KR20180114209A - 세포 증식법을 이용한 순환종양세포의 검출·분리취득방법 - Google Patents

세포 증식법을 이용한 순환종양세포의 검출·분리취득방법 Download PDF

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Abstract

혈액이나 림프액과 같은 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 순환종양세포 및 순환종양줄기세포를, 해당 종양세포가 어떠한 암의 세포인지 특정되어 있지 않은 상태, 또한 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 상태에서도, 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하는 것이 가능한 CTC의 검출·분리취득방법을 제공하는 것을 과제로 하며, 이하의 (1) 내지 (4)의 처리단계를 포함하는, 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 의해 상기 과제를 해결한다: (1) 생체순환체액에서 채취된 시료를 전처리하여 단핵구상을 얻는 제1단계; (2) 웰 플레이트에 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액을 주입한 웰 플레이트를 준비하고, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여, 인큐베이션하는 제2단계; (3) 제2단계에서 인큐베이션하여 얻은 플레이트 웰로부터 배양액을 제거하는 제3단계; (4) 제3단계 후, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 검출하거나 혹은 분리취득하는 제4단계.

Description

세포 증식법을 이용한 순환종양세포의 검출·분리취득방법
본 발명은 인간 생체 조직, 즉 말초혈을 대표로 하는 순환 체액, 혹은, 이 체액을 통해 골수, 비장 등을 비롯한 체내 각종 장기로부터 순환 체액으로 침입해오는 종양(암)세포인 순환종양세포(Circulating Tumor Cells : CTC) 및 순환종양(암)줄기세포(Circulating Tumor Stem Cells : CTSC)를 검출·분리취득하는 방법에 관한 것으로, 특히, 혈액이나 림프액과 같은 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 순환종양세포 및 순환종양줄기세포를, 해당 종양세포가 어떠한 암의 세포인지 특정되어 있지 않은 상태에서도, 또한 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 상태에서도, 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하는 것이 가능한 순환종양세포(CTC) 및 순환종양줄기세포(CTSC)의 검출·분리취득방법을 제공하는 것에 관한 것이다.(또한, 이하의 설명에서, 순환종양세포(CTC) 및 순환종양줄기세포(CTSC)를 구별하여 설명할 필요가 있는 경우를 제외하고는 "순환종양세포(CTC)"라고 기재하고, 상기 "순환종양세포(CTC)"에는 "순환종양줄기세포(CTSC)"도 포함되는 의미로 설명한다.)
암 질환은 선진국에서 질병에 의한 사망률의 상위에 있다. 특히, 일본에서는 연령 조정 이환율(罹患率), 그 사망률 등의 통계에서는 감소 경향이 보인다고는 해도, 고령화나 당뇨병 등의 만성 질환의 암 발생·사망에 대한 기여도가 높으며, 이제는 2명 중 1명의 확률로 암에 걸리고, 3명 중 1명이 암으로 사망하는 등 매우 우려할만한 상황이 되고 있다(Estimated using the method by Wum LM et al., Estimating lifetime and age-conditional probabilities of developing cancer, Lifetime Data Anal., 1998, 4:169-186).
한편, 이들 암 질환에 대한 대처와 관련해서는 그 치료 기술의 개발에 대한 주력을 통해, 각종 암 치료 방법에 있어서 그 진전이 보이고 있다. 암 치료의 3대 요법인 수술 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 그리고 최근 주목받고 있는 면역 요법 등의 진보는 나름대로 눈부신 성과를 내고 있다. 그러나, 아직까지 수술후 재발, 소속 림프절 전이, 원격 전이 등을 충분히 제어하지 못하므로, 그 대책이 매우 시급하다. 또한, 최근에는 암 조직의 절제에 성공하더라도, 수술 후에 재발 전이하는 경우가 발견되고 있어, 해당 수술 후에 재발 전이하는 요인으로서, 암 줄기세포의 존재가 매우 중요하다는 사실도 알 수 있게 되었다(Breast Cancer Res Treat 2010, 124:403-412.; New Engl. J Med 2004, 351:781-791.; Clin Cancer Res 2008, 14: 6302-6309.; J. Clin Oncol 2008, 26:3213-3221.). 그리고, 그 메커니즘의 중심에, 체내를 순환하고 있는 CTC가 그 재발·전이에 관여하고 있음이 밝혀지게 되었다(Clin Cancer Res 2008, 14:7004-7010.; Proc (Bayl Univ Med Cent) 2008, 21:127-132.).
