WO2017149564A1 - 細胞増殖法を用いた循環腫瘍細胞の検出・分離取得方法 - Google Patents

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    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to human biological tissue, that is, circulating body fluid typified by peripheral blood, or tumor (cancer) cells that enter the circulating body fluid from various internal organs such as bone marrow and spleen through this body fluid.
  • the present invention relates to a method for detecting / separating circulating tumor cells (CirculatingumTumorsCells: CTC) and circulating tumor (cancer) stem cells (Circulating Tumor Stem Cells: CTSC), particularly in a biological circulating body fluid such as blood and lymph.
  • the present invention relates to providing a method for detecting / separating and obtaining circulating tumor cells (CTC) and circulating tumor stem cells (CTSC) that can be detected / separated and acquired.
  • CTC circulating tumor cells
  • CTC circulating tumor stem cells
  • Cancer diseases are at the top of mortality from diseases in developed countries. In particular, in Japan, although there is a downward trend in statistics such as age-adjusted morbidity and mortality, the degree of contribution to cancer development and death of chronic diseases such as aging and diabetes is high. One person is affected by cancer, and one in three people die of cancer (Estimated using the method by Wum LM et al., Estimating lifetime and age-conditional probabilities of developing cancer, Lifetime Data Anal., 1998, 4: 169-186.).
  • the proliferated cancer cells are bound by an adhesion factor to form a tumor tissue.
  • the cancer cells are not limited to the primary lesion, but are released from the primary lesion due to abnormalities or disappearance of adhesion factors, and the connective tissue, blood vessels, and lymphatic vessel walls surrounding the cancer cells are decomposed in the blood, Infiltrate into the lymph.
  • Cancer cells that have infiltrated into the body fluid circulate in the body as circulating tumor cells (CTC) together with blood circulating in the body and lymph fluid.
  • CTC circulating tumor cells
  • the CTC is transported to other tissues and organs by circulation of blood and the like, and enters the other tissues and organs from blood vessels and the like, newly synthesizes an adhesion factor, and settles to form a metastatic focus. Circulation in the body and formation of metastasis of CTC are considered to be a mechanism of cancer metastasis and are considered to be involved in cancer recurrence and metastasis.
  • CTC analysis is extremely important as a means for that. It is attracting attention as a major factor. CTC analysis is also considered important in predicting cancer recurrence and evaluating cancer treatment effects, and has been reported to be an effective means for predicting prognosis and determining treatment effects.
  • CTC circulating in blood etc. has a very low presence level, and the half-life of cancer cells circulating in blood is as short as 1 to 24 hours. It is extremely difficult to detect CTCs present in body fluids. For example, the separation of CTC from peripheral blood is inefficient, and the 2012 World Collaborative Research 19 report (J Translational-medicine 2012, 10: 138: 1-20.) It has been reported that 1/10 8 , that is, only one can be taken from 100 ml of blood. In terms of an adult with a body weight of 60 kg, this means that even if a total amount of about 5 liters (5000 ml) of whole peripheral blood is collected, only a very small number of CTCs can be collected with an extremely low probability of 50. This fact has been the biggest impediment to CTC research (J Translational-medicine 2012, 10: 138: 1-20.).
  • CTC detection / measurement technology has been improved, and detection sensitivity and measurement accuracy have been improved by the advancement of detection / measurement technology, and only a few hundred thousand to 100 million mononuclear cells in blood can be detected. It has become possible to specifically detect several cancer cells. And it has come to be accepted as a test that can provide clinical information such as prognosis prediction and treatment effect determination in metastatic cancers such as breast cancer, colon cancer, and prostate cancer.
  • US FDA Food and Drug Administration
  • the current CTC detection / measurement technology has to be a detection / measurement technology limited to a specific CTC, such as when a target cancer cell has been identified, and there is a wide range. No CTC detection / measurement technology applicable to cancer cells has been found yet.
  • an immunomagnetic separation detection method As a method for detecting CTC that is widely used at present, an immunomagnetic separation detection method is known (Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 95: 4589-4594,1998; WO99 / 41613; Special Table 2002). No. 503814).
  • This method uses magnetic beads to which a monoclonal antibody against epithelial cancer cell epithelial cell adhesion molecule (Epithelial cell adhesion molecule: EpCAM, "CD326”) is immobilized, and CTC epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) in a sample is obtained.
  • EpCAM epithelial cell adhesion molecule
  • an immunomagnetic target CTC derived from a body fluid is labeled with a fluorescent chromophore, and the labeled cells are subjected to Time-delayed integrating in which a beam homogenizer is introduced.
  • a method and apparatus for quickly and accurately detecting rare CTCs in blood by scanning and acquiring two-dimensionally distributed images of CTCs by imaging (TDI) technology are disclosed.
  • JP 2007-178193 A and JP 2012-103077 A disclose cancer cells captured on magnetic beads immobilized by an epithelial cell surface antigen (EpCAM) specific antibody, and the surface antigen.
  • EpCAM epithelial cell surface antigen
  • FISH fluorescent in ⁇ situ hybridization
  • JP-A-2014-105159 discloses the concentration of CTC using magnetic beads immobilized with a monoclonal antibody (first antibody) against human-derived epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), and different epitopes specifically.
  • a monoclonal antibody first antibody
  • EpCAM human-derived epithelial cell adhesion molecule
  • second antibody fluorescently labeled anti-EpCAM monoclonal antibody
  • ⁇ iCeap method is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • cytokeratin (CK) marker that is a specific marker for epithelial cells and Wright-Giemsa dye.
  • CK cytokeratin
  • Wright-Giemsa dye a cytological dye that identifies CTCs by nuclear-to-cytoplasmic ratio. Cormorants method is disclosed.
  • JP-A-2014-39480 provides a culture surface containing a urokinase (urokinase-type plasminogen activator: uPA) -specific fluorescent substrate for the detection of EpCAM-negative CTCs.
  • a method of separating and recovering CTC by detecting a signal derived from a urokinase-specific substrate by seeding and incubating a blood sample on the surface is disclosed.
  • CTC cell markers cell surface specific antigens
  • monoclonal antibodies that specifically bind to the cell antigens.
  • the CTC detection / measurement technology can be applied when a target cancer such as breast cancer, colon cancer, prostate cancer, etc. has been identified.
  • a target cancer such as breast cancer, colon cancer, prostate cancer, etc.
  • a method for detecting and measuring CTC a method for detecting CTC without using a CTC cell marker (specific antigen on the cell surface) or a monoclonal antibody that specifically binds to the cell antigen is also disclosed.
  • CTC contained in a blood sample is captured by a size-selective microcavity array having fine through-holes with controlled hole diameter, number of holes, and arrangement for CTC capture.
  • CTC concentration from blood, CTC staining and washing processes are consistently performed within one device, and CTC detection and detection can be performed quickly using an automated fluorescent microscope.
  • a measurement method is disclosed.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2013-36818 discloses that a body fluid containing tumor cells is made of polyester fiber, polypropylene fiber or the like having a density of 2.0 ⁇ 10 4 to 1.9 ⁇ 10 5 and a fiber diameter of 1 ⁇ m to 15 ⁇ m.
  • a blood cell separator made of a molded non-woven fabric, tumor cells and leukocytes and platelets are captured, and the fraction rich in tumor cells in the captured body fluid is obtained from physiological saline, buffer solution, dextran, etc.
  • a method of separating and recovering using the separated liquid is disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-224800 has a main body and a cover that form a gap, and the gap forms a separation element that separates the inlet region and the outlet region of the gap. Defining a channel with the surface of the gap and, for particles passing through the channel, by blocking the passage of smaller particles and the passage of larger particles, CTCs that are larger particles and blood spheres that are smaller particles A separation method, such as CTC, for separating the components is disclosed. These CTC separation / detection methods physically separate and detect CTCs present in body fluids, and specifically bind to CTC cell markers (cell surface specific antigens) and the cell antigens.
  • CTC cell markers cell surface specific antigens
  • Acquiring cancer cells including CTC, is an indispensable factor for cancer research, especially for cancer diagnosis, diagnosis and prognosis, and selection of effective cancer chemotherapy.
  • cancer immunotherapy the acquisition of cancer cells is a key technology for vaccine development, and in personalized medicine, it is the key to further custom-made vaccine development.
  • individual cell immune cell transfer therapy it is also used as a stimulant for the induction of killer cells, which are responsible for the specific cytotoxic response to the patient's own cancer, or when the cytotoxicity of induced killer cells is measured. It is also indispensable as an autologous cancer target cell.
  • cancer cells can only be obtained from biopsies or surgical materials that are highly invasive operations on the living body and accompanied by certain risks such as promoting metastasis and seeding. It did not exist. Therefore, avoiding these risks and developing a safe, simple, and short-term CTC isolation method from peripheral blood, for example, is extremely important for basic and clinical cancer research. It contributes and has important significance for CTC separation acquisition.
  • Cancer has been shown to be mainly hematogenous rather than lymphogenic (Cancer (Res. 11, 648-651,1951; CANCER JULY-AUGUST, Vol.13: 674-676, 1960), despite the lapse of more than 50 years, until now, no method has been developed for stably collecting cancer cells from peripheral blood.
  • a method for a specific subject as described above, a method for examining the presence or absence of cancer by detecting and amplifying a very small amount of cell fragments derived from cancer cells in peripheral blood with an antibody is known. It was done. However, this method is a means that can be applied only to cancer cells that have already identified a substance that is a target for antibody binding.
  • CTC detection / separation acquisition is extremely important. Detects and separates CTCs and CTSCs present in trace amounts in biological circulating body fluids such as blood and lymph, even when the tumor cells cannot be identified as any cancer cells. The method has not been developed. Therefore, it is safe and simple to use CTCs and CTSCs that are present in minute amounts from biological circulating body fluids such as blood and lymph, for example, blood such as peripheral blood, even for cancer cells for which cancer has not been identified. Developing a method for reliable and stable detection / separation is an extremely important issue in the basic and clinical response of cancer.
  • An object of the present invention is to identify CTC (circulating tumor cells) and CTSC (circulating tumor stem cells), which are present in trace amounts in biological circulating body fluids such as blood and lymph, as to which cancer cells the tumor cells are.
  • CTC circulating tumor cells
  • CTSC circulating tumor stem cells
  • the present inventor has identified CTCs and CTSCs present in minute amounts in biological circulating body fluids such as blood and lymph even in a state where the tumor cells cannot be identified as any cancer cells.
  • CTC and / or CTC and / or CTSC detection / separation acquisition methods that can be reliably and stably detected / separated / acquired even in a minute amount in the biological circulatory fluid have been studied.
  • CTC and / or CTC using a culture solution comprising a serum-free medium for CTC and / or CTSC (circulating tumor cells and / or circulating tumor stem cells) for the detection / separation acquisition step
  • CTC and / or CTSC slightly present in the sample can be amplified and reliably and stably detected. It found that it is possible to obtain separated, thereby completing the present invention.
  • the present invention comprises a method for detecting / separating and obtaining CTC and / or CTSC in a biological circulating body fluid using a cell proliferation method, which comprises the following processing steps (1) to (4): (1) a first step of pretreating a sample from a biological circulation fluid to obtain a mononuclear cell phase; (2) Second step of preparing a well plate in which a culture solution comprising a serum-free medium for CTC and / or CTSC growth is injected into a well plate, seeding and incubating the mononuclear cells obtained in the first step , (3) a third step of removing the culture solution from the plate well obtained by incubation in the second step; (4) A fourth step of detecting or separating and acquiring adherent tumor cells attached to the plate well after the third step.
  • the CTC and / or CTSC detection / separation acquisition method using the cell proliferation method of the present invention amplifies CTC and / or CTSC slightly present in the sample, such as circulating body fluid, and reliably and stably detects and Can be obtained separately.
  • a biological circulating body fluid can be used as a sample.
  • a sample from the biological circulating body fluid a blood sample from peripheral blood is most easily used.
  • an operable sample it can be cited as an effective sample.
  • the first step is to pre-process the sample from the biological circulation body fluid.
  • a treatment for removing liquid components contained in body fluids and non-cellular components such as blood cells can be mentioned.
  • the second step of seeding and incubating the mononuclear cells obtained in the first step is performed on the well plate without CTC and / or CTSC proliferation.
  • a well plate into which a culture medium comprising a serum medium is injected is prepared, and the mononuclear cells obtained in the first step are seeded and incubated.
  • the culture medium comprising the serum-free medium for CTC and / or CTSC proliferation include a culture medium based on the AIM-V culture medium which is a serum-free medium for cell proliferation.
  • the culture solution By using the culture solution, it is possible to proliferate CTC and / or CTSC in a short period of time in the incubation step in the method for detecting / separating CTC and / or CTSC in biological circulating body fluid using cell proliferation method, CTCs and / or CTSCs present in trace amounts in the medium can be proliferated and amplified so that detection and separation can be reliably and stably obtained.
  • the culture medium based on the AIM-V culture medium include AIM-V culture liquid, or AIM-V culture liquid, subject's autoserum, AB serum derived from healthy subjects, and palmitic acid (Palmitic Acid) or its A culture solution to which one or two or more selected from salts is added can be used.
  • the incubation conditions in the second step can be suitably determined as appropriate for the growth temperature and growth period, but optimally, 37 ° C. and 3 to 7 days are the reference conditions for the growth temperature and growth period. As can be done. Further, as a condition of incubating in the second step can be carried out in an incubator adjusted to 5% CO 2 condition.
  • the culture solution composed of a serum-free medium for CTC and / or CTSC proliferation used in the CTC and / or CTSC detection / separation acquisition method of the present invention is a culture solution based on an AIM-V culture solution.
  • the culture medium based on the AIM-V culture medium the AIM-V culture liquid itself can be used as the basic medium.
  • palmitic acid (Palmitic acid) or a salt thereof is added to the AIM-V culture solution, Therefore, a more efficient and stable CTC and / or CTSC detection / separation effect can be obtained.
  • palmitic acid or a salt thereof can be mentioned as an additive component that enables safe and stable detection and separation of CTC and / or CTSC.
  • the third step of removing the culture medium from the plate well obtained by incubation in the second step is obtained by incubating in a well plate for a predetermined time.
  • the treatment comprises removing the culture solution from the obtained culture by an appropriate means.
  • the fourth step of detecting or separating and acquiring the adherent tumor cells attached to the plate well is: The adhering tumor cells adhering to the plate well are detected as they are using a detection means such as microscopic examination, dye staining, antigen-antibody staining, or the adhering tumor cells adhering to the plate well are separated. And obtained as cancer cells for various detections.
  • RPMI-1640 which is a standard culture medium for peripheral blood mononuclear cells
  • AIM-V serum-free medium
  • FBS 5% calf serum
  • AS autologous Serum
  • palmiticin is used as a new CTC separation and acquisition factor in order to avoid an increase in patient burden due to the collection of autologous serum and to eliminate the influence of changes in serum components for each medical condition of the subject.
  • Various candidates including acids (Palmitic Acid), LPS, Con A, PHA, IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ were examined, and the most safe and efficient factor was searched.
  • the effect of CTC induction was also observed in LPS, but LPS is a highly toxic substance. Therefore, in view of the purpose of various research after CTC separation and clinical development of technology, Was determined to be inappropriate for safety, and was excluded in subsequent experiments.
  • AIM-V culture solution or AIM-V culture solution is selected from autologous serum of subjects, AB serum from healthy individuals, and palmitic acid (Palmitic acid) or salts thereof.
  • the present invention has been completed by demonstrating that the culture solution added with 1 or 2 or more, particularly, the culture solution added with palmitic acid or its salt is useful. .
  • Method for detecting / separating and obtaining circulating tumor cells and / or circulating tumor stem cells in a biological circulating body fluid comprising the following processing steps (1) to (4): (1) a first step of pretreating a sample from a biological circulation fluid to obtain a mononuclear cell phase; (2) Prepare a well plate into which a culture solution composed of circulating tumor cells and / or serum-free medium for circulating tumor stem cells is injected, and inoculate and incubate the mononuclear cells obtained in the first step.
  • a culture solution comprising circulating tumor cells and / or serum-free medium for circulating tumor stem cells for seeding and incubating the mononuclear cells obtained in the first step is AIM-V.
  • a culture solution based on the AIM-V culture solution for seeding and incubating the mononuclear cells obtained in the first step is AIM-V culture solution or AIM-
  • the culture medium is a culture medium in which one or more selected from autologous serum of a subject, AB serum derived from a healthy subject, and palmitic acid or a salt thereof are added to a V culture medium.
  • the present invention relates to a state in which circulating tumor cells and circulating tumor stem cells present in trace amounts in biological circulating body fluids such as blood and lymph cannot be identified as any cancer cell, and biological circulating body fluids Provided is a CTC detection / separation acquisition method capable of reliably and stably detecting / separating / acquiring even a minute amount.
  • the CTC detection / separation acquisition method of the present invention enables not only CTC but also CTSC detection / separation, and provides an effective means for basic elucidation of cancer and clinical response. To do.
  • CTCs can be efficiently and stably sorted according to the present invention provides the possibility of technological progress in cancer research.
  • CTSCs especially cancer cells
  • peripheral blood or the like which has been a major cause of delays in CTC research.
  • the technology of the present invention has created a foundation for dramatically promoting CTC research. According to the present invention, it is possible to proceed with basic and clinical research of CTC, and it can be expected that the development of CTC control technology will be boosted.
  • FIG. 1 shows the results of a CTC acquisition test using an AIM-V culture solution and an RPMI-1640 culture solution as a culture solution in a selection test of an efficient culture solution for acquiring cancer cells (CTC). It is a figure which shows the result (photograph) observed by 1.
