CN109073626A - 使用细胞增殖法的循环肿瘤细胞的检测·分离获取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种CTC的检测·分离获取方法，所述方法能够在血液、淋巴液等生物体循环体液中可靠且稳定地检测·分离获取微量存在的循环肿瘤细胞及循环肿瘤干细胞，即使是在无法确定该肿瘤细胞为何种癌细胞的状态下、并且该肿瘤细胞在生物体循环体液中微量存在的状态下亦能可靠且稳定地检测·分离获取。所述课题通过下述方法来解决，所述方法是生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法，其包括以下(1)～(4)的处理步骤：(1)第1步骤，对来自生物体循环体液的试样进行预处理，得到单核细胞相；(2)第2步骤，准备向孔板中注入了培养液而得到的孔板，接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育，所述培养液中包含循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞增殖用无血清培养基；(3)第3步骤，从经第2步骤孵育而得的板孔除去培养液；(4)第4步骤，在第3步骤后，对粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞进行检测、或进行分离获取。

Description

使用细胞增殖法的循环肿瘤细胞的检测·分离获取方法
技术领域
本发明涉及对循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells：CTC)及循环肿瘤(癌)干细胞(Circulating Tumor Stem Cells：CTSC)进行检测·分离获取的方法，所述循环肿瘤细胞及循环肿瘤(癌)干细胞为侵入人机体组织、即以外周血为代表的循环体液，或者经由所述体液而自以骨髓、脾脏等为代表的体内各种器官侵入循环体液中的肿瘤(癌)细胞，本发明特别涉及提供下述这样的对循环肿瘤细胞(CTC)及循环肿瘤干细胞(CTSC)进行检测·分离获取的方法，所述方法能够在血液、淋巴液等生物体循环体液中可靠且稳定地检测·分离获取微量存在的循环肿瘤细胞及循环肿瘤干细胞，即使是在无法确定该肿瘤细胞为何种癌细胞的状态下、并且该肿瘤细胞在生物体循环体液中微量存在的状态下亦能可靠且稳定地检测·分离获取。(需要说明，在下文的说明中，除了必须要对循环肿瘤细胞(CTC)及循环肿瘤干细胞(CTSC)加以区别说明的情况之外，记载为“循环肿瘤细胞(CTC)”时，以所述“循环肿瘤细胞(CTC)”中也包括“循环肿瘤干细胞(CTSC)”的含义进行说明。)
背景技术
在发达国家，癌症处于疾病导致的死亡率的前列。特别地，在日本，尽管在经年龄调整的患病率及死亡率等的统计中观察到有减少的倾向，但老龄化、糖尿病等慢性病对癌症发病·死亡的作用度高，目前已呈现为以每两人中即有一人的概率患癌，每三人中有一人因癌症死亡等极令人忧虑的情况(Wum LM等，Estimated using the method.Estimatinglifetime and age-conditional probabilities of developing cancer，Lifetime DataAnal.，1998，4：169-186)。
另一方面，关于对这些癌症的处置，通过致力于开发其治疗技术，已在各种癌症治疗方法中获得进展。作为癌症治疗三大疗法的手术疗法、化学疗法、放射疗法以及近年备受关注的免疫疗法等的进步，相应得到了惊人的成果。然而，目前尚不能充分抑制术后复发、区域淋巴结转移、远端转移等，针对其的对策已成为燃眉之急。另外，近年来还发现即使成功切除癌组织也有却仍然于术后出现复发转移的情况，还已知，作为这样的术后复发转移的主要原因，癌症干细胞的存在是极为重要的(Breast Cancer Res Treat 2010，124：403-412；New Engl.J Med 2004，351：781-791；Clin Cancer Res 2008，14：6302-6309；J.ClinOncol 2008，26：3213-3221)。并且，已发现，作为该机理的核心，在体内循环的CTC与该复发·转移相关(Clin Cancer Res 2008，14：7004-7010；Proc(Bayl Univ Med Cent)2008，21：127-132)。
对于人机体组织(尤其是各种体内各器官)中产生的癌细胞·组织(以下指包括白血病的全部恶性肿瘤)而言，除了白血病之外，原发病灶(癌症发生的位置)处增殖的癌细胞通过粘附因子结合而形成肿瘤组织。然而，该癌细胞并不仅局限于原发病灶处，而会因粘附因子的异常或消失而从原发病灶游离出来，分解癌细胞周围的结合组织、血管、淋巴管壁，浸润至血液中、淋巴液中。浸润于所述体液中的癌细胞与循环于体内的血液、淋巴液共同作为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells：CTC)而在体内循环。所述CTC因血液等的循环而被运送至其他组织、器官，在其他组织、器官中自血管等渗出，重新合成粘附因子，固定下来形成转移病灶。所述CTC的体内循环、转移病灶的形成，被认为是癌症转移的机理，认为其与癌的复发·转移相关。
在对癌症的诊断、治疗的确立过程中，在癌症向其他组织、器官发生转移之前即尽早获得关于对原发病灶处发生的癌症的鉴定及症状的信息，对于有效进行癌症诊断、治疗来说是极其重要的因素，其成为用于防止癌症向其他组织、器官转移的有意义的信息，作为获得其的手段，对CTC的分析作为极其重要的因素而受到关注。另外，认为对CTC的分析在对癌症复发的预测及对癌症治疗效果的评价中也是重要的，有报道称其在对预后的预测、对治疗效果的判定中也成为有效的手段。
然而，循环于血液中等的CTC由于其存在水平非常低，另外在血中循环的癌细胞的半衰期为1～24小时这样短的时间，因此现状是：循环体液中存在的CTC极难检测。例如，来自外周血的CTC的分离效率低，关于CTC，即使在2012年世界共同研究19间机构的报告(JTranslational-medicine 2012，10：138：1-20)中，也仅报道了从血中单核细胞仅能分取1/108、即从100ml血液仅能分取1个。若以60kg体重的成人换算，将仅能以极低的概率(即使全量采血约5升(5000ml)的全部外周血，也只能分取50个)分取极少数量的CTC。这一事实成为CTC研究的最大的障碍因素(JTranslational-medicine 2012，10：138：1-20)。
近年来，CTC的检测·测定技术取得了进展，由于检测·测定技术的进步，检测灵敏度、测定精度得以提高，使得能够特异性地检测出血液中10万个至1亿个单核细胞中所仅存的数个癌细胞。并且，开始作为能够得到乳腺癌、大肠癌、前列腺癌等转移性癌症中的预后预测、治疗效果判定的临床信息的检查而得到认可。另外，美国FDA(食品药品局)已承认关于乳腺癌、大肠癌、前列腺癌的CTC临床有用性，作为体外诊断药而得到了认可。然而，现状是CTC的检测·测定技术在能够确定作为对象的癌细胞等情况下，有理由不得不将其限于特定CTC的检测·测定技术，尚未发现能够适用于广泛的癌细胞的CTC的检测·测定技术。
作为现在广泛利用的CTC检测方法，已知有免疫磁性分离检测方法(Proc.Natl.Acad.Sci，USA，95：4589-4594，1998；WO99/41613；日本特表2002-503814号公报)。该方法为以下方法：使用固定有针对上皮癌细胞的上皮细胞粘附分子(Epithelialcell adhesion molecule：EpCAM、“CD326”)的单克隆抗体的磁珠，将试样中CTC的上皮细胞粘附分子(EpCAM)作为靶标使之结合，通过磁性浓缩将该磁性标记化的CTC进行富集，检测试样中所包含的微量CTC。亦公开了应用所述免疫磁性分离检测方法的各种CTC检测方法。
例如，WO2007/133465(日本特表2009-537021号公报)中公开了如下方法及用于所述方法的装置，所述方法是用荧光发色团标记来自体液的免疫磁性靶标CTC，通过导入光束均化器的时间延迟积分成像(Time-delayed integrating imaging，TDI)技术，对所述标记化的细胞进行扫描得到二维分布的CTC的图像，由此迅速且准确地检测血液中稀少的CTC。另外，日本特开2007-178193号公报、日本特开2012-103077号公报中公开了如下方法：利用针对与上皮细胞表面抗原(EpCAM)不同的上皮特异性表面抗原(细胞角蛋白)的荧光标记抗体而对癌细胞(其为利用该上皮细胞表面抗原(EpCAM)特异性抗体进行固定化的磁珠上所捕获的癌细胞)进行荧光染色，对该荧光染色的细胞数进行计数，并且组合使用通过荧光原位杂交法(fluorescent in situ hybridization，FISH)所得到的与致癌基因杂交的荧光标记DNA探针的细胞核染色，从而同时进行对荧光染色的细胞数的计数和对荧光染色的细胞中的基因的检测。
另外，日本特开2014-105159号公报中公开了使用固定有针对来自人的上皮细胞粘附分子(EpCAM)的单克隆抗体(第1抗体)的磁珠进行CTC的浓缩，及使用特异性识别不同表位的经荧光标记的抗EpCAM单克隆抗体(第2抗体)和细胞核染色法，在维持细胞生存能力的情况下进行CTC的检测·定量分析的方法(intact CTC enumeration and analysisprocedure：iCeap法)；而日本特开2014-112094号公报中公开了使用对上皮细胞具有特异性的标记物即细胞角蛋白(CK)标记物及第2标记物进行CTC的鉴定和表征的方法，所述第2标记物是瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染料等利用形态、尺寸或核与细胞质的比而鉴定CTC的细胞学染料。
进一步地，日本特开2014-39480号公报中公开了以下方法：为了进行EpCAM阴性的CTC的检测，准备含有尿激酶(尿激酶型纤溶酶原激活因子：uPA)特异性荧光底物的培养面，在该培养面上接种血液样品进行孵育，由此检测源自尿激酶特异性底物的信号，将CTC分离、回收。如上所述，以往关于CTC的检测已公开了使用CTC的细胞标记物(细胞表面的特异性抗原)、与该细胞抗原特异性结合的单克隆抗体等检测CTC的各种检测方法，但是，该CTC的检测·测定技术存在仅可适用于如乳腺癌、大肠癌、前列腺癌等能够确定对象癌症的情况的制约。因此，对于不能确定对象癌细胞的情况下的广泛的癌症，尚未发现有效地检测·测定该癌症的CTC的技术。
另一方面，在CTC的检测·测定方法中，也公开了不使用CTC的细胞标记物(细胞表面的特异性抗原)、与该细胞抗原特异性结合的单克隆抗体等而检测CTC的方法。例如，日本特开2011-163830号公报中公开了如下的CTC检测·测定方法：利用微流体装置，在一个装置内连贯地进行来自血液的CTC的浓缩以及CTC的染色、洗涤等操作，并使用自动化荧光显微镜等迅速地对CTC进行计数，所述微流体装置能够利用CTC捕获用的具有经控制的孔径、孔数、配置的微细贯通孔的尺寸选择微腔阵列而捕获血液试样中所包含的CTC。另外，日本特开2013-36818号公报中公开了如下方法：通过使含有肿瘤细胞的体液与血细胞分离材料(其由密度为2.0×104～1.9×105、纤维径为1μm～15μm的聚酯纤维、聚丙烯纤维等成型而得到的无纺布形成)接触，捕获肿瘤细胞、白细胞及血小板，并使用包含生理盐水、缓冲液、葡聚糖等的分离液对所捕获到的体液中的肿瘤细胞丰富的组分进行分离·回收。