인간 생체 조직, 그 중에서도 각종 체내 모든 장기에 발생한 암세포·조직(이하, 백혈병을 포함해 악성 종양 전반을 가리키는 것으로 한다.)은 백혈병을 제외하고, 원발소(암 발생 장소)에서, 증식된 암세포는 접착 인자에 의해 결합하여 종양 조직을 형성한다. 그러나, 그 암세포는 원발소에 그치지 않고, 접착 인자의 이상이나 소실로 인해, 원발소로부터 유리(遊離)하며, 암세포 주위의 결합 조직이나 혈관, 림프관 벽을 분해하여, 혈액 속이나 림프액 속으로 침윤한다. 그 체액 속으로 침윤한 암세포는 체내를 순환하고 있는 혈액이나, 림프액과 함께 순환종양세포(Circulating Tumor Cells : CTC) 형태로 체내를 순환한다. 그 CTC가 혈액 등의 순환에 의해 다른 조직이나 장기에 운반되고, 다른 조직이나 장기에서, 혈관 등으로부터 기어나와, 새로이 접착 인자를 합성하고 정착하여 전이소를 형성한다. 이 CTC의 체내 순환, 전이소 형성이 암 전이의 메커니즘으로 생각되며, 암의 재발·전이에 관여하고 있다고 생각되고 있다.
암의 진단이나 치료의 확립에 있어, 원발소에 발생한 암의 특정이나 병태에 관한 정보를 암의 다른 조직이나 장기로의 전이가 일어나기 전에 조기에 얻는 것은 암의 진단이나 치료를 유효하게 수행하기 위해 극히 중요한 요인이며, 암의 다른 조직이나 장기로의 전이를 방지하기 위한 유력한 정보가 되는 것이다. 그를 위한 수단으로서, CTC 분석이 매우 중요한 요소(factor)로 주목받고 있다. 또한, CTC 분석은 암의 재발 예측이나 암 치료 효과의 평가에 있어서도 중요하게 여겨져, 예후의 예측이나 치료 효과의 판정에도 유효한 수단이 되는 것으로 보고되고 있다.
그러나, 혈액 속 등에서 순환하고 있는 CTC는 그 존재 레벨이 매우 낮고, 또한 혈중을 순환하고 있는 암세포의 반감기는 1시간 내지 24시간이라는 짧은 시간이기 때문에, 순환 체액 중에 존재하는 CTC를 검출하는 것은 극히 어려운 상황에 있다. 예를 들어, 말초혈로부터의 CTC 분리는 효율이 나쁘고, CTC에 관해, 2012년 세계공동연구 19시설의 보고(J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20.)에서도, 혈중 단핵구로부터 1/108, 즉 혈액 100ml에서 겨우 1개밖에 분리취득할 수 없다고 보고되고 있다. 이는 60kg 체중의 성인으로 환산해보면, 전체 말초혈 약 5리터(5000ml)를 전량 채혈하여도 50개라는 극히 낮은 확률로, 게다가 극히 소수의 CTC밖에 분리취득할 수 없다는 것이다. 이 사실이 CTC 연구의 가장 큰 저해 요인이 되어 왔다(J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20.).
