝分裂活性。当将PTM转导的OT-1T细胞与Panc02-OVA或Panc02细胞共培养时，观察到强的共刺激活性，如与未转导的T细胞相比转导的T细胞中IFN-γ释放所证实(545+/-37vs 191+/-0.5ng/ml，p<0.001，图1E)。鼠PTM融合蛋白的共刺激活性取决于PD-L1的存在、肿瘤细胞的OVA表达和TCR衔接，如通过MHC-I阻断(图1E)和通过与OVA阴性Panc02-PD-L1细胞共培养所证实(图7B)。抗CD3抗体和PD-L1预刺激的PTM受体转导的T细胞介导肿瘤细胞的即时和完全裂解，而未转导的T细胞无效(图1F，从22小时，p<0.001)。总之，这些发现表明，用鼠PTM融合蛋白转导的T细胞已经对PD-1-PD-L1介导的无反应性具有抗性。这些结果表明鼠PD-1-CD28融合蛋白(PTM，SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))受体在体外的功能和治疗潜力。

3.6.3不同PD-1-CD28融合构建体的功能比较

已经描述了两种PD-1-CD28融合蛋白具有高达两倍的细胞因子诱导，很少的增殖活性和一些细胞裂解潜力(Ankri等人,J.Immunol 191(8)(2013),4121-4129and Prosser等人,Mol.Immunol.51(3-4)(2012),263-272)。考虑到用鼠PTM融合蛋白观察到的强作用，分析了与我们结果的差异是否与PD-1-CD28融合蛋白(PTM)的结构相关。因此，生成了PD-1-CD28融合受体构建体的另外的融合蛋白，其含有(鼠)CD28跨膜结构域(CTM，SEQ ID NO：43(核酸(cDNA))；44(蛋白质))或CD28跨膜结构域加上CD28胞外结构域(CEX，SEQ ID NO：49(核酸(cDNA))；50(蛋白质))的部分；见图2A。当用抗CD3抗体和重组PD-L1刺激时，如通过IFN-γ释放(79+/-0.9vs 4+/-1vs 7+/-2ng/ml，p<0.001，图2B)和通过诱导增殖(540+/-45vs 278+/-37vs 279+/-46个细胞每珠，分别为p＝0.01和0.02，图2C)所评估，所有受体都是功能性的。然而，就IFN-γ分泌和增殖两方面而言，PTM融合蛋白远优于CTM和CEX受体。从机理上看，增强的活性与增强的PD-L1与PTM融合蛋白的结合相平行，与CTM和CEX融合蛋白相反(MFI 9315+/-165vs 2311+/-144vs 2997+/-167,p<0.001,图2D)。增强的PTM融合蛋白的结合只能部分地由该构建体增加的表面表达来解释，因为通过流式细胞术在CD8-T细胞上的表达对于所有融合蛋白来说都不很优越(图2E)。与其它融合蛋白CEX和CTM相比，增强的PTM融合蛋白的结合可能是其明显优越的功能活性的原因。

3.6.4 PTM融合蛋白功能所需的功能结构域

为了进一步剖析PTM活性的机理，我们生成了突变PD-1-CD28PTM融合蛋白，其中CD28的信号传导结构域变得无功能。胞内CD28结构域的YMNM基序是在CD28激活后最佳细胞因子分泌所需的，并且PYAP基序对于细胞因子产生和细胞增殖活性都是必需的(Boomer和Green,Cold Spring Harb Perspect Biol 8(2010),a002436)。我们生成了PTM-FMNM突变构建体(SEQ ID NO：51(核酸(cDNA))；52(蛋白质))、PTM-AYAA突变构建体(SEQ ID NO：53(核酸(cDNA)；54(蛋白质))和PTM-FMNM-AYAA双突变构建体(SEQ ID NO：55(核酸(cDNA))；56(蛋白质))，用于在原代鼠T细胞中表达(图3A)。用抗CD3抗体和重组PD-L1刺激表达PTM构建体或三种突变构建体之一的T细胞。PTM融合构建体转导的T细胞比PTM-FMNM、PTM-AYAA或PTM-FMNM-AYAA产生统计学上显著更多的IFN-γ(22+/-2vs 8+/-1vs 1+/-0.07vs 0.1+/-0.05ng/ml,p<0.001,图3B)。PTM融合构建体衔接以PYAP依赖性方式诱导增殖，而YMNM对于增殖作用不是必要的(图3C)。相比之下，由PTM融合构建体衔接导致的各种细胞因子和趋化因子的产生似乎依赖于两个基序，因为与天然PTM融合蛋白相比，突变构建体是较弱的诱导子(图3D)。