  • Figure (1-a) shows the results of CTC acquisition using the AIM-V culture medium
  • Figure (1-b) shows the results of CTC acquisition using the RPMI-1640 culture medium.
  • FIG. 2 is a graph showing the morphology of CTCs cultured and obtained with the AIM-V culture medium alone in the test for confirming the morphological change of cancer cells (CTC) obtained with the CTC proliferation culture medium in the examples of the present invention.
  • FIG. 3 shows a test for confirming the morphological change of cancer cells (CTC) obtained with the culture solution for CTC proliferation in the example of the present invention, “PalmiticVAcid ( ⁇ 1conc.) In AIM-V culture solution”. It is a figure which shows the microscope image of CTC which culture
  • FIG. 4 shows a test for confirming the morphological change of cancer cells (CTC) obtained with the culture solution for CTC proliferation in the example of the present invention, “PalmiticVAcid ( ⁇ 4conc.) In AIM-V culture solution”. It is a figure which shows the microscope image of CTC which culture
  • FIG. 5 is a graph showing the morphological change of cancer cells (CTC) obtained with the CTC proliferation culture solution in the example of the present invention, obtained by culturing with “AIM-V + 5% Auto ⁇ Serum culture solution”. It is a figure which shows the microscope image of CTC which was culture
  • FIG. 6 shows a test for confirming the morphological change of cancer cells (CTC) obtained with the culture solution for CTC proliferation in the example of the present invention under the condition of “AIM ⁇ V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 1conc.) It is a figure which shows the microscope image of CTC which culture
  • FIG. 7 shows a test for confirming the morphological change of cancer cells (CTC) obtained with the CTC growth medium in the example of the present invention under the condition of “AIM ⁇ V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 4 conc.) It is a figure which shows the microscope image of CTC which culture
  • FIG. 8 shows an example of the present invention, in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the “confirmation and identification of CTC using the membrane antigen CD44”.
  • FIG. 6 is a diagram showing a micrograph (a) and a fluorescence micrograph (b) of a CTC obtained separately from vagina.
  • FIG. 9 shows an example of the present invention, in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD44” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient. . K.
  • FIG. 10 shows the results of the confirmation and identification of CTC using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the patient's peripheral blood in the example of the present invention, in “Confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD44”.
  • . H. Gastric Ca. ⁇ : gastric cancer: liver meta. It is a diagram showing a micrograph (a) and a fluorescence micrograph (b) of a CTC obtained separately from liver metastasis.
  • FIG. 11 shows an example of the present invention in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD44” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the Example of the present invention.
  • FIG. 12 shows an example of the present invention, in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD44” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the example of the present invention. . K.
  • FIG. 13 shows an example of the present invention, in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD44” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the example of the present invention. .
  • O. It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence microscope picture (b) of CTC isolate
  • FIG. 14 shows an example of the present invention, in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD44” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient.
  • Y. It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence microscope picture (b) of CTC isolate
  • FIG. 15 shows the results of the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the patient's peripheral blood in the example of the present invention, in “Confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD44”. . H.
  • FIG. 16 shows the results of the confirmation and identification of CTC using cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the patient's peripheral blood in the example of the present invention, in “Confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD45”. .
  • Y It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence microscope picture (b) of CTC isolate
  • FIG. 17 shows the results of the confirmation and identification of CTC using the membrane antigen CD45 of the CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the example of the present invention in the “confirmation and identification of CTC using the membrane antigen CD45”.
  • Y. It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence microscope picture (b) of CTC isolate
  • FIG. 18 is a diagram showing a case in which the patient: Y in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD45” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the example of the present invention. . H.
  • FIG. 19 shows an example of the present invention, in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD47” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the Example of the present invention. . N. It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence micrograph (b) of CTC which were isolate
  • FIG. 20 shows an example of the patient: S in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD47” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the example of the present invention.
  • K. It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence microscope picture (b) of CTC which were isolate
  • FIG. 21 shows an example of the present invention, in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD47” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient. . O.
  • FIG. 22 shows an example of the present invention, in the “confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD47” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the Example of the present invention. . Y. It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence microscope picture (b) of CTC isolate
  • FIG. 23 shows the results of the confirmation and identification of CTC using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the example of the present invention, in “Confirmation and identification of CTC using membrane antigen CD47”.
  • FIG. 24 shows the results of the confirmation and identification of the CTC using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the patient's peripheral blood in the example of the present invention, in the “confirmation and identification of CTC using the membrane antigen CKII”. . Y.
  • FIG. 25 shows the results of “Confirmation and identification of CTC using membrane antigen CKII” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the example of the present invention. . H. It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence microscope picture (b) of CTC isolate
  • FIG. 26 shows the results of “Confirmation and identification of CTC using membrane antigen EpCAM” in the confirmation and identification test using the cell membrane antigen of CTC isolated and obtained from the peripheral blood of the patient in the example of the present invention.
  • Y It is a figure which shows the microscope picture (a) and fluorescence microscope picture (b) of CTC isolate
  • FIG. 27 is an image of a micrograph (non-fluorescent light emission image) of cells remaining in the CTC transplanted group in the “test for confirming tumorigenicity or long-term survival of CTC in nude mice” in the Example of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing a photograph of a fluorescent antibody microscope (fluorescence emission image) using the membrane antigen CD45.
  • (27-a) and (27-b) represent patient H.P. Y.
  • FIG. 28 is an image of a micrograph (non-fluorescent light emission image) of cells remaining in the CTC transplanted group in the “test for confirming tumorigenicity or long-term survival of CTC in nude mice” in the Example of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing a photograph of a fluorescent antibody microscope (fluorescence emission image) using the membrane antigen CD45.
  • (28-a) and (28-b) represent patient K. H.
  • FIG. 29 is an image of a micrograph (non-fluorescent light emission image) of cells remaining in the CTC transplanted group in the “test for confirming tumorigenicity or long-term survival of CTC in nude mice” in Examples of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing a photograph of a fluorescent antibody microscope (fluorescence emission image) using the membrane antigen CD45.
  • (29-a) and (29-b) represent patient H. Y.
  • FIG. 30 is an image of a micrograph (non-fluorescent light emission image) of cells remaining in the CTC transplanted group in the “test for confirming tumorigenicity or long-term survival of CTC in nude mice” in the Example of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing a photograph of a fluorescent antibody microscope (fluorescence emission image) using the membrane antigen CD45.
  • (30-a) and (30-b) represent patient K. H. Of micrographs (Control) of cells remaining in the CTC transplantation group when CTC (KH-1) separated from the sample from the sample was transplanted to “Nude2-2”, and fluorescent antibody microscope (fluorescence emission image) Show photos.
  • FIG. 31 shows a microscope for “normal small intestine tissue cells” of a control nude mouse not transplanted with CTC in the “test for confirming tumorigenicity or long-term survival of CTC in nude mice” in the Examples of the present invention.
  • FIG. 32 shows growth of CTC cells using the established cancer cell line (UTC-8) as a sample in the detection test (I) of CD47 positive cells (CTSC) using the established cancer cell line (UTC-8). It is the photograph which displayed the result of having detected this antigen positive cell by CD47 antigen on a cell membrane after acquisition with the microscope image of non-fluorescent dye staining, and the CD47 positive cell image by fluorescent dye staining method.
  • FIG. 33 shows growth of CTC cells using the established cancer cell line (UTC-8) as a sample in the detection test (II) of CD47 positive cells (CTSC) using the established cancer cell line (UTC-8). It is the photograph which displayed the result of having detected this antigen positive cell by CD47 antigen on a cell membrane after acquisition with the microscope image of non-fluorescent dye staining, and the CD47 positive cell image by fluorescent dye staining method.
  • (33-a) shows a microscopic image of non-fluorescent dye staining
  • (33-b) shows a CD47 positive cell image by fluorescent dye staining.
  • the present invention comprises a method for detecting / separating and obtaining CTC and / or CTSC in a biological circulatory fluid using a proliferation method including the following processing steps (1) to (4): (1) a first step of pretreating a sample from a biological circulation fluid to obtain a mononuclear cell phase; (2) Second step of preparing a well plate in which a culture solution comprising a serum-free medium for CTC and / or CTSC growth is injected into a well plate, seeding and incubating the mononuclear cells obtained in the first step , (3) a third step of removing the culture solution from the plate well obtained by incubation in the second step; (4) A fourth step of detecting or separating and acquiring adherent tumor cells attached to the plate well after the third step.
  • a biological circulating body fluid can be used as a sample.
  • a sample from the biological circulating body fluid a blood sample from peripheral blood is most easily used.
  • an operable sample it can be cited as an effective sample.
  • organs isolated from the circulation of blood and body fluids cannot exist in one solid in the living body. Even if the presence of cancer cannot be predicted macroscopically, CTCs and / or CTSCs from all organs can be collected. For example, we succeeded in isolating human-derived CTC by transplanting human-derived CTC subcutaneously or intradermally in nude mice, removing the spleen three months later, and performing separation from peripheral blood. ing.
  • the first step includes a step of pretreating a sample from the biological circulatory fluid to obtain a mononuclear cell phase.
  • This step can include a treatment for removing a non-cellular component such as a liquid component and blood cells contained in the biological circulation fluid by pretreating a sample from the biological circulation fluid.
  • the treatment for removing liquid components and non-cell components such as blood cells contained in the biological circulatory fluid is not particularly limited, and a known method can be used.
  • a method of separating and removing red blood cells and white blood cells by centrifugation for blood samples, a method of separating and removing red blood cells and white blood cells by centrifugation (centrifugation method), and a method of separating and removing red blood cells and white blood cells using density of cells (density gradient) Centrifugation method), blood cell separation method using a difference in cell size (separation method using a filter), and the like.
  • a particularly preferable method is a density gradient centrifugation method. In that case, specifically, the processing conditions of the Ficoll isopark density gradient centrifugation method can be mentioned.
  • AIM-V A culture solution based on the culture solution can be used as the culture solution comprising CTC and / or a serum-free medium for CTSC proliferation used for incubation in the second step.
  • the AIM-V culture medium has been developed as a growth medium for T cells and the like, but the culture liquid itself can be obtained from commercially available products.
  • the second step in the method for detecting / separating and obtaining CTC and / or CTSC in the biological circulatory fluid of the present invention will be described.
  • AIM-V which is a serum-free medium for cell proliferation
  • a well plate into which a culture solution based on the culture solution is injected is prepared, and the mononuclear cells obtained in the first step are seeded and incubated.
  • the culture medium based on the AIM-V culture medium is selected from AIM-V culture liquid or AIM-V culture liquid from subject autologous serum, AB serum derived from healthy subjects, and palmitic acid or a salt thereof. 1 or 2 or more can be used.
  • the incubation conditions in the second step can be appropriately set according to the situation, but preferably, the incubation is performed under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. for 3 to 7 days in the incubation. it can. Particularly preferably, 5% CO 2, 37 °C , incubated in conditions of 7 days, can be carried out under conditions of cultivation temperature and culture period.
  • the third step comprises a step of removing the culture solution from the plate well obtained by incubation in the second step.
  • the removal of the culture solution from the plate well can be performed by an appropriate means.
  • the fourth step detects adherent tumor cells attached to the plate well after the third step, or It consists of the steps of obtaining separately.
  • the adherent tumor cells attached to the plate well can be directly applied to the detection means by using a detection means such as a speculum, dye staining, antigen, antibody staining and the like.
  • the adherent tumor cells attached to the plate well can be separated and obtained as cancer cells for various detections.
  • the cancer cells obtained by separation and acquisition are used for cancer clarification, clinical evaluation, clinical diagnosis, treatment, prognostic evaluation and determination, etc. It can be provided as a cancer cell sample for research for application.
  • the cells separated and acquired in the present invention are cancer cells can be confirmed by selecting a plurality of appropriate ones from the following criteria. For example, (1) to (5), (7), and (9) can be selected and determined.
  • at least one of 24 types of markers that are generally regarded as tumor markers, such as CA19-9, should show a positive reaction compared to the control group.
  • Total RNA is purified from the cells, subjected to genetic analysis, and the expression of cancer-related genes and cancer stem cell genes is recognized predominantly.
  • CTC efficiently separated / detected from peripheral blood that can be operated most easily can be obtained after the separation / detection results before and after cancer therapy. It can be used as an index for comparative evaluation of effects, and can contribute to prognostic evaluation.
  • the method of the present invention enables highly efficient separation and acquisition of CTCs, the development of new therapeutic techniques and the like can be promoted, such as the development of effective drugs for the cancer. . That is, according to the present invention, it is possible to obtain CTC with high efficiency for any cancer or unspecified cancer, thereby enabling early detection of cancer and analysis and evaluation of prognosis.
  • sample collection Blood collection
  • a disposable 30 ml blood collection syringe containing an appropriate amount of the anticoagulant sodium heparin (0.05 ml) was prepared, and the same 30 ml blood collection syringe for obtaining serum without heparin sodium was prepared. This was inserted into each insertion port of an L-shaped 180 ° three-way stopcock, and appropriate ones of 18, 21, 24, and a gauge winged needle were connected to the blood vessel side to prepare for blood collection. 30 ml of each blood was collected and the following separation operation was performed.
  • sample purification blood cell separation
  • For serum collection attach a needle to a blood collection syringe, leave it at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator for 1 hour, and then centrifuge at 4 ° C, 3,000 rpm (800G) for 30 minutes. did.
  • the top static was autoserum (AS) and stored in a cold place at 4 ° C. 3.
  • heparin blood collection tubes aiming at separation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were well mixed by rolling the blood collection tube well after blood collection.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs were collected by aspiration, (-) PBS was added, and then centrifugation was performed at 4 ° C., 1200 rpm (270 G) for 15 minutes. This was repeated twice, and after removing the static state, a culture solution (RPMI-1640, AIM-V) suitable for the planned experimental conditions was added and used for the following experiments.
  • PBMCs (Incubation in culture) 4).
  • the resulting PBMCs adjusted to I ⁇ 10 4 / 100 ⁇ l, 96 well plates (BDFalcon Co., 96 Well, Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom), or 384 well plates (BD Falcon Co. Ltd., 384 well, Clear, Tissue Culture Treated Plate, and one group 3 wells of the experimental conditions based on the experimental design to each well of the Flat Bottom), 1 ⁇ 10 4 / 100 ⁇ l (/ well / 96 well plate or 1x10 4 / 25 ⁇ l / well / 384 well plate) and inoculated the cells.
  • RPMI-1640 serum-free medium AIM-V culture solution
  • CMI isolation and acquisition As for the culture solution, the serum-free medium AIM-V culture solution (hereinafter referred to as RPMI-1640), which is a standard culture solution of peripheral blood mononuclear cells, is referred to as CMI isolation and acquisition.
  • RPMI-1640 serum-free medium AIM-V culture solution
  • AS autologous serum
  • AB type serum AB type serum
  • LPS is a highly toxic substance, so it is considered in view of various research after CTC separation and the development of clinical application technology. For example, it was judged that the reagent was inappropriate for safety, and it was decided to exclude it in the subsequent experiments. As a result, it was confirmed that the addition of AIM-V medium and palmitic acid gave the best results for stable CTC fractionation.
  • test sample 8 was a sample provided from a terminal cancer patient such as tongue cancer, mandibular malignant tumor, malignant lymphoma, breast cancer, lung cancer, stomach cancer, prostate cancer, or uterine sarcoma provided by a hospital.
  • a terminal cancer patient such as tongue cancer, mandibular malignant tumor, malignant lymphoma, breast cancer, lung cancer, stomach cancer, prostate cancer, or uterine sarcoma provided by a hospital.
  • a terminal cancer patient such as tongue cancer, mandibular malignant tumor, malignant lymphoma, breast cancer, lung cancer, stomach cancer, prostate cancer, or uterine sarcoma provided by a hospital.
  • ⁇ Test medium> The following culture solutions were prepared and used as the test culture solution. (1) RPMI-1640 + 5% FBS (2) RPMI-1640 + 5% Auto Serum (autoserum) (3) AIM-V (serum-free medium alone) (4) AIM-V + 5% FBS (5) AIM-V + 5% Auto Serum (autologous serum)
  • Example 2 ⁇ Experiment method> Using the culture solution, according to the experimental method described in Example 1, cancer cell (CTC) acquisition efficiency (cancer cell detection accuracy) in each culture solution was tested.
  • CTC cancer cell
  • RPMI-1640 is used as a culture medium, and this culture medium is divided into a calf serum (FBS) addition group and an autoserum (Auto Serum) addition group. The collected samples were examined for their ability to induce CTC.
  • FBS calf serum
  • Auto Serum Auto Serum
  • RPMI-1640 added with palmitic acid is used as a common culture solution, and the culture solution is added to a calf serum (FBS) addition group and autoserum (Auto Serum). It divided into the addition group, and the presence or absence of the CTC induction ability was examined about the sample extract
  • FBS calf serum
  • Auto Serum autoserum
  • RPMI-1640 is divided into two groups, calf serum (FBS) added group and autoserum (Auto Serum) added group, and the presence or absence of CTC inducing ability of samples collected from 6 cancer patients investigated.
  • FBS calf serum
  • Auto Serum Auto Serum
  • Test 4 Examination of CTC inducing ability of the culture solution obtained by adding FBS to the AIM-V culture solution
  • FBS calf serum
  • a common culture medium is a culture medium in which patient serum (Auto Serum) is added to the AIM-V culture medium, and a group in which palmitic acid is added to the culture medium is prepared, and a group in which no palmitic acid is added. The CTC induction ability was compared and examined.
