CN117279931A - Prame特异性t细胞受体与嵌合共刺激受体的组合 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对PRAME肽SLLQHLIGL具有特异性的T细胞受体(TCR)与嵌合共刺激受体的组合，所述嵌合共刺激受体包含源自PD‑1(CD279)的胞外结构域和源自4‑1BB(CD137)的胞内结构域。特别地，本发明涉及包含所述TCR和嵌合共刺激蛋白的细胞。此外，本发明涉及编码TCR和共刺激受体的核酸、相应的载体和相应的核酸组合物。此外，本发明涉及相应的药物组合物。因此，本发明还涉及用作药物的细胞和核酸构建体，特别是涉及用于治疗癌症的TCR。

Description

PRAME特异性T细胞受体与嵌合共刺激受体的组合

技术领域

本发明涉及对PRAME肽SLLQHLIGL具有特异性的T细胞受体(TCR)与嵌合共刺激受体的组合，所述嵌合共刺激受体包含源自PD-1(CD279)的胞外结构域和源自4-1BB(CD137)的胞内结构域。特别地，本发明涉及包含所述TCR和嵌合共刺激蛋白的细胞。此外，本发明涉及编码TCR和共刺激受体的核酸、相应的载体和相应的核酸组合物。此外，本发明涉及相应的药物组合物。因此，本发明还涉及用作药物的细胞和核酸构建体，特别是涉及用于治疗癌症的TCR。

背景技术

PRAME是在多种肿瘤，优选黑色素瘤中表达的肿瘤相关抗原。此外，PRAME已被描述为转移(例如葡萄膜黑色素瘤)的独立生物标志物(Fiedl等人,Clin Cancer Res2016March；22(5):1234-1242)和DLBCL的预后标志物(Mitsuhashi等人,Hematology 2014,1/2014)。除睾丸外，它不在正常组织中表达。这种表达模式类似于其他癌症睾丸(CT)抗原，例如MAGE、BAGE和GAGE。然而，与这些其它CT抗原不同，该基因也在急性白血病中表达。编码的蛋白质充当视黄酸受体的阻遏物，并可能通过此功能赋予癌细胞生长优势。选择性剪接导致多种转录变体。还发现三阴性乳腺癌中的PRAME过表达通过诱导上皮间质转化来促进癌细胞运动(Al-Khadairi等人,Journal of Translational Medicine 2019；17:9)。已经在慢性淋巴细胞白血病中报道了PRAME缺失，然而，这与功能无关，因为该基因不在B细胞中表达，并且缺失是生理性免疫球蛋白轻链重排的结果。根据所描述的CT抗原PRAME的特征，它构成了使用TCR导向的基于细胞的免疫疗法治疗不同类型癌症的合适靶标。为此，需要对抗原具有高特异性的TCR，其使细胞产物能够发挥肿瘤清除所需的效应功能，包括细胞因子的释放、细胞毒性和增殖。

利用TCR修饰的T细胞的免疫疗法的成功不仅取决于靶抗原的选择，还取决于具有高抗原特异性和敏感性的TCR的选择。另一个挑战(特别是在实体瘤的治疗中)是免疫抑制性肿瘤微环境(TME)，它会对TCR修饰的T细胞的功效、适应性和持久性产生负面影响。除了抑制性细胞因子和必需代谢因子的缺乏之外，T细胞还面临TME中的抑制性检查点PD-1/PD-L1轴，这会减少T细胞浸润并导致其衰竭。因此，需要新的策略来使TCR修饰的T细胞具有克服抑制性免疫抑制肿瘤微环境的特性。更具体地，需要具有高特异性并具有增强的增殖、细胞因子释放和细胞毒性的靶向PRAME的TCR修饰的T细胞。

发明内容

为了满足这些需要，本发明提供了本发明的高亲合力TCR和嵌合共刺激受体的组合，其允许产生具有增强的细胞因子释放、增殖和细胞毒性的靶向PRAME的高度特异性T细胞。

因此，本发明的一个目的是提供一种细胞，包含

(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和

(B)嵌合共刺激受体，包含

-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

所使用的PRAME特异性TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的PRAME肽。它提供了高功能亲合力和有利的肿瘤细胞识别和杀伤特性。特别地，本发明的TCR比现有技术公开的TCR具有更高的功能亲合力，最好地识别所测试的肿瘤细胞系，并且更有效地裂解PRAME阳性肿瘤细胞。共刺激受体逆转抑制性检查点轴PD-1/PD-L1，以改善T细胞功能，特别是在抑制性TME中。因此，本发明的TCR和嵌合共刺激受体的组合允许以高特异性改善PRAME的靶向以及增强的增殖、细胞因子释放和细胞毒性。

在一些实施方案中，PRAME特异性TCR能够结合SLLQHLIGL的HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09结合形式。与PRAME表位SLLQHLIGL或其部分或其HLA-A2结合形式的结合诱导TCR转导或转染的细胞分泌IFN-γ。

在一些实施方案中，TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。在更具体的实施方案中，TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区。TCR可包含具有与SEQ ID NO:10相同或至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有与SEQ ID NO:11相同或至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

嵌合共刺激受体可以包含源自PD-1的跨膜结构域。在具体实施方案中，嵌合共刺激受体的序列可以包含SEQ ID NO:26的序列。

因此，另一方面涉及一种组合物，包含

-编码PRAME特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述PRAME特异性T细胞受体(TCR)包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和

-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含

-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

此外，一方面涉及一种核酸，包含

-编码PRAME特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述PRAME特异性T细胞受体(TCR)包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和

-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含

-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

另一方面涉及包含核酸的载体，所述核酸包含PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体的序列。还涵盖包含核酸组合物和/或载体的细胞。

通常，细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。在一个具体实施方案中，细胞是T细胞。

其他方面涉及包含本文定义的细胞、组合物、核酸和载体的药物组合物。其他方面涉及用于癌症治疗的本文定义的细胞、组合物、核酸和载体。

附图说明

图1：PD1-41BB的共表达未改变TCR表达水平。

从健康供体中分离出CD8+T细胞，并在IL-7和IL-15的存在下用CD3/CD28抗体激活。用含有T23.8-2.1-027-004(＝TCR)或T23.8-2.1-027-004和PD1-41BB的组合(＝TCR_PD1-41BB)的序列的逆转录病毒颗粒转导激活的细胞。以相同方式制备的未转导的(＝UT)CD8+T细胞用作对照。通过TCR-β链(TRBV09)和PD-1的抗体染色以及随后的流式细胞术分析来确定转基因的转导效率和表达水平。

图2：PD1-41BB的共表达未改变TCR转基因T细胞的功能亲和力。

TCR转基因T细胞群的功能亲合力测量为与负载滴定量的SLLQHLIGL(SLL)肽(10^-5M至10^-10M)的PD-L1转基因T2细胞的共培养物中的IFN-γ释放。半数最大IFN-γ释放作为TCR转基因效应T细胞功能亲和力的量度。左图显示共培养20小时后通过ELISA确定的IFN-γ浓度的绝对值，右图显示相对值的非线性回归曲线。虽然PD1-41BB的共表达增加了TCR转基因T细胞响应于PD-L1阳性靶细胞释放的IFN-γ水平，但共表达未改变T细胞的功能亲和力。

图3：PD1-41BB的共表达未改变HLA-A*02亚型识别。

TCR转导的T细胞与选定HLA-A*02亚等位基因阳性类淋巴母细胞系(LCL；EBV转化的B细胞)以1:1的E:T比例(20.000个T细胞/孔)体外共培养。与用10^-5M SLL-肽脉冲的LCL共培养20小时后，通过ELISA确定IFN-γ浓度。使用和不使用PD1-41BB转导的TCR转基因T细胞以与A*02:01相比相似水平识别由HLA-A*02亚等位基因A*02:02、A*02:04和A*02:09编码的MHC分子呈递的SLL肽。

图4：成功降低潜在肽脱靶毒性的风险。

为了降低潜在脱靶毒性的风险，使用Expitope选择了与SLL肽相比具有最多达4个氨基酸差异的191种部分同源肽(错配(MM)肽)。在使用负载有10^-6M MM肽或SLL肽的PD-L1转基因T2细胞的预筛选共培养物中，鉴定出33种可被TCR转导的T细胞识别的MM肽(数据未示出)。当表位(肽)被PRAME阴性靶细胞系SNB-19的蛋白酶体内源加工时，检查了这33种MM肽诱导TCR转基因效应T细胞释放IFN-γ的潜力。将编码最多达5种MM肽的体外转录(ivt)RNA电穿孔至SNB-19细胞中。在预筛选共培养物中诱导TCR转基因T细胞中最高IFN-γ释放的MM肽(MM01、MM26、MM66)分别作为“midigene”构建体(约400bp)进行测试。所有其它MM肽均作为编码5种MM肽的小基因(minigene)构建体(每种肽约90bp)进行测试。编码SLL肽的midigene构建体用作阳性对照。所有RNA构建体均包含被阳性对照TCR识别的表位。转染的SNB-19细胞与TCR转基因效应T细胞共培养20小时后确定IFN-γ浓度。检测到的IFNγ水平表明无法识别细胞内加工的MM肽。因此，所有MM肽都可以被降低风险，并且不太可能导致潜在的脱靶毒性。此外，PD1-41BB的共表达未改变单独使用TCR所观察到的已识别MM肽的模式。

图5：使用涵盖常见HLA的LCL文库未鉴定出脱靶毒性。

为了评估潜在的脱靶毒性，将具有和不具有PD1-41BB的TCR转导T细胞与由36个类淋巴母细胞系(LCL)组成的文库共培养，该文库涵盖了高加索人群体中最常见的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因。这些LCL表达多种内源性表达的肽，并且由于识别匹配的HLA-A2分子或最常见的其它HLA分子上呈递的内源性肽，有助于鉴定潜在的交叉反应性。与LCL共培养20小时后，通过ELISA确定IFN-γ浓度。负载SLL肽的HLA-A*02:01阳性LCL作为阳性对照。TCR转基因T细胞仅在与LCL#5共培养时才分泌非常低水平的IFN-γ，其中可以通过qPCR证实低水平的PRAME表达。所有其它LCL均未被表达转基因TCR或与PD1-41BB组合的转基因TCR的效应T细胞识别。因此，在此安全模型中未鉴定出脱靶毒性。