3.6.5 PD-1-CD28融合蛋白转导的OT-1T细胞在鼠胰腺癌模型中的疗效

为了进一步评估鼠PD-1-CD28(PTM；SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))融合蛋白转导的抗原特异性T细胞的效力，我们用未转导的OT-1T细胞或PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞治疗携带皮下Panc02-OVA肿瘤的小鼠。与接受未转导的T细胞的小鼠相比，PTM受体转导的T细胞诱导优异的抗肿瘤免疫性(图4A)。有趣的是，PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞在强过表达PD-L1的Panc02-OVA-PD-L1模型中保留其治疗潜力，而未转导的OT-1细胞的作用几乎完全消除(图7C)。当用Panc02-OVA细胞再攻击时，与对照小鼠的0％相比，先前用PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞治疗的12只小鼠中的11只保持无肿瘤(p<0.001，图4B)。此外，当用野生型Panc02细胞再攻击时，先前用PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞治疗的11只小鼠中的9只保持无肿瘤(p<0.001，图4C)。这些结果提示在治愈的小鼠中表位扩散导致针对其它Panc02特异性肿瘤相关抗原如p15E(Bauer等人,Gut 56(9)(2007),1275-1282)的免疫。因此，分析无肿瘤小鼠的淋巴结中SIINFEKL(OVA；SEQ ID NO：65))和p15E(gp70)特异性CD8+T细胞的存在。发现在转导的T细胞转移后的小鼠中，与对照肽特异性的CTL相比，SIINFEKL特异性的CTL细胞数统计学上显著增加(13+/-3vs 1+/-0,p＝0.008,图4D)。我们还检测到了p15E特异性CTL的小的但统计学上显著的增加(3+/-1vs 1+/-0,p＝0.008,图4D)。如下所示，所获得的免疫是可转移的：过继转移来自治愈小鼠的脾细胞的9只小鼠中有3只产生肿瘤保护，并延迟肿瘤生长，相比之下转移未治疗脾细胞的3只小鼠中没有一只产生肿瘤保护(图4E)。

3.6.6过继转移的T细胞在携带肿瘤的小鼠中的分布

为了区分PTM融合蛋白转导的与未转导的OT-1T细胞的疗效是否归因于PTM融合蛋白中CD28结构域的存在或仅归因于T细胞表面上非信号传导的PD-1的表达，我们表达了PD-1缺失突变体，其不含PD-1的胞内部分(PD-1del，SEQ ID NO：57(核酸(cDNA))；58(蛋白质))。与未转导的OT-1T细胞相比，注射PD-1del转导的OT-1T细胞在Panc02-OVA模型中没有改善疗效，这与注射PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞不同(图5A)。这些结果表明依赖于PTM融合蛋白的胞内CD28结构域。我们接下来研究PTM融合蛋白(SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))转导的与未转导的OT-1T细胞在携带肿瘤的小鼠中的命运。与未转导的T细胞相比，PTM融合蛋白转导的T细胞显示在Panc02-OVA肿瘤中富集(59+/-2vs.49+/-1％,p＝0.002)。在不携带肿瘤的小鼠的淋巴结或器官中没有观察到这种效应(图5B)。此外，PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞在肿瘤中比在其它器官或不携带肿瘤的小鼠中产生比未转导的OT-1T细胞统计学上显著更多的IFN-γ(PTMIFN-γ+比未转导的IFN-γ+T细胞的比率1.5+/-0.2vs 0.6+/-0.02vs0.9+/-0.03,p＝0.002,图5C)。体内IFN-γ的中和几乎完全消除了PTM转导的OT-1T细胞的治疗影响，表明该细胞因子对于受体功能的重要性(图7D)。为了进一步剖析负责PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞在肿瘤中累积的信号传导基序，我们使用如上所述PTM-FMNM(SEQ ID NO:51(核酸(cDNA))；52(蛋白质))、PTM-AYAA(SEQ ID NO:53(核酸(cDNA))；54(蛋白质))和PTM-FMNM-AYAA(SEQ ID NO:55(核酸(cDNA))；56(蛋白质))突变构建体转导的T细胞，比较其在携带肿瘤的动物中与PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞的命运。PTM融合蛋白转导的T细胞在肿瘤部位的T细胞浸润和持久性似乎依赖于YMNM(SEQ ID NO：29)和PYAP(SEQ ID NO：30)基序，因为发现携带突变体的T细胞比携带野生型受体的T细胞的量较低(图5D)。浸润的PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞的增加使浸润的CD8+T细胞与髓源性抑制细胞(MDSC)的比率偏移，有利于PTM融合蛋白转导的OT-1T细胞(0.7+/-0.1vs.0.1+/-0.03,p<0.001,PTM-CD8+T细胞比MDSC的比率,图5E)。对CD8⁺T细胞与调节性T细胞的比率观察到类似的效果(图7E)。总之，这些发现表明PTM融合蛋白转导的T细胞的过继转移打破平衡，从免疫抑制到产生免疫。

