CN115975003B - Tcr、多肽、表达载体、宿主细胞、药物组合物和tcr获得方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及细胞免疫治疗技术领域，特别涉及一种T细胞受体（TCR）、多肽、表达载体、宿主细胞、药物组合物和TCR的获得方法。所述TCR包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30中的任一条序列具有至少90%同一性的TCRα多肽以及与SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:60中的任一条序列具有至少90%同一性的TCRβ多肽，其中所述TCRα多肽与所述TCRβ多肽按顺序一一对应。本申请中获得的TCR均是经过病人自身胸腺阴性选择排除了能与人体正常组织反应的TCR，从源头大幅度降低了因抗自身抗原的免疫毒性。
Description
技术领域
本申请涉及细胞免疫治疗的技术领域，尤其涉及一种特异性识别MAGE-A4抗原肽的TCR、多肽、表达载体、宿主细胞、药物组合物和TCR获得方法。
背景技术
黑色素瘤抗原A4(Melanoma antigen family A4，MAGE A4)属于癌-睾丸抗原家族，在多种肿瘤细胞中表达，但在正常组织中的表达仅限于成人睾丸和胎盘。因此，MAGE A4是较为理想的肿瘤治疗靶标。但由于该靶点不是肿瘤细胞表面抗原，因此现有的抗体技术和嵌合抗原受体技术难以特异性识别该靶点。
T细胞受体(T Cell Receptor,TCR)是表达在T细胞表面的类抗体样分子，根据组成该受体蛋白的不同可分为αβ型TCR和γδ型TCR。其中，αβ型TCR可特异性地识别细胞表面由主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC；人类MHC被称为human leukocyte antigen，HLA)呈递的抗原短肽-MHC复合物。因此，TCR可以特异性地识别由肿瘤细胞MHC呈递至肿瘤细胞表面的细胞内癌抗原，如MAGE A4，可突破前述抗体和嵌合抗原受体等现有技术的局限。
TCR具有多样性，且该多样性被认为是宿主防御的重要机制之一。多样性的产生是由各个不同的TCR-αβ基因片段通过随机重组、插入、删除和替换所导致的，其形成具有多态性的TCR库。基因组编码TCR的基因序列理论上可以创造出1015至1020种TCR克隆型(一个克隆型是表达一种特定TCR的一群T细胞)。
目前，在一些相关技术中，本领域技术人员主要通过体外试验手段筛选特定靶点的TCR序列。例如，在一些相关技术中，通过体外刺激T细胞来对MAGE A4或MAGE B2的TCR序列进行筛选，产生新的TCR序列。经该途径筛选获得的特异性TCR-T虽然能识别其特异性靶点并通过功能性验证(细胞杀伤，小鼠肿瘤清除实验等)，但由上述现有技术获得的T细胞未经胸腺阴性选择去除自身免疫性，故构建的TCR T细胞有可能攻击自身正常组织，产生免疫毒性。例如，在一些相关技术中，经体外筛选得到的MAGE-A3 TCR T细胞，因未经胸腺阴性筛选而异常识别心脏的肌联蛋白，在临床试验中产生不可耐受的心脏毒性。
此外，目前针对MAGE A4的TCR-T技术在临床应用时实际主要选择肉瘤作为临床开发研究适应症，但该适应症在中国肿瘤患者中的比例非常低。
发明内容
针对前述问题，本申请提供了一种天然的特异性识别MAGE-A4阳性肿瘤的T细胞受体(TCR)以及该TCR表达载体及宿主细胞，以用于治疗肿瘤疾病。
在第一方面，本申请提供了一种特异性识别MAGE-A4抗原肽的T细胞受体(TCR)，其包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30中的任一条序列具有至少90％同一性的TCRα多肽以及与SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:60中的任一条序列具有至少90％同一性的TCRβ多肽，其中所述TCRα多肽与所述TCRβ多肽按顺序一一对应。
在一些实施方案中，所述抗原肽是HLA-A2限制性的。例如，在本申请的一些进一步的实施方案中，所述HLA-A2的分型为HLA-A*0201。
在一些实施方案中，序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30依次包含与CDRα1(SEQ IDNO:61至SEQ ID NO:90)、CDRα2(SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:120)和CDRα3(SEQ ID NO:121至SEQ ID NO:150)具有至少95％同一性的序列，其中所述CDRα1、所述CDRα2和所述CDRα3按顺序一一对应；并且序列SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:60依次包含与CDRβ1(SEQ ID NO:151至SEQ ID NO:180)、CDRβ2(SEQ ID NO:181至SEQ ID NO:210)和CDRβ3(SEQ ID NO:211至SEQ ID NO:240)具有至少95％同一性的序列，其中所述CDRβ1、所述CDRβ2和所述CDRβ3按顺序一一对应。例如，SEQ ID NO:1的TCRα多肽包含SEQ ID NO:61的CDRα1、SEQ ID NO:91的CDRα2和SEQ ID NO:121的CDRα3。又如，SEQ ID NO:31的TCRβ多肽包含SEQ ID NO:151的CDRβ1、SEQ ID NO:181的CDRβ2和SEQ ID NO:211的CDRβ3。其余的序列依次类推。
在一些进一步的实施方案中，序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30依次包含与CDRα1(SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:90)、CDRα2(SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:120)和CDRα3(SEQ IDNO:121至SEQ ID NO:150)具有至少99％同一性的序列，其中所述CDRα1、所述CDRα2和所述CDRα3按顺序一一对应；并且序列SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:60依次包含与CDRβ1(SEQ IDNO:151至SEQ ID NO:180)、CDRβ2(SEQ ID NO:181至SEQ ID NO:210)和CDRβ3(SEQ ID NO:211至SEQ ID NO:240)具有至少99％同一性的序列，其中所述CDRβ1、所述CDRβ2和所述CDRβ3按顺序一一对应。
