KR20210150440A - Mage a4 t 세포 수용체 - Google Patents

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KR20210150440A
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크리스티안 엘링거
다니엘 좀머마이어
파슨스 게오프라이 블랙번
야스데프 만
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메디진 이뮤노테라피스 게엠바하
2세븐티 바이오, 인크.
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Abstract

본 발명은 MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(TCR) 및 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 다가 TCR 복합체, TCR을 암호화하는 핵산, TCR을 발현하는 세포 및 TCR을 포함하는 약학 조성물이 추가로 포함된다. 본 발명은 또한 약제로 사용하기 위한 TCR, 특히 암 치료에 사용하기 위한 TCR에 관한 것이다.

Description

MAGE A4 T 세포 수용체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 27일자로 출원된 유럽특허출원 제19 165 387호의 이익을 주장하며, 상기 출원은 전체 내용이 본 명세서에 참조로서 인용된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 참조로서 본 명세서에 통합된다. 서열 목록이 포함된 텍스트 파일의 명칭은 MED16702PCT_ST25이다. 2020년 3월 24일에 생성된 텍스트 파일은 146 KB이었으며, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.
기술분야
본 발명은 MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR), TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, TCR을 암호화하는 핵산, TCR을 발현하는 세포, 및 이를 포함하는 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의학적 치료 방법에서 또는 제형화를 위해 상기를 이용하는 방법 및/또는 약제로 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
세포 매개 면역 시스템의 일부를 형성하는 T 림프구(또는 T 세포)는 병원체의 박멸에 중요한 역할을 한다. T 세포는 흉선에서 발생하고, 유핵 세포에서 발현되는 주조직적합성복합체(MHC) 분자 상에 제시된 펩티드를 인식할 수 있게 하는 TCR 분자를 표면에 발현시킨다(항원 제시로 공지됨). 병원체로부터 유래된 항원, 즉 MHC 분자에 의해 제시된 외래 항원은 강력한 T 세포 반응을 유도하는 반면, 자가-항원은 일반적으로 상기 T 세포가 발생하는 동안 흉선에서 자가-항원 특이적 T 세포의 음성 선택으로 인해 T 세포 반응을 유도하지 않는다. 따라서 면역계는 외래- 또는 자가-항원을 제시하는 유핵 세포를 구별할 수 있고, 강력한 사이토카인 방출 및 T 세포의 세포 독성 메커니즘을 통해 감염된 세포를 특이적으로 표적화하여 박멸할 수 있다.
면역계의 힘은 미래의 암 요법에 대한 유망한 도구로 인식되어 왔다. 지난 10 년 동안, 생체 외에서 증폭된 환자 유래 림프구의 투여를 수반하는 입양전달(adoptive) 세포 치료(ACT)를 이용하여 T 세포의 독특한 특성을 개발하기 위한 연구가 시작되었다. ACT는 환자의 면역 능력이 필요하지 않기 때문에 암 치료에 대한 매력적인 개념이며, 전달된 림프구의 특이성은 돌연변이가 없어서 면역원성이 낮으므로 통상 자가 T 세포 반응을 효과적으로 유발하지 못하는 종양 항원을 표적으로 할 수 있다. ACT는 다양한 유형의 암에 대해 유망한 치료법으로 여겨졌지만, 임상 치료법으로서의 광범위한 적용은 각 환자로부터의 종양 특이적 T 세포의 맞춤형 단리 및 특성화에 대한 필요성으로 인해 어려움을 겪었다 - 이는 어렵고 시간 소모적일 수 있을 뿐만 아니라 종종 고-결합력(avidity) T 세포를 생산하지 못하는 과정이다(Xue et al,, Clin. Exp. Immunol. 2005 Feb; 139(2): 167-172; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 2009 Nov; 20(11): 1240-1248.)
면역 손상 환자에서조차 한정된 항원 특이성을 갖는 종양-반응성 T 림프구의 신속한 생성을 허용하기 때문에, 1차 T 세포로의 종양 항원-특이적 TCR의 유전자 전달은 ACT의 현재 한계의 일부를 극복할 수 있다. 그러나, 종양 항원을 특이적으로 인식하고 생체 내에서 원하는 항 종양 효과를 나타내는 TCR을 갖는 적합한 T 세포 클론의 동정은 여전히 진행중인 연구의 주제이다. 2012년에 전 세계적으로 약 1,410만의 신규 사례의 암이 발생했으며 현재 암이 전 세계 모든 인간 사망의 약 14.6%의 원인이라는 점을 고려할 때 새롭고 효율적인 치료 옵션이 시급히 필요하다. 본 발명의 목적은 상기에 제시된 요구를 충족시키는 것이다.
MAGE-A4는 흑색종 항원(MAGE) 패밀리에 속한다. MAGE 패밀리는 흑색종, 결장, 폐에서 유방 및 기타 종양에 이르는 다양한 악성 종양 유형에서 발현된다. 구체적으로, MAGE 패밀리는 조직 발현 패턴에 따라 두 그룹으로 나뉘는 데, MAGE-A 서브패밀리는 고환의 생식 세포에서 발현되고 악성 종양에서 비정상적으로 재발현된다. 이것은 또한 MAGE-A4에도 적용된다.
종양 조직 발현 연구에 따르면 MAGE-A4는 비소세포폐암(NSCLC) 사례의 19~35%, 유방암 사례의 13%, 상피성 난소암 사례의 47%, 결장직장암 사례의 22%에서 (과)발현되는 것으로 드러났다(Tajima et al. Lung Cancer 2003; 42: 23-33; Gure et al. Clin Cancer Res 2005, 11 :8055-8062; Kim et al. Int J Mol Med 2012, 29: 656-662; Otte et al. Cancer Res 2001, 61 :6682-668; Daudi et al. PLoS One 2014, 9:e104099; Li et al. Clin Cancer Res 2005, 11:1809-1814).
본 발명의 목적은 MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(TCR)를 제공하는 것이다.
특히, TCR은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 특이적으로 인식한다.
특정 구현예에서, TCR은 서열 번호 1의 아미노산 서열의 HLA-A2 결합 형태를 특이적으로 인식하고, 보다 구체적으로 TCR은 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 인식한다.
일부 구현예에서, TCR은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역; 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역; 또는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역을 포함한다. 이들 TCR을 하기에서 보다 상세히 설명한다.
특정 구현예에서, TCR은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, TCR은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬을 포함한다.
특정 구현예에서, TCR은 서열 번호 87의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 서열 번호 89의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 90의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는 서열 번호 91의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR은 서열 번호 102의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 서열 번호 108의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 109의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는 서열 번호 114의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬을 포함한다.
본 발명에서 고려되는 TCR은 단리 및/또는 정제된 것이고 가용성이거나 막에 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 단리된 TCR와 관련되며, 여기서 이펙터 세포(effector cell) 상에 발현된 TCR이 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 결합함으로써 유도된 IFN-γ 분비가, HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 관련 없는 펩티드(irrelevent peptide)에의 결합과 비교하여, HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산에 결합할 때 100 배 초과, 바람직하게는 500 배 초과, 보다 바람직하게는 2000 배 초과일 수 있다.
일부 구현예에서, TCR의 아미노산 서열은 하나 이상의 표현형 침묵 치환을 포함할 수 있다. 또한, TCR은 표지(label)될 수 있다. 유용한 표지는 당업계에 공지되어 있고, 선택적으로 다양한 길이의 링커를 통해 일반적인 방법을 사용하여 TCR 또는 TCR 변이체에 연결될 수 있다. "표지" 또는 "표지 그룹(labelling group)"이라는 용어는 검출가능한 임의의 표지를 지칭한다. 추가로 또는 대안적으로, 아미노산 서열은 변형되어 치료제 또는 약동학적(pharmacokinetic) 변형 모이어티(moiety)를 포함할 수 있다. 치료제는 면역 이펙터 분자, 세포독성제 및 방사성핵종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 면역 이펙터 분자는 예를 들어 사이토카인일 수 있다. 약동학적 변형 모이어티는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 반복 단위, 적어도 하나의 글리콜기, 적어도 하나의 시알릴기 또는 이들의 조합물일 수 있다.
본 발명에서 고려되는 TCR, 특히 TCR의 가용성 형태는 예를 들어 면역원성의 감소, 유체역학적 크기(용액에서의 크기), 용해도 및/또는 안정성(예를 들어 단백질 분해에 대한 보호 강화에 의함)의 증가 및/또는 혈청 반감기의 확장을 위한 추가적인 기능적 모이어티의 부착에 의해 변형될 수 있다. 다른 유용한 기능적 모이어티 및 변형은 환자의 신체에서 본 발명의 TCR을 보유하는 이펙터 숙주 세포를 끄거나 켜는데 사용될 수 있는 "자살(suicide)" 또는 "안전 스위치(safety switches)"를 포함한다. 변경된 글리코실화 패턴을 갖는 TCR도 또한 본 발명에서 고려된다.
본 발명에서 고려되는 TCR, 특히 TCR의 가용성 형태에 약물 또는 치료 물질, 예를 들어 소분자 화합물을 부가하는 것도 고려할 수 있다. 본 발명에서 고려되는 TCR, 특히 TCR의 가용성 형태는 각각의 분자(태그)의 식별, 추적, 정제 및/또는 단리를 돕는 추가 도메인을 도입하도록 추가로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 단일 사슬 유형이고, 여기서 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬은 링커 서열에 의해 연결되고, 선택적으로 링커 서열은 절단가능하다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드에 관련되며, 상기 기능적 부분은 서열 번호 4, 7, 14, 17, 24 및 27로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
특정 구현예에서, 기능적 부분은 TCR α 가변 영역 및/또는 TCR β 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 TCR을 포함하는 다가 TCR 복합체와 관련된다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 TCR 중 적어도 하나는 치료제와 회합된다.
특정 구현예는 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 상기 융합 단백질은 서열 번호 94, 96, 98, 104, 110, 및 116 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 양태에서 융합 단백질은 푸린 절단 부위 및/또는 리보솜 스킵 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 암호화하거나 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산과 관련된다.
일 양태에서, TCR α 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 69, 77, 85, 99, 105, 및 111 중 어느 하나에 기재된다. 또 다른 양태에서, TCR β 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 70, 78, 86, 100, 106, 및 112 중 어느 하나에 기재된다. 다른 양태에서, TCR은 서열 번호 69에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 70에 의해 암호화되는 β 사슬; 서열 번호 77에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 78에 의해 암호화되는 β 사슬; 서열 번호 85에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 86에 의해 암호화되는 β 사슬; 서열 번호 99에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 100에 의해 암호화되는 β 사슬; 서열 번호 105에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 106에 의해 암호화되는 β 사슬; 또는 서열 번호 111에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 112에 의해 암호화되는 β 사슬을 포함한다.
추가 양태는 서열 번호 93, 95, 97, 101, 107 및 113 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화되는 융합 단백질과 관련된다.
추가 양태는 상기 기재된 바와 같은 본 출원의 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터와 관련된다. 추가 양태는 서열 번호 87 및 서열 번호 88에 기재된 폴리펩티드 서열; 서열 번호 89 및 서열 번호 90에 기재된 폴리펩티드 서열; 서열 번호 91 및 서열 번호 92에 기재된 폴리펩티드 서열; 서열 번호 102 및 서열 번호 103에 기재된 폴리펩티드 서열; 서열 번호 108 및 서열 번호 109에 기재된 폴리펩티드 서열; 또는 서열 번호 114 및 서열 번호 115에 기재된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터와 관련된다. 바람직하게는, 벡터는 세포, 특히 진핵 세포의 형질도입 또는 형질감염에 적합한 발현 벡터 또는 벡터이다. 벡터는 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 발현하는 세포와 관련된다. 상기 세포는 단리되거나 또는 비자연적으로 발생하는 것일 수 있다.
또 다른 양태는 상기 기재된 바와 같은 핵산 또는 상기 기재된 바와 같은 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 세포와 관련된다. 보다 구체적으로, 세포는 다음을 포함할 수 있다: 상기 기재된 바와 같은 핵산 또는 다중 핵산을 포함하는 발현 벡터; 또는 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 알파 사슬을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터, 및 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 베타 사슬을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터.
세포는 말초 혈액 림프구(PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)일 수 있다. 전형적으로, 세포는 면역 이펙터 세포, 특히 T 세포이다. 다른 적합한 세포 유형은 감마-델타 T 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 NK-유사 T (NKT) 세포를 포함한다.
또 다른 양태는 MAGE-A4에 대한 특이성을 매개하는 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 일부에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 관련된다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질, 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체, 본원에 기재된 바와 같은 핵산, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 본원에 기재된 바와 같은 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물과 관련된다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질, 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체, 본원에 기재된 바와 같은 핵산, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 본원에 기재된 바와 같은 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함하는 약학 조성물과 관련된다.
전형적으로 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태는 약제로 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 TCR, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체, 본원에 기재된 바와 같은 핵산, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 본원에 기재된 바와 같은 세포, 본원에 기재된 바와 같은 항체, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 또는 약학 조성물과 관련된다. 상기 암은 혈액암 또는 고형 종양일 수 있다. 상기 암은 육종, 전립선암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비소세포폐암, 비-호지킨(non-Hodgkin's) 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 간세포 암종, 두경부암, 위암, 자궁내막암, 결장직장암, 담관암, 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 암은 NSCLC, SCLC, 유방, 난소 또는 결장직장암, 육종 및 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1은 상이한 MAGE-A4-반응성 TCR로 형질도입된 CD8+ T 세포의 MAGE-A4GVY-MHC-다량체 결합을 나타낸다. CD8+ T 세포는 건강한 공여자의 PBMC로부터 단리되었고 3개의 상이한 MAGE-A4-TCR 및 MAGE-A4를 인식하지 못하는 1개의 대조군 TCR로 형질도입되었다. 형질도입된 CD8+ T 세포는 형질도입을 위한 마커로서 뮤린 불변 베타 영역을 사용하여 FACS에 의해 농축되었다. 이들 세포를 확장한 후, 이들을 MAGE-A4GVY-MHC-다량체 및 CD8 및 뮤린 불변 베타 영역(mmCb)에 대한 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. 집단은 살아있는 CD8+/mCb+ 세포에 게이팅되었고 다량체/CD8의 염색이 나타난다. 도 2는 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포가 HLA-A2 상에 제시된 MAGE-A4GVY-펩티드를 인식함을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 MAGE-A4GVY-펩티드가 외부 로딩된 T2 세포 또는 MAGE-A4 유전자가 형질도입된 K562/HLA-A2 세포와 공동 배양하였다. 음성 대조군으로, 대조군 펩티드가 로딩된 T2 세포와 형질도입되지 않은 K562/HLA-A2 세포가 각각 사용되었다. 표적 세포의 인식은 표준 ELISA에 의해 공동 배양 상청액에서 IFN-γ 농도를 측정함으로써 분석하였다.
도 3은 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포의 기능적 결합력을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 등급화된 농도의 MAGE-A4GVY-펩티드(10-12 M 내지 10-4 M)가 외부 로딩된 T2 세포와 공동 배양하였다. 공동 배양 상청액의 IFN-γ 농도를 표준 ELISA로 측정했다.
도 4a 내지 도 4c는 HLA-A2 의존적 방식으로 MAGE-A4-양성 종양 세포주를 용해시키는 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포(TCR-1, TCR-2 및 TCR-3)의 능력을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 상이한 MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주(NCI-H1703, NCI-H1755), MAGE-A4-음성 HLA-A2-양성 종양 세포주(Saos-2) 및 MAGE-A4-음성 HLA-A2-음성 종양 세포주(A549)와 공동 배양하였다. MAGE-A4GVY-펩티드가 로딩된 종양 세포가 양성 대조군으로 사용된다. 형광 마커로 안정적으로 형질도입된 종양 세포주에 대한 세포독성은 IncuCyte® ZOOM 장치(Essen Bioscience)로 2시간마다 사진을 찍어서 측정하였다. 사이토카인 방출을 분석하기 위해, 공동 배양 상청액을 24 시간 후에 수확하고 IFN-γ 농도를 표준 샌드위치 ELISA(BD 인간 IFN-γ 또는 IL-2 ELISA 세트)로 분석했다.
도 5a 내지 도 5c는 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포(TCR-1, TCR-2 및 TCR-3)가 정상 인간 세포를 인식하지 못한다는 것을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 상이한 1차 세포 및 필수 조직 또는 기관을 대표하는 유도 만능 줄기 세포(iPS) 유래의 세포와 공동 배양하였다. MAGE-A4GVY-펩티드가 로딩된 정상 세포가 양성 대조군으로 사용된다. HLA-A2 발현은 IFN-γ와의 사전 인큐베이션에 의해 뉴런 상에서 유도되었다. HLA-A2-음성 NHBE 세포를 HLA-A2-ivtRNA로 전기천공하고 모든 세포의 HLA-A2 발현을 유세포 분석을 통해 확인하였다. 사이토카인 방출을 분석하기 위해, 공동 배양 상청액을 24 시간 후에 수확하고 IFN-γ 및 IL-2 농도를 표준 샌드위치 ELISA(BD 인간 IFN-γ 또는 IL-2 ELISA 세트)로 분석했다.
도 6은 상이한 MAGE-A4-반응성 완전 인간 TCR로 형질도입된 CD3+ T 세포의 MAGE-A4GVY-MHC-다량체 결합을 나타낸다. CD3+ T 세포를 건강한 공여자의 PBMC로부터 단리하였으며, 3개의 상이한 MAGE-A4-TCR과 MAGE-A4를 인식하지 못하는 1개의 대조군 TCR로 형질도입하였다. 이들 세포를 확장한 후, MAGE-A4GVY-MHC-다량체 및 CD3에 대한 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. 집단은 살아있는 CD3+ 세포 및 다량체 염색에 게이팅되었다.
도 7은 MAGE-A4 완전 인간 TCR-트랜스제닉 T 세포가 HLA-A2 상에 제시된 MAGE-A4GVY-펩티드를 인식함을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 MAGE-A4GVY-펩티드가 외부 로딩된 T2 세포 또는 MAGE-A4 유전자가 형질도입된 A549/HLA-A2 세포와 공동 배양하였다. 음성 대조군으로서, 대조군 펩티드가 로딩된 T2 세포 및 형질도입되지 않은 A549/HLA-A2 세포가 각각 사용되었다. 표적 세포의 인식은 Luminex 분석에 의해 공동 배양 상청액의 IFN-γ 농도를 측정함으로써 분석하였다.