实施例4：生成具有人序列(SEQ ID NO：23(核酸(cDNA)和24(蛋白质))的PD-1-CD28受体

按照上述实施例1.1所述的方法，产生人同系物PD-1-CD28融合蛋白并在NotI和EcoRI消化和连接之后，克隆到pMP71载体中。得到的人PD-1跨膜融合蛋白(hPTM(SEQ IDNO：23(核酸(cDNA))和24(蛋白质))由PD-1胞外(Uniprot Entry No.:Q15116(登录号具有入口版本号138和序列版本3)，AA1-170；SEQ ID NO：17(核酸(cDNA))和18(蛋白质))、人PD-1跨膜序列(Uniprot Entry No:Q15116(登录号具有入口版本号138和序列版本3)，AA 171-191，SEQ ID NO：19(核酸)和20(蛋白质))和人CD28胞内区(Uniprot Entry No.:P10747(登录号具有入口版本：164和序列版本1),AA 180-220,SEQ ID NO:21(核酸(cDNA))和22(蛋白质))组成。

4.1人PD-1-CD28融合蛋白(SEQ ID NO：23(核酸(cDNA))和24(蛋白质))在人T细胞中的功能

原代人T细胞用人PD-1-CD28融合蛋白(hPTM，SEQ ID NO：23(cDNA)和24(蛋白质))转导，并用抗CD3抗体单独或与抗CD28抗体组合或与重组PD-L1(R&D，目录号：156-B7-100)组合刺激。与抗CD3抗体刺激的细胞相比，用抗CD3抗体和PD-L1同时刺激T细胞导致转导的T细胞中IFN-γ的诱导显著增加，但是在未转导的T细胞中无增加。这证明了用人PD-1-CD28融合蛋白转导的T细胞的功能和刺激优势。

实施例5：T细胞的转导和细胞毒性杀伤测定

使用分选的CD4+T细胞群和/或肿瘤细胞系EG7-PD-L1重复实施例3的选择实验。这些实验的材料和方法与实施例2和3中概述的相同，除了下面指出的例外。

5.1细胞系

小鼠胰腺癌细胞系Panc02及其卵白蛋白转染的对应物Panc02-OVA如上文2.1节所述。

肿瘤细胞系EG7-PD-L1基于细胞系EL4。通过9,10-二甲基-1,2-苯并蒽在C57BL小鼠中诱导淋巴瘤产生肿瘤细胞系EL4。基于电穿孔转染携带鸡卵白蛋白(OVA)mRNA和新霉素(G418)抗性基因拷贝的pAc-neo-OVA质粒，导致EL4衍生物E.G7-OVA的建立(Moore MW等人,Cell 54；777-785,1988)。然后通过用含有全长鼠PD-L1SEQ ID NO：29(核酸(cDNA))和30(蛋白质)的pMX-s(Kitamura等人,Exp.Hematol.31(2003),1007-1014)逆转录病毒转导产生EG7-OVA-PDL1，通过随后的基于FACS的细胞分选分选PD-L1阳性细胞(抗PD-L1,APC,克隆10F.9G2,BioLegend)。EG7-PD-L1肿瘤细胞培养在含有10％FBS、1％PS和1％L-谷氨酰胺的RPMI1640中，将1％丙酮酸钠、1mM HEPES和50μMβ-巯基乙醇添加到T细胞培养基中。

5.2动物

卵白蛋白特异性CD8+T细胞受体(OT-1)和卵白蛋白特异性CD4+T细胞受体(OT2)的转基因小鼠从美国Jackson实验室获得，并且在我们的动物设施中在无特定病原体(SPF)条件饲育。野生型C57BL/6小鼠购自法国Janvier。

