TWI618931B

TWI618931B - 使用細胞增殖法之循環腫瘤細胞的檢測、分離取得方法

Info

Publication number: TWI618931B
Application number: TW106106897A
Authority: TW
Inventors: Yasuiki Umezu
Original assignee: Yasuiki Umezu
Priority date: 2016-03-03
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2018-03-21
Also published as: WO2017149564A1; KR20180114209A; IL261398B; CA3049519A1; SG11201807509PA; NZ745735A; EP3406714A4; AU2016395556A1; IL261398A; AU2016395556B2; CN109073626A; JP6173577B1; RU2707083C1; TW201732291A; JPWO2017149564A1; US20190049456A1; EP3406714A1; BR112018017204A2

Abstract

本發明之課題在於提供一種CTC的檢測、分離取得方法，其係即使於血液或淋巴液之類的生物循環體液中微量存在之循環腫瘤細胞及循環腫瘤幹細胞無法特定該腫瘤細胞為何種癌之細胞之狀態、且即使於生物循環體液中微量存在之狀態下，仍能夠確實且穩定地檢測、分離取得該腫瘤細胞，該方法藉由包括以下之(1)～(4)之處理步驟的生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法而解決該課題：(1)對來自生物循環體液之試樣進行預處理而獲得單核細胞相之第1步驟；(2)準備於孔板中注入有包含循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞增殖用無血清培養基之培養液的孔板，接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之第2步驟；(3)自於第2步驟中進行培養而獲得之板孔中除去培養液之第3步驟；(4)於第3步驟之後，檢測、或分離取得附著於板孔之附著性腫瘤細胞的第4步驟。

Description

使用細胞增殖法之循環腫瘤細胞的檢測、分離取得方法

本發明係關於一種檢測、分離取得循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells；CTC)及循環腫瘤(癌)幹細胞(Circulating Tumor Stem Cells；CTSC)之方法，該循環腫瘤細胞(CTC)及循環腫瘤(癌)幹細胞(CTSC)係侵入至人類活體組織、即以末梢血液為代表之循環體液，或經由該體液自以骨髓、脾臟等為首之體內各種器官侵入至循環體液的腫瘤(癌)細胞，尤其關於一種即使於血液或淋巴液之類的生物循環體液中微量存在之循環腫瘤細胞及循環腫瘤幹細胞無法特定為何種癌之細胞之狀態、且於生物循環體液中微量存在之狀態下，亦能夠確實且穩定地檢測、分離取得該腫瘤細胞的循環腫瘤細胞(CTC)及循環腫瘤幹細胞(CTSC)的檢測、分離取得方法。(再者，於以下之說明中，除了需要區別說明循環腫瘤細胞(CTC)及循環腫瘤幹細胞(CTSC)之情形以外，記載為「循環腫瘤細胞(CTC)」，該「循環腫瘤細胞(CTC)」係以亦包括「循環腫瘤幹細胞(CTSC)」之含義而說明)

癌症在發達國家處於疾病死亡率之前列。尤其於日本，雖然於年齡調整罹患率、年齡調整死亡率等統計中發現減少傾向，但高齡化或糖尿病等慢性疾病對於癌產生、死亡之貢獻度較高，現狀為以每二人中有一人之概率罹患癌症，每三人中有一人因癌致死等，極令人擔憂(Estimated using the method by Wum LM et al., Estimating lifetime and age-conditional probabilities of developing cancer, Lifetime Data Anal., 1998, 4 : 169-186.)。另一方面，關於針對該等癌症之處置，業界集中精力於開發其治療技術，而於各種癌治療方法見到進展。作為癌治療之三大療法之手術療法、化學療法、放射線療法、及近年來受到關注之免疫療法等之進步相應地獲得驚人之成果。但是，目前尚無法充分地抑制手術後復發、所屬淋巴結轉移、遠距離轉移等，針對該等之對策已成燃眉之急。又，近年來發現了即便成功地切除癌組織，於手術後亦復發轉移之情形，作為該手術後復發轉移之要因，亦已知癌幹細胞之存在極重要(Breast Cancer Res Treat 2010, 124:403-412.；New Engl. J Med 2004, 351:781-791.；Clin Cancer Res 2008, 14:6302-6309.；J. Clin Oncol 2008, 26:3213-3221.)。而且，於其機制之中心，已知於體內循環之CTC係與該復發、轉移相關(Clin Cancer Res 2008, 14:7004-7010.；Proc (Bayl Univ Med Cent) 2008, 21:127-132.)。於人類活體組織、尤其是各種體內各器官所產生之癌細胞、組織(以下係指包括白血病在內之全部惡性腫瘤者)除了白血病以外，於原發病灶(產生癌之部位)中，增殖之癌細胞利用接著因子而結合，從而形成腫瘤組織。但是，該癌細胞並不滯留於原發病灶，會因接著因子之異常或消失而自原發病灶游離，分解癌細胞周圍之結合組織或血管、淋巴管壁，浸潤至血液中、或淋巴液中。該體液中所浸潤之癌細胞與在體內循環之血液、或淋巴液一同作為循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells；CTC)而在體內循環。該CTC因血液等之循環而被搬運至其他組織或器官，於其他組織或器官中，自血管等滲出，重新合成接著因子，進行固定而形成轉移病灶。認為該CTC之體內循環、轉移病灶之形成係癌轉移之機制，與癌之復發、轉移相關。關於癌之診斷或治療之確立，於引起癌向其他組織或器官之轉移之前，早期地獲得關於原發病灶所產生之癌之特定或病態之資訊係為了有效地進行癌之診斷或治療而極重要之要因，成為用以防止癌向其他組織或器官之轉移的有力資訊，關於為此之方法，CTC分析作為極重要之因素而受到關注。又，報告有CTC分析於癌之復發預測或癌治療效果之評價中亦重要，於預後之預測或治療效果之判定中亦成為有效之方法。然而，於血液中等循環之CTC由於其存在水準非常低，又，於血中循環之癌細胞之半衰期係1～24小時之較短時間，因此現狀為極其難以檢測出循環體液中所存在之CTC。例如，來自末梢血液之CTC之分離效率較差，關於CTC，於2012年世界共同研究19機構提供之報告(J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20.)中亦報告有自血中單核細胞中僅能分取1/10⁸ 、即自100 ml血液中僅能分取1個。若以60 kg體重之成人進行換算，則即使全量採血約5升(5000 ml)之全末梢血液，亦以50個之極低概率而僅分取極少數之CTC。該情況成為CTC研究之最大阻礙要因(J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20.)。近年來，實現了CTC的檢測、測定技術之進展，由於檢測、測定技術之進步而實現檢測感度或測定精度之提高，變得能夠特異性地檢測出於血液之10萬個至1億個單核細胞中僅存在數個癌細胞。而且，開始作為乳癌、大腸癌、攝護腺癌等轉移性癌之預後預測、或獲得治療效果判定之臨床資訊的檢查而得到承認。又，美國FDA (食品醫藥品局)承認其關於乳癌、大腸癌、攝護腺癌之CTC之臨床有用性，作為體外診斷試劑而得到認可。然而，現狀為CTC之檢測、測定技術於能夠特定作為對象之癌細胞之情形時等，不得不成為限定於特定CTC之檢測、測定技術，因此目前尚未發現可應用於廣泛之癌細胞的CTC之檢測、測定技術。作為現在廣泛利用之CTC之檢測方法，已知有免疫磁性分離檢測方法(Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 95:4589-4594, 1998；WO99/41613；日本專利特表2002-503814號公報)。該方法係使用固定化有對於上皮癌細胞之上皮細胞接著分子(Epithelial cell adhesion molecule；EpCAM、「CD326」)之單株抗體的磁珠，將試樣中之CTC之上皮細胞接著分子(EpCAM)作為靶向而與其結合，藉由磁性濃縮將該磁性標記化之CTC進行富集化，檢測出試樣中所微量含有之CTC的方法。亦揭示有應用該免疫磁性分離檢測方法的各種CTC之檢測方法。例如WO2007/133465(日本專利特表2009-537021號公報)中揭示有如下之方法及用於其之裝置，該方法係利用螢光發色團而標記源自體液之免疫磁性靶向CTC，藉由導入有光束均化器之時間延遲累積成像(Time-delayed integrating imaging，TDI)技術，對該標記化之細胞進行掃描而獲得二維分佈之CTC之圖像，藉此迅速且準確地檢測血液中之稀少之CTC。又，日本專利特開2007-178193號公報、日本專利特開2012-103077號公報中揭示有如下方法，即對於利用上皮細胞表面抗原(EpCAM)特異性抗體而固定化之磁珠上所捕捉之癌細胞，藉由對於與該表面抗原不同之上皮特異性表面抗原(細胞角蛋白)的螢光標記抗體進行螢光染色，對該螢光染色之細胞數進行計數，並且組合使用藉由螢光原位雜交法(fluorescent in situ hybridization，FISH)所進行之使用與致癌基因進行雜交之螢光標記DNA探針的細胞核染色，而同時進行螢光染色之細胞數之計數及螢光染色之細胞中之基因之檢測。又，日本專利特開2014-105159號公報中揭示有使用固定化有對於人源性上皮細胞接著分子(EpCAM)之單株抗體(第1抗體)的磁珠而進行CTC之濃縮，及使用特異性識別不同之表位之經螢光標記之抗EpCAM單株抗體(第2抗體)、與細胞核之染色法，於維持細胞之生存能力之狀態下進行CTC的檢測、定量分析之方法(intact CTC enumeration and analysis procedure；iCeap法)；日本專利特開2014-112094號公報中揭示有使用對上皮細胞具有特異性之標記即細胞角蛋白(CK)標記、及第2標記進行CTC之鑑定及賦予特徵之方法，該第2標記係如瑞氏-吉姆薩(Wright-Giemsa)染料般根據形態、尺寸或核與細胞質之比而鑑定CTC的細胞學染料。進而，日本專利特開2014-39480號公報中揭示有：為了進行EpCAM陰性CTC之檢測，而準備含有尿激酶(尿激酶型漿素原活化因子：uPA)特異性螢光受質之培養面，於該培養面上接種血液樣品並進行培養，藉此檢測源自尿激酶特異性受質之訊號，並分離、回收CTC。如上所述，關於CTC之檢測，先前起已揭示有使用CTC之細胞標記(細胞表面之特異性抗原)、或與該細胞抗原特異性結合之單株抗體等而檢測CTC的各種檢測方法，但該CTC之檢測、測定技術存在僅能應用於如乳癌、大腸癌、攝護腺癌等般對象之癌已特定之情形的制約。因此，對於未能特定對象之癌細胞之情形時之廣泛之癌，尚未發現有效地檢測、測定該癌之CTC之技術。另一方面，於CTC之檢測、測定方法中亦揭示有不使用CTC之細胞標記(細胞表面之特異性抗原)、或與該細胞抗原特異性地結合之單株抗體等而檢測CTC之方法。例如日本專利特開2011-163830號公報中記載有如下之CTC之檢測、測定方法，其係利用微流體裝置而於一個裝置內連貫地進行來自血液之CTC之濃縮、與CTC之染色及洗淨之製程，並使用自動化螢光顯微鏡等而迅速地對CTC進行計數，該微流體裝置能夠利用CTC捕捉用之具有孔徑、孔數、配置經控制之微細貫通孔之尺寸選擇微空腔陣列而捕捉血液試樣中所含之CTC。又，日本專利特開2013-36818號公報中揭示有如下之方法，其係藉由使包含腫瘤細胞之體液接觸包含利用密度為2.0×10⁴ ～1.9×10⁵ 、纖維直徑為1 μm～15 μm之聚酯纖維、聚丙烯纖維等所成形之不織布的血球分離材料，而捕捉腫瘤細胞與白血球及血小板，並使用包含生理鹽水、緩衝液、聚葡萄糖等之分離液而分離、回收該捕捉之體液中之腫瘤細胞豐富之組分。進而，日本專利特開2014-224800號公報中揭示有如下之CTC等之分離方法，其包含形成間隙之本體與罩部，該間隙形成將間隙之注入口區域及排出口區域加以分離之分離元件，該分離元件係與間隙之表面一同劃分形成通道，針對通過該通道之粒子，藉由使更小之粒子通過與阻止更大粒子通過，而將作為更大粒子之CTC與作為更小粒子之血液球加以分離。該等CTC之分離、檢測方法係對體液中所存在之CTC進行物理性分離、檢測，並非使用CTC之細胞標記(細胞表面之特異性抗原)、或與該細胞抗原特異性結合之單株抗體等者，因此即使對於無法特定作為對象之癌細胞的癌，亦能夠應用於該癌之CTC之分離、檢測，但存在如下問題：難以藉由如上所述之方法而確實地分離、檢測體液中以微量水準存在之CTC。包括CTC在內之癌細胞之獲得成為基於癌研究、尤其是癌之基因分析的診斷或預後判定、有效之癌化學療法之選擇等不可或缺之因素。又，於癌免疫療法中，癌細胞之獲得係於疫苗開發、個體化醫療中進而成為定製疫苗開發之要點的技術。進而，於個體化醫療之免疫細胞移入療法中，於作為針對患者本人之癌的特異性細胞損傷反應之中堅的殺手細胞之誘導中亦作為刺激物質而不可或缺，或者作為測定經誘導之殺手細胞之細胞損傷性時之自體癌靶細胞而不可或缺。又，近年來，作為於手術後復發轉移之要因而關注其存在之癌幹細胞之獲得成為提供對於現在成為燃眉之急之癌幹細胞研究與其控制技術之開發而言具有劃時代意義之方法者。迄今為止，於醫療現場，癌細胞之取得僅有活檢、或自手術材料獲得之對於活體而言侵入性強之操作及伴隨於此之轉移促進、接種等伴隨有一定危險性之方法。因此，開發出避免該等風險、例如自末梢血液等安全、簡便、且短時間地分離取得CTC之方法對於癌之基礎研究及臨床研究具有極大貢獻，具有CTC分離取得之重要意義。由於揭示有癌之轉移主要血源性地產生而並非淋巴源性地產生(Cancer Res. 11, 648-651,1951；CANCER JULY-AUGUST, Vol.13: 674-676, 1960)，故而儘管經過了50多年，至今為止仍未開發出自末梢血液穩定地採取癌細胞之方法。作為針對特定對象之方法，已知有如上所述藉由抗體檢測、擴增末梢血液中所存在之源自癌細胞之極其微量之細胞片段，並研究有無癌之存在的方法。但是，該方法係僅能夠應用於已經特定了成為抗體之結合目標之物質的癌細胞之方法。因此，關於游離物質未知之癌細胞，無法應用該方法。又，與此同樣地，亦可認為其係藉由PCR而對源自癌細胞之基因片段進行擴增，並研究有無癌之方法。即，具有如下缺點：僅藉由對已經判明之基因部分進行擴增而判定有無癌細胞，無法應用於使用未知之基因而癌化之細胞。另一方面，作為克服該缺點之方法，癌細胞之取得可考慮採用活檢或自手術材料獲得之伴隨著活體侵入之方法，但該癌細胞之取得可採用自原發病灶活檢或手術採取，即使容許採用，仍有自轉移病灶採取會導致癌細胞之進一步接種之虞，於倫理上亦不被容許。又，無法應對尚未特定癌之初期癌。於如上所述醫療現場對癌細胞之檢測、分離取得之需求下，利用CTC之檢測、分離取得所進行之癌細胞之檢測、分離取得具有極重要之意義，但現狀為尚未開發出即使於未能特定出於血液或淋巴液之類的生物循環體液中微量存在之CTC或CTSC為何種癌之細胞之狀態下，亦能夠確實且穩定地檢測、分離取得該腫瘤細胞之方法。因此，即使對於尚未特定出癌之癌細胞，亦安全、簡便、確實且穩定地自血液或淋巴液之類的生物循環體液、例如末梢血液之血液中檢測、分離取得微量存在之CTC或CTSC的方法之開發於癌之基礎、臨床應用中成為極重要之課題。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]日本專利特開2007-178193號公報。 [專利文獻2]日本專利特開2011-163830號公報。 [專利文獻3]日本專利特開2012-103077號公報。 [專利文獻4]日本專利特開2013-36818號公報。 [專利文獻5]日本專利特開2014-39480號公報。 [專利文獻6]日本專利特開2014-105159號公報。 [專利文獻7]日本專利特開2014-112094號公報。 [專利文獻8]日本專利特開2014-224800號公報。 [專利文獻9]特表2002-503814號公報。 [專利文獻10]特表2009-537021號公報。 [專利文獻11]WO99/41613。 [專利文獻12]WO2007/133465。 [非專利文獻] [非專利文獻1]Estimated using the method by Wum LM et al., Estimating lifetime and age-conditional probabilities of developing cancer, Lifetime Data Anal., 1998, 4 : 169-186. [非專利文獻2]Breast Cancer Res Treat 2010, 124:403-412. [非專利文獻3]New Engl. J Med 2004, 351:781-791. [非專利文獻4]Clin Cancer Res 2008, 14：6302-6309 . [非專利文獻5]J. Clin Oncol 2008, 26:3213-3221. [非專利文獻6]Clin Cancer Res 2008, 14:7004-7010. [非專利文獻7]Proc (Bayl Univ Med Cent) 2008, 21:127-132. [非專利文獻8]J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20. [非專利文獻9]Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 95:4589-4594, 1998. [非專利文獻10]Cancer Res. 11, 648-651, 1951. [非專利文獻11]CANCER JULY-AUGUST, Vol.13: 674-676, 1960.