图6：使用一组正常细胞未鉴定出脱靶毒性。

通过与多种组织来源的正常细胞共培养，分析了关键健康组织的潜在脱靶识别。作为阳性对照，正常细胞负载有SLL肽。共培养20小时后通过ELISA确定共培养上清液中的IFN-γ浓度。没有观察到健康细胞的脱靶识别。只有PRAME阳性的成熟树突状细胞(DC)触发了TCR转基因T细胞中高于未转导T细胞背景的IFN-γ释放，而成熟DC的祖细胞(单核细胞和未成熟DC)未导致T细胞释放IFN-γ。添加PD1-41BB不会改变表达PRAME特异性TCR的T细胞的安全性。人肾上皮细胞(HREpC)、人肾皮质上皮细胞(HRCEpC)、肾近端小管上皮细胞(RPTEC)、正常人肺成纤维细胞(NHLF)、人成骨细胞(HOB)、单核细胞(Mono)、未成熟DC(iDC)、成熟DC(mDC)、iCell心肌细胞2(iCardio)。

图7：PD1-41BB增强响应于表达PD-L1的肿瘤细胞的IFN-γ特异性释放。

(A)通过实时定量PCR确定肿瘤细胞系中的PRAME-mRNA表达水平，并根据管家基因GUSB进行标准化。(B)具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞与表达不同水平的PRAME和PD-L1的各种适应症的HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系共培养。为了使PD-L1稳定表达，一些肿瘤细胞用PD-L1转导(TD)。此外，通过抗体染色和随后的流式细胞术分析确定，一些细胞系在用IFN-γ处理后表现出可诱导的(ind)PD-L1表达，而其它细胞系在未经IFN-γ处理的情况下已经表现出一定水平的内源性PD-L1表达(end)。未转导的T细胞用作对照。共培养20小时后通过ELISA确定IFN-γ浓度。PD1-41BB的共表达增强了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的IFN-γ释放。

图8：PD1-41BB增强针对3维(3D)肿瘤细胞球体的特异性细胞毒性反应。

将具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞与源自表达不同水平的PRAME和PD-L1的HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系的3维(3D)肿瘤细胞球体共培养。使用Incucyte或设备通过20天内红色荧光的消失来确定针对肿瘤球体的细胞毒性，每4小时记录图像。在第3、7、10、13和16天将新鲜肿瘤细胞球体转移到共培养板中。在反复暴露于肿瘤细胞的攻击性环境中，PD1-41BB的表达对T细胞的效应功能和适应性具有有益作用。在用肿瘤细胞球体的多次攻击过程中，与仅表达转基因TCR的效应T细胞相比，表达PD1-41BB的效应T细胞可以更好地控制肿瘤细胞生长。

图9：PD1-41BB增加响应于表达PD-L1的肿瘤细胞的TCR转基因T细胞增殖。

将具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞与表达不同水平PRAME和PD-L1的HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系以1:1的效应细胞与靶细胞比例共培养。未转导的T细胞用作对照。7天后，根据总细胞计数计算共培养物中T细胞的X倍扩增。PD1-41BB的共表达增强了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的增殖和/或存活。

图10：共表达PD1-41BB的T细胞在体内表现出强烈的抗肿瘤反应性。

将5x10⁶个PD-L1转基因MelA375肿瘤细胞皮下注射到18只免疫缺陷(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)小鼠中。一周后，将小鼠分配到三个治疗组，每组六只小鼠。向小鼠注射10x10⁶个具有(TCR_PD1-41BB)或不具有(TCR)PD1-41BB的TCR阳性细胞(16x10⁶个总细胞)，或等量的未转导T细胞(UT)。每周测量肿瘤体积2-3次。表达PD1-41BB的效应T细胞可以控制体内肿瘤细胞生长，而仅表达转基因TCR的效应T细胞与未转导的T细胞相比几乎没有作用。

具体实施方式

在关于其优选实施方案详细描述本发明之前，提供以下一般定义。

下面示例性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实践。

将关于特定实施方案并参考某些附图来描述本发明，但本发明不限于此而仅受权利要求书的限制。

当本说明书和权利要求中使用术语“包括”时，其不排除其它要素。出于本发明的目的，术语“由......组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括至少一定数量的实施方案，则这也应当理解为公开了优选地仅由这些实施方案组成的组。

出于本发明的目的，术语“获得的”被认为是术语“可获得的”的优选实施方案。如果下文中例如抗体被定义为是从特定来源可获得的，这也应理解为公开从该来源获得的抗体。

当指代单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“a”、“an”或“the”，除非另有明确说明，否则包括该名词的复数形式。在本发明的上下文中，术语“约”或“大约”表示本领域技术人员将理解的准确度区间，以仍然确保所讨论的特征的技术效果。该术语通常表示与所指示的数值的偏差为±10％，并且优选为±5％。

技术术语按照本领域技术人员的常识或含义来使用。如果某些术语表达了特定含义，则下面将在使用这些术语的上下文中给出术语的定义。

TCR背景

TCR由两条不同且独立的蛋白质链组成，即TCR alpha(α)和TCR beta(β)链。TCRα链包含可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRβ链包含可变区(V)、多样性区(D)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRα和TCRβ链二者的重排V(D)J区均包含高变区(CDR，互补决定区)，其中CDR3区决定特异性表位识别。在C末端区域，TCRα链和TCRβ链均含有疏水性跨膜结构域，并以短胞质尾结束。

通常，TCR是一条α链和一条β链的异二聚体。该异二聚体可以与呈递肽的MHC分子结合。

在本发明的上下文中，术语“可变TCRα区”或“TCRα可变链”或“可变结构域”是指TCRα链的可变区。在本发明的上下文中，术语“可变TCRβ区”或“TCRβ可变链”是指TCRβ链的可变区。

TCR基因座和基因使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法命名(IMGT数据库,www.IMGT.org；Giudicelli,V.,等人.IMGT/LIGM-DB,免疫球蛋白和T细胞受体核酸序列的综合性数据库,Nucl.Acids Res.,34,D781-D784(2006).PMID:16381979；T cellReceptor Factsbook,LeFranc和LeFranc,Academic Press ISBN 0-12-441352-8)。

靶标

本文提供的与嵌合共刺激受体组合的TCR有利地能够与源自(人)PRAME(SEQ IDNO:1)的肽结合。因此，所述TCR对如SEQ ID NO:1中所示的PRAME肽具有特异性，也称为PRAME-SLL。在本发明的上下文中，术语“特异性”是指TCR与靶标特异性结合。PRAME(黑色素瘤中优先表达的抗原，Uniprot登录号P78395)，也称为MAPE(肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原)和OIP4(OPA相互作用蛋白4)，被报道为功能未知的癌睾丸抗原(CTA)。PRAME是一种蛋白质编码基因，与黑色素瘤、白血病和慢性骨髓细胞相关。与该基因相关的基因本体论(GO)注释包括视黄酸受体结合。PRAME蛋白作为转录阻遏因子发挥功能，通过视黄酸受体RARA、RARB和RARG抑制视黄酸信号传导。它防止视黄酸诱导的细胞增殖、分化和凋亡的停滞。

特别地，本发明提供了嵌合共刺激受体和TCR的组合，其能够结合包含在如SEQ IDNO:1所示的PRAME氨基酸序列内的肽(参见表1)。术语“能够结合”是指所述肽被所述TCR特异性结合。术语“特异性(地)结合”通常表示与随机、不相关的非靶抗原相比，TCR通过其抗原结合位点更容易与其预期抗原靶标结合。特别地，术语“特异性结合”表示TCR对于其抗原靶标的结合特异性是TCR对于非靶标抗原的结合特异性的至少约5倍、优选10倍、更优选25倍、甚至更优选50倍、最优选100倍或更多。由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的PRAME肽在本文中也称为“抗原靶标”或“SLL肽”。因此，由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的PRAME肽是或包含本发明的TCR的靶向表位。

术语“表位”一般指结合结构域识别的抗原(通常是(多)肽)上的位点。术语“结合结构域”在其最广泛的意义上是指“抗原结合位点”，即表征与抗原靶标上的特定表位结合/相互作用的分子结构域。抗原靶标可包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并且可包含任意数量的表位，具体取决于抗原的大小、构象和类型。术语“表位”一般涵盖线性表位和构象表位。线性表位是包含在氨基酸一级序列中的连续表位并且通常包括至少2个氨基酸或更多。构象表位是由通过折叠靶抗原、特别是靶(聚)肽而并置的非连续氨基酸形成的。

本发明人发现，本发明的TCR识别的最小氨基酸序列对应于PRAME(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。具体地，本发明的TCR已显示出(特异性地)识别包含氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其HLA-A2结合形式或由其组成的氨基酸序列，如所附实施例中所示。这种选择性识别可以通过TCR的识别基序来获得，仅显示几个固定位置。序列SLLQHLIGL(SEQ IDNO:1)的氨基酸LLQ并且尤其是HLI是该识别基序的一部分。

本发明的一个目的是提供一种细胞，包含

(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和

(B)嵌合共刺激受体，包含

-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

TCR特异性序列

因此，本发明的组合中使用的TCR包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；或

在一些实施方案中，TCR包含TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。

如本文所用，“至少80％相同”，特别是“具有与……至少80％相同的氨基酸序列”包括与列出的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

优选使用Vector NTI Advance^TM 10程序(Invitrogen Corporation,CarlsbadCA,USA)的AlignX应用程序来确定多个序列之间的百分比同一性。该程序使用改进的Clustal W算法(Thompson等人,1994.Nucl Acids Res.22:pp.4673-4680；InvitrogenCorporation；Vector NTI Advance^TM 10 DNA和蛋白质序列分子软件.用户手册,2004,pp.389-662)。使用AlignX应用程序的标准参数来进行百分比同一性的确定。

在具体实施方案中，TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区。

从实施例可以看出，根据本发明的TCR对PRAME、特别是PRAME表位SLLQHLIGL(SEQID NO:1)具有特异性，并且对于其他表位或抗原仅表现出非常低的交叉反应性。