在一些实施方案中，序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30依次包含序列CDRα1(SEQID NO:61至SEQ ID NO:90)、CDRα2(SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:120)和CDRα3(SEQ ID NO:121至SEQ ID NO:150)，其中所述CDRα1、所述CDRα2和所述CDRα3按顺序一一对应；并且序列SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:60依次包含序列CDRβ1(SEQ ID NO:151至SEQ ID NO:180)、CDRβ2(SEQ ID NO:181至SEQ ID NO:210)和CDRβ3(SEQ ID NO:211至SEQ ID NO:240)，其中所述CDRβ1、所述CDRβ2和所述CDRβ3按顺序一一对应。
在一些实施方案中，所述TCRα多肽与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:31中的任一条序列具有至少95％同一性，并且所述TCRβ多肽与SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:62中的任一条序列具有至少95％同一性，其中所述TCRα多肽与所述TCRβ多肽按顺序一一对应。
本申请中，所述TCRα多肽与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:31中的任一条序列具有至少99％同一性，并且TCRβ多肽与SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:62中的任一条序列具有至少99％同一性，其中所述TCRα多肽与所述TCRβ多肽按顺序一一对应。
在第二方面，本申请提供了一种多肽，其包含序列CDRα1(SEQ ID NO:61至SEQ IDNO:90)、CDRα2(SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:120)和CDRα3(SEQ ID NO:121至SEQ ID NO:150)的TCRα多肽和含有序列CDRβ1(SEQ ID NO:151至SEQ ID NO:180)、CDRβ2(SEQ ID NO:181至SEQ ID NO:210)和CDRβ3(SEQ ID NO:211至SEQ ID NO:240)的TCRβ多肽。
在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30的任一条氨基酸序列具有至少90％同一性的TCRα多肽和与SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:60任一条氨基酸序列具有至少90％同一性的TCRβ多肽。
在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30的任一条氨基酸序列具有至少95％同一性的TCRα多肽和与SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:60任一条氨基酸序列具有至少95％同一性的TCRβ多肽。
在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30中的任一条序列的TCRα多肽。
在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:60中的任一条序列的TCRβ多肽。
在第三方面，本申请还提供了一种多核苷酸，其能够编码根据第二方面所述的多肽。
在第四方面，本申请还提供了一种表达载体，所述表达载体包含根据前述第一方面所述的TCR。在一些实施方案中，所述表达载体为病毒载体。在一些实施方案中，所述表达载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在一些实施方案中，所述载体还包含人源化C域或鼠源化C域或经改造的人源C域。进一步地，所述人源化C域包含链接α链的人源化C域(序列SEQ ID NO:243)和链接β链的人源化C域(序列SEQ ID NO:244)；所述鼠源化C域包含链接α链的鼠源化C域(序列SEQ ID NO:245)和链接β链的鼠源化C域(序列SEQ ID NO:246)；所述经改造的人源C域包含链接α链的经改造的人源C域(序列SEQ ID NO:247)和链接β链的经改造的人源C域(序列SEQ ID NO:248)。
在一些实施方案中，所述表达载体还包含接头结构域，所述接头结构域在TCRα多肽和TCRβ多肽之间。在一些实施方案中，所述接头结构域选自序列SEQ ID NO:241或SEQ IDNO:242。
在一些实施方案中，在所表达载体中TCRα链和TCRβ链的连接方式为：TCRα链V(D)J+链接α链的人源化C域(序列SEQ ID NO:243)或链接α链的鼠源化C域(序列SEQ ID NO:245)或链接α链经改造的人源化C域(序列SEQ ID NO:247)+接头结构域(序列SEQ ID NO:249或SEQ ID NO:250)+TCRβ链V(D)J+链接β链的人源化C域(序列SEQ ID NO:244)或链接β链的鼠源化C域(序列SEQ ID NO:246)或链接β链经改造的人源化C域(序列SEQ ID NO:248)。
其中，在同一条TCR完整链中，TCRα链后链接的C域与TCRβ链后链接的C域选自同种来源，如同时选自人源化C域，或同时选自鼠源化C域，或同时选自经改造的人源化C域。
在第五方面，本申请还提供一种宿主细胞，用于改造本申请制备的TCR。在一些实施方案中，所述细胞为免疫细胞。
进一步地，所述免疫细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、恒定NK细胞或外周血其他淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是从脐带或血液中分离的同种自体或同种异体细胞。
在第六方面，本申请还提供一种药物组合物，包含根据第五方面所述的MAGE-A4TCR特异性细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症。在一些进一步的实施方案中，所述癌症为食管癌、胃癌、膀胱癌、头颈部肿瘤或肉瘤。