[發明所欲解決之問題] 本發明之課題在於開發出即使於血液或淋巴液之類的生物循環體液中微量存在之CTC(循環腫瘤細胞)及CTSC(循環腫瘤幹細胞)無法特定為何種癌之細胞之狀態下、且於生物循環體液中微量存在之狀態下，亦能夠確實且穩定地檢測、分離取得該腫瘤細胞之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法。 [解決問題之技術手段] 本發明者為了解決上述課題，在針對即使於血液或淋巴液之類的生物循環體液中微量存在之CTC及CTSC無法特定為何種癌之細胞之狀態下、且於生物循環體液中微量存在之狀態下，亦能夠確實且穩定地檢測、分離取得該腫瘤細胞之CTC及CTSC的檢測、分離取得方法而進行之努力研究中，發現藉由在CTC及/或CTSC之檢測、分離取得方法中，於其檢測、分離取得之步驟中設置使用包含CTC及/或CTSC(循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞)增殖用無血清培養基之培養液的CTC及/或CTSC之增殖步驟，可擴增試樣中微量存在之CTC及/或CTSC，而可確實且穩定地檢測、分離取得CTC及/或CTSC，從而完成本發明。即，本發明包含使用細胞增殖法之生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法，該方法包括以下之(1)～(4)之處理步驟： (1)對來自生物循環體液之試樣進行預處理而獲得單核細胞相之第1步驟； (2)準備於孔板中注入有包含CTC及/或CTSC增殖用無血清培養基之培養液的孔板，接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之第2步驟； (3)自於第2步驟中進行培養而獲得之板孔中除去培養液之第3步驟； (4)於第3步驟之後，檢測、或分離取得附著於板孔之附著性腫瘤細胞的第4步驟。藉由本發明之使用細胞增殖法之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法，可擴增循環體液等試樣中微量存在之CTC及/或CTSC，從而可確實且穩定地檢測、分離取得CTC及/或CTSC。於本發明之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，可將生物循環體液作為試樣而進行，作為來自該生物循環體液之試樣，可列舉來自末梢血液之血液試樣作為可最簡單地操作並且有效之試樣。於本發明之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，作為第一步驟之獲得來自生物循環體液之單核細胞相之步驟，可列舉對來自生物循環體液之試樣進行預處理，而用以除去生物循環體液中所含之液體成分及血球等非細胞成分的處理。於本發明之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之第2步驟包括準備於孔板中注入有包含CTC及/或CTSC增殖用無血清培養基之培養液的孔板，接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養。作為該包含CTC及/或CTSC增殖用無血清培養基之培養液，可列舉以作為細胞增殖用無血清培養基之AIM-V培養液為基礎的培養液。藉由使用該培養液，於使用細胞增殖法的生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中之培養步驟中，可進行CTC及/或CTSC之短時間增殖，使試樣中微量存在之CTC及/或CTSC增殖、擴增，從而可確實且穩定地檢測、分離取得CTC及/或CTSC。作為該以AIM-V培養液為基礎之培養液，可使用AIM-V培養液、或於AIM-V培養液中添加有選自受驗者之自體血清、源自健康人之AB血清及棕櫚酸(Palmitic Acid)或其鹽中之1種或2種以上之培養液。至於第2步驟中之培養條件，關於其增殖溫度及增殖期間，可決定適宜、合適之條件，但最適合的是可將37℃、3～7天作為增殖溫度及增殖期間之基準條件而進行。又，作為第2步驟中之培養條件，可於調整為5%CO₂ 之培養箱內之條件下進行。即，於本發明之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中所使用之包含CTC及/或CTSC增殖用無血清培養基之培養液可使用以AIM-V培養液為基礎之培養液，作為該以AIM-V培養液為基礎之培養液，可使用AIM-V培養液本身作為基礎培養基。又，藉由使用於該AIM-V培養液中添加有選自受驗者之自體血清、源自健康人之AB血清及棕櫚酸(Palmitic Acid)或其鹽中之1種或2種以上之培養液，可提高CTC之誘導效果，可獲得效率更良好、穩定之CTC及/或CTSC的檢測、分離效果。尤其可列舉棕櫚酸(Palmitic Acid)或其鹽作為能夠安全且穩定地進行CTC及/或CTSC的檢測、分離之添加成分。於本發明之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，自於第2步驟中進行培養而獲得之板孔中除去培養液之第3步驟包含藉由適宜之方法，自於孔板中培養特定時間而獲得之培養物除去培養液之處理。又，於本發明之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，於第3步驟之後檢測、或分離取得附著於板孔之附著性腫瘤細胞之第4步驟包括使用以顯微鏡檢查、染料染色、抗原-抗體染色等檢測方法而直接檢測附著於板孔之附著性腫瘤細胞，或者分離附著於板孔之附著性腫瘤細胞，而以各種檢測用癌細胞之形式取得。對本發明之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法之構建過程加以說明，為了確實且穩定地檢測、分離取得於生物循環體液中微量存在之CTC及/或CTSC，變得需要使試樣中微量存在之CTC及/或CTSC於短時間內有效地增殖、擴增。而且，為了構建該使用細胞增殖法之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法，探索能夠進行CTC及CTSC之增殖的CTC及/或CTSC增殖用無血清培養基成為課題。因此，本發明者於為了解決本發明之課題而進行之努力研究中，關於CTC之分離、取得，以作為末梢血液單核細胞之標準培養液的RPMI-1640培養液(RPMI-1640)為基準而與無血清培養基AIM-V培養液(AIM-V)進行了比較。即，於該等培養液中分別添加5%之胎牛血清(FBS)或末梢血液提供者之自體血清(Autologous Serum；AS)並進行培養，研究該等各培養液間之CTC分離、取得之有無及效果。其結果為，證實了於CTC及/或CTSC之分離、取得中，AIM-V有用，又，添加AS會增強其效果。進而，基於上述培養液之結果，為了避免因自體血清採取引起之患者負擔之增加，又，為了排除每個受驗者症狀的血清成分變動之影響，而研究包括棕櫚酸(Palmitic Acid)在內之各種候補LPS、Con A、PHA、IL-1α、IL-1β作為新的CTC之分離取得因子，實施最安全且效率良好之因子之探索。於該研究過程中，於LPS中亦觀察到了CTC之誘導效果，但LPS係具有極強毒性之物質，因此若鑒於CTC分離後之各種研究、臨床應用之技術開發之目的，則判斷為作為試劑而言於安全上不妥，於以後之實驗中將其排除。其結果為，關於CTC取得而言，證實於其供給或性質(不會另外感染之病毒載體等)方面而言，作為即使排除作為不穩定因素之自體血清，亦可安全且穩定地使CTC分散之新穎因子，棕櫚酸(Palmitic Acid)極其有用。據此證實，對於CTC之穩定之分取，AIM-V培養液、或於AIM-V培養液中添加有選自受驗者之自體血清、源自健康人之AB血清及棕櫚酸(Palmitic Acid)或其鹽中之1種或2種以上的培養液有用，其中尤其是添加有棕櫚酸(Palmitic Acid)或其鹽之培養液有用，從而完成本發明。即，具體而言本發明包括如下之技術方案。 [1]一種生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其包括以下之(1)～(4)之處理步驟： (1)對來自生物循環體液之試樣進行預處理而獲得單核細胞相之第1步驟； (2)準備於孔板中注入有包含循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞增殖用無血清培養基之培養液的孔板，接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之第2步驟； (3)自於第2步驟中進行培養而獲得之板孔中除去培養液之第3步驟； (4)於第3步驟之後，檢測、或分離取得附著於板孔之附著性腫瘤細胞的第4步驟。 [2]如上述[1]所記載之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中於第2步驟中，用以接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之包含循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞增殖用無血清培養基之培養液係以AIM-V培養液為基礎之培養液。 [3]如上述[1]或[2]所記載之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中於第2步驟中，用以接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之以AIM-V培養液為基礎之培養液係AIM-V培養液、或於AIM-V培養液中添加有選自受驗者之自體血清、源自健康人之AB血清及棕櫚酸或其鹽中之1種或2種以上之培養液。 [4]如上述[1]至[3]中任一項所記載之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中來自生物循環體液之試樣係來自末梢血液之血液試樣。 [5]如上述[1]至[3]中任一項所記載之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中第1步驟之來自生物循環體液之試樣之預處理係除去生物循環體液中所含之液體成分及非細胞成分。 [6]如上述[1]至[5]中任一項所記載之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中第2步驟中之培養係將37℃、3～7天作為增殖溫度及增殖期間之基準條件而進行。 [7]如上述[6]所記載之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中第2步驟中之培養係於調整為5%CO₂ 之培養箱內進行。 [發明之效果] 本發明提供即使於血液或淋巴液之類的生物循環體液中微量存在之循環腫瘤細胞及循環腫瘤幹細胞無法特定為何種癌細胞之狀態、且於生物循環體液中微量存在之狀態下，亦能夠確實且穩定地檢測、分離取得該腫瘤細胞之CTC的檢測、分離取得方法。本發明之CTC的檢測、分離取得法不僅可進行CTC的檢測、分離，亦可進行CTSC的檢測、分離，提供於癌之基礎闡明、或臨床應對方面有力之方法。即，藉由本發明，變得可進行CTC之有效率且穩定的分取，對癌之研究提供劃時代進展之可能性。迄今為止，無法自末梢血液等中有效率且穩定地檢測、分離、分取癌細胞、尤其是CTSC係CTC研究延遲之主要原因。鑒於此情況，藉由本發明之技術，變得可達成飛躍性地促進CTC研究之基礎。藉由本發明，可持續進行CTC之基礎闡明、臨床研究，從而可期待促進CTC之控制技術開發。若推進使用本發明之基礎研究，則變得能夠以作為實態之基因等之物質水準而遺傳學地研究CTC之細胞學的多種態樣。藉此，於與其增殖控制相關之新穎藥劑開發中，或免疫學地於CTC之殺細胞性抗體等新穎藥劑開發中開啟展望。又，於臨床上亦變得可進行與癌患者之階段分類之比較、與組織學的分類之比較，進而變得可尋求與所獲得之各種指標之相關性。進而，亦能夠弄清與治療效果之相關性等，因此關於前所未有之診斷、治療、預後之評價判定，亦可期待確立穩固之科學基礎。因此，本發明會於癌之基礎闡明、臨床應用等之研究開發中做出極大貢獻。