进一步地，日本特开2014-224800号公报中公开了如下的CTC等的分离方法：形成具有形成间隙的主体和罩部、该间隙分离出间隙的注入口区域及排出口区域的分离元件，该分离元件与间隙的表面共同划分成通道，对于通过该通道的粒子而言，通过使更小的粒子通过并阻止更大的粒子通过，而将作为更大粒子的CTC与作为更小粒子的血液细胞分离开来。这些CTC的分离·检测方法是对体液中存在的CTC进行物理性的分离·检测，而并非使用CTC的细胞标记物(细胞表面的特异性抗原)、与该细胞抗原特异性结合的单克隆抗体等，因此即使对于无法确定对象癌细胞的癌症而言，也可能适用于该癌症的CTC的分离·检测，但存在如下问题：难以通过上述方法可靠地分离·检测体液中以微量水平存在的CTC。
包括CTC在内的癌细胞的获得，对于基于癌研究、特别是癌的基因解析的诊断、预后判定、有效的癌化学疗法的选择等而言是不可或缺的因素。另外，在癌免疫疗法中，癌细胞的获得是对于疫苗开发、进一步地在个体化医疗中对于定制疫苗的开发而言十分重要的技术。进而，在个体化医疗的免疫细胞移入疗法中，在作为针对患者本人的癌的特异性细胞损伤反应的中坚力量的杀伤细胞的诱导中也作为刺激物质、或者作为测定所诱导的杀伤细胞的细胞毒性时的自体癌症靶标细胞也是不可或缺的。另外，近年来，作为术后复发转移的主要因素而关注了其存在的癌症干细胞的获得，对于现在已成为燃眉之急的癌症干细胞研究与其控制技术的开发而言提供了具有划时代意义的手段。
迄今为止，对于医疗现场中癌细胞的获取而言，仅存在活检、自手术材料得到的对生物体侵入性强的操作以及伴随于此的转移促进·接种等伴有一定危险性的方法。因此，为了避免上述风险，开发例如自外周血等安全、简便、且在短时间内分离获取CTC的方法，对于癌症的基础研究及临床研究具有极大贡献，具有CTC分离获取的重要意义。
尽管自阐明癌症转移的产生主要是血源性而非淋巴源性(Cancer Res.11，648-651，1951；CANCER JULY-AUGUST，Vol.13：674-676，1960)之后已经过了50年以上的岁月，但至今仍然没有开发出自外周血稳定地采集癌细胞的方法。作为针对特定对象的方法，已知有如前述那样利用抗体来检测·扩增外周血中存在的来自癌细胞的极其微量的细胞碎片、并研究是否存在癌症的方法。然而，该方法是仅能适用于已经确定了成为抗体结合目标的物质的癌细胞的手段。因此，其为不能适用于游离物质未知的癌细胞的手段。另外，这对于通过PCR将来自癌细胞的基因片段进行扩增从而研究有无癌症的方法而言也是同样的。即具有如下缺点：由于通过对已判明的基因部分进行扩增来判定有无癌细胞，因此无法使用未知基因以适用于癌化的细胞。另一方面，作为克服所述缺点的方法，癌细胞的获取可考虑采用活检、从手术材料获得这样的伴有生物体侵入的方法，但对于该癌细胞的获取而言，即便从原发病灶进行的活检或手术采集是可能的、且被允许，从转移病灶的采集仍然有招致癌细胞进一步扩散接种的风险，伦理上亦不被允许。另外，也不可能应对未确定癌症的初期癌。
在如上所述的医疗现场对于癌细胞的检测·分离获取的需求之下，利用CTC的检测·分离获取实现癌细胞的检测·分离获取具有极重要的意义，但现状是：对于在血液、淋巴液等生物体循环体液中微量存在的CTC、CTSC，尚未能开发出即使在无法确定该肿瘤细胞为何种癌的细胞的状态下、仍然能可靠且稳定地进行检测·分离获取的方法。因此，开发即使对于尚未确定癌症的癌细胞而言也能安全、简便、可靠且稳定地自血液、淋巴液等生物体循环体液(例如外周血等血液)来检测·分离获取微量存在的CTC、CTSC的方法，已成为癌症的基础和临床应对中极其重要的课题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-178193号公报。
专利文献2：日本特开2011-163830号公报。
专利文献3：日本特开2012-103077号公报。
专利文献4：日本特开2013-36818号公报。
专利文献5：日本特开2014-39480号公报。
专利文献6：日本特开2014-105159号公报。
专利文献7：日本特开2014-112094号公报。
专利文献8：日本特开2014-224800号公报。
专利文献9：日本特表2002-503814号公报。
专利文献10：日本特表2009-537021号公报。
专利文献11：WO99/41613。
专利文献12：WO2007/133465。
非专利文献
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非专利文献4：Clin Cancer Res 2008，14：6302-6309。
非专利文献5：J.Clin Oncol 2008，26：3213-3221。
非专利文献6：Clin Cancer Res 2008，14：7004-7010。
非专利文献7：Proc(Bayl Univ Med Cent)2008，21：127-132。
非专利文献8：J Translational-medicine 2012，10：138：1-20。
非专利文献9：Proc.Natl.Acad.Sci，USA，95：4589-4594，1998。
非专利文献10：Cancer Res.11，648-651，1951。
非专利文献11：CANCER JULY-AUGUST，Vol.13：674-676，1960。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于开发出一种CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法，所述方法能够在血液、淋巴液等生物体循环体液中可靠且稳定地检测·分离获取微量存在的CTC(循环肿瘤细胞)及CTSC(循环肿瘤干细胞)，即使是在无法确定该肿瘤细胞为何种癌细胞的状态下、并且该肿瘤细胞在生物体循环体液中微量存在的状态下亦能可靠且稳定地检测·分离获取。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为了解决上述课题，针对CTC及CTSC的检测·分离获取方法(能够在血液、淋巴液等生物体循环体液中可靠且稳定地检测·分离获取微量存在的CTC及CTSC，即使是在无法确定该肿瘤细胞为何种癌细胞的状态下、并且该肿瘤细胞在生物体循环体液中微量存在的状态下亦能可靠且稳定地检测·分离获取的方法)进行了深入研究，在研究过程中发现，通过在CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，在所述检测·分离获取的步骤中设置使用包含CTC和/或CTSC(循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞)增殖用无血清培养基的培养液的CTC和/或CTSC的增殖步骤，从而能对试样中微量存在的CTC和/或CTSC进行扩增，能可靠且稳定地进行检测·分离获取，从而完成了本发明。
即，本发明包括使用细胞增殖法的生物体循环体液中CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法，所述方法包括以下(1)～(4)的处理步骤：
(1)第1步骤，对来自生物体循环体液的试样进行预处理，得到单核细胞相；
(2)第2步骤，准备向孔板中注入了培养液而得到的孔板，接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育，所述培养液中包含CTC和/或CTSC增殖用无血清培养基；
(3)第3步骤，从经第2步骤孵育而得的板孔除去培养液；
(4)第4步骤，在第3步骤后，对粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞进行检测、或进行分离获取。
通过本发明的使用细胞增殖法的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法，能够对循环体液等的试样中微量存在的CTC和/或CTSC进行扩增，从而可靠且稳定地进行检测·分离获取。本发明的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法可将生物体循环体液作为试样进行，作为所述来自生物体循环体液的试样，可举出来自外周血的血液试样作为可最简单地操作并且有效的试样。
本发明的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，第1步骤、即得到来自生物体循环体液的单核细胞相的步骤中对来自生物体循环体液的试样进行预处理，可举出用于除去生物体循环体液中所包含的液体成分及血细胞等非细胞成分的处理。
本发明的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育的第2步骤包括：准备向孔板中注入了培养液而得到的孔板、接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育，所述培养液中包含CTC和/或CTSC增殖用无血清培养基。作为所述包含CTC和/或CTSC增殖用无血清培养基的培养液，可举出以作为细胞增殖用无血清培养基的AIM-V培养液为基础的培养液。通过使用该培养液，从而在使用细胞增殖法的生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中的孵育步骤中，能使CTC和/或CTSC进行短时间的增殖，使试样中微量存在的CTC和/或CTSC得以增殖·扩增，由此能可靠且稳定地进行检测·分离获取。作为该以AIM-V培养液为基础的培养液，可使用AIM-V培养液、或者在AIM-V培养液中添加选自受试者的自体血清、来自健康人的AB血清及棕榈酸(PalmiticAcid)或其盐中的1种或2种以上而得到的培养液。关于第2步骤中的孵育条件，可针对其增殖温度及增殖期间适宜地确定适合的条件，但最适地，可将37℃、3～7天作为增殖温度及增殖期间的基准条件而进行。另外，作为第2步骤中的孵育条件，可在调整为5％CO2的培养箱内的条件下进行。
即，在本发明的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中所使用的包含CTC和/或CTSC增殖用无血清培养基的培养液，可使用以AIM-V培养液为基础的培养液，而作为该以AIM-V培养液为基础的培养液，可使用AIM-V培养液本身作为基础培养基。另外，通过使用在该AIM-V培养液中添加选自受试者的自体血清、来自健康人的AB血清及棕榈酸(PalmiticAcid)或其盐中的1种或2种以上而得到的培养液，可提高CTC的诱导效果，可得到效率更高的、稳定的CTC和/或CTSC的检测·分离效果。特别地，可举出棕榈酸(Palmitic Acid)或其盐作为能安全且稳定地进行CTC和/或CTSC的检测·分离的添加成分。
在本发明的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，从经第2步骤孵育而得的板孔除去培养液的第3步骤包括：通过适宜手段从在孔板中孵育规定时间而得到的培养物中除去培养液的处理。另外，本发明的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，在第3步骤后对粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞进行检测、或进行分离获取的第4步骤包括：使用显微镜检查、染料染色、抗原-抗体染色等检测手段而原样地检测粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞，或者分离粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞，作为各种检测用癌细胞而获取。