在第七方面，本申请提供了一种获得前述任一方面所述的TCR的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(1)通过免疫组织化学及HLA测序分型获得人体MAGE-A4阳性(HLA-A*02:01)肿瘤组织作为潜在的TCR筛选对象，此对象群体全部为经过胸腺自身免疫耐受筛选过的T细胞；(2)制备含有MAGE-A4肽段HLA-A*02:01四聚体；(3)将获得的天然肿瘤组织消化成单细胞悬液，并通过由步骤(2)制得的含有MAGE-A4肽段的HLA-A*02:01四聚体筛选能识别MAGE-A4肽段的T细胞；(4)单细胞组学测序上一步筛选的T细胞，获得能识别MAGE-A4肽段的TCR V(D)J全长序列。
进一步地，所述步骤(1)MAGE-A4阳性肿瘤的筛选包括：取MAGE-A4阳性肿瘤的手术或穿刺标本，从FFPE标本中切下4μm厚的切片，并贴在玻片上；载玻片被烘烤和脱蜡；抗原修复；在阻断内源性过氧化物酶和非特异性结合蛋白后，稀释MAGE-A4一抗，4℃过夜孵育一抗，次日孵育酶标二抗，随后DAB显色，接着用Harris苏木素染色液复染,最后用中性树胶封片，扫描，确认筛选结果；HLA-A*02:01分型的确认。
更进一步地，所述步骤HLA-A*02:01分型的确认，包括两种确认方法：
方法一：单细胞测序获得的表达原始数据经cellranger的count模块比对到参考基因组GRCh38上，比对之后会生成比对的bam文件“possorted_genome_bam.bam”及细胞-基因表达矩阵；基于比对产生的bam文件和细胞barcode文件，用软件scHLAcount进行单细胞的HLA分型，分型后会生成样本检测到的所有HLA分型种类文件，样本每种HLA分型深度统计文件，以及细胞-HLA分型深度矩阵文件，从而确认样本的分型。
方法二：将样本收样状态为冻存于细胞冻存液的PBMC，样本融化后使用PBS清洗两次去除细胞冻存液，离心去除PBS缓冲液。细胞沉淀使用Qiagen总RNA提取试剂盒提取RNA，RNA变性后使用Vazyme HiScript逆转录得到cDNA；cDNA使用Abclonal Gloria HS PCR Kit和HAL1、HLA2对应引物进行两次靶向富集，取富集产物取50ng用Abclonal FSDNA Lib Prepkit经片段化、末端修复、接头连接、Index PCR扩增构建测序文库，确认样本的分型。
进一步地，所述步骤(2)制备MAGE-A4 HLA-A*02:01四聚体，具体方式如下：选取合成MAGE-A4的结合有HLA-A*02:01的抗原肽；肽交换；制备四聚体。
更进一步地，所述肽交换的具体步骤包括：
通过将5μl肽储备液与120μl PBS混合，将选择的10mM肽储备液稀释至400μM，并保持在冰上；
添加20μl稀释肽(400μM)和20μl肽Flex-TTM HLA-A*02:01单体UVX(280004；Biolegend)(200微克/毫升)注入96孔V底板。用移液管上下混合；
封板，在4℃下以2500xg离心2分钟，以收集液体；
拆下密封件，将板放在冰上，用紫外线灯照射30分钟(紫外线灯与样品的距离应为2-5cm)；
再次封板，在37℃的黑暗中培养30分钟，以收集液体，所得液体为获得的肽交换单体。
更进一步地，四聚体的制备，具体步骤包括：
将肽交换单体转移到1.5ml Eppendorf微型离心管或新板中，然后添加PE链霉亲和素，通过上下移液管混合，在冰上黑暗中孵化30分钟；
在培养过程中，通过向PBS中添加M D-生物素和10％(w/v)NaN3制备封闭溶液，培养后，添加封闭溶液并上下移液管停止反应；
将试管或密封板在2-8℃下培养过夜；
准备靶组：
在进行染色之前，将组装好的四聚体在管或板中以2500xg在4℃下离心5分钟，然后在黑暗中冰上保存；
在12x75mm管子或96孔U形底板上，用细胞染色缓冲液将体积调节至200μl，每个Flex-T样品添加2μlTM在步骤7-9中制备复合物，混合并在冰上在黑暗中培养30分钟；
如果与表面抗体共染色，根据每种试剂的最佳染色浓度制备抗体混合物，在黑暗中冰上孵育30分钟。
用染色缓冲液清洗细胞两次，用染色缓冲液重新培养细胞；
用流式细胞仪采集样本，并在2小时内进行适当设置。
进一步地，所述步骤(3)将获得的天然肿瘤组织消化成单细胞悬液，并通过MAGE-A4肽段HLA-A*02:01四聚体筛选能识别MAGE-A4肽段的T细胞，具体方式为：根据样本特性选择合适的单细胞悬液制备方法，将手术取出肿瘤组织后剔除表面附着的结缔组织，剪成1cm×1cm大小的组织块，用眼科剪充分剪碎，放入15ml离心管内，而后每管肿瘤组织加入适量体积Miltenyi gentleMACS dissociator KIT中消化液或自研组织消化酶混合液消化组织；
处理后细胞悬液样本中如果含有红细胞需要使用红细胞裂解液裂解；
细胞质量检测：使用Bio-Rad TC20全自动细胞计数仪结合显微镜进行细胞悬液质量准确检测。
进一步地，所述步骤(4)单细胞组学测序上一步筛选的T细胞，获得能识别MAGE-A4肽段的T细胞TCRV(D)J全长序列，具体方式为：通过单细胞免疫组学测序获得肿瘤中能识别MAGE-A4肽段的T细胞TCRV(D)J全长序列。
本申请的含有有效治疗剂量的MAGE-A4 TCR特异性细胞的用途，用于治疗癌症。
有益效果：
1、本申请选取了MAGE A4+HLA-A02+的食管癌、膀胱癌、喉癌病人的肿瘤组织，从中获取T细胞，并筛选出能识别MAGEA4+的天然TCR。此方法获得的TCR均是经过病人自身胸腺阴性选择排除了能与人体正常组织反应的TCR，从源头大幅度降低了因抗自身抗原的免疫毒性。
2、本申请通过免疫组织化学方法在20种癌种中筛选MAGEA4的表达量，发现该靶点在中国肿瘤患者的食管癌、胃癌、膀胱癌、喉癌中高表达、阳性比例高。考虑到上述癌种在中国人发病率均高于肉瘤，因此本申请开发针对食管癌、胃癌、膀胱癌、喉癌、肉瘤的TCR序列及包含有该序列的表达载体、赋形剂、细胞及其制剂，以及包含有该序列产品在癌症患者中的临床应用。
附图说明
图1A至图1D为MAGE-A4阳性肿瘤切片扫描筛选结果。其中，图1A为PA001食管中分化鳞形细胞癌，临床IA期扫描结果；图1B为PA002食管基底样鳞形细胞癌，中-低分化临床IIIB期扫描结果；图1C为PA003声门型中分化鳞形细胞癌，临床III期扫描结果；图1D为PA004膀胱浸润性尿路上皮癌，临床II期扫描结果。
图2为细胞系杀伤效果图。
图3A至图3D为肿瘤清除效果实验，图3E为实验小鼠体重变化检测。
图4A至4C为IFN ELISA实验。
图5为本申请实施例6PA2021-TCR01 MAGE-A4 IHC病理染色结果(40X)。