本發明包含使用增殖法之生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法，其包括以下之(1)～(4)之處理步驟： (1)對來自生物循環體液之試樣進行預處理而獲得單核細胞相之第1步驟； (2)準備於孔板中注入有包含CTC及/或CTSC增殖用無血清培養基之培養液的孔板，接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之第2步驟； (3)自於第2步驟中進行培養而獲得之板孔中除去培養液之第3步驟； (4)於第3步驟之後，檢測、或分離取得附著於板孔之附著性腫瘤細胞的第4步驟。於本發明之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，可將生物循環體液作為試樣而進行，作為來自該生物循環體液之試樣，可列舉來自末梢血液之血液試樣作為可最簡單地操作並且有效之試樣。關於為了檢測、分離取得CTC及/或CTSC而自生物循環體液中採取試樣，關於生物體，體內並不存在獨立於血液、體液之循環的器官，因此即使無法肉眼地預測癌之存在，亦可分取來自所有器官之CTC及/或CTSC。例如，於裸鼠之背部皮下或皮內移植人源性CTC，3個月後摘取脾臟，實施自末梢血液之分離操作，藉此成功地分離出人源性CTC。於本發明之生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，第1步驟包括對來自生物循環體液之試樣進行預處理而獲得單核細胞相之步驟。該步驟可列舉對來自生物循環體液之試樣進行預處理，而用以將生物循環體液中所含之液體成分及血球等非細胞成分除去之處理。該用以將生物循環體液中所含之液體成分及血球等非細胞成分除去之處理並無特別限定，可使用公知之方法。例如可列舉：於血液試樣中，藉由離心分離將血液中之紅血球、白血球分離除去之方法(離心分離法)；利用細胞之密度，將血液中之紅血球、白血球分離除去之方法(密度梯度離心法)；使用細胞之尺寸差異的血球之分離方法(使用過濾器之分離法)等，作為尤佳之方法，可列舉密度梯度離心法。於該情形時，具體可列舉Ficoll-Isopaque密度梯度離心分離法之處理條件。於本發明之生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，作為第2步驟中之培養所使用之包含CTC及/或CTSC增殖用無血清培養基之培養液，可使用以AIM-V培養液為基礎之培養液。AIM-V培養液係作為T細胞等之增殖用培養基而開發者，但該培養液本身亦可購買市售品。若對本發明之生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中之第2步驟加以說明，則第2步驟包括準備於孔板中注入有以作為細胞增殖用無血清培養基之AIM-V培養液為基礎之培養液的孔板，接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養的步驟。作為該以AIM-V培養液為基礎之培養液，可使用AIM-V培養液、或於AIM-V培養液中添加有選自受驗者之自體血清、源自健康人之AB血清及棕櫚酸或其鹽中之1種或2種以上之培養液。第2步驟中之培養之條件可根據狀況而適宜設定，較佳為於培養中，可於5%CO₂ 之條件下，且於37℃、3～7天之條件下進行。尤佳為可於5%CO₂ 、37℃、7天之培養中條件、培養溫度、及培養時間之條件下進行。於本發明之生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，第3步驟包括自於第2步驟中進行培養而獲得之板孔中除去培養液之步驟。自板孔除去培養液可藉由適宜之方法進行。於本發明之生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，第4步驟包括於第3步驟之後，檢測、或分離取得附著於板孔之附著性腫瘤細胞之步驟。於該第4步驟中，附著於板孔之附著性腫瘤細胞可使用顯微鏡檢查、染料染色、抗原、抗體染色等檢測方法而直接供於檢測機構。又，可將附著於板孔之附著性腫瘤細胞分離，作為各種檢測用癌細胞而取得。於本發明之生物循環體液中之CTC及/或CTSC的檢測、分離取得方法中，分離取得之癌細胞可提供為用於癌之診斷、治療、預後之評價判定等癌之闡明、臨床應用等之研究用癌細胞試樣。於本發明中分離、取得之細胞為癌細胞之證明可自以下之基準選擇複數個適當者並進行確認。例如，可選定(1)～(5)、(7)、(9)。 (確認基準) (1)未見接觸抑制現象。 (2)顯示出軟瓊脂內群落形成能力(該方法係應用於浮游性細胞之方法) (3)於顯微鏡下可見與細胞之體積相比異常之染色體之形態與容積。 (4)顯示出繼代培養下之分裂次數為對於人類正常細胞而言成為極限之Hayflick極限之約50次以上之分裂能力，即假設一星期分裂2～3次，於約半年以上之期間進行繼代培養，顯示出永久增殖能力、不死化。 (於遺傳學、血清學上) (5)具有單獨或複數個作為已經判明之癌幹細胞CTSC之細胞表面標記的CD44、CD45、CD47、CKII、EpCAM等抗原。 (6)於該細胞之培養液中，於頭頸部、食道扁平上皮癌中為SCC，於肺癌中為CA125，於乳癌中為CA15-3，於肺癌中為AFP、CEA，於胰腺癌中為CEA、CA19-9，於大腸癌中為CA19-9等通常被視為腫瘤標記之24種標記中之至少一種以上與對照群相比顯示出陽性反應。 (7)自該細胞精製TotalRNA，實施基因分析，優先地見到癌相關基因及癌幹細胞基因之表現。 (為了觀察取得細胞之致腫瘤性) (8)對分離、取得之癌細胞之DNA進行精製，若導入至NIH3T3細胞中，則觀察到NIH3T3細胞之接觸抑制現象消失，形態學地表現癌細胞形質。 (9)於對免疫缺陷裸鼠或SCID鼠移植該細胞時，移植細胞顯示出致腫瘤性。若進而對增殖之組織進行再培養，則該組織細胞增殖。關於如上所述藉由本發明之方法自例如作為人類活體組織之代表的可最簡便地操作之末梢血液中有效地分離、檢測的CTC，可將其分離、檢測結果用作癌療法之實施前後之效果之比較評價指標，又，有助於預後之評價。又，藉由本發明之方法，變得可進行CTC之高效率之分離取得，因此可促進新穎之治療技術等之開發，例如針對該癌有效之藥劑等之開發。即，藉由本發明，針對任何癌、或不特定之癌，亦變得可進行CTC之高效率之分離取得，藉此不僅可進行癌之早期發現、或預後之分析評價，亦可基於穩定地獲得之CTC之數量上、形態上的推移而確立治療前後之評價指標，從而促進控制CTC之藥劑之開發或治療方法之開發。進而，可用作用以確立基礎、臨床的CTC研究之穩定基礎的材料。以下，列舉實施例更具體地說明本發明，但本發明並不限定於該等實施例。 [實施例1] [實驗方法]：於本發明之實施例中，依照以下之實驗方法。即，藉由以下順序對實驗試樣(來自提供血液之各種癌患者之末梢血液)均進行無菌化處理。再者，預先根據來自各合作機構之資訊而有HBV、HCV等各種病毒之感染之情形時，該處理係與非感染群分開試驗，由醫療廢棄物處理專門從業者實施妥當之醫療廢棄物處理。 (試樣之採取：採血) 1.準備放入有適量之抗凝固劑肝素鈉(0.05 ml)之拋棄式30 ml採血用注射器，又，準備未放入肝素鈉之血清獲得用之拋棄式30 ml採血注射器。將其結合於L型180°三通閥之各插入口，將18、21、24號數之翼狀針之適當者結合於血管側，準備採血。分別採血30 ml血液，並實施以下之分離操作。 (試樣之精製：血球分離) 2.血清採取係於採血注射筒上安裝針後，於37℃、5%CO₂ 之培養箱內進行1小時之靜置處理，其後於4℃下實施3,000轉(800 G)、30分鐘之離心分離。將上清液作為自體血清(AS)，於4℃之冷處進行保存。 3.另一方面，以末梢血液單核細胞(PBMCs)分離為目標之肝素採血管係於採血後使採血管充分旋轉，而充分地混合。其後，放入等量之(-)PBS並進行混合，使血液黏度降低後，於預先準備之注入有5 ml Ficoll-Isopaque (F/I)密度梯度離心分離劑之15 ml管中，以不混合於F/I中之方式，將各5 ml緩慢地注入至F/I上表面並靜置。將其於4℃、3,000轉(1710 G)下進行30分鐘之離心分離，於F/I與血漿之邊界獲得單核細胞層。自該處抽吸採取PBMCs，加入(-)PBS後，實施4℃、1200轉(270 G)、15分鐘之離心分離。反覆進行該操作兩次，除去上清液後，加入適合於預定之實驗條件的培養液(RPMI-1640、AIM-V)，於以下之實驗中使用。 (培養液中培養) 4.調整所獲得之PBMCs以使其成為I×10⁴ /100 μl，於96孔盤(BD Falcon公司製造、96孔、潔淨、經組織培養處理之培養盤、平底)、或384孔盤(BD Falcon公司製造、384孔、潔淨、經組織培養處理之培養盤、平底)之各孔中，基於實驗計劃，將實驗條件設為1群3孔，分別以1×10⁴ /100 μl(/well/96孔板或1×10⁴ /25 μl/well/384孔板)進行注入，結束細胞之接種。於單獨使用培養液之情形時，於該孔中進而注入100 μl該培養液，關於5% AS之群、或使用各種添加藥劑(LPS、IL-1α、IL-1β、棕櫚酸(Palmitic Acid))之群，依計劃進行濃度之分配，分別準備100 μl之溶液並注入。將總培養液量設為200 μl/孔，於37℃、5%CO₂ 條件下之培養箱中靜置培養特定時間而開始實驗。 (培養液之除去：附著性細胞之檢測) 5.於培養開始1星期後，自各孔抽吸除去培養液，向其中分別注入100 μl之(-)PBS，將孔內充分洗淨後廢棄，反覆進行該操作兩次。其後，再次注入100 μl之(-)PBS，對於各孔中之附著性細胞，利用顯微鏡根據其形態學特徵(大小、形狀、細胞內顆粒之存在樣式等)而分辨出正常PBMCs，並算出細胞數。算出1群3孔之細胞數後，算出其平均值與標準誤差(Average±SE)。[該等實驗歷時約2年，對同一患者等實施複數次，儘管病期(Stage I～IV)或症狀(惡化、改善傾向)變化，但只要癌存在，於該等資料中雖然可見取得CTCs數減少，但始終確認作為整體而言，針對藥劑之反應具有再現性，顯示出同一傾向，仍可採用作正式資料(參照各種資料)；當然，對於視為癌已治癒之階段之患者，判明藉由該處理所進行之附著性癌細胞之檢測亦成為1個以下；又，自認為是健康人體內未檢測到該附著性細胞] (藉由螢光染色所進行之CTSC之檢測) 6.利用被視為CTC(CTSC)之表面抗源的CD44、CD45、CD47、CKII、EpCAM等特異性抗體而結合預先藉由該處理所獲得之附著細胞，其後利用FITC結合二次抗體進行染色，並利用螢光顯微鏡進行觀察。其結果為，證實藉由該處理而取得之附著性細胞係CTC(CTSC)(參照染色圖像)。 (使用藥劑之誘導效果之研究) 7.設定各種培養條件，對使用藥劑之CTC(CTSC)誘導效果進行研究。將所使用之各種藥劑濃度等記載於結果之表(Table)中。 (1)「培養液、添加藥劑之研究I」：針對培養液，關於CTC之分離取得，以作為末梢血液單核細胞之標準培養液的RPMI-1640培養液(以下記載為RPMI-1640)為基準，與無血清培養基AIM-V培養液(以下記載為AIM-V)加以比較。即，於該等培養液中分別添加5%之胎牛血清(FBS)或末梢血液提供者之自體血清(Autologous Serum；AS)或AB型血清並進行培養，研究該等各培養液間之CTC分離、取得之有無及效果。其結果為，證實於CTC之分取中，AIM-V有用，又，添加AS會增強其效果，AB型血清之效果較AS血清有若干減弱等。 (2)「培養液、添加藥劑之研究II」：進而，以上述培養液之結果為基礎，為了避免因自體血清採取引起之患者負擔之增加，另外排除受驗者之每個症狀之血清成分變動之影響，除去AB型血清所具有之本質上之不穩定性、例如不確定是否真的是帶癌患者血清等，研究包含棕櫚酸(Palmitic Acid)之各種添加成分(LPS、ConA、PHA、IL-1α、IL-1β)之候補作為新的CTC分離取得因子，實施最安全且效率良好之因子之探索。於該研究過程中，於LPS中亦觀察到若干CTC誘導效果，但由於LPS係具有極強毒性之物質，因此鑒於CTC分離後之各種研究、臨床應用之技術開發之目的，可判定作為試劑而言於安全上並不妥當，於以後之實驗中排除。