5.3 CD4+T细胞分选和转导

使用逆转录病毒载体pMP71(Schambach等人,Mol Ther 2(5)(2000),435-45；EPB1 0 955 374)转染营养缺陷型包装细胞系Plat-E(Platinum-E)。根据Leisegang等人,JMol Med 86(2008),573-83；Mueller等人,J Virol.86(2012),10866-10869；Kobold等人,JNatl Cancer Inst(2014)(正在出版)进行转导。简而言之，将包装细胞系Plat-E(如Morita等人,Gene Ther 7(2000),1063-6所述)接种在6孔板中并过夜生长至70-80％汇合。在第一天，将18μgDNA与100mM CaCl₂(Merck，德国)混合在一起。将Plat-E细胞与沉淀的DNA孵育6小时。然后移除培养基并进行培养基交换。在第二天，从C57Bl/6小鼠(HarlanLaboratories，The Netherlands)收获原代脾细胞，并用MACS CD4+(L3T4)T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，德国)分选CD4+T细胞。用抗CD3(克隆145-2c11BD Pharmingen，USA)、抗CD28(克隆37.51，BD Pharmingen，USA)、重组鼠IL-2(Peprotech，德国)和50μMβ-巯基乙醇在T细胞培养基中过夜刺激CD4+T细胞。在第三天，将24孔板用12.5μg/ml重组retronectin(Takara Biotech，日本)在室温包被2小时，用2％牛血清白蛋白(Roth，德国)在37℃封闭30分钟，用PBS洗涤。从Plat-E培养物收获含病毒上清液并通过过滤器(45μm，Millipore，USA)。然后将新鲜T细胞培养基加入到Plat-E细胞中。将1ml过滤的上清液分布在24孔板的每个孔中，并在4℃下涡旋2h。然后从24孔板上移除上清液。将1x 10⁶个T细胞接种于每孔补充有100U IL-2和400,000抗小鼠CD3和抗小鼠CD28珠(Invitrogen，德国)的1mlT细胞培养基中，并在32℃以800x g涡旋30分钟。在第四天，再次收获Platinum-E上清液并过滤。将1ml过滤的上清液加入到24孔板的每个孔中，并在32℃以800x g离心90分钟。随后将细胞在37℃下孵育6小时。随后，收获细胞，计数并在补充有10ng IL-15/ml(Peprotech，德国)和50μMβ-巯基乙醇的T细胞培养基中以1x 10⁶个细胞/ml的密度再接种。将T细胞保持在该密度直到第10天，进行细胞分析或功能测定。

5.4功能性T细胞测定

对于基于抗体的刺激测定，用含有单独的鼠抗-CD3抗体(100ng/ml，克隆145-2C11，eBioscience)或与其抗-CD28抗体(2μg/ml，克隆37.51，eBioscience)或重组PD-L1Fc嵌合体(5μg/ml，R&D Systems)组合的PBS(载体溶液)在4℃下包被12小时制备96孔板。还制备仅含有PBS的孔作为对照。随后，每孔添加300,000个T细胞并孵育36小时。通过添加计数珠(Life Technologies，德国；目录号：C36950)计数细胞，随后通过流式细胞术进行增殖、生存力和表型分析(如下所述)。通过ELISA定量上清液中的细胞因子(对于IL-2和IFN-γ，均为根据制造商说明书的BD)。

对于肿瘤细胞共培养实验中的T细胞增殖和表型分析，如上所述，用鼠抗-CD3e抗体和重组鼠PD-L1以0.3x 10⁶个细胞每孔在先前包被的96孔板中刺激转导的或未转导的CD8+和/或CD4+T细胞(对于分离的CD4+细胞，每孔0.15x 10⁶个细胞)36小时(刺激结束为时间点1)。刺激结束前四小时将每孔0.030x 10⁶个PancOVA肿瘤细胞(在具有分离的CD4+细胞的实验中，每孔0.04x 10⁶个PancOVA细胞)接种在新的96孔板中。在36小时刺激结束时，将含有预刺激T细胞的孔的三分之二体积加入到含有靶肿瘤细胞的孔中并共培养另外12小时(时间点2)。通过加入计数珠(Life Technologies，德国)计数细胞。在时间点1和2通过流式细胞术(如下所述)测定T细胞表型(CD62L，CCR7)和激活标记物(CD69，PD-1)。