  • FIG. 1 shows the results (photographs) observed with a fluorescence microscope of the CTC acquisition test using the AIM-V culture solution and the RPMI-1640 culture solution examined in Test 1 and Test 2 above.
  • Figure (1-a) shows the results of CTC acquisition using the AIM-V culture medium
  • Figure (1-b) shows the results of CTC acquisition using the RPMI-1640 culture medium.
  • ⁇ Test medium The following culture solutions were prepared and used as the test culture solution.
  • AIM-V (serum-free medium) (2) AS (Auto Serum) (3) LPS (Lipopolysaccharide) (4) IL-1 ⁇ (Interleukin 1 ⁇ ) (5) IL-1 ⁇ (Interleukin 1 ⁇ ) (6) Palmitic Acid
  • Example 2 Using the culture solution, according to the experimental method described in Example 1, the prepared cancer patient peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are seeded in each well, and the cancer cell (CTC) acquisition efficiency (g The effect of additives on the detection accuracy of cancer cells was tested.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • CTC cancer cell
  • AIM-V culture medium AIM-V: Group A
  • AS autoserum
  • AIM-V + AS Group B
  • LPS Lipopolysaccharide
  • a group (AIM-V + AS: Group B) based on an AIM-V culture medium (AIM-V: Group A), to which AS (autoserum) was added, and IL-1 ⁇ (Interleukin 1 ⁇ )
  • the basic concentration was 1 conc.
  • each group (Group GH, GD) was prepared by adding concentrations of 0.1 conc. To 100 conc. And the CTC fractionation effect between those groups was examined.
  • a group based on AIM-V culture medium A group based on AIM-V culture medium (AIM-V: Group A), to which AS (autoserum) was added (AIM-V + AS: Group B), and IL-1 ⁇ (Interleukin 1 ⁇ )
  • the basic concentration was 1 conc.
  • each group Group GH, GD was prepared by adding concentrations of 0.1 conc. To 100 conc. And the CTC fractionation effect between those groups was examined.
  • AIM-V culture medium AIM-V: Group A
  • AS autoserum
  • AIM-V + AS Group B
  • Palmitic Acid to these groups with a basic concentration of 1 conc.
  • Group G, H AIM-V culture medium
  • AS autoserum
  • Group B Palmitic Acid + AS
  • the purpose of the experiment is to examine the presence or absence of morphologically different expression of CTC cells due to the difference of each growth condition.
  • (A) and (b) are the same for different patients, even if they are from different patients. It is for verifying that the same cell morphology is exhibited under the culture conditions.
  • the concentration of palmitic acid was in accordance with Table 12 below.
  • FIG. 2 (2-a; 2-b) shows fluorescence microscope images of CTCs cultured and obtained with the AIM-V culture medium alone.
  • FIG. 2 (2-a; 2-b) shows fluorescence microscope images of CTCs cultured and obtained with the AIM-V culture medium alone.
  • FIG. 3 shows a fluorescence microscope image of CTC obtained by adding AIM-V culture medium + Palmitic Acid ( ⁇ 1 concentration) and culturing.
  • AIM-V culture medium + Palmitic Acid ⁇ 1 concentration
  • FIG. 4 (4-a; 4-b) shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by adding AIM-V culture medium + Palmitic Acid ( ⁇ 4 concentration) and culturing.
  • FIG. 4-b shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by adding AIM-V culture medium + Palmitic Acid ( ⁇ 4 concentration) and culturing.
  • the nuclear component and the nucleus in the cytoplasm A marked increase in the granular component and a deep dyeing are observed.
  • FIG. 5 shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in AIM-V + 5% Auto Serum culture solution.
  • FIG. 5 shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in AIM-V + 5% Auto Serum culture solution.
  • no abnormalities in the size or dark staining of cells, cytoplasmic nuclei and granule components are observed.
  • FIG. 6 shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in an AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 1 concentration) culture solution.
  • FIG. 6 shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in an AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 1 concentration) culture solution.
  • CTC cell morphology obtained by culturing with AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 1 concentration) culture medium abnormally sized or densely stained parts of cells, cytoplasmic nucleus and granule components are seen. Absent.
  • FIG. 7 (7-a; 7-b) shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in an AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 4 concentration) culture solution.
  • FIG. 7-a shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in an AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 4 concentration) culture solution.
  • FIG. 7-a shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in an AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 4 concentration) culture solution.
  • FIG. 7-a shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in an AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 4 concentration) culture solution.
  • FIG. 7-a shows fluorescence microscope images of CTCs obtained by culturing in an AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid ( ⁇ 4 concentration) culture solution.
  • FIG. 7-a shows fluor
  • CTC obtained by adding an AIM-V culture solution or an additive component such as Auto Serum and / or Palmitic Acid to the culture solution.
  • CTC can be obtained reliably and effectively by proliferating and acquiring CTC using the growth medium, and at that time, it is possible to acquire and proliferate without causing morphological change in CTC cell morphology. It was confirmed that. That is, when proliferating and acquiring CTC (CTSC), it is important not to induce artificial changes in the acquired cell morphology in order to confirm the properties and characteristics of CTC.
  • each ( Figure-a) is a photograph image by a CTC microscope
  • each ( Figure-b) is a photograph image by a fluorescence microscope stained with a membrane surface antigen. Show.
  • ⁇ Antigen staining method For the antigen staining method, a sample was prepared according to the following procedure using FITIC (fluorescein isothiocyanate) label, and stained, examined, observed and photographed.
  • FITIC fluorescein isothiocyanate
  • FIGS. 8 to 10 show images of CTC micrographs obtained from peripheral blood of (Gastric Ca .: gastric cancer: liver meta. Liver metastasis) and fluorescent antibody microscopes using membrane antigen CD44.
  • FIGS. 8-a to 10-a show micrograph images
  • FIGS. 8-b to 10-b show fluorescent antibody micrographs.
  • FIGS. 11 to 13 show images of CTC micrographs obtained from peripheral blood of (Lung Ca. lung cancer) and fluorescent antibody microscopes using membrane antigen CD44.
  • FIGS. 12-a to 13-a show micrograph images
  • FIGGS. 12-b to 13-b show photographs of fluorescent antibody microscopes.
  • the CTCs obtained from the above patients (2) to (3) were stained with CD44, and an image of the micrograph and a photo of the fluorescent antibody microscope were obtained. It was confirmed that the obtained CTC was a CTC of the above cancer.
  • FIGS. 14 to 15 show images of CTC micrographs obtained from peripheral blood of (Lung Ca. lung cancer) and fluorescent antibody microscopes using membrane antigen CD44.
  • FIGS. 14-a to 15-a show micrograph images
  • FIGS. 14-b to 15-b show photographs of fluorescent antibody microscopes.
  • the CTC obtained from the above patients (1) to (2) was stained with CD44, and an image of a micrograph and a photograph of a fluorescent antibody microscope were obtained. It was confirmed that the obtained CTC was a CTC of the above cancer.
  • FIGS. 16 to 18 show images of CTC micrographs obtained from peripheral blood of (Lung Ca. lung cancer) and fluorescent antibody microscopes using membrane antigen CD45.
  • FIGS. 16-a to 18-a show micrograph images
  • FIGS. 16-b to 18-b show photographs of a fluorescent antibody microscope.
  • the CTCs obtained from the above patients (1) to (2) showed staining with CD45, and an image of a micrograph and a photograph of a fluorescent antibody microscope were obtained. It was confirmed that the obtained CTC was a CTC of the above cancer.
  • CTSC CTC
  • FIGS. 19 to 23 show images of CTC micrographs obtained from peripheral blood of (Lung Ca. ⁇ lung cancer) and fluorescent antibody microscopes using membrane antigen CD47.
  • FIGS. 19-a to 23-a show micrograph images
  • FIGS. 19-b to 23-b show photographs of a fluorescent antibody microscope. As shown in the photographs (FIGS.
  • the CTCs obtained from the above patients (1) to (5) showed staining with CD47, and an image of a micrograph and a photograph of a fluorescent antibody microscope were obtained. It was confirmed that the obtained CTC was a CTC of the above cancer.
  • the arrow indicates CD47 positive CTSC.
  • CTSCs indicated by white arrows are CD47-positive CTSCs in cancer cells grown and cultured as CTCs (CTSCs), and are shown to be observed regardless of cell size or size. ing. That is, it was confirmed that CD47-positive CTSCs are not cells having a fixed shape and size but have various variations.
  • FIGS. 24 to 25 show images of CTC micrographs obtained from peripheral blood of (Lung Ca. ⁇ ⁇ lung cancer) and fluorescent antibody microscopes using the membrane antigen CKII.
  • FIGS. 24-a to 25-a show micrograph images
  • FIGGs. 24-b to 25-b show photographs of fluorescent antibody microscopes.
  • the CTC obtained from the above patients (1) to (2) showed staining with CKII, and an image of the micrograph and a photograph of the fluorescent antibody microscope were obtained. It was confirmed that the obtained CTC was a CTC of the above cancer.
  • FIG. 26 shows an image of a photomicrograph of CTC obtained from peripheral blood of (Breast Ca. breast cancer) and a photo of a fluorescent antibody microscope using the membrane antigen EpCAM.
  • FIG. 26-a shows an image of a photomicrograph
  • FIG. 26-b shows a photo of a fluorescent antibody microscope.
  • the CTC obtained from the patient showed very few cells expressing EpCAM on the cell membrane.
  • Example group A For two nude mice (Nude1-1; Nude1-2), “Nude1-1” had CTC (HY-1) and “Nude1-2” had CTC ( 1 ⁇ 10 6 of KH-1) was implanted subcutaneously in the back of nude mice, and the presence or absence of tumorigenicity was examined for 3 months during the entire observation period. After the period, peripheral blood and spleen of the nude mouse were collected, and CTC was separated and cultured. For cells remaining in the proliferating CTC transplanted group, the survival of the transplanted CTC was examined by staining with non-fluorescent emission (Control) and fluorescent antibody method using membrane surface CD45 antigen. , CTC remaining was confirmed.
  • Example group B For two nude mice (Nude2-1; Nude2-2), “Nude2-1” had CTC (HY-1) and “Nude2-2” had CTC ( KH-1) was transplanted 1 ⁇ 10 6 subcutaneously in the back of nude mice, and the same amount of cells was transplanted intraperitoneally. As in the case of the experimental group A, for the cells remaining in the proliferating CTC transplant group, it was confirmed that the surviving cells were transplanted CTCs.
  • FIGS. 27 to 30 show micrographs (non-fluorescence emission images) of cells remaining in the CTC transplanted group and fluorescence antibody microscopes (fluorescence emission images) using the membrane antigen CD45.
  • (27-a) and (27-b) are photomicrographs (Control) of cells remaining in the CTC transplant group when CTC (HY-1) is transplanted to “Nude1-1”
  • (28-a) and (28-b) are photographs of fluorescent antibody microscopes (fluorescence emission images) that remain in the CTC transplantation group when CTC (KH-1) is transplanted to “Nude1-2”.
  • the microphotograph (Control) and the fluorescent antibody microscope (fluorescence emission image) photograph of the cell which is present are shown.
  • (29-a) and (29-b) are photomicrographs (Control) of cells remaining in the CTC transplantation group when CTC (HY-1) is transplanted to “Nude2-1”, and The photographs of fluorescent antibody microscopes (fluorescence emission images), (30-a) and (30-b), remained in the CTC transplantation group when CTC (KH-1) was transplanted to “Nude2-2”.
  • the microphotograph (Control) and the fluorescent antibody microscope (fluorescence emission image) photograph of the cell which is present are shown.
  • the cells remaining in the CTC transplanted group are stained with the membrane antigen CD45, which is consistent with the micrograph image and remain in the CTC transplanted group.
  • a micrograph image (31-a) of normal small intestinal tissue cells and a photomicrograph image (31-b) of the cells by CD45 staining are shown. As shown in FIG. 31, no staining by CD45 was shown in normal small intestine tissue cells.
  • CSC CD47 positive cells
  • UTC-8 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patented Material Deposit Center deposit number: FERM BP-08611
  • CSC CD47 positive cells
  • ⁇ Test method> Using an established cancer cell line (UTC-8) as a sample, CTC cells were proliferated and obtained by the method of Example 1, and then the antigen-positive cells were detected by CD47 antigen on the cell membrane. The results were displayed as a non-fluorescent dye stained microscopic image and a CD47 positive cell image by fluorescent dye staining.
  • results are shown in FIG.
  • (32-a) shows a microscope image of non-fluorescent dye staining
  • (32-b) shows a CD47 positive cell image obtained by the fluorescent dye staining method.
  • thick arrows ( ⁇ ) indicate CT47 positive for CD47
  • double-ended arrows ( ⁇ ⁇ ) indicate CTC cancer cells with different sizes and shapes of CD47 non-positive cells.
  • Example 12 In the same manner as in Example 12, using an established cancer cell line (UTC-8) as a sample, CTC cells were proliferated by the method of Example 1, and then the CD47 antigen on the cell membrane was used to detect the antigen-positive cells. Detection was performed. The results were displayed as a non-fluorescent dye stained microscopic image and a CD47 positive cell image by fluorescent dye staining.
  • results are shown in FIG.
  • (33-a) shows a microscopic image of non-fluorescent dye staining
  • (33-b) shows a CD47 positive cell image by fluorescent dye staining.
  • thick arrows ( ⁇ ) indicate CT47 positive for CD47
  • double-ended arrows ( ⁇ ⁇ ) indicate CTC cancer cells with different sizes and shapes of CD47 non-positive cells.
  • the cancer cells were irregularly shaped, showing no vertical and left-right symmetry, from morphological shapes, round shapes, spindle shapes, and the like.
  • the CD47 positive CTSC was also found to have a unique shape with irregular protrusions protruding like dendritic cells, and the features of the morphology were clearly confirmed.
  • the present invention relates to biological tumors such as blood and lymph that are present in trace amounts of circulating tumor cells and circulating tumor stem cells in a state where the tumor cells cannot be identified as any cancer cell,
  • a CTC detection / separation acquisition method capable of reliably and stably detecting / separating and acquiring even a minute amount in a circulating body fluid.
  • the CTC detection / separation acquisition method of the present invention enables not only CTC but also CTSC detection / separation, and provides an effective means for basic elucidation of cancer and clinical response. To do.