其結果為，確認於CTC之穩定之分取中，AIM-V培養液與棕櫚酸(Palmitic Acid)之添加獲得最良好之結果。 (供於試驗之試樣) 8.於本發明之實驗中，供於試驗之試樣係使用醫院提供之由舌癌、下顎惡性腫瘤、惡性淋巴瘤、乳癌、肺癌、胃癌、攝護腺癌、子宮肉瘤等之末期癌患者提供之試樣作為供於試驗之試樣。 [實施例2] [對於癌細胞(CTC)取得而言有效率之培養液之選定試驗(I)] ＜供於試驗之培養液＞作為供於試驗之培養液，準備以下之培養液並使用。 (1)RPMI-1640＋5%FBS (2)RPMI-1640＋5%自體血清(Auto Serum) (3)AIM-V(無血清培養基單獨) (4)AIM-V＋5%FBS (5)AIM-V＋5%自體血清(Auto Serum) ＜實驗方法＞使用上述培養液，依照實施例1中所記載之實驗方法，對各培養液中之癌細胞(CTC)取得效率(癌細胞檢測精度)進行試驗。 (試驗1：使用RPMI-1640之CTC誘導能力之研究) 使用RPMI-1640作為培養液，將其作為共用之培養液，將該培養液分為胎牛血清(FBS)添加群與自體血清(Auto Serum)添加群，針對自6名癌患者採取之試樣研究其有無CTC誘導能力。＜結果＞將結果示於表1。如表中所示，於RPMI-1640培養液中，於自體血清添加群與FBS添加群之間之癌細胞取得效率上未見顯著差異，取得效率均較低。 [表1] (試驗2：使用RPMI-1640及棕櫚酸(Plmitic Acid)之CTC誘導能力之研究) 使用於RPMI-1640中添加有棕櫚酸(Plmitic Acid)者作為培養液，將其作為共用之培養液，將該培養液分為胎牛血清(FBS)添加群與自體血清(Auto Serum)添加群，針對自6名癌患者採取之試樣研究其有無CTC誘導能力。＜結果＞將結果示於表2。如表中所示，關於向RPMI-1640培養液中添加有棕櫚酸(Plmitic Acid)者，於自體血清添加群與FBS添加群之間，除了(＊)以外，於癌細胞取得效率上未見顯著差異，兩者之取得效率均較低。 [表2] (試驗3：使用RPMI-1640及AIM-V之CTC誘導能力之研究) 將RPMI-1640培養液與AIM-V培養液之間之CTC誘導能力之有無進行比較研究。關於RPMI-1640，分為胎牛血清(FBS)添加群與自體血清(Auto Serum)添加群之2群，針對自6名癌患者採取之試樣研究其有無CTC誘導能力。＜結果＞將結果示於表3。如表中所示，AIM-V培養液係無血清之單純培養液，與添加有胎牛血清(FBS)或自體血清(Auto Serum)之RPMI-1640培養液之任一培養液相比，顯示出較高之癌細胞取得效率。 [表3] (試驗4：於AIM-V培養液中添加有FBS之培養液之CTC誘導能力之研究) 研究於AIM-V培養液中添加有胎牛血清(FBS)之條件下有無CTC誘導能力。＜結果＞將結果示於表4。如表中所示，於AIM-V培養液中添加有胎牛血清(FBS)之群中，顯示出較高之癌細胞取得效率，但於患者源之間，於癌細胞取得效率上見到較大差異。 [表4] (試驗5：於AIM-V中添加有FBS之培養液中添加有棕櫚酸(Plmitic Acid)之培養液之CTC誘導能力之研究) 將於AIM-V培養液中添加有胎牛血清(FBS)之培養液作為共用之培養液，於該培養液中製成棕櫚酸(Plmitic Acid)添加群，於與棕櫚酸(Plmitic Acid)未添加群之間，對CTC誘導能力進行比較研究。＜結果＞將結果示於表5。如表中所示，於棕櫚酸(Plmitic Acid)未添加群中，與試驗4之情形同樣地於患者間見到CTC取得效率之差異，於棕櫚酸(Plmitic Acid)未添加群中，對於CTC取得效率較差之患者源，亦見到因添加棕櫚酸(Plmitic Acid)(群)而改善、增強CTC取得效率。 [表5] (試驗6. AIM-V培養液單獨、與於AIM-V中添加有自體血清(Auto Serum)之培養液之CTC誘導能力之研究) 準備AIM-V培養液單獨之群、與於AIM-V中添加有患者之自體血清(Auto Serum)之群，進行兩種培養液間之CTC誘導能力之比較研究。＜結果＞將結果示於表6。如表中所示，於AIM-V中添加有患者之自體血清(Auto Serum)之群中，除了(＊)之情形以外，大部分患者源之CTC取得效率提高。於任一情形時均見到較高之CTC取得效率。 [表6] (試驗7. 於AIM-V中添加有自體血清(Auto Serum)之培養液中添加棕櫚酸(Plmitic Acid)而成之培養液之CTC誘導能力之研究) 將於AIM-V培養液中添加有患者自體血清(Auto Serum)之培養液作為共用培養液，於該培養液中製成棕櫚酸(Plmitic Acid)添加群，於與棕櫚酸(Plmitic Acid)未添加群之間，對CTC誘導能力進行比較研究。＜結果＞將結果示於表7。如表中所示，於AIM-V培養液中添加有患者自體血清(Auto Serum)之培養液之群中，於添加有棕櫚酸(Plmitic Acid)之群與並未添加棕櫚酸(Plmitic Acid)之未添加群之間，於CTC取得效率上顯示出對照性之兩個傾向。即，對於未添加棕櫚酸而CTC取得效率較高之患者源，若添加棕櫚酸(Plmitic Acid)則顯示出降低之傾向。另一方面，對於未添加棕櫚酸而CTC取得效率較低之患者源，若添加棕櫚酸(Plmitic Acid)則見到CTC取得效率上升。 [表7] (利用螢光顯微鏡之觀察) 將利用螢光顯微鏡觀察上述試驗1及試驗2中所研究之使用AIM-V培養液及RPMI-1640培養液之CTC取得試驗中所獲得者之結果(照片)示於圖1。圖(1-a)係表示使用AIM-V培養液之CTC取得之結果，圖(1-b)係表示使用RPMI-1640培養液之情形時之CTC取得之結果。於使用AIM-V培養液之情形時，見到大量CTC細胞，顯示出CTC誘導能力，但於使用RPMI-1640培養液之情形時，未見CTC細胞。 (綜合評價) 根據以上之試驗結果而獲得以下之結論。 (i)於RPMI-1640單獨、及添加有RPMI-1640＋5%自體血清 (自體血清)之兩個群中，未能以所接種之源自末梢血液之單核細胞(PBMC)數(I×10⁴ /Well)之0.1%以上之單位進行CTC之誘導、分離、取得。 (ii)於AIM-V單獨之群中，能夠以所接種之源自末梢血液之單核細胞(PBMC)之0.1～0.2%之範圍進行CTC之誘導、分離、取得。 (iii)於添加有AIM-V＋5%自體血清 (自體血清)之群中，CTC取得率增加至2.2～2.7%，即AIM-V單獨之情形時之14倍至20倍。 (iv)若於AIM-V中以50%之比例加入RPMI-1640，則CTC取得率降低至與添加有RPMI-1640＋5%自體血清(自體血清)之群相同之%。 (v)上述(iv)之傾向於添加25%之RPMI-1640、添加12.5%之RPMI-1640時亦相同，未觀察到CTC之取得效果上升。根據該試驗結果確認：作為CTC之誘導、分離、取得中所使用之培養液，AIM-V有用，藉由向該培養液中添加自體血清 (AS)，可提高CTC取得效果。 [實施例3] [對於癌細胞(CTC)取得而言有效率之培養液之選定試驗(II)-添加物之影響] ＜供於試驗之培養液＞作為供於試驗之培養液，準備以下之培養液並使用。 (1)AIM-V(無血清培養基) (2)AS(Auto Serum；自體血清) (3)LPS(Lipopolysaccharide；酯多醣) (4)IL-1α(Interleukin 1 α；介白素1α) (5)IL-1β(Interleukin 1 β；介白素1β) (6)棕櫚酸＜實驗方法＞使用上述培養液，依照實施例1中所記載之實驗方法，將所準備之癌患者末梢血液單核細胞(PBMCs)接種至各孔中，針對添加物對各培養液中之癌細胞(CTC)取得效率(癌細胞檢測精度)之影響進行試驗。 (試驗8：AIM-V培養液中添加LPS之影響) 以AIM-V培養液(AIM-V：群A)為基礎，設為向其中添加有AS(自體血清)之群(AIM-V＋AS：群B)，進而對於該等群，將LPS(Lipopolysaccharide；酯多醣)設為基礎濃度1 conc.(群E、F)，設為分別添加有0.1 conc.～100 conc.之濃度之各群(群GH、GD)。繼而，研究該等群之間之CTC分取效果。＜結果＞將結果示於表8。如表中所示，對於AIM-V培養液中添加有LPS之群，於LPS之添加量較少之群中觀察到較AIM-V單獨更有效；但對於AIM-V＋AS群之LPS添加群，於任一LPS濃度添加群中CTC分取效率均銳減。 [表8] (試驗9：AIM-V培養液中添加IL-1α之影響) 以AIM-V培養液(AIM-V：群A)為基礎，設為向其中添加有AS(自體血清)之群(AIM-V＋AS：群B)，進而對於該等群，將IL-1α(Interleukin 1α)設為基礎濃度1 conc. (群E，F)，設為分別添加有0.1 conc.～100 conc.之濃度之各群(群GH、GD)。繼而，研究該等群之間之CTC分取效果。＜結果＞將結果示於表9。如表中所示，於AIM-V培養液中添加有IL-1α之群中，不論IL-1α之添加量多寡，均僅見到與AIM-V單獨同等、或其以下之效果(群C、E、G)。對於AIM-V＋AS群之IL-1α添加群，於任一IL-1α濃度添加群中，CTC取得效率均較未添加群有所減少。 [表9] (試驗10：AIM-V培養液中之添加IL-1β之影響) 以AIM-V培養液(AIM-V：群A)為基礎，設為向其中添加有AS(自體血清)之群(AIM-V＋AS：群B)，進而對於該等群，將IL-1β (Interleukin 1β)設為基礎濃度1 conc. (群E、F)，設為分別添加有0.1 conc.～100 conc.之濃度之各群(群GH、GD)。繼而，研究該等群之間之CTC分取效果。＜結果＞將結果示於表10。如表中所示，於AIM-V培養液中添加有IL-1β之群中，與IL-1β之添加量相應地僅見到與AIM-V單獨同等、或稍許上升之程度之效果(群C、E、G)。對於AIM-V＋AS群之IL-1β添加群，於任一IL-1β濃度添加群中均僅見到與未添加群同等程度之CTC取得效率。 [表10] (試驗11：AIM-V培養液中添加棕櫚酸之影響) 以AIM-V培養液(AIM-V：群A)為基礎，設為向其中添加有AS(自體血清)之群(AIM-V＋AS：群B)，進而對於該等群，將棕櫚酸設為基礎濃度1 conc. (群G、H)，設為分別添加有0.25 conc.～4 conc.之濃度之各群(群KL、IJ、GH、EF、CD)。繼而，研究該等群之間之CTC分取效果。＜結果＞將結果示於表11。如表中所示，於AIM-V培養液中添加有棕櫚酸之群中，與棕櫚酸之添加量基本無關，與未添加群相比確認到2～3倍之CTC取得效率之上升(群C、E、G、I、K)。對於AIM-V＋AS群之棕櫚酸添加群，於任一棕櫚酸濃度添加群中均未見濃度依賴性，僅見到與未添加群同等程度或其以下之CTC取得效率。 [表11] (綜合評價) 根據以上之試驗結果而獲得如下之結論：對藉由向AIM-V培養液中添加添加成分而提高CTC取得效果之情況進行研究，並對作為新的CTC分離取得因子之包括棕櫚酸(Palmitic Acid)在內之各種添加成分(LPS、ConA、PHA、IL-1α、IL-1β)之候補進行研究，實施最安全且效率良好之因子之探索，結果確認於CTC之穩定之分取中，於AIM-V培養液中添加棕櫚酸(Palmitic Acid)可獲得最良好之結果。再者，於該研究過程中，對於LPS亦觀察到了若干CTC誘導效果，但LPS係具有極強之毒性之物質，因此若鑒於CTC分離後之各種研究、臨床應用之技術開發之目的，則判斷為作為試劑而言於安全上不妥，於以後之實驗中將其排除。 [實施例4] [利用CTC增殖用培養液所獲得之癌細胞(CTC)之形態變化之確認] 藉由實施例1之試驗方法，藉由顯微鏡圖像對在實施例2中使用CTC增殖用培養液所取得之癌細胞(CTC)之形態變化進行驗證。將顯微鏡照片示於圖2～7。