图6A-图6B为本申请所筛选的TCR-T细胞在肿瘤病人治疗效果，图6A为Day 0:静脉输注TCR01-05细胞制剂5e10 TCR-T细胞的MR结果，图6B为Day 45:静脉输注后45天的MR结果。
序列表说明
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:30：TCRα多肽链序列
SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:60：TCRβ多肽链序列
SEQ ID NO:61-SEQ ID NO90：TCRα多肽链CDRα1序列
SEQ ID NO:91-SEQ ID NO120：TCRα多肽链CDRα2序列
SEQ ID NO:121-SEQ ID NO:150：TCRα多肽链CDRα3序列
SEQ ID NO:151-SEQ ID NO:180：TCRβ多肽链CDRβ1序列
SEQ ID NO:181-SEQ ID NO:210：TCRβ多肽链CDRβ2序列
SEQ ID NO:211-SEQ ID NO:240：TCRβ多肽链CDRβ3序列
SEQ ID NO:241-SEQ ID NO:242：接头结构域
SEQ ID NO:243：链接α链的人源化C域
SEQ ID NO:244：链接β链的人源化C域
SEQ ID NO:245：链接α链的鼠源化C域
SEQ ID NO:246：链接β链的鼠源化C域
SEQ ID NO:247：链接α链的经改造的人源化C域
SEQ ID NO:248：链接β链的经改造的人源化C域
具体实施方式
针对目前存在的问题，经过大量研究，本申请的发明人发现了一种新的技术路径，其包括选取MAGEA4+和HLA-A02+的食管癌、膀胱癌、喉癌病人的肿瘤组织，从中获取T细胞，并筛选出能识别MAGEA4+的天然TCR序列。此方法获得的TCR均是经过病人自身胸腺阴性选择排除了能与人体正常组织反应的TCR，从源头大幅度降低了脱靶毒性。
此外，在一些相关技术中，针对MAGE A4的TCR T技术在临床应用时实际主要选择肉瘤作为临床开发研究适应症，但该适应症在中国肿瘤患者中的比例非常低。为扩大本技术应用范围，本申请的发明人通过免疫组织化学方法在20种癌种中筛选MAGEA4的表达量，发现该靶点在中国肿瘤患者的食管癌、胃癌、膀胱癌、喉癌中高表达、阳性比例高。考虑到上述癌种在中国人发病率均高于肉瘤，因此本申请的发明人开发针对食管癌、胃癌、膀胱癌、喉癌、肉瘤的TCR序列及包含有该序列的表达载体、赋形剂、细胞及其制剂，以及包含有该序列产品在癌症患者中的临床应用。
基于以上发现，完成了本发明。
除非上下文另有清楚地说明，否则本申请中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种，例如，对“细胞”的提及包括多个这样的细胞，并且对“肽”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或更多种肽及其等同物(例如，多肽)的提及。
实施例1
通过MAGE-A4抗原肽-四聚体筛选潜在能识别MAGE-A4阳性实体肿瘤(HLA-A*02:01阳性病人)的T细胞，包括以下步骤。
(1)通过免疫组织化学及HLA测序分型筛选得到人体MAGE-A4阳性(HLA-A*02:01)肿瘤手术标本或穿刺肿瘤组织
临床上获取MAGE-A4阳性肿瘤的手术标本，也可以为穿刺标本。本实施例中采用2例MAGE-A4阳性表达的食管癌肿瘤组织、1例MAGE-A4阳性表达的膀胱癌和1例MAGE-A4阳性表达的头颈部肿瘤，通过免疫组织化学法确认MAGE-A4表达强阳性。
具体方法如下：
从FFPE标本中切下4μm厚的切片，贴在载玻片上；对负载有切片的载玻片进行烘烤和脱蜡；进行抗原修复。
在阻断内源性过氧化物酶和非特异性结合蛋白后(山羊血清封闭液)，1：200稀释MAGE-A4一抗，4℃过夜孵育一抗，次日孵育酶标二抗，然后DAB显色，接着用Harris苏木素染色液复染，最后用中性树胶封片。用Vectra3多光谱扫描仪，在40×等效物镜下进行扫描，扫描结果见图1A-图1D，扫描后用inForm软件对图像进行分析，确认筛选结果。
然后进行HLA-A*02:01分型的确认，此实施例中，HLA-A*02:01分型确认的方法如下：
单细胞测序获得的表达原始数据经cellranger(V6.0.2)的count模块比对到参考基因组GRCh38上，比对之后会生成比对的bam文件“possorted_genome_bam.bam”及细胞-基因表达矩阵。
基于比对产生的bam文件和细胞barcode文件，用软件scHLAcount进行单细胞的HLA分型，分型后会生成样本检测到的所有HLA分型种类文件(labels.tsv)，样本每种HLA分型深度统计文件(summary.tsv)，以及细胞-HLA分型深度矩阵文件(count_matrix.mtx)，从而确认样本的分型。
本实施案例中测得4例病人的HLA分型依次如表1-表4所示：
表1
| PA001 HLA Type | Read_counts | HLA_cell_number | Total_cell_num | Pos_Cell_ratio |
| A*02:01:176 | 123094 | 11594 | 12342 | 0.9394 |
| B*38:01:01:06 | 116695 | 11248 | 12342 | 0.9114 |
| C*12:227 | 107872 | 11254 | 12342 | 0.9118 |
| DPA1*01:03:01:34 | 56519 | 7251 | 12342 | 0.5875 |
| DPA1*02:02:08 | 30281 | 5544 | 12342 | 0.4492 |
| DPB1*02:01:19:01 | 23787 | 5365 | 12342 | 0.4347 |
| DPB1*05:01:01:14 | 27268 | 5804 | 12342 | 0.4703 |
| DQA1*03:02:01:02 | 28750 | 5348 | 12342 | 0.4333 |
| DQB1*03:19:01:01 | 31422 | 5475 | 12342 | 0.4436 |
| DRB1*09:01:02:07 | 168840 | 9347 | 12342 | 0.7573 |
表2
表3
| PA003 HLA Type | Read_counts | HLA_cell_number | Total_cell_num | Pos_Cell_ratio |
| A*02:01:176 | 84405 | 5362 | 5886 | 0.911 |