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Abstract

血液やリンパ液のような生体循環体液中に、微量に存在する循環腫瘍細胞及び循環腫瘍幹細胞を、当該腫瘍細胞がいかなるがんの細胞か特定できていない状態、かつ、生体循環体液中に微量に存在する状態においても、確実かつ安定的に検出・分離取得することが可能なCTCの検出・分離取得方法を提供することを課題とし、以下の（１）～（４）の処理ステップを含む、生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法により該課題を解決する：（１）生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第１のステップ；（２）ウェルプレートに、循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第２のステップ；（３）第２のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第３のステップ；（４）第３のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第４のステップ。

Description

細胞増殖法を用いた循環腫瘍細胞の検出・分離取得方法
　本発明は、ヒト生体組織、すなわち末梢血を代表とする循環体液、或いは、この体液を介して骨髄、脾臓などをはじめとする体内各種臓器から循環体液に侵入してくる腫瘍（がん）細胞である循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cells：ＣＴＣ）及び循環腫瘍（がん）幹細胞（Circulating Tumor  Stem Cells：ＣＴＳＣ）を検出・分離取得する方法に関し、特に、血液やリンパ液のような生体循環体液中に、微量に存在する循環腫瘍細胞及び循環腫瘍幹細胞を、当該腫瘍細胞がいかなるがんの細胞か特定できていない状態においても、かつ、生体循環体液中に微量に存在する状態においても、確実かつ安定的に検出・分離取得することが可能な循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び循環腫瘍幹細胞（ＣＴＳＣ）の検出・分離取得方法を提供することに関する。（なお、以下の説明において、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び循環腫瘍幹細胞（ＣＴＳＣ）を区別して説明をする必要がある場合を除いて、「循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）」と記載し、該「循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）」には、「循環腫瘍幹細胞（ＣＴＳＣ）」も含まれる意味で説明する。）
　がん疾患は、先進国において、疾病による死亡率の上位にある。特に、日本国においては、年齢調整罹患率、同死亡率などの統計では減少傾向がみられるとはいえ、高齢化や糖尿病などの慢性疾患のがん発生・死亡に対する寄与度が高く、今や二人に一人の確率でがんに罹患し、三人に一人が、がん死するなど極めて憂慮すべき状況となっている（Estimated using the method by Wum LM et al., Estimating lifetime and age-conditional probabilities of developing cancer, Lifetime Data Anal., 1998, 4 : 169-186.）。
　一方で、これらがん疾患に対する対処については、その治療技術の開発に対する注力により、各種のがん治療方法においてその進展がみられている。がん治療の三大療法としての手術療法、化学療法、放射線療法、そして近年注目されている免疫療法などの進歩はそれなりに目覚ましい成果を得ている。しかし、いまだに、術後再発、所属リンパ節転移、遠隔転移などが十分制御できず、その対策が焦眉の急となっている。また、近年、がん組織の切除に成功しても、術後に再発転移する場合が見出されており、該術後に再発転移する要因として、がん幹細胞の存在が極めて重要であることも分ってきている（Breast Cancer Res Treat 2010, 124:403-412.；New Engl. J Med 2004, 351:781-791.；Clin Cancer Res 2008, 14:6302-6309.；J. Clin Oncol 2008, 26:3213-3221.）。そして、このメカニズムの中心に、体内を循環しているＣＴＣが、この再発・転移に関与していることが明らかになってきた（Clin Cancer Res 2008, 14:7004-7010.；Proc (Bayl Univ Med Cent) 2008, 21:127-132.）。
　ヒト生体組織、なかんずく各種体内諸臓器に発生したがん細胞・組織（以下、白血病を含め悪性腫瘍全般を指すものとする。）は、白血病を除き、原発巣（がん発生の場所）において、増殖したがん細胞は接着因子によって結合して腫瘍組織を形成する。しかし、該がん細胞は、原発巣にとどまらず、接着因子の異常や消失により、原発巣から遊離し、がん細胞周囲の結合組織や、血管、リンパ管壁を分解し、血液中や、リンパ液中に浸潤する。該体液中に浸潤したがん細胞は、体内を循環している血液や、リンパ液と共に、循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cells：ＣＴＣ）として体内を循環する。該ＣＴＣが、血液等の循環により他の組織や臓器に運ばれ、他の組織や臓器において、血管等からはいだし、新たに接着因子を合成し、定着して転移巣を形成する。このＣＴＣの、体内の循環、転移巣の形成が、がんの転移のメカニズムと考えられ、がんの再発・転移に関与していると考えられている。
　がんの診断や治療の確立において、原発巣に発生したがんの特定や病態についての情報を、がんの他組織や臓器への転移が起こる前に早期に得ることは、がんの診断や治療を有効に行うために極めて重要な要因であり、がんの他組織や臓器への転移を防止するための有力な情報となるものであり、そのための手段として、ＣＴＣの解析が極めて重要なファクターとして、注目されている。また、ＣＴＣの解析は、がんの再発予測やがん治療効果の評価においても重要と考えられ、予後の予測や治療効果の判定にも有効な手段となることが報告されている。
　しかしながら、血液中等で循環しているＣＴＣは、その存在レベルが非常に低く、また、血中を循環しているがん細胞の半減期は１～２４時間というように短い時間であるため、循環体液中に存在するＣＴＣを検出することは極めて難しい状況にある。例えば、末梢血からのＣＴＣの分離は効率が悪く、ＣＴＣに関して、２０１２年世界共同研究１９施設の報告（J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20.）でも、血中単核球から１／１０８、すなわち血液１００ｍｌから僅かに１個しか分取することができないことが報告されている。これは６０ｋｇ体重の成人で換算すると、全末梢血約５リットル（５０００ｍｌ）を全量採血しても５０個という極めて低確率で、しかも極めて少数のＣＴＣしか分取できないということになる。この事実がＣＴＣ研究の最大の阻害要因となってきた（J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20.）。
　近年、ＣＴＣの検出・測定技術の進展が図られ、検出・測定技術の進歩により、検出感度や、測定精度の向上が図られ、血液の１０万個から１億個の単核細胞中にわずか数個存在するがん細胞を特異的に検出することが可能となってきた。そして、乳がん、大腸がん、前立腺がんなどの転移性がんにおける予後予測や、治療効果判定といった臨床情報が得られる検査として認められるようになってきた。また、米国ＦＤＡ（食品医薬品局）は、乳がん、大腸がん、前立腺がんについてのＣＴＣの臨床的有用性を認め体外診断薬として認可するに至っている。しかしながら、現状のＣＴＣの検出・測定技術は、対象とするがん細胞が特定できている場合等、特定のＣＴＣに限定された検出・測定技術にならざるを得ない理由があり、広範のがん細胞に適用できるＣＴＣの検出・測定技術はいまだに見いだせていない。
　現在広く利用されているＣＴＣの検出方法としては、免疫磁気的分離検出方法が知られている（Proc. Natl. Acad. Sci, USA,95:4589-4594,1998；ＷＯ９９／４１６１３；特表２００２－５０３８１４号公報）。この方法は、上皮がん細胞の上皮細胞接着分子（Epithelial cell adhesion molecule：ＥｐＣＡＭ、“ＣＤ３２６”）に対するモノクローナル抗体を固定化した磁気ビーズを用い、試料中のＣＴＣの上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的として結合させ、該磁気的に標識化したＣＴＣを、磁気的濃縮により、富化することにより、試料中に微量に含まれるＣＴＣを検出する方法である。この免疫磁気的分離検出方法を応用して、各種のＣＴＣの検出方法も開示されている。
　例えば、ＷＯ２００７／１３３４６５（特表２００９－５３７０２１号公報）には、体液由来の免疫磁気的標的ＣＴＣを、蛍光発色団で標識し、該標識化した細胞を、ビームホモジナイザーを導入したTime-delayed integrating imaging (TDI）技術によって、二次元的に分布したＣＴＣのイメージをスキャンして獲得することにより、血液中の希少なＣＴＣを迅速かつ正確に検出する方法及びそのための装置が開示されている。また、特開２００７－１７８１９３号公報、特開２０１２－１０３０７７号公報には、上皮細胞表面抗原（ＥｐＣＡＭ）特異的抗体によって不動化した磁気ビーズ上に捕捉されたがん細胞を、該表面抗原とは別の上皮特異的表面抗原（サイトケラチン）に対する蛍光標識抗体で蛍光染色し、該蛍光染色された細胞数を計数するとともに、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法（fluorescent in situ hybridization, FISH）による発がん遺伝子とハイブリダイズする蛍光標識ＤＮＡプローブを用いた細胞核の染色を組み合わせて、蛍光染色された細胞数を計数と蛍光染色された細胞中の遺伝子を同時に検出する方法が開示されている。
　また、特開２０１４－１０５１５９号公報には、ヒト由来上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対するモノクロナール抗体（第１の抗体）を固定化した磁気ビーズを用いたＣＴＣの濃縮と、異なるエピトープを特異的に認識する蛍光標識した抗ＥｐＣＡＭモノクロナール抗体（第２の抗体）と、細胞核の染色法を用い、細胞の生存能力を維持したままＣＴＣの検出・定量の分析を行う方法（intact ＣＴＣ enumeration and analysis procedure： iCeap法）が、特開２０１４－１１２０９４号公報には、上皮細胞に特異的なマーカーであるサイトケラチン（ＣＫ）マーカーと、ライト・ギムザ（Wright－Giemsa）染料のような、形態、寸法又は核対細胞質の比によってＣＴＣを同定する細胞学的染料である第２のマーカーを用いてＣＴＣの同定及び特徴付けを行う方法が開示されている。
　更に、特開２０１４－３９４８０号公報には、ＥｐＣＡＭネガティブなＣＴＣの検出のために、ウロキナーゼ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子：ｕＰＡ）特異的蛍光基質を含有する培養面を用意し、該培養面で血液サンプルを播種、インキュベートすることにより、ウロキナーゼ特異的基質由来のシグナルを検出してＣＴＣを分離、回収する方法が開示されている。このように、従来より、ＣＴＣの検出については、ＣＴＣの細胞マーカー（細胞表面の特異的抗原）や、該細胞抗原に特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いてＣＴＣを検出する各種の検出方法が開示されているが、該ＣＴＣの検出・測定技術は、乳がん、大腸がん、前立腺がんなどのような対象とするがんが特定できている場合に適用することが可能であるという制約がある。したがって、対象とするがん細胞が特定できていない場合の、広範のがんに対しても、該がんのＣＴＣを、効果的に検出・測定する技術はいまだに見いだせていない。
　一方で、ＣＴＣの検出・測定方法において、ＣＴＣの細胞マーカー（細胞表面の特異的抗原）や、該細胞抗原に特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いずに、ＣＴＣを検出する方法も開示されている。例えば、特開２０１１－１６３８３０号公報には、ＣＴＣ捕捉用の孔径、孔数、配置が制御された微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイによって、血液試料中に含まれるＣＴＣを捕捉することが可能なマイクロ流体デバイスにより、血液からのＣＴＣの濃縮と、ＣＴＣの染色や洗浄のプロセスを一つのデバイス内で一貫して行い、自動化蛍光顕微鏡などを用いて迅速にＣＴＣを計数するＣＴＣの検出・測定方法が開示されている。また、特開２０１３－３６８１８号公報には、腫瘍細胞を含む体液を、密度が２．０×１０４～１．９×１０５、繊維径が１μｍ～１５μｍであるポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維等で成形された不織布からなる血球分離材と接触させることにより、腫瘍細胞と白血球及び血小板を捕捉し、該捕捉した体液中の腫瘍細胞が豊富な分画を、生理食塩水、緩衝液、デキストラン等からなる分離液を用いて分離・回収する方法が開示されている。
　更に、特開２０１４－２２４８００号公報には、間隙を形成する本体とカバーとを有し、該間隙は、間隙の注入口領域及び排出口領域を分離する分離エレメントを形成し、該分離エレメントは、間隙の表面と共にチャネルを画成し、該チャネルを通過する粒子について、より小さな粒子の通過と、より大きな粒子の通過の阻止によって、より大きな粒子であるＣＴＣと、より小さな粒子である血液球を分離するＣＴＣ等の分離方法が開示されている。これらのＣＴＣの分離・検出方法は、体液中に存在するＣＴＣを物理的に分離・検出するものであり、ＣＴＣの細胞マーカー（細胞表面の特異的抗原）や、該細胞抗原に特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いるものでないことから、対象とするがん細胞が特定できていないがんに対しても、該がんのＣＴＣの分離・検出に適用することが可能であるが、体液中に微量なレベルで存在するＣＴＣを上記のような方法で、確実に分離・検出することは難しいという問題がある。
　ＣＴＣを含めて、がん細胞の獲得は、がん研究、とりわけがんの遺伝子解析に基く、診断や予後判定、効果的ながん化学療法の選択などに欠かせないファクターとなる。また、がん免疫療法においては、がん細胞の獲得は、ワクチン開発、個別化医療においては更にオーダーメイドのワクチン開発の要となる技術である。更に、個別医療の免疫細胞移入療法においては、患者本人のがんに対する特異的細胞障害反応の担い手であるキラー細胞の誘導にも刺激物質とし、或いは誘導したキラー細胞の細胞障害性を測定する際の自己がん標的細胞としても欠かせないものである。また、近年、術後に再発転移する要因としてその存在が注目されているがん幹細胞の獲得は、現在、焦眉の急となっているがん幹細胞研究とその制御技術の開発にとって画期的な手段を提供するものとなる。
　これまで、医療現場において、がん細胞の取得には、生検や、手術材料から獲得する、生体に対し侵襲性の強い操作とそれに伴う転移促進・播種などの一定の危険性を伴う方法しか存在していなかった。したがって、これらのリスクを回避して、例えば、末梢血等から、安全、簡便、そして短期間でのＣＴＣの分離取得法を開発することは、がんの基礎的研究及び臨床的研究に極めて大きな貢献するものであり、ＣＴＣ分離取得の重要な意義をもつものである。
　がんの転移が、主に、リンパ行性ではなく、血行性に起こることが示されてから（Cancer Res. 11, 648-651,1951；CANCER JULY-AUGUST, Vol.13: 674-676, 1960）、５０年以上の年月がたっているにもかかわらず、現在まで、末梢血からがん細胞を安定的に採取する方法は開発されていなかった。特定な対象に対する方法として、上記のように、末梢血中に存在するがん細胞由来のごく微量の細胞フラグメントを抗体で検出・増幅して、がんの存在の有無を検討する方法は、知られていた。しかし、該方法は既に抗体の結合目標となる物質を特定できているがん細胞にのみ適用可能な手段であった。したがって、その遊離物質が未知のがん細胞に関しては、適用不可能な手段であった。また、これと同じことは、がん細胞由来の遺伝子フラグメントをＰＣＲにより増幅し、がんの有無を検討する方法にも言える。すなわち、既に判明している遺伝子部分を増幅することで、がん細胞の有無を判定するわけで、未知の遺伝子を使用し、がん化している細胞には適用できない弱点がある。一方で、この弱点を克服する方法として、がん細胞の取得を生検や手術材料から獲得する生体侵襲を伴う方法が考えられるが、該がん細胞の取得は、原発巣からの生検或いは手術採取は可能で、許されるとしても、転移巣からの採取は、がん細胞の更なる播種を招く恐れがあり、倫理的にも許されるものではない。また、がんが特定されていない初期のがんに対しては、対応することが不可能である。
　以上のようながん細胞の検出・分離取得に対する医療現場のニーズの下で、ＣＴＣの検出・分離取得によるがん細胞の検出・分離取得は、極めて重要な意義を持っているが、現状では、血液やリンパ液のような生体循環体液中に、微量に存在するＣＴＣやＣＴＳＣを、当該腫瘍細胞がいかなるがんの細胞か特定できていない状態においても、確実かつ安定的に検出・分離取得する方法は開発できていない。したがって、血液やリンパ液のような生体循環体液、例えば、末梢血のような血液から、微量に存在するＣＴＣやＣＴＳＣを、がんが特定されていないがん細胞に対しても、安全、簡便で、確実かつ安定的に検出・分離取得する方法を開発することは、がんの基礎的、臨床的対応において、極めて重要な課題となっている。
特開２００７－１７８１９３号公報。 特開２０１１－１６３８３０号公報。 特開２０１２－１０３０７７号公報。 特開２０１３－３６８１８号公報。 特開２０１４－３９４８０号公報。 特開２０１４－１０５１５９号公報。 特開２０１４－１１２０９４号公報。 特開２０１４－２２４８００号公報。 特表２００２－５０３８１４号公報。 特表２００９－５３７０２１号公報。 ＷＯ９９／４１６１３。 ＷＯ２００７／１３３４６５。
Estimated using the method by Wum LM et al., Estimating lifetime and age-conditional probabilities of developing cancer, Lifetime Data Anal., 1998, 4 : 169-186. Breast Cancer Res Treat 2010, 124:403-412. New Engl. J Med 2004, 351:781-791. Clin Cancer Res 2008, 14：6302－6309 . J. Clin Oncol 2008, 26:3213-3221. Clin Cancer Res 2008, 14:7004-7010. Proc (Bayl Univ Med Cent) 2008, 21:127-132. J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20. Proc. Natl. Acad. Sci, USA,95:4589-4594,1998． Cancer Res. 11, 648-651,1951． CANCER JULY-AUGUST, Vol.13: 674-676, 1960．
　本発明の課題は、血液やリンパ液のような生体循環体液中に、微量に存在するＣＴＣ（循環腫瘍細胞）及びＣＴＳＣ（循環腫瘍幹細胞）を、当該腫瘍細胞がいかなるがんの細胞か特定できていない状態においても、かつ、生体循環体液中に微量に存在する状態においても、確実かつ安定的に検出・分離取得することが可能なＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法を開発することにある。
発明を解決するための手段
　本発明者は、上記課題を解決すべく、血液やリンパ液のような生体循環体液中に、微量に存在するＣＴＣ及びＣＴＳＣを、当該腫瘍細胞がいかなるがんの細胞か特定できていない状態においても、かつ、生体循環体液中に微量に存在する状態においても、確実かつ安定的に検出・分離取得することが可能なＣＴＣ及びＣＴＳＣの検出・分離取得方法について、鋭意検討する中で、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、その検出・分離取得のステップに、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣ（循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞）増殖用無血清培地からなる培養液を用いたＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの増殖ステップを設けることにより、試料中に僅かに存在するＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣを増幅し、確実かつ安定的に検出・分離取得することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の（１）～（４）の処理ステップを含む、細胞増殖法を用いた生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法からなる：
（１）生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第１のステップ、
（２）ウェルプレートに、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣ増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第２のステップ、