於各圖中，(圖-a)、(圖-b)係表示針對不同患者之CTC，研究CTC細胞增殖實驗中之培養條件、即增殖用培養液與血清、或棕櫚酸等因子之有無或濃度等培養條件所引起之CTC之形態特徵的結果(來自不同患者之癌細胞(CTC)之顯微鏡照片)。該實驗係以研究有無因各增殖條件之差異引起之CTC細胞之形態差異表現為目的，(a)、(b)係針對源自不同患者，用以驗證於源自不同患者且相同培養條件下顯示出相同細胞形態之情況。於供於試驗之培養液之濃度中，棕櫚酸(Palmitic Acid)之濃度係依照以下之表12。 [表12] ＜1.利用AIM-培養液單獨而培養、取得之CTC之形態變化之觀察＞將利用AIM-V培養液單獨而培養、取得之CTC之螢光顯微鏡圖像示於圖2(2-a；2-b)。於利用AIM-V培養液單獨而培養、取得之CTC之細胞形態中，於細胞質內之核或顆粒成分方面未特別見到大小之異常或濃染之部分。＜2.於AIM-V培養液中添加棕櫚酸(×1 conc.)而培養、取得之CTC之形態變化之觀察＞將添加AIM-V培養液＋棕櫚酸(×1濃度)而培養、取得之CTC之螢光顯微鏡圖像示於圖3(3-a；3-b)。於添加AIM-V培養液＋棕櫚酸(×1濃度)而培養、取得之CTC之細胞形態中，於細胞質內之核或顆粒成分方面，與棕櫚酸未添加群之情形相比雖然稍見核成分增加，但並未特別見到大小之擴大或濃染之部分。＜3.於AIM-V培養液中添加棕櫚酸(×4 conc.)而培養、取得之CTC之形態變化之觀察＞將添加AIM-V培養液＋棕櫚酸(×4濃度)而培養、取得之CTC之螢光顯微鏡圖像示於圖4(4-a；4-b)。於添加AIM-V培養液＋棕櫚酸(×4濃度)而培養、取得之CTC之細胞形態中，見到細胞大小之擴大、融合傾向(圖4-b)，對於細胞質內之核或顆粒成分，與棕櫚酸未添加群(圖2-a；2-b)、或(×1濃度)添加群(圖3-a；3-b)之情形相比，觀察到核成分或細胞質內之核或顆粒成分之顯著增加或濃染。＜4.於AIM-V＋5%自體血清培養液中進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察＞將於AIM-V＋5%自體血清培養液中進行培養、取得之CTC之螢光顯微鏡圖像示於圖5(5-a；5-b)。於AIM-V＋5%自體血清培養液中進行培養、取得之CTC之細胞形態中，對於細胞、細胞質內之核或顆粒成分未特別見到大小之異常或濃染之部分。＜5.於AIM-V＋5%自體血清＋棕櫚酸(×1 conc.)之條件下之培養液中進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察＞將於AIM-V＋5%自體血清＋棕櫚酸(×1濃度)培養液中進行培養、取得之CTC之螢光顯微鏡圖像示於圖6(6-a；6-b)。於AIM-V＋5%自體血清＋棕櫚酸(×1濃度)培養液中進行培養、取得之CTC之細胞形態中，對於細胞、細胞質內之核或顆粒成分並未特別見到大小之異常或濃染之部分。＜6.於AIM-V＋5%自體血清＋棕櫚酸(×4 conc.)之條件下之培養液中進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察＞將於AIM-V＋5%自體血清＋棕櫚酸(×4濃度)培養液中進行培養、取得之CTC之螢光顯微鏡圖像示於圖7(7-a；7-b)。於AIM-V＋5%自體血清＋棕櫚酸(×4濃度)培養液中進行培養、取得之CTC之細胞形態中，見到細胞大小之擴大、融合傾向(圖7-a)，對於細胞質內之核或顆粒成分，與棕櫚酸未添加群(圖5-a；5-b)、或×1濃度添加群(圖6-a；6-b)相比，觀察到核成分或細胞質內顆粒成分之顯著增加或濃染。認為該形態變化之原因在於，於棕櫚酸(×4濃度)培養液之條件下，因CTC細胞之增殖、活化而使作為核之異常增殖與細胞內小器官、能量產生之主角的粒線體等增加，結果於顯微鏡圖像中，核酸或細胞內顆粒增加，進一步妨礙核或細胞質之光透過性，從而觀察到濃染之狀態。 (綜合評價) 根據以上之CTC(CTSC)之形態變化之試驗結果而獲得如下之結論：使用AIM-V培養液或於該培養液中添加有自體血清及/或棕櫚酸之類的添加成分的CTC增殖培養液，增殖取得CTC，藉此可確實且有效地取得CTC，此時確認到能夠在CTC之細胞形態不產生形態變化之情況下增殖取得CTC。即，於增殖、取得CTC(CTSC)之情形時，為了確認CTC之性質或特性，重要的是對於所取得之細胞之形態不誘導人工變化，因此要求能夠於不對CTC之形態或性狀誘導特別變化之條件下穩定地增殖、取得CTC之方法。根據上述實驗結果而確認該方法係滿足該條件，並且可確實地增殖、取得CTC(CTSC)之方法。 [實施例5] [使用所取得之CTC之細胞膜抗原之確認及鑑定] 如以下之實施例所示，針對自各患者末梢血液分離取得之CTC，使用膜表面之CD44、CD45、CD47、CKII、EpCAM之各抗原，藉由螢光抗體染色法進行確認及鑑定。於各試驗之結果之各圖之照片中，各(圖-a)係表示CTC之顯微鏡之照片之圖像，各(圖-b)係使用膜表面抗原進行染色之螢光顯微鏡之照片圖像。＜抗原染色方法＞抗原染色方法係利用FITIC(fluorescein isothiocyanate，螢光異硫氰酸鹽)標記，依照以下之順序製備試樣，並進行染色、顯微鏡檢查、觀察-拍攝照片。 (I.各種末梢血液分離細胞之製備、及利用FITC標記一次抗體所進行之抗原染色) (1)附著細胞之酶處理。(非附著細胞係自(4)開始) (2)胰蛋白酶EDTA處理。 (3)對單細胞群添加5%FBS添加RPMI培養基，使酶反應停止，並進行抽吸。 (4)離心分離(1200～1500轉、4℃、7分鐘)。 (5)於4℃保冷下，利用(-)PBS進行洗淨、渦旋，並離心2次。 (6)細胞數之計測、分注：1×10⁶ /100 μl/管。 (7)為了遮光而利用鋁輪圈覆蓋細胞之各管之周圍，於4℃保冷下放置30分鐘，使細胞之代謝活動降低(阻止表面抗原向細胞膜內外運動、移動)。 (8)抗體之添加：1 μg/2 μl/1×10⁶ 短暫離心細胞(除去培養基之細胞群)，於4℃之保冷下、遮光下進行1小時染色。 (9)於4℃保冷下，利用(-)PBS進行洗淨、渦旋，並離心2次：離心分離(1200～1500轉、4℃、7分鐘)。 (10)對細胞加入適量之(-)PBS，添加至載玻片或培養板上，並進行顯微鏡檢查。 (11)利用螢光顯微鏡進行觀察、拍攝照片。 (II.各種末梢血液分離細胞之製備、及針對各抗原之一次抗體染色、繼而利用FITC標記二次抗體所進行之抗原染色) (1)附著細胞之酶處理。(非附著細胞係自(4)開始) (2)胰蛋白酶EDTA處理。 (3)對單細胞群添加5%FBS添加RPMI培養基，使酶反應停止，並進行抽吸。 (4)離心分離(1200～1500轉、4℃、7分鐘)。 (5)於4℃保冷下，利用(-)PBS進行洗淨、渦旋，並離心2次。 (6)細胞數之計測、分注：1×10⁶ /100 μl/管。 (7)為了遮光而利用鋁圈覆蓋細胞之各管之周圍，於4℃保冷下放置30分鐘，使細胞之代謝活動降低(阻止表面抗原向細胞膜內外運動、移動)。 (8)一次抗體之添加：1 μg/2 μl/1×10⁶ 短暫離心細胞(除去培養基之細胞群)，於4℃之保冷下、遮光下進行1小時染色。 (9)於4℃保冷下，利用(-)PBS進行洗淨、渦旋，並離心2次：離心分離(1200～1500轉、4℃、7分鐘)。 (10)二次抗體之添加：1 μg/2 μl/1×10⁶ 短暫離心細胞(除去培養基之細胞群)，於4℃之保冷下、遮光下進行1小時染色。 (11)於4℃保冷下，利用(-)PBS進行洗淨、渦旋，並離心2次：離心分離(1200～1500轉、4℃、7分鐘)。 (12)對細胞加入適量之(-)PBS，添加至載玻片或培養板上，並進行顯微鏡檢查。 (13)利用螢光顯微鏡進行觀察、拍攝照片。 [實施例6] [使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定] 針對藉由實施例1之方法自各患者之末梢血液取得之CTC，使用膜抗原CD44進行該CTC之確認及鑑定。＜使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定(I)＞將自3名患者：(1)K.H.(Gastric Ca.，胃癌；liver meta.，肝轉移)、(2)T.K.(Tongue Ca.，舌癌)、(3)K.H.(Gastric Ca.，胃癌；liver meta.，肝轉移)之末梢血液取得之CTC之顯微鏡照片之圖像與使用膜抗原CD44之螢光抗體顯微鏡之照片示於圖8～10。(圖8-a～10-a)係表示顯微鏡照片之圖像，(圖8-b～10-b)係表示螢光抗體顯微鏡之照片。如照片所示，自上述(1)～(3)之患者所取得之CTC未顯示出利用CD44所進行之染色。＜使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定(II)＞將自3名患者：(1)T.K.(Tongue Ca.，舌癌)、(2)S.K.(Kerato-cystic Ca.，角化囊腫癌)、(3)S.O.(Lung Ca.，肺癌)之末梢血液取得之CTC之顯微鏡照片之圖像與使用膜抗原CD44之螢光抗體顯微鏡之照片示於圖11～13。(圖12-a～13-a)係表示顯微鏡照片之圖像，(圖12-b～13-b)係表示螢光抗體顯微鏡之照片。如照片(圖12～13)所示，自上述(2)～(3)之患者所取得之CTC顯示出利用CD44所進行之染色，顯微鏡照片之圖像與螢光抗體顯微鏡之照片一致，確認到所取得之CTC係上述癌之CTC。＜使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定(III)＞將自2名患者：(1)H.Y.(Breast Ca.，乳癌)、(2)Y.H.(Lung Ca.，肺癌)之末梢血液取得之CTC之顯微鏡照片之圖像與使用膜抗原CD44之螢光抗體顯微鏡之照片示於圖14～15。(圖14-a～15-a)係表示顯微鏡照片之圖像，(圖14-b～15-b)係表示螢光抗體顯微鏡之照片。如照片(圖14～15)所示，自上述(1)～(2)之患者所取得之CTC顯示出利用CD44所進行之染色，顯微鏡照片之圖像與螢光抗體顯微鏡之照片一致，確認到所取得之CTC係上述癌之CTC。 [實施例7] [使用膜抗原CD45之CTC之確認及鑑定] 針對藉由實施例1之方法自各患者之末梢血液所取得之CTC，使用膜抗原CD45進行該CTC之確認及鑑定。將自2名患者：(1)H.Y.(Breast Ca.，乳癌)、(2)Y.H.(Lung Ca.，肺癌)之末梢血液取得之CTC之顯微鏡照片之圖像與使用膜抗原CD45之螢光抗體顯微鏡之照片示於圖16～18。(圖16-a～18-a)係表示顯微鏡照片之圖像，(圖16-b～18-b)係表示螢光抗體顯微鏡之照片。如照片(圖16～18)所示，自上述(1)～(2)之患者所取得之CTC顯示出利用CD45所進行之染色，顯微鏡照片之圖像與螢光抗體顯微鏡之照片一致，確認到所取得之CTC係上述癌之CTC。於CTC(CTSC)之顯微鏡照片中，以箭頭表示CTSC細胞之存在。於各照片群(照片1-3：圖16～18)中，於左邊之顯微鏡照片中所見到之CTC(CTSC)中，如右邊之螢光顯微鏡圖像所見，顯示出大部分細胞為CD45陽性CTSC細胞。如雙向箭頭所示，對於該等CD45陽性CTSC細胞，明確其形態、大小均具有多樣性，並非可利用一個指標進行判別之細胞。 [實施例8] [使用膜抗原CD47之CTC之確認及鑑定] 針對藉由實施例1之方法自各患者之末梢血液取得之CTC，使用抗原CD47進行該CTC之確認及鑑定。將自5名患者：(1)G.N.(Breast Ca.，乳癌；multiple metastasis，多發轉移性)、(2)S.K.(Kerato-cystic Ca.，角化囊腫癌)、(3)S.O.(Lung Ca.，肺癌)、(4)H.Y.(Breast Ca.，乳癌)、(5)Y.H.(Lung Ca.，肺癌)之末梢血液取得之CTC之顯微鏡照片之圖像與使用膜抗原CD47之螢光抗體顯微鏡之照片示於圖19～23。(圖19-a～23-a)係表示顯微鏡照片之圖像，(圖19-b～23-b)係表示螢光抗體顯微鏡之照片。