최근, CTC의 검출·측정 기술이 발전되고, 검출·측정 기술의 진보로 인해 검출 감도나 측정 정밀도가 향상되게 되어, 혈액의 10만개 내지 1억개의 단핵 세포 중에 불과 몇 개 존재하는 암세포를 특이적으로 검출하는 것이 가능하게 되었다. 그리고, 유방암, 대장암, 전립선암 등의 전이성 암에서의 예후 예측이나 치료 효과 판정 등의 임상 정보를 얻을 수 있는 검사로서 인정받게 되었다. 또한, 미국 FDA(식품의약국)는 유방암, 대장암, 전립선암에 대한 CTC의 임상적 유용성을 인정하여 체외 진단약으로서 허가하기에 이르렀다. 그러나, 현재의 CTC의 검출·측정 기술은 대상으로 하는 암세포를 특정할 수 있는 경우 등, 특정 CTC에 한정된 검출·측정 기술이 될 수밖에 없는 이유가 있어, 광범위한 암세포에 적용될 수 있는 CTC의 검출·측정 기술은 아직까지 발견하지 못했다.
현재 널리 이용되고 있는 CTC 검출 방법으로는 면역 자기(磁氣)적 분리검출방법이 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 95:4589-4594,1998; WO99/41613; 일본 특허공표 2002-503814호 공보). 이 방법은 상피 암세포의 상피세포 접착분자(Epithelial cell adhesion molecule : EpCAM "CD326")에 대한 단클론 항체를 고정화한 자기(磁氣) 비드를 이용하고, 시료 중의 CTC의 상피세포 접착분자(EpCAM)을 표적으로서 결합시켜며, 그 자기적으로 표지화(labeling)한 CTC를 자기적 농축에 의해 부화(富化)함으로써, 시료 중에 미량으로 포함되는 CTC를 검출하는 방법이다. 이 면역 자기적 분리검출방법을 응용하여, 각종 CTC 검출 방법도 개시되어 있다.
예를 들어, WO2007/133465(일본 특허공표 2009-537021호 공보)에는 체액 유래의 면역 자기적 표적 CTC를 형광 발색단으로 표지하고, 그 표지화한 세포를 빔 호모게나이저(homogenizer)를 도입한 Time-delayed integrating imaging(TDI) 기술에 의해, 이차원적으로 분포된 CTC의 이미지를 스캔하여 획득함으로써, 혈액 중의 희귀한 CTC를 신속하고 정확하게 검출하는 방법 및 그를 위한 장치가 개시되어 있다. 또한, 일본 특허공개 2007-178193호 공보, 일본 특허공개 2012-103077호 공보에는 상피세포 표면항원(EpCAM) 특이적 항체에 의해 부동화한 자기 비드 상에 포착된 암세포를 그 표면항원과는 별도의 상피 특이적 표면항원(사이토케라틴)에 대한 형광 표지 항체로 형광 염색하고, 이 형광 염색된 세포수를 계수함과 아울러, 형광 인사이츄 하이브리다이제이션법(fluorescent in situ hybridization, FISH)에 의한 발암 유전자와 하이브리다이제이션하는 형광 표지 DNA 프로브를 이용한 세포핵의 염색을 조합하여, 형광 염색된 세포수를 계수와 형광 염색된 세포 중의 유전자를 동시에 검출하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 일본 특허공개 2014-105159호 공보에는, 인간 유래 상피세포 접착분자(EpCAM)에 대한 단클론 항체(제1항체)를 고정화한 자기 비드를 이용한 CTC의 농축과, 다른 에피토프를 특이적으로 인식하는 형광 표지한 항EpCAM 단클론 항체(제2항체)와, 세포핵 염색법을 이용하여, 세포의 생존 능력을 유지한 채 CTC의 검출·정량 분석을 수행하는 방법(intact CTC enumeration and analysis procedure : iCeap법)이 개시되어 있으며, 일본 특허공개 2014-112094호 공보에는, 상피세포에 특이적인 마커인 사이토케라틴(CK) 마커와, Wright-Giemsa 염료와 같은 형태, 치수 또는 핵 대 세포질의 비에 따라 CTC를 동정(同定)하는 세포학적 염료인 제2 마커를 사용하여 CTC의 동정 및 특징화를 수행하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 일본 특허공개 2014-39480호 공보에는 EpCAM 네거티브적 CTC의 검출을 위해, 우로키나제(우로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자 : uPA) 특이적 형광기질을 함유하는 배양면을 준비하고, 그 배양면에서 혈액 샘플을 파종, 인큐베이션함으로써, 우로키나제 특이적 기질 유래의 시그널을 검출하여 CTC를 분리, 회수하는 방법이 개시되어 있다. 이처럼, 종래부터 CTC 검출과 관련해서는 CTC의 세포 마커(세포 표면의 특이적 항원)나, 그 세포 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 등을 이용하여 CTC를 검출하는 각종 검색 방법이 개시되어 있는데, 그 CTC의 검출·측정 기술은 유방암, 대장암, 전립선암 등과 같은 대상으로 하는 암이 특정되어 있는 경우에 적용가능하다는 제약이 있다. 따라서, 대상으로 하는 암세포가 특정되어 있지 않은 경우의 광범위한 암에 대해서도, 그 암의 CTC를 효과적으로 검출·측정하는 기술은 아직까지 발견하지 못했다.