（３）第２のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第３のステップ、
（４）第３のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第４のステップ。
　本発明の細胞増殖法を用いたＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法により、循環体液等の、試料中に僅かに存在するＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣを増幅し、確実かつ安定的に検出・分離取得することができる。本発明のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法においては、生体循環体液を試料として行うことができるが、該生体循環体液からの試料としては、末梢血からの血液試料を、最も簡単に操作できる試料として、なおかつ、有効な試料として挙げることができる。
　本発明のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、第一のステップである、生体循環体液からの単核球相を得るステップは、生体循環体液からの試料を前処理し、生体循環体液に含まれる液体成分及び血球等の非細胞成分の除去のための処理を挙げることができる。
　本発明のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第２のステップは、ウェルプレートに、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣ増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートすることからなる。該ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣ増殖用無血清培地からなる培養液としては、細胞増殖用無血清培地であるＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液を挙げることができる。該培養液を用いることにより、細胞増殖法を用いた生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法におけるインキュベーションステップにおいて、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの短期間の増殖を可能とし、試料中に微量に存在するＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣを増殖・増幅して、確実かつ安定的に検出・分離取得することを可能とする。該ＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液としては、ＡＩＭ－Ｖ培養液、或いは、ＡＩＭ－Ｖ培養液に、被験者の自己血清、健常人由来のＡＢ血清及びパルミチン酸（Palmitic Acid）又はその塩から選択される１又は２以上を添加した培養液を用いることができる。第２のステップにおけるインキュベートの条件は、その増殖温度及び増殖期間について、適宜、適合した条件を定めることができるが、最適には、３７℃、３～７日間を増殖温度及び増殖期間の基準条件として行うことができる。また、第２のステップにおけるインキュベートの条件として、５％ＣＯ２に調整されたインキュベーター内条件で行うことができる。
　すなわち、本発明のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において用いられる、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣ増殖用無血清培地からなる培養液は、ＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液を用いることができるが、該ＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液としては、基本培地として、ＡＩＭ－Ｖ培養液自体を用いることができる。また、該ＡＩＭ－Ｖ培養液に、被験者の自己血清、健常人由来のＡＢ血清及びパルミチン酸（Palmitic Acid）又はその塩から選択される１又は２以上を添加した培養液を用いることにより、ＣＴＣの誘導効果を上げることができ、より効率の良い、安定したＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離効果を得ることができる。特に、パルミチン酸（Palmitic Acid）又はその塩は、安全かつ安定的にＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離を可能とする添加成分として挙げることができる。
　本発明のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、第２のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第３のステップは、ウェルプレートで所定時間インキュベートして得られた培養物から、適宜手段で、培養液を除去する処理からなる。また、本発明のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、第３のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第４のステップは、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を、検鏡、染料染色、抗原－抗体染色、等の検出手段を用いて、そのまま検出するか、或いは、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を、分離して、各種検出用のがん細胞として取得することからなる。
　本発明のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法の構築の経緯について説明すれば、生体循環体液中に、微量に存在するＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣを確実かつ安定的に検出・分離取得するには、試料中に微量に存在するＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣを、短期間のうちに効果的に増殖し、増幅することが必要となる。そして、該細胞増殖法を用いたＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法を構築するためには、ＣＴＣ及びＣＴＳＣの増殖を可能とする、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣ増殖用無血清培地を探索することが課題となる。そこで、本発明者は本発明の課題を解決すべく鋭意検討する中で、ＣＴＣの分離、取得について、末梢血単核球の標準的培養液であるＲＰＭＩ－１６４０培養液（ＲＰＭＩ－１６４０）を基準に無血清培地ＡＩＭ－Ｖ培養液（ＡＩＭ－Ｖ）と比較した。すなわち、これら培養液に、それぞれ５％の児牛血清（ＦＢＳ）又は末梢血提供者の自己血清（Autologous Serum：ＡＳ）を添加培養し、それら各培養液間のＣＴＣ分離、取得の有無及び効果を検討した。その結果、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの分離、取得には、ＡＩＭ－Ｖが有用で、また、ＡＳ添加がその効果を増強することを実証した。
　更に、上記培養液の結果を基礎に、自己血清採取による患者負担の増加を回避し、なおかつ、被験者の病状毎の血清成分の変動の影響を排除するため、新たなＣＴＣの分離取得因子としてパルミチン酸（Palmitic Acid）を含む各種の候補、ＬＰＳ、Con A、ＰＨＡ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βを検討し、最も安全かつ効率の良い因子の探索を実施した。この検討経過でＬＰＳにもＣＴＣの誘導効果は観察されたが、ＬＰＳは極めて強い毒性を持つ物質であることから、ＣＴＣ分離後の各種研究、臨床応用の技術開発という目的から鑑みれば、試薬としては安全上不適切であると判断し、以後の実験では除外することとした。その結果、ＣＴＣ取得にとって、その供給や性質（他に感染させてはならないウイルスキャリヤー等）上、不安定要因である自己血清を排除しても、安全かつ安定的にＣＴＣを分散することができる新規因子として、パルミチン酸（Palmitic Acid）が極めて有用であることを実証した。以上から、ＣＴＣの安定した分取には、ＡＩＭ－Ｖ培養液、或いは、ＡＩＭ－Ｖ培養液に、被験者の自己血清、健常人由来のＡＢ血清及びパルミチン酸（Palmitic Acid）又はその塩から選択される１又は２以上を添加した培養液、その中でも特に、パルミチン酸（Palmitic Acid）又はその塩を添加した培養液が有用であることを実証し、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち具体的には本発明は、次の請求項からなる。
［１］以下の（１）～（４）の処理ステップを含む、生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法：
（１）生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第１のステップ、
（２）ウェルプレートに、循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第２のステップ、
（３）第２のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第３のステップ、
（４）第３のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第４のステップ。
［２］第２のステップで、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするための循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液が、ＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液であることを特徴とする前記［１］に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
［３］第２のステップで、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするためのＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液が、ＡＩＭ－Ｖ培養液、或いは、ＡＩＭ－Ｖ培養液に、被験者の自己血清、健常人由来のＡＢ血清及びパルミチン酸又はその塩から選択される１又は２以上を添加した培養液であることを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
［４］生体循環体液からの試料が、末梢血からの血液試料であることを特徴とする、前記［１］～［３］のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
［５］第１のステップの生体循環体液からの試料の前処理が、生体循環体液に含まれる液体成分及び非細胞成分の除去であることを特徴とする前記［１］～［３］のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
［６］第２のステップにおけるインキュベートが、３７℃、３～７日間を増殖温度及び増殖期間の基準条件として行われることを特徴とする前記［１］～［５］のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
［７］第２のステップにおけるインキュベートが、５％ＣＯ２に調整されたインキュベーター内で行われることを特徴とする前記［６］に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
　本発明は、血液やリンパ液のような生体循環体液中に、微量に存在する循環腫瘍細胞及び循環腫瘍幹細胞を、当該腫瘍細胞がいかなるがんの細胞か特定できていない状態、かつ、生体循環体液中に微量に存在する状態においても、確実かつ安定的に検出・分離取得することが可能なＣＴＣの検出・分離取得方法を提供する。本発明のＣＴＣの検出・分離取得法は、ＣＴＣのみならず、ＣＴＳＣの検出・分離を可能とするものであり、がんの基礎的な解明や、臨床的な対応に、有力な手段を提供する。
　すなわち、本発明によって、ＣＴＣの効率的かつ安定的分取が可能となったことは、がんの研究において画期的な進展の可能性を与える。これまで、がん細胞なかんずくＣＴＳＣを末梢血等から効率的かつ安定的に検出、分離・分取できなかったことがＣＴＣ研究の遅延の主要な原因であった。このことに鑑みれば、本発明の技術により、ＣＴＣ研究が飛躍的に促進される基盤ができたことになる。本発明により、ＣＴＣの基礎的、臨床的研究を進めることが可能で、ＣＴＣの制御技術の開発に弾みをつけることが期待できる。
　本発明を使用した基礎的研究が進めば、ＣＴＣの細胞学的な多様な側面を遺伝学的に実態としての遺伝子などの物質レベルで検討することが可能となる。これにより、その増殖制御に関わる新規薬剤や、免疫学的にはＣＴＣの殺細胞性抗体などの新規薬剤開発に展望が開ける。また、臨床的にも、がん患者のステージ分類との比較、組織学的分類との比較、更には、得られた各種指標との相関性の追求が可能となる。更に、治療効果との関連性なども明らかにできることから、これまでになかった診断、治療、予後の評価判定に関しても、強固な科学的基盤を確立することが期待できる。したがって、本発明は、がんの基礎的解明、臨床的応用などの研究開発に極めて多大な貢献をなすものである。
図１は、がん細胞（ＣＴＣ）取得に効率的な培養液の選定試験において、培養液として、ＡＩＭ－Ｖ培養液及びＲＰＭＩ－１６４０培養液を用いたＣＴＣ取得試験で得られたものを顕微鏡で観察した結果（写真）を示す図である。図（１－ａ）は、ＡＩＭ－Ｖ培養液を用いたＣＴＣ取得の結果を、図（１－ｂ）は、ＲＰＭＩ－１６４０培養液を用いた場合のＣＴＣ取得の結果を示す。 図２は、本発明の実施例における、ＣＴＣ増殖用培養液で得られたがん細胞（ＣＴＣ）の形態変化の確認の試験において、「ＡＩＭ－Ｖ培養液単独で培養・取得したＣＴＣの形態変化の観察」の結果について、培養・取得したＣＴＣの顕微鏡画像を示す図である。図中、（２－ａ）、（２－ｂ）は、異なる患者のＣＴＣについて検討した結果（異なる患者からのがん細胞（ＣＴＣ）の顕微鏡写真）を示したものである。 図３は、本発明の実施例における、ＣＴＣ増殖用培養液で得られたがん細胞（ＣＴＣ）の形態変化の確認の試験において、「ＡＩＭ－Ｖ培養液に、Palmitic Acid（×１conc.）を添加培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察」の結果について、培養・取得したＣＴＣの顕微鏡画像を示す図である。図中、（３－ａ）、（３－ｂ）は、異なる患者のＣＴＣについて検討した結果（異なる患者からのがん細胞（ＣＴＣ）の顕微鏡写真）を示したものである。 図４は、本発明の実施例における、ＣＴＣ増殖用培養液で得られたがん細胞（ＣＴＣ）の形態変化の確認の試験において、「ＡＩＭ－Ｖ培養液に、Palmitic Acid（×４conc.）を添加培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察」の結果について、培養・取得したＣＴＣの顕微鏡画像を示す図である。図中、（４－ａ）、（４－ｂ）は、異なる患者のＣＴＣについて検討した結果（異なる患者からのがん細胞（ＣＴＣ）の顕微鏡写真）を示したものである。 図５は、本発明の実施例における、ＣＴＣ増殖用培養液で得られたがん細胞（ＣＴＣ）の形態変化の確認の試験において、「ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum培養液にて培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察」の結果について、培養・取得したＣＴＣの顕微鏡画像を示す図である。図中、（５－ａ）、（５－ｂ）は、異なる患者のＣＴＣについて検討した結果（異なる患者からのがん細胞（ＣＴＣ）の顕微鏡写真）を示したものである。 図６は、本発明の実施例における、ＣＴＣ増殖用培養液で得られたがん細胞（ＣＴＣ）の形態変化の確認の試験において、「ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum＋Palmitic Acid（×１conc.）条件下の培養液にて培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察」の結果について、培養・取得したＣＴＣの顕微鏡画像を示す図である。図中、（６－ａ）、（６－ｂ）は、異なる患者のＣＴＣについて検討した結果（異なる患者からのがん細胞（ＣＴＣ）の顕微鏡写真）を示したものである。 図７は、本発明の実施例における、ＣＴＣ増殖用培養液で得られたがん細胞（ＣＴＣ）の形態変化の確認の試験において、「ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum＋Palmitic Acid（×４conc.）条件下の培養液にて培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察」の結果について、培養・取得したＣＴＣの顕微鏡画像を示す図である。図中、（７－ａ）、（７－ｂ）は、異なる患者のＣＴＣについて検討した結果（異なる患者からのがん細胞（ＣＴＣ）の顕微鏡写真）を示したものである。 図８は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者： Ｋ．Ｈ．(Gastric Ca. :胃がん：liver meta.肝転移) から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図９は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｔ．Ｋ．(Tongue Ca. 舌がん) から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１０は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｋ．Ｈ．(Gastric Ca. :胃がん：liver meta.肝転移 から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１１は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｔ．Ｋ．(Tongue Ca. 舌がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１２は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｓ．Ｋ．（Kerato-cystic Ca. 角化嚢胞がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１３は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｓ．Ｏ．(Lung Ca. 肺がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１４は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１５は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｙ．Ｈ．（Lung Ca. 肺がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１６は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４５を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１７は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４５を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１８は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４５を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｙ．Ｈ．（Lung Ca. 肺がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図１９は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４７を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｇ．Ｎ．(Breast Ca. 乳がん：multiple metastasis多発転移性)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図２０は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４７を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｓ．Ｋ．(Kerato-cystic Ca. 角化嚢胞がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図２１は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４７を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｓ．Ｏ．(Lung Ca. 