在具体实施方案中，本文所述的TCR包含具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

因此，更具体地，在一些实施方案中，TCR可以包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRα区、具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区、具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

在甚至更具体的实施方案中，TCR可以包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

因此，在具体实施方案中，TCR可以包含具有与SEQ ID NO:24相同或至少80％相同的氨基酸序列的TCRα链，和具有与SEQ ID NO:22相同或至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ链。

修饰

在一些实施方案中，TCR和/或嵌合共刺激受体的氨基酸序列可以包含一个或多个表型沉默替换。

“表型沉默替换”也称为“保守氨基酸替换”。“保守氨基酸替换”的概念是本领域技术人员所理解的，并且优选地是指编码带正电的残基(H、K和R)的密码子被编码带正电的残基的密码子替换，编码带负电的残基(D和E)的密码子被编码带负电的残基的密码子替换，编码中性极性残基(C、G、N、Q、S、T和Y)的密码子被编码中性极性残基的密码子替换，编码中性非极性残基(A、F、I、L、M、P、V和W)的密码子被编码中性非极性残基的密码子替换。这些变化可以自发地发生、通过随机诱变引入、或者可以通过定向诱变引入。这些改变可以在不破坏这些多肽的基本特征的情况下进行。普通技术人员可以通过本领域已知的方法容易且常规地筛选变体氨基酸和/或编码它们的核酸以确定这些变体是否显著降低或破坏配体结合能力。

技术人员理解，编码TCR和/或嵌合共刺激受体的核酸也可以被修饰。总体核酸序列中的有用修饰包括序列的密码子优化。可以进行导致所表达的氨基酸序列内的保守替换的改变。这些变异可以在TCR链氨基酸序列的不影响功能的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在CDR3区域进行添加和缺失。

根据本发明的一些实施方案，TCR和/或嵌合共刺激受体的氨基酸序列被修饰以包含可检测标记、治疗剂或药代动力学修饰部分。

可检测标记的非限制性实例是放射性标记、荧光标记、核酸探针、酶和造影剂。可以与TCR缔合的治疗剂包括放射性化合物、免疫调节剂、酶或化疗剂。治疗剂可以被封装在与TCR连接的脂质体中，使得化合物可以在靶位点缓慢释放。这将避免在体内运输过程中受到损害并确保治疗剂(例如毒素)在TCR与相关抗原呈递细胞结合后具有最大效果。治疗剂的其他实例是：

肽细胞毒素，即能够杀死哺乳动物细胞的蛋白质或肽，如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、DNase和RNase。小分子细胞毒剂，即能够杀死哺乳动物细胞的分子量小于700道尔顿的化合物。此类化合物可能含有能够产生细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒性剂还包括前药，即在生理条件下分解或转化以释放细胞毒性剂的化合物。此类药剂可以例如包括多西紫杉醇、吉西他滨、顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、依托泊苷、异环磷酰胺、伊立替康、卟吩姆钠光敏素II、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸三甲曲沙(trimetrexate glucoronate)、米托蒽醌、奥瑞他汀E、长春新碱和多柔比星；放射性核素，例如碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213。放射性核素与TCR或其衍生物的缔合可以例如通过螯合剂进行；免疫刺激剂(immune-stimulator)，也称为免疫刺激剂(immunostimulant)，即刺激免疫反应的免疫效应分子。示例性的免疫刺激剂是细胞因子，例如IL-2和IFN-γ、抗体或其片段，包括抗T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)；具有抗体样结合特性的替代蛋白质支架；超级抗原，即引起T细胞非特异性激活、导致多克隆T细胞激活和大量细胞因子释放的抗原及其突变体；趋化因子如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等补体激活剂；异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。

治疗剂可以优选选自由免疫效应分子、细胞毒性剂和放射性核素组成的组。优选地，免疫效应分子是细胞因子。

药代动力学修饰部分可以是例如至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或其组合。至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团的缔合可以以本领域技术人员已知的多种方式引起。在一个优选的实施方案中，这些单元与TCR共价连接。根据本发明的TCR可以被一种或多种药代动力学修饰部分修饰。特别地，TCR的可溶形式被一种或多种药代动力学修饰部分修饰。药代动力学修饰部分可以实现治疗剂的药代动力学特征的有益改变，例如改善的血浆半衰期、降低或增强的免疫原性以及改善的溶解度。

TCR和/或嵌合共刺激受体可以通过连接额外的功能部分进行修饰，例如，用于降低免疫原性、增加流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)溶解度和/或稳定性(例如通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期的部分。

其它有用的功能部分和修饰包括“自杀”或“安全开关”，其可用于关闭患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞。一个实例是Gargett and Brown Front Pharmacol.2014；5:235描述的诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)“安全开关”。简而言之，通过众所周知的方法修饰效应宿主细胞以表达胱天蛋白酶9结构域，其二聚化依赖于小分子二聚化药物(例如AP1903/CIP)，并导致修饰的效应细胞中快速诱导细胞凋亡。该系统例如在EP2173869(A2)中描述。其它“自杀”“安全开关”的实例是本领域已知的，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、CD20的表达以及随后使用抗CD20抗体或myc标签的消除(Kieback等人,Proc NatlAcad Sci U S A.2008Jan 15；105(2):623-8)。

本文还设想了具有改变的糖基化模式的TCR。如本领域已知的，糖基化模式可以取决于氨基酸序列(例如，特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在，如下所述)和/或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。向结合分子添加N-连接糖基化位点通过改变氨基酸序列来方便地完成，使得其包含选自天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸的一个或多个三肽序列(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)。O-连接糖基化位点可以通过向起始序列添加或替换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来引入。

TCR糖基化的另一种方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶偶联。根据所使用的偶联模式，糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基团，(c)游离巯基基团，例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基基团，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。类似地，去糖基化(即，去除结合分子上存在的碳水化合物部分)可以通过化学方式完成，例如，通过将TCR暴露于三氟甲磺酸，或通过使用内切糖苷酶和外切糖苷酶以酶促方式完成。

还可以想到将药物(例如小分子化合物)添加至TCR，特别是本发明的可溶形式的TCR。连接可以通过共价键或非共价相互作用(例如通过静电力)来实现。可以使用本领域已知的各种接头来形成药物缀合物。

TCR，特别是本发明的可溶形式的TCR可以另外被修饰以引入有助于鉴定、追踪、纯化和/或分离相应分子(标签)的另外的结构域。因此，在一些实施方案中，TCRα链或TCRβ链可以被修饰以包含表位标签。

表位标签是可以并入本发明的TCR中的标签的有用实例。表位标签是氨基酸的短片段，其允许特异性抗体的结合，因此能够鉴定和跟踪可溶性TCR或宿主细胞在患者体内或培养的(宿主)细胞内的结合和运动。表位标签以及因此标记的TCR的检测可以使用多种不同的技术来实现。

通过在对所述标签特异的结合分子(抗体)的存在下培养细胞，标签还可用于刺激和扩增携带本发明TCR的宿主细胞。

一般而言，在一些情况下，可以用各种突变来修饰TCR，这些突变改变了TCR与靶抗原的亲和力和解离率。特别地，突变可以增加亲和力和/或降低解离率。因此，TCR可以在至少一个CDR及其可变结构域框架区中突变。

然而，在优选的实施方案中，TCR的CDR未被修饰或体外亲和力成熟，例如对于实施例中的TCR。这意味着CDR具有天然存在的序列。这可能是有利的，因为体外亲和力成熟可以导致TCR分子的免疫原性。这可能导致抗药物抗体的产生，降低或灭活治疗效果和治疗和/或诱发副作用。

突变可以是一种或多种替换、缺失或插入。这些突变可以通过本领域已知的任何合适的方法引入，例如聚合酶链式反应、基于限制酶的克隆、不依赖于连接的克隆程序，其描述于Sambrook,分子克隆-第4版(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press中的实例中。

理论上，由于内源性和外源性TCR链之间的错配，可能会出现具有交叉反应风险的不可预测的TCR特异性。为了避免TCR序列错配，可以对重组TCR序列进行修饰以含有鼠源化或最小鼠源化Cα和Cβ区域，该技术已被证明有效增强几种不同转导TCR链的正确配对。TCR的鼠源化(即用其鼠类对应物交换人类Cα和Cβ区域)是一种常用于改善宿主细胞中TCR的细胞表面表达的技术。不希望受具体理论的束缚，认为鼠源化TCR与CD3共受体更有效地缔合；和/或优先彼此配对并且不太容易在离体基因修饰的人T细胞上形成混合TCR，以表达具有所需抗原特异性的TCR，但仍保留并表达其“原始”TCR。

已鉴定出负责改进鼠源化TCR表达的九个氨基酸(Sommermeyer and Uckert,JImmunol.2010Jun 1；184(11):6223-31)，并设想将TCRα和/或β链恒定区中的一个或全部氨基酸残基替换为它们的鼠对应物残基。该技术也称为“最小鼠源化”，具有增强细胞表面表达的优点，同时减少氨基酸序列中“外来”氨基酸残基的数量，从而降低了免疫原性的风险。

一些实施方案涉及如本文所述的分离的TCR，其中TCR是单链类型，其中TCRα链和TCRβ链通过接头序列连接。

合适的单链TCR形式包含由对应于可变TCRα区的氨基酸序列构成的第一区段，由融合至对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端的对应于可变TCRβ区的氨基酸序列构成的第二区段，以及将第一区段的C末端连接到第二区段的N末端的接头序列。或者，第一区段可以由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，第二区段可以由融合至对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端的对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成。上述单链TCR还可以在第一链和第二链之间包含二硫键，并且其中接头序列的长度和二硫键的位置使得第一区段和第二区段的可变结构域序列基本上如天然T细胞受体中那样相互定向。更具体地，第一区段可以由融合至对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端的对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成，第二区段可以由融合至对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成，并且可以在第一链和第二链之间提供二硫键。接头序列可以是不损害TCR功能的任何序列。