도 8은 HLA-A2 의존적 방식으로 MAGE-A4-양성 종양 세포주에 특이적으로 반응하는 MAGE-A4 완전 인간 TCR-트랜스제닉 T 세포의 능력을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 여러가지의 MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주(A375, NCI-H1703, NCI-H1755), MAGE-A4-양성 HLA-A2-음성 종양 세포주(NCI-H520), 및 MAGE-A4-음성 HLA-A2-양성 종양 세포주(A549)와 공동 배양하였다. 사이토카인 방출을 분석하기 위해, 공동 배양 상청액을 24 시간 후에 수확하였으며, Luminex 분석에 의해 IFN-γ 농도를 분석하였다.
도 9는 HLA-A2 의존적 방식으로 MAGE-A4-양성 종양 세포주를 용해시키는 MAGE-A4 완전 인간 TCR-트랜스제닉 T 세포의 능력을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 여러가지의 MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주(A375, NCI-H1755, A549-HLA-A2-MAGE-A4) 및 MAGE-A4-음성 HLA-A2- 양성 종양 세포주(A549-HLA-A2)와 공동 배양하였다. 종양 세포주에 대한 세포독성을 공동 배양 개시 후 6 시간에 시작하여 임피던스 분석에 의해 측정하였다.
도 10은 NSG 마우스에 이식된 MAGE-A4-양성 종양을 제어하는 MAGE-A4 완전 인간 TCR-트랜스제닉 T 세포의 능력을 나타낸다.
도 11의 A) 내지 C)는 벡터 카피 수(VCN) 및 MAGE-A4 TCR의 발현을 나타낸다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 완전한 인간 MAGE-A4 TCR(TCR-5) 또는 강화된 변이체(TCR-8)를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. A) TCR-5 및 TCR-8 T 세포에서의 VCN 측정은 비슷하였다. B) T 세포 표면의 TCR 발현은 유세포 분석에 의한 GVY-특이적 4량체 검출을 사용하여 평가되었으며 총 CD3+ T 세포의 백분율로 제시되어 있다. TCR-8 발현은 TCR-5 발현에 비해 증가된다. C) T 세포 표면 상의 TCR 분자의 밀도를 유세포 분석에 의한 GVY 특이적 4량체 검출을 사용하여 평가하였으며, 총 Tetramer+ TCR T 세포의 기하 평균 형광 강도(gMFI)로 제시한다. TCR-8의 발현 밀도는 TCR-5 발현 밀도에 비해 증가된다.
도 12의 A) 및 B)는 완전 인간 MAGE-A4 TCR(TCR-5) 또는 강화된 변이체(TCR-8)를 발현하는 T 세포가 시험관 내에서 MAGE-A4 발현 표적 세포를 특이적으로 사멸시킨다는 것을 나타낸다. A) TCR-5, TCR-8 또는 형질도입되지 않은(UTD) T 세포를 A549.A2 세포(A2+, MAGE-A4(-)), NCI-H2023 세포(A2+, MAGE-A4(+)), A375 세포(A2+, MAGE-A4(+)) 또는 A549.A2.MAGEA4 세포(A2+, MAGE-A4(+))와 1:1 E:T 비로 공동 배양하였다. IFNγ 방출은 24 시간 후 T-세포 활성에 대한 바이오마커로서 평가되었다. TCR-5 및 TCR-8 T 세포는 공동 배양된 표적 세포가 MAGE-A4를 발현하지만 MAGE-A4 음성이 존재하지 않을 때 INFγ를 분비했다. B) TCR-5, TCR-8 또는 형질도입되지 않은(UTD) T 세포를 A375 세포(A2+, MAGE-A4(+)), A549.A2.MAGEA4 세포(A2+, MAGE-A4(+)), 또는 U20S 세포(A2+, MAGE-A4(낮음))와 10:1, 5:1 및 2.5:1 E:T 비로 공동 배양하였다. 세포독성은 임피던스를 통해 6 시간 후 종양 세포 단독에 대한 정규화된 백분율로 측정되었다. TCR-5 및 TCR-8 T 세포는 3개의 MAGE-A4 발현 세포주에 대해 필적할만한 세포독성을 매개하였다.
도 13의 A) 및 B)는 완전 인간 MAGE-A4 TCR(TCR-5) 또는 강화된 변이체(TCR-8)를 발현하는 T 세포가 MAGE-A4 발현 종양을 갖는 마우스에서 퇴행을 매개한다는 것을 나타낸다. 5 마리의 NSG 마우스(각 조건)에 MAGEA4(+) A375 종양 세포를 피하 주사하고 비히클, UTD T 세포 또는 완전 인간 MAGE-A4 TCR(TCR-5) 또는 강화된 변이체(TCR-8)를 발현하는 T 세포로 처리했다. 종양 성장을 주 2회 측정하고 TCR T 세포 항종양 활성을 UTD 및 비히클 대조군을 투여받은 마우스와 비교하여 평가하였다. A) 50mm3 A375 종양이 있는 마우스는 5 x 106(왼쪽) 또는 1.5 x 106(오른쪽) UTD T 세포, TCR-5 T 세포 또는 TCR-8 T 세포를 투여받았다. TCR-5 및 TCR-8 T 세포는 모두 5 x 106 T 세포의 투여량에서 종양을 제어시켰지만, TCR-8 T 세포는 1.5 x 106 T 세포의 더 낮은 투여량에서 종양 제어 증가를 나타내었다. B) 100mm3 A375 종양이 있는 마우스는 10 x 106 UTD T 세포, TCR-5 T 세포 또는 TCR-8 T 세포를 투여받았다. TCR-8 T 세포는 TCR-5 T 세포 또는 UTD T 세포와 비교하여 종양 퇴행 증가를 매개하였다.
A. 개요
MAGE-A4 발현 패턴은 ACT에 적합한 종양 특이적 표적이 된다. MAGE-A4는 HLA-A2 분자에 의해 제시되는 아미노산 서열 GVYDGREHTV(서열 번호 1)를 갖는 데카펩티드(Duffour et al. Eur J Immunol. 1999 10: 3329-37) 형태의 에피토프를 포함한다. 종합하면 MAGE-A4는 ACT에 적합한 종양 특이적 표적이다. 암 면역 요법을 위한 MAGE-A 항원을 표적으로 하는 새롭고 안전하고 효과적인 TCR 이펙터가 필요하다. 본 발명은 암세포 상의 MAGE-A4 항원을 효율적으로 표적화하는 T 세포 수용체에 관한 것으로, 이러한 미충족 의학적 요구를 해결하는 것을 목표로 한다.
B. 정의
바람직한 구현예들 중 일부와 관련하여 본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 하기의 일반적인 정의가 제공된다.
하기에서 예시적으로 설명된 바와 같은 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들이 없이 적합하게 실시될 수 있다.
본 발명은 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기재될 것이지만, 본 발명은 이에 제한되지 않으며 청구범위에 의해서만 제한된다.
용어 "포함하는(comprising)"이 상세한 설명 및 청구범위에서 사용되는 경우, 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "~로 이루어진(consisting of)"은 용어 "~을 포함하는(comprising of)"의 바람직한 구현예로 간주된다. 이하, 그룹이 적어도 특정 수의 구현예를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 또한 바람직하게는 이러한 구현예만으로 이루어진 그룹을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "수득된(obtained)"은 용어 "수득가능한(obtainable)"의 바람직한 구현예인 것으로 간주된다. 이하, 예를 들어 항체가 특정 공급원으로부터 수득가능한 것으로 정의될 경우, 이는 또한 상기 공급원으로부터 수득된 항체를 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
단수 명사를 언급할 때 부정 관사 또는 정관사, 예를 들어 “a”“an”또는 “the”가 사용되는 경우, 이는 특별히 다른 언급이 없는 한 상기 명사의 복수를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 용어 "약" 또는 "대략"은 당업자가 해당 특징의 기술적 효과를 여전히 보장하도록 이해하는 정확도의 차를 나타낸다. 상기 용어는 전형적으로 표시된 수치로부터 ±10%, 바람직하게는 ±5%, 보다 바람직하게는 ±2%, 가장 바람직하게는 ±1%의 편차를 나타낸다.
달리 표시되지 않는 한, 일련의 요소 앞에 오는 용어 "적어도"는 시리즈의 모든 요소를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "적어도 하나"는 하나 이상, 예를 들어 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열 또는 그 이상을 의미한다. 당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 단지 일반적인 실험만으로 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 전부 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
용어 "미만" 또는 "초과"라는 용어는 구체적인 숫자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 20 미만은 표시된 숫자보다 작음을 의미한다. 유사하게, 초과 또는 보다 많은이란 표시된 수보다 많거나 큰 것을 의미하며, 예를 들어, 80% 초과는 표시된 수인 80%보다 많거나 큼을 의미한다.
용어 "포함하는(including)"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미한다. "포함하는" 및 "포함하지만 제한되지 않는"은 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서의 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 단수는 복수를 포함한다. 특히, 부정관사가 사용되는 경우, 명세서는 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 단수뿐만 아니라 복수도 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
기술 용어는 당업자에게 상식 또는 의미로 사용된다. 특정 용어에 특정한 의미가 전달되는 경우, 용어의 정의는 해당 용어가 사용되는 맥락에서 이하에 제시된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 추가 정의가 제시된다.
위 또는 아래에 상관없이 본 명세서의 텍스트 전체에 인용된 모든 간행물(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 지침 등 포함)은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 개시보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 참고로 포함된 자료가 이 사양과 모순되거나 일치하지 않는 경우 사양은 그러한 자료를 대체한다.
본원에 인용된 모든 문헌 및 특허 문헌의 내용은 그 전체가 참고로 포함된다.
C. TCR 배경
TCR은 2 개의 상이한 및 개별 단백질 사슬, 즉 TCR 알파(α) 및 TCR 베타(β) 사슬로 구성된다. TCR α 사슬은 가변(V), 연결(J) 및 불변(C) 영역을 포함한다. TCR β 사슬은 가변(V), 다양성(D), 연결(J) 및 불변(C) 영역을 포함한다. TCR α 및 TCR β 사슬 둘 모두의 재배열된 V(D)J 영역은 초가변 영역(CDR, 상보성 결정 영역)을 함유하고, 그 중 CDR3 영역이 특정 에피토프 인식을 결정한다. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 둘 모두는 C-말단 영역에서 소수성 막관통 도메인을 함유하고 짧은 세포질 꼬리로 끝난다.
전형적으로, TCR은 하나의 α 사슬 및 하나의 β 사슬의 이종 이량체이다. 상기 이종 이량체는 펩티드를 제시하는 MHC 분자와 결합할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "가변 TCR α 영역" 또는 "TCR α 가변 사슬" 또는 "가변 도메인"은 TCR α 사슬의 가변 영역을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 용어 "가변 TCR β 영역" 또는 "TCR β 가변 사슬"은 TCR β사슬의 가변 영역을 지칭한다.
TCR 유전자좌 및 유전자는 국제 면역 유전학(International Immunogenetics, IMGT) TCR 명명법을 사용하여 명명된다(IMGT Database, www. IMGT.org; Giudicelli et al. Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006).; Lefranc and Lefranc, Academic Press 2001).
D. MAGE-A4
제1 양태는 MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다.
MAGE-A4는 소위 암/고환 항원 그룹에 속한다. 암/고환 항원은 다양한 악성 종양 및 생식 세포에서 발현되지만 다른 성인 조직에서는 발현되지 않는다. 따라서 MAGE-A4는 흥미로운 면역치료 표적 항원이다. MAGE-A4를 암호화하는 인간 유전자는 MAGEA4(ENSG00000147381)로 지정된다.
특히, 본 발명에서 고려되는 TCR은 MAGE-A4의 아미노산 230 내지 239를 포함하는 에피토프, 즉, 아미노산 서열 서열 번호 1(GVYDGREHTV; 본원에서 MAGE-A4GVY로도 표시됨) 또는 이의 단편을 특이적으로 인식한다.
전형적으로, TCR은 주조직적합성복합체(MHC) 분자에 의해 제시될 때 항원의 펩티드 단편을 인식한다.
인간 백혈구 항원(HLA) 시스템 또는 복합체는 인간의 주조직적합성복합체(MHC) 단백질을 암호화하는 유전자 복합체이다. HLA-A*02(HLA-A2)는 HLA-A 유전자 자리에 있는 하나의 특정 클래스 I 주조직적합성복합체(MHC) 대립 유전자군이다. HLA-A*02:01은 특정 HLA-A*02 대립 유전자이다.
따라서 특정 구현예에서, TCR은 서열 번호 1의 아미노산 서열의 HLA-A2 결합 형태를 특이적으로 인식한다. 보다 더 특정 구현예에서, TCR은 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식한다.
TCR은 MAGE-A4에 대해 매우 특이적이며 다른 펩티드에 대해 교차 반응성을 나타내지 않는다. 이는 TCR이 MAGE-A4를 발현하지 않는 심장근육세포, 내피세포, 폐섬유아세포, 간세포, 신장 피질 상피 세포, 성상세포, 기관지 상피 세포 및 뉴런을 포함한 정상 인간 세포주를 인식하지 못한다는 것을 의미한다. 교차 반응성은 본 명세서에 기재된 바와 같이 IFN-γ 분비에 의해 측정될 수 있다.
문맥에서 용어 "~에 특이적인"은 TCR이 표적에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, TCR은 MAGE-A4에 특이적이며, HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다.
E. TCR 특이적 서열
TCR의 TCR α 사슬의 CDR3은 서열 번호 4, 서열 번호 14 및 서열 번호 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
TCR의 TCR β 사슬의 CDR3은 서열 번호 7, 서열 번호 17 및 서열 번호 27로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에는 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하는 단리된 TCR에 관한 것이며, 여기서 a) TCR α 사슬은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고, TCR β 사슬은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고; 또는 b) TCR α 사슬은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고, TCR β 사슬은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고; 또는 c) TCR α 사슬은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는CDR3을 포함하고, TCR β 사슬은 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다.
보다 구체적인 구현예는 단리된 TCR에 관한 것이며, 여기서 TCR은 a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 사슬, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 사슬; b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 사슬, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 사슬; 또는 c) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 사슬, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 사슬을 포함한다.
바람직한 구현예는 CDR, 특히 전술한 바와 같은 TCR α 및 TCR β 사슬의 CDR3에 의해 정의되는 단리된 TCR에 관한 것이며, 여기서 재조합 TCR 서열은 뮤린화된, 바람직하게는 최소로 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역을 포함하도록 변형된다. 특히 바람직한 구현예에서, 단리된 TCR은 CDR, 특히 전술한 바와 같은 TCR α 및 TCR β 사슬의 CDR3에 의해 정의되며, 여기서 재조합 TCR 서열은 최소로 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역 및 Cα 막관통 도메인의 소수성 아미노산 돌연변이를 포함하도록 변형된다.
특정 구현예에서, 이들 TCR은 최소로 뮤린화되지 않고 Cα 막관통 영역 내 소수성 돌연변이를 포함하지 않는 TCR과 비교하여 증가된 발현 및 기능적 결합력을 갖는다.
추가의 바람직한 구현예에서, 단리된 TCR은 CDR에 의해, 특히 전술한 바와 같은 TCR α 및 TCR β 사슬의 CDR3에 의해 정의되며, 여기서 재조합 TCR 서열은 뮤린화되거나 최소로 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역을 함유하도록 변형되지 않는다.
일부 구현예는 단리된 TCR과 관련되며, 여기서 TCR은 a) 서열 번호 8과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는 b) 서열 번호 18과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 19와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는 c) 서열 번호 28과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "적어도 80% 동일한", 특히 "적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는"은 아미노산 서열이 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR은 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하며, 여기서 a) 가변 TCR α 영역은 서열 번호 8과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고, 가변 TCR β 영역은 서열 번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하거나; 또는 b) 가변 TCR α 영역은 서열 번호 18과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고, 가변 TCR β 영역은 서열 번호 19와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하거나; 또는 c) 가변 TCR α 영역은 서열 번호 28과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고, 가변 TCR β 영역은 서열 번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다.
예시적인 구현예는 단리된 TCR과 관련되며, 여기서 TCR은 a) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는 b) a) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는 c) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함한다.
아래의 표는 예시적인 TCR의 요약을 나타낸다.
Figure pct00001
실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 명세서에서 고려되는 TCR은 MAGE-A4에 특이적이다.
다중 서열들 간의 퍼센트 동일성의 결정은 바람직하게는 Vector NTI AdvanceTM 10 프로그램(Invitrogen Corporation, Carlsbad CA, USA)의 AlignX 응용프로그램을 사용하여 달성된다. 이 프로그램은 수정된 Clustal W 알고리즘을 사용한다(Thompson et al. Nucl Acids Res 1994; 42: 23-33; Invitrogen Corporation. User Manual2004; 389-662). 퍼센트 동일성의 결정은 AlignX 응용프로그램의 표준 매개변수를 이용해 수행된다.
본 발명에서 고려되는 TCR은 단리되거나 정제된다. "단리된(isolated)"은 상기 TCR이 원래 자연에서 발생하는 맥락에서는 존재하지 않음을 의미한다. "정제된(purified)"은 예를 들어 상기 TCR이 원래 유래한 세포의 다른 단백질 및 비단백질 부분이 없거나 또는 실질적으로 없는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, TCR의 아미노산 서열은 하나 이상의 표현형 침묵 치환을 포함할 수 있다.
"표현형 침묵 치환(phenotypically silent substitutions)"은 "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitutions)"으로도 명명된다. "보존적 아미노산 치환"의 개념은 당업자에 의해 이해되고 바람직하게는 양으로 하전된 잔기(H, K, 및 R)를 암호화하는 코돈이 양으로 하전된 잔기를 암호화하는 코돈으로 치환되고, 음으로 하전된 잔기(D 및 E)를 암호화하는 코돈은 음으로 하전된 잔기를 암호화하는 코돈으로 치환되고, 중성 극성 잔기(C, G, N, Q, S, T, 및 Y)를 암호화하는 코돈은 중성 극성 잔기를 암호화하는 코돈으로 치환되며, 중성 비극성 잔기(A, F, I, L, M, P, V, 및 W)를 암호화하는 코돈은 중성 비극성 잔기를 암호화하는 코돈으로 치환되는 것을 의미한다. 상기 변이는 자발적으로 발생하거나, 무작위 돌연변이 유발에 의해 도입되거나 또는 유도 돌연변이 유발에 의해 도입될 수 있다. 상기 변화는 상기 폴리펩티드의 본질적인 특성을 파괴하지 않고 이루어질 수 있다. 통상적으로 당업자는 상기 변이가 리간드 결합 능력을 실질적으로 감소시키거나 파괴하는지 결정하기 위해 당업계에 공지된 방법으로 이들을 암호화하는 핵산 및/또는 변이 아미노산을 용이하게 및 일상적으로 스크리닝할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, TCR의 아미노산 서열은 검출가능한 표지, 치료제 또는 약동학적 변형 모이어티를 포함하도록 변형된다.