한편, CTC의 검출·측정 방법에 있어서, CTC의 세포 마커(세포 표면의 특이적 항원)나, 그 세포 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 등을 사용하지 않고 CTC를 검출하는 방법도 개시되어 있다. 예를 들면, 일본 특허공개 2011-163830호 공보에는, CTC 포착용 구멍 크기, 구멍 수, 배치가 제어된 미세 관통공을 갖는 사이즈 선택 마이크로 캐비티 어레이를 통해, 혈액 시료 중에 포함되는 CTC를 포착하는 것이 가능한 마이크로 유체 디바이스에 의해, 혈액으로부터의 CTC 농축과, CTC의 염색이나 세척 과정을 하나의 디바이스 내에서 일관되게 실시하고, 자동화 형광 현미경 등을 사용하여 신속하게 CTC를 계수하는 CTC 검출·측정 방법이 개시되어 있다. 또한, 일본 특허공개 2013-36818호 공보에는, 종양세포를 포함하는 체액을, 밀도가 2.0×104 내지 1.9×105이고 섬유 직경이 1μm 내지 15μm인 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유 등으로 성형된 부직포로 이루어진 혈구분리재와 접촉시킴으로써, 종양세포와 백혈구 및 혈소판을 포착하고, 그 포착한 체액 중의 종양세포가 풍부한 분획을, 생리 식염수, 완충액, 덱스트란 등으로 이루어지는 분리액을 이용하여 분리·회수하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 일본 특허공개 2014-224800호 공보에는, 간극을 형성하는 본체와 커버를 가지며, 그 간극은 간극의 주입구 영역 및 배출구 영역을 분리하는 분리 엘리먼트를 형성하고, 이 분리 엘리먼트는 간극의 표면과 함께 채널을 구획형성하고, 그 채널을 통과하는 입자에 대해, 보다 작은 입자의 통과와, 보다 큰 입자의 통과 저지를 통해, 보다 큰 입자인 CTC와, 보다 작은 입자인 혈액구를 분리하는 CTC 등의 분리 방법이 개시되어 있다. 이들 CTC의 분리·검출 방법은 체액 중에 존재하는 CTC를 물리적으로 분리·검출하는 것으로, CTC의 세포 마커(세포 표면의 특이적 항원)나, 상기 세포 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 등을 사용하는 것이 아니기 때문에, 대상으로 하는 암세포가 특정되어 있지 않은 암에 대해서도, 상기 암의 CTC 분리·검출에 적용하는 것이 가능하지만, 체액 중에 미량의 레벨로 존재하는 CTC를 상기와 같은 방법으로 확실하게 분리·검출하는 것은 어렵다는 문제가 있다.