在本发明的上下文中，“功能性”TCRα和/或β链融合蛋白应指TCR或TCR变体，例如通过氨基酸的添加、缺失或替换进行修饰，其保持至少实质的生物活性。在TCR的α和/或β链的情况下，这应意味着两条链仍然能够形成TCR(与未修饰的α和/或β链或与另一种本发明的融合蛋白α和/或β链)，其发挥其生物学功能，特别是与所述TCR的特定肽-MHC复合物结合，和/或在特定肽:MHC相互作用时的功能性信号转导。

在具体实施方案中，TCR可以被修饰为功能性TCRα和/或β链融合蛋白，其中所述表位标签具有6至15个氨基酸、优选9至11个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，TCR可以被修饰为功能性T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白，其中所述TCRα和/或β链融合蛋白包含两个或更多个间隔开或者直接串联的表位标签。融合蛋白的实施方案可包含2、3、4、5或甚至更多表位标签，只要融合蛋白保持其一种或多种生物活性(“功能性”)。

优选的是根据本发明的功能性TCRα和/或β链融合蛋白，其中所述表位标签选自但不限于CD20或Her2/neu标签，或其它常规标签例如myc-标签、FLAG-标签、T7-标签、HA(血凝素)-标签、His-标签、S-标签、GST-标签或GFP-标签。myc、T7、GST、GFP标签是源自现有分子的表位。相反，FLAG是设计用于高抗原性的合成表位标签(参见例如美国专利号4,703,004和4,851,341)。可以优选使用myc标签，因为高质量的试剂可用于其检测。表位标签当然可以具有一种或多种超出抗体识别范围的附加功能。这些标签的序列描述于文献中且为本领域技术人员所熟知。

嵌合共刺激受体

与PRAME特异性TCR组合使用的嵌合共刺激受体包含

-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

与本文的PRAME特异性TCR组合使用的嵌合共刺激受体可以特别地包含含有源自PD-1(例如人PD-1)的胞外结构域的胞外结构域。在本文中，术语“源自”具体指胞外结构域中所含的多肽分别包含PD-1(例如人PD-1)的至少一部分，优选PD-1的胞外结构域。包含源自PD-1的胞外结构域的嵌合共刺激受体具有对PD-L1、PD-L2或PD-1的其它抑制性配体的结合活性。如本文所用，术语“源自”PD-1还允许与PD-1(例如人PD-1)或其部分(例如胞外结构域)的天然序列相比最多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸被替换、缺失和/或插入。

在一个实施方案中，含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包含SEQ ID NO:28中列出的序列或与SEQ ID NO:28至少80％相同的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包含SEQ ID NO:28中列出的序列。

在本发明的一个实施方案中，嵌合共刺激受体包含含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，与人或鼠PD-1(例如SEQ ID NO:28所示的人PD-1)的胞外结构域的氨基酸序列相比，其包含具有最多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸替换(优选保守或高度保守替换)、缺失和/或插入的氨基酸序列。

本文中与PRAME特异性TCR组合使用的嵌合共刺激受体还包含可操作地连接在胞外结构域和胞内结构域之间的跨膜结构域。通常，跨膜结构域不限于特定的跨膜结构域。优选地，跨膜结构域分别地允许融合蛋白稳定锚定在表达融合蛋白的细胞(例如，T细胞)的膜中，并且进一步允许胞外结构域与PD-L1结合，并且在与PD-L1结合后，允许信号转导至含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

在一个优选的实施方案中，嵌合共刺激受体的跨膜结构域是源自PD-1的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中列出的序列或与SEQ ID NO:30至少80％相同的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中列出的序列。

与本文的PRAME特异性TCR组合使用的嵌合共刺激受体可以特别包含含有源自4-1BB(也称为“41BB”)的多肽、优选4-1BB(例如人4-1BB)的胞内结构域的胞内结构域。在本文中，术语“源自”特别意味着胞内结构域中所含的多肽分别包含4-1BB(例如人4-1BB)的至少一部分，优选4-1BB的胞内结构域。包含源自4-1BB的胞内结构域的嵌合共刺激受体能够在用PD-L1、PD-L2或PD-1的另一种抑制性配体刺激后增加表达所述嵌合共刺激受体的T细胞的增殖速率，和/或与不表达嵌合共刺激受体的相应T细胞相比，能够增强表达所述嵌合共刺激受体的T细胞的效应功能(例如增加的IFN-γ释放和/或增加的细胞毒性)。如本文所用，术语“源自”4-1BB还允许与4-1BB(人或鼠，优选人4-1BB)或其部分(例如胞外结构域)的天然序列相比最多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸被替换、缺失和/或插入。在一个实施方案中，含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包含SEQ ID NO:32中列出的序列或与SEQ ID NO:32至少80％相同的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，含有源自4-1BB的多肽的胞外结构域包含SEQ ID NO:32中列出的序列。

如本文所用，“至少80％相同”，特别是“具有与……至少80％相同的氨基酸序列”包括与列出的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

优选使用Vector NTI Advance^TM 10程序(Invitrogen Corporation,CarlsbadCA,USA)的AlignX应用程序来确定多个序列之间的百分比同一性。该程序使用改进的Clustal W算法(Thompson等人,1994.Nucl Acids Res.22:pp.4673-4680；InvitrogenCorporation；Vector NTI Advance^TM 10DNA和蛋白质序列分析软件.用户手册,2004,pp.389-662)。

核酸、核酸组合物和载体

本发明的另一个方面涉及编码本文所述的PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体的核酸。

编码PRAME特异性TCR的相关区域和结构域的核苷酸序列列于表1中：

表1

编码嵌合共刺激受体的相关区域和结构域的核苷酸序列列于表2中：

表2

“核酸分子”通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或从天然来源获得(例如，分离和/或纯化)的，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间键合，例如氨基磷酸酯键合或硫代磷酸酯键合，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。优选地，本文描述的核酸是重组的。本文使用的术语“重组”是指(i)通过将天然或合成的核酸片段连接至可在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或(ii)由上文(i)中描述的那些的复制产生的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。可以使用本领域已知的或市售(例如来自Genscript,Thermo Fisher等公司)的程序基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见例如Sambrook等人，可以使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子的生物稳定性或增加杂交时形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(参见例如Sambrook等人2001)(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶替换的核苷酸)来化学合成核酸。核酸可包含编码任何重组TCR和/或嵌合共刺激受体、多肽或蛋白质、或其功能部分或功能变体的任何核苷酸序列。

例如，本公开内容还提供了分离的或纯化的核酸的变体，其中变体核酸包含与编码本文所述TCR的核苷酸序列具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。这样的变体核苷酸序列编码特异性识别PRAME、尤其是PRAME表位SLLQHLIGL(SEQID NO:1)的功能性TCR。

例如，本公开内容还提供了分离的或纯化的核酸的变体，其中变体核酸包含与本文所述共刺激受体具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。这样的变体核苷酸序列编码如本文所述的功能性嵌合共刺激受体。

如本文别处已经描述的，编码TCR和/或嵌合共刺激受体的核酸可以被修饰。整个核酸序列中有用的修饰可以是密码子优化。可以进行导致翻译的氨基酸序列内的保守替换的改变。对于TCR，这些变异可以在TCR链的氨基酸序列的不影响功能的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在CDR3区域进行添加和缺失。

另一个实施方案涉及包含编码本文所述的TCR和嵌合共刺激受体的核酸的载体。

载体优选是质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或用于基因治疗的颗粒和/或载体。

“载体”是能够将核酸序列携带到合适的宿主细胞中的任何分子或组合物，在所述宿主细胞中可以发生所编码的多肽的合成。通常且优选地，载体是已使用本领域已知的重组DNA技术工程化以掺入所需核酸序列(例如本发明的核酸)的核酸。载体可以包含DNA或RNA和/或包含脂质体和/病毒颗粒。载体可以是质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或用于基因治疗的颗粒和/或载体。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一种或多种选择性标记基因和本领域普通技术人员已知的其它遗传元件。载体优选是表达载体，其包括与允许表达所述核酸的序列可操作地连接的根据本发明的核酸。

优选地，载体是表达载体。更优选地，载体是逆转录病毒，更具体地是γ-逆转录病毒或慢病毒载体。

技术人员理解，嵌合共刺激受体序列和TCR链TCR-α和TCR-β链序列可以包含在一个核酸(例如载体)中。在这种情况下，序列与内部核糖体进入位点(IRES)序列或源自猪捷申病毒(P2A)或源自其它物种的2A肽序列(例如明脉扁刺蛾β四体病毒2A肽(T2A)或口蹄疫病毒2A肽(F2A))连接(如Szymczak等人:Development of 2Apeptide-based strategiesin the design of multicistronic vectors中所述)，导致在病毒启动子的控制下在转导细胞内表达单个信使RNA(mRNA)分子。

在具体的实施方案中，细胞可以包含编码本文所述的TCR和嵌合共刺激受体的核酸或包含所述核酸的载体。

术语“转染”和“转导”是可互换的，并且是指将外源核酸序列引入宿主细胞(例如真核宿主细胞)中的过程。值得注意的是，核酸序列的引入或转移不限于所提及的方法，而是可以通过许多手段中的任一种来实现，包括电穿孔、显微注射、基因枪递送、脂转染、超转染以及所提及的逆转录病毒或其它用于转导或转染的合适的病毒的感染。TCR的克隆和外源表达的方法例如描述于Engels等人(Relapse or eradication of cancer ispredicted by peptide-major histocompatibility complex affinity.Cancer Cell,23(4),516-26.2013)中。例如，Cribbs“simplified production and concentration oflentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells”BMCBiotechnol.2013；13:98中描述了用慢病毒载体转导原代人T细胞。

在本发明上下文中描述和提供的包含本文描述和提供的核酸分子或载体的细胞优选能够稳定地或瞬时地(例如，稳定地)表达(组成型或条件性)本发明的PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体。通常可以通过任何方法用任何合适的核酸分子或载体转导或转化宿主细胞。在一个实施方案中，用逆转录病毒或慢病毒(例如，逆转录病毒)载体转导宿主细胞，所述载体包含编码如上所述本发明的融合蛋白或其部分(例如，ECD、TMD和/或ICD)的核酸分子。

在一些实施方案中，细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。细胞可以是自然杀伤细胞或T细胞。优选地，细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+或CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞样记忆T细胞。