| B*08:18 | 84061 | 5065 | 5886 | 0.8605 |
| C*01:17 | 57872 | 5181 | 5886 | 0.8802 |
| DPA1*01:03:01:34 | 40401 | 3787 | 5886 | 0.6434 |
| DPB1*05:01:01:14 | 12676 | 2536 | 5886 | 0.4309 |
| DPB1*124:01:02:01 | 14969 | 2441 | 5886 | 0.4147 |
| DQA1*03:02:01:02 | 12375 | 2092 | 5886 | 0.3554 |
| DQB1*03:03:02:04 | 6243 | 1529 | 5886 | 0.2598 |
| DRB1*09:01:02:07 | 52190 | 4147 | 5886 | 0.7046 |
表4
| PA004 HLA Type | Read_counts | HLA_cell_number | Total_cell_num | Pos_Cell_ratio |
| A*02:01:175 | 28510 | 2703 | 2983 | 0.9061 |
| B*08:18 | 31832 | 2671 | 2983 | 0.8954 |
| C*03:47 | 2300 | 1287 | 2983 | 0.4314 |
| C*07:429 | 10576 | 2289 | 2983 | 0.7673 |
| DPA1*01:03:17 | 955 | 531 | 2983 | 0.178 |
| DPA1*02:06 | 20972 | 1499 | 2983 | 0.5025 |
| DPB1*22:01:01:01 | 6010 | 918 | 2983 | 0.3077 |
| DPB1*105:01:01:10 | 6470 | 980 | 2983 | 0.3285 |
| DQA1*03:02:01:02 | 18009 | 1350 | 2983 | 0.4526 |
| DQB1*03:01:01:35 | 10154 | 1177 | 2983 | 0.3946 |
| DRB1*09:01:02:07 | 50977 | 1964 | 2983 | 0.6584 |
(2)制备含有MAGE-A4肽段HLA-A*02:01的四聚体
S1、选取10mM的MAGE-A4肽储备液，本实施例中选取的MAGE-A4肽储备液具有如下氨基酸序列：
1)KVLEHVVRV；2)GVYDGREHTV；3)ALLEEEEGV；4)KVDELAHFL；5)ALAETSYVKV；6)ALSNKVDEL。
选取具有氨基酸序列GVAGDVSAV(非自然界存在的)的HLA-A*02:01作为阴性对照。
S2、肽交换
S2-1、将5μl肽储备液与120μl PBS缓冲液混合，从而将10mM的肽储备液稀释至400μM，得稀释肽，并保持在冰上；
S2-2、将20μl由步骤S2-1制得的稀释肽添和20μL肽Flex-TTM HLA-A*02:01单体UVX(200μg/mL)注入96孔V底板，使用移液管进行混合；
S2-3、封板，在4℃条件下以2500xg离心2min，收集液体；
S2-4、拆下密封件，将板放在冰上，用紫外线灯照射30min，紫外线灯与样品的距离为4cm；
S2-5、再次封板，在37℃条件下，黑暗中培养30min，收集液体，所得液体即为肽交换单体。
为了评估肽交换的效率，遵循HLAI类ELISA评估肽交换的方案。
S3、制备四聚体
S3-1、将30μl由步骤S2获得的肽交换单体转移到1.5ml微型离心管或新板中，然后添加3.3μl PE链霉亲和素(购自Biolegend，货号为405204)，使用移液管进行混合，并在冰上黑暗中孵化30min；
S3-2、在步骤S3-1进行孵化的过程中，向192.4μl的PBS缓冲液中添加1.6μl 50mM的D-生物素和6μl 10％(w/v)的NaN3以制备封闭溶液，通过涡流混合，将制备得到的2.4μl封闭溶液添加至由步骤S3-1孵化所得的溶液中，并使用移液管进行混合，以停止反应；
S3-3、将微型离心管或板在5℃条件下培养过夜，以获得四聚体。
S4、准备靶组：
S4-1、在进行染色之前，将由步骤S3获得的四聚体在微型离心管或板中以2500xg在4℃下离心5min，然后在黑暗中冰上保存；
S4-2、在12x75mm管子或96孔U形底板上添加2x106个细胞。用细胞染色缓冲液将体积调节至200μl。每个Flex-TTM样品添加2μl在S4-1获得的四聚体，混合，并在冰上黑暗中培养30min；
S4-3、用染色缓冲液清洗细胞两次，用染色缓冲液重新培养细胞；
S4-4、在2小时内用流式细胞仪收集阳性细胞样本。
(3)将病人肿瘤组织消化成单细胞悬液
手术取出肿瘤组织后小心剔除表面附着的结缔组织，剪成1cm×1cm大小的组织块，用眼科剪充分剪碎，放入15ml离心管内，每管肿瘤组织加入6ml Miltenyi gentleMACSdissociator KIT的消化液或自研组织消化酶混合液消化组织；如果处理后的细胞悬液样本中含有红细胞，则使用红细胞裂解液裂解。
细胞质量检测：使用Bio-Rad TC20全自动细胞计数仪结合显微镜进行细胞悬液质量准确检测，实验细胞活性需大于70％，细胞直径小于40μm。
(4)获得能识别MAGE-A4肽段的TCR V(D)J全长序列
通过单细胞免疫组学测序获得上述4例病人肿瘤中(2例MAGE-A4阳性表达的食管癌肿瘤组织及1例MAGE-A4阳性表达的膀胱癌，1例MAGE-A4阳性表达的头颈部肿瘤)能识别MAGE-A4肽段的TCR V(D)J全长序列。
本实验共获得30条TCR V(D)J全长序列，编号为TCR01至TCR30，每一份TCR V(D)J全长序列一条包含TCRα多肽和一条TCRβ多肽，其序列如表5所示。
表5
| TCR | TCRα多肽链 | TCRβ多肽链 |
| TCR01 | SEQ ID NO：1 | SEQ ID NO：31 |
| TCR02 | SEQ ID NO：2 | SEQ ID NO：32 |
| TCR03 | SEQ ID NO：3 | SEQ ID NO：33 |
| TCR04 | SEQ ID NO：4 | SEQ ID NO：34 |
| TCR05 | SEQ ID NO：5 | SEQ ID NO：35 |
| TCR06 | SEQ ID NO：6 | SEQ ID NO：36 |
| TCR07 | SEQ ID NO：7 | SEQ ID NO：37 |
| TCR08 | SEQ ID NO：8 | SEQ ID NO：38 |