对于体外杀伤测定，如上所述用抗CD3e抗体和重组PD-L1Fc嵌合体刺激每孔的转导或未转导的CD8+和/或CD4+T细胞36小时。刺激结束前四小时，如上所述将肿瘤细胞接种在96孔板中。肿瘤细胞的确切数量取决于应用的肿瘤细胞：0.03-0.040x 10⁶个PancOVA和0.02x 10⁶个EG7-PD-L1。刺激后，将含有预刺激T细胞的孔的三分之二体积加入到含有靶肿瘤细胞的孔中。根据应用的肿瘤细胞运行共培养8至18小时(PancOVA肿瘤细胞8小时，EG7-PDL1 18小时)。然后，收集上清液，使用基于LDH的细胞毒性测定(Promega，US)或鼠颗粒酶BELISA(R&D Systems，US)分析T细胞杀伤能力。通过ELISA(IFN-γ，BD)定量上清液中的IFN-γ水平。

对于体内实验，每只小鼠皮下注射200,000个EG7-PD-L1细胞。当肿瘤可触知时，每只小鼠通过尾静脉静脉注射10x 10⁶个PTM转导的T细胞或未转导的OT-1。每2-3天测量一次肿瘤大小，当肿瘤达到最大尺寸225mm2时将小鼠处死。在肿瘤排斥后30天用30,000个肿瘤细胞(每只小鼠，再次皮下注射)再攻击治愈的小鼠和对照动物。

5.5流式细胞术

使用BD FACS Canto II(BD bioscience，德国)进行多色流式细胞术，并使用以下抗体组。

对于基于抗体的刺激测定，用Fixable Viability Dye(AmCyan，BioLegend)、抗小鼠CD4(PacBlue，克隆GK1.5，BioLegend)和抗小鼠PD-1(APC克隆29F.1A12，Biolegend)染色细胞。随后将细胞固定并透化。在用抗Ki67(PE，克隆16A8，Biolegend)和抗EOMES(PeCy7，克隆Dan11mag，eBioscience)进行细胞内染色后，洗涤细胞并重悬于含有Count BrightAbsolute计数珠(Life Technologies，US)的PBS中。或者，在胞内染色过程中包括抗IL17(FITC，克隆TC11-18H10.1，BioLegend)和抗FoxP3(PE，克隆150D，BioLegend)以区分特定的T细胞亚群。

对于表型分型实验，用Fixable Viability Dye(AmCyan，BioLegend)、抗小鼠CD8a(APCCy7，克隆53-6.7，BioLegend)、抗小鼠CD4(PE，克隆GK1.5，BioLegend)、抗小鼠CD62L(PacBlue，克隆MEL-14，BioLegend)、抗小鼠CCR7(PerCP/Cy5.5，克隆4B12，BioLegend)、抗小鼠CD69(PeCy7，克隆H1.2F3，BioLegend)和抗小鼠PD-1(APC克隆29F.1A12，Biolegend)染色细胞。

5.6结果

5.6.1转导的CD4+T细胞的体外功能和表型分析

为了测试鼠PD-1-跨膜PD-1-CD28融合蛋白(PTM，SEQ ID NO：13(cDNA)和14(蛋白质))的功能，转导原代鼠CD4+T细胞并用激动性抗CD3抗体或激动性抗CD3抗体与重组PD-L1(SEQ ID NO：29和30)或抗CD28抗体组合刺激。与未转导的CD4+T细胞相比，PTM转导的CD4+T细胞显示显著增加的IFN-γ(19998vs 291pg/ml,p<0.001,图9A)。与对照相比，PTM受体的激活导致统计学上显著改善的增殖和生存力(对于增殖：151vs 68个细胞/珠(分别为抗CD3抗体和重组PD-L1vs抗CD3抗体)，p<0.001图9B；对于生存力：60％vs 40％(分别为抗CD3抗体和重组PD-L1vs抗CD3抗体)，p<0.001，图9C)。这种细胞数目的增加与强的ki67和eosmesdermin/Tbr2(EOMES)上调相关，表明强的有丝分裂活性和增强的转录/显著的激活状态(分别为图9D和9E)。

PTM受体的激活也与IL-17或FoxP3产生的任何增加无关。PTM转导的CD4+T细胞中IL-17和FoxP3的表达与对照细胞中的相似(分别为图10A和10B)，表明PTM受体的激活不导致表型偏移至T辅助细胞群内的Th17或Treg细胞亚型。

预刺激的PTM转导的T细胞与PancOVA细胞的共培养导致对CD8+(图11A和11B)和CD4+群(图11C和11D)的效应细胞百分比降低和中央记忆T细胞百分比增加。这些结果还可部分解释体内PTM转导的T细胞的有利活性，因为中央记忆T细胞已被描述为相对于效应记忆T细胞具有改善的抗肿瘤效应活性。早期激活标记物CD69的表达在PTM转导的或未转导的CD4+和CD8+T细胞的共培养期间下降(图11E和11F)，而晚期激活标记物PD1的表达增加(图11G)。