对本发明的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法的构建过程说明如下：为了在生物体循环体液中可靠且稳定地检测·分离获取微量存在的CTC和/或CTSC，需要使试样中微量存在的CTC和/或CTSC在短时间内有效地增殖、扩增。此外，为了构建该使用细胞增殖法的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法，对能使CTC及CTSC增殖的CTC和/或CTSC增殖用无血清培养基的探索成为课题。因此，本申请的发明人在为了解决本发明的课题而进行深入研究的过程中，针对CTC的分离、获取，以作为外周血单核细胞的标准培养液的RPMI-1640培养液(RPMI-1640)作为基准，与无血清培养基AIM-V培养液(AIM-V)进行了比较。即，向这些培养液中分别加入5％的胎牛血清(FBS)或外周血提供者的自体血清(Autologous Serum：AS)并进行培养，研究所述各培养液间的CTC分离、获取的有无及效果。其结果是，证实了AIM-V对于CTC和/或CTSC的分离、获取是有用的，并且AS的添加会增强其效果。
进一步地，基于前述培养液的结果，为了避免因自体血清的采集而造成患者负担增加、并且排除根据受试者的各症状出现的血清成分变动所造成的影响，对包括作为新的CTC的分离获取因子的棕榈酸(Palmitic Acid)在内的各种候选物质、LPS、Con A、PHA、IL-1α、IL-1β进行研究，实施对最安全且效率良好的因子的探索。在所述研究过程中，在LPS中也观察到CTC的诱导效果，但LPS是具有极强毒性的物质，因此，鉴于CTC分离后的各种研究、临床应用的技术开发这样的目的，判断其在安全上不适合作为试剂，决定在以后的实验中将其排除。结果已证实，对于CTC的获取而言，从其供给、性质(不能另外感染的病毒载体等)来考虑，作为即使排除作为不稳定因素的自体血清也能够安全且稳定地分散CTC的新因子，棕榈酸(Palmitic Acid)是极其有用的。由以上证实，对于CTC的稳定分取而言，AIM-V培养液、或者在AIM-V培养液中添加受试者的自体血清、来自健康人的AB血清及棕榈酸(PalmiticAcid)或其盐中的1种或2种以上而得到的培养液是有用的，其中添加棕榈酸(PalmiticAcid)或其盐而得到的培养液尤其有用，从而完成了本发明。
即，本发明具体包括以下请求项。
[1]生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其包括以下(1)～(4)的处理步骤：
(1)第1步骤，对来自生物体循环体液的试样进行预处理，得到单核细胞相；
(2)第2步骤，准备向孔板中注入了培养液而得到的孔板，接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育，所述培养液中包含循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞增殖用无血清培养基；
(3)第3步骤，从经第2步骤孵育而得的板孔除去培养液；
(4)第4步骤，在第3步骤后，对粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞进行检测、或进行分离获取。
[2]如上述[1]所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，用于在第2步骤中接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育的、包含循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞增殖用无血清培养基的培养液为：以AIM-V培养液为基础的培养液。
[3]如上述[1]或[2]所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，用于在第2步骤中接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育的、以AIM-V培养液为基础的培养液为：AIM-V培养液；或者在AIM-V培养液中添加选自受试者的自体血清、来自健康人的AB血清及棕榈酸或其盐中的1种或2种以上而得到的培养液。
[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，来自生物体循环体液的试样为来自外周血的血液试样。
[5]如上述[1]～[3]中任一项所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，第1步骤的来自生物体循环体液的试样的预处理为除去生物体循环体液中所包含的液体成分及非细胞成分。
[6]如上述[1]～[5]中任一项所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，第2步骤中的孵育是将37℃、3～7天作为增殖温度及增殖期间的基准条件而进行的。
[7]如上述[6]所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，第2步骤中的孵育是在调节为5％CO2的培养箱内进行的。
发明的效果
本发明提供一种CTC的检测·分离获取方法，所述方法能够在血液、淋巴液等生物体循环体液中可靠且稳定地检测·分离获取微量存在的循环肿瘤细胞及循环肿瘤干细胞，即使是在无法确定该肿瘤细胞为何种癌细胞的状态下、并且该肿瘤细胞在生物体循环体液中微量存在的状态下亦能可靠且稳定地检测·分离获取。本发明的CTC的检测·分离获取方法不仅限于CTC、也可进行CTSC的检测·分离，为癌的基础性阐明、临床应对提供有力的手段。
即，通过本发明，使得能够进行CTC的高效且稳定的分取，这在对癌的研究中可能带来划时代的进展。CTC研究迟缓的主要原因是迄今为止尚不能从外周血等中高效且稳定地检测、分离·分取癌细胞尤其是CTSC。鉴于此，通过本发明的技术，将形成可飞跃性地促进CTC研究的基准。通过本发明，可推进CTC的基础研究、临床研究，从而可期待促进CTC的控制技术的开发。
若推进使用本发明的基础研究，则有可能从遗传学上以作为实态的基因等物质水平来研究CTC的细胞学多样性。由此，已开始展望与其增殖控制相关的新药开发、在免疫学上对CTC的细胞杀灭性抗体等新药的开发。另外，在临床上也使得与癌症患者的阶段分类的比较、与组织学分类的比较成为可能，进而可探求与所得各种指标之间的相关性。进一步地，还可以查明与治疗效果之间的相关性等，因此，即使对于迄今为止尚未实现的诊断、治疗、预后的评价判定，也可期待确立稳固的科学基准。因此，本发明将对癌症的基础性阐明、临床应用等的研究开发作出极大贡献。
附图说明
图1：图1是表示在对于癌细胞(CTC)的获取而言高效的培养液的选定试验中，利用显微镜观察通过使用AIM-V培养液及RPMI-1640培养液作为培养液的CTC获取试验得到的细胞的结果(照片)的图。图(1-a)表示使用AIM-V培养液的CTC获取的结果，图(1-b)表示使用RPMI-1640培养液的情况下的CTC获取的结果。
图2：图2是在本发明的实施例中通过CTC增殖用培养液得到的癌细胞(CTC)的形态变化的确认试验中，针对“用AIM-V培养液单独培养·获取的CTC的形态变化的观察”的结果示出培养·获取的CTC的显微镜图像的图。图中，(2-a)、(2-b)是表示对不同患者的CTC进行研究的结果(来自不同患者的癌细胞(CTC)的显微镜照片)的图。
图3：图3是在本发明的实施例中通过CTC增殖用培养液所得到的癌细胞(CTC)的形态变化的确认试验中，针对“向AIM-V培养液中添加棕榈酸(×1conc.)并进行培养而获取的CTC的形态变化的观察”的结果示出培养·获取的CTC的显微镜图像的图。图中，(3-a)、(3-b)是表示对不同患者的CTC进行研究的结果(来自不同患者的癌细胞(CTC)的显微镜照片)的图。
图4：图4是在本发明的实施例中通过CTC增殖用培养液所得到的癌细胞(CTC)的形态变化的确认试验中，针对“向AIM-V培养液中添加棕榈酸(×4conc.)并进行培养而获取的CTC的形态变化的观察”的结果示出培养·获取的CTC的显微镜图像的图。图中，(4-a)、(4-b)是表示对不同患者的CTC进行研究的结果(来自不同患者的癌细胞(CTC)的显微镜照片)的图。
图5：图5是在本发明的实施例中通过CTC增殖用培养液得到的癌细胞(CTC)的形态变化的确认试验中，针对“在AIM-V+5％自体血清(Auto Serum)培养液中进行培养而获取的CTC的形态变化的观察”的结果示出培养·获取的CTC的显微镜图像的图。图中，(5-a)、(5-b)是表示对不同患者的CTC进行研究的结果(来自不同患者的癌细胞(CTC)的显微镜照片)的图。
图6：图6是在本发明的实施例中通过CTC增殖用培养液得到的癌细胞(CTC)的形态变化的确认试验中，针对“在AIM-V+5％自体血清+棕榈酸(×1conc.)条件下的培养液中进行培养而获取的CTC的形态变化的观察”的结果示出培养·获取的CTC的显微镜图像的图。图中，(6-a)、(6-b)是表示对不同患者的CTC进行研究的结果(来自不同患者的癌细胞(CTC)的显微镜照片)的图。
图7：图7是在本发明的实施例中通过CTC增殖用培养液得到的癌细胞(CTC)的形态变化的确认试验中，针对“在AIM-V+5％自体血清+棕榈酸(×4conc.)条件下的培养液中进行培养而获取的CTC的形态变化的观察”的结果示出培养·获取的CTC的显微镜图像的图。图中，(7-a)、(7-b)是表示对不同患者的CTC进行研究的结果(来自不同患者的癌细胞(CTC)的显微镜照片)的图。
图8：图8是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定”中，表示自患者：K.H.(Gastric Ca.：胃癌；liver meta.：肝转移)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图9：图9是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定”中，显示从患者T.K.(Tongue Ca.：舌癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图10：图10是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定”中，显示从患者K.H.(Gastric Ca.：胃癌；liver meta.：肝转移)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图11：图11是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者T.K.(Tongue Ca.：舌癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图12：图12是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者S.K.(Kerato-cystic Ca.：角化囊性瘤)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图13：图13是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者：S.O.(Lung Ca.：肺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图14：图14是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图15：图15是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者Y.H.(Lung Ca.