검출가능한 표지에 대한 비제한적인 예는 방사성 표지, 형광 표지, 핵산 프로브, 효소 및 조영제이다. TCR과 연관될 수 있는 치료제는 방사성 화합물, 면역조절제, 효소 또는 화학치료제를 포함한다. 치료제는 화합물이 표적 부위에서 천천히 방출될 수 있도록 TCR에 연결된 리포솜에 의해 둘러싸일 수 있다. 이것은 체내 수송 중 손상을 방지하고 치료제, 예를 들어 독소가 관련 항원 제시 세포에 TCR이 결합된 후 최대 효과를 발휘하도록 한다. 치료제의 다른 예는 펩티드 세포독소, 즉 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 박테리아 외독소 A, DNase 및 RNase와 같은 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 단백질 또는 펩티드이다. 소분자 세포독성제, 즉 700 달톤 미만의 분자량을 갖는 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 화합물. 이러한 화합물은 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 소분자 세포독성제는 전구약물, 즉 생리학적 조건하에서 붕괴되거나 전환되어 세포독성제를 방출하는 화합물도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 제제는 예를 들어 도세탁셀(docetaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 시스-플라틴(cis-platin), 메이탄신 유도체(maytansine derivatives), 라첼마이신( rachelmycin), 칼리키아미신(calicheamicin), 에토포시드(etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), 포르피머 나트륨 포토프린 II(porfimer sodium photofrin II), 테모졸리미드(temozolomide), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉세이트 글루코로네이트(trimetrexate glucoronate), 미톡산트론(mitoxantrone), 아우리스타틴 E(auristatin E), 빈크리스틴(vincristine) 및 독소루비신(doxorubicin); 방사성핵종, 예를 들어 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213을 포함할 수 있다. 방사성핵종의 TCR 또는 이의 유도체와의 회합은 예를 들어 킬레이트제; 면역증강물질(immunostimulant)로도 알려진 면역자극제(immunostimulator), 즉 면역 반응을 자극하는 면역 이펙터 분자에 의해 수행될 수 있다. 예시적인 면역자극제로는 사이토카인 예컨대 IL-2 및 IFN-γ, 항-T 세포 또는 NK 세포 결정자 항체(예를 들어 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16)를 포함한 항체 또는 이의 단편; 항체 유사 결합 특성을 갖는 대안적인 단백질 스캐폴드; 수퍼항원, 즉 다클론성 T 세포 활성화 및 대량의 사이토카인 방출을 초래하는 T-세포의 비-특이적 활성화를 야기하는 항원 및 이의 돌연변이체; 케모카인 예컨대 IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등 보체 활성물; 이종발생 단백질 도메인, 동종이계 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 펩티드가 있다.
인간 T 림프구 상의 항원 수용체 분자(T 세포 수용체 분자)는 세포 표면에서 CD3(T3) 분자 복합체와 비공유 결합으로 연결된다. 항-CD3 단클론성 항체와 상기 복합체의 교란은 T 세포 활성화를 유도한다. 따라서, 일부 구현예는 항-CD3 항체와 연결된(일반적으로 알파 또는 베타 사슬의 N- 또는 C-말단에의 융합에 의함) 본원에 기재된 바와 같은 TCR, 또는 상기 항-CD3 항체의 기능적 단편 또는 변이체와 관련된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 항체 단편 및 변이체/유사체는 미니바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, dsFv 및 scFv 단편, Nanobodies™(Ablynx(Belgium)), 카멜리드(camelid)(예를 들어 낙타 또는 라마) 항체로부터 유래한 합성 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인을 포함하는 분자, 및 도메인 항체(친화도 성숙 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인 또는 면역글로불린 가변 경쇄 도메인(Domantis(Belgium)을 포함) 또는 항체-유사 결합 특성을 나타내는 대안적인 단백질 스캐폴드 예컨대 Affibodies(조작된 단백질 A 스캐폴드 Affibody(Sweden) 포함) 또는 Anticalins(조작된 안티칼린 Pieris(Germany) 포함)을 포함한다.
치료제는 바람직하게는 면역 이펙터 분자, 세포독성제 및 방사성핵종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 면역 이펙터 분자는 사이토카인이다.
약동학적 변형 모이어티는 예를 들어 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 반복 단위, 적어도 하나의 글리콜 기, 적어도 하나의 시알릴 기 또는 이의 조합물일 수 있다. 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 반복 단위, 적어도 하나의 글리콜 기, 적어도 하나의 시알릴 기의 연결은 당업자에게 공지된 다수의 방식으로 야기될 수 있다. 바람직한 구현예에서 상기 단위는 TCR에 공유결합으로 연결될 수 있다. 본 발명에서 고려되는 TCR은 하나 또는 몇 개의 약동학적 변형 모이어티에 의해 변형될 수 있다. 특히, TCR의 가용성 형태는 하나 또는 몇 개의 약동학적 변형 모이어티에 의해 변형될 수 있다. 약동학적 변형 모이어티는 치료제의 약동학적 프로파일에 유리한 변화, 예를 들어 혈장 반감기의 개선, 면역원성의 감소 또는 강화 및 용해도의 개선을 달성할 수 있다.
본 발명에 따른 TCR은 가용성이거나 또는 막 결합될 수 있다. 용어 "가용성"은 예를 들어 항원 제시 세포에 치료제를 전달하기 위한 표적제로서의 용도를 위한 가용성 형태(즉 막관통 또는 세포질 도메인이 없음)인 TCR을 지칭한다. 안정성을 위해, 가용성 αβ 이종 이량체 TCR은 바람직하게는 예를 들어, WO 03/020763호에 기재된 바와 같은 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 이황화 결합을 갖는다. αβ 이종 이량체에 존재하는 불변 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 예를 들어 최대 15 또는 최대 10 또는 최대 8 개 이하의 아미노산이 C 말단 또는 C 말단들에서 절단될 수 있다. 입양전달 치료에 사용하기 위해, αβ 이종 이량체 TCR은 예를 들어, 세포질 및 막관통 도메인 둘 모두를 가진 전장 사슬로서 형질감염될 수 있다. TCR은 각각의 알파와 베타 불변 도메인 사이에 천연적으로 발견되는 것에 상응하는 이황화 결합을 함유할 수 있고, 추가로 또는 대안적으로 비-천연 이황화 결합이 존재할 수 있다.
따라서 본 발명에서 고려되는 TCR, 특히 TCR의 가용성 형태는 예를 들어 면역원성의 감소, 유체 역학적 크기(용액에서의 크기) 용해도 및/또는 안정성(예를 들어 단백질의 가수 분해에 대한 보호 강화)의 증가 및/또는 혈청 반감기의 연장을 위해 추가의 기능적 모이어티를 부착시켜 변형될 수 있다. 다른 유용한 기능적 모이어티 및 변형은 환자의 신체에서 본 발명의 TCR을 보유하는 이펙터 숙주 세포를 차단하기 위해 사용될 수 있는 "자살(suicide)" 또는 "안전 스위치(safety switches)"를 포함한다. 일 예로 문헌[Gargett and Brown. Front Pharmacol 2014; 5: 235]에 기재된 유도성 카스파제(Caspase) 9(iCasp9) "안전 스위치"가 있다. 간략하게, 이펙터 숙주 세포는 잘 알려진 방법에 의해 이량체화가 AP1903/CIP와 같은 소분자 이량체화제 약물에 의존하는 카스파제 9 도메인을 발현하도록 변형되고, 변형된 이펙터 세포에서 세포자멸사의 빠른 유도를 초래한다. 상기 시스템은 예를 들어 문헌[유럽 특허 출원 공개번호 EP2173869 (A2)]에 기재되어 있다. 기타 "자살" 또는 "안전 스위치"에 대한 예시로는 예를 들어, 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex Virus) 티미딘 키나아제(HSV-TK), CD20의 발현, 및 항-CD20 항체 또는 myc 태그를 이용한 후속 고갈이 당업계에 공지되어 있다(Kieback et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008 15;105(2):623-628).
변경된 글리코실화 패턴을 갖는 TCR도 본 발명에서 고려된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 글리코실화 패턴은 아미노산 서열(예를 들어, 하기에서 논의된 특정 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재) 및/또는 단백질이 생산되는 숙주 세포 또는 유기체에 따라 달라질 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결 중 하나이다. N-연결은 아스파라긴 잔기 측쇄에의 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 결합 분자에의 N-연결 글리코실화 위치의 추가는 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)으로부터 선택된 하나 이상의 트리-펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경하여 편리하게 달성된다. O-연결 글리코실화 위치는 출발 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 추가 또는 치환함으로써 도입될 수 있다.
TCR의 글리코실화의 또 다른 방법은 단백질에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 연결에 의한 것이다. 사용되는 연결 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 유리 설프히드릴기, 예를 들어 시스테인의 것 (d) 유리 히드록실기, 예를 들어 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것, (e) 방향족 잔기, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 유사하게, 탈글리코실화(즉, 결합 분자에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거)는 트리플루오로메탄술폰산에 TCR을 노출시켜 화학적으로, 또는 엔도- 및 엑소-글리코시다아제를 이용하여 효소적으로 달성될 수 있다.
본 발명에서 고려되는 TCR, 특히 TCR의 가용성 형태에 소분자 화합물과 같은 약물을 추가하는 것이 또한 고려된다. 연결은 공유 결합 또는 정전기력과 같은 비공유 결합 상호 작용을 통해 달성될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 링커들이 약물 접합체를 형성하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명에서 고려되는 TCR, 특히 TCR의 가용성 형태는 추가적으로 변형되어 각자의 분자(태그)의 확인, 추적, 정제 및/또는 단리를 돕는 추가 도메인이 도입될 수 있다. 따라서 일부 구현예에서, TCR α 사슬 또는 TCR β 사슬은 변형되어 에피토프 태그를 포함할 수 있다.
에피토프 태그는 TCR에 포함될 수 있는 태그의 유용한 예이다. 에피토프 태그는 특정 항체의 결합을 허용하는 짧은 구간의 아미노산이며 따라서 가용성 TCR 또는 환자의 신체 내의 숙주 세포 또는 배양된 (숙주) 세포의 결합 및 이동의 확인과 추적을 가능하게 한다. 에피토프 태그와 따라서 태그된 TCR의 검출은 다수의 상이한 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 태그는 또한 상기 태그에 대해 특이적인 결합 분자(항체)의 존재 하에 세포를 배양하여 본 발명의 TCR을 보유하는 숙주 세포의 자극 및 증폭에 이용될 수 있다.
일반적으로, TCR은 일부 경우에 표적 항원과 TCR의 친화도 및 오프-비율(off-rate)을 변형시키는 다양한 돌연변이로 변형될 수 있다. 특히, 돌연변이는 친화도를 증가시킬 수 있고/있거나 오프-비율을 감소시킬 수 있다. 따라서, TCR은 적어도 하나의 CDR 및 이의 가변 도메인 프레임워크 영역에서 돌연변이될 수 있다.
그러나, 바람직한 구현예에서 TCR의 CDR 영역은 실시예의 TCR 수용체와 같이 변형되거나 또는 시험관 내 친화도 성숙이 이루어지지 않는다. 이는 CDR 영역이 자연적으로 발생하는 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 이는 시험관 내 친화도 성숙이 TCR 분자에 대한 면역원성으로 이어질 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 이는 치료적 효과 및 치료를 감소시키거나 불활성화시키고/거나 부작용을 유발하는 항-약물 항체의 생산으로 이어질 수 있다
돌연변이는 하나 이상의 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)일 수 있다. 이들 돌연변이는 DNA 합성, 중합효소 연쇄 반응, 제한 효소 기반 클로닝, 결찰 독립 클로닝 절차와 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 도입될 수 있으며, 이는 예를 들어 문헌[Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012]에 기재되어 있다.
이론적으로, 내인성 및 외인성 TCR 사슬 간의 잘못짝짓기로 인해 교차 반응성의 위험이 있는 예측불가의 TCR 특이성이 발생할 수 있다. TCR 서열의 잘못짝짓기를 피하기 위해, 재조합 TCR 서열은 몇 개의 상이한 형질도입 TCR 사슬의 정확한 짝짓기를 효과적으로 향상시키는 것으로 입증된 기술로, 최소로 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역을 함유하도록 변형될 수 있다. TCR의 뮤린화(즉 알파 및 베타 사슬에서 인간 불변 영역을 뮤린 대응물로 교환)는 숙주 세포에서 TCR의 세포 표면 발현을 개선하기 위해 통상적으로 적용되는 기술이다. 특정 이론에 구속되길 바라지 않으면서, 뮤린화된 TCR은 CD3 공-수용체와 보다 유효하게 회합되고/거나; 우선적으로 서로 쌍을 이루고, 원하는 항원 특이성의 TCR을 발현하도록 생체 외에서 유전적으로 변형된 인간 T 세포 상의 혼합 TCR을 형성하는 경향이 작으나, "원래의(original)" TCR을 여전히 보유하고 발현하는 것으로 여겨진다.
뮤린화된 TCR의 개선된 발현의 원인이 되는 9개의 아미노산이 확인되었고(Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010; 184(11):6223-6231), TCR 알파 및/또는 베타 사슬 불변 영역에 있는 하나의 또는 모든 아미노산 잔기를 뮤린 대응 잔기로 치환하는 것이 고려된다. 이러한 기술은 "최소의 뮤린화(minimal murinization)"로도 지칭되고, 세포 표면 발현을 강화하면서 동시에 아미노산 서열에서 "외래" 아미노산 잔기의 수를 감소시키고 이로써 면역원성의 위험을 감소시키는 이점을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 최소로 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역을 함유하는 TCR은 서열 번호 10의 α 사슬 및 서열 번호 11의 β 사슬을 포함하는 TCR-1, 서열 번호 20의 α 사슬 및 서열 번호 11의 β 사슬을 포함하는 TCR-2, 서열 번호 30의 α 사슬 및 서열 번호 31의 β 사슬을 포함하는 TCR-3이다.
바람직한 구현예에서, TCR은 최소로 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역을 함유하고 Cα 막관통 도메인에 소수성 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다. TCR α 사슬의 막관통 도메인은 전체 사슬의 안정성 부족에 기여하여 전체 TCR-CD3 복합체의 형성 및 표면 발현에 영향을 미치는 것으로 나타났다. TCR α 막관통 도메인의 3개 아미노산을 소수성 아미노산인 류신 또는 발린으로 치환하면 TCR 발현과 기능적 결합력이 증가하였다. Haga-Friedman et al. J. Immunology 2012; 188:5538-5546.
바람직한 구현예에서, 최소로 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역 및 TCR α 사슬에 소수성 아미노산 치환을 함유하는 TCR은 서열 번호 102의 α 사슬 및 서열 번호 103의 β 사슬을 포함하는 TCR-7, 서열 번호 108의 α 사슬 및 서열 번호 109의 β 사슬을 포함하는 TCR-8, 서열 번호 114의 α 사슬 및 서열 번호 115의 β 사슬을 포함하는 TCR-9이다.
일부 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 단리된 TCR와 관련되며, 여기서 TCR은 단일 사슬 유형이고, TCR α 사슬 및 TCR β 사슬은 링커 서열에 의해 연결되고, 선택적으로 링커는 절단가능하다.
적합한 단일 사슬 TCR 형태는 가변 TCR α 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제1 세그먼트, TCR β 사슬 불변 영역의 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 가변 TCR β 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제2 세그먼트, 및 제1 세그먼트의 C 말단을 제2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다. 대안적으로 제1 세그먼트는 TCR β 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 제2 세그먼트는 TCR α 사슬 불변 영역의 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 단일 사슬 TCR은 또한 제1 사슬과 제2 사슬 사이에 이황화 결합을 포함할 수 있고, 여기에서 링커 서열의 길이 및 이황화 결합의 위치는 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트의 가변 도메인 서열이 실질적으로 천연의 T 세포 수용체에서와 같이 상호 배향되도록 하는 것이다. 보다 구체적으로 제1 세그먼트는 TCR α 사슬 불변 영역의 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 제2 세그먼트는 TCR β 사슬 불변 영역의 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 제1 사슬과 제2 사슬 사이에 이황화 결합이 제공될 수 있다. 링커 서열은 TCR의 기능을 손상시키지 않는 임의의 서열일 수 있다.
"기능적" TCR α 및/또는 β 사슬 융합 단백질은 적어도 실질적인 생물학적 활성을 유지하는 TCR 또는 예를 들어 아미노산의 추가, 결실 또는 치환에 의해 변형된 TCR 변이체를 의미하여야 한다. TCR의 α 사슬 및/또는 β 사슬의 경우에, 이는 두 사슬 모두 그의 생물학적 기능, 특히 상기 TCR의 특정 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 및/또는 특정 펩티드:MHC 상호작용시 기능적 신호 전달을 나타내는(비-변형된 α 사슬 및/또는 β 사슬, 또는 본 발명의 다른 융합 단백질 α 사슬 및/또는 β 사슬 중 하나를 갖는) T-세포 수용체를 계속 형성할 수 있음을 의미해야 한다.