如照片(圖19～23)所示，自上述(1)～(5)之患者所取得之CTC顯示出利用CD47所進行之染色，顯微鏡照片之圖像與螢光抗體顯微鏡之照片一致，確認到所取得之CTC係上述癌之CTC。於各圖之照片中，箭頭表示CD47陽性CTSC。以白箭頭表示之CTSC係表示於作為CTC(CTSC)而增殖培養之癌細胞中，顯示CD47陽性CTSC者，不論細胞之大小或形態之大小如何均加以觀察。即，確認到CD47陽性CTSC並非具有確定之形態或大小之細胞，具有各種變化。 [實施例9] [使用膜抗原CKII之CTC之確認及鑑定] 針對藉由實施例1之方法自各患者之末梢血液取得之CTC，使用膜抗原CKII進行該CTC之確認及鑑定。將自2名患者：(1)H.Y.(Breast Ca.，乳癌)、(2)Y.H.(Lung Ca.，肺癌)之末梢血液取得之CTC之顯微鏡照片之圖像與使用膜抗原CKII之螢光抗體顯微鏡之照片示於圖24～25。(圖24-a～25-a)係表示顯微鏡照片之圖像，(圖24-b～25-b)係表示螢光抗體顯微鏡之照片。如照片(圖24～25)所示，自上述(1)～(2)之患者所取得之CTC顯示出利用CKII所進行之染色，顯微鏡照片之圖像與螢光抗體顯微鏡之照片一致，確認到所取得之CTC係上述癌之CTC。 [實施例10] [使用膜抗原EpCAM之CTC之確認及鑑定] 針對藉由實施例1之方法自各患者之末梢血液取得之CTC，使用膜抗原EpCAM進行該CTC之確認及鑑定。將自患者：(1)H.Y.(Breast Ca.，乳癌)之末梢血液取得之CTC之顯微鏡照片之圖像與使用膜抗原EpCAM之螢光抗體顯微鏡之照片示於圖26。(圖26-a)係表示顯微鏡照片之圖像，(圖26-b)係表示螢光抗體顯微鏡之照片。如照片(圖26)所示，對於自上述患者所取得之CTC，僅見到極少數之於細胞膜上表現EpCAM之細胞。 [實施例11] [裸鼠之CTC之致腫瘤性或長期生存之研究] 為了研究藉由實施例1之方法自患者之末梢血液取得之CTC是否保持CTC細胞功能，進行該取得之CTC之致腫瘤性或長期生存之確認。＜試驗方法＞將從來自患者H.Y.(Breast Ca.，乳癌)之試樣中分離之CTC：CTC-HY-1(HY-1)與自患者K.H. (Gastric Ca.，胃癌；liver meta，肝轉移)分離之CTC：CTC-KH-1 (KH-1)分為「實驗群A」與「實驗群B」之兩個實驗群，如下所述移植自患者增殖分離採取之CTC。 (實驗群A)：對於2隻裸鼠(Nude1-1；Nude1-2)，對於「Nude1-1」，於裸鼠之背部皮下移植1×10⁶ 個CTC(HY-1)，對於「Nude1-2」，於裸鼠之背部皮下移植1×10⁶ 個CTC(KH-1)，研究三個月之整個觀察期間有無致腫瘤性。其後，採取該裸鼠之末梢血液與脾臟，實施CTC之分離、培養。針對增殖之CTC移植群所殘存之細胞，藉由非螢光發光圖像(對照)及使用膜表面CD45抗原之螢光抗體法而進行染色研究，確認CTC之殘存，而確認存活係移植之CTC。 (實驗群B)：對於2隻裸鼠(Nude2-1；Nude2-2)，對於「Nude2-1」，於裸鼠之背部皮下移植1×10⁶ 個CTC(HY-1)，對於「Nude2-2」，於裸鼠之背部皮下移植1×10⁶ 個CTC(KH-1)，於腹腔內亦移植等量之細胞。與實驗群A之情形同樣地，針對增殖之CTC移植群所殘存之細胞，確認存活係移植之CTC。＜結果＞將CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(非螢光發光圖像)之圖像與使用膜抗原CD45之螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片示於圖27～30。圖中，圖(27-a)、圖(27-b)係表示將CTC(HY-1)移植至「Nude1-1」之情形時CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(對照)、及螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片，圖(28-a)、圖(28-b)係表示將CTC(KH-1)移植至「Nude1-2」之情形時CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(對照)、及螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片。圖中，圖(29-a)、圖(29-b)係表示將CTC(HY-1)移植至「Nude2-1」之情形時CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(對照)、及螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片，圖(30-a)、圖(30-b)係表示將CTC(KH-1)移植至「Nude2-2」之情形時CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(對照)、及螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片。如照片(圖27～30)所示，CTC移植群所殘存之細胞顯示出膜抗原CD45之染色，與顯微鏡照片之圖像一致，確認CTC移植群所殘存之細胞係上述癌之CTC。作為參考，揭示正常小腸組織細胞之顯微鏡照片之圖像(31-a)與該細胞之CD45染色之螢光顯微鏡之照片之圖像(31-b)。如圖31所示，於正常小腸組織細胞中，完全未顯示CD45之染色。 [實施例12] [使用樹突狀癌細胞株(UTC-8)之CD47陽性細胞(CTSC)之檢測(I)] 使用現有之樹突狀癌細胞株(UTC-8：獨立行政法人產業技術綜合研究所、專利生物寄存中心寄存編號：FERM BP-08611)，針對該樹突狀癌細胞株中之CD47陽性細胞(CTSC)之檢測進行試驗。＜試驗方法＞使用樹突狀癌細胞株(UTC-8)作為試樣，藉由實施例1之方法而增殖取得CTC細胞後，藉由細胞膜上之CD47抗原進行該抗原陽性細胞之檢測。藉由非螢光色素染色之顯微鏡圖像、及利用螢光色素染色法所獲得之CD47陽性細胞圖像表示結果。將結果示於圖32。於圖32中，圖(32-a)表示非螢光色素染色之顯微鏡圖像，圖(32-b)表示利用螢光色素染色法所獲得之CD47陽性細胞圖像。圖中，粗箭頭(⇒)表示CD47陽性之CTSC，雙向箭頭(←→)表示CD47非陽性細胞之大小、形態均不同之CTC癌細胞。其結果為，對於超過20年及經形態培養之大部分癌細胞而言，如本顯微鏡之視野(×200倍)中所見，觀察到CD47陽性CTSC為極少數。又，亦顯示癌細胞係形態狀、圓形或紡錘形、及接近其者，因此基本上為不顯示上下及左右之對稱性的不規則形態之細胞。另一方面，亦判明CD47陽性CTSC係形狀呈現如樹狀細胞樣地突出不規則突起之特異形狀。 [實施例13] [使用樹突狀癌細胞株(UTC-8)之CD47陽性細胞(CTSC)之檢測(II)] 與實施例12之情形同樣地，使用現有之樹突狀癌細胞株(UTC-8：FERM BP-08611)，針對該樹突狀癌細胞株中之CD47陽性細胞(CTSC)之檢測再次進行試驗。＜試驗方法＞與實施例12之情形同樣地，使用樹突狀癌細胞株(UTC-8)作為試樣，藉由實施例1之方法增殖取得CTC細胞後，藉由細胞膜上之CD47抗原進行該抗原陽性細胞之檢測。藉由非螢光色素染色之顯微鏡圖像、及利用螢光色素染色法所獲得之CD47陽性細胞圖像表示結果。將結果示於圖33。於圖33中，圖(33-a)表示非螢光色素染色之顯微鏡圖像，圖(33-b)表示利用螢光色素染色法所獲得之CD47陽性細胞圖像。圖中，粗箭頭(⇒)表示CD47陽性之CTSC，雙向箭頭(←→)表示CD47非陽性細胞之大小、形態均不同之CTC癌細胞。其結果為，獲得與實施例12之情形相同之結果。即，於該樹突狀癌細胞株(UTC-8)中，如本顯微鏡之視野(×200倍)中所見，觀察到CD47陽性CTSC為極少數。又，亦顯示癌細胞係形態狀、圓形或紡錘形、及接近其者，因此基本上為不顯示上下及左右之對稱性的不規則形態之細胞。另一方面，亦判明CD47陽性CTSC係形狀呈現如樹狀細胞樣地突出不規則突起之特異形狀，該形態之特徵鮮明地得到確認。 [實施例14] [使用市售「無血清培養基」之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞增殖試驗] 於本發明之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法中，關於可應用作單核細胞培養中所使用之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞增殖用無血清培養基的培養基，以市售無血清培養基為對象而實施增殖試驗。＜試驗方法＞使用下述培養基作為供於試驗之培養基，依照實施例1之實驗方法而實施增殖試驗。＜供於試驗之培養基＞作為供於試驗之培養基，使用下述之市售「無血清培養基」、及於該培養基中添加有棕櫚酸(2.54% (w/v))之培養基。 1. AIM-V培養基單獨(Thermo Fisher Scientific Inc.) 2. AIM-V培養基＋5%自體血清 3. X-VIVO 10 (04-743Q)單獨(日本龍沙(Lonza)股份有限公司) 4. X-VIVO 10＋5%自體血清 5. X-VIVO 15 (04-744Q)單獨(日本龍沙(Lonza)股份有限公司) 6. X-VIVO 15＋5%自體血清 7. Pro PER 1單獨(日本龍沙(Lonza)股份有限公司) 8. Pro PER 1＋5%自體血清 9. Mesen Cult-SF培養套組單獨(Veritas股份有限公司) 10. Mesen Cult-SF培養套組＋5%自體血清 11. hPSC培養基Δ單獨(和光純藥工業股份有限公司) 12. hPSC培養基Δ＋5%自體血清 13. STK 1單獨(DS Pharma Biomedical股份有限公司) 14. STK 1＋5%自體血清 15. X-VIVO (BE02-055Q)單獨(日本龍沙(Lonza)股份有限公司) 16. X-VIVO＋5%自體血清 17. PC-1單獨(TAKARA BIO股份有限公司) 18. PC-1＋5%自體血清 19. Ultra CULTURE單獨(SARTORIUS STEDIM JAPAN K.K.) 20. Ultra CULTURE＋5%自體血清 21. TexMACS GMP培養基單獨(Miltenyl Biotec股份有限公司) 22. TexMACS GMP培養基＋5%自體血清 23. STEM α.A單獨(Funakoshi股份有限公司) 24. STEM α.A＋5%自體血清 25. MSC Nutristem FX單獨(Cosmo Bio股份有限公司) 26. MSC Nutristem FX＋5%自體血清 27. Stem-partner單獨(極東製藥工業股份有限公司) 28. Stem-partner＋5%自體血清＜供於試驗之試樣＞作為供於試驗之試樣，使用醫院提供之末期癌患者：NK(肝癌)。＜結果＞將結果示於表1、及表2。如表所示，確認供於試驗之市售無血清培養基(培養液)中，培養基(培養液)編號為1～6、11～14、16、18、20、22、26、28者係可應用作本發明之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法中之單核細胞培養中所使用之增殖用無血清培養基的培養基。再者，表中，各培養液編號下之4個數字係表示試驗中所使用之4個孔之實測值。平均值及標準誤差亦根據該4個孔之實測值而以統計學方法算出。 [表1] [表2] [產業上之可利用性] 本發明提供即使於血液或淋巴液之類的生物循環體液中微量存在之循環腫瘤細胞及循環腫瘤幹細胞無法特定為何種癌細胞之狀態、且於生物循環體液中微量存在之狀態下，亦能夠確實且穩定地檢測、分離取得該腫瘤細胞之CTC的檢測、分離取得方法。本發明之CTC的檢測、分離取得方法不僅可進行CTC的檢測、分離，亦可進行CTSC的檢測、分離，於癌之基礎闡明、或臨床應對方面提供有力之方法。