：肺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图16：图16是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD45进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图17：图17是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD45进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图18：图18是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD45进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者Y.H.(Lung Ca.：肺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图19：图19是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD47进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者G.N.(Breast Ca.：乳腺癌；multiple metastasis：多发转移性)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图20：图20是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD47进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者S.K.(Kerato-cystic Ca.：角化囊性瘤)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图21：图21是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD47进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者S.O.(Lung Ca.：肺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图22：图22是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD47进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图23：图23是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CD47进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者Y.H.(Lung Ca.：肺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图24：图24是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CKII进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者：H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图25：图25是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原CKII进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者Y.H.(Lung Ca.：肺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图26：图26是本发明的实施例中在使用细胞膜抗原确认及鉴定从患者外周血分离获取的CTC的试验中的“使用膜抗原EpCAM进行的CTC的确认及鉴定”中，表示从患者H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)分离获取的CTC的显微镜照片(a)及荧光显微镜照片(b)的图。
图27：图27是本发明的实施例中的“裸鼠中的CTC的致肿瘤性或长期生存的确认试验”中，表示CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(非荧光发光图像)的图像以及使用膜抗原CD45的荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片的图。图中，(27-a)、(27-b)表示将从来自患者H.Y.的试样分离的CTC(HY-1)移植至“Nude1-1”的情况下CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(对照)及荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片。
图28：图28是本发明的实施例中的“裸鼠中的CTC的致肿瘤性或长期生存的确认试验”中，表示CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(非荧光发光图像)的图像以及使用膜抗原CD45的荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片的图。图中，(28-a)、(28-b)表示将从来自患者K.H.的试样分离的CTC(KH-1)移植至“Nude1-2”的情况下CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(对照)及荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片。
图29：图29是本发明的实施例中的“裸鼠中的CTC的致肿瘤性或长期生存的确认试验”中，表示CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(非荧光发光图像)的图像以及使用膜抗原CD45的荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片的图。图中，(29-a)、(29-b)表示将从来自患者H.Y.的试样分离的CTC(HY-1)移植至“Nude2-1”的情况下的CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(对照)及荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片。
图30：图30是本发明的实施例中的“裸鼠中的CTC的致肿瘤性或长期生存的确认试验”中，表示CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(非荧光发光图像)的图像以及使用膜抗原CD45的荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片的图。图中，(30-a)、(30-b)表示将从来自患者K.H.的试样分离的CTC(KH-1)移植至“Nude2-2”的情况下的CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(对照)及荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片。
图31：图31是本发明的实施例中的“裸鼠中的CTC的致肿瘤性或长期生存的确认试验”中，表示针对未移植CTC的对照组裸鼠的“正常小肠组织细胞”的显微镜照片的图像(a)及使用膜抗原CD45的荧光抗体显微镜的照片(b)的图。
图32：图32是在使用建立的癌细胞株(UTC-8)的CD47阳性细胞(CTSC)的检测试验(I)中，通过非荧光色素染色的显微镜图像及由荧光色素染色法得到的CD47阳性细胞图像来表示使用建立的癌细胞株(UTC-8)作为试样、增殖获取CTC细胞后利用细胞膜上的CD47抗原进行该抗原阳性细胞的检测的结果的照片。图32中，(32-a)表示非荧光色素染色的显微镜图像，(32-b)表示由荧光色素染色法得到的CD47阳性细胞图像。
图33：图33是在使用建立的癌细胞株(UTC-8)的CD47阳性细胞(CTSC)的检测试验(II)中，通过非荧光色素染色的显微镜图像及由荧光色素染色法得到的CD47阳性细胞图像来表示使用建立的癌细胞株(UTC-8)作为试样、增殖获取CTC细胞后利用细胞膜上的CD47抗原进行该抗原阳性细胞的检测的结果的照片。图33中，(33-a)表示非荧光色素染色的显微镜图像，(33-b)表示由荧光色素染色法得到的CD47阳性细胞图像。
具体实施方式
本发明包括使用增殖法进行的生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法，所述方法包括以下(1)～(4)的处理步骤：
(1)第1步骤，对来自生物体循环体液的试样进行预处理，得到单核细胞相；
(2)第2步骤，准备向孔板中注入了培养液而得到的孔板，接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育，所述培养液中包含CTC和/或CTSC增殖用无血清培养基；
(3)第3步骤，从经第2步骤孵育而得的板孔除去培养液；
(4)第4步骤，在第3步骤后，对粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞进行检测、或进行分离获取。
在本发明的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，可将生物体循环体液作为试样而进行，作为所述来自生物体循环体液的试样，可举出来自外周血的血液试样作为可最简单地操作并且有效的试样。关于用于CTC和/或CTSC的检测·分离获取的来自生物体循环体液的试样的采集，在生物体中不可能存在独立于血液、体液循环的器官，即使无法肉眼预测其中癌的存在，也可以从所有器官分取CTC和/或CTSC。例如，向裸鼠的背部皮下、皮内移植来自人的CTC，3个月后摘取脾脏，实施从外周血的分离操作，由此已成功地分离来自人的CTC。
在本发明的生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，第1步骤包括对来自生物体循环体液的试样进行预处理、得到单核细胞相的步骤。对于该步骤，可举出用于对来自生物体循环体液的试样进行预处理从而除去生物体循环体液中所包含的液体成分及血细胞等非细胞成分的处理。所述用于除去生物体循环体液中所包含的液体成分及血细胞等非细胞成分的处理没有特别限定，可使用已知方法。例如可举出：在血液试样中通过离心分离而将血液中的红细胞、白细胞分离除去的方法(离心分离法)；利用细胞的密度将血液中的红细胞、白细胞分离除去的方法(密度梯度离心法)；利用细胞的尺寸差异来分离血细胞的方法(使用过滤器的分离法)等，作为特别优选的方法，可举出密度梯度离心法。在此情况下，具体可举出Ficoll-Isopaque密度梯度离心分离法的处理条件。