干细胞样记忆T细胞(TSCM)是CD8+或CD4+T细胞的低分化亚群，其特点是自我更新和长期持续的能力。一旦这些细胞在体内遇到它们的抗原，它们就会进一步分化为中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和终末分化效应记忆T细胞(TEMRA)，其中一些TSCM保持静止状态(Flynn等人,Clinical&Translational Immunology(2014)。这些剩余的TSCM细胞表现出在体内建立持久免疫记忆的能力，因此被认为是用于过继性T细胞治疗的重要T细胞亚群(Lugli等人,Nature Protocols 8,33-42(2013)Gattinoni等人,Nat.Med.2011Oct；17(10):1290-1297)。可以使用免疫磁力选择来将T细胞库限制为干细胞记忆T细胞亚型，参见(Riddell等人.2014,Cancer Journal 20(2):141-44)

药物组合物、药物治疗和试剂盒

本发明的另一个方面涉及药物组合物，包含：包含PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体的细胞或包含编码如本文所述的所述分子的核酸分子，所述核酸编码PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体，包含编码PRAME特异性TCR的核酸和编码嵌合共刺激受体的核酸的组合物，本文所述的相应载体。

本发明的那些活性成分优选以与可接受的载体或载体材料混合的剂量用于这样的药物组合物，使得可以治疗或至少减轻疾病。这样的组合物可以(除了活性组分和载体之外)包含填充材料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域已知的其它材料。

术语“药学上可接受的”定义为无毒材料，其不干扰活性成分的生物活性的有效性。载体的选择取决于应用。

药物组合物可以含有增强活性成分的活性或补充治疗的附加成分。此类附加成分和/或因子可以是药物组合物的一部分以实现协同作用或使不利或不期望的作用最小化。

本发明的活性成分的配制或制备以及应用/药物治疗的技术公开于"Remington'sPharmaceutical Sciences",Mack Publishing Co.,Easton,PA最新版中。合适的施用是肠胃外施用，例如肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、结节内、腹膜内或瘤内注射。静脉内注射是患者的优选治疗方法。

根据一个优选的实施方案，所述药物组合物是输注或注射剂。

可注射组合物是药学上可接受的流体组合物，包含至少一种活性成分，例如包含PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体的扩增T细胞群(例如对于待治疗患者为自体或同种异体)。活性成分通常溶解或混悬于生理学上可接受的载体中，并且组合物还可以包含少量的一种或多种无毒辅助物质，例如乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等。可用于与本公开内容的融合蛋白一起使用的此类可注射组合物是常规的；合适的制剂是本领域普通技术人员众所周知的。

通常，药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。

因此，本发明的另一方面涉及本文所述的细胞、本文所述的组合物、本文所述的核酸和/或本文所述的载体，用作药物。

一些实施方案涉及本文所述的细胞、本文所述的组合物、本文所述的核酸和/或载体，用于治疗癌症。

在一个实施方案中，癌症是血液癌症或实体瘤。

血液癌症也称为血癌，其不形成实体瘤，因此分散在体内。血液癌症的例子有白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。实体瘤有两种主要类型：肉瘤和癌。肉瘤是例如血管、骨、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或肌腱的肿瘤。在一个具体的实施方案中，癌症是实体瘤。

在一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病、癌、肉瘤或骨肉瘤。

包含如本文所述的修饰的T细胞的组合物可以用于根据已知技术的过继免疫治疗的方法和组合物，或其变体，基于本公开内容这对本领域技术人员来说是显而易见的。

在一些实施方案中，通过首先从其培养基中收获，然后在适合于以治疗有效量施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载体)中洗涤和浓缩来配制细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用5％葡萄糖水溶液或林格乳酸盐。输注介质中可以补充人血清白蛋白。

组合物中用于有效治疗的细胞数量通常大于10个细胞，并且最多达10⁶个，最多达并包含10⁸或10⁹个细胞，并且可以多于10¹⁰个细胞。细胞的数量将取决于组合物预期的最终用途以及其中包含的细胞的类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以是500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所需细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，并且一般大于10⁷个细胞/ml，一般为10⁸个细胞/ml或更大。临床相关数量的免疫细胞可分配到多次输注中，其累计等于或超过10⁹、10¹⁰或10¹¹个细胞。本文提供的药物组合物可以是各种形式，例如固体、液体、粉末、水性或冻干形式。合适的药物载体的实例是本领域已知的。此类载体和/或添加剂可以通过常规方法配制并且可以以合适的剂量施用于受试者。稳定剂例如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以防止组合物在体内降解。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

包含编码本文提供的PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体的核苷酸序列的病毒载体颗粒可以包装为试剂盒。试剂盒可以任选地包含一种或多种组分，例如使用说明书、装置和附加试剂，以及用于实施方法的组分，例如管、容器和注射器。示例性试剂盒可以包含编码本文提供的重组TCR和嵌合共刺激受体、重组多肽或病毒的核酸，并且可以任选地包含使用说明书、用于检测受试者体内病毒的装置、用于将组合物施用于受试者的装置，以及用于将组合物施用于受试者的装置。

本文还考虑了包含编码PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体的多核苷酸的试剂盒。本文还考虑了包含编码感兴趣序列(例如重组TCR)的病毒载体和任选地编码免疫检查点抑制剂的多核苷酸序列的试剂盒。

本文考虑的试剂盒还包括用于实施用于检测编码本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体中的任何一种或多种的多核苷酸的存在的方法的试剂盒。特别地，此类诊断试剂盒可以包含适当的扩增和检测引物组以及用于进行深度测序以检测编码本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体的多核苷酸的其它相关试剂。在进一步的实施方案中，本文的试剂盒可以包含用于检测本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体的试剂，例如抗体或其它结合分子。诊断试剂盒还可以包含用于确定编码本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体的多核苷酸的存在或用于确定本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体的存在的说明书。试剂盒还可以包含说明书。说明书通常包括描述试剂盒中包含的组分的有形表述，以及施用方法，包括用于确定受试者的正确状态、正确的剂量量和正确的施用方法的方法。说明书还可以包括在治疗持续时间内监测受试者的指导。

本文提供的试剂盒还可以包括用于向受试者施用本文描述的组合物的装置。本领域已知的用于施用药物或疫苗的多种装置中的任一种可以包含在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如滴管。通常，用于施用试剂盒的病毒的装置将与试剂盒的病毒相容；例如，诸如高压注射装置的无针注射装置可以包含在具有不被高压注射破坏的病毒的试剂盒中，但通常不包含在具有被高压注射破坏的病毒的试剂盒中。

实验

实施例1：PD1-41BB的共表达未改变TCR表达水平。

为了制备用于测试和表征转基因TCR T23.8-2.1-027-004(＝TCR)以及与PD1-41BB组合的TCR(＝TCR_PD1-41BB)的效应T细胞，从健康供体中分离了CD8+T细胞并在IL-7和IL-15存在的情况下用CD3/CD28抗体激活。激活的细胞用含有TCR序列或与PD1-41BB偶联的TCR序列的逆转录病毒颗粒转导。以相同方式制备的未转导(＝UT)CD8+T细胞用作对照。第14天，通过TCR-β链(TRBV09)和PD-1的抗体染色以及随后的流式细胞术分析确定转基因的转导效率和表达水平。

分析表明，构建体TCR(90.2％)和TCR_PD1-41BB(82％)均可实现高转导率(图1)。在未转导(UT)和TCR转导的效应T细胞中未检测到PD-1表达。然而，PD-1抗体与TCR_PD1-41BB转导的T细胞的结合表明与转基因TCR的表达相关的PD1-41BB的高表达水平。PD-41BB的共表达导致TCR表达水平与仅表达转基因TCR的效应T细胞中测量的水平相当。这表明PD1-41BB转换受体和转基因TCR的共表达在T细胞中是可行的，并导致细胞表面等摩尔表达。

实施例2：PD1-41BB的共表达未改变TCR转基因T细胞的功能亲和力。

功能亲和力是指单个非共价结合相互作用(例如转基因TCR和肽-MHC复合物)的多重亲和力的累积强度。因此，效应T细胞的功能亲合力作为肽敏感性的量度。具有高肽敏感性的TCR能够识别较低量的肽。为了研究PD1-41BB受体的共表达是否影响TCR转基因效应T细胞的肽敏感性，将它们与携带所需HLA|(HLA-A2:01)并过度表达PD-L1的PD-L1转基因T2细胞(T2_PD-L1)共培养，以允许与PD1-41BB连接。

使T2_PD-L1细胞负载滴定量的SLLQHLIGL(SLL)-肽(10^-5M至10^-10M)，并与不表达转基因TCR(UT)、仅表达转基因TCR(TCR)或表达TCR和PD1-41BB的组合(TCR_PD1-41BB)的效应T细胞以E:T为1:1(20.000个细胞)进行共培养。共培养20小时后进行IFN-γELISA，用于评估效应T细胞在受到T2_PD-L1细胞呈递的不同肽浓度攻击时的反应性(图2)。半数最大IFN-γ释放作为TCR转基因效应T的细胞功能亲和力的量度。左图中描绘了绝对IFN-γ水平，而右图显示了计算出的相对值的非线性回归曲线。如通过绝对IFN-γ值所示，与仅表达转基因TCR的效应细胞相比，PD1-41BB的共表达增加了T细胞分泌的IFN-γ总量。然而，非线性回归曲线表明，无论PD1-41BB表达如何，总体功能亲合力都是相当的。因此，即使存在配体PD-L1，TCR转基因T细胞的肽敏感性也不会因PD1-41BB转换受体的共表达而改变。

实施例3：PD1-41BB的共表达未改变HLA-A*02亚型识别。

HLA-A2蛋白可由不同的HLA-A*02亚等位基因(HLA-A*02:XX)编码，从而导致略有不同的氨基酸序列。在HLA-A*02:01背景下识别其同源肽的特定TCR不一定识别另一个HLA-A*02亚等位基因呈递的肽。为了定义成功的基于TCR的细胞疗法所需的遗传特征并潜在地扩大患者群体，在最常见的HLA-A*02亚等位基因的背景下对TCR进行了表征(图3)。