특정 구현예에서, TCR은 기능적 T-세포 수용체(TCR) α 사슬 및/또는 β 사슬 융합 단백질이 되도록 변형될 수 있고, 여기에서 상기 에피토프-태그는 6 내지 15개의 아미노산, 바람직하게는 9 내지 11개의 아미노산 길이를 갖는다. 다른 구현예에서 TCR은 기능적 T-세포 수용체(TCR) α 사슬 및/또는 β사슬 융합 단백질이 되도록 변형될 수 있고, 여기에서 상기 T-세포 수용체(TCR) α 사슬 및/또는 β 사슬 융합 단백질은 서로 이격되거나 또는 일직선으로 직렬로 된 2개 이상의 에피토프-태그를 포함한다. 융합 단백질의 구현예는 융합 단백질이 생물학적 활성/활성들을 유지하는("기능적인") 한, 2, 3, 4, 5개 또는 훨씬 더 많은 에피토프-태그를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 기능적 T-세포 수용체(TCR) α 사슬 및/또는 β 사슬 융합 단백질이 바람직하고, 여기에서 상기 에피토프-태그는 CD20 또는 Her2/neu 태그 또는 기타 통상적인 태그 예컨대 Myc-태그, FLAG-태그, T7-태그, HA(혈구 응집소(hemagglutinin))-태그, His-태그, S-태그, GST-태그 또는 GFP-태그로부터 선택되나 이에 제한되지 않는다. Myc-, T7-, GST-, GFP-태그는 기존 분자에서 유래한 에피토프이다. 대조적으로, FLAG는 높은 항원성을 위해 설계된 합성 에피토프 태그이다(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,703,004호 및 제4,851,341호 참조). 상기 myc 태그는 고품질의 시약이 입수 가능하여 검출에 이용되기 때문에 바람직하게 사용될 수 있다. 에피토프 태그는 물론 항체에 의한 인식을 넘어서 하나 이상의 추가 기능을 가질 수 있다. 상기 태그의 서열들이 문헌에 기술되어 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다.
보다 바람직한 구현예에서, 단리된 TCR은 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬은 하나 이상의 폴리펩티드 절단 신호 신호에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 5' 내지 3': TCR α 사슬, 하나 이상의 폴리펩티드 절단 신호 신호, 및 TCR 사슬을 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 5' 내지 3': TCR β 사슬, 하나 이상의 폴리펩티드 절단 신호 신호, 및 TCR α 사슬을 포함한다.
본원에서 고려되는 폴리펩티드 절단 신호는 프로테아제 절단 부위 및 리보솜 스킵 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 폴리펩티드 절단 신호는 본원에 기재된 각각의 폴리펩티드 도메인, 예를 들어 TCR α 사슬과 TCR β 사슬 사이에 배치될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 절단 신호는 임의의 링커 펩티드 서열에 삽입될 수 있다. 예시적인 폴리펩티드 절단 신호는 폴리펩티드 절단 인식 부위, 예를 들어 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한 효소 인식 부위, 자가-절단 리보자임 인식 부위), 및 자가-절단 바이러스 올리고펩티드 또는 리보솜 스킵 서열을 포함한다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26)] 참조).
특정 구현예에 사용하기에 적합한 프로테아제 절단 부위의 예시적인 예는 푸린(예를 들어, Arg-XX-Arg, 예컨대 Arg-X-Lys/Arg-Arg 또는 Arg-GIn/Tyr-Lys/Arg-Arg)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 푸린은 서열 Arg-Ala-Arg-Tyr-Lys-Arg 또는 Arg-Ala-Arg-Tyr-Lys-Arg-Ser); 서브틸리신(예를 들어, PC2, PC1/PC3, PACE4, PC4, PC5/PC6, LPC/PC7IPC8/SPC7 및 SKI-I); 엔테로키나제(예를 들어, Asp-Asp- Asp-Aps-Lys* 및 Asp/Glu-Arg-*Met); 인자 Xa(예를 들어, Glu-Gly-Arg*); 트롬빈(예를 들어, Leu-Val-Pro-Arg*Gly-Ser); 그랜자임 B(예를 들어, Ile-Glu-Pro-Asp*); 카스파제-3(예를 들어, Asp-Glu-Val-Asp*); 등을 추가로 절단할 수 있다.
자가-절단 바이러스 펩티드 또는 리보솜 스킵 서열의 예시적인 예는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). 특정 구현예에서, 바이러스 2A 펩티드는 아프토바이러스 2A 펩티드, 포티바이러스 2A 펩티드, 또는 카디오바이러스 2A 펩티드이다. 바람직한 구현예에서, 바이러스 2A 펩티드는 구제역 바이러스 2A 펩티드(F2A), 말 비염 A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 토세아 아시안나(thosea asigna) 바이러스 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스-1 2A 펩티드(P2A), 테일로바이러스 2A 펩티드, 뇌심근염 바이러스 2A 펩티드로 이루어진 군에서 선택된다.
특정 구현예에서, 융합 단백질은 TCR α 사슬, 단백질 분해 절단 부위 및/또는 리보솜 스킵 서열 및 TCR β 사슬을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 TCR α 사슬, 푸린 절단 부위 및/또는 P2A 리보솜 스킵 서열 및 TCR β 사슬을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 TCR α 사슬, P2A 리보솜 스킵 서열, 및 TCR β 사슬을 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 단백질은 TCR β 사슬, 단백질 분해 절단 부위 및/또는 리보솜 스킵 서열 및 TCR α 사슬을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 TCR β 사슬, 푸린 절단 부위 및/또는 P2A 리보솜 스킵 서열 및 TCR α 사슬을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 TCR β 사슬, P2A 리보솜 스킵 서열, 및 TCR α 사슬을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 서열 번호 94, 96, 98, 104, 110, 및 116 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
F. TCR 단편 및 변이체
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드와 관련된다. 기능적 부분은 서열 번호 4, 서열 번호 14, 서열 번호 24, 서열 번호 7, 서열 번호 17, 서열 번호 27로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 폴리펩티드는 TCR 단독의 기능적 부분, 예를 들어 가용성 형태일 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 다른 도메인과 조합될 수 있다.
기능적 부분은 항원, 특히 항원-MHC 복합체에 대한 TCR의 결합을 매개할 수 있다. 일 구현예에서, 기능적 부분은 본원에 기재된 바와 같은 TCR α 가변 사슬 및/또는 TCR β 가변 사슬을 포함한다.
TCR 변이체 분자, 즉 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드를 다른 도메인과 결합하는 분자는, TCR 수용체의 결합 특성을 가질 수 있으나 이펙터 세포의 신호 전달 도메인(T 세포 이외), 특히 NK 세포의 신호 전달 도메인과 결합할 수 있다. 따라서, 일부 구현예는 이펙터 세포, 예컨대 NK 세포의 신호 전달 도메인과 함께 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 기능적 부분을 포함하는 단백질과 관련된다.
"결합"은 표적과 특이적이고 비공유적으로 회합, 연합 또는 결합하는 능력을 지칭한다.
또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 TCR을 포함하는 다가 TCR 복합체를 지칭한다. 이 양태의 한 구현예에서, 적어도 2개의 TCR 분자가 링커 모이어티를 통해 연결되어 다가 복합체를 형성한다. 바람직하게는, 복합체는 수용성이므로 링커 모이어티는 그에 따라 선택되어야 한다. 링커 모이어티는 TCR 분자의 정의된 위치에 부착할 수 있어, 형성된 복합체의 구조적 다양성이 최소화되는 것이 바람직한다. 본 양태의 일 구현예는 TCR의 가변 영역 서열에 위치하지 않는 각 TCR의 아미노산 잔기 사이에서 중합체 사슬 또는 펩티드 링커 서열이 연장되는 TCR 복합체에 의해 제공된다. 복합체가 의약에 사용하기 위한 것일 수 있으므로, 링커 모이어티는 예를 들어 면역원성과 같은 약제학적 적합성을 고려하여 선택되어야 한다. 상기 바람직한 기준을 충족하는 링커 모이어티의 예는 당업계, 예를 들어 항체 단편을 연결하는 분야에 공지되어 있다.
링커의 예로는 친수성 중합체 및 펩티드 링커가 있다. 친수성 중합체의 예로는 폴리알킬렌 글리콜이 있다. 상기 부류 중 가장 일반적으로 이용되는 것은 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG에 기초한다. 그러나, 다른 것들은 다른 적합한, 선택적으로 치환된, 폴리프로필렌 글리콜을 비롯한 폴리알킬렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체에 기초한다. 펩티드 링커는 아미노산 사슬, 및 TCR 분자가 부착될 수 있는 단순 링커 또는 다량체화 도메인을 생산하는 기능부로 구성된다.
일 구현예는 다가 TCR 복합체와 관련되며, 여기서 상기 TCR 중 적어도 하나는 치료제와 회합된다.
G. 사이토카인 및 케모카인 방출
일부 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 단리된 TCR, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체와 관련되고, 여기서 IFN-γ 분비는, 이펙터 세포 상에서 발현된 본 발명의 TCR이 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 결합함으로써 유도된다.
이펙터 세포 상에서 발현된 본 발명의 TCR이 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 결합함으로써 유도된 IFN-γ 분비는, HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 관련 없는 펩티드(ASTN1, 서열 번호 56, KLYGLDWAEL)에의 결합과 비교하여, HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 결합할 때 100 배 초과, 바람직하게는 500 배 초과, 보다 바람직하게는 2000 배 초과일 수 있다. IFN-γ 분비는 예를 들어 100 pg/ml 초과, 예를 들어 500 pg/ml 초과, 또는 2000 pg/ml 초과일 수 있다.
IFN-γ 분비와 같은 사이토카인 및 케모카인 방출은, K562 세포(Greiner et al. 2006, Blood. 2006 Dec 15;108(13):4109-17)를 ivtRNA로 형질감염시키거나 각각 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 관련 없는 펩티드를 발현하도록 형질도입하고 조사 대상 TCR을 발현하는 CD8+ 농축 및/또는 비-CD8+ 농축 PBMC와 함께 인큐베이션하는 시험관 내 분석, 또는 T 세포를 서열 번호 1 또는 관련 없는 펩티드 중 하나로 외부 로딩하고 후속하여 조사 대상 TCR을 발현하는 CD8+ 농축 및/또는 비-CD8+ 농축 PBMC와 함께 공동-인큐베이션하는 시험관 내 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
일부 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 단리된 TCR, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체와 관련되며, 여기서 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 특히 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 이펙터 세포 상에서 발현된 본 발명의 TCR을 결합시킴으로써 유도된 IFN-γ 분비는 미리 정의된 임계값 미만이다. 임계값은 적어도 2:1의 특정 이펙터 대 표적 비를 사용하여 결정될 수 있다.
"이펙터 세포"는 말초 혈액 림프구(PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)일 수 있다. 전형적으로, 이펙터 세포는 면역 이펙터 세포, 특히 T 세포이다. 기타 적합한 세포 유형은 감마-델타 T 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 NK-유사 T 세포를 포함한다.
HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 이펙터 세포 상에서 발현된 본 발명의 TCR을 결합할 때의 IFN-γ 분비는, 적어도 10-7 [M], 바람직하게는 적어도 10-8 [M], 보다 바람직하게는 10-9 [M]의 MAGE-A4 펩티드 농도로 유도될 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어 TCR-트랜스제닉 T 세포 대 T2 세포의 비가 2:1인 경우, HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 이펙터 세포 상에서 발현된 본 발명의 TCR이 결합할 때의 IFN-γ 분비는, 적어도 10-7 [M], 바람직하게는 적어도 10-8 [M], 보다 바람직하게는 10-9 [M]의 MAGE-A4 펩티드 농도로 유도될 수 있다.
본 발명은 또한 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 표적 아미노산 서열에 결합하는 TCR 또는 이의 단편을 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 후보 TCR 또는 이의 단편을 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열과 접촉시키는 단계, 및 후보 TCR 또는 이의 단편이 표적에 결합하는지 및/또는 면역 반응을 매개하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
후보 TCR 또는 이의 단편이 면역 반응을 매개하는지 여부는 예를 들어 IFN-γ 분비와 같은 사이토카인 분비의 측정에 의해 결정될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 사이토카인 분비는 예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 ivtRNA로 형질감염된 K562 세포(또는 다른 APC)가 조사 대상 TCR을 발현하는 CD8+ 농축 PBMC 또는 조사 대상 TCR의 단편을 포함하는 분자와 함께 인큐베이션하는 시험관 내 분석으로 측정할 수 있다.
H. 핵산, 벡터
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 암호화하거나 또는 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산과 관련된다.
하기 표는 각자의 펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
"핵산 분자" 및 "뉴클레오티드 서열"은 일반적으로 천연 공급원으로부터 합성되거나 수득된(예를 들어, 단리 및/또는 정제된) 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이에서 발견되는 포스포디에스테르 대신에, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드간 연결, 예컨대 포스포로아미데이트 연결 또는 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있는, DNA 또는 RNA의 중합체를 의미한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 핵산은 재조합이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 (i) 살아있는 세포에서 복제할 수 있는 핵산 분자에 대한 천연 또는 합성 핵산 세그먼트를 연결하여 살아있는 세포 외부에서 주조된 분자 또는 (ii) 상기 (i)에 기재된 것들의 복제로 생성된 분자를 지칭한다. 본 발명에서의 목적을 위해, 복제는 시험관 내 복제 또는 생체 내 복제일 수 있다. 핵산은 당업계에 공지되거나 상업적으로 이용가능한(예를 들어 Genscript, Thermo Fisher 및 유사 회사) 절차를 이용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 결찰 반응에 기초하여 주조될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 혼성화 시 형성되는 이중체의 물리적 안정성을 증가시키기 위해(예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환 뉴클레오티드) 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키기 위해 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드 또는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다(문헌[Sambrook 외] 참조). 핵산은 재조합 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 기능적 부분 또는 기능적 변이체 중 어느 것을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서는 또한 단리된 또는 정제된 핵산의 변이체를 제공하며, 여기서 상기 변이체 핵산은 본원에 기재된 TCR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이와 같은 변이체 뉴클레오티드 서열은 MAGE-A4를 특이적으로 인식하는 기능적 TCR을 암호화한다.
본 명세서는 또한 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 정제된 핵산을 제공한다.
엄격한 조건 하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에서 혼성화된다. "고도의 엄격한 조건"은 뉴클레오티드 서열이 비특이적 혼성화보다 더 강하게 검출가능한 양으로 표적 서열(본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 혼성화된다는 것을 의미한다. 고도의 엄격한 조건은 정확한 상보성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 매칭되는 소수의 작은 영역(예를 들어, 3 내지 10 개의 염기)을 우연히 갖는 무작위 서열로부터 소수의 산재된 미스매치만을 함유하는 것을 구별하는 조건을 포함한다. 이러한 작은 상보성 영역은 14 내지 17개 이상의 염기의 전장 상보체보다 쉽게 용융되고, 고도의 엄격한 혼성화로 인해 용이하게 구별할 수 있다. 상대적으로 높은 엄격한 조건으로는, 예를 들어, 약 50 내지 70 ℃의 온도에서 약 0.02 내지 0.1 M NaCl 또는 등가물로 제공되는 것과 같은 저염 및/또는 고온 조건을 포함할 것이다. 상기 고도의 엄격한 조건은 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치(만약 있다면)를 거의 허용하지 못하며, 본원에 기재된 임의의 TCR의 발현을 검출하는데 특히 적합하다. 일반적으로 조건은 포름아미드의 양을 증가시켜 첨가하여 보다 더 엄격해질 수 있는 것으로 이해된다.
특정 구현예에서, 핵산은 코돈 최적화된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코돈 최적화된"은 폴리펩티드의 발현, 안정성 및/또는 활성을 증가시키기 위해 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내 코돈을 치환하는 것을 지칭한다. 코돈 최적화에 영향을 미치는 요인은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: (i) 둘 이상의 유기체 또는 유전자 또는 합성적으로 주조된 편향(bias) 표 간의 코돈 편향의 변동, (ii) 유기체, 유전자 또는 유전자 세트 내의 코돈 편향 정도의 변동, (iii) 맥락을 포함한 코돈의 체계적인 변동, (iv) 해독하는 tRNA에 따른 코돈의 변동, (v) 삼중항의 전체 또는 한 위치에서 GC %에 따른 코돈의 변동, (vi) 참조 서열, 예를 들어 자연 발생 서열에 대한 유사성 정도의 변동, (vii) 코돈 빈도 컷오프의 변동, (viii) DNA 서열로부터 전사된 mRNA의 구조적 특성, (ix) 코돈 치환 세트의 설계가 기초가 되는 DNA 서열의 기능에 대한 사전 지식, (x) 각 아미노산에 대한 코돈 세트의 체계적인 변동 및/또는 (xi) 가짜 번역 시작 부위의 단리된 제거.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터와 관련된다. 벡터는 바람직하게는 플라스미드, 셔틀 벡터, 파지미드, 코스미드, 발현 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 유전자 치료에 사용되는 입자 및/또는 벡터이다.
"벡터"는 암호화된 폴리펩티드의 합성이 일어날 수 있는 적합한 숙주 세포 내로 핵산 서열을 운반할 수 있는 임의의 분자 또는 조성물이다. 전형적으로 및 바람직하게는, 벡터는 원하는 핵산 서열을 포함하도록 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 조작된 핵산이다. 벡터는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고/있거나 리포좀을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 셔틀 벡터, 파지미드 복합체, 코스미드, 발현 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 유전자 요법에 사용되는 입자 및/또는 벡터일 수 있다. 벡터는 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 당업자에게 공지된 기타 유전적 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산의 발현을 허용하는 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 서열 번호 88에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬 및 서열 번호 87에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬; 서열 번호 90에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬 및 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬; 서열 번호 92에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬 및 서열 번호 91에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬; 서열 번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬 및 서열 번호 102에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬; 서열 번호 109에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬 및 서열 번호 108에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬; 또는 서열 번호 115에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬 및 서열 번호 114에 기재된 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬을 암호화하는 핵산을 포함한다.
바람직하게는, 벡터는 발현 벡터이다. 보다 바람직하게는, 벡터는 레트로바이러스, 보다 구체적으로 감마-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다.
I. 세포, 세포주
본 발명의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 발현하는 세포와 관련된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 단리되거나 또는 비자연적으로 발생하는 것이다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 암호화하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
세포에는, 상기 기재된 TCR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 상기 기재된 벡터가 도입될 수 있고 또는 상기 TCR을 코딩하는 ivtRNA가 도입될 수 있다. 세포는 말초 혈액 림프구 예컨대 T 세포일 수 있다. TCR의 클로닝 및 외인성 발현 방법은 예를 들어 문헌[Engels et al. Cancer Cell, 2013; 23(4): 516-526]에 기재되어 있다. 렌티바이러스 벡터로의 1차 인간 T 세포의 형질도입은 예를 들어 문헌[Cribbs et al. BMC Biotechnol. 2013; 13: 98]에 기재되어 있다.
용어 "형질감염"은 외인성 핵산 서열이 숙주 세포, 예를 들어 진핵 숙주 세포로 도입되는 비-바이러스 과정을 지칭한다. 핵산 서열의 도입 또는 전달은 언급된 방법으로 제한되지 않고 전기천공법, 미세주사법, 유전자 총 전달법, 리포펙션 또는 슈퍼펙션(superfection)을 포함한 다수의 임의의 방법으로 달성될 수 있음에 유의한다.