在本发明的生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，作为第2步骤中的孵育所使用的包含CTC和/或CTSC增殖用无血清培养基的培养液，可使用以AIM-V培养液为基础的培养液。AIM-V培养液是作为T细胞等的增殖用培养基而开发的，该培养液本身也可从市售品中购买。若对本发明的生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中的第2步骤加以说明，则第2步骤包括下述步骤：准备向孔板中注入了培养液而得到的孔板，接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育，所述培养液是以作为细胞增殖用无血清培养基的AIM-V培养液为基础的培养液。作为所述以AIM-V培养液为基础的培养液，可使用AIM-V培养液；或者在AIM-V培养液中添加选自受试者的自体血清、来自健康人的AB血清及棕榈酸或其盐中的1种或2种以上而得到的培养液。第2步骤中的孵育条件可根据状况而适宜设定，优选地，在孵育中，可在5％CO2的条件下、在37℃、3～7天的条件下进行。特别优选可在5％CO2、37℃、孵育7天的条件这样的培养温度及培养期间的条件下进行。
在本发明的生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，第3步骤包括从经第2步骤孵育而得的板孔除去培养液的步骤。培养液从板孔的除去可通过适当的手段进行。
在本发明的生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，第4步骤包括下述步骤：在第3步骤后，对粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞进行检测、或进行分离获取。该第4步骤中，可使用显微镜检查、染料染色、抗原、抗体染色等检测手段，并将粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞原样地供于所述检测手段中。另外，可将粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞分离，作为各种检测用癌细胞而获取。
在本发明的生物体循环体液中的CTC和/或CTSC的检测·分离获取方法中，分离获取的癌细胞可作为用于癌的诊断、治疗、预后的评价判定等、癌的阐明、临床应用等的研究用癌细胞试样而提供。
关于对在本发明中分离、获取的细胞是癌细胞的证明，可自以下基准中选择多个适当的基准并进行确认。例如，可选择并决定为(1)～(5)、(7)、(9)。
(确认基准)
(1)未见接触阻止现象。
(2)显示在软琼脂内形成群落的能力(该方法是适用于悬浮性细胞的方法)。
(3)显微镜下可见与细胞的体积相比异常的染色体的形态和容积。
(4)显示传代培养下的分裂次数为对于人类正常细胞而言成为极限的Hayflick极限的约50次以上的分裂能力，即，假设一周中分裂2～3次，在约半年以上的期间进行传代培养，显示永久增殖能力·不死化。
(在遗传学、血清学方面)
(5)具有单独一个或多个已判明为癌干细胞CTSC的细胞表面标记物的CD44、CD45、CD47、CKII、EpCAM等抗原。
(6)在该细胞的培养液中，通常被视为肿瘤标记物的24种标记物中的至少一种以上(在头颈癌·食道扁平上皮癌中为SCC，在肺癌中为CA125，在乳腺癌中为CA15-3，在肺癌中为AFP、CEA，在胰腺癌中为CEA、CA19-9，在大肠癌中为CA19-9等)与对照组相比显示出阳性反应。
(7)自该细胞纯化总RNA，实施基因解析，优先确认到癌相关基因及癌症干细胞基因的表达。
(为了观察获取细胞的致肿瘤性)
(8)对分离·获取的癌细胞的DNA进行纯化，导入至NIH3T3细胞中时，观察到NIH3T3细胞的接触阻止现象消失，在形态学上呈现癌细胞的形态和实质。
(9)向免疫缺陷裸鼠或SCID小鼠移植该细胞时，移植细胞显示出致肿瘤性。若进一步对增殖的组织进行再培养，则该组织细胞增殖。
如前文所述，对于通过本发明的方法从例如作为人机体组织的代表的、可最简便地操作的外周血高效率地分离·检测的CTC而言，可将其分离·检测结果用作癌疗法实施前后效果的比较评价指标，另外，可有助于预后的评价。此外，通过本发明的方法使得CTC的高效率的分离获取成为可能，由此可促进新治疗技术等的开发，例如针对该癌症有效的药剂等的开发。即，通过本发明，对于任何癌症或者不确定的癌症均能进行CTC的高效率的分离获取，由此不仅可进行癌症的早期发现、预后的分析评价等，而且还可基于稳定地得到的CTC的数量上、形态上的推移而确立治疗前后的评价指标，从而促进控制CTC的药剂的开发、治疗方法的开发。进而，可作为用于确立基础性的临床CTC研究的稳定基准的材料而加以利用。
以下列举实施例以更具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
[实验方法]：
本发明的实施例中依照以下的实验方法。即，通过以下步骤对全部的实验试样(来自提供血液的各种癌症患者的外周血)进行无菌处理。另外，预先根据来自各合作机构的信息，在有HBV、HCV等各种病毒感染的情况下，其处理与非感染组分开进行试验，并由医疗废弃物处理专业人士实施适当的医疗废弃物处理。
(试样的采集：采血)
1.准备放入有适量抗凝剂肝素钠(0.05ml)的一次性30ml采血用注射器，另外准备未放入肝素钠的用于得到血清的相同30ml采血注射器。将其结合于L型180°三通旋塞阀的各插入口中，将18、21、24号(Gauge)翼状针中适当的针结合于血管侧，进行采血的准备。对于血液，分别采血30ml，并实施以下的分离操作。
(试样的纯化：血细胞分离)
2.血清采集是在向采血注射筒上安装针后，在37℃、5％CO2培养箱内静置处理1小时，然后在4℃进行3,000转(800G)、30分钟的离心分离。将上清液作为自体血清(AS)，在4℃冷藏保存。
3.另一方面，用于外周血单核细胞(PBMCs)的分离的肝素采血管是在采血后使采血管充分摇晃，充分混合。然后，加入等量的(-)PBS并混合，使血液粘度降下后，向预先准备的注入有5ml Ficoll-Isopaque(F/I)密度梯度离心分离剂的15ml管中，以不与F/I混合的方式，将各5ml缓慢注入至F/I上表面并静置。在4℃以3,000转(1710G)将其离心分离30分钟，在F/I和血浆的边界处得到单核细胞层。自该位置抽吸采集PBMCs，加入(-)PBS后，在4℃以1200转(270G)实施15分钟的离心分离。重复该操作两次，除去上清液，然后加入适合于预定实验条件的培养液(RPMI-1640、AIM-V)，用于以下的实验中。
(培养液中的孵育)
4.将所得PBMCs调整为1×104/100μl，在96孔板(BDFalcon公司制造，96孔，洁净，经组织培养处理的培养板，平底)、或384孔板(BD Falcon公司制造，384孔，洁净，经组织培养处理的培养板，平底)的各孔中，根据实验计划将实验条件设为1组3孔，分别以1×104/100μl(/孔/96孔板或1×104/25μl/孔/384孔板)进行注入，结束细胞的接种。在单独使用培养液的情况下，在该孔中进一步注入100μl该培养液；关于5％AS的组、或使用各种添加药剂(LPS、IL-1α、IL-1β、棕榈酸(Palmitic Acid))的组，按计划进行浓度的分配而分别准备100μl的溶液并实施注入。将总培养液量设定为200μl/孔，在37℃、5％CO2条件下的培养箱中静置培养规定的时间，从而开始实验。
(培养液的除去：粘附性细胞的检测)
5.在培养开始1周后，从各孔抽吸除去培养液，向其中分别注入100μl的(-)PBS，将孔内充分洗涤后废弃，反复进行该操作两次。然后，再次注入100μl的(-)PBS，对各孔中的粘附性细胞，利用显微镜根据其形态学特征(大小、形状、细胞内颗粒的存在形式等)而区分出正常的PBMCs，算出细胞数。
算出1组3孔的细胞数后，算出其平均值和标准误差(均值±SE)。[这些实验历时约2年，在同一患者等中实施多次，尽管病期(第I～IV阶段)、病情(恶化、改善倾向)有变化，但只要存在癌症，则虽然在这些数据中可见获取的CTCs数减少，但常常整体上确认就针对药剂的反应而言具有重现性、显示相同倾向，故而作为正式数据加以采用。(参照各种数据)当然，对于视为癌症已治愈的阶段的患者，也判明了通过所述处理进行的粘附性癌细胞的检测成为1个以下。另外，从被认为是健康人的人体内检测不到该粘附性细胞。]
(通过荧光染色进行的CTSC的检测)
6.使用被认为是CTC(CTSC)的表面抗原的CD44、CD45、CD47、CKII、EpCAM等特异性抗体来结合预先通过所述处理得到的粘附细胞，然后利用FITC结合二抗进行染色，利用荧光显微镜观察。其结果是，证实了经所述处理获取的粘附性细胞为CTC(CTSC)(参见染色图像)。
(使用药剂的诱导效果的研究)
7.设定各种培养条件，对使用药剂的CTC(CTSC)诱导效果进行研究。关于所使用的各种药剂浓度等，记载于结果的表(Table)中。
(1)“培养液、添加药剂的研究I”：
对于培养液，关于CTC的分离获取，以作为外周血单核细胞的标准培养液的RPMI-1640培养液(以下记载为“RPMI-1640”)为基准，与无血清培养基AIM-V培养液(以下记载为“AIM-V”)进行比较。即，向这些培养液中分别添加5％的胎牛血清(FBS)或外周血提供者的自体血清(Autologous Serum：AS)或AB型血清并进行培养，研究所述各培养液间的CTC分离、获取的有无及效果。作为其结果，证实了AIM-V对于CTC的分取而言是有用的，并且AS的添加会增强其效果，AB型血清的效果较之AS血清而言略微减弱；等等。
(2)“培养液、添加药剂的研究II”：
进一步地，以前述培养液的结果为基础，为了避免因自体血清的采集而造成患者负担增加、并且排除根据受试者的各症状出现的血清成分变动所造成的影响、除去AB型血清所具有的本质上的不稳定性(例如不确定是否真的不是患癌患者的血清等)，对包括作为新的CTC分离获取因子的棕榈酸(Palmitic Acid)在内的各种候选添加成分(LPS、ConA、PHA、IL-1α、IL-1β)进行研究，实施对最安全且效率良好的因子的探索。在该研究过程中，虽然有时在LPS中也观察到若干CTC诱导效果，但由于LPS为具有极强毒性的物质，因此，鉴于CTC分离后的各种研究、临床应用的技术开发这样的目的，判断其在安全上不适合作为试剂，在以后的实验中将其排除。作为结果，确认了对于CTC的稳定分取而言，AIM-V培养液和棕榈酸(Palmitic Acid)的添加得到了最优的结果。
(供试试样)
8.本发明的实验中，关于供试试样，使用了由医院提供的来源于舌癌、下颚恶性肿瘤、恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、子宫肉瘤等晚期癌症患者的试样作为供试试样。
实施例2
[对于癌细胞(CTC)的获取而言高效的培养液的选定试验(I)]
<供试培养液>
作为供试培养液，准备并使用以下的培养液。
(1)RPMI-1640+5％FBS
(2)RPMI-1640+5％自体血清(Auto Serum)
(3)AIM-V(无血清培养基单独)
(4)AIM-V+5％FBS
(5)AIM-V+5％自体血清(Auto Serum)
<实验方法>
使用前述培养液，依照实施例1中记载的实验方法，对各培养液中的癌细胞(CTC)获取效率(癌细胞检测精度)进行试验。
(试验1：使用RPMI-1640的CTC诱导能力的研究)
使用RPMI-1640作为培养液，将其作为共用的培养液，将该培养液分为胎牛血清(FBS)添加组和自体血清(Auto Serum)添加组，针对自6名癌症患者采集的试样研究其有无CTC诱导能力。
<结果>
结果示于表1中。如表中所示，在RPMI-1640培养液中，自体血清添加组和FBS添加组之间癌细胞获取效率未见显著差异，获取效率均低。
表1
(试验2：使用RPMI-1640及棕榈酸(Plmitic Acid)的CTC诱导能力的研究)
作为培养液，使用向RPMI-1640中添加棕榈酸(Plmitic Acid)而得到的培养液，将其作为共用的培养液，将该培养液分为胎牛血清(FBS)添加组和自体血清(Auto Serum)添加组，针对自6名癌症患者采集的试样研究其有无CTC诱导能力。
<结果>
结果示于表2。如表中所示，在向RPMI-1640培养液中添加棕榈酸(Plmitic Acid)而得到的培养液中，自体血清添加组和FBS添加组之间除(*)之外在癌细胞获取效率上未见显著差异，两者的获取效率均低。