| TCR09 | SEQ ID NO：9 | SEQ ID NO：39 |
| TCR10 | SEQ ID NO：10 | SEQ ID NO：40 |
| TCR11 | SEQ ID NO：11 | SEQ ID NO：41 |
| TCR12 | SEQ ID NO：12 | SEQ ID NO：42 |
| TCR13 | SEQ ID NO：13 | SEQ ID NO：43 |
| TCR14 | SEQ ID NO：14 | SEQ ID NO：44 |
| TCR15 | SEQ ID NO：15 | SEQ ID NO：45 |
| TCR16 | SEQ ID NO：16 | SEQ ID NO：46 |
| TCR17 | SEQ ID NO：17 | SEQ ID NO：47 |
| TCR18 | SEQ ID NO：18 | SEQ ID NO：48 |
| TCR19 | SEQ ID NO：19 | SEQ ID NO：49 |
| TCR20 | SEQ ID NO：20 | SEQ ID NO：50 |
| TCR21 | SEQ ID NO：21 | SEQ ID NO：51 |
| TCR22 | SEQ ID NO：22 | SEQ ID NO：52 |
| TCR23 | SEQ ID NO：23 | SEQ ID NO：53 |
| TCR24 | SEQ ID NO：24 | SEQ ID NO：54 |
| TCR25 | SEQ ID NO：25 | SEQ ID NO：55 |
| TCR26 | SEQ ID NO：26 | SEQ ID NO：56 |
| TCR27 | SEQ ID NO：27 | SEQ ID NO：57 |
| TCR28 | SEQ ID NO：28 | SEQ ID NO：58 |
| TCR29 | SEQ ID NO：29 | SEQ ID NO：59 |
| TCR30 | SEQ ID NO：30 | SEQ ID NO：60 |
实施例2
本实施例与实施例1的区别之处在于，步骤(2)HLA-A*02：01分型确认的方法不同。本实施例HLA-A*02：01分型确认的方法为：
样本收样状态为冻存于细胞冻存液的PBMC。样本融化后使用PBS清洗两次去除细胞冻存液，离心去除PBS缓冲液。细胞沉淀使用Qiagen总RNA提取试剂盒提取RNA。RNA变性后使用Vazyme HiScript逆转录得到cDNA；
cDNA使用Abclonal Gloria HS PCR Kit和HAL1、HLA2对应引物进行两次靶向富集。富集产物取50ng用Abclonal FSDNALib Prep kit经片段化、末端修复、接头连接、IndexPCR扩增构建测序文库。
文库质检后在IlluminaNovaSeq6000测序平台完成测序，每个样本目标数据量9G。
实施例3TCR-T构建质粒病毒、细胞
(1)质粒构建
将TCR完整序列(TRA V(D)J+链接α链的C域+接头结构域+TRB V(D)J+链接β链的C域)克隆到慢病毒系统目的质粒(如PGK中)，并经过转染大肠杆菌，挑选卡纳抗性的阳性克隆扩增培养，利用Qiagen PlasmidMaxi Kit抽提质粒。
接头结构域选自改造后P2A(SEQ ID NO:241)或P2A链接序列(SEQ ID NO:242)。
本实施例中，TCR01-TCR05，选取的C域序列为SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244，接头结构域为改造后P2A(SEQ ID NO:241)；
TCR06-TCR10，选取的C域序列为SEQ ID NO:245和SEQ ID NO:246，接头结构域为改造后P2A(SEQ ID NO:241)；
TCR11-TCR15，选取的C域序列为SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244，接头结构域为P2A链接序列(SEQ ID NO:242)；
TCR15-TCR20，选取的C域序列为SEQ ID NO:245和SEQ ID NO:246，接头结构域为P2A链接序列(SEQ ID NO:242)；
TCR16-TCR20，选取的C域序列为SEQ ID NO:247和SEQ ID NO:248，接头结构域为改造后P2A(SEQ ID NO:241)；
TCR21-TCR25，选取的C域序列为SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244，接头结构域为改造后P2A(SEQ ID NO:241)；
TCR26-TCR30，选取的C域序列为SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244，接头结构域为C链接序列(SEQ ID NO:242)。
(2)病毒包装
1)包装前24h，将8x106293T细胞铺在10cm培养皿中，并补足10ml含10％FBS的DMEM培养基；随后将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
2)包装当天观察细胞，确认细胞汇合度达到80％(±2％)，且细胞呈透亮状态时进行慢病毒包装；
3)将包装过程中使用的试剂取出，平衡至室温；
4)吸10cm培养皿中的培养基，并沿着皿壁加入9ml不含血清的DMEM培养基，随后转移至CO2培养箱待用；
5)在1.5ml离心管中加入450μl Opti-MEM，再分别加入7.5μg psPAX2、5μg pMD2.G和10μg目的质粒，吹打混匀；
6)另取一个1.5ml离心管，加入450μl Opti-MEM，加入22.5ul的PEIpro试剂，吹打混匀；
7)将步骤5)所得的混合物与步骤6)所得的混合物混合，并吹打均匀，室温孵育10-15min；
8)将步骤7)所得的混合物轻轻滴加到10cm培养皿中，随后转移至CO2培养箱中继续培养；
9)6h后吸弃步骤8)培养获得的10cm培养皿中的培养基，并沿着皿壁加入10ml含10％FBS的DMEM培养基，随后转移至CO2培养箱中继续培养；
10)将步骤9)的培养基培养48h后，收集上清至50ml离心管，并沿着皿壁加入10ml含10％FBS的DMEM培养基，随后转移至CO2培养箱中继续培养，将病毒上清保存在4℃冰箱；
11)72h后收集步骤10)中保存的上清至50ml离心管，将收集好的病毒上清在500×g、4℃条件下离心10min去除细胞碎片；
12)使用注射器吸取步骤11)离心后的上清，经0.45μm的滤器过滤至新的50ml离心管中；
13)在步骤12)过滤后获得的上清，加入四分之一体积的PEG8000浓缩试剂，4℃摇床孵育3h以上；