5.6.2PD-1-CD28融合蛋白转导的T细胞在鼠胰腺癌模型中的疗效

PD-1-CD28(PTM；SEQ ID NO：13(核酸(cDNA))；14(蛋白质))蛋白转导的抗原特异性T细胞(OT-1T细胞，如实施例2和3中所述)用于治疗皮下携带EG7-PD-L1肿瘤的小鼠。携带相似肿瘤的小鼠用PBS或未转导的OT-1T细胞治疗用作对照。PTM受体转导的T细胞也在该模型中诱导优异的抗肿瘤免疫，因为与对照小鼠(图12A)相比，显著改善生存率(p＝0.03；图12B)。当用EG7-PD-L1细胞再攻击时，与对照的未治疗小鼠相比，先前用PTM转导的治疗的小鼠被有效治愈，并保持无肿瘤(图12C)。

Claims

1.一种融合蛋白，其包含通过其C-末端有效地连接至CD28多肽的胞内结构域的N-末端的PD-1多肽，其中所述PD-1多肽包含PD-1的胞外结构域和跨膜结构域。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述PD-1多肽包含SEQ ID NO：16的序列或与SEQ ID NO：16相比具有1至10个取代、缺失或插入的序列，并且其特征在于具有PD-L1和/或PD-L2结合活性。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中PD-1的跨膜结构域具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述CD28多肽包含源自具有序列YMNM(SEQ ID NO：29)和/或PYAP(SEQ ID NO：30)的CD28多肽的胞内结构域的序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中所述CD28多肽具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO：24组成。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有

(a)PD-1多肽，其包含与SEQ ID NO：18相比具有1至10个取代、缺失或插入的序列，和其特征在于具有PD-L1和/或PD-L2结合活性；

(b)PD-1的跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列；和

8.编码根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白的核酸分子。

9.根据权利要求8所述的核酸分子，其进一步编码第二多肽。

10.一种组合物，其包含权利要求8所述的核酸分子的第一核酸分子和编码第二多肽的第二核酸分子。

11.根据权利要求9所述的核酸分子或根据权利要求10所述的组合物，其中所述第二多肽是嵌合抗原受体、α/βT细胞受体、天然T细胞受体、抗CD3T细胞衔接子或T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)。

12.一种载体，其包含权利要求8至9和11中任一项所述的核酸分子。

13.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子包含在第一载体和第二载体中。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述第一和第二载体是相同或不同的载体。

15.一种转导细胞，其包含权利要求8、9和11中任一项所述的核酸；权利要求10、11、13和14中任一项所述的组合物；或权利要求12所述的载体。

16.一种转导细胞，其表达由权利要求8所述的核酸分子编码的融合蛋白。

17.一种表达融合蛋白和第二多肽的转导细胞，所述细胞包含权利要求9或11所述的核酸分子；权利要求10、11、13和14中任一项所述的组合物；或权利要求12所述的载体。

18.一种生产表达权利要求1至7中任一项所定义的融合蛋白的转导细胞的方法，其包括以下步骤：

(a)用权利要求12所述的载体或权利要求13或14所述的组合物转导细胞；

(b)在允许融合蛋白在所述转导细胞中或细胞上表达的条件下培养所述转导细胞；和

(c)从培养物中回收转导细胞。

19.一种表达由权利要求8所述的核酸分子编码的融合蛋白的转导细胞，其可通过权利要求18的方法获得。

20.一种药物组合物，其包含表达由权利要求8、9和11中任一项所述的核酸分子编码的融合蛋白的转导细胞、权利要求15至17和19中任一项所述的转导细胞、或由权利要求18所述的方法产生的转导细胞。

21.表达由权利要求8、9和11中任一项所述的核酸分子编码的融合蛋白的转导细胞、权利要求15至17和19中任一项所述的转导细胞或由权利要求18所述的方法产生的转导细胞，用于治疗肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌、肾细胞癌、食管癌、神经胶质瘤、尿路上皮癌、成视网膜细胞瘤、乳癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、肝细胞癌、白血病、宫颈癌、胆管癌、口腔癌、头颈部癌症或间皮瘤的方法中。

22.一种试剂盒，其包含权利要求8至10中任一项所述的核酸分子、权利要求11所述的载体和/或权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白。