表2
(试验3：使用RPMI-1640及AIM-V的CTC诱导能力的研究)
比较研究了RPMI-1640培养液和AIM-V培养液之间CTC诱导能力的有无。对于RPMI-1640，分为胎牛血清(FBS)添加组和自体血清(Auto Serum)添加组这两组，针对自6名癌症患者采集的试样研究其有无CTC诱导能力。
<结果>
结果示于表3。如表中所示，AIM-V培养液为无血清的单纯培养液，与添加有胎牛血清(FBS)或自体血清(Auto Serum)的RPMI-1640培养液中的任一培养液相比，显示出更高的癌细胞获取效率。
表3
(试验4：向AIM-V培养液中添加FBS而得到的培养液的CTC诱导能力的研究)
研究在向AIM-V培养液中添加胎牛血清(FBS)的条件下的CTC诱导能力的有无。
<结果>
结果示于表4。如表中所示，在向AIM-V培养液中添加胎牛血清(FBS)的组中，显示了高的癌细胞获取效率，但在患者来源之间，在癌细胞获取效率方面确认到较大差异。
表4
(试验5：向添加有FBS的AIM-V培养液中添加棕榈酸(Plmitic Acid)而得到的培养液的CTC诱导能力的研究)
将向AIM-V培养液中添加胎牛血清(FBS)而得到的培养液作为共用培养液，针对该培养液作成棕榈酸(Plmitic Acid)添加组，在其与棕榈酸(Plmitic Acid)非添加组之间比较研究CTC诱导能力。
<结果>
结果示于表5。如表中所示，在棕榈酸(Plmitic Acid)非添加组中，与试验4的情况相同，在患者间可见CTC获取效率的差异，但即使在棕榈酸(Plmitic Acid)非添加组中CTC获取效率差的患者来源中，通过棕榈酸(Plmitic Acid)添加(组)，也确认到CTC获取效率的改善、增强。
表5
(试验6：单独的AIM-V培养液以及向AIM-V中添加自体血清(Auto Serum)而得到的培养液的CTC诱导能力的研究)
准备AIM-V培养液单独组、以及向AIM-V中添加了患者的自体血清(Auto Serum)的组，对两培养液之间的CTC诱导能力进行比较研究。
<结果>
结果示于表6。如表中所示，在向AIM-V中添加了患者的自体血清(Auto Serum)的组中，除了(*)的情况之外，大部分的患者来源中CTC获取效率升高。在任一情况下均确认到高的CTC获取效率。
表6
(试验7：向添加有自体血清(Auto Serum)的AIM-V培养液中添加棕榈酸(PlmiticAcid)而得到的培养液的CTC诱导能力的研究)
将向AIM-V培养液中添加患者自体血清(Auto Serum)而得到的培养液作为共用培养液，针对该培养液作成棕榈酸(Plmitic Acid)添加组，在其与棕榈酸(Plmitic Acid)非添加组之间比较研究CTC诱导能力。
<结果>
结果示于表7。如表中所示，在向AIM-V培养液中添加患者自体血清(Auto Serum)而得到的培养液的组中，在添加棕榈酸(Plmitic Acid)的组与不添加棕榈酸(PlmiticAcid)的组之间，CTC获取效率显示出两个对比倾向。即，在不添加棕榈酸时CTC获取效率高的患者来源中，添加棕榈酸(Plmitic Acid)时显示出降低的倾向。另一方面，在不添加棕榈酸时CTC获取效率低的患者来源中，确认到添加棕榈酸(Plmitic Acid)时CTC获取效率上升。
表7
(荧光显微镜的观察)
将利用荧光显微镜对在前述试验1及试验2中所研究的、由使用AIM-V培养液及RPMI-1640培养液的CTC获取试验得到的物质进行观察的结果(照片)示于图1中。图(1-a)显示使用AIM-V培养液的CTC获取的结果，图(1-b)显示使用RPMI-1640培养液的情况下的CTC获取的结果。在使用AIM-V培养液的情况下，可见大量CTC细胞，显示了CTC的诱导能力，而在使用RPMI-1640培养液的情况下，未见CTC细胞。
(综合评价)
由以上试验结果，得出以下的结论。
(i)在单独的RPMI-1640以及RPMI-1640+5％自体血清(Auto Serum)添加的两组中，未能以所接种的来自外周血的单核细胞(PBMC)数(1×104/孔)的0.1％以上的单位进行CTC的诱导·分离·获取。
(ii)在单独的AIM-V的情况下，能够在所接种的来自外周血的单核细胞(PBMC)的0.1～0.2％的范围内进行CTC的诱导·分离·获取。
(iii)在AIM-V+5％自体血清(Auto Serum)添加组中，CTC获取率增加至2.2～2.7％，是单独的AIM-V的情况下的14倍至20倍。
(iv)若在AIM-V中以50％的比例加入RPMI-1640，则CTC的获取率降低至与RPMI-1640+5％自体血清(Auto Serum)添加的组相同的百分比(％)。
(v)对于前述(iv)的倾向而言，即使在添加25％的RPMI-1640、添加12.5％的RPMI-1640时也是同样的，未观察到CTC的获取效果提高。
根据该试验结果确认到，作为用于CTC的诱导·分离·获取的培养液，AIM-V是有用的，通过向该培养液中添加自体血清(Auto Serum，AS)，可提高CTC的获取效果。
实施例3
[对于癌细胞(CTC)的获取而言高效的培养液的选定试验(II)-添加物的影响]
<供试培养液>
作为供试培养液，准备并使用以下的培养液。
(1)AIM-V(无血清培养基)
(2)AS(Auto Serum：自体血清)
(3)LPS(脂多糖)
(4)IL-1α(白介素1α)
(5)IL-1β(白介素1β)
(6)棕榈酸
<实验方法>
使用前述培养液，依照实施例1中记载的实验方法，将所准备的癌症患者外周血单核细胞(PBMCs)接种于各孔中，针对添加物对于各培养液中的癌细胞(CTC)获取效率(癌细胞检测精度)的影响进行试验。
(试验8：AIM-V培养液中添加LPS的影响)
以AIM-V培养液(AIM-V：组A)为基础，作成向其中添加AS(自体血清)的组(AIM-V+AS：组B)，进一步地，在这些组中使LPS(脂多糖)的基础浓度为1conc.(组E、F)，作成分别添加有0.1conc.～100conc.的浓度的各组(组GH、GD)。然后，研究这些组之间的CTC分取效果。
<结果>
结果示于表8中。如表中所示，对于向AIM-V培养液中添加LPS的组而言，在LPS添加量少的组中观察到比单独的AIM-V更有效，而对于AIM-V+AS组的LPS添加组而言，在任意LPS浓度的添加组中，CTC的分取效率均骤减。
表8：添加LPS的影响
(试验9：AIM-V培养液中添加IL-1α的影响)
以AIM-V培养液(AIM-V：组A)为基础，作成向其中添加AS(自体血清)的组(AIM-V+AS：组B)，进一步地，在这些组中使IL-1α(白介素1α)的基础浓度为1conc.(组E、F)，作成分别添加有0.1conc.～100conc.的浓度的各组(组GH、GD)。然后，研究这些组之间的CTC分取效果。
<结果>
结果示于表9。如表中所示，对于向AIM-V培养液中添加IL-1α的组而言，无论IL-1α的添加量是多少，均仅确认到与单独的AIM-V相同或低于其的效果(组C、E、G)。对于AIM-V+AS组的IL-1α添加组而言，在任意IL-1α浓度的添加组中，较之非添加组而言CTC的获取效率均减少。
表9：添加IL-1α的影响
均值±SE
A AIMV 19.3±0
B AIMV+AS 32±5
C AIMV+IL-1α(x10conc.) 20±2
D AIMV+AS+IL-1α(x10conc.) 30±4
E AIMV+IL-1α(x1conc.) 6.3±0
F AIMV+AS+IL-1α(x1conc.) 12.7±0
G AIMV+IL-1α(x0.1conc.) 15.3±3
H AIMV+AS+IL-1α(x0.1conc.) 24.7±6
(试验10：AIM-V培养液中添加IL-1β的影响)
以AIM-V培养液(AIM-V：组A)为基础，作成向其中添加AS(自体血清)的组(AIM-V+AS：组B)，进一步地，在这些组中使IL-1β(白介素1β)的基础浓度为1conc.(组E、F)，作成分别添加有0.1conc.～100conc.的浓度的各组(组GH、GD)。然后，研究这些组之间的CTC分取效果。
<结果>
结果示于表10。如表中所示，对于向AIM-V培养液中添加IL-1β的组中而言，与IL-1β的添加量相应地，仅确认到与单独的AIM-V相同或略微上升的程度的效果(组C、E、G)。对于AIM-V+AS组的IL-1β添加组而言，在任意IL-1β浓度的添加组中，均仅确认到与非添加组相同程度的CTC获取效率。
表10：添加IL-1β的影响
均值±SE
A AIMV 31±1
B AIMV+AS 41±2
C AIMV+IL-1β(x10conc.) 41±2
D AIMV+AS+IL-1β(x10conc.) 37±2
E AIMV+IL-1β(x1conc.) 35±1
F AIMV+AS+IL-1β(x1conc.) 40±2
G AIMV+IL-1β(x0.1conc.) 27±2
H AIMV+AS+IL-1β(x0.1conc.) 31±9
(试验11：AIM-V培养液中添加棕榈酸的影响)
以AIM-V培养液(AIM-V：组A)为基础，作成向其中添加AS(自体血清)的组(AIM-V+AS：组B)，进一步地，在这些组中使棕榈酸的基础浓度为1conc.(组G、H)，作成分别添加有0.25conc.～4conc.的浓度的各组(组KL、IJ、GH、EF、CD)。然后，研究这些组之间的CTC分取效果。
<结果>
结果示于表11中。如表中所示，对于向AIM-V培养液中添加棕榈酸的组而言，与棕榈酸的添加量几乎无关地，较之非添加组相而言确认到CTC获取效率提高2～3倍(组C、E、G、I、K)。对于AIM-V+AS组的棕榈酸添加组而言，在任意棕榈酸浓度的添加组中均未见到浓度依赖性，仅确认到与非添加组相同程度或其以下的CTC获取效率。
表11：添加棕榈酸的影响
均值±SE
A AIMV 45.3±3
B AIMV+AS 192±12
C AIMV+棕榈酸(x4conc.) 95.3±2
D AIMV+AS+棕榈酸(x4conc.) 123.3±8
E AIMV+棕榈酸(x2conc.) 142.7±19
F AIMV+AS+棕榈酸(x2conc.) 182.7±15
G AIMV+棕榈酸(x1conc.) 99.7±3
H AIMV+AS+棕榈酸(x1conc.) 184.7±30
I AIMV+棕榈酸(x0.5conc.) 112.3±21
J AIMV+AS+棕榈酸(x0.5conc.) 194.7±20
K AIMV+棕榈酸(x0.25conc.) 97.3±11
L AIMV+AS+棕榈酸(x0.25conc.) 176.7±37
(综合评价)
从以上的试验结果得到了以下的结论：对通过向AIM-V培养液中加入添加成分来提高CTC获取效果的方案进行研究，并对包括作为新的CTC分离获取因子的棕榈酸(Palmitic Acid)在内的各种候选添加成分(LPS、ConA、PHA、IL-1α、IL-1β)进行研究，实施对最安全且效率良好的因子的探索，其结果是，确认了对于CTC的稳定分取而言，向AIM-V培养液中添加棕榈酸(Palmitic Acid)时可得到最良好的结果。需要说明的是，在该研究经过中，虽然有时在LPS中也观察到若干CTC诱导效果，但由于LPS是具有极强毒性的物质，因此，鉴于CTC分离后的各种研究、临床应用的技术开发这样的目的，判断其在安全上不适合作为试剂，在以后的实验中将其排除。
实施例4
[利用CTC增殖用培养液得到的癌细胞(CTC)的形态变化的确认]