14)将步骤12)孵育的病毒液在2000×g、4℃条件下离心40min，吸弃上清，加入4℃预冷的PBS轻轻吹打混匀；
15)将步骤14)获得的病毒分装到冻存管中，在-80℃条件下保存待用。
以上步骤获得的病毒需进行病毒滴度检测：
1)检测当天，将Jurkat细胞密度调整至3x105cells/ml，在24孔板中每孔加入1ml细胞悬液，随后将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养待用；
2)将病毒按照下表6配制方法进行梯度稀释，每组设置额外一组副孔；
表6
| 稀释比例 | 病毒体积(μL) | 1640培养基体积(μL) | 10mg/mL polybrene体积(μL) |
| 1∶50 | 30 | 468.5 | 1.5 |
| 1∶100 | 15 | 483.5 | 1.5 |
| 1∶200 | 7.5 | 483.5 | 1.5 |
| 1∶400 | 3.75 | 494.75 | 1.5 |
3)将病毒稀释液加入到细胞中，800g、21℃条件下离心2h，随后将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养；
4)60h后，取细胞送检FACS检测。
滴度计算方法：
TU/ml＝(感染细胞数×阳性率×稀释倍数)/感染体积
例如：当稀释比例为1∶100的孔阳性率为25％时，滴度为(3x105×0.25×100)/(1.5ml)＝5x106TU/ml
计算滴度时，只考虑阳性率低于40％的孔，因为阳性率高于40％时，会增加多个病毒颗粒重复感染一个细胞的情况，导致滴度计算不准确。
(3)PBMC复苏：
1)取30ml L500培养基至50ml离心管中，恢复至室温备用；
2)从-80℃冰箱或者液氮管中取出冻存的PBMC，核对好相关信息后将冻存管迅速放入37℃水浴锅中，快速晃动冻存管至冻存管管内无可见冰块；
3)取出已复苏的冻存管，擦干表面水滴并用75％酒精擦拭消毒，转移至生物安全柜中，用1ml移液器缓慢滴加至已复温的L500培养基中，在25℃400g离心5min；
4)离心结束后，弃上清，用30ml预温L500培养基重悬细胞，取10ul样本用于活细胞计数，再次在25℃400g离心5min洗涤一次。
(4)PBMC刺激活化
1)根据计数结果，使用适量L500培养基重悬细胞，调整活细胞密度至1-2e6/ml；
2)加入300IU/ml IL-2和50ng/ml CD3抗体，混匀后转入CO2培养箱刺激活化60h。
(5)慢病毒转导
1)PBMC活化48h后观察细胞活化情况，若活化情况良好可进行慢病毒转导，若活化效果不理想再刺激24h后进行慢病毒转导；
2)按照MOI＝2进行病毒添加，转入二氧化碳培养箱中培养48h；
3)将细胞转移至50ml离心管中，并取10μl用于活细胞计数，在25℃400g离心5min洗涤；
4)根据计数结果，用L500培养基重悬转染后的细胞，调整细胞浓度至1e6/ml，按100IU/ml添加IL-2，转入CO2培养箱中培养。
(6)细胞扩增培养
1)慢病毒转导换液后，每日观察细胞并取样计数，根据细胞数进行补液或者扩瓶，控制细胞细胞在1e6/ml，IL-2浓度100IU/ml；
2)细胞培养达预期数量收获，或培养天数至第九天收获。
实施例4细胞系杀伤实验
阳性：A375、H1755、H1395——(MAGE-A4+,HLA-A02+)
阴性：H1299——(MAGE-A4-,HLA-A02-)
取本申请筛选的能够特异性识别MAGE-A4阳性肿瘤的T细胞，与靶细胞按照细胞浓度5:1的比例，进行相关实验，所得结果如图2所示，其中横坐标1-30分别表示TCR01-TCR30，纵坐标表示其杀伤效果百分比。
采用TCR01-TCR30制备的T细胞，分别对阳性A375、H1755、H1395的靶细胞混合，T细胞与靶细胞的浓度比为5:1，所得结果如图2所示，其中横坐标1-30分别表示TCR01-TCR30，纵坐标表示其杀伤效果百分比。
结果显示，本申请筛选的TCR构建的TCR T细胞对阳性H1755、H1395有最显著的杀伤效果，其细胞杀伤率在70％-90％之间，本申请筛选的TCR构建的TCR-T细胞对阳性A375有较为显著的杀伤效果，其细胞杀伤率在50％-70％之间，本申请筛选的T细胞对HLA-A*02:01阴性的且MAGE-A4敲除的H1299的杀伤效果很低，低于10％。
实施例5小鼠体内肿瘤清除实验
选取NCG小鼠接种1e7个A375，H1395，H1755，H1395(MAGE-A4-)，其中前三个细胞系为天然HLA-A*02:01且MAGE-A4阳性表达；H1395(MAGE-A4-)为MAGE-A4靶点已经敲除。当肿瘤生长到体积100mm3时，尾静脉单次输注200μl体积3×106个相应的TCR-T细胞，进行肿瘤体积测量及体重检测。图3A-图3D为肿瘤清除效果实验，其中，横坐标表示用药天数，纵坐标表示随用药天数的增加，肿瘤大小的变化。
图3A是针对NCG H1395肿瘤小鼠进行注射，初始选择肿瘤细胞体积在100mm3左右，在TCR T注射后1-5天有一个较小的增幅，肿瘤体积增长至200mm3，5-18天期间，肿瘤体积发生明显下降，对照组MOCK在第18天肿瘤体积达到800mm3，而注射治疗后的肿瘤体积在100mm3以下，注射TCR05后，肿瘤大小维持在100mm3左右，其余TCR T注射后的肿瘤细胞体积明显缩小，接近0；
图3B是分别和NCG A375肿瘤小鼠进行注射，初始选择肿瘤细胞体积在100mm3左右，在TCR T注射后1-8天左右有一个较小的增幅，肿瘤体积增长至250mm3，8-18天期间，肿瘤体积发生明显变化，对照组MOCK在第18天肿瘤体积达到1000mm3以上，而注射治疗后的肿瘤体积在100mm3以下，其中，注射TCR07和TCR12的效果较好，接近0；
图3C是针对NCG H1755肿瘤小鼠进行注射，初始选择肿瘤细胞体积在100mm3左右，在1-18天期间内，对照组MOCK在第18天肿瘤体积达到900mm3，TCR T治疗组中，除了注射TCR17后，肿瘤体积浮动较大，其余TCR T细胞注射后，肿瘤体积浮动较平缓，整体细胞体积在18天内无增幅，维持在100mm3及以下；
图3D是针对MAGE-A4敲除的H1395(MAGE-A4-，HLA-A02+)或野生型的H1395(MAGE-A4+，HLA-A02+)肿瘤小鼠进行注射，初始选择肿瘤细胞体积在100mm3左右，当肿瘤细胞呈现MAGE-A4阴性时，TCR T治疗效果显著受损，肿瘤在注射后18天体积达到800-900mm3，当肿瘤细胞呈现MAGE-A4阳性时，本专利TCR T注射后，可明显抑制细胞体积的增长，在注射后18天，肿瘤体积控制在100mm3以下；