肺がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図２２は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４７を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図２３は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＤ４７を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｙ．Ｈ．(Lung Ca. 肺がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図２４は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＫII を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図２５は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＣＫIIを用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｙ．Ｈ．(Lung Ca. 肺がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図２６は、本発明の実施例における、患者末梢血から分離取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定の試験における、「膜抗原ＥｐＣＡＭ を用いたＣＴＣの確認及び同定」において、患者：Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)から分離取得したＣＴＣの顕微鏡写真（ａ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す図である。 図２７は、本発明の実施例における、「ヌードマウスにおけるＣＴＣの造腫瘍性又は長期生存の確認の試験」において、ＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（非蛍光発光像）の像と、膜抗原ＣＤ４５を用いた蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す図である。図中、（２７－ａ）、（２７－ｂ）は、患者Ｈ．Ｙ．からの試料から分離したＣＴＣ（ＨＹ－１）を「Nude1-1」に移植した場合のＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（Control）、及び、蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す。 図２８は、本発明の実施例における、「ヌードマウスにおけるＣＴＣの造腫瘍性又は長期生存の確認の試験」において、ＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（非蛍光発光像）の像と、膜抗原ＣＤ４５を用いた蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す図である。図中、（２８－ａ）、（２８－ｂ）は、患者Ｋ．Ｈ．からの試料から分離したＣＴＣ（ＫＨ－１）を「Nude1-2」に移植した場合のＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（Control）、及び、蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す。 図２９は、本発明の実施例における、「ヌードマウスにおけるＣＴＣの造腫瘍性又は長期生存の確認の試験」において、ＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（非蛍光発光像）の像と、膜抗原ＣＤ４５を用いた蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す図である。図中、（２９－ａ）、（２９－ｂ）は、患者Ｈ．Ｙ．からの試料から分離したＣＴＣ（ＨＹ－１）を「Nude2-1」に移植した場合のＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（Control）、及び、蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す。 図３０は、本発明の実施例における、「ヌードマウスにおけるＣＴＣの造腫瘍性又は長期生存の確認の試験」において、ＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（非蛍光発光像）の像と、膜抗原ＣＤ４５を用いた蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す図である。図中、（３０－ａ）、（３０－ｂ）は、患者Ｋ．Ｈ．からの試料から分離したＣＴＣ（ＫＨ－１）を「Nude2-2」に移植した場合のＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（Control）、及び、蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す。 図３１は、本発明の実施例における、「ヌードマウスにおけるＣＴＣの造腫瘍性又は長期生存の確認の試験」において、ＣＴＣを移植していない対照群ヌードマウスの「正常小腸組織細胞」についての顕微鏡写真の像（ａ）と、膜抗原ＣＤ４５を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真（ｂ）とを示す図である。 図３２は、樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）を用いたＣＤ４７陽性細胞（ＣＴＳＣ）の検出試験（Ｉ）において、樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）を試料として用い、ＣＴＣ細胞を増殖取得後、細胞膜上のＣＤ４７抗原により、該抗原陽性細胞の検出を行った結果を非蛍光色素染色の顕微鏡像、及び、蛍光色素染色法によるＣＤ４７陽性細胞像で表示した写真である。図３２中、（３２－ａ）は、非蛍光色素染色の顕微鏡像を、（３２－ｂ）は、蛍光色素染色法によるＣＤ４７陽性細胞像を示す。 図３３は、樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）を用いたＣＤ４７陽性細胞（ＣＴＳＣ）の検出試験（II）において、樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）を試料として用い、ＣＴＣ細胞を増殖取得後、細胞膜上のＣＤ４７抗原により、該抗原陽性細胞の検出を行った結果を非蛍光色素染色の顕微鏡像、及び、蛍光色素染色法によるＣＤ４７陽性細胞像で表示した写真である。図３３中、（３３－ａ）は、非蛍光色素染色の顕微鏡像を、（３３－ｂ）は、蛍光色素染色法によるＣＤ４７陽性細胞像を示す。
　本発明は、以下の（１）～（４）の処理ステップを含む増殖法を用いた生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法からなる：
（１）生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第１のステップ、
（２）ウェルプレートに、ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣ増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第２のステップ、
（３）第２のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第３のステップ、
（４）第３のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第４のステップ。
　本発明のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法においては、生体循環体液を試料として行うことができるが、該生体循環体液からの試料としては、末梢血からの血液試料を、最も簡単に操作できる試料として、なおかつ、有効な試料として挙げることができる。ＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得のための生体循環体液からの試料の採取に関しては、生体において、血液、体液の循環から孤立した臓器は一固体内には存在し得えず、そこに肉眼的にがんの存在を予測できなくても、すべての臓器からのＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣが分取可能である。例えば、ヌードマウスの背部皮下や皮内にヒト由来のＣＴＣを移植し、３か月後に脾臓を摘出、末梢血からの分離操作を実施することで、ヒト由来のＣＴＣを分離することに成功している。
　本発明の生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、第１のステップは、生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得るステップからなる。該ステップは、生体循環体液からの試料を前処理し、生体循環体液に含まれる液体成分及び血球等の非細胞成分の除去のための処理を挙げることができる。該生体循環体液に含まれる液体成分及び血球等の非細胞成分の除去のための処理は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、血液試料においては、遠心分離により、血液中の赤血球、白血球を分離除去する方法（遠心分離法）、細胞の密度を利用して、血液中の赤血球、白血球を分離除去する方法（密度勾配遠心法）、細胞のサイズの差を用いた血球の分離方法（フィルターを用いた分離法）等が挙げられるが、特に、好ましい方法としては、密度勾配遠心法を挙げることができる。その場合に、具体的には、ファイコール・アイソパーク密度勾配遠心分離法の処理条件を挙げることができる。
　本発明の生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、第２のステップにおいて、インキュベートに用いるＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣ増殖用無血清培地からなる培養液としては、ＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液を用いることができる。ＡＩＭ－Ｖ培養液は、Ｔ細胞等の増殖用培地として開発されたものであるが、該培養液自体は、市販のものから入手することができる。本発明の生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法における第２のステップについて説明すれば、第２のステップは、ウェルプレートに、細胞増殖用無血清培地であるＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液を注入したウェルプレートを用意し、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするステップからなる。該ＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液としては、ＡＩＭ－Ｖ培養液、或いは、ＡＩＭ－Ｖ培養液に、被験者の自己血清、健常人由来のＡＢ血清及びパルミチン酸又はその塩から選択される１又は２以上を添加した培養液を用いることができる。第２のステップにおけるインキュベートの条件は、状況に合わせて適宜設定することができるが、好ましくは、インキュベート内、５％ＣＯ２の条件下で、３７℃、３～７日間の条件で行うことができる。特に好ましくは、５％ＣＯ２、３７℃、７日間のインキュベート内条件、培養温度、及び培養期間の条件で行うことができる。
　本発明の生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、第３のステップは、第２のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去するステップからなる。プレートウェルからの培養液の除去は、適宜の手段により行うことができる。
　本発明の生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、第４のステップは、第３のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得するステップからなる。該第４のステップにおいて、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞は、検鏡、染料染色、抗原、抗体染色、等の検出手段を用いて、そのまま検出手段に付することができる。また、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を、分離して、各種検出用のがん細胞として取得することができる。
　本発明の生体循環体液中のＣＴＣ及び／又はＣＴＳＣの検出・分離取得方法において、分離取得されたがん細胞は、がんの診断、治療、予後の評価判定等、がんの解明、臨床的応用などのための研究用のがん細胞試料として、提供することができる。
　本発明で分離し、取得した細胞が、がん細胞であることの証明は、以下の基準から複数適当なものを選択し、確認することができる。例えば、（１）～（５）、（７）、（９）を選択し決定することができる。
　（確認基準）
（１）接触阻止現象が見られないこと。
（２）軟寒天内コロニー形成能を示すこと（当該方法は、浮遊性細胞に適用する方法である。）
（３）顕微鏡下で細胞の体積に比し異常な染色体の形態と容積が見られること。
（４）継代培養下分裂回数がヒト正常細胞では限界とされるヘイフリック限界の約５０回以上の分裂能を示すこと、すなわち仮に一週間に２～３回分裂するとして約半年間以上の間、継代培養し、永久増殖能・不死化を示すこと。
（遺伝学的、血清学的には）
（５）すでに判明しているがん幹細胞ＣＴＳＣの細胞表面マーカーであるＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＫII、ＥｐＣＡＭ等、抗原を単独或いは複数有すること。
（６）当該細胞の培養液中に、頭径部・食道扁平上皮がんではＳＣＣ、肺がんではＣＡ１２５、乳がんではＣＡ１５－３、肺がんではＡＦＰ、ＣＥＡ、すい臓がんではＣＥＡ、ＣＡ１９－９、大腸がんではＣＡ１９－９など、一般的に腫瘍マーカーとされる２４種類のマーカーのうち、少なくとも一つ以上が対照群に比べて陽性反応を示すこと。
（７）当該細胞から、TotalＲＮＡを精製し、遺伝子解析にかけ、がん関連遺伝子及びがん幹細胞遺伝子の発現が優位に認められること。
（取得細胞の造腫瘍性を観察するために）
（８）分離・取得したがん細胞のＤＮＡを精製し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入するとＮＩＨ３Ｔ３細胞の接触阻止現象が消失し、形態学的にがん細胞形質を発現することが観察されること。
（９）免疫不全ヌードマウス又はスキッドマウスに当該細胞を移植した時、移植細胞が造腫瘍性を示すこと。更に増殖した組織を再培養するとその組織細胞が増殖すること。
　上記のとおり、本発明の方法により、例えば、ヒト生体組織の代表として、最も簡便に操作できる末梢血から効率的に分離・検出したＣＴＣは、その分離・検出結果をがん療法の実施前後の効果の比較評価の指標として用いることができ、また、予後の評価に資することができる。また、本発明の方法により、ＣＴＣの高効率な分離取得が可能となったことにより、当該がんに対する有効な薬剤などの開発のように、新規な治療技術等の開発を促進することができる。すなわち、本発明により、いかなるがんか、不特定のがんに対しても、ＣＴＣの高効率な分離取得が可能となったことにより、がんの早期発見や、予後の分析評価を可能とすることのみならず、安定的に得られたＣＴＣの数的、形態的推移をもとに治療前後の評価の指標を確立し、ＣＴＣを制御する薬剤の開発や治療方法の開発を促進することができる。更に、基礎的、臨床的なＣＴＣ研究の安定的基盤を確立するための材料として、利用することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実験方法］：
本発明の実施例においては、以下の実験方法にしたがった。すなわち、実験試料（血液提供した各種がん患者からの末梢血）を以下の手順で、すべて無菌的に処理した。なお、あらかじめ、各協力施設からの情報で、ＨＢＶ、ＨＣＶなどの各種ウイルス感染のある場合は、その処理は非感染群とは別個に試験し、医療廃棄物処理専門業者による適正な医療廃棄物処理を実施した。
　（試料の採取：採血）
１．適量の抗凝固剤ヘパリンナトリウム（０．０５ｍｌ）入りのディスポーザブル３０ｍｌ採血用注射器を用意し、また、ヘパリンナトリウムの入っていない血清入手用の同３０ｍｌ採血注射器を用意した。これをＬ型１８０°三方活栓の各挿入口に、１８、２１、２４、ゲージ翼状針の適当なものを血管側に結合、採血の準備をした。血液は各々３０ｍｌ採血し、以下の分離操作を実施した。
　（試料の精製：血球分離）
２．血清採取は、採血注射筒に針を装着の上、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で、１時間静置処理し、その後４℃、３，０００回転（８００Ｇ）、３０分間遠心分離を実施した。上静を自己血清（ＡＳ）とし、４℃で冷所保存した。
３．一方、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）分離を目指すヘパリン採血管は、採血後よく採血管をローリングさせ、十分に混和した。その後、同量の（－）ＰＢＳを入れ混和、血液粘度を低下させた後、予め用意したファイコール・アイソパーク（Ｆ／Ｉ）密度勾配遠心分離剤を５ｍｌ注入した１５ｍｌチューブに各５ｍｌずつＦ／Ｉに混和しないように、ゆっくりとＦ／Ｉ上面に注ぎ、静置した。これを、４℃、３，０００回転（１７１０Ｇ）で、３０分遠心分離し、Ｆ／Ｉと血漿との境界に単核球層を得た。これからＰＢＭＣｓを吸引採取し、（－）ＰＢＳを加えたのち、４℃、１２００回転（２７０Ｇ）、１５分間遠心分離を実施した。これを二度繰り返し、上静を除去後、予定した実験条件に適合する培養液（ＲＰＭＩ－１６４０、ＡＩＭ－Ｖ）を加え、以下の実験に使用した。
　（培養液中インキュベート）
４．得られたＰＢＭＣｓを、Ｉ×１０４／１００μｌとなるように調整し、９６穴プレート（BDFalcon社製、96 Well, Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom）、又は、３８４穴プレート（BD Falcon社製、384 Well, Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom）の各ウェルに実験計画に基き実験条件の１グループ３ウェルとし、１×１０４／１００μｌ（/well / 96 well plate or 1x104/25μl/well/384 well plate ）ずつ注入し、細胞の播種を終えた。培養液単独の場合は、そのウェルに更に１００μｌの当該培養液を注入し、５％ＡＳのグループ、又は各種添加薬剤（ＬＰＳ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、パルミチン酸（Palmitic Acid）)の使用グループに関しては、計画に従って濃度の配分が行われるように、１００μｌの溶液をそれぞれ用意し、注入した。全培養液量を２００μｌ／ウェルとして、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに、所定時間、静置培養し、実験を開始した。
　（培養液の除去：付着性細胞の検出）
５．培養開始１週間後、各ウェルから培養液を吸引除去し、そこに（－）ＰＢＳを１００μｌずつ注入し、よくウェル内を洗浄した後、廃棄し、この操作を二度繰り返した。その後、再度（－）ＰＢＳを１００μｌ注入し、顕微鏡にて各ウェル中の付着性細胞をその形態学的特徴（大きさ、形状、細胞内顆粒の存在様式など）から正常ＰＢＭＣｓを分別し、算出した。
　１グループ３ウェルの細胞数を算出後、その平均値と標準誤差（Average± SE）を算出した。［これらの実験は、約２年間にわたり、同一患者等において複数回実施し、病期（Stage I～IV）や病状（悪化、改善傾向）の変化にもかかわらず、がんが存在している限り、それらデータで、取得ＣＴＣｓ数の減少がみられるものの、常に全体として、薬剤に対する反応としては再現性を持ち、同一傾向を示すことを確認し、正式データとして採用した。（各種データ参照）もちろん、がんが治癒したとみなされる段階の患者においては、この処理による付着性がん細胞の検出は、１個以下になることも判明した。また、健常人と考えられるものからは、該付着性細胞は検出されなかった。］
　（蛍光染色によるＣＴＳＣの検出）
６．あらかじめ当該処理により得られた付着細胞をＣＴＣ（ＣＴＳＣ）の表面抗源とされるＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＫII、ＥｐＣＡＭなどの特異抗体で結合させ、その後ＦＩＴＣ結合合二次抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、当該処理で取得した付着性細胞が、ＣＴＣ（ＣＴＳＣ）であることを実証した（染色像参照）。
　（使用薬剤の誘導効果の検討）
７．各種培養条件を設定し、使用薬剤のＣＴＣ（ＣＴＳＣ）誘導効果について検討した。使用した各種薬剤濃度などに関しては、結果の表（Table）の中に記載した。
　（１）「培養液、添加薬剤の検討Ｉ」：
培養液については、ＣＴＣの分離取得について、末梢血単核球の標準的培養液であるＲＰＭＩ－１６４０培養液（以下、ＲＰＭＩ－１６４０と記載）を基準に無血清培地ＡＩＭ－Ｖ培養液（以下ＡＩＭ－Ｖと記載）と比較した。すなわち、これら培養液にそれぞれ５％の児牛血清（ＦＢＳ）又は末梢血提供者の自己血清（Autologous Serum：ＡＳ）又はＡＢ型血清を添加培養し、それら各培養液間のＣＴＣ分離、取得の有無及び効果を検討した。その結果として、ＣＴＣの分取にはＡＩＭ－Ｖが有用で、また、ＡＳ添加がその効果を増強すること、ＡＢ型血清はＡＳ血清より若干効果が減弱することなどを実証した。