通过实施例1的试验方法，通过显微镜图像对在实施例2中使用CTC增殖用培养液获取的癌细胞(CTC)的形态变化进行验证。显微镜照片示于图2～7。各图中，(图-a)、(图-b)表示针对不同患者的CTC研究由CTC细胞增殖实验中的培养条件(即，基于增殖用培养液和血清、或棕榈酸等因子的有无、浓度等的培养条件)导致的CTC形态特征的结果(来自不同患者的癌细胞(CTC)的显微镜照片)。该实验的目的为研究因各增殖条件的不同而引起的CTC细胞的形态学差异呈现的有无，(a)、(b)用于针对来自不同患者的情况，验证即使来自不同患者、在同一培养条件下也显示出相同细胞形态。
对于供试培养液的浓度，棕榈酸(Palmitic Acid)浓度如下表12所示。
表12
<1.用AIM-V培养液单独培养·获取的CTC的形态变化的观察>
用AIM-V培养液单独培养·获取的CTC的荧光显微镜图像如图2(2-a；2-b)所示。在用AIM-V培养液单独培养·获取的CTC的细胞形态中，在细胞质内的核、颗粒成分方面未特别见到大小异常或浓染的部分。
<2.向AIM-V培养液中添加棕榈酸(×1conc.)并进行培养而获取的CTC的形态变化的观察>
添加AIM-V培养液+棕榈酸(×1conc.)并进行培养而获取的CTC的荧光显微镜图像如图3(3-a；3-b)所示。在添加AIM-V培养液+棕榈酸(×1conc.)而培养·获取的CTC的细胞形态中，对于细胞质内的核、颗粒成分而言，与棕榈酸非添加组的情况相比，虽然稍见核成分的增加，但并未特别见到大小的扩大或浓染的部分。
<3.向AIM-V培养液中添加棕榈酸(×4conc.)并进行培养而获取的CTC的形态变化的观察>
添加AIM-V培养液+棕榈酸(×4conc.)并进行培养而获取的CTC的荧光显微镜图像如图4(4-a；4-b)所示。在添加AIM-V培养液+棕榈酸(×4conc.)而培养·获取的CTC的细胞形态中，可见细胞大小的扩大、融合倾向(图4-b)，对于细胞质内的核、颗粒成分而言，与棕榈酸非添加组(图2-a；2-b)、棕榈酸(×1conc.)添加组(图3-a；3-b)的情况相比，观察到核成分、细胞质内的核、颗粒成分的显著增加、浓染。
<4.在AIM-V+5％自体血清培养液中进行培养而获取的CTC的形态变化的观察>
在AIM-V+5％自体血清培养液中进行培养而获取的CTC的荧光显微镜图像如图5(5-a；5-b)所示。对于在AIM-V+5％自体血清培养液中进行培养而获取的CTC的细胞形态而言，在细胞、细胞质内的核、颗粒成分方面未特别见到大小异常或浓染的部分。
<5.在AIM-V+5％自体血清+棕榈酸(×1conc.)条件下的培养液中进行培养而获取的CTC的形态变化的观察>
在AIM-V+5％自体血清+棕榈酸(×1conc.)培养液中进行培养而获取的CTC的荧光显微镜图像如图6(6-a；6-b)所示。对于在AIM-V+5％自体血清+棕榈酸(×1conc.)培养液中进行培养而获取的CTC的细胞形态而言，在细胞、细胞质内的核、颗粒成分方面未特别见到大小异常或浓染的部分。
<6.在AIM-V+5％自体血清+棕榈酸(×4conc.)的条件下的培养液中进行培养而获取的CTC的形态变化的观察>
在AIM-V+5％自体血清+棕榈酸(×4conc.)培养液中进行培养而获取的CTC的荧光显微镜图像如图7(7-a；7-b)所示。对于在AIM-V+5％自体血清+棕榈酸(×4conc.)培养液中进行培养而获取的CTC的细胞形态而言，可见细胞大小的扩大、融合倾向(图7-a)，就细胞质内的核、颗粒成分方面与棕榈酸非添加组(图5-a；5-b)、×1conc.添加组(图6-a；6-b)相比，观察到核成分、细胞质内颗粒成分的显著增加、浓染。认为该形态变化的原因在于在棕榈酸(×4conc.)培养液的条件下、通过CTC细胞的增殖·活化而使核的异常增殖和细胞内细胞器、线粒体(其为能量产生的主要结构)等增加，认为其结果是，在显微镜图像中，核酸、细胞内颗粒增加，核、细胞质进一步妨碍光的透过性，从而观察到浓染的状态。
(综合评价)
由以上的CTC(CTSC)的形态变化的试验结果，得到了如下结论：通过使用AIM-V培养液或向该培养液中添加自体血清和/或棕榈酸等添加成分而得到的CTC增殖培养液对CTC进行增殖获取，能够可靠且有效地获取CTC，此时确认了能在CTC的细胞形态不发生形态变化的情况下增殖获取。即，在增殖、获取CTC(CTSC)的情况下，为了确认CTC的性质、特性，重要的是不诱导所获取细胞的形态发生人工变化，因此，需求在不诱导CTC的形态、性状发生特别变化的条件下进行、并且能够稳定地增殖、获取CTC的方法。由前述实验结果确认到，本发明的方法是满足该条件、并且能够可靠地增殖、获取CTC(CTSC)的方法。
实施例5
[使用所获取的CTC的细胞膜抗原进行的确认及鉴定]
如以下实施例所示，针对自各患者外周血分离获取的CTC，使用膜表面的CD44、CD45、CD47、CKII、EpCAM的各抗原，利用荧光抗体染色法进行确认及鉴定。在各试验中的结果的各图的照片中，各(图-a)表示CTC的显微镜照片的图像，各(图-b)表示使用膜表面抗原进行染色的荧光显微镜照片图像。
<抗原染色方法>
抗原染色方法是利用FITIC(异硫氰酸荧光素，fluorescein isothiocyanate)标记按以下的步骤制备试样，并进行染色、显微镜检查、观察·照片拍摄。
(I.各种外周血分离细胞的制备、及利用FITC标记一抗进行的抗原染色)
(1)粘附细胞的酶处理。(非粘附细胞自(4)开始。)
(2)胰蛋白酶EDTA处理。
(3)向单细胞群中加入添加有5％FBS的RPMI培养基，使酶反应停止，并进行抽吸。
(4)离心分离(1200～1500转、4℃、7分钟)。
(5)在保持4℃冷却的条件下，用(-)PBS洗涤·涡旋，离心×2次。
(6)细胞数的测量·分注：1×106/100μl/管。
(7)为了遮光而用铝箔覆盖细胞的各管周围，在保持4℃冷却的条件下放置30分钟，使细胞的代谢活动降低(阻止表面抗原向细胞膜内外运动·移动)。
(8)抗体的添加：对于1μg/2μl/1×106个快速离心(spin down)细胞(除去培养基的细胞群)，在保持4℃冷却·遮光的条件下染色1小时。
(9)在保持4℃冷却的条件下，用(-)PBS洗涤·涡旋，离心×2次：离心分离(1200～1500转、4℃、7分钟)。
(10)向细胞中加入适量的(-)PBS，添加至载玻片或培养板上，并进行显微镜检查。
(11)利用荧光显微镜进行观察·照片拍摄。
(II.各种外周血分离细胞的制备及针对各抗原的一抗染色、接下来的利用FITC标记二抗进行的抗原染色)
(1)粘附细胞的酶处理。(非粘附细胞从(4)开始。)
(2)胰蛋白酶EDTA处理。
(3)向单细胞群中加入添加有5％FBS的RPMI培养基，使酶反应停止，并进行抽吸。
(4)离心分离(1200～1500转、4℃、7分钟)。
(5)在保持4℃冷却的条件下，用(-)PBS洗涤·涡旋，离心×2次。
(6)细胞数的测量·分注：1×106/100μl/管。
(7)为了遮光而用铝箔覆盖细胞的各管周围，在保持4℃冷却的条件下放置30分钟，使细胞的代谢活动降低(阻止表面抗原向细胞膜内外运动·移动)。
(8)一抗的添加：对于1μg/2μl/1×106个快速离心细胞(除去培养基的细胞群)，在保持4℃冷却·遮光的条件下染色1小时。
(9)在保持4℃冷却的条件下，用(-)PBS洗涤·涡旋，离心×2次：离心分离(1200～1500转、4℃、7分钟)。
(10)二抗的添加：对于1μg/2μl/1×106个快速离心细胞(除去培养基的细胞群)，在保持4℃冷却·遮光的条件下染色1小时。
(11)在保持4℃冷却的条件下，用(-)PBS洗涤·涡旋，离心×2次：离心分离(1200～1500转、4℃、7分钟)。
(12)向细胞中加入适量的(-)PBS，添加至载玻片或培养板上，并进行显微镜检查。
(13)利用荧光显微镜进行观察·照片拍摄。
实施例6
[使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定]
通过实施例1的方法，对于自各患者的外周血获取的CTC，利用膜抗原CD44进行该CTC的确认及鉴定。
<使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定(I)>
图8～10显示自3名患者：(1)K.H.(Gastric Ca.：胃癌；liver meta.：肝转移)、(2)T.K.(Tongue Ca.：舌癌)、(3)K.H.(Gastric Ca.：胃癌；liver meta.：肝转移)的外周血获取的CTC的显微镜照片的图像、以及使用膜抗原CD44的荧光抗体显微镜的照片。(图8-a～10-a)显示显微镜照片的图像，(图8-b～10-b)显示荧光抗体显微镜的照片。如照片所示，从前述(1)～(3)的患者获取的CTC未显示由CD44导致的染色。
<使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定(II)>
图11～13显示自3名患者：(1)T.K.(Tongue Ca.：舌癌)、(2)S.K.(Kerato-cysticCa.：角化囊性瘤)、(3)S.O.(Lung Ca.：肺癌)的外周血获取的CTC的显微镜照片的图像、以及使用膜抗原CD44的荧光抗体显微镜的照片。(图12-a～13-a)显示显微镜照片的图像，(图12-b～13-b)显示荧光抗体显微镜的照片。如照片(图12～13)所示，从前述(2)～(3)的患者获取的CTC显示由CD44导致的染色，显微镜照片的图像和荧光抗体显微镜的照片一致，确认了所获取的CTC为前述癌的CTC。
<使用膜抗原CD44进行的CTC的确认及鉴定(III)>
图14～15显示自2名患者：(1)H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)、(2)Y.H.(Lung Ca.：肺癌)的外周血获取的CTC的显微镜照片的图像、以及使用膜抗原CD44的荧光抗体显微镜的照片。(图14-a～15-a)显示显微镜照片的图像，(图14-b～15-b)显示荧光抗体显微镜的照片。如照片(图14～15)所示，自前述(1)～(2)的患者获取的CTC显示由CD44导致的染色，显微镜照片的图像和荧光抗体显微镜的照片一致，确认了所获取的CTC为前述癌的CTC。
实施例7
[使用膜抗原CD45进行的CTC的确认及鉴定]
通过实施例1的方法，对于自各患者的外周血获取的CTC，使用膜抗原CD45进行该CTC的确认及鉴定。
图16～18显示自2名患者：(1)H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)、(2)Y.H.(Lung Ca.：肺癌)的外周血获取的CTC的显微镜照片的图像、以及使用膜抗原CD45的荧光抗体显微镜的照片。(图16-a～18-a)显示显微镜照片的图像，(图16-b～18-b)显示荧光抗体显微镜的照片。如照片(图16～18)所示，自前述(1)～(2)的患者获取的CTC显示由CD45导致的染色，显微镜照片的图像和荧光抗体显微镜的照片一致，确认了所获取的CTC为前述癌的CTC。在CTC(CTSC)的显微镜照片中，以箭头表示CTSC细胞的存在。在各照片组(照片1-3：图16～18)中，在左侧的显微镜照片中可见的CTC(CTSC)中，如右侧的荧光显微镜图像可见，显示了大部分的细胞为CD45阳性CTSC细胞。如双向箭头所示，对于这些CD45阳性CTSC细胞而言，其形态、大小均具有多样性，可知其并非利用一个指标就能进行判别的细胞。
实施例8
[使用膜抗原CD47进行的CTC的确认及鉴定]
通过实施例1的方法，对于自各患者的外周血获取的CTC，使用膜抗原CD47进行该CTC的确认及鉴定。