图3E是注射后小鼠体重变化，可看出，在整个注射期内，小鼠体重无明显变化，说明注射本发明TCR-T细胞后，不会造成明显毒性反应。
通过图3A-图3E结果显示，构建的TCR T细胞有良好的抑制肿瘤效且较低体内毒性。
实施例6与正常细胞系不发生反应的IFN ELISA实验
选取TCR01-TCR15，对11种正常组织细胞以及阳性H1755(MAGE-A4+,HLA-A02+)细胞进行反应，3天后检测各细胞中的IFN含量，所选择的正常组织细胞如表7所示：
表7
| 原代细胞中文名称 | 产品货号 |
| 肺II型肺泡上皮细胞 | CTCC-A005-PC |
| 心肌细胞 | CTCC-C002-PC |
| 食管上皮细胞 | CTCC-D001-PC |
| 胃粘膜上皮细胞 | CTCC-D004-PC |
| 小肠黏膜上皮细胞 | CTCC-D007-PC |
| 结肠粘膜上皮细胞 | CTCC-D011-PC |
| 胆囊上皮细胞 | CTCC-D014-PC |
| 肝实质细胞 | CTCC-D017-PC |
| 肾小管上皮细胞 | CTCC-U002-PC |
| 膀胱上皮细胞 | CTCC-U008-PC |
| 胰岛细胞 | CTCC-G004-PC |
其检测结果如图4A-图4C所示。其中，横坐标为TCR01-TCR10，纵坐标为IIFFNN含量；图4A选用的是肺II型肺泡上皮细胞、心肌细胞、食管上皮细胞及胃粘膜上皮细胞；图4B选用的小肠粘膜上皮细胞、结肠粘膜上皮细胞、胆囊上皮细胞及肝实质细胞；图4C选用的是肾小管上皮细胞、膀胱上皮细胞。
当注射本发明TCR T细胞后，11种正常组织细胞中的IFN含量维持在0-5ng/ml，接近0ng/ml，表明TCR-T细胞对正常细胞基本无毒性，而在阳性H1755(MAGE-A4+,HLA-A02+)肿瘤细胞中IFN含量可达15-255ng/ml。
实施例7本申请所筛选的TCRT在肿瘤病人治疗中的效果
患者PA2021-TCR01，男，75岁，膀胱高级别乳头状尿路上皮癌，2020年9月因肉眼血尿就诊，完善相关检查后考虑膀胱占位，2020年10月行经尿道膀胱肿瘤电切术，术后病理提示膀胱高级别乳头状尿路上皮癌，浸润肌层。PET CT检查发现盆腔多个淋巴结FDG摄取阳性，考虑转移。确诊后行4次吉西他滨+顺铂+特普瑞利单抗方案治疗，2021年3月复查后肿瘤仍进展。后入组MAGE-A4 TCR T细胞治疗，肿瘤病理白片IHC染色结果显示MAGE-A4阳性(图5)，外周血HLA分型结果为HLA-A*02:01，见下表8。
表8
静脉输注TCR01-05细胞制剂5e9个TCR-T细胞，注射当天(图6A)及注射45天后MR复查结果(图6B)，显示病灶缩小且弥散减弱，肿瘤最大直径由48.52mm缩小至34.48mm。
上述实施例只为说明本申请的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本申请的内容并据以实施，并不能以此限制本申请的保护范围，在不偏离本申请的概念、精神和范围的情况下，可对本申请中所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。凡根据本申请精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (17)
1. 一种特异性识别MAGE-A4抗原肽的T细胞受体（TCR），其特征在于，其包含TCRα多肽与TCRβ多肽，其中TCRα多肽包含如SEQ ID NO:64所示的CDRα1、如SEQ ID NO:94所示的CDRα2和如SEQ ID NO:124所示的CDRα3；并且TCRβ多肽包含如SEQ ID NO:154所示的CDRβ1、如SEQ ID NO:184所示的CDRβ2和如SEQ ID NO:214所示的CDRβ3。
2.根据权利要求1所述的TCR，其特征在于，其中所述抗原肽是HLA-A2限制性的。
3.根据权利要求2所述的TCR，其特征在于，其中所述抗原肽是HLA-A*02:01限制性的。
4. 根据权利要求1所述的TCR，其特征在于，TCRα多肽为如SEQ ID NO:4所示的多肽，TCRβ多肽为如SEQ ID NO:34所示的多肽。
5. 一种特异性结合MAGE-A4抗原肽的TCR多肽，其特征在于，所述TCR多肽为包含如SEQID NO:4所示的TCRα多肽和含有如SEQ ID NO:34所示的TCRβ多肽的TCR多肽。
6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸能够编码根据权利要求5所述的TCR多肽。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含根据权利要求1-4任一项所述的TCR。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为病毒载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含接头结构域。
11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于，所述接头结构域在TCRα多肽和TCRβ多肽之间。
12. 根据权利要求11所述的表达载体，其特征在于，所述所述接头结构域选自序列SEQID NO:241或SEQ ID NO:242。
13. 根据权利要求12所述的表达载体，其特征在于，所述载体还包含序列SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247和SEQ ID NO:248中的一种。
14.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞用于表达根据权利要求1-3任一项所述的TCR，所述宿主细胞选自T细胞、NK细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是从脐带或血液中分离的同种自体或同种异体细胞。
16.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含根据权利要求14-15任一项所述的宿主细胞。
17. 根据权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗MAGE-A4 阳性的黑色素瘤、肺癌、或膀胱癌。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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