圖1係表示對於癌細胞(CTC)取得而言有效率之培養液之選定試驗中，利用顯微鏡觀察於使用AIM-V培養液及RPMI-1640培養液作為培養液的CTC取得試驗中所獲得者之結果(照片)的圖。圖(1-a)係表示使用AIM-V培養液之CTC取得之結果，圖(1-b)係表示使用RPMI-1640培養液之情形時之CTC取得之結果。圖2係於本發明之實施例中之藉由CTC增殖用培養液所獲得之癌細胞(CTC)之形態變化之確認試驗中，關於「藉由AIM-V培養液單獨進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察」之結果，表示培養、取得之CTC之顯微鏡圖像的圖。圖中，圖(2-a)、圖(2-b)係表示對不同患者之CTC進行研究之結果(來自不同患者之癌細胞(CTC)之顯微鏡照片)。圖3係於本發明之實施例中之藉由CTC增殖用培養液所獲得之癌細胞(CTC)之形態變化之確認試驗中，關於「於AIM-V培養液中添加棕櫚酸(×1 conc.)並進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察」之結果，表示培養、取得之CTC之顯微鏡圖像的圖。圖中，圖(3-a)、圖(3-b)係表示對不同患者之CTC進行研究之結果(來自不同患者之癌細胞(CTC)之顯微鏡照片)。圖4係於本發明之實施例中之藉由CTC增殖用培養液所獲得之癌細胞(CTC)之形態變化之確認試驗中，關於「於AIM-V培養液中添加棕櫚酸(×4 conc.)並進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察」之結果，表示培養、取得之CTC之顯微鏡圖像的圖。圖中，圖(4-a)、圖(4-b)係表示對不同患者之CTC進行研究之結果(來自不同患者之癌細胞(CTC)之顯微鏡照片)。圖5係於本發明之實施例中之藉由CTC增殖用培養液所獲得之癌細胞(CTC)之形態變化之確認試驗中，關於「於AIM-V＋5%自體血清培養液中進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察」之結果，表示培養、取得之CTC之顯微鏡圖像的圖。圖中，圖(5-a)、圖(5-b)係表示對不同患者之CTC進行研究之結果(來自不同患者之癌細胞(CTC)之顯微鏡照片)。圖6係於本發明之實施例中之藉由CTC增殖用培養液所獲得之癌細胞(CTC)之形態變化之確認試驗中，關於「於AIM-V＋5%自體血清＋棕櫚酸(×1 conc.)之條件下之培養液中進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察」之結果，表示培養、取得之CTC之顯微鏡圖像的圖。圖中，圖(6-a)、圖(6-b)係表示對不同患者之CTC進行研究之結果(來自不同患者之癌細胞(CTC)之顯微鏡照片)。圖7係於本發明之實施例中之藉由CTC增殖用培養液所獲得之癌細胞(CTC)之形態變化之確認試驗中，關於「於AIM-V＋5%自體血清＋棕櫚酸(×4 conc.)之條件下之培養液中進行培養、取得之CTC之形態變化之觀察」之結果，表示培養、取得之CTC之顯微鏡圖像的圖。圖中，圖(7-a)、圖(7-b)係表示對不同患者之CTC進行研究之結果(來自不同患者之癌細胞(CTC)之顯微鏡照片)。圖8係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定」中，自患者： K.H. (Gastric Ca.，胃癌；liver meta.，肝轉移)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖9係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定」中，自患者：T.K. (Tongue Ca.，舌癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖10係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定」中，自患者：K.H. (Gastric Ca.，胃癌；liver meta.，肝轉移)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖11係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定」中，自患者：T.K. (Tongue Ca.，舌癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖12係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定」中，自患者：S.K. (Kerato-cystic Ca.，角化囊腫癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖13係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定」中，自患者：S.O. (Lung Ca.，肺癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖14係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定」中，自患者：H.Y. (Breast Ca.，乳癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖15係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD44之CTC之確認及鑑定」中，自患者：Y.H. (Lung Ca.，肺癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖16係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD45之CTC之確認及鑑定」中，自患者：H.Y. (Breast Ca.，乳癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖17係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD45之CTC之確認及鑑定」中，自患者：H.Y. (Breast Ca.，乳癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖18係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD45之CTC之確認及鑑定」中，自患者：Y.H. (Lung Ca.，肺癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖19係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD47之CTC之確認及鑑定」中，自患者：G.N. (Breast Ca.，乳癌；multiple metastasis，多發轉移性)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖20係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD47之CTC之確認及鑑定」中，自患者：S.K. (Kerato-cystic Ca.，角化囊腫癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖21係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD47之CTC之確認及鑑定」中，自患者：S.O. (Lung Ca.，肺癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖22係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD47之CTC之確認及鑑定」中，自患者：H.Y. (Breast Ca.，乳癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖23係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CD47之CTC之確認及鑑定」中，自患者：Y.H. (Lung Ca.，肺癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖24係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CKII之CTC之確認及鑑定」中，自患者：H.Y. (Breast Ca.，乳癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖25係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原CKII之CTC之確認及鑑定」中，自患者：Y.H. (Lung Ca.，肺癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖26係表示於本發明之實施例中之使用自患者末梢血液分離取得之CTC之細胞膜抗原的確認及鑑定試驗中之「使用膜抗原EpCAM之CTC之確認及鑑定」中，自患者：H.Y. (Breast Ca.，乳癌)分離取得之CTC之顯微鏡照片(a)及螢光顯微鏡照片(b)之圖。圖27係表示於本發明之實施例中之「裸鼠之CTC之致腫瘤性或長期生存之確認試驗」中，CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(非螢光發光圖像)之圖像、與使用膜抗原CD45之螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片的圖。圖中，圖(27-a)、圖(27-b)係表示將從來自患者H.Y.之試樣中分離之CTC(HY-1)移植至「Nude1-1」之情形時，CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(對照)、及螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片。圖28係表示於本發明之實施例中之「裸鼠之CTC之致腫瘤性或長期生存之確認試驗」中，CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(非螢光發光圖像)之圖像、與使用膜抗原CD45之螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片的圖。圖中，圖(28-a)、圖(28-b)係表示將從來自患者K.H.之試樣中分離之CTC(KH-1)移植至「Nude1-2」之情形時，CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(對照)、及螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片。圖29係表示於本發明之實施例中之「裸鼠之CTC之致腫瘤性或長期生存之確認試驗」中，CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(非螢光發光圖像)之圖像、與使用膜抗原CD45之螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片的圖。圖中，圖(29-a)、圖(29-b)係表示將從來自患者H.Y.之試樣中分離之CTC(HY-1)移植至「Nude2-1」之情形時，CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(對照)、及螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片。圖30係表示於本發明之實施例中之「裸鼠之CTC之致腫瘤性或長期生存之確認試驗」中，CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(非螢光發光圖像)之圖像、與使用膜抗原CD45之螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片的圖。圖中，圖(30-a)、圖(30-b)係表示將從來自患者K.H.之試樣中分離之CTC(KH-1)移植至「Nude2-2」之情形時，CTC移植群所殘存之細胞之顯微鏡照片(對照)、及螢光抗體顯微鏡(螢光發光圖像)之照片。圖31係表示於本發明之實施例中之「裸鼠之CTC之致腫瘤性或長期生存之確認試驗」中，針對未移植CTC之對照群裸鼠之「正常小腸組織細胞」之顯微鏡照片之圖像(a)、與使用膜抗原CD45之螢光抗體顯微鏡之照片(b)之圖。圖32係表示於使用樹突狀癌細胞株(UTC-8)之CD47陽性細胞(CTSC)的檢測試驗(I)中，藉由非螢光色素染色之顯微鏡圖像、及利用螢光色素染色法之CD47陽性細胞圖像而表示使用樹突狀癌細胞株(UTC-8)作為試樣，增殖取得CTC細胞後，藉由細胞膜上之CD47抗原而進行該抗原陽性細胞的檢測之結果的照片。圖32中，圖(32-a)係表示非螢光色素染色之顯微鏡圖像，圖(32-b)係表示利用螢光色素染色法之CD47陽性細胞圖像。圖33係表示於使用樹突狀癌細胞株(UTC-8)之CD47陽性細胞(CTSC)的檢測試驗(II)中，藉由非螢光色素染色之顯微鏡圖像、及利用螢光色素染色法之CD47陽性細胞圖像而表示使用樹突狀癌細胞株(UTC-8)作為試樣，增殖取得CTC細胞後，藉由細胞膜上之CD47抗原而進行該抗原陽性細胞的檢測之結果的照片。圖33中，圖(33-a)係表示非螢光色素染色之顯微鏡圖像，圖(33-b)係表示利用螢光色素染色法之CD47陽性細胞圖像。