용어 "형질도입"은 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 사용하여 숙주 세포 내로 외인성 핵산 서열을 도입하는 것을 지칭한다.
일부 구현예는 세포와 관련되고, 상기 세포는 a) 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 발현 벡터; 또는 b) 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 알파 사슬을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터, 및 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 베타 사슬을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터를 포함한다
일부 구현예에서, 세포는 말초 혈액 림프구(PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 세포는 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 유사 T(NKT) 세포 또는 T 세포일 수 있다. 바람직하게, 세포는 T 세포이다. T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포또는 이중 음성 T 세포, 즉 CD4 또는 CD8을 발현하지 않는 T 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포-유사 기억 T 세포이다.
바람직한 구현예에서, TCR은 공-수용체와 독립적으로 기능하며, 즉 TCR은 CD8+ 및 CD4+ 세포, 예를 들어, TCR-5 및 TCR-8 모두에서 기능한다.
줄기 세포-유사 기억 T 세포(stem cell-like memory T cells, TSCM)는 CD8+ T 세포의 덜 분화된 하위집단이고, 이는 자가 재생 능력 및 장기간 지속 능력에 의해 특성화된다. 상기 세포들이 생체 내에서 항원을 만나면, 중앙 기억 T 세포(TCM), 이펙터 기억 T 세포(TEM) 및 진행이 중단된 상태로 남아있는 일부 TSCM을 갖는 말단 분화된 이펙터 기억 T 세포(TEMRA)로 더욱 분화한다(Flynn et al., Clinical & Translational Immunology 2014; 3(7): e20.). 상기 남아있는 TSCM 세포는 생체 내에서 영속적인 면역학적 기억을 구축하는 능력을 나타내고 따라서 입양전달 T 세포 치료를 위한 중요한 T 세포 하위집단으로 간주된다(Lugli et al., Nature Protocols 2013; 8: 33-42, Gattinoni et al., Nat. Med. 2011; Oct; 17(10): 1290-1297). T 세포 풀(pool)을 줄기 세포 기억 T 세포 아형으로 한정하기 위해 면역-자성 선택이 이용될 수 있다(Riddell et al. Cancer Journal 2014; 20(2): 141-144).
J. TCR 표적 항체
본 발명의 다른 양태는 MAGE-A4에 대한 특이성을 매개하는 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 일부에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 관련된다. 일 구현예에서, MAGE-A4 특이성을 매개하는 TCR의 일부는 서열 번호 4, 서열 번호 14 및 서열 번호 24로 이루어진 군에서 선택된 TCR 알파 사슬의 CDR3 및 서열 번호 7, 서열 번호 17 및 서열 번호 27로 이루어진 군에서 선택된 베타 사슬의 CDR3을 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편은 TCR의 활성을 조절할 수 있다. 이는 MAGE-A4와 TCR의 결합을 차단하거나 차단하지 않을 수 있다. 이는 TCR의 치료적 활성을 조절하거나 진단 목적을 위해 이용될 수 있다.
K. 약학 조성물, 의학적 치료제 및 키트
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR, 상기 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체, TCR을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 TCR을 포함하는 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 일부에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물과 관련된다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR, 상기 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체, TCR을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 TCR을 포함하는 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 TCR의 일부에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약학 조성물과 관련된다.
본 발명의 상기 활성 성분은 바람직하게는 상기 약학 조성물에서 허용가능한 담체 또는 담체 물질과 혼합된 용량으로 사용되어 질환을 치료하거나 적어도 완화시킬 수 있다. 상기 조성물은 (활성 성분 및 담체에 추가하여) 충전 재료, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제 및 종래 기술로 알려진 기타 재료를 포함할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비독성 물질로 정의된다. 담체의 선택은 적용에 따라 달라진다.
약학 조성물은 활성 성분의 활성을 강화하거나 치료를 보충하는 추가 성분을 함유할 수 있다. 상기 추가 성분 및/또는 인자는 상승적 효과를 달성하거나 부작용 또는 원하지 않는 효과를 최소화하는 약학 조성물의 일부일 수 있다.
본 발명의 활성 성분의 제형 또는 제제 및 적용/약물치료를 위한 기술은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, volume I and volume II. 22nd Edition. Edited by Loyd V. Allen Jr. Philadelphia, PA: Pharmaceutical Press; 2012]에 공개되어 있으며, 상기 문헌은 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된다. 적절한 적용은 비경구 적용, 예를 들어 근육 내, 피하, 골수 내 주사뿐만 아니라 경막 내, 직접 뇌실 내, 정맥 내, 결절 내, 복강 내 또는 종양 내 주사이다. 정맥 주사 또는 주입은 환자의 바람직한 치료법이다.
바람직한 구현예에 따르면, 약학 조성물은 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 주사가능한 조성물은 적어도 하나의 활성 성분, 예를 들어 TCR을 발현하는 증폭된 T 세포 집단(예를 들어 치료될 환자에 대해 자가 또는 동종이계)을 포함하는 약학적으로 허용가능한 유체 조성물이다. 활성 성분은 일반적으로 생리학적으로 허용가능한 담체에 용해되거나 현탁되고, 조성물은 소량의 하나 이상의 비-독성 보조 물질, 예컨대 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서의 융합 단백질과 함께 사용하기에 유용한 상기 주사가능한 조성물이 통상적이며; 적절한 제형은 당업자에게 잘 알려져 있다.
전형적으로, 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
따라서, 또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 TCR, 상기 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체, 상기 TCR을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 TCR을 포함하는 세포, TCR의 일부에 특이적으로 결합하는 항체, 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 조성물 또는 약학 조성물과 관련된다.
일부 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 TCR, 상기 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 다가 TCR 복합체, 상기 TCR을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 TCR을 포함하는 세포, 또는 암 치료에 사용하기 위한 조성물 또는 약학 조성물과 관련된다.
일 구현예에서 상기 암은 혈액암 또는 고형 종양이다. 혈액암은 또한 고형 종양을 형성하지 않아서 신체에 분산되는 혈액 암으로도 명명된다. 혈액암의 예로는 백혈병, 림프종 또는 다발성 골수종이 있다. 고형 종양에는 육종과 암종의 두 가지 주요 유형이 있다. 육종은 예를 들어 혈관, 뼈, 지방 조직, 인대, 림프관, 근육 또는 힘줄의 종양이다.
일 구현예에서, 암은 육종, 전립선암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비소세포 폐암(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 간세포 암종, 두경부암, 위암, 자궁 내막암, 결장직장암, 담관암, 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 암은 NSCLC, SCLC, 유방암, 난소암 또는 결장직장암, 또는 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 암은 요로상피(방광)암, 흑색종, 두경부암, 난소암, NSCLC, 식도암, 위암, 활막 육종 및 점액성 원형 세포 지방육종(MRCLS)으로부터 선택된다.
일 구현예에서, TCR은 폐암 세포주, 예를 들어 NSCLC 세포주 NCI-H1703 및 NSCLC, NCI-H1755의 간 전이 세포주를 인식한다.
(i) 본원에 기재된 바와 같은 단리된 TCR; (ii) 재조합 TCR을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자; (iii) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 TCR을 발현하도록 변형된 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포; (iv) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 중 하나 이상을 함유하는 약학 조성물 및 키트가 본원에서 또한 고려된다. 일부 구현예에서, 본 명세서는 본원에 기재된 재조합 TCR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물 (또는 재조합 TCR을 발현하도록 본원에 기재된 벡터 입자를 이용하여 변형된 T 세포)를 제공한다. 상기 조성물은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 본 명세서의 방법에서 대상체에 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 공지된 기술에 따른 입양전달 면역 요법을 위한 방법 및 조성물 또는 본 명세서에 기초하여 당업자에게 명백할 이의 변형에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 배양 배지로부터 먼저 수확한 다음 세포를 치료 유효량으로 투여에 적합한 배지 및 컨테이너 시스템("약학적으로 허용가능한" 담체)에서 세척 및 농축함으로써 제형화된다. 적합한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제형일 수 있으며, 전형적으로 생리 식염수, Normosol R(Abbott) 또는 Plasma-Lyte A(Baxter)뿐만 아니라 수중 5% 덱스트로오스 또는 링거 락테이트(Ringer's lactate)가 이용될 수 있다. 주입 매질은 인간 혈청 알부민으로 보충될 수 있다.
조성물 내 효과적인 치료를 위한 세포수는 전형적으로 10 개 초과의 세포 및 최대 106, 최대 108 또는 109 개의 세포이며 1010 개 초과의 세포일 수 있다. 세포수는 조성물에 포함된 세포의 유형과 같이 조성물이 의도하는 최종 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 특정 항원에 특이적인 세포가 바람직한 경우, 집단은 상기 세포를 70% 초과, 일반적으로 80% 초과, 85% 초과 및 90 내지 95% 함유할 것이다. 본원에서 제공하는 용도를 위해, 세포는 일반적으로 1 L 이하의 부피이고, 500 ml 이하, 심지어 250 ml 또는 100 ml 이하일 수 있다. 따라서 바람직한 세포의 농도는 전형적으로 106 세포/ml 초과 및 일반적으로 107 세포/ml 초과, 일반적으로 108 세포/ml 이상이다. 임상적으로 적절한 수의 면역 세포를 109, 1010 또는 1011 개 이상의 누적 세포로 다중 주입에 배분할 수 있다.
본원에 제공된 약학 조성물은 다양한 형태, 예를 들어, 고형, 액체, 분말, 수성 또는 동결 건조 형태일 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 당업계에 공지되어 있다. 상기 담체 및/또는 첨가제는 통상적인 방법으로 제형화될 수 있고 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 안정화제, 예를 들어 지질, 뉴클레아제 억제제, 중합체 및 킬레이트제가 체내에서의 분해로부터 조성물을 보존할 수 있다. 주사에 의한 투여가 의도되는 조성물에는, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 재조합 TCR 또는 본원에서 제공된 재조합 TCR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터 입자가 키트로서 패키징될 수 있다. 키트는 선택적으로 사용을 위한 지침, 장치 및 추가의 시약과 같은 하나 이상의 구성 요소 및 튜브, 컨테이너 및 시린지와 같은 방법의 실시를 위한 구성 요소를 포함할 수 있다. 예시적인 키트는 재조합 TCR을 암호화하는 핵산, 재조합 TCR 폴리펩티드 또는 본원에서 제공된 바이러스를 포함할 수 있고, 사용을 위한 지침, 대상체에서 바이러스를 검출하기 위한 장치, 대상체에 조성물을 투여하기 위한 장치 및 대상체에 조성물을 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다.
관심 유전자(예를 들어, 재조합 TCR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트가 본원에서 또한 고려된다. 관심 서열(예를 들어, 재조합 TCR) 및 선택적으로, 면역 관문 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 암호화하는 바이러스 벡터를 포함하는 키트가 본 발명에서 또한 고려된다.
본 발명에서 고려되는 키트는 또한 본원에 개시된 하나 이상의 임의의 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 특히, 상기 진단 키트는 본원에 개시된 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해 딥 시퀀싱(deep sequencing)을 수행하기 위한 적절한 증폭 및 검출 프라이머와 다른 관련 시약의 세트를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 본원의 키트는 본원에 개시된 TCR을 검출하기 위한 시약, 예컨대 항체 또는 다른 결합 분자를 포함할 수 있다. 진단 키트는 또한 본원에 개시된 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 결정하거나 본원에 개시된 TCR의 존재를 결정하기 위한 지침을 함유할 수 있다. 키트에는 지침이 포함되어 있을 수도 있다. 지침은 전형적으로 키트에 포함된 구성 요소를 기술하는 명백한 표현 및 대상체의 적절한 상태, 적절한 투여량 및 적절한 투여 방법을 결정하는 방법을 포함하는 투여 방법을 포함한다. 지침은 또한 치료 시간 기간에 걸친 대상을 모니터링하기 위한 안내를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 키트는 또한 본원에 기재된 조성물을 대상체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 약물 또는 백신을 투여하기 위해 당업계에 공지된 임의의 다양한 장치가 본원에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치는 피하 주사 바늘, 정맥 주사 바늘, 카테터, 바늘이 없는 주사 장치, 흡입기 및 점안기와 같은 액체 분배기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 키트의 바이러스를 투여하기 위한 장치는 키트의 바이러스와 양립 가능하고; 예를 들어, 고압 주사 장치와 같은 바늘이 없는 주사 장치는 고압 주사에 의해 손상되지 않은 바이러스를 갖는 키트에는 포함될 수 있지만, 고압 주사에 의해 손상되는 바이러스를 갖는 키트에는 전형적으로 포함되지 않는다.
본원에서 제공하는 키트는 또한 T 세포 활성화제 또는 자극제와 같은 화합물 또는 TLR4 작용제(agonist)와 같은 TLR 작용제를 대상체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 대상체에게 약물을 투여하기 위해 당업계에 공지된 임의의 다양한 장치가 본원에서 제공하는 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치에는 피하 주사 바늘, 정맥 주사 바늘, 카테터, 바늘이 없는 주사가 포함되나, 피하 주사 바늘, 정맥 주사 바늘, 카테터, 바늘이 없는 주사 장치, 흡입기 및 점안기와 같은 액체 분배기로 제한되지 않는다. 전형적으로, 키트의 화합물을 투여하기 위한 장치는 바람직한 화합물의 투여 방법과 양립 가능할 것이다.
특정 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체 용액의 제형은 예를 들어, 경장 및 비경구, 예를 들어, 혈관 내, 정맥 내, 동맥 내, 골 내, 뇌실내, 뇌 내, 두개 내, 척수 내, 척추강 내, 및 골수 내 투여 및 제형을 포함하는 다양한 치료 요법으로 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하는 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 같이 당업자에게 잘 알려져 있다. 당업자는 본원에서 고려되는 특정 구현예는 약학 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, volume I and volume II. 22nd Edition. Edited by Loyd V. Allen Jr. Philadelphia, PA: Pharmaceutical Press; 2012]에 기재되어 것과 같은 다른 제형을 포함할 수 있음을 이해할 것이며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 출원 및 발행된 특허는 각각의 개별 간행물, 특허 출원 또는 발행된 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.
전술한 구현예가 이해의 명료함을 위해 예시 및 예에 의해 일부 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구범위의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것은 본원에 고려된 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 이하의 실시예는 제한이 아니라 예시의 목적으로만 제공된다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 산출하도록 변경 또는 수정될 수 있는 다양한 비임계 매개변수를 쉽게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1
MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포는 MAGE-A4GVY-MHC-다량체에 결합함
시험관 내 프라이밍 접근법을 사용하여 MAGE-A4-반응성 T 세포 클론을 단리하였다. 프라이밍 시스템은 HLA-A*02:01-양성 및 HLA-A*02:01-음성 공여자의 성숙한 수지상 세포(mDC)를 항원 제시 세포로 사용하고 자가 CD8+-풍부 T 세포를 반응 세포로 사용하였다. 인간 MAGEA4 유전자를 암호화하는 시험관 내 전사된 RNA(ivtRNA)를 특정 항원의 공급원으로 사용하였다. mDC로의 전기천공 후, MAGE-A4-암호화 ivtRNA는 단백질로 번역되고, 후속적으로 처리되고 mDC 상의 HLA-A*02:01 암호화된 분자에 의해 펩티드로서 제시되었다. HLA-A*02:01-음성 공여자의 경우, MAGE-A4 ivtRNA와 함께 HLA-A*02:01을 코딩하는 ivtRNA를 사용하여 항원 제시 세포에서 각자의 HLA 대립유전자를 형질전환적으로 발현시켰다(동종이계 접근법). 동일한 공여자로부터의 ivtRNA-형질감염된 mDC와 T 세포의 시험관 내 공동 배양은 상응하는 TCR의 공급원으로 작용하는 항원 특이적 T 세포의 새로운 유도를 유발한다. 항원 특이적 T 세포는 다양한 방법으로 농축될 수 있으며 제한 희석 또는 FACS 기반 단일 세포 분류에 의해 클로닝된다. MAGE-A4-반응성 T-세포 클론의 TCR 알파 및 TCR 베타 사슬의 서열은 차세대 서열분석에 의해 그리고 레트로바이러스 벡터 pES.12-6에 클로닝된 뮤린 대응물에 의해 불변 TCR 영역을 교환한 후 확인하였다. 건강한 공여자의 PBMC를 피콜 구배 원심분리에 의해 단리하였다. CD8+ T-세포를 음성 자기 선택(Miltenyi)에 의해 농축시키고, 항-CD3(5μg/ml) 및 항-CD28(1μg/ml) mAb (BD Pharmingen, Heidelberg, Germany)로 사전 코팅된 비-조직 배양 24-웰 플레이트에서 자극시켰다. HEK293T 세포를 레트로바이러스 플라스미드 및 2개의 발현 플라스미드를 암호화하는 각자의 TCR로 형질감염시켜 양쪽성 레트로바이러스 입자를 생산하였다. 자극 후 2 일째에, CD8+ T 세포를 형질도입하고, 12 일째에 형질도입을 위한 마커로서 뮤린 불변 베타 영역을 사용하여 FACS에 의해 형질도입된 CD8+ 세포에 대해 강화한 다음 급속 확장 프로토콜에 의해 확장시켰다(Riddell SR, Science, 1992 Jul 10;257(5067):238-41).
실시예 2 내지 5에 기재된 실험에서, 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역을 함유하는 TCR을 사용하였다(즉, 서열 번호 57의 α 사슬 및 서열 번호 58의 β 사슬을 포함하는 TCR-1, 서열 번호 59의 α 사슬 및 서열 번호 60의 β 사슬을 포함하는 TCR-2, 서열 번호 61의 α 사슬 및 서열 번호 62의 β 사슬을 포함하는 TCR-3). 실시예 2 내지 5에 기재된 것과 동일 유형의 실험을 또한 상기 기재된 바와 같은 최소의 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역을 함유하는 TCR을 사용하여 수행할 수 있다.
결과:
CD8+ T 세포를 MAGE-A4 반응성 T 세포 클론에서 단리된 3개의 상이한 TCR 및 MAGE-A4를 인식하지 못하는 1개의 대조군 TCR로 형질도입하였다. 그것들을 MAGE-A4GVY-MHC-다량체(MAGE-A4230-239, GVYDGREHTV; immuneAware) 및 CD8 및 뮤린 불변 베타 영역에 대한 항체로 염색하였다. 모든 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포 집단은 MAGE-A4GVY-MHC-다량체에 매우 효율적으로 결합하였다(>70%). 대조군 TCR에서는 MAGE-A4GVY-MHC-다량체 염색이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 MAGE-A4-반응성 T 세포 클론에서 단리된 TCR이 건강한 공여자의 T 세포에서 형질전환적으로 발현될 수 있음을 보여준다(도 1).