CTC를 포함해 암세포의 획득은, 암 연구, 특히 암의 유전자 분석에 기반한, 진단이나 예후 판정, 효과적인 암 화학요법의 선택 등에 필수적인 요소가 된다. 또한, 암 면역요법에 있어서는, 암세포의 획득은 백신 개발, 개별화 의료에서는 더욱 맞춤형 백신 개발의 핵심이 되는 기술이다. 또한, 개별 의료의 면역세포 이입요법에서는 환자 본인의 암에 대한 특이적 세포 장애 반응의 담당인 킬러세포의 유도에도 자극 물질로서, 혹은 유도한 킬러세포의 세포 장애성을 측정할 때의 자가 암 표적세포로서도 빼놓을 수 없는 것이다. 또한, 최근, 수술 후에 재발 전이하는 요인으로서 그 존재가 주목받고 있는 암 줄기세포의 획득은, 현재 매우 시급한 암 줄기세포 연구와 그 제어기술의 개발에 있어 획기적인 수단을 제공하는 것이 된다.
이제까지, 의료 현장에서, 암세포의 취득에는 생검이나 수술 재료로부터 획득하는, 생체에 대해 침습성이 강한 조작과 그에 따른 전이 촉진·파종 등의 일정한 위험성을 동반하는 방법밖에 존재하지 않았다. 따라서, 이들 위험을 회피하여, 예를 들면, 말초혈 등으로부터 안전하고, 간편하고, 그리고 단기간의 CTC 분리취득법을 개발하는 것은 암의 기초적 연구 및 임상적 연구에 매우 큰 기여를 하는 것으로, CTC 분리취득의 중요한 의의를 가지는 것이다.
암의 전이가 주로 림프행성이 아니라, 혈행성으로 발생하는 것으로 확인되고 나서(Cancer Res. 11, 648-651,1951; CANCER JULY-AUGUST, Vol.13: 674-676, 1960), 50년 이상의 세월이 지났음에도 불구하고, 현재까지 말초혈로부터 암세포를 안정적으로 채취하는 방법은 개발되지 않았다. 특정 대상에 대한 방법으로서, 상기와 같이, 말초혈 중에 존재하는 암세포 유래의 극미량의 세포 단편(fragment)을 항체로 검출·증폭하여 암의 존재 여부를 검토하는 방법은 알려져 있었다. 그러나, 상기 방법은 이미 항체의 결합 목표가 되는 물질을 특정하고 있는 암세포에만 적용가능한 수단이었다. 따라서, 그 유리(遊離)물질이 알려져 있지 않은 암세포에 관해서는 적용 불가능한 수단이었다. 또한, 이와 같은 것은 암세포 유래의 유전자 단편을 PCR에 의해 증폭하여 암의 유무를 검토하는 방법에 대해서도 말할 수 있다. 즉, 이미 판명되어 있는 유전자 부분을 증폭함으로써, 암세포의 유무를 판정하는 것으로, 알려져 있지 않은 유전자를 사용하여, 암화되고 있는 세포에는 적용할 수 없는 약점이 있다. 한편, 그 약점을 극복하는 방법으로서, 암세포의 취득을 생검이나 수술 재료로부터 획득하는 생체 침습을 동반하는 방법을 생각해 볼 수 있는데, 이 암세포의 취득은 원발소로부터의 생검 혹은 수술 채취는 가능하고, 허용된다고 하더라도, 전이소로부터의 채취는 암세포의 추가 파종을 초래할 우려가 있어, 윤리적으로도 허용되는 것이 아니다. 또한, 암이 특정되지 않은 초기 암에 대해서는 대응하는 것이 불가능하다.
이상과 같은 암세포의 검출·분리취득에 대한 의료 현장의 요구 하에, CTC의 검출·분리취득에 의한 암세포의 검출·분리취득은 매우 중요한 의의를 가지고 있는데, 현재로는 혈액이나 림프액과 같은 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 CTC나 CTSC를, 해당 종양세포가 어떠한 암의 세포인지 특정되어 있지 않은 상태에서도, 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하는 방법은 개발되어 있지 않다. 따라서, 혈액이나 림프액과 같은 생체순환체액, 예를 들어, 말초혈과 같은 혈액으로부터, 미량으로 존재하는 CTC나 CTSC를, 암이 특정되지 않은 암세포에 대해서도 안전하고, 간편하며, 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하는 방법을 개발하는 것은 암의 기초적, 임상적 대응에 있어서 매우 중요한 과제가 되고 있다.