無

Claims

一種生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其包括以下之(1)~(4)之處理步驟：(1)對來自生物循環體液之試樣進行預處理而獲得單核細胞相之第1步驟；(2)準備於孔板中注入有包含循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞增殖用無血清培養基之培養液的孔板，接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之第2步驟；(3)自於第2步驟中進行培養而獲得之板孔中除去培養液之第3步驟；(4)於第3步驟之後，檢測、或分離取得附著於板孔之附著性腫瘤細胞的第4步驟。
如請求項1之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中於第2步驟中，用以接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之包含循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞增殖用無血清培養基之培養液係以AIM-V培養液為基礎之培養液。
如請求項2之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中於第2步驟中，用以接種第1步驟中所獲得之單核細胞並進行培養之以AIM-V培養液為基礎之培養液係AIM-V培養液、或於AIM-V培養液中添加有選自受驗者之自體血清、源自健康人之AB血清及棕櫚酸或其鹽中之1種或2種以上之培養液。
如請求項1之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中來自生物循環體液之試樣係來自末梢血液之血液試樣。
如請求項1之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中第1步驟之來自生物循環體液之試樣之預處理係除去生物循環體液中所含之液體成分及非細胞成分。
如請求項1之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中第2步驟中之培養係將37℃、3~7天作為增殖溫度及增殖期間之基準條件而進行。
如請求項6之生物循環體液中之循環腫瘤細胞及/或循環腫瘤幹細胞的檢測、分離取得方法，其中第2步驟中之培養係於調整為5%CO₂之培養箱內進行。