실시예 2
MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포는 MAGE-A4GVY-펩티드를 인식함
TCR-트랜스제닉 T 세포의 MAGE-A4 특이성을 다음 프로토콜에 따라 확인하였다:
표적 세포로서, T2 세포(HLA-A*02pos)에 포화량(10-5 M)의 MAGE-A4GVY-펩티드(서열 번호 1) 또는 관련 없는 대조군 펩티드를 로딩하였다. 또한, K562 세포에 HLA-A*02:01 및 MAGE-A4 유전자를 형질도입하였다(K562/A2/MAGE-A4). HLA-A*02:01로만 형질도입된 K562 세포를 대조군으로 사용하였다(K562/A2). 각각의 표적 세포주는 20,000개의 T 세포와 10,000개의 표적 세포를 2:1의 비율로 사용하여 TCR-트랜스제닉 T 세포와 공동 배양하였다. 20-24 시간 후, 공동 배양 상청액의 IFN-γ 농도를 표준 샌드위치 ELISA(BD 인간 IFN-γ ELISA 세트)로 분석하였다.
결과:
MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포는 MAGE-A4GVY-로딩된 T2 및 MAGE-A4-형질도입된 K562 세포를 인식했지만 대조군 표적 세포는 인식하지 못했다. TCR-3 형질도입된 T 세포는 K562/A2 대조군의 인식을 보였다. 이러한 결과는 MAGE-A4 반응성 T 세포 클론에서 단리된 TCR이 건강한 공여자의 T 세포로 옮겨졌을 때 기능적임을 보여준다(도 2).
실시예 3
MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포는 높은 기능적 결합력을 나타냄
MAGE-A4GVY-펩티드가 로딩된 T2 세포를 사용하여 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포의 기능적 결합력의 차이를 분석했다:
T2 세포에 등급화된 농도(10-11 M - 10-5 M)의 MAGE-A4GVY-펩티드를 외부에서 로딩하고 10,000개의 T2 세포 및 20,000개의 T 세포를 1:2의 비율로 사용하여 TCR-트랜스제닉 T 세포와 공동 배양하였다. 20-24 시간 후, 공동 배양 상청액의 IFN-γ 농도를 표준 샌드위치 ELISA(BD 인간 IFN-γ ELISA 세트)로 분석하였다.
결과:
여러 공여자들에 대해 통합하였을 때, HLA-A*02에 로딩된 MAGE-A4GVY-펩티드에 대한 가장 높은 기능적 결합력이 TCR-2에 의해 보여졌다. TCR-1과 TCR-3은 TCR-2에 비해 약간 감소된 기능적 결합력을 보였다(도 3).
실시예 4
MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포는 MAGE-A4-양성 종양 세포주를 용해함
MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주(NCI-H1703, NCI-H1755), MAGE-A4-음성 HLA-A2-양성 종양 세포주(Saos-2) 및 MAGE-A4-음성 HLA-A2-음성 종양 세포주(A549)를 표적 세포로 사용하였다. 세포독성 분석을 위해, 공동 배양물은 40,000개의 TCR-트랜스제닉 T 세포 및 5,000개(NCI-H1755, NCI-H1703, A549) 및 2,500개 (Saos-2) 종양 세포를 사용하여 약 8-16:1의 이펙터 대 표적 비율로 설정되었고(표적 세포 크기에 따라 다름), 상기 세포들은 각각 형광 마커 유전자로 형질도입되었다. 포화 농도의 MAGE-A4GVY-펩티드(10-5 M)가 로딩된 종양 세포를 내부 양성 대조군으로 사용하였다. 형광 표적 세포의 감소(웰당 세포 수)를 살아있는 세포 모니터링(IncuCyte® ZOOM, Essen Bioscience)을 사용하여 총 172 시간에 걸쳐 3 시간마다 측정하였다. 사이토카인 방출을 분석하기 위해, 공동 배양 상청액을 24 시간 후에 수확하고 각자의 IFN-γ 농도를 표준 샌드위치 ELISA(BD 인간 IFN-γ ELISA 세트)로 분석하였다.
결과:
2개의 내인성 MAGE-A4-양성 HLA-A2 양성 종양 세포주(NCI-H1703, NCI-H1755)는 모든 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포에 의해 인식되고 용해되었다. MAGE-A4-음성이지만 HLA-A2 양성인 종양 세포주(Saos-2)는, 세포에 포화 농도의 MAGE-A4GVY-펩티드가 외부적으로 로딩되었을 때만 인식되고 용해되었다. 음성 대조군 세포주(A549)는 MAGE-A4-TCR 중 하나에 의해 인식되거나 용해되지 않았다. 이러한 결과는 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포가 고도로 선택적인 방식으로 MAGE-A4-양성 종양 세포를 내인성으로 효율적으로 용해할 수 있음을 보여준다(도 4a, 4b 및 4c).
실시예 5
MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포는 정상 인간 세포를 인식하지 못함
정상 인간 세포 패널을 사용하여 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포에 의해 유발될 수 있는 잠재적인 표적상/종양외(on-target/off-tumor) 및 표적외 독성을 분석했다.
필수 조직 또는 기관을 대표하는 1차 세포 및 유도 만능 줄기 세포(iPS)-유래 세포를 MAGE-A4-TCR로 형질도입된 T 세포에 의한 인식에 대해 시험하였다. HLA-A*02:01-음성 NHBE 세포를 전기천공법을 통해 HLA-A2-ivtRNA로 형질감염시켜 HLA-A2를 일시적으로 발현시켰다. iCell 뉴런을 세포 표면 HLA-A2 발현을 유도하기 위한 공동 배양을 시작하기 전 72 시간 동안 IFN-γ로 처리하였다. 모든 세포 유형의 HLA-A2 발현은 유세포 분석을 통해 확인되었다. 독성 분석을 위해, 20,000개의 TCR 트랜스제닉 T 세포 및 세포 유형 특정 양의 표적 세포를 사용하여 공동 배양물을 설정했다. 내부 양성 대조군으로서, 모든 정상 인간 세포에 최종 농도 10-5 M의 MAGE-A4GVY-펩티드를 로딩하였다. 사이토카인 방출을 분석하기 위해, 공동 배양 상청액을 24 시간 후에 수확하고 IFN-γ 또는 IL-2 농도를 표준 샌드위치 ELISA(BD 인간 IFN-γ 또는 IL-2 ELISA 세트)로 분석했다. IL-2 방출은 HLA-A2 표면 발현을 유도하도록 IFN-γ로 사전 처리된, iCell Neurons를 함유하는 공동 배양물에 대해 측정하였다.
결과:
모든 1차 세포 및 유도 만능 줄기 세포(iPS) 유래 세포는 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포와의 공동 배양 초기에 HLA-A2 양성이었다. 또한, MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포는, 개별 표적 세포에 MAGE-A4GVY-펩티드가 로딩되었을 때 모든 정상 세포를 효율적으로 인식할 수 있었다. 로딩되지 않은 정상 세포는 MAGE-A4-트랜스제닉 T 세포에 의해 인식되지 않았다. MAGE-A4-트랜스제닉 T 세포는 표적상/종양외 및 표적외 독성의 징후를 나타내지 않는다(도 5a, 5b 및 5c).
실시예 6
완전 인간 MAGE-A4 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터
실시예 1에서 확인된 TCR 폴리뉴클레오티드 서열이 발현을 위해 최적화되었다. 폴리시스트론 TCR 구축물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 TCR을 발현시켰다. 폴리시스트론 TCR 구축물은 TCR α 또는 β 사슬, 선택적인 푸린 절단 부위, P2A 리보솜 스킵 서열 및 상응하는 TCR α 또는 β 사슬을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 공지된 방법에 따라 생산하였다. 예를 들어, Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22 참조.
MAGE-A4 TCR-4 다단백질(서열 번호 94)을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드(서열 번호 93)는 서열 번호 70에 의해 암호화된 β 사슬, 리보솜 스킵 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 69에 의해 암호화된 α 사슬을 포함한다.
MAGE-A4 TCR-5 다단백질(서열 번호 96)을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드(서열 번호 95)는 서열 번호 78에 의해 암호화된 β 사슬, 푸린 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 리보솜 스킵 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 77에 의해 암호화된 α 사슬을 포함한다.
MAGE-A4 TCR-6 다단백질(서열 번호 98)을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드(서열 번호 97)는 서열 번호 86에 의해 암호화된 β 사슬, 푸린 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 리보솜 스킵 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 85에 의해 암호화된 α 사슬을 포함한다.
실시예 7
MAGE-A4 완전 인간 TCR을 발현하는 T 세포는 MAGE-A4GVY-MHC-다량체에 결합함
CD3+ T 세포를 건강한 공여자의 PBMC에서 단리하고 3개의 다른 완전 인간 MAGE-A4 TCR과 MAGE-A4를 인식하지 못하는 대조군 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입했다. 확장 후, 형질도입된 T 세포를 MAGE-A4GVY-MHC-다량체(MAGE-A4230-239, GVYDGREHTV; immuneAware) 및 CD3에 대한 항체로 염색하였다. 집단은 살아있는 CD3+ 세포 및 다량체 염색에 대해 게이팅되었다. 모든 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포 집단은 MAGE-A4GVY-MHC-다량체에 매우 효율적으로 결합하였다(>70%). 대조군 TCR에서는 MAGE-A4GVY-MHC-다량체 염색이 관찰되지 않았다.
결과:
이러한 결과는 MAGE-A4 반응성 T 세포 클론에서 단리된 TCR이 건강한 공여자의 T 세포에서 형질전환적으로 발현될 수 있음을 보여준다(도 6).
실시예 8
MAGE-A4 완전 인간 TCR을 발현하는 T 세포는 MAGE-A4GVY-MHC-펩티드를 인식함
TCR-트랜스제닉 T 세포의 MAGE-A4 특이성을 항원 의존성 사이토카인 발현을 사용하여 확인하였다. 실시예 6에 기재된 완전 인간 MAGE-A4 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 T 세포를 10 ng/mL의 MAGE-A4GVY-펩티드 또는 관련 없는 대조군 펩티드로 펄스된 T2 세포(HLA-A*02pos)와, 형질도입되지 않은 A549/HLA-A2 세포 또는 MAGE-A4 유전자로 형질도입된 A549/HLA-A2를 사용하여 2:1의 이펙터 대 표적 세포 비로 공동 배양하였다. 20-24 시간 후, 공동 배양 상청액 내 IFN-γ 농도를 Luminex 분석을 사용하여 분석하였다.
결과:
MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포는 MAGE-A4GVY-로딩된 T2 세포 및 MAGE-A4-형질도입된 A549 세포를 인식했지만 대조군 표적 세포는 인식하지 못했다. 이러한 결과는 완전 인간 MAGE-A4 TCR을 발현하는 건강한 인간 공여자 T 세포가 MAGE-A4GVY 펩티드를 표시하는 표적 세포와 특이적으로 반응한다는 것을 보여준다(도 7).
실시예 9
MAGE-A4 완전 인간 TCR을 발현하는 T 세포는 높은 기능적 결합력을 보임
MAGE-A4GVY 펩티드를 표시하는 종양 세포주가 완전 인간 MAGE-A4-TCR을 발현하는 T 세포의 기능적 결합력의 차이를 분석하는 데 사용되었다. 실시예 6에 기재된 완전 인간 MAGE-A4 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 T 세포를 MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주(A375, NCI-H1703, NCI-H1755), MAGE-A4-양성 HLA-A2-음성 종양 세포주(NCI-H520), 및 MAGE-A4-음성 HLA-A2-양성 종양 세포주(A549)를 사용하여 5:1의 이펙터 대 표적 세포 비로 공동 배양하였다. 20-24 시간 후, 공동 배양 상청액 내 IFN-γ 농도를 Luminex 분석을 사용하여 분석하였다.
결과:
여러 공여자들에 대해 통합하였을 때, MAGE-A4 TCR5는 MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주에서 가장 높은 기능적 결합력을 보였다. MAGE-A4 TCR1 및 MAGE-A4 TCR-6은 MAGE-A4 TCR-5에 비해 감소된 기능적 결합력을 보였다(도 8).
실시예 10
MAGE-A4 완전 인간 TCR을 발현하는 T 세포는 MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주를 용해함
실시예 6에 기재된 완전 인간 MAGE-A4 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 T 세포를 MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주(A375, NCI-H1703, A549-HLA-A2-MAGE-A4) 및 MAGE-A4-음성 HLA-A2-양성 종양 세포주(A549-HLA-A2)를 사용하여 5:1의 이펙터 대 표적 세포 비로 공동 배양하였다. 6 시간의 공동 배양 후, 종양 세포주에 대한 세포독성을 임피던스 분석으로 측정하였다.
결과:
MAGE-A4-양성 HLA-A2 양성 종양 세포주(A375, NCI-H1703, A549-HLA-A2-MAGE-A4)는 모든 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포에 의해 인식되고 용해되었다. MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포에 의한 MAGE-A4-음성 HLA-A2-양성 종양 세포주(A549-HLA-A2)의 용해는 형질도입되지 않은 대조군 T 세포를 사용하여 관찰된 용해와 크게 다르지 않았다(도 9).
실시예 11
MAGE-A4 완전 인간 TCR을 발현하는 T 세포는 생체 내에서 MAGE-A4-양성 종양을 제어함
5 x 106 MAGE-A4 양성 A375 종양 세포를 10마리 NSG 마우스의 각 옆구리에 주사했다. 종양 이식 10일 후, 3.5 x 107 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포, 3.5 x 107 대조군 비형질도입 T 세포 또는 비히클 PBS를 마우스에 투여하였다. 처리 후, 모든 마우스는 캘리퍼스로 주 2회 종양 부피를 측정했다.
결과:
형질도입되지 않은 T 세포 및 비히클-PBS 처리된 마우스는 종양 성장을 제어하는 데 실패했으며, 종양이 프로토콜당 허용되는 최대 크기에 도달하면 이를 희생시켰다. MAGE-A4-TCR 트랜스제닉 T 세포 처리된 마우스는 T 세포 주입 후 최대 35일 동안 종양 성장을 제어하였다(도 10).
실시예 12
강화된 인간 MAGE-A4 TCR
실시예 1에서 확인된 TCR 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 및 기능적 결합력을 향상시키기 위해 변형시켰다. TCR α 및 β 사슬 불변 영역을 최소한으로 뮤린화하고 소수성 아미노산 치환을 TCR α 사슬 불변 영역의 막횡단 도메인에 도입하였다. 강화된 MAGE-A4 TCR에 대한 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 97 내지 99, 103 내지 105 및 109 내지 11에 제시되어 있다. 강화된 MAGE-A4 TCR에 대한 예시적인 폴리펩티드 서열은 서열 번호 100 내지 102, 106 내지 108 및 112 내지 114에 기재되어 있다.
폴리시스트론 TCR 구축물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 강화된 MAGE-A4 TCR(TCR-7, TCR-8 및 TCR-9)을 발현시켰다. 폴리시스트론 TCR 구축물은 TCR α 또는 β 사슬, 선택적인 푸린 절단 부위, P2A 리보솜 스킵 서열 및 상응하는 TCR α 또는 β 사슬을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 공지된 방법에 따라 제조했다. Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22 참조.
MAGE-A4 TCR-7 다단백질(서열 번호 102)을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드(서열 번호 99)는 서열 번호 98에 의해 암호화된 β 사슬, 리보솜 스킵 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 97에 의해 암호화된 α 사슬을 포함한다.
MAGE-A4 TCR-8 다단백질(서열 번호 108)을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드(서열 번호 105)는 서열 번호 104에 의해 암호화된 β 사슬, 푸린 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 리보솜 스킵 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 103에 의해 암호화된 α 사슬을 포함한다.
MAGE-A4 TCR-9 다단백질(서열 번호 114)을 암호화하는 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드(서열 번호 111)는 서열 번호 110에 의해 암호화된 β 사슬, 푸린 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 리보솜 스킵 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 109에 의해 암호화된 α 사슬을 포함한다.
실시예 13
MAGE-A4 완전 인간 TCR 또는 강화된 MAGE-A4 TCR을 발현하는 T 세포는 인간 T 세포에서 효율적으로 발현될 수 있음.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 3명의 독립적인 건강한 공여자로부터 단리하고, 활성화하고, 완전 인간 MAGE-A4 TCR(TCR-5) 또는 강화된 MAGE-A4 TCR(TCR-8)을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하거나 또는 음성 대조군으로서 형질도입하지 않았다. 세포를 시험관 내 확장을 위해 배양하고 벡터 카피 수(VCN)를 측정함으로써 벡터 통합에 대해 분석하고 MAGE-A4GVY-MHC-다량체(MAGE-A4230-239, GVYDGREHTV; immuneAware) 및 CD3에 대한 항체로 염색된 세포에 대해 유세포 분석을 사용하여 발현에 대해 분석했다.
결과:
TCR-5 및 TCR-8에 대한 VCN은 유사했지만, TCR 표면 발현 및 밀도는 TCR-5에 비해 TCR-8로 형질도입된 세포에서 더 높았다. 도 11A 내지 11C
실시예 14
MAGE-A4 완전 인간 TCR 또는 강화된 MAGE-A4 TCR을 발현하는 T 세포는 시험관 내에서 MAGE-A4+ 세포주를 특이적으로 인식하고 사멸시킴
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 3명의 독립적인 건강한 공여자로부터 단리하고, 활성화하고, 완전 인간 MAGE-A4 TCR(TCR-5) 또는 강화된 MAGE-A4 TCR(TCR-8)을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하거나 또는 음성 대조군으로서 형질도입하지 않았다(UTD). TCR 발현 T 세포를 MAGEA4 양성(+) 및 음성(-) 종양 세포주에 대한 특이적 반응성에 대해 평가하였다: A549.A2 (A2+, MAGE-A4(-)); NCI-H2023 (A2+, MAGE-A4(+)); A375 (A2+, MAGE-A4(+));A549.A2.MAGEA4 (A2+, MAGE-A4(+)); 및 U2OS (A2+, MAGE-A4(low)).