　（２）「培養液、添加薬剤の検討II」：
更に、上記培養液の結果を基礎に、自己血清採取による患者負担の増加を回避し、尚かつ被験者の病状毎の血清成分の変動の影響を排除し、真に担癌患者血清でないのか否かが判然としないなど、ＡＢ型血清の持つ本質的不安定性を除去するため、新たなＣＴＣ分離取得因子としてパルミチン酸（Palmitic Acid）を含む各種添加成分（ＬＰＳ、ConA、ＰＨＡ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β）の候補を検討し、最も安全かつ効率の良い因子の探索を実施した。この検討経過で、ＬＰＳにもＣＴＣ誘導効果は若干観察されることもあったが、ＬＰＳは極めて強い毒性を持つ物質であるから、ＣＴＣ分離後の各種研究、臨床応用の技術開発という目的から鑑みれば、試薬としては安全上不適切であると判断し以後の実験では、除外することにした。結果として、ＣＴＣの安定した分取には、ＡＩＭ－Ｖ培養液とパルミチン酸（Palmitic Acid）添加が、最良の結果を得ることを確認した。
　（供試試料）
８．本発明の実験において、供試試料は、病院から提供された、舌癌、下顎悪性腫瘍、悪性リンパ腫、乳がん、肺がん、胃がん、前立腺がん、子宮肉腫などの末期がん患者から提供された試料を、供試試料として用いた。
　［がん細胞（ＣＴＣ）取得に効率的な培養液の選定試験（I）］
　＜供試培養液＞
供試培養液として、以下の培養液を用意し、用いた。
（１）ＲＰＭＩ－１６４０＋５％ＦＢＳ
（２）ＲＰＭＩ－１６４０＋５％Auto Serum（自己血清）
（３）ＡＩＭ－Ｖ（無血清培地単独）
（４）ＡＩＭ－Ｖ＋５％ＦＢＳ
（５）ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum（自己血清）
　＜実験方法＞
上記培養液を用い、実施例１に記載の実験方法に従って、各培養液におけるがん細胞（ＣＴＣ）取得効率（がん細胞検出精度）について試験した。
　（試験１：ＲＰＭＩ－１６４０を使用したＣＴＣ誘導能の検討）
培養液として、ＲＰＭＩ－１６４０を用い、これを共通の培養液として、該培養液を子牛血清（ＦＢＳ）添加群と、自己血清（Auto Serum）添加群とに分け、がん患者６名より採取した試料につき、そのＣＴＣ誘導能の有無を検討した。
　＜結果＞
結果を、表１に示す。表に示されるように、ＲＰＭＩ－１６４０培養液では、自己血清添加群とＦＢＳ添加群間でのがん細胞取得効率に顕著な差は見られず、いずれも取得効率は低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（試験２：ＲＰＭＩ－１６４０及びパルミチン酸（Plmitic Acid）を使用したＣＴＣ誘導能の検討）
培養液として、ＲＰＭＩ－１６４０にパルミチン酸（Plmitic Acid）を添加したものを使用し、これを共通の培養液として、該培養液を子牛血清（ＦＢＳ）添加群と、自己血清（Auto Serum）添加群とに分け、がん患者６名より採取した試料につき、そのＣＴＣ誘導能の有無を検討した。
　＜結果＞
結果を、表２に示す。表に示されるように、ＲＰＭＩ－１６４０培養液にパルミチン酸（Plmitic Acid）を添加したものでは、自己血清添加群とＦＢＳ添加群との間で、（＊）を除き、がん細胞取得効率に顕著な差は見られず、両方とも取得効率は低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（試験３：ＲＰＭＩ－１６４０及びＡＩＭ－Ｖを使用したＣＴＣ誘導能の検討）
ＲＰＭＩ－１６４０培養液と、ＡＩＭ－Ｖ培養液との間でのＣＴＣ誘導能の有無を比較検討した。ＲＰＭＩ－１６４０については、子牛血清（ＦＢＳ）添加群と、自己血清（Auto Serum）添加群との２群に分けて、がん患者６名より採取した試料につき、そのＣＴＣ誘導能の有無を検討した。
　＜結果＞
結果を、表３に示す。表に示されるように、ＡＩＭ－Ｖ培養液は、血清なしの単味で、子牛血清（ＦＢＳ） 又は自己血清（Auto Serum）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培養液のいずれの培養液に比較して、高いがん細胞取得効率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（試験４：ＡＩＭ－Ｖ培養液にＦＢＳを添加した培養液のＣＴＣ誘導能の検討）
ＡＩＭ－Ｖ培養液に子牛血清（ＦＢＳ）を添加した条件でのＣＴＣ誘導能の有無を検討した。
　＜結果＞
結果を、表４に示す。表に示されるように、ＡＩＭ－Ｖ培養液に子牛血清（ＦＢＳ）を添加した群では、高いがん細胞取得効率を示したが、患者ソース間で、がん細胞取得効率に大きな違いが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（試験５、ＡＩＭ－ＶにＦＢＳを添加した培養液に、パルミチン酸（Plmitic Acid）を添加した培養液のＣＴＣ誘導能の検討）
ＡＩＭ－Ｖ培養液に子牛血清（ＦＢＳ）を添加した培養液を共通とし、該培養液にパルミチン酸（Plmitic Acid）添加群を作成し、パルミチン酸（Plmitic Acid）非添加群との間で、ＣＴＣ誘導能を比較検討した。
　＜結果＞
結果を、表５に示す。表に示されるように、パルミチン酸（Plmitic Acid）非添加群では、試験４の場合と同様、患者間で、ＣＴＣ取得効率の相違がみられたが、パルミチン酸（Plmitic Acid）非添加群で、ＣＴＣ取得効率の悪かった患者ソースにおいても、パルミチン酸（Plmitic Acid）添加により（群）、ＣＴＣ取得効率の改善、増強が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（試験６．ＡＩＭ－Ｖ培養液単独と、ＡＩＭ－Ｖに自己血清（Auto Serum）添加培養液のＣＴＣ誘導能の検討）
ＡＩＭ－Ｖ培養液単独の群と、ＡＩＭ－Ｖに患者の自己血清（Auto Serum）を添加した群を用意し、両培養液間のＣＴＣ誘導能の比較検討を行った。
　＜結果＞
結果を、表６に示す。表に示されるように、ＡＩＭ－Ｖに患者の自己血清（Auto Serum）を添加した群では、（＊）の場合を除き、大部分の患者ソースにおいて、ＣＴＣ取得効率は向上した。いずれの場合も高いＣＴＣ取得効率が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（試験７．ＡＩＭ－Ｖに自己血清（Auto Serum）を添加した培養液に、パルミチン酸（Plmitic Acid）を添加した培養液のＣＴＣ誘導能の検討）
ＡＩＭ－Ｖ培養液に患者自己血清（Auto Serum）を添加した培養液を共通培養液とし、該培養液にパルミチン酸（Plmitic Acid）添加群を作成し、パルミチン酸（Plmitic Acid）非添加群との間で、ＣＴＣ誘導能を比較検討した。
　＜結果＞
結果を、表７に示す。表に示されるように、ＡＩＭ－Ｖ培養液に患者自己血清（Auto Serum）を添加した培養液の群に、パルミチン酸（Plmitic Acid）を添加した群と添加しなかった非添加群との間で、ＣＴＣ取得効率において、対照的な二つの傾向が示された。すなわち、パルミチン酸非添加でＣＴＣ取得効率の高かった患者ソースでは、パルミチン酸（Plmitic Acid）添加で低下傾向を示した。一方、パルミチン酸非添加でＣＴＣ取得効率の低かった患者ソースでは、パルミチン酸（Plmitic Acid）添加でＣＴＣ取得効率の上昇が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（蛍光顕微鏡での観察）
上記試験１及び試験２で検討した、ＡＩＭ－Ｖ培養液及びＲＰＭＩ－１６４０培養液を用いたＣＴＣ取得試験で得られたものを蛍光顕微鏡で観察した結果（写真）を、図１に示す。図（１－ａ）は、ＡＩＭ－Ｖ培養液を用いたＣＴＣ取得の結果を、図（１－ｂ）は、ＲＰＭＩ－１６４０培養液を用いた場合のＣＴＣ取得の結果を示す。ＡＩＭ－Ｖ培養液を用いた場合には、多数のＣＴＣ細胞が認められ、ＣＴＣ誘導能が示されたが、ＲＰＭＩ－１６４０培養液を用いた場合には、ＣＴＣ細胞は、認められなかった。
　（総合評価）
以上の試験結果から、以下の結論が得られた。
（ｉ）ＲＰＭＩ－１６４０単独、及びＲＰＭＩ－１６４０＋５％Auto Serum（自己血清）添加の両グループでは、播種した末梢血由来単核球（PBMC）数（Ｉ×１０４／Well）の０．１％以上の単位で、ＣＴＣの誘導・分離・取得はできなかった。
（ii）ＡＩＭ－Ｖ単独では、播種した末梢血由来単核球（PBMC）の０．１～０．２％の範囲で、ＣＴＣの誘導・分離・取得ができた。
（iii）ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum（自己血清）添加グループでは、ＣＴＣ取得率が、２．２～２．７％へと、ＡＩＭ－Ｖ単独の場合の１４倍から２０倍へと増加した。
（iv）ＡＩＭ－Ｖに５０％の割合で、ＲＰＭＩ－１６４０を加えると、ＣＴＣ取得率が、ＲＰＭＩ－１６４０＋５％Auto Serum（自己血清）添加のグループと同一％へと低下した。
（v）上記（iv）の傾向は、ＲＰＭＩ－１６４０の２５％添加、ＲＰＭＩ－１６４０の１２．５％添加でも同様で、ＣＴＣの取得効果上昇は観察されなかった。
　この試験結果から、ＣＴＣの誘導・分離・取得に用いる培養液として、ＡＩＭ－Ｖが有用であり、該培養液にAuto Serum（ＡＳ）を添加することにより、ＣＴＣ取得効果を高めることができることが確認された。
　［がん細胞（ＣＴＣ）取得に効率的な培養液の選定試験（II）－添加物の影響］
　＜供試培養液＞
供試培養液として、以下の培養液を用意し、用いた。
（１）ＡＩＭ－Ｖ（無血清培地）
（２）ＡＳ(Auto Serum：自己血清）
（３）ＬＰＳ(Lipopolysaccharide)
（４）ＩＬ－１α(Interleukin 1 α)
（５）ＩＬ－１β(Interleukin 1 β)
（６）Palmitic Acid
　＜実験方法＞
上記培養液を用い、実施例１に記載の実験方法に従って、用意したがん患者末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を各ウェルに播種し、各培養液におけるがん細胞（ＣＴＣ）取得効率（がん細胞検出精度）における、添加物の影響について試験した。
　（試験８：ＡＩＭ－Ｖ培養液におけるＬＰＳ 添加の影響）
ＡＩＭ－Ｖ培養液（ＡＩＭ－Ｖ：Group A）を基本とし、そこにＡＳ（自己血清）を添加したグループ（ＡＩＭ－Ｖ＋ＡＳ：Group B）、更に、これらのグループにＬＰＳ(Lipopolysaccharide)を基本濃度を１conc. (Group E, F)とし、０．１conc.～１００conc.の濃度をそれぞれ添加した各グループ（Group GH, GD）を作成した。そして、それらのグループ間でのＣＴＣ分取効果を検討した。
　＜結果＞
結果を、表８に示す。表に示されるように、ＡＩＭ－Ｖ培養液にＬＰＳを添加したグループでは、ＬＰＳの添加量が少ないグループで、ＡＩＭ－Ｖ単独より効果はみられたが、ＡＩＭ－Ｖ＋ＡＳグループのＬＰＳ添加群では、どのＬＰＳ濃度添加グループでも、ＣＴＣ分取効率は激減した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（試験９：ＡＩＭ－Ｖ培養液におけるＩＬ－１α 添加の影響）
ＡＩＭ－Ｖ培養液（ＡＩＭ－Ｖ：Group A）を基本とし、そこにＡＳ（自己血清）を添加したグループ（ＡＩＭ－Ｖ＋ＡＳ：Group B）、更に、これらのグループにＩＬ－１α(Interleukin 1α)を基本濃度を１conc. (Group E, F)とし、０．１conc.～１００conc.の濃度をそれぞれ添加した各グループ（Group GH, GD）を作成した。そして、それらのグループ間でのＣＴＣ分取効果を検討した。
　＜結果＞
結果を、表９に示す。表に示されるように、ＡＩＭ－Ｖ培養液にＩＬ－１αを添加したグループでは、ＩＬ－１αの添加量の多賓に無関係にＡＩＭ－Ｖ単独と同等か、それ以下の効果しか認められなかった（Group C, E, G）。ＡＩＭ－Ｖ＋ＡＳグループのＩＬ－１α添加群では、どのＩＬ－１α濃度添加グループでも、非添加群よりＣＴＣ取得効率は減少した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（試験１０：ＡＩＭ－Ｖ培養液におけるＩＬ－１β添加の影響）
ＡＩＭ－Ｖ培養液（ＡＩＭ－Ｖ：Group A）を基本とし、そこにＡＳ（自己血清）を添加したグループ（ＡＩＭ－Ｖ＋ＡＳ：Group B）、更に、これらのグループにＩＬ－１β(Interleukin 1β)を基本濃度を１conc. (Group E, F)とし、０．１conc.～１００conc.の濃度をそれぞれ添加した各グループ（Group GH, GD）を作成した。そして、それらのグループ間でのＣＴＣ分取効果を検討した。
　＜結果＞
結果を、表１０に示す。表に示されるように、ＡＩＭ－Ｖ培養液にＩＬ－１βを添加したグループでは、ＩＬ－１βの添加量に応じて、ＡＩＭ－Ｖ単独と同等か、わずかに上回る程度の効果しか認められなかった（Group C, E, G）。ＡＩＭ－Ｖ＋ＡＳグループのＩＬ－１β添加群では、どのＩＬ－１β濃度添加グループでも、非添加群と同等程度のＣＴＣ取得効率しか認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（試験１１：ＡＩＭ－Ｖ培養液におけるPalmitic Acid 添加の影響）
ＡＩＭ－Ｖ培養液（ＡＩＭ－Ｖ：Group A）を基本とし、そこにＡＳ（自己血清）を添加したグループ（ＡＩＭ－Ｖ＋ＡＳ：Group B）、更に、これらのグループにPalmitic Acid を基本濃度を１conc. (Group G, H)とし、０．２５conc.～４conc.の濃度をそれぞれ添加した各グループ（Group KL, IJ, GH, EF, CD）を作成した。そして、それらのグループ間でのＣＴＣ分取効果を検討した。
　＜結果＞
結果を、表１１に示す。表に示されるように、ＡＩＭ－Ｖ培養液にPalmitic Acid を添加したグループでは、Palmitic Acid の添加量にほぼ無関係に、非添加群に比し２～３倍のＣＴＣ取得効率の上昇が確認された（Group C, E, G, I, K）。ＡＩＭ－Ｖ＋ＡＳグループのPalmitic Acid添加群では、どのPalmitic Acid濃度添加グループでも、濃度依存性は見られず、非添加群と同程度かそれ以下のＣＴＣ取得効率しか認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　（総合評価）
以上の試験結果から、次の結論が得られた：ＡＩＭ－Ｖ培養液に添加成分を添加することにより、ＣＴＣ取得効果を高めることを検討し、新たなＣＴＣ分離取得因子としてパルミチン酸（Palmitic Acid）を含む各種添加成分（ＬＰＳ、ConA、ＰＨＡ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β）の候補を検討し、最も安全かつ効率の良い因子の探索を実施した結果、結果として、ＣＴＣの安定した分取には、ＡＩＭ－Ｖ培養液にパルミチン酸（Palmitic Acid）を添加することが、最良の結果を得ることを確認した。なお、この検討経過で、ＬＰＳにもＣＴＣ誘導効果は若干観察されることもあったが、ＬＰＳは極めて強い毒性を持つ物質であるから、ＣＴＣ分離後の各種研究、臨床応用の技術開発という目的から鑑みれば、試薬としては安全上不適切であると判断し、以後の実験では、除外することにした。
　［ＣＴＣ増殖用培養液で得られたがん細胞（ＣＴＣ）の形態変化の確認］
実施例１の試験方法により、実施例２でＣＴＣ増殖用培養液を用いて取得されたがん細胞（ＣＴＣ）の形態変化について、顕微鏡画像により検証した。顕微鏡写真を図２～７に示す。各図中、（図－ａ）、（図－ｂ）は、ＣＴＣ細胞増殖実験における培養条件、すなわち、増殖用培養液と血清、又はパルミチン酸等の因子の有無や濃度などによる培養条件によるＣＴＣの形態的な特徴を、異なる患者のＣＴＣについて検討した結果（異なる患者からのがん細胞（ＣＴＣ）の顕微鏡写真）を示す。該実験は、各増殖条件の違いによるＣＴＣ細胞の形態的相違発現の有無を検討することを目的とし、（ａ）、（ｂ）は、異なる患者由来について、異なる患者由来であっても、同一培養条件では、同一の細胞形態を示すことを検証するためのものである。
　供試培養液の濃度において、パルミチン酸（Palmitic Acid）の濃度は、以下の表１２にしたがった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　＜１．ＡＩＭ－培養液単独で培養・取得したＣＴＣの形態変化の観察＞
ＡＩＭ－Ｖ培養液単独で培養・取得したＣＴＣの蛍光顕微鏡画像を図２（２－ａ；２－ｂ）に示す。ＡＩＭ－Ｖ培養液単独で培養・取得したＣＴＣの細胞形態において、細胞質内の核や顆粒成分に特に大きさの異常や濃染した部分は見当たらない。
　＜２．ＡＩＭ－Ｖ培養液に、Palmitic Acid（×１conc.）を添加培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察＞
ＡＩＭ－Ｖ培養液＋Palmitic Acid（×１濃度）を添加培養し、取得したＣＴＣの蛍光顕微鏡画像を図３（３－ａ；３－ｂ）に示す。ＡＩＭ－Ｖ培養液＋Palmitic Acid（×１濃度）を添加培養・取得したＣＴＣの細胞形態において、細胞質内の核や顆粒成分に、Palmitic Acid非添加群の場合に比べて、やや核成分の増加がみられるものの、特に大きさの拡大や濃染した部分は見られなかった。
　＜３．ＡＩＭ－Ｖ培養液に、Palmitic Acid（×４conc.）を添加培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察＞
ＡＩＭ－Ｖ培養液＋Palmitic Acid（×４濃度）を添加培養し、取得したＣＴＣの蛍光顕微鏡画像を図４（４－ａ；４－ｂ）に示す。ＡＩＭ－Ｖ培養液＋Palmitic Acid（×４濃度）を添加培養・取得したＣＴＣの細胞形態において、細胞の大きさの拡大、融合傾向がみられ（図４－ｂ）、細胞質内の核や顆粒成分に、Palmitic Acid非添加群（図２－ａ；２－ｂ）や、（×１濃度）添加群（図３－ａ；３－ｂ）の場合に比べて、核成分や細胞質内の核や顆粒成分の顕著な増加や濃染が観察される。
　＜４．ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum培養液にて培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察＞
ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum培養液にて培養し、取得したＣＴＣの蛍光顕微鏡画像を図５（５－ａ；５－ｂ）に示す。ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum培養液にて培養し、取得したＣＴＣの細胞形態において、細胞、細胞質内の核や顆粒成分に特に大きさの異常や濃染した部分は見られない。
　＜５．ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum＋Palmitic Acid（×１conc.）条件下の培養液にて培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察＞
ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum＋Palmitic Acid（×１濃度）培養液にて培養し、取得したＣＴＣの蛍光顕微鏡画像を図６（６－ａ；６－ｂ）に示す。ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum＋Palmitic Acid（×１濃度）培養液にて培養し、取得したＣＴＣの細胞形態において、細胞、細胞質内の核や顆粒成分に特に大きさの異常や濃染した部分は見られない。
　＜６．ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum＋Palmitic Acid（×４conc.）条件下の培養液にて培養し、取得したＣＴＣの形態変化の観察＞
ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum＋Palmitic Acid（×４濃度）培養液にて培養し、取得したＣＴＣの蛍光顕微鏡画像を図７（７－ａ；７－ｂ）に示す。ＡＩＭ－Ｖ＋５％Auto Serum＋Palmitic Acid（×４濃度）培養液にて培養し、取得したＣＴＣの細胞形態において、細胞の大きさの拡大、融合傾向がみられ(図７－ａ)、細胞質内の核や顆粒成分にPalmitic Acid非添加群（図５－ａ；５－ｂ）や、×１濃度添加群（図６－ａ；６－ｂ）に比べて、核成分や細胞質内顆粒成分の顕著な増加や濃染が観察される。該形態変化は、Palmitic Acid（×４濃度）培養液の条件下で、ＣＴＣ細胞の増殖・活性化により、核の異常増殖と細胞内小器官、エネルギー産生の主役であるミトコンドリア等を増加させると考えられ、その結果、顕微鏡像では、核酸や細胞内顆粒が増加し、核や細胞質が光の透過性を一層妨げ、濃染した状態が観察されると考えられる。
　（総合評価）
以上のＣＴＣ（ＣＴＳＣ）の形態変化の試験結果から、次の結論が得られた：ＡＩＭ－Ｖ培養液或いは、該培養液にAuto Serum及び／又はPalmitic Acidのような添加成分を添加した、ＣＴＣ増殖培養液を用いて、ＣＴＣを増殖取得することによりＣＴＣを確実かつ効果的に取得することができ、その際に、ＣＴＣの細胞形態には形態変化を起こさずに、増殖取得することが可能であることが確認された。すなわち、ＣＴＣ（ＣＴＳＣ）を増殖、取得する場合には、取得した細胞の形態には人工的変化を誘導しないことが、ＣＴＣの性質や特性を確認するために重要となり、したがって、ＣＴＣの形態や性状に特段の変化を誘導しない条件で、かつ、安定的にＣＴＣを増殖、取得できる方法であることが求められる。上記実験結果からは、該条件を満たしつつ、確実にＣＴＣ（ＣＴＳＣ）を増殖、取得することができる方法であることが確認された。
　［取得したＣＴＣの細胞膜抗原を用いた確認及び同定］