将不表达转基因TCR(UT)、仅表达转基因TCR(TCR)或表达TCR和PD1-41BB的组合(TCR_PD1-41BB)的T细胞与携带选定的HLA-A*02亚等位基因(HLA-A*02:XX)的类淋巴母细胞系(LCL；EBV转化的B细胞)以1:1的E:T比例(20.000个细胞/孔)共培养。为了允许被转基因TCR识别，LCL负载有10^-5M SLL肽。共培养20小时后通过ELISA确定IFN-γ浓度。

TCR转基因效应T细胞以与A*02:01相比相似的水平识别由HLA-A*02亚等位基因A*02:02、A*02:04和A*02:09编码的MHC分子呈递的SLL肽。该识别模式并未因PD1-41BB的共表达而改变，并且与之前的结果一致。TCR转基因效应T细胞在4个不同的HLA-A*02亚等位基因背景下识别SLL肽，与PD1-41BB共表达无关。

实施例4：成功降低潜在肽脱靶毒性的风险。

当TCR不仅识别特定肽(例如SLL肽)，而且还识别与原始肽具有高度序列同源性的其它肽时，就会出现脱靶毒性。为了鉴定与特定肽表现出高度序列相似性并可能被TCR识别的可能的候选肽，可以使用计算工具，例如Expitope[Jaravine V,/>A,Raffegerst S,等人.Expitope 2.0:a tool to assess immunotherapeutic antigensfor their potential cross-reactivity against naturally expressed proteins inhuman tissues.BMC Cancer 2017；17(1):892.]。该工具基于基因组、转录组和蛋白质组数据预测最可能错配(MM)的肽。通过应用Expitope/>搜索，可以鉴定19种MM肽，其与特定SLL肽相比显示出最多达4个氨基酸差异。在使用负载有10^-6M MM肽或SLL肽的PD-L1转基因T2细胞的预筛选共培养物中，鉴定出33种可被TCR转导的T细胞识别的MM肽。由于高肽浓度的外源负载不一定转化为对内源加工和呈递肽的生理识别，因此当表位(肽)从体外转录RNA(ivtRNA)翻译并在PRAME阴性靶细胞系SNB-19中进行内源加工时，检查了33种MM肽诱导TCR转基因效应T细胞释放IFN-γ的潜力。将编码最多达5种MM肽的IvtRNA电穿孔至SNB-19细胞中。在预筛选共培养物中诱导TCR转基因T细胞中最高IFN-γ释放的MM肽(MM01、MM26、MM66)作为“midigene”构建体(约400bp)单独进行测试。所有其它MM肽均作为编码5种MM肽的小基因构建体(每种肽约90bp)进行测试。编码SLL肽的midigene构建体用作阳性对照。为了确认成功的ivtRNA转染，所有RNA构建体都包含被阳性对照TCR识别的表位。在转染的SNB-19细胞与TCR转基因效应T细胞共培养20小时后确定IFN-γ浓度。所有转染的SNB-19细胞均被阳性对照TCR识别，证实了成功的转染(图4)。用编码SLL肽的ivtRNA构建体转染的SNB-19细胞被具有或不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞识别，而细胞内加工的MM肽均未被识别。因此，所有MM肽都可以被降低风险，并且不太可能导致脱靶毒性。

实施例5：使用涵盖常见HLA的LCL文库未鉴定出脱靶毒性。

为了获得有关TCR转基因T细胞与其它HLA同种异型的潜在交叉反应性的信息，将涵盖高加索人群体中最常见的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因的类淋巴母细胞系(LCL)文库用作靶细胞。这些LCL表达多种内源性表达的肽，并且由于识别匹配的HLA-A2分子或最常见的其它HLA分子上呈递的内源性肽，有助于鉴定潜在的交叉反应性。检测到特定HLA同种异型的交叉识别将导致将具有相应HLA等位基因的患者排除在临床研究之外。将不表达转基因TCR(UT)、仅表达转基因TCR(TCR)或表达TCR和PD1-41BB的组合(TCR_PD1-41BB)的T细胞与36种不同的LCL以1:1的E:T比例共培养。共培养20小时后通过ELISA确定IFN-γ浓度。具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞识别作为阳性对照的负载有SLL肽的HLA-A*02:01阳性LCL(图5)。仅与一种HLA-A*02:01LCL共培养而没有任何外源肽负载导致了IFN-γ的释放。由于通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)可以在该细胞系中检测到低水平的PRAME-RNA，因此轻微识别很可能是HLA-A2呈递的SLL肽的靶向识别。其它LCL均未被表达转基因TCR或与PD1-41BB组合的转基因TCR的效应T细胞识别。因此，未检测到因识别匹配的HLA-A2分子或最常见的其它HLA分子上呈递的内源肽而引起的脱靶毒性。

实施例6：使用一组正常细胞未鉴定出脱靶毒性。

本实验的目的是评估具有或不具有PD1-41BB的PRAME特异性TCR转基因T细胞可能引起的潜在靶向肿瘤/脱靶肿瘤和脱靶毒性。测试HLA-A*02:01阳性原代正常细胞和代表重要组织或器官的诱导多能干细胞(iPS)衍生细胞系是否被TCR转导的T细胞识别。根据各个靶标的特性，在共培养开始前1至7天，按照制造商的说明以细胞密度接种细胞，并在平底孔中进行单层培养。通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)分析所有测试的正常细胞的PRAMEmRNA表达，以区分靶向肿瘤/脱靶肿瘤与潜在的脱靶毒性。10^-5M肽负载靶细胞用作内部阳性对照(SLL-肽)。共培养20小时后通过ELISA确定IFN-γ浓度。所有负载有特定SLL肽的正常细胞均被具有或不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞识别(图6)。在没有肽负载的情况下，只有成熟的树突状细胞(mDC)导致IFN-γ水平高于未转导细胞的背景。由于mDC表达PRAME，该识别是由于对HLA-A2呈递的SLL肽的靶向识别。其它靶细胞均未被表达转基因TCR或与PD1-41BB组合的转基因TCR的效应T细胞识别。因此，没有观察到由内源肽识别引起的脱靶毒性。

实施例7：PD1-41BB增强响应于表达PD-L1的肿瘤细胞的IFN-γ的特异性释放。

肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1的相互作用通常产生抑制信号，从而降低T细胞活性。当转基因TCR与其同源肽-MHC复合物结合时，PD1-41BB应逆转该信号并导致增加的T细胞反应性。为了测试PD1-41BB共表达对TCR转基因T细胞反应性的影响，将具有或不具有PD1-41BB的效应T细胞与表达配体PD-L1的肿瘤细胞共培养。选择源自表达不同水平的特定抗原PRAME的各种适应症的肿瘤细胞用于这种共培养(图7A)。通过实时定量PCR确定肿瘤细胞系中的PRAME-RNA表达水平，并根据管家基因GUSB进行标准化。虽然10个肿瘤细胞系显示了PRAME表达，但在4个肿瘤细胞系中未检测到PRAME mRNA的表达。然而，这4个PRAME阴性肿瘤细胞系表达PD1-41BB配体PD-L1，并用作阴性对照以确保PD1-41BB不会对转基因TCR-T细胞的特异性产生负面影响。PD-L1表达水平通过抗体染色和随后的流式细胞术分析来确定。为了实现稳定表达，一些肿瘤细胞系用PD-L1转导(TD)。虽然一些肿瘤细胞系表现出内源(end)PD-L1表达，但通过IFN-γ处理，可以在其它细胞系中诱导(ind)PD-L1表达。用于诱导表达的IFN-γ水平与识别其抗原的特定T细胞共培养实验中产生的水平相当。肿瘤细胞中的内源PD-L1表达水平通常可以通过IFN-γ处理进一步增加(end、ind)。

为了确定PD1-41BB共表达对细胞因子释放的影响，将具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞与表达不同水平的PRAME和PD-L1的选定HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系共培养(图7B)。未转导的(UT)T细胞用作对照。TCR转基因T细胞和肿瘤细胞以1:1的E:T比例(20.000个细胞)共培养，并且在共培养20小时后通过ELISA确定IFN-γ浓度。PD1-41BB的共表达增强了响应PD-L1阳性肿瘤细胞的IFN-γ的释放，表明PD1-41BB的共表达提高了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的T细胞反应性。同时，未识别显示PD-L1表达的PRAME阴性肿瘤细胞，这表明PD1-41BB的共表达不会影响TCR转基因T细胞的特异性。仅当转基因TCRT细胞识别特定的PRAME抗原时，才会观察到细胞因子释放增加。

实施例8：PD1-41BB增强针对3D肿瘤细胞球体的特异性细胞毒性反应。

为了确定PD1-41BB共表达是否对细胞毒性具有有益影响，将TCR转基因T细胞与PD-L1阳性3D肿瘤细胞球体共培养(图8)。这些3维肿瘤细胞球体应作为实体瘤的体外模型。从实施例7中引入的肿瘤细胞组中，选择了三种HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系，其表现出不同水平的PRAME表达并表达红色荧光蛋白(NucLight-Red)。使用Incucyte或/>设备通过20天内红色荧光的消失来确定针对肿瘤球体的细胞毒性，每4小时记录图像。为了研究PD1-41BB共表达对T细胞适应性和恢复力的影响，在第3、7、10、13和16天将新鲜肿瘤细胞球体转移到共培养板中。在反复暴露于肿瘤细胞的攻击性环境中，PD1-41BB的表达对T细胞的效应功能和适应性具有有益作用。在用肿瘤细胞球体的多次攻击过程中，与仅表达转基因TCR的效应T细胞相比，表达PD1-41BB的效应T细胞可以更好地控制肿瘤细胞生长。此外，无论PD1-41BB表达与否，PRAME阴性PD-L1阳性肿瘤细胞都不会被转基因TCR T细胞靶向。因此，共表达PD1-41BB的T细胞保持严格的抗原依赖性，同时针对PD-L1阳性3D肿瘤细胞球体的特异性细胞毒性响应增强。