결과:
TCR-5 및 TCR-8 T 세포는 HLA-A2+/MAGEA4(+) 종양 세포주와 공동 배양할 때 IFNγ를 방출하지만 HLA-A2+/MAGEA4(-) 세포와 공동 배양하거나 표적 세포의 부재 하에 배양할 때에는 방출하지 않았다. UTD T 세포는 어떤 배양 조건에서도 IFNγ를 방출하지 않았다. 도 12A.
TCR-5 및 TCR-8 T 세포는 10:1, 5:1 및 2.5:1의 E:T 비에서 HLA-A2+/MAGEA4(+) 종양 세포주를 유효하게 사멸시켰다. UTD T 세포는 어떤 E;T 비에서도 HLA-A2+/MAGEA4(+) 종양 세포주를 사멸시키지 않았다. 도 12B.
실시예 15
MAGE-A4 완전 인간 TCR 또는 강화된 MAGE-A4 TCR을 발현하는 T 세포는 생체 내에서 MAGE-A4 발현 종양의 퇴행을 매개함
MAGE-A4 양성 A375 종양 세포를 5마리 NSG 마우스의 각 옆구리에 주사하였다. 50mm3 A375 종양이 있는 마우스에 PBS(비히클), 형질도입되지 않은 T 세포(UTD), 5 x 106 TCR-5 또는 TCR-8 T 세포(왼쪽 옆구리), 또는 1.5 x 106 TCR-5 또는 TCR-8 T 세포(오른쪽 옆구리)를 투여하였다. 100mm3 A375 종양이 있는 마우스에 PBS(비히클), 형질도입되지 않은(UTD) T 세포, 또는 10 x 106 TCR-5 또는 TCR-8 T 세포를 투여하였다. 종양 성장을 주 2회 측정하고 TCR T 세포 항종양 활성을 UTD 및 비히클 대조군을 투여받은 마우스와 비교하여 평가하였다.
결과:
TCR-5 및 TCR-8 T 세포는 5 x 106 TCR+ T 세포의 투여량에서 50mm3 A375 종양의 종양 퇴행을 비슷하게 매개했다. TCR-8 T 세포는 1.5 x 106 TCR+ T 세포의 투여량에서의 50mm3 A375 종양의 TCR-5 T 세포 및 10 x 106 TCR+ T 세포의 투여량에서의 100mm3 A375 종양의 TCR-5 T 세포와 비교하여 증가된 종양 퇴행을 매개하였다. 비히클 및 UTD T 세포는 어떤 조건에서도 A375 종양의 퇴행을 매개하지 않았다.
본 발명은 하기 항목에 의해 추가로 특성화된다:
항목 1: MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(TCR).
항목 2: MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(TCR)로서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역,
서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역; 또는
b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역,
서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역; 또는
c) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역,
서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역.
항목 3: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 특이적으로 인식하는, 단리된 TCR.
항목 4: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 서열 번호 1의 아미노산 서열의 HLA-A2 결합 형태를 특이적으로 인식하는, 단리된 TCR.
항목 5: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는, 단리된 TCR.
항목 6: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 서열 번호 4, 서열 번호 14 및 서열 번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 TCR α 사슬을 포함하는, 단리된 TCR.
항목 7: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 서열 번호 7, 서열 번호 17 및 서열 번호 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 사슬을 포함하는, 단리된 TCR.
항목 8: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
a) 서열 번호 8과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역;
b) 서열 번호 18과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 19와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는
c) 서열 번호 28과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역.
항목 9: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
a) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는
b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는
c) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역.
항목 10: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
a) 서열 번호 10과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 11과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬;
b) 서열 번호 20과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 21과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
c) 서열 번호 30과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 31과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬.
항목 11: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
b) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
c) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬.
항목 12: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하며,
a) - 가변 TCR α 영역은 서열 번호 8과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열에 의해 암호화된 CDR3을 포함하고,
- 가변 TCR β 영역은 서열 번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 의해 암호화된 CDR3을 포함하거나; 또는
b) - 가변 TCR α 영역은 서열 번호 18과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열에 의해 암호화된 CDR3을 포함하고,
- 가변 TCR β 영역은 서열 번호 19와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 17에 기재된 아미노산 서열에 의해 암호화된 CDR3을 포함하거나; 또는
c) - 가변 TCR α 영역은 서열 번호 28과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열에 의해 암호화된 CDR3을 포함하고,
- 가변 TCR β 영역은 서열 번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열 번호 27에 기재된 아미노산 서열에 의해 암호화된 CDR3을 포함하는, 단리된 TCR.
항목 13: 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR.
a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬;
b) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
c) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬.
항목 14: 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR.
a) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬;
b) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 90의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
c) 서열 번호 91의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬.
항목 15: 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR.
a) 서열 번호 102의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬;
b) 서열 번호 108의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 109의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
c) 서열 번호 114의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬.
항목 16: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR은 정제된 것인, 단리된 TCR.
항목 17: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, 그의 아미노산 서열이 하나 이상의 표현형 침묵 치환을 포함하는, 단리된 TCR.
항목 18: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, 그의 아미노산 서열이 검출가능한 표지, 치료제 또는 약동학적 변형 모이어티를 포함하도록 변형된 것인, 단리된 TCR.
항목 19: 항목 18에 있어서, 치료제가 면역 이펙터 분자, 세포독성제 및 방사성핵종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 TCR.
항목 20: 항목 19에 있어서, 면역 이펙터 분자가 사이토카인인, 단리된 TCR.
항목 21: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR이 가용성이거나 막 결합된 것인, 단리된 TCR.
항목 22: 항목 18에 있어서, 약동학적 변형 모이어티는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 반복 단위, 적어도 하나의 글리콜 기, 적어도 하나의 시알릴 기 또는 이들의 조합인, 단리된 TCR.
항목 23: 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, TCR이 단일 사슬 유형이고, TCR α 사슬과 TCR β 사슬이 링커 서열에 의해 연결되는, 단리된 TCR.
항목 24: 항목 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, TCR α 사슬 또는 TCR β 사슬이 에피토프 태그를 포함하도록 변형된 것인, 단리된 TCR.
항목 25: 항목 1 내지 24 중 어느 하나의 TCR의 기능적 부분을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서, 기능적 부분은 서열 번호 4, 7, 14, 17, 24 및 27의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는, 단리된 폴리펩티드.
항목 26: 항목 25에 있어서, 기능적 부분은 TCR α 가변 사슬 및/또는 TCR β 가변 사슬을 포함하는, 단리된 폴리펩티드.
항목 27: TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하는 융합 단백질로서, 융합 단백질은 서열 번호 94, 96, 98, 104, 110 및 116 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
항목 28: 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 구현된 바와 같은 적어도 2개의 TCR을 포함하는 다가 TCR 복합체.
항목 29: 항목 28에 있어서, 상기 TCR 중 적어도 하나는 치료제와 회합되는, 다가 TCR 복합체.
항목 30: IFN-γ 분비가 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에의 결합에 의해 유도되는, 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 단리된 TCR, 항목 25 또는 26에 따른 폴리펩티드, 항목 27에 따른 융합 단백질, 항목 28 또는 29에 따른 다가 TCR 복합체.
항목 31: 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 TCR을 암호화하거나, 항목 25 또는 26에 따른 폴리펩티드를 암호화하거나, 항목 27에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
항목 32: 항목 31에 있어서, TCR α 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 69, 77, 85, 99, 105, 및 111 중 어느 하나에 기재된 것인, 핵산.
항목 33: 항목 31 또는 항목 32에 있어서, TCR β 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 70, 78, 86, 100, 106, 및 112 중 어느 하나에 기재된 것인, 핵산.
항목 34: 항목 31에 있어서, TCR은 서열 번호 69에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 70에 의해 암호화되는 β 사슬; 서열 번호 77에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 78에 의해 암호화되는 β 사슬; 서열 번호 85에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 86에 의해 암호화되는 β 사슬; 서열 번호 99에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 100에 의해 암호화되는 β 사슬; 서열 번호 105에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 106에 의해 암호화되는 β 사슬; 또는 서열 번호 111에 의해 암호화되는 α 사슬 및 서열 번호 112에 의해 암호화되는 β 사슬을 포함하는, 핵산.
항목 35: 항목 31에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 93, 95, 97, 101, 107 및 113 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화되는, 핵산.
항목 36: 항목 31 내지 35 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 벡터.
항목 37: (a) 서열 번호 87 및 서열 번호 88에 기재된 폴리펩티드 서열; (b) 서열 번호 89 및 서열 번호 90에 기재된 폴리펩티드 서열; (c) 서열 번호 91 및 서열 번호 92에 기재된 폴리펩티드 서열; (d) 서열 번호 102 및 서열 번호 103에 기재된 폴리펩티드 서열; (e) 서열 번호 108 및 서열 번호 109에 기재된 폴리펩티드 서열; 또는 (f) 서열 번호 114 및 서열 번호 115에 기재된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
항목 38: 항목 36 또는 항목 37에 있어서, 벡터가 발현 벡터인, 벡터.
항목 39: 항목 36 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 레트로바이러스 벡터인, 벡터.
항목 40: 항목 36 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
항목 41: 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 TCR을 발현하는 세포.
항목 42: 항목 36 내지 40 중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는 세포.
항목 43: 항목 41 또는 항목 42에 있어서, 세포는 단리되거나 또는 비자연적으로 발생하는 것인, 세포.
항목 44: 항목 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 핵산 또는 항목 36 내지 40 중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는 세포.
항목 45: 항목 41 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 하기를 포함하는 세포:
a) 항목 28 내지 32 중 어느 하나에서 구현된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 발현 벡터,
b) 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 구현된 TCR의 알파 사슬을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 발현 벡터, 및 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 구현된 TCR의 베타 사슬을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 발현 벡터.
항목 46: 항목 41 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 세포가 말초 혈액 림프구(PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 세포.
항목 49: 항목 41 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 세포가 T 세포인, 세포.
항목 50: 항목 41 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 세포가 T 세포인, 세포.
항목 51: MAGE-A4에 대한 특이성을 매개하는 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 TCR의 일부에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
항목 52: 항목 51에 있어서, MAGE-A4 특이성을 매개하는 TCR의 일부는 다음을 포함하는, 항체.
a) 서열 번호 4의 알파 사슬의 CDR3 및/또는 서열 번호 7의 베타 사슬의 CDR3 또는;
b) 서열 번호 14의 알파 사슬의 CDR3 및/또는 서열 번호 17의 베타 사슬의 CDR3 또는;
c) 서열 번호 24의 알파 사슬의 CDR3 및/또는 서열 번호 27의 베타 사슬의 CDR3.
항목 53: 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 TCR, 항목 25 또는 26에 따른 폴리펩티드, 항목 27에 따른 융합 단백질, 항목 28 또는 29에 따른 다가 TCR 복합체, 항목 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 핵산, 항목 36 내지 40 중 어느 하나에 따른 벡터, 항목 41 내지 50 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 항목 51 또는 52에 따른 항체를 포함하는 조성물.
항목 54: 약학적으로 허용가능한 담체, 및 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 TCR, 항목 25 또는 26에 따른 폴리펩티드, 항목 27에 따른 융합 단백질, 항목 28 또는 29에 따른 다가 TCR 복합체, 항목 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 핵산, 항목 36 내지 40 중 어느 하나에 따른 벡터, 항목 41 내지 50 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 항목 51 또는 52에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
항목 55: 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 및 항목 41 내지 50 중 어느 하나에 따른 세포를 포함하는 약학 조성물.
항목 56: 약제로 사용하기 위한, 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 TCR, 항목 25 또는 26에 따른 폴리펩티드, 항목 27에 따른 융합 단백질, 항목 28 또는 29에 따른 다가 TCR 복합체, 항목 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 핵산, 항목 36 내지 40 중 어느 하나에 따른 벡터, 항목 41 내지 50 중 어느 하나에 따른 세포, 항목 51 또는 52에 따른 항체, 항목 53의 조성물, 또는 항목 54 또는 55의 약학 조성물.
항목 57: 암의 치료에 사용하기 위한, 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 TCR, 항목 25 또는 26에 따른 폴리펩티드, 항목 27에 따른 융합 단백질, 항목 28 또는 29에 따른 다가 TCR 복합체, 항목 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 핵산, 항목 36 내지 40 중 어느 하나에 따른 벡터, 항목 41 내지 50 중 어느 하나에 따른 세포, 항목 51 또는 52에 따른 항체, 항목 53의 조성물, 또는 항목 54 또는 55의 약학 조성물.
항목 58: 항목 57에 있어서, 암은 혈액암 또는 고형 종양인, TCR, 폴리펩티드, 융합 단백질, 다가 TCR 복합체, 핵산, 세포, 항체, 조성물 또는 약학 조성물.
항목 59: 항목 57 또는 58에 있어서, 암은 육종, 전립선암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비소세포폐암, 비-호지킨(non-Hodgkin's) 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 간세포 암종, 두경부암, 위암, 자궁내막암, 결장직장암, 담관암, 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, TCR, 폴리펩티드, 융합 단백질, 다가 TCR 복합체, 핵산, 세포, 항체, 조성물 또는 약학 조성물.
항목 60: 항목 50 또는 51에 있어서, 암은 바람직하게는 NSCLC, SCLC, 유방, 난소 또는 결장직장암, 육종 및 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, TCR, 폴리펩티드, 융합 단백질, 다가 TCR 복합체, 핵산, 세포, 항체, 조성물 또는 약학 조성물.
참고문헌
Allen, LD (Editor): Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Volume I and II. Twenty-second edition. Pharmaceutical Press 2012.
Bhan, S, Chuang, A, Negi, SS, Glazer, CA & Califano, JA: MAGEA4 induces growth in normal oral keratinocytes by inhibiting growth arrest and apoptosis. Oncol. Rep. 2012 28, 1498-1502.
Brichard VG, Louahed J, Clay TM: Cancer regression and neurological toxicity cases after anti-MAGE-A3 TCR gene therapy. J Immunother 2013 36:79-81.
Cameron BJ, Gerry AB, Dukes J, Harper JV, Kannan V, Bianchi FC, et al.: Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed Tcells. Sci Transl Med 2013 5:197ra103.
Cribbs AP, Kennedy A, Gregory B, Brennan FM: Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 2013; 13:98.
Daudi S, Eng KH, Mhawech-Fauceglia P, Morrison C, Miliotto A,Beck A, Matsuzaki J, Tsuji T, Groman A, Gnjatic S et al.: Expression and immune responses to MAGE antigens predict survival in epithelial ovarian cancer. PLoS One 2014, 9:e104099.
Duffour MT, Chaux P, Lurquin C, Cornelis G, Boon T, van der Bruggen P:
A MAGE-A4 peptide presented by HLA-A2 is recognized by cytolytic T lymphocytes. Eur J Immunol. 1999 Oct; 29(10):3329-37.
Engels B, Engelhard VH, Sidney J, Sette A, Binder DC, Liu RB, Kranz DM, Meredith SC, Rowley DA, Schreiber H: Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell 2013; 23(4):516-526.
Flynn JK and Gorry PR. Stem memory T cells (TSCM)―their role in cancer and HIV immunotherapies. Clin Transl Immunology 2014; 3(7): e20.
Gargett T, Brown MP: The inducible caspase-9 suicide gene system as a "safety switch" to limit on-target, off-tumor toxicities of chimeric antigen receptor T cells. Front Pharmacol. 2014 Oct 28;5: 235.
Gattinoni L, Lugli E, Ji Y, Pos Z, Paulos CM, Quigley MF, Almeida JR, Gostick E, Yu Z, Carpenito C, Wang E, Douek DC, Price DA, June CH, Marincola FM, Roederer M, Restifo NP: A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nat Med. 2011;17(10):1290-1297.
Giudicelli, V, et al.: IMGT/LIGM-DB, the IMGT® comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acid Research 2006, 34, D781-D784.
Gure AO, Chua R, Williamson B, Gonen M, Ferrera CA, Gnjatic S, Ritter G, Simpson AJ, Chen YT, Old LJ et al.: Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2005, 11:8055-8062.
Invitrogen Corporation: Vector NTI AdvanceTM 10 DNA and protein sequence analysis software. User Manual 2004, 389-662.
Kageyama S, Ikeda H, Miyahara Y, Imai N, Ishihara M, Saito K et al.: Adoptive transfer of MAGE-A4 T-cell receptor gene-transduced lymphocytes in patients with recurrent esophageal cancer. Clin Cancer Res 2015 21:2268-77.
Kieback E, Charo J, Sommermeyer D, Blankenstein T, Uckert W: A safeguard eliminates T cell receptor gene-modified autoreactive T cells after adoptive transfer. PNAS 2008 105 (2) 623-628.
Kim YD, Park HR, Song MH, Shin DH, Lee CH, Lee MK, Lee SY: Pattern of cancer/testis antigen expression in lung cancer patients. Int J Mol Med 2012, 29:656-662.
Lefranc and Lefranc: T cell Receptor Factsbook, Academic Press 2001, Elsevier Ltd ISBN 0-12- 441352-8.
Li M, Yuan YH, Han Y, Liu YX, Yan L, Wang Y, Gu J: Expression prole of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue. Clin Cancer Res 2005, 11:1809-1814.
Linette GP, Stadtmauer EA, Maus MV, Rapoport AP, Levine BL, Emery L et al.: Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood (2013) 122:863-71.
Lugli E, Gattinoni L, Roberto A, Mavilio D, Price DA, Restifo NP, Roederer M: Identification, isolation and in vitro expansion of human and nonhuman primate T stem cell memory cells. Nat Protoc. 2013;8(1):33-42.
Morgan RA, Chinnasamy N, Abate-Daga D, Gros A, Robbins PF, Zheng Z et al.: Cancer regression and neurological toxicity following anti-MAGE-A3 TCR gene therapy. J Immunother (2013) 36:133-51
Otte M, Zafrakas M, Riethdorf L, Pichlmeier U, Loning T, Janicke F, Pantel K: MAGE-A gene expression pattern in primary breast cancer. Cancer Res 2001, 61:6682-6687.
Riddell SR, Sommermeyer D, Berger C, Liu LS, Balakrishnan A, Salter A, Hudecek M, Maloney DG, Turtle CJ: Adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells of defined subset composition. Cancer J. 2014 ;20(2):141-144.
Sambrook: Molecular Cloning - 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012, ISBN 978-1-936113-42-2.
Sommermeyer D, Uckert W: Minimal amino acid exchange in human TCR constant regions fosters improved function of TCR gene-modified T cells. J Immunol. 2010;184(11):6223-6231.