以下の実施例に示されるとおり、各患者末梢血から分離取得したＣＴＣについて、膜表面のＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＫII、ＥｐＣＡＭの各抗原を用いて、蛍光抗体染色法により、確認及び同定を行った。各試験における結果の各図の写真において、各（図－ａ）は、ＣＴＣの顕微鏡による写真の像を、各（図－ｂ）は、膜表面抗原を用いて染色した蛍光顕微鏡による写真像を示す。
　＜抗原染色方法＞
抗原染色の方法は、FITIC(fluorescein isothiocyanate) labelによる、以下の手順に従って、試料を調製し、染色、検鏡、観察・写真撮影した。
　（I．各種末梢血分離細胞の調製、及び、FITC label 一次抗体による抗原染色）
（１）付着細胞の酵素処理。（非付着細胞は（４）から開始する。）
（２）Trypsin ＥＤＴＡ処理。
（３）シングル細胞群に、５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ medium添加、酵素反応停止、吸引。
（４）遠心分離（１２００～１５００回転、４℃、７分）。
（５）４℃保冷下（－）ＰＢＳで洗浄・ボルテックス、遠心×２回。
（６）細胞数の計測・分注：１×１０６／１００μｌ／TUBE。
（７）細胞の各チューブの周囲を遮光のためにアルミホイールで覆い、４℃保冷下に３０分放置し、細胞の代謝活動を低下させる（表面抗原の細胞膜内外への運動・移動の阻止）。
（８）抗体の添加：１μｇ／２μｌ／１×１０６spin down cells（medium除去細胞群）４℃保冷下・遮光下で１時間染色。
（９）４℃保冷下、（－）ＰＢＳで洗浄・ボルテックス、遠心×２回：遠心分離（１２００～１５００回転、４℃、７分）。
（１０）適量の（－）ＰＢＳを細胞に加え、スライドグラス又はプレートに添加し、検鏡する。
（１１）蛍光顕微鏡にて観察・写真撮影。
　（II．各種末梢血分離細胞の調製、及び、各抗原に対する一次抗体染色、次いで、FITC label 二次抗体による抗原染色）
（１）付着細胞の酵素処理。（非付着細胞は（４）から開始する。）
（２）Trypsin ＥＤＴＡ処理。
（３）シングル細胞群に、５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ medium添加、酵素反応停止、吸引。
（４）遠心分離（１２００～１５００回転、４℃、７分）。
（５）４℃保冷下（－）ＰＢＳで洗浄・ボルテックス、遠心×２回。
（６）細胞数の計測・分注：１×１０６／１００μｌ／TUBE。
（７）細胞の各チューブの周囲を遮光のためにアルミホイールで覆い、４℃保冷下に３０分放置し、細胞の代謝活動を低下させる（表面抗原の細胞膜内外への運動・移動の阻止）。
（８）一次抗体の添加：１μｇ／２μｌ／１×１０６spin down cells（medium除去細胞群）４℃保冷下・遮光下で１時間染色。
（９）４℃保冷下、（－）ＰＢＳで洗浄・ボルテックス、遠心×２回：遠心分離（１２００～１５００回転、４℃、７分）。
（１０）二次抗体の添加：１μｇ／２μｌ／１×１０６spin down cells（medium除去細胞群）４℃保冷下・遮光下で１時間染色。
（１１）４℃保冷下、（－）ＰＢＳで洗浄・ボルテックス、遠心×２回：遠心分離（１２００～１５００回転、４℃、７分）。
（１２）適量の（－）ＰＢＳを細胞に加え、スライドグラス又はプレートに添加し、検鏡する。
（１３）蛍光顕微鏡にて観察・写真撮影。
　［膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定］
実施例１の方法により、各患者の末梢血から取得したＣＴＣについて、膜抗原ＣＤ４４を用いて、該ＣＴＣの確認及び同定を行った。
　＜膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定(I)＞
３人の患者：（１）Ｋ．Ｈ．(Gastric Ca. :胃がん：liver meta.肝転移)、（２）Ｔ．Ｋ．(Tongue Ca. 舌がん)、（３）Ｋ．Ｈ．（Gastric Ca. :胃がん：liver meta.肝転移)の末梢血から取得した、ＣＴＣの顕微鏡写真の像と、膜抗原ＣＤ４４を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図８～１０に示す。（図８－ａ～１０－ａ）は顕微鏡写真の像を、（図８－ｂ～１０－ｂ）は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真に示されるように、上記（１）～（３）の患者から取得されたＣＴＣは、ＣＤ４４による染色は示されなかった。
　＜膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定(II)＞
３人の患者：（１）Ｔ．Ｋ．(Tongue Ca. 舌がん)、（２）Ｓ．Ｋ．（Kerato-cystic Ca. 角化嚢胞がん)（３）Ｓ．Ｏ．(Lung Ca. 肺がん)の末梢血から取得した、ＣＴＣの顕微鏡写真の像と、膜抗原ＣＤ４４を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図１１～１３に示す。（図１２－ａ～１３－ａ）は顕微鏡写真の像を、（図１２－ｂ～１３－ｂ）は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真（図１２～１３）に示されるように、上記（２）～（３）の患者から取得されたＣＴＣは、ＣＤ４４による染色が示され、顕微鏡写真の像と、蛍光抗体顕微鏡の写真とが、一致し、取得したＣＴＣが上記がんのＣＴＣであることが確認された。
　＜膜抗原ＣＤ４４を用いたＣＴＣの確認及び同定(III)＞
２人の患者：（１）Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)、（２）Ｙ．Ｈ．（Lung Ca. 肺がん)の末梢血から取得した、ＣＴＣの顕微鏡写真の像と、膜抗原ＣＤ４４を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図１４～１５に示す。（図１４－ａ～１５－ａ）は顕微鏡写真の像を、（図１４－ｂ～１５－ｂ）は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真（図１４～１５）に示されるように、上記（１）～（２）の患者から取得されたＣＴＣは、ＣＤ４４による染色が示され、顕微鏡写真の像と、蛍光抗体顕微鏡の写真とが、一致し、取得したＣＴＣが上記がんのＣＴＣであることが確認された。
　［膜抗原ＣＤ４５を用いたＣＴＣの確認及び同定］
実施例１の方法により、各患者の末梢血から取得したＣＴＣについて、膜抗原ＣＤ４５を用いて、該ＣＴＣの確認及び同定を行った。
　２人の患者：（１）Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)、（２）Ｙ．Ｈ．（Lung Ca. 肺がん)の末梢血から取得した、ＣＴＣの顕微鏡写真の像と、膜抗原ＣＤ４５を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図１６～１８に示す。（図１６－ａ～１８－ａ）は顕微鏡写真の像を、（図１６－ｂ～１８－ｂ）は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真（図１６～１８）に示されるように、上記（１）～（２）の患者から取得されたＣＴＣは、ＣＤ４５による染色が示され、顕微鏡写真の像と、蛍光抗体顕微鏡の写真とが、一致し、取得したＣＴＣが上記がんのＣＴＣであることが確認された。ＣＴＣ（ＣＴＳＣ）の顕微鏡写真中、ＣＴＳＣ細胞の存在を、矢印で示す。各写真グループ（写真１－３：図１６～１８）中、左の顕微鏡写真で見られるＣＴＣ（ＣＴＳＣ）のうち、右の蛍光顕微鏡像で見られるように、大部分の細胞がＣＤ４５陽性ＣＴＳＣ細胞であることを示している。両端矢印で示したように、それらＣＤ４５陽性ＣＴＳＣ細胞は、その形態も大きさも多様性を持ち、一つの指標で判別できる細胞でないことが明らかである。
　［膜抗原ＣＤ４７を用いたＣＴＣの確認及び同定］
実施例１の方法により、各患者の末梢血から取得したＣＴＣについて、膜抗原ＣＤ４７を用いて、該ＣＴＣの確認及び同定を行った。
　５人の患者：（１）Ｇ．Ｎ．(Breast Ca. 乳がん：multiple metastasis多発転移性)、（２）Ｓ．Ｋ．(Kerato-cystic Ca. 角化嚢胞がん)、（３）Ｓ．Ｏ．(Lung Ca. 肺がん)、（４）Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)、（５）Ｙ．Ｈ．(Lung Ca. 肺がん)の末梢血から取得した、ＣＴＣの顕微鏡写真の像と、膜抗原ＣＤ４７を用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図１９～２３に示す。（図１９－ａ～２３－ａ）は顕微鏡写真の像を、（図１９－ｂ～２３－ｂ）は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真（図１９～２３）に示されるように、上記（１）～（５）の患者から取得されたＣＴＣは、ＣＤ４７による染色が示され、顕微鏡写真の像と、蛍光抗体顕微鏡の写真とが、一致し、取得したＣＴＣが上記がんのＣＴＣであることが確認された。各図の写真中、矢印はＣＤ４７陽性ＣＴＳＣを示す。白の矢印で示されるＣＴＳＣは、ＣＴＣ（ＣＴＳＣ）として増殖培養されているがん細胞において、ＣＤ４７陽性ＣＴＳＣを示すもので、細胞の大きさや形態の大小を問わずに観察されることが示されている。すなわち、ＣＤ４７陽性ＣＴＳＣは、決まった形態や大きさを有する細胞ではなく、様々なバリエーションを持つことが確認された。
　［膜抗原ＣＫIIを用いたＣＴＣの確認及び同定］
実施例１の方法により、各患者の末梢血から取得したＣＴＣについて、膜抗原ＣＫIIを用いて、該ＣＴＣの確認及び同定を行った。
　２人の患者：（１）Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)、（２）Ｙ．Ｈ．(Lung Ca. 肺がん)の末梢血から取得した、ＣＴＣの顕微鏡写真の像と、膜抗原ＣＫIIを用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図２４～２５に示す。（図２４－ａ～２５－ａ）は顕微鏡写真の像を、（図２４－ｂ～２５－ｂ）は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真（図２４～２５）に示されるように、上記（１）～（２）の患者から取得されたＣＴＣは、ＣＫIIによる染色が示され、顕微鏡写真の像と、蛍光抗体顕微鏡の写真とが、一致し、取得したＣＴＣが上記がんのＣＴＣであることが確認された。
　［膜抗原ＥｐＣＡＭを用いたＣＴＣの確認及び同定］
実施例１の方法により、各患者の末梢血から取得したＣＴＣについて、膜抗原ＥｐＣＡＭを用いて、該ＣＴＣの確認及び同定を行った。
　患者：（１）Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)の末梢血から取得した、ＣＴＣの顕微鏡写真の像と、膜抗原ＥｐＣＡＭを用いた蛍光抗体顕微鏡の写真を図２６に示す。（図２６－ａ）は顕微鏡写真の像を、（図２６－ｂ）は、蛍光抗体顕微鏡の写真を示す。写真（図２６）に示されるように、上記患者から取得されたＣＴＣは、ＥｐＣＡＭを細胞膜上に発現する細胞は極めて少数しか認められなかった。
　［ヌードマウスにおけるＣＴＣの造腫瘍性又は長期生存の検討］
実施例１の方法により、患者の末梢血から取得したＣＴＣが、ＣＴＣ細胞機能を保持するか否かを検討するために、該取得したＣＴＣの造腫瘍性又は長期生存の確認を行った。
　＜試験方法＞
患者Ｈ．Ｙ．(Breast Ca. 乳がん)からの試料から分離したＣＴＣ：ＣＴＣ－ＨＹ－１（ＨＹ－１）と、患者Ｋ．Ｈ．(Gastric Ca. :胃がん：liver meta.肝転移) から分離したＣＴＣ：ＣＴＣ－ＫＨ－１（ＫＨ－１）、を「実験群Ａ」と、「実験群Ｂ」の二つの実験群に分け、以下のとおり、患者から増殖分離採取したＣＴＣを移植した。
（実験群Ａ）：２匹のヌードマウス（Nude1-1；Nude1-2）に対して、「Nude1-1」には、ＣＴＣ（ＨＹ－１）を、「Nude1-2」には、ＣＴＣ（ＫＨ－１）をヌードマウスの背部皮下に１×１０６移植し、全観察期間三か月間造腫瘍性有無を検討した。期間後、当該ヌードマウスの末梢血と脾臓を採取し、ＣＴＣの分離、培養を実施した。増殖しているＣＴＣ移植群に残存している細胞につき、生残存が移植したＣＴＣであることを、非蛍光発光増（Control）及び膜表面ＣＤ４５抗原を用いた蛍光抗体法にて、染色検討し、ＣＴＣ の残存を確認した。
（実験群Ｂ）：２匹のヌードマウス（Nude2-1；Nude2-2）に対して、「Nude2-1」には、ＣＴＣ（ＨＹ－１）を、「Nude2-2」には、ＣＴＣ（ＫＨ－１）をヌードマウスの背部皮下に１×１０６移植し、同量の細胞を腹腔内にも移植した。実験群Ａの場合と同様に、増殖しているＣＴＣ移植群に残存している細胞につき、生残存が移植したＣＴＣであることを確認した。
　＜結果＞
ＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（非蛍光発光像）の像と、膜抗原ＣＤ４５を用いた蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を図２７～３０に示す。図中、（２７－ａ）、（２７－ｂ）は、ＣＴＣ（ＨＹ－１）を「Nude1-1」に移植した場合のＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（Control）、及び、蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を、（２８－ａ）、（２８－ｂ）は、ＣＴＣ（ＫＨ－１）を「Nude1-2」に移植した場合のＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（Control）、及び、蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す。図中、（２９－ａ）、（２９－ｂ）は、ＣＴＣ（ＨＹ－１）を「Nude2-1」に移植した場合のＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（Control）、及び、蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を、（３０－ａ）、（３０－ｂ）は、ＣＴＣ（ＫＨ－１）を「Nude2-2」に移植した場合のＣＴＣ移植群に残存している細胞の顕微鏡写真（Control）、及び、蛍光抗体顕微鏡（蛍光発光像）の写真を示す。写真（図２７～３０）に示されるように、ＣＴＣ移植群に残存している細胞は、膜抗原ＣＤ４５による染色が示され、顕微鏡写真の像と一致し、ＣＴＣ移植群に残存している細胞が上記がんのＣＴＣであることが確認された。参考として、正常小腸組織細胞の顕微鏡写真の像（３１－ａ）と、該細胞のＣＤ４５染色による蛍光顕微鏡による写真の像（３１－ｂ）を示す。図３１のとおり、正常小腸組織細胞においては、ＣＤ４５による染色は全く示されなかった。
　［樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）を用いたＣＤ４７陽性細胞（ＣＴＳＣ）の検出（Ｉ）］
既存の樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８：独立行政法人産業技術総合研究所、特許性物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－０８６１１）を用い、該樹立がん細胞株におけるＣＤ４７陽性細胞（ＣＴＳＣ）の検出について試験した。
　＜試験方法＞
樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）を試料として用い、実施例１の方法により、ＣＴＣ細胞を増殖取得後、細胞膜上のＣＤ４７抗原により、該抗原陽性細胞の検出を行った。結果を非蛍光色素染色の顕微鏡像、及び、蛍光色素染色法によるＣＤ４７陽性細胞像で表示した。
　結果を、図３２に示す。図３２中、（３２－ａ）は、非蛍光色素染色の顕微鏡像を、（３２－ｂ）は、蛍光色素染色法によるＣＤ４７陽性細胞像を示す。図中、太い矢印（⇒）は、ＣＤ４７陽性のＣＴＳＣを示し、両端矢印（←→）は、ＣＤ４７非陽性の細胞の大きさも形態も異なるＣＴＣがん細胞を示す。結果として、２０年超に及び形態培養された大部分のがん細胞では、本顕微鏡の視野（×２００倍）で見られるように、ＣＤ４７陽性ＣＴＳＣは極めて少数であることが観察された。また、がん細胞は形態状、円形や紡錘形、及びそれに近いものから、上下及び左右の対称性を示さない不規則な形態の細胞がほとんどであることも示された。一方、ＣＤ４７陽性ＣＴＳＣは、その形状は樹状細胞様に不規則な突起を張り出した特異な形状を呈していることが判明した。
　［樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）を用いたＣＤ４７陽性細胞（ＣＴＳＣ）の検出（II）］
実施例１２の場合と同様に、既存の樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８：ＦＥＲＭ　ＢＰ－０８６１１）を用い、該樹立がん細胞株におけるＣＤ４７陽性細胞（ＣＴＳＣ）の検出について再度試験した。
　＜試験方法＞
実施例１２の場合と同様に、樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）を試料として用い、実施例１の方法により、ＣＴＣ細胞を増殖取得後、細胞膜上のＣＤ４７抗原により、該抗原陽性細胞の検出を行った。結果を非蛍光色素染色の顕微鏡像、及び、蛍光色素染色法によるＣＤ４７陽性細胞像で表示した。
　結果を、図３３に示す。図３３中、（３３－ａ）は、非蛍光色素染色の顕微鏡像を、（３３－ｂ）は、蛍光色素染色法によるＣＤ４７陽性細胞像を示す。図中、太い矢印（⇒）は、ＣＤ４７陽性のＣＴＳＣを示し、両端矢印（←→）は、ＣＤ４７非陽性の細胞の大きさも形態も異なるＣＴＣがん細胞を示す。結果として、実施例１２の場合と同様の結果が得られた。すなわち、当樹立がん細胞株（ＵＴＣ－８）では、本顕微鏡の視野（×２００倍）で見られるように、ＣＤ４７陽性ＣＴＳＣは極めて少数であることが観察された。また、がん細胞は形態状、円形や紡錘形、及びそれに近いものから、上下及び左右の対称性を示さない不規則な形態の細胞がほとんどであることも示された。一方、ＣＤ４７陽性ＣＴＳＣは、その形状は樹状細胞様に不規則な突起を張り出した特異な形状を呈していることも判明し、該形態の特徴が鮮明に確認された。
　本発明は、血液やリンパ液のような生体循環体液中に、微量に存在する循環腫瘍細胞及び循環腫瘍幹細胞を、当該腫瘍細胞がいかなるがんの細胞か特定できていない状態においても、かつ、生体循環体液中に微量に存在する状態においても、確実かつ安定的に検出・分離取得することが可能なＣＴＣの検出・分離取得方法を提供する。本発明のＣＴＣの検出・分離取得方は、ＣＴＣのみならず、ＣＴＳＣの検出・分離を可能とするものであり、がんの基礎的な解明や、臨床的な対応に、有力な手段を提供する。

Claims (7)

  1. 　以下の（１）～（４）の処理ステップを含む、生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法：
    （１）生体循環体液からの試料を前処理し、単核球相を得る第１のステップ、
    （２）ウェルプレートに、循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液を注入したウェルプレートを用意し、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートする第２のステップ、
    （３）第２のステップでインキュベーションして得たプレートウェルから、培養液を除去する第３のステップ、
    （４）第３のステップの後、プレートウェルに付着した付着性腫瘍細胞を検出するか、或いは、分離取得する第４のステップ。
  2. 　第２のステップで、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするための循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞増殖用無血清培地からなる培養液が、ＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液であることを特徴とする請求項１に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
  3. 　第２のステップで、第１のステップで得た単核球を播種し、インキュベートするためのＡＩＭ－Ｖ培養液を基本とする培養液が、ＡＩＭ－Ｖ培養液、或いは、ＡＩＭ－Ｖ培養液に、被験者の自己血清、健常人由来のＡＢ血清及びパルミチン酸又はその塩から選択される１又は２以上を添加した培養液であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
  4. 　生体循環体液からの試料が、末梢血からの血液試料であることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
  5. 　第１のステップの生体循環体液からの試料の前処理が、生体循環体液に含まれる液体成分及び非細胞成分の除去であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
  6. 　第２のステップにおけるインキュベートが、３７℃、３～７日間を増殖温度及び増殖期間の基準条件として行われることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
  7. 　第２のステップにおけるインキュベートが、５％ＣＯ２に調整されたインキュベーター内で行われることを特徴とする請求項６に記載の生体循環体液中の循環腫瘍細胞及び／又は循環腫瘍幹細胞の検出・分離取得方法。
     
PCT/JP2016/001172 2016-03-03 2016-03-03 細胞増殖法を用いた循環腫瘍細胞の検出・分離取得方法 WO2017149564A1 (ja)

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