实施例9：PD1-41BB增加响应于表达PD-L1的肿瘤细胞的TCR转基因T细胞增殖。

通过响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的细胞因子释放和细胞毒性的增强来确定共表达PD1-41BB的TCR转基因T细胞的效应子功能和恢复力的增强(实施例7、8)。特别是，即使在用肿瘤细胞球体多次攻击后，肿瘤细胞也能得到更好的控制，这表明T细胞在抑制性肿瘤细胞环境中的适应度有所增加，这也可能与T细胞更好的存活或增殖有关。PD1-41BB开关受体中包含的4-1BB信号传导结构域已知可提供共刺激，从而提高T细胞的增殖率(Choi等人,4-1BB signaling activates glucose and fatty acidmetabolism to enhance CD8+Tcell proliferation；2017)。为了研究当PD1-41BB与其配体PD-L1相互作用时是否也能观察到这种T细胞扩增增加，将TCR转基因T细胞与表达不同水平PRAME抗原的PD-L1阳性肿瘤细胞共培养(图9)。TCR转基因T细胞和HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系以1:1的E:T共培养，并且未转导的T细胞(UT)用作对照。为了确定T细胞在与PD-L1阳性肿瘤细胞共培养中的X倍扩增，在第7天收获细胞并使用X分析仪确定总细胞计数。基于流式细胞术的细胞计数允许容易的区分T细胞和可能仍存在于共培养物中的肿瘤细胞。正如预期的那样，未转导的T细胞不会响应PRAME阳性肿瘤细胞而增殖，因为不存在扩增所需的特定TCR刺激。转基因TCR-T细胞响应于PD-L1阳性肿瘤细胞而增殖，其增殖方式似乎依赖于特定抗原PRAME的水平。与仅表达转基因TCR的T细胞相比，PD1-41BB的共表达也以抗原水平依赖性方式增强了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的增殖和存活。因此，TCR转基因T细胞中PD1-41BB的表达提高了增殖率，并有助于细胞在含有抑制性PD-L1受体的攻击性肿瘤细胞环境中更好地存活。

实施例10：共表达PD1-41BB的T细胞在体内表现出强烈的抗肿瘤反应性。

在体外试验中，PD1-41BB的共表达增加了TCR转基因T细胞的抗肿瘤效应功能。为了在体内也证实PD1-41BB对TCR转基因T细胞的这种积极作用，我们使用免疫缺陷(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)小鼠和PRAME/HLA-A*02:01阳性黑色素瘤细胞系MelA375开发了小鼠模型。为了模拟实体瘤的免疫抑制环境，用PD-L1转导MelA375细胞。皮下注射5x10⁶PD-L1转基因MelA375一周后，小鼠出现了明显的肿瘤。此时，小鼠被分配到三个治疗组，每组六只小鼠。向小鼠注射10x10⁶个具有(TCR_PD1-41BB)或不具有(TCR)PD1-41BB的TCR阳性细胞(16x10⁶总细胞)或等量的未转导T细胞(UT)。每周测量肿瘤体积2-3次。处死肿瘤体积超过1000mm³的小鼠。用未转导的T细胞处理的小鼠中的肿瘤迅速生长并在T细胞注射后2-4周内达到最大肿瘤体积(图10)。仅表达转基因TCR的效应T细胞对肿瘤生长几乎没有影响。只有共表达PD1-41BB的T细胞才能排斥肿瘤，并在治疗后3.5周后无肿瘤。这些数据表明，将显示出有效体外抗肿瘤反应性的PRAME特异性TCR与PD1-41BB组合得到了高效的T细胞，其可以消除体内模型中侵袭性生长的肿瘤细胞。

该申请还包括以下项目：

项目1：一种细胞，包含

(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和

(B)嵌合共刺激受体，包含

-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

项目2：根据项目1所述的细胞，其中所述TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的PRAME肽。

项目3：根据项目2所述的细胞，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子。

项目4：根据项目1至3中任一项所述的细胞，其中与序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的结合诱导TCR转导或转染的细胞分泌IFN-γ。

项目5：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。

项目6：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区。

项目7：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

项目8：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含，

具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

项目9：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包含SEQ ID NO:28的序列。

项目10：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包含SEQ ID NO:32的序列。

项目11：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述跨膜结构域源自PD-1。

项目12：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包含SEQ ID NO:30的序列。

项目13：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述嵌合共刺激受体包含SEQID NO:26的序列。

项目14：一种组合物，包含

-编码PRAME特异性TCR的核酸，所述TCR包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和

-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含

-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

项目15：一种核酸，包含

-编码PRAME特异性TCR的核酸，所述TCR包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和

-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含

-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。

项目16：根据项目14所述的组合物或根据项目15所述的核酸，其中所述TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的PRAME肽。

项目17：根据项目16所述的组合物或核酸，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子。

项目18：根据项目14和16至17所述的组合物或根据项目15至17所述的核酸，其中与序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的结合诱导TCR转导或转染的细胞分泌IFN-γ。

项目19：根据项目14和16至18所述的组合物或根据项目15至18所述的核酸，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。

项目20：根据项目14和15至19所述的组合物或根据项目15至19所述的核酸，其中所述TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区。

项目21：根据项目14和15至20所述的组合物或根据项目15至20所述的核酸，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有与SEQID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

项目22：根据项目14和16至21所述的组合物或根据项目15至21所述的核酸，其中所述TCR包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

项目23：根据项目14和16至22所述的组合物或根据项目15至22所述的核酸，其中所述含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包含SEQ ID NO:28的序列。

项目24：根据项目14和16至23所述的组合物或根据项目15至23所述的核酸，其中所述含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包含SEQ ID NO:32的序列。

项目25：根据项目14和16至24所述的组合物或根据项目15至24所述的核酸，其中所述跨膜结构域源自PD-1。

项目26：根据项目14和16至25所述的组合物或根据项目15至25所述的核酸，其中所述含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包含SEQ ID NO:30的序列。

项目27：根据项目14和16至26所述的组合物或根据项目15至26所述的核酸，其中所述嵌合共刺激受体包含SEQ ID NO:26的序列。

项目28：一种载体，包含项目15至27所述的核酸。

项目29：一种细胞，包含根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸或根据项目28所述的载体。

项目30：根据项目1至13和项目29所述的细胞，其中所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。

项目31：根据项目1至13和项目29至30中任一项的细胞，其中所述细胞是T细胞。

项目32：药物组合物，包含根据项目1至13所述的细胞、根据项目29至31所述的细胞、根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸和/或根据项目28所述的载体。

项目33：根据项目20所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。

项目34：根据项目1至13所述的细胞、根据项目29至31所述的细胞、根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸和/或根据项目28所述的载体，用于作为药物使用。

第35项：根据项目1至13所述的细胞、根据项目29至31所述的细胞、根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸和/或根据项目28所述的载体，用于在治疗癌症中使用。

项目36：根据项目1至13所述的细胞、根据项目29至31所述的细胞、根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸和/或根据项目28所述的载体，其用于在治疗癌症中使用，其中所述癌症优选选自由以下组成的组：黑素瘤、膀胱癌、结肠癌和乳腺癌、肉瘤、前列腺癌、子宫癌、葡萄膜癌、葡萄膜黑素瘤、鳞状头颈癌、滑膜癌、尤因肉瘤、三阴性乳腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、骨髓性白血病和急性淋巴细胞白血病，优选地其中所述癌症选自由NSCLC、SCLC、乳腺癌、卵巢癌或结直肠癌、肉瘤或骨肉瘤组成的组。

序列表

<110> 基因医疗免疫疗法有限责任公司(Medigene Immunotherapies GmbH)

<120> PRAME特异性T细胞受体与嵌合共刺激受体的组合

<130> M11754WO

<150> EP21172722.7

<151> 2021-05-07

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ser Ile Phe Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Cys Ala Gly Leu Ala Asp Tyr Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe

1 5 10 15

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Ser Gly Asp Leu Ser

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu

1 5

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Cys Ala Ser Ser Val Trp Ala Ser Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe

1 5 10 15

<210> 8

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp

1 5 10 15

Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln

20 25 30

Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn

35 40 45

Thr Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Asp Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu

50 55 60

Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr

65 70 75 80

Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala

85 90 95

Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Leu Ala Asp

100 105 110

Tyr Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Ser Val Lys Pro Asn

130

<210> 9

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr

20 25 30

Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp

35 40 45

Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe

50 55 60

Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu

65 70 75 80

Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Val Trp Ala Ser Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

115 120 125

Arg Leu Thr Val Thr

130

<210> 10

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Ca

<400> 10

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

1 5 10 15

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

20 25 30

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val

35 40 45

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

50 55 60

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

65 70 75 80

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val

85 90 95

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

100 105 110

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

115 120 125

Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 11

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Cb

<400> 11

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Arg Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Ser Arg Gly

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CDR1_a

<400> 12

agcatattta acacc 15

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CDR2_a

<400> 13

ttatataagg ctggtgaatt g 21

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CDR3_a

<400> 14

tgtgccggcc tggccgatta cggcggctct cagggaaatc tgatcttc 48

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CDR1_b

<400> 15

tctggagacc tctct 15

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CDR2_b

<400> 16

tattataatg gagaagag 18

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> CDR3_b

<400> 17

tgtgcctcta gcgtgtgggc ctctggcggc tacgagcagt atttt 45

<210> 18

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> Va

<400> 18

atgctgctgg aacatctgct gatcatcctg tggatgcagc tgacctgggt ttccggccag 60

cagctgaatc agagccctca gagcatgttc atccaagaag gcgaggacgt ttccatgaat 120

tgcaccagca gcagcatctt caacacctgg ctgtggtaca agcaggaccc tggcgaagga 180

ccagtgctgc tgatcgcctt gtacaaagcc ggcgagctga ccagcaacgg cagactgaca 240

gcccagttcg gcattacccg gaaggacagc ttcctgaaca tctccgccag cattccctcc 300

gacgtgggca tctatttttg tgccggcctg gccgattacg gcggctctca gggaaatctg 360

atcttcggca agggcaccaa gctgagcgtg aagcccaac 399

<210> 19

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> Vb

<400> 19

atgggcttca gactgctgtg ctgcgtggcc ttttgtctgc ttggagccgg acctgtggat 60

agcggcgtta cccagacacc taagcacctg atcacagcca caggccagcg cgtgaccctg 120

agatgttctc ctagaagcgg cgacctgagc gtgtactggt atcagcagtc tctggaccag 180

ggcctgcagt tcctgatcca gtactacaac ggcgaggaaa gagccaaggg caacatcctg 240

gaacggttca gcgcccagca gttcccagat ctgcacagcg agctgaacct gagcagcctg 300

gaactgggag atagcgccct gtacttctgt gcctctagcg tgtgggcctc tggcggctac 360

gagcagtatt ttggccctgg caccagactg accgtgacc 399

<210> 20

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> Ca

<400> 20

attcagaacc ccgatcctgc cgtgtaccag ctgagagaca gcaagagcag cgacaagagc 60

gtgtgcctgt tcaccgactt cgacagccag accaacgtgt cccagagcaa ggacagcgac 120

gtgtacatca ccgacaagac cgtgctggac atgcggagca tggacttcaa gagcaacagc 180

gccgtggcct ggtccaacaa gagcgatttc gcctgcgcca acgccttcaa caacagcatt 240

atccccgagg acacattctt ccccagctcc gatgtgccct gcgacgtgaa gctggtggaa 300

aagagcttcg agacagacac caacctgaac ttccagaacc tgtccgtgat cggcttcaga 360

atcctgctgc tgaaggtggc cggcttcaac ctgctgatga cactgagact gtggtccagc 420

<210> 21

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> Cb

<400> 21

gaggatctga agaacgtgtt cccacctgag gtggccgtgt tcgagccttc taaggccgag 60

attgcccaca cacagaaagc cacactcgtg tgtctggcca ccggcttcta tcccgatcac 120

gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa gaggtgcaca gcggcgtcag cacagatccc 180