일본 특허 공개 2007-178193호 공보 일본 특허 공개 2011-163830호 공보 일본 특허 공개 2012-103077호 공보 일본 특허 공개 2013-36818호 공보 일본 특허 공개 2014-39480호 공보 일본 특허 공개 2014-105159호 공보 일본 특허 공개 2014-112094호 공보 일본 특허 공개 2014-224800호 공보 일본 특허 공표 2002-503814호 공보 일본 특허 공표 2009-537021호 공보 국제공개 WO99/41613 국제공개 WO2007/133465
Estimated using the method by Wum LM et al., Estimating lifetime and age-conditional probabilities of developing cancer, Lifetime Data Anal., 1998, 4 : 169-186. Breast Cancer Res Treat 2010, 124:403-412. New Engl. J Med 2004, 351:781-791. Clin Cancer Res 2008, 14：6302－6309. J. Clin Oncol 2008, 26:3213-3221. Clin Cancer Res 2008, 14:7004-7010. Proc (Bayl Univ Med Cent) 2008, 21:127-132. J Translational-medicine 2012, 10:138:1-20. Proc. Natl. Acad. Sci, USA,95:4589-4594,1998． Cancer Res. 11, 648-651,1951． CANCER JULY-AUGUST, Vol.13: 674-676, 1960．
본 발명의 과제는 혈액이나 림프액과 같은 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 CTC(순환종양세포) 및 CTSC(순환종양줄기세포)를, 해당 종양세포가 어떠한 암의 세포인지 특정되어 있는 않은 상태에서도, 또한 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 상태에서도, 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하는 것이 가능한 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법을 개발하는 데 있다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해, 혈액이나 림프액과 같은 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 CTC 및 CTSC를, 해당 종양세포가 어떠한 암의 세포인지 특정되어 있지 않은 상태에서도, 또한 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 상태에서도, 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하는 것이 가능한 CTC 및 CTSC의 검출·분리취득방법에 대해 열심히 검토하는 중에, CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 그 검출·분리취득 단계에, CTC 및/또는 CTSC(순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포) 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액을 이용한 CTC 및/또는 CTSC의 증식 단계를 마련함으로써, 시료 중에 소량 존재하는 CTC 및/또는 CTSC를 증폭하여, 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하는 것이 가능하다는 사실을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (4)의 처리단계를 포함하는, 세포 증식법을 이용한 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법으로 이루어진다:
(1) 생체순환체액에서 채취한 시료를 전처리하여 단핵구상(單核球相)을 얻는 제1단계,
(2) 웰 플레이트에, CTC 및/또는 CTSC 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액을 주입한 웰 플레이트를 준비하고, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여, 인큐베이션하는 제2단계,
(3) 제2단계에서 인큐베이션하여 얻은 플레이트 웰로부터 배양액을 제거하는 제3단계,
(4) 제3단계 후, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 검출하거나 혹은 분리취득하는 제4단계.
본 발명의 세포증식법을 이용한 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 의해, 순환체액 등의 시료 중에 소량 존재하는 CTC 및/또는 CTSC를 증폭하여 확실하고 안정적으로 검출·분리취득할 수 있다. 본 발명의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에서는 생체순환체액을 시료로 사용하여 실시할 수 있는데, 이 생체순환체액에서 채취한 시료로는 말초혈로부터 채취한 혈액 시료를 가장 쉽게 조작될 수 있는 시료로서, 또한 유효한 시료로서 들 수 있다.
본 발명의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 제1단계인, 생체순환체액으로부터의 단핵구상을 얻는 단계는, 생체순환체액에서 채취한 시료를 전처리하여, 생체순환체액에 포함되는 액체 성분 및 혈구 등의 비세포 성분의 제거를 위한 처리를 들 수 있다.