图19～23显示自5名患者：(1)G.N.(Breast Ca.：乳腺癌；multiple metastasis：多发转移性)、(2)S.K.(Kerato-cystic Ca.：角化囊性瘤)、(3)S.O.(Lung Ca.：肺癌)、(4)H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)、(5)Y.H.(Lung Ca.：肺癌)的外周血获取的CTC的显微镜照片的图像、以及使用膜抗原CD47的荧光抗体显微镜的照片。(图19-a～23-a)显示显微镜照片的图像，(图19-b～23-b)显示荧光抗体显微镜的照片。如照片(图19～23)所示，自前述(1)～(5)的患者获取的CTC显示由CD47导致的染色，显微镜照片的图像和荧光抗体显微镜的照片一致，确认了所获取的CTC为前述癌的CTC。各图的照片中，箭头显示CD47阳性CTSC。白色箭头所示的CTSC表示在作为CTC(CTSC)而增殖培养的癌细胞中显示CD47阳性的CTSC，表明无论细胞的大小、形态的大小如何均可观察到。即，确认了CD47阳性CTSC并非具有特定形态、大小的细胞，具有各种变化。
实施例9
[使用膜抗原CKII进行的CTC的确认及鉴定]
通过实施例1的方法，对于自各患者的外周血获取的CTC，利用膜抗原CKII进行该CTC的确认及鉴定。
图24～25显示自2名患者：(1)H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)、(2)Y.H.(Lung Ca.：肺癌)的外周血获取的CTC的显微镜照片的图像、以及使用膜抗原CKII的荧光抗体显微镜的照片。(图24-a～25-a)显示显微镜照片的图像，(图24-b～25-b)显示荧光抗体显微镜的照片。如照片(图24～25)所示，自前述(1)～(2)的患者获取的CTC显示由CKII导致的染色，显微镜照片的图像和荧光抗体显微镜的照片一致，确认了所获取的CTC为前述癌的CTC。
实施例10
[使用膜抗原EpCAM进行的CTC的确认及鉴定]
通过实施例1的方法，对于自各患者的外周血获取的CTC，使用膜抗原EpCAM进行该CTC的确认及鉴定。
图26显示自患者：(1)H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)的外周血获取的CTC的显微镜照片的图像、以及使用膜抗原EpCAM的荧光抗体显微镜的照片。(图26-a)显示显微镜照片的图像，(图26-b)显示荧光抗体显微镜的照片。如照片(图26)所示，对于自前述患者获取的CTC而言，仅确认到极少数的在细胞膜上表达EpCAM的细胞。
实施例11
[裸鼠中的CTC的致肿瘤性或长期生存的研究]
为了研究通过实施例1的方法自患者的外周血获取的CTC是否保持CTC细胞机能，对所获取的CTC的致肿瘤性或长期生存进行确认。
<试验方法>
将从来自患者H.Y.(Breast Ca.：乳腺癌)的试样分离的CTC：CTC-HY-1(HY-1)、和从患者K.H.(Gastric Ca.：胃癌；liver meta.：肝转移)分离的CTC：CTC-KH-1(KH-1)分为“实验组A”和“实验组B”两个实验组，如以下所述对自患者增殖分离采集的CTC进行移植。
(实验组A)：对于2只裸鼠(Nude1-1；Nude1-2)，在裸鼠“Nude1-1”的背部皮下移植1×106个CTC(HY-1)，在裸鼠“Nude1-2”的背部皮下移植1×106个CTC(KH-1)，研究三个月的整体观察期间内有无致肿瘤性。在此期间后，采集该裸鼠的外周血和脾脏，实施CTC的分离、培养。针对增殖的CTC移植组中残存的细胞，通过使用非荧光发光图像(对照)及膜表面CD45抗原的荧光抗体法进行染色研究，对CTC的残存加以确认，从而确认残存的活细胞为所移植的CTC。
(实验组B)：对于2只裸鼠(Nude2-1；Nude2-2)，在裸鼠“Nude2-1”的背部皮下移植1×106个CTC(HY-1)，在裸鼠“Nude2-2”的背部皮下移植1×106个CTC(KH-1)，向腹腔内也移植等量的细胞。与实验组A的情况同样地，针对增殖的CTC移植组中残存的细胞，确认残存的活细胞为所移植的CTC。
<结果>
图27～30显示CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(非荧光发光图像)的图像、以及使用膜抗原CD45的荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片。图中，(27-a)、(27-b)表示将CTC(HY-1)移植至“Nude1-1”的情况下的CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(对照)以及荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片，(28-a)、(28-b)表示将CTC(KH-1)移植至“Nude1-2”的情况下的CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(对照)以及荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片。图中，(29-a)、(29-b)显示将CTC(HY-1)移植至“Nude2-1”的情况下的CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(对照)以及荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片，(30-a)、(30-b)显示将CTC(KH-1)移植至“Nude2-2”的情况下的CTC移植组中残存的细胞的显微镜照片(对照)以及荧光抗体显微镜(荧光发光图像)的照片。如照片(图27～30)所示，CTC移植组中残存的细胞显示由膜抗原CD45导致的染色，与显微镜照片的图像一致，确认了CTC移植组中残存的细胞为前述癌的CTC。作为参考，示出正常小肠组织细胞的显微镜照片的图像(31-a)以及该细胞通过CD45染色的荧光显微镜照片的图像(31-b)。如图31所示，正常小肠组织细胞中完全没有显示由CD45导致的染色。
实施例12
[使用建立的癌细胞株(UTC-8)进行的CD47阳性细胞(CTSC)的检测(I)]
使用现有的建立的癌细胞株(UTC-8：独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心保藏编号：FERM BP-08611)，针对该建立的癌细胞株中的CD47阳性细胞(CTSC)的检测进行试验。
<试验方法>
使用建立的癌细胞株(UTC-8)作为试样，通过实施例1的方法增殖获取CTC细胞后，通过细胞膜上的CD47抗原对该抗原阳性细胞进行检测。以非荧光色素染色的显微镜图像以及由荧光色素染色法得到的CD47阳性细胞图像示出结果。
结果如图32所示。图32中，(32-a)表示非荧光色素染色的显微镜图像，(32-b)表示由荧光色素染色法得到的CD47阳性细胞图像。图中，粗箭头表示CD47阳性的CTSC，双向箭头(←→)表示CD47非阳性的、细胞的大小和形态均不同的CTC癌细胞。其结果是，对于超过20年及经形态培养的大部分的癌细胞而言，如本显微镜的视野(×200倍)所见，观察到CD47阳性CTSC为极少数。另外，癌细胞的形态或形状为圆形、纺锤形及与之接近的形态或形状，由此也表明大部分为不显示上下及左右对称性的不规则形态的细胞。另一方面，对于CD47阳性CTSC而言，判明其形状为树突状细胞样、呈现为突出有不规则突起的特异形状。
实施例13
[使用建立的癌细胞株(UTC-8)进行的CD47阳性细胞(CTSC)的检测(II)]
与实施例12的情况同样地，使用现有的建立的癌细胞株(UTC-8：FERM BP-08611)，再次针对该建立的癌细胞株中的CD47阳性细胞(CTSC)的检测进行试验。
<试验方法>
与实施例12的情况同样地，使用建立的癌细胞株(UTC-8)作为试样，通过实施例1的方法增殖获取CTC细胞后，利用细胞膜上的CD47抗原对该抗原阳性细胞进行检测。以非荧光色素染色的显微镜图像及由荧光色素染色法得到的CD47阳性细胞图像示出结果。
结果如图33所示。图33中，(33-a)显示非荧光色素染色的显微镜图像，(33-b)显示由荧光色素染色法得到的CD47阳性细胞图像。图中，粗箭头表示CD47阳性的CTSC，双向箭头(←→)表示CD47非阳性的、细胞的大小和形态均不同的CTC癌细胞。作为结果，得到了与实施例12的情况相同的结果。即，在该建立的癌细胞株(UTC-8)中，如本显微镜的视野(×200倍)所见，观察到CD47阳性CTSC为极少数。另外，癌细胞形态或形状为圆形、纺锤形及与之接近的形态或形状，由此也表明大部分为不显示上下及左右对称性的不规则形态的细胞。另一方面，对于CD47阳性CTSC而言，判明其形状为树突状细胞样、呈现为突出有不规则突起的特异形状，鲜明地确认了该形态的特征。
产业上的可利用性
本发明提供一种CTC的检测·分离获取方法，所述方法能够在血液、淋巴液等生物体循环体液中可靠且稳定地检测·分离获取微量存在的循环肿瘤细胞及循环肿瘤干细胞，即使是在无法确定该肿瘤细胞为何种癌细胞的状态下、并且该肿瘤细胞在生物体循环体液中微量存在的状态下亦能可靠且稳定地检测·分离获取。本发明的CTC的检测·分离获取方法不仅限于CTC、也可进行CTSC的检测·分离，为癌的基础性阐明、临床应对提供有力的手段。

Claims (7)

1.生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其包括以下(1)～(4)的处理步骤：
(1)第1步骤，对来自生物体循环体液的试样进行预处理，得到单核细胞相；
(2)第2步骤，准备向孔板中注入了培养液而得到的孔板，接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育，所述培养液中包含循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞增殖用无血清培养基；
(3)第3步骤，从经第2步骤孵育而得的板孔除去培养液；
(4)第4步骤，在第3步骤后，对粘附至板孔的粘附性肿瘤细胞进行检测、或进行分离获取。
2.如权利要求1所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，用于在第2步骤中接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育的、包含循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞增殖用无血清培养基的培养液为：以AIM-V培养液为基础的培养液。
3.如权利要求1或2所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，用于在第2步骤中接种第1步骤中得到的单核细胞并进行孵育的、以AIM-V培养液为基础的培养液为：AIM-V培养液；或者在AIM-V培养液中添加选自受试者的自体血清、来自健康人的AB血清及棕榈酸或其盐中的1种或2种以上而得到的培养液。
4.如权利要求1～3中任一项所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，来自生物体循环体液的试样为来自外周血的血液试样。
5.如权利要求1～3中任一项所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，第1步骤的来自生物体循环体液的试样的预处理为除去生物体循环体液中所包含的液体成分及非细胞成分。
6.如权利要求1～5中任一项所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，第2步骤中的孵育是将37℃、3～7天作为增殖温度及增殖期间的基准条件而进行的。
7.如权利要求6所述的生物体循环体液中的循环肿瘤细胞和/或循环肿瘤干细胞的检测·分离获取方法，其特征在于，第2步骤中的孵育是在调节为5％CO2的培养箱内进行的。
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