cagcctctga aagaacagcc cgctctgaac gacagccggt actgtctgag cagcagactg 240

agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc 300

tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc caggacagag ctaagcccgt gacacagatc 360

gtgtctgccg aagcttgggg cagagccgat tgtggcatca ccagcagatc ttaccaccag 420

ggcgtgctga gcgccaccat cctgtatgag atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc 480

gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc atggtcaagc ggaaggatag cagaggc 537

<210> 22

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> TCRb

<400> 22

Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr

20 25 30

Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp

35 40 45

Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe

50 55 60

Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu

65 70 75 80

Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Val Trp Ala Ser Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

115 120 125

Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val

130 135 140

Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala

145 150 155 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

165 170 175

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

180 185 190

Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

195 200 205

Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

210 215 220

Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

225 230 235 240

Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Arg Ser Tyr His

260 265 270

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys

275 280 285

Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met

290 295 300

Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 23

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TCRb

<400> 23

atgggcttca gactgctgtg ctgcgtggcc ttttgtctgc ttggagccgg acctgtggat 60

agcggcgtta cccagacacc taagcacctg atcacagcca caggccagcg cgtgaccctg 120

agatgttctc ctagaagcgg cgacctgagc gtgtactggt atcagcagtc tctggaccag 180

ggcctgcagt tcctgatcca gtactacaac ggcgaggaaa gagccaaggg caacatcctg 240

gaacggttca gcgcccagca gttcccagat ctgcacagcg agctgaacct gagcagcctg 300

gaactgggag atagcgccct gtacttctgt gcctctagcg tgtgggcctc tggcggctac 360

gagcagtatt ttggccctgg caccagactg accgtgaccg aggatctgaa gaacgtgttc 420

ccacctgagg tggccgtgtt cgagccttct aaggccgaga ttgcccacac acagaaagcc 480

acactcgtgt gtctggccac cggcttctat cccgatcacg tggaactgtc ttggtgggtc 540

aacggcaaag aggtgcacag cggcgtcagc acagatcccc agcctctgaa agaacagccc 600

gctctgaacg acagccggta ctgtctgagc agcagactga gagtgtccgc caccttctgg 660

cagaacccca gaaaccactt cagatgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgat 720

gagtggaccc aggacagagc taagcccgtg acacagatcg tgtctgccga agcttggggc 780

agagccgatt gtggcatcac cagcagatct taccaccagg gcgtgctgag cgccaccatc 840

ctgtatgaga tcctgctggg caaagccact ctgtacgccg tgctggtgtc tgccctggtg 900

ctgatggcca tggtcaagcg gaaggatagc agaggc 936

<210> 24

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> TCRa

<400> 24

Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp

1 5 10 15

Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln

20 25 30

Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn

35 40 45

Thr Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Asp Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu

50 55 60

Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr

65 70 75 80

Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala

85 90 95

Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Leu Ala Asp

100 105 110

Tyr Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Ser Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu

130 135 140

Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe

145 150 155 160

Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile

165 170 175

Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn

180 185 190

Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala

195 200 205

Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp

210 215 220

Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr

225 230 235 240

Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu

245 250 255

Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser

260 265 270

Ser

<210> 25

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> TCRa

<400> 25

atgctgctgg aacatctgct gatcatcctg tggatgcagc tgacctgggt ttccggccag 60

cagctgaatc agagccctca gagcatgttc atccaagaag gcgaggacgt ttccatgaat 120

tgcaccagca gcagcatctt caacacctgg ctgtggtaca agcaggaccc tggcgaagga 180

ccagtgctgc tgatcgcctt gtacaaagcc ggcgagctga ccagcaacgg cagactgaca 240

gcccagttcg gcattacccg gaaggacagc ttcctgaaca tctccgccag cattccctcc 300

gacgtgggca tctatttttg tgccggcctg gccgattacg gcggctctca gggaaatctg 360

atcttcggca agggcaccaa gctgagcgtg aagcccaaca ttcagaaccc cgatcctgcc 420

gtgtaccagc tgagagacag caagagcagc gacaagagcg tgtgcctgtt caccgacttc 480

gacagccaga ccaacgtgtc ccagagcaag gacagcgacg tgtacatcac cgacaagacc 540

gtgctggaca tgcggagcat ggacttcaag agcaacagcg ccgtggcctg gtccaacaag 600

agcgatttcg cctgcgccaa cgccttcaac aacagcatta tccccgagga cacattcttc 660

cccagctccg atgtgccctg cgacgtgaag ctggtggaaa agagcttcga gacagacacc 720

aacctgaact tccagaacct gtccgtgatc ggcttcagaa tcctgctgct gaaggtggcc 780

ggcttcaacc tgctgatgac actgagactg tggtccagc 819

<210> 26

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PD1-41BB

<400> 26

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Lys

180 185 190

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

195 200 205

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

210 215 220

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

225 230

<210> 27

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PD1-41BB

<400> 27

atgcaaattc ctcaagctcc ttggcctgtc gtgtgggccg ttctgcaact tggatggcgg 60

cctggctggt tcctggactc tcctgacaga ccctggaatc ctccaacatt cagccccgct 120

ctgctggtgg ttaccgaggg cgataatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gcctttcctg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt tacacagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtccgggcca gaagaaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatttc tctggcccct aaggctcaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgacagaaag acgggccgaa gtgcccacag ctcacccttc accttctcca 480

agacctgccg gccagttcca gacactggtc gtgggagttg ttggcggact gctgggatct 540

ctggtgctgc ttgtttgggt gctcgccgtg atcaagcggg gcagaaagaa gctgctgtac 600

atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccacac aagaggaaga tggctgctcc 660

tgcagattcc ccgaggaaga agaaggcggc tgcgaactc 699

<210> 28

<211> 170

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val

165 170

<210> 29

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PD1 ECD

<400> 29

atgcaaattc ctcaagctcc ttggcctgtc gtgtgggccg ttctgcaact tggatggcgg 60

cctggctggt tcctggactc tcctgacaga ccctggaatc ctccaacatt cagccccgct 120

ctgctggtgg ttaccgaggg cgataatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gcctttcctg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt tacacagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtccgggcca gaagaaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatttc tctggcccct aaggctcaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgacagaaag acgggccgaa gtgcccacag ctcacccttc accttctcca 480

agacctgccg gccagttcca gacactggtc 510

<210> 30

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp

1 5 10 15

Val Leu Ala Val Ile

20

<210> 31

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PD1 TM

<400> 31

gtgggagttg ttggcggact gctgggatct ctggtgctgc ttgtttgggt gctcgccgtg 60

atc 63

<210> 32

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 33

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 41BB_ICD

<400> 33

aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60

accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 120

gaactc 126

Claims (15)

1.一种细胞，包含

(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，包含

-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和

-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和

(B)嵌合共刺激受体，包含

-含有源自PD-1的胞外结构域的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-含有源自4-1BB的胞内结构域的胞内结构域。

2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的PRAME肽。

3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子。

4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:8相同或至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:9相同或至少80％相同的氨基酸序列的可变TCRβ区。

5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含，

具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的恒定TCRα区和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的恒定TCRβ区。

6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述含有源自PD-1的胞外结构域的胞外结构域包含SEQ ID NO:28的序列，并且

其中所述含有源自4-1BB的胞内结构域的胞内结构域包含SEQ ID NO:32的序列。

7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述跨膜结构域源自PD-1，其中优选地所述含有源自PD-1的跨膜结构域的跨膜结构域包含SEQ ID NO:30的序列，优选地其中所述嵌合共刺激受体包含SEQ ID NO:26的序列。

8.一种组合物，包含

-编码权利要求1中定义的T细胞受体(TCR)的核酸；和

-编码权利要求1中定义的嵌合共刺激受体的核酸。

9.一种核酸，包含

-编码权利要求1中定义的T细胞受体(TCR)的核酸；和

-编码权利要求1中定义的嵌合共刺激受体的核酸。

10.一种载体，包含根据权利要求9所述的核酸。

11.一种细胞，包含根据权利要求8所述的组合物、根据权利要求9所述的核酸或根据权利要求10所述的载体。

12.根据权利要求1至7和权利要求11中任一项所述的细胞，其中所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)，优选地其中所述细胞是T细胞。

13.一种药物组合物，包含根据权利要求1至7中任一项或权利要求11所述的细胞、根据权利要求8所述的组合物、根据权利要求9所述的核酸和/或根据权利要求10所述的载体。

14.根据权利要求1至7中任一项或权利要求11所述的细胞、根据权利要求8所述的组合物、根据权利要求9所述的核酸和/或根据权利要求10所述的载体，用于作为药物使用。

15.根据权利要求1至7中任一项或权利要求11所述的细胞、根据权利要求8所述的组合物、根据权利要求9所述的核酸和/或根据权利要求10所述的载体，用于在治疗癌症中使用。