Tajima K, Obata Y, Tamaki H, Yoshida M, Chen YT, Scanlan MJ, Old LJ, Kuwano H, Takahashi T, Takahashi T et al.: Expression of cancer/testis (CT) antigens in lung cancer. Lung Cancer 2003, 42:23-33.
Thompson JF, Higgins DG, Gibson TJ: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 1994, 22: 4673-4680.
Yamada R, Takahashi A, Torigoe T, Morita R, Tamura Y, Tsukahara T, Kanaseki T, Kubo T, Watarai K, Kondo T et al.: Preferential expression of cancer/testis genes in cancer stem-like cells: proposal of a novel sub-category, cancer/testis/stem gene. Tissue Antigens 2013, 81:428-434.
일반적으로, 이하의 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이와 같은 청구범위가 부여된 균등물의 전체 범위와 함께 가능한 모든 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서 청구범위는 본 개시 내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Medigene Immunotherapies GmbH 2seventy bio, Inc. <120> MAGE-A4-TCRs <130> MED16702PCT <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Ser Asp Gln Ser Tyr Gly 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn 1 5 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Ala Met Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Gly His Asp Arg 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Phe Asp Val Lys Asp 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Cys Ala Thr Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr 1 5 10 15 Phe <210> 8 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr 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Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser 500 505 510 Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp 515 520 525 Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala 530 535 540 Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe 545 550 555 560 Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe 565 570 575 Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu 580 585 590 Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu 595 600 605 Arg Leu Trp Ser Ser 610 <210> 111 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR-9 a complete <400> 111 atgacgtcca ttagagccgt gttcattttc ctgtggctgc aactggacct cgtgaatgga 60 gaaaacgtcg agcagcaccc atccaccctg agcgtgcagg agggagactc cgcagtcatc 120 aagtgcactt actccgactc agcatcaaac tatttcccgt ggtataagca ggaactcgga 180 aagcggcctc agctcatcat tgacatccgc tccaacgtcg gagagaagaa ggaccagaga 240 attgccgtga cactcaacaa gaccgccaag catttctccc ttcacatcac cgaaacccag 300 cccgaggaca gcgccgtcta cttttgtgcg gcctcgaggg gcactgggtt tcagaagctc 360 gtgttcggca ctgggacccg gctgctggtg tcgccaaaca tccagaatcc agaccccgcg 420 gtgtaccagc tgagagactc gaagtcttcc gataaatccg tgtgtctctt tacagacttc 480 gatagccaga ctaacgtgtc ccagtccaag gactccgatg tgtacatcac cgacaagact 540 gtgctggata tgcggagcat ggactttaag tccaattcag cggtcgcgtg gagcaacaag 600 tccgacttcg cctgcgctaa cgctttcaac aactccatta tcccggagga taccttcttc 660 ccgtcaagcg acgtcccctg cgacgtgaag ctggtcgaga agtccttcga aaccgatacc 720 aacctgaact tccaaaacct cctagtgatt gtgctcagaa tcctgctgct gaaagtggct 780 ggcttcaatt tgctgatgac cctgcggctc tggagcagc 819 <210> 112 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR-9 b complete <400> 112 atgggttgtc ggttgctgtg ttgcgtcgtg ttctgccttc ttcaagctgg tcctctcgat 60 actgccgtga gccaaacccc taagtacctt gtcacccaaa tgggcaacga caagtccatc 120 aaatgcgaac agaacctcgg acacgacacc atgtactggt acaaacagga ttccaagaag 180 ttcctgaaga ttatgttctc atacaacaac aaggaactga ttatcaacga aactgtgccg 240 aaccggttct caccgaagtc gcctgacaag gctcatctca acttgcatat caactcgctg 300 gagctcggcg actccgccgt gtacttctgc gcgtccagcc agttctggga cggagcgggc 360 gacgaacagt acttcggccc gggcactcgg ctgaccgtga ccgaagatct gaacaaagtg 420 ttcccccccg aagtggccgt gttcgaacct tccaaggcgg agatcgccca cacccaaaag 480 gccactctgg tctgcctggc caccggtttc ttccccgatc acgtggaact gtcttggtgg 540 gtgaacggaa aagaagtgca ctcgggggtg tccacggacc cccagcctct gaaggaacag 600 ccggcactga atgactcacg ctactgtctg tcgtcacggc tgcgcgtgtc ggccaccttc 660 tggcaaaacc cgcgaaacca ctttcgctgc caagtgcagt tttacgggct ttccgagaac 720 gacgagtgga ctcaggacag agcgaagccc gtgacccaaa tcgtgtccgc cgaggcctgg 780 ggacgcgccg actgcggtat caccagcgcc agctaccacc agggcgtgct gtcagctacc 840 atcctttacg agatcctcct gggaaaggcc accctctacg ccgtcctggt gtccgcactg 900 gtgctgatgg ctatggtcaa gcggaaggat 930 <210> 113 <211> 1833 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR-9 polycistronic construct <400> 113 atgggttgtc ggttgctgtg ttgcgtcgtg ttctgccttc ttcaagctgg tcctctcgat 60 actgccgtga gccaaacccc taagtacctt gtcacccaaa tgggcaacga caagtccatc 120 aaatgcgaac agaacctcgg acacgacacc atgtactggt acaaacagga ttccaagaag 180 ttcctgaaga ttatgttctc atacaacaac aaggaactga ttatcaacga aactgtgccg 240 aaccggttct caccgaagtc gcctgacaag gctcatctca acttgcatat caactcgctg 300 gagctcggcg actccgccgt gtacttctgc gcgtccagcc agttctggga cggagcgggc 360 gacgaacagt acttcggccc gggcactcgg ctgaccgtga ccgaagatct gaacaaagtg 420 ttcccccccg aagtggccgt gttcgaacct tccaaggcgg agatcgccca cacccaaaag 480 gccactctgg tctgcctggc caccggtttc ttccccgatc acgtggaact gtcttggtgg 540 gtgaacggaa aagaagtgca ctcgggggtg tccacggacc cccagcctct gaaggaacag 600 ccggcactga atgactcacg ctactgtctg tcgtcacggc tgcgcgtgtc ggccaccttc 660 tggcaaaacc cgcgaaacca ctttcgctgc caagtgcagt tttacgggct ttccgagaac 720 gacgagtgga ctcaggacag agcgaagccc gtgacccaaa tcgtgtccgc cgaggcctgg 780 ggacgcgccg actgcggtat caccagcgcc agctaccacc agggcgtgct gtcagctacc 840 atcctttacg agatcctcct gggaaaggcc accctctacg ccgtcctggt gtccgcactg 900 gtgctgatgg ctatggtcaa gcggaaggat tttagggcca aacgcgggtc cggagcgacc 960 aacttctcgc tgttgaagca ggccggcgat gtggaagaga accctggacc gatgacgtcc 1020 attagagccg tgttcatttt cctgtggctg caactggacc tcgtgaatgg agaaaacgtc 1080 gagcagcacc catccaccct gagcgtgcag gagggagact ccgcagtcat caagtgcact 1140 tactccgact cagcatcaaa ctatttcccg tggtataagc aggaactcgg aaagcggcct 1200 cagctcatca ttgacatccg ctccaacgtc ggagagaaga aggaccagag aattgccgtg 1260 acactcaaca agaccgccaa gcatttctcc cttcacatca ccgaaaccca gcccgaggac 1320 agcgccgtct acttttgtgc ggcctcgagg ggcactgggt ttcagaagct cgtgttcggc 1380 actgggaccc ggctgctggt gtcgccaaac atccagaatc cagaccccgc ggtgtaccag 1440 ctgagagact cgaagtcttc cgataaatcc gtgtgtctct ttacagactt cgatagccag 1500 actaacgtgt cccagtccaa ggactccgat gtgtacatca ccgacaagac tgtgctggat 1560 atgcggagca tggactttaa gtccaattca gcggtcgcgt ggagcaacaa gtccgacttc 1620 gcctgcgcta acgctttcaa caactccatt atcccggagg ataccttctt cccgtcaagc 1680 gacgtcccct gcgacgtgaa gctggtcgag aagtccttcg aaaccgatac caacctgaac 1740 ttccaaaacc tcctagtgat tgtgctcaga atcctgctgc tgaaagtggc tggcttcaat 1800 ttgctgatga ccctgcggct ctggagcagc taa 1833 <210> 114 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR-9 a complete <400> 114 Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp 1 5 10 15 Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val 20 25 30 Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala 35 40 45 Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln 50 55 60 Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg 65 70 75 80 Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile 85 90 95 Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser 100 105 110 Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu 130 135 140 Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe 145 150 155 160 Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile 165 170 175 Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn 180 185 190 Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala 195 200 205 Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp 210 215 220 Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr 225 230 235 240 Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu 245 250 255 Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser 260 265 270 Ser <210> 115 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR-9 b complete <400> 115 Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala 1 5 10 15 Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr 20 25 30 Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His 35 40 45 Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile 50 55 60 Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro 65 70 75 80 Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His 85 90 95 Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly 115 120 125 Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu 130 135 140 Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys 145 150 155 160 Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu 165 170 175 Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr 180 185 190 Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr 195 200 205 Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro 210 215 220 Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn 225 230 235 240 Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser 245 250 255 Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr 260 265 270 His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly 275 280 285 Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala 290 295 300 Met Val Lys Arg Lys Asp 305 310 <210> 116 <211> 610 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR-9 polyprotein <400> 116 Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala 1 5 10 15 Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr 20 25 30 Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His 35 40 45 Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile 50 55 60 Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro 65 70 75 80 Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His 85 90 95 Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly 115 120 125 Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu 130 135 140 Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys 145 150 155 160 Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu 165 170 175 Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr 180 185 190 Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr 195 200 205 Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro 210 215 220 Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn 225 230 235 240 Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser 245 250 255 Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr 260 265 270 His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly 275 280 285 Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala 290 295 300 Met Val Lys Arg Lys Asp Phe Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr 305 310 315 320 Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 325 330 335 Pro Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu 340 345 350 Asp Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser 355 360 365 Val Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser 370 375 380 Ala Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro 385 390 395 400 Gln Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln 405 410 415 Arg Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His 420 425 430 Ile Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala 435 440 445 Ser Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg 450 455 460 Leu Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 465 470 475 480 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 485 490 495 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 500 505 510 Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 515 520 525 Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 530 535 540 Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser 545 550 555 560 Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp 565 570 575 Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu Arg Ile Leu 580 585 590 Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 595 600 605 Ser Ser 610

Claims (27)

  1. MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(TCR)로서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
    a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역,
    서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역; 또는
    b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역,
    서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역; 또는
    c) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역,
    서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역.
  2. 제1항에 있어서, TCR는 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 특이적으로 인식하고, 바람직하게는 TCR은 서열 번호 1의 아미노산 서열의 HLA-A2 결합 형태를 특이적으로 인식하고, 보다 바람직하게는 TCR은 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는, 단리된 TCR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
    a) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는
    b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는
    c) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TCR은 서열 번호 4, 7, 14, 17, 24 및 27의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 기능적 부분을 포함하는, 단리된 TCR.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
    a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
    b) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
    c) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
    a) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬;
    b) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 90의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
    c) 서열 번호 91의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 단리된 TCR:
    a) 서열 번호 102의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬;
    b) 서열 번호 108의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 109의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬; 또는
    c) 서열 번호 114의 아미노산 서열을 갖는 TCR α 사슬 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 갖는 TCR β 사슬.
  8. IFN-γ 분비가 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에의 결합에 의해 유도되는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단리된 TCR, 또는 제8항에 따른 다가 TCR 복합체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 세포(effector cell) 상에 발현된 TCR이 HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 결합함으로써 유도된 IFN-γ 분비는, HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 관련 없는 펩티드에의 결합과 비교하여, HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 결합할 때 100 배 초과, 바람직하게는 500 배 초과, 보다 바람직하게는 2000 배 초과일 수 있는, 단리된 TCR.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 적어도 2개의 TCR을 포함하는 다가 TCR 복합체.
  11. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 94, 96, 98, 104, 110 및 116 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 제11항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  13. 제12항에 있어서, TCR α 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 69, 77, 85, 99, 105, 및 111 중 어느 하나에 기재된 것인, 핵산.
  14. 제12항에 있어서, TCR β 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 70, 78, 86, 100, 106, 및 112 중 어느 하나에 기재된 것인, 핵산.
  15. 제10항에 있어서, TCR은 다음을 포함하는, 핵산:
    a) 서열 번호 69에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 70에 의해 암호화되는 TCR β 사슬;
    b) 서열 번호 77에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 78에 의해 암호화되는 TCR β 사슬;
    c) 서열 번호 85에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 86에 의해 암호화되는 TCR β 사슬;
    d) 서열 번호 99에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 100에 의해 암호화되는 TCR β 사슬;
    e) 서열 번호 105에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 106에 의해 암호화되는 TCR β 사슬; 또는
    f) 서열 번호 111에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 112에 의해 암호화되는 TCR β 사슬.
  16. 제12항에 있어서, 융합 단백질은 서열 번호 93, 95, 97, 101, 107 및 113 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화되는, 핵산.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터로서, 상기 벡터는 바람직하게는 발현 벡터, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터 또는 더욱 더 바람직하게는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  18. 하기를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로서,
    a) 서열 번호 87 및 서열 번호 88에 기재된 폴리펩티드 서열;
    b) 서열 번호 89 및 서열 번호 90에 기재된 폴리펩티드 서열;
    c) 서열 번호 91 및 서열 번호 92에 기재된 폴리펩티드 서열;
    d) 서열 번호 102 및 서열 번호 103에 기재된 폴리펩티드 서열;
    e) 서열 번호 108 및 서열 번호 109에 기재된 폴리펩티드 서열; 또는
    f) 서열 번호 114 및 서열 번호 115에 기재된 폴리펩티드 서열;
    상기 벡터는 바람직하게는 발현 벡터, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터 또는 더욱 더 바람직하게는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  19. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 발현하는 세포.
  20. 제17항 또는 제18항의 벡터를 포함하는 세포.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 세포는 면역 이펙터 세포인, 세포.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포 또는 자연 살해 T(NKT) 세포인, 세포.
  23. MAGE-A4에 대한 특이성을 매개하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 TCR의 일부에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 바람직하게는 MAGE-A4 특이성을 매개하는 TCR의 일부는
    a) 서열 번호 4의 알파 사슬의 CDR3 및/또는 서열 번호 7의 베타 사슬의 CDR3 또는;
    b) 서열 번호 14의 알파 사슬의 CDR3 및/또는 서열 번호 17의 베타 사슬의 CDR3 또는;
    c) 서열 번호 24의 알파 사슬의 CDR3 및/또는 서열 번호 27의 베타 사슬의 CDR3
    을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 제8항에 따른 다가 TCR 복합체, 제11항의 융합 단백질, 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제17항 또는 제18항에 따른 벡터, 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포, 또는 제23항에 따른 항체를 포함하는 조성물.
  25. 약학적으로 허용가능한 담체, 및 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 제8항에 따른 다가 TCR 복합체, 제11항의 융합 단백질, 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제17항 또는 제18항에 따른 벡터, 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포, 또는 제23항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
  26. 약제로 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 제8항에 따른 다가 TCR 복합체, 제11항의 융합 단백질, 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제17항 또는 제18항에 따른 벡터, 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포, 제23항에 따른 항체, 제24항의 조성물, 또는 제25항의 약학 조성물.
  27. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 제8항에 따른 다가 TCR 복합체, 제11항의 융합 단백질, 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제17항 또는 제18항에 따른 벡터, 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포, 제23항에 따른 항체, 제24항의 조성물, 또는 제25항의 약학 조성물로서, 여기서 암은 바람직하게는 혈액암 또는 고형 종양이고, 보다 바람직하게는 암은 육종, 전립선암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비소세포폐암, 비-호지킨(non-Hodgkin's) 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 간세포 암종, 두경부암, 위암, 자궁내막암, 결장직장암, 담관암, 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 암은 NSCLC, SCLC, 유방, 난소 또는 결장직장암, 육종 및 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, TCR, 다가 TCR 복합체, 융합 단백질, 핵산, 벡터, 세포, 항체, 조성물 또는 약학 조성물.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3139011A1 (en) * 2019-05-08 2020-11-12 Medigene Immunotherapies Gmbh Engineered t cells
WO2021195503A1 (en) * 2020-03-27 2021-09-30 2Seventy Bio, Inc. T cell receptors
CN111647069B (zh) * 2020-06-17 2022-06-21 深圳豪石生物科技有限公司 一种改进的tcr及其应用
WO2022190009A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Cdr-Life Ag Mage-a4 peptide-mhc antigen binding proteins
CN115975003B (zh) * 2021-03-09 2024-01-26 科士华(南京)生物技术有限公司 Tcr、多肽、表达载体、宿主细胞、药物组合物和tcr获得方法
EP4091627A1 (en) 2021-05-21 2022-11-23 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Tcr constructs specific for magea4-derived epitopes
WO2023288267A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 2Seventy Bio, Inc. Engineered t cell receptors fused to binding domains from antibodies
CN116836261A (zh) * 2022-03-24 2023-10-03 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别mage-a4抗原的高亲和力tcr及其序列和应用
WO2023196997A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 2Seventy Bio, Inc. Multipartite receptor and signaling complexes
WO2023230512A1 (en) 2022-05-26 2023-11-30 2Seventy Bio, Inc. Compositions for maintaining lentiviral vector and uses thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
PL208712B1 (pl) 2001-08-31 2011-05-31 Avidex Ltd Rozpuszczalny receptor komórek T (sTCR), rozpuszczalna αβ-postać receptora komórek T (sTCR), wielowartościowy kompleks receptora komórek T (TCR), sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd, środek farmaceutyczny zawierający sTCR i/lub wielowartościowy kompleks TCR, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarz, sposób otrzymywania całości lub części łańcucha α TCR albo całości lub części łańcucha β TCR, sposób otrzymywania rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), sposób otrzymywania rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR) oraz sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd
EP2006376A1 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH Fusion protein comprising a caspase domain and a nuclear hormone receptor binding domain and methods and uses thereof
HUE048014T2 (hu) * 2012-09-14 2020-05-28 Us Health MHC Class II-korlátozott MAGE-A3-at felismerõ T-sejt receptorok
JP7240176B2 (ja) * 2016-04-08 2023-03-15 アダプティミューン・リミテッド Ｔ細胞受容体
DK3440105T3 (da) * 2016-04-08 2022-06-13 Immunocore Ltd T-cellereceptorer
CN111328288A (zh) * 2017-08-18 2020-06-23 磨石肿瘤生物技术公司 靶向共同抗原的抗原结合蛋白

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