본 발명의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하고 인큐베이션하는 제2단계는, 웰 플레이트에 CTC 및/또는 CTSC 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액을 주입한 웰 플레이트를 준비하고, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여 인큐베이션하는 것으로 이루어진다. 상기 CTC 및/또는 CTSC 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액으로서는 세포 증식용 무혈청 배지인 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액을 들 수 있다. 그 배양액을 이용함으로써, 세포 증식법을 이용한 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법의 인큐베이션 단계에서, CTC 및/또는 CTSC의 단기간의 증식을 가능하게 하고, 시료 중에 미량으로 존재하는 CTC 및/또는 CTSC를 증식·증폭하여 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하는 것을 가능하게 한다. 상기 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액으로는 AIM-V 배양액, 혹은, AIM-V 배양액에 피험자의 자가혈청, 건강한 사람 유래의 AB 혈청 및 팔미트산(Palmitic Acid) 또는 그 염으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 첨가한 배양액을 사용할 수 있다. 제2단계에서의 인큐베이션 조건은 그 증식 온도 및 증식 기간에 대해 적절히 적합한 조건을 정할 수 있는데, 최적으로는 37℃, 3 내지 7일간을 증식 온도 및 증식 기간의 기준 조건으로 하여 수행할 수 있다. 또한, 제2 단계에서의 인큐베이션 조건으로서 5% CO2로 조정된 인큐베이터 내 조건에서 수행할 수 있다.
즉, 본 발명의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에서 사용되는, CTC 및/또는 CTSC 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액은 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액을 사용할 수 있는데, 상기 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액으로는 기본 배지로서 AIM-V 배양액 자체를 사용할 수 있다. 또한, 상기 AIM-V 배양액에 피험자의 자가혈청, 정상인 유래의 AB 혈청 및 팔미트산(Palmitic Acid) 또는 그 염으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 첨가한 배양액을 사용함으로써, CTC의 유도 효과를 높일 수 있으며, 보다 효율적인 안정된 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리 효과를 얻을 수 있다. 특히, 팔미트산(Palmitic Acid) 또는 그 염은, 안전하고 안정적으로 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리를 가능하게 하는 첨가 성분으로서 들 수 있다.
본 발명의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 제2단계에서 인큐베이션하여 얻은 플레이트 웰로부터 배양액을 제거하는 제3단계는, 웰 플레이트에서 소정 시간 인큐베이션하여 얻은 배양물로부터 적절한 수단으로 배양액을 제거하는 처리로 이루어진다. 또한, 본 발명의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 제3단계 후, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 검출하거나 혹은 분리취득하는 제4단계는, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 현미경 검사, 염료 염색, 항원-항체 염색 등의 검출수단을 사용하여 그대로 검출하거나, 혹은 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 분리하여 각종 검출용 암세포로서 취득하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법의 구축 경위에 대해 설명하면, 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 CTC 및/또는 CTSC을 확실하고 안정적으로 검출·분리취득하기 위해서는, 시료 중에 미량으로 존재하는 CTC 및/또는 CTSC를 단기간 내에 효과적으로 증식하여 증폭하는 것이 필요하게 된다. 그리고, 상기 세포 증식법을 이용한 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법을 구축하기 위해서는, CTC 및 CTSC의 증식을 가능하게 하는, CTC 및/또는 CTSC 증식용 무혈청 배지를 탐색하는 것이 과제가 된다. 이에, 본 발명자는 본 발명의 과제를 해결하기 위해 예의 검토하는 중에, CTC의 분리, 취득에 관해, 말초혈 단핵구의 표준적 배양액인 RPMI-1640 배양액(RPMI-1640)을 기준으로 무혈청 배지 AIM-V 배양액(AIM-V)과 비교하였다. 즉, 이들 배양액에 각각 5%의 소태아혈청(FBS) 또는 말초혈 제공자의 자가혈청(Autologous Serum : AS)을 첨가 배양하고, 그들 각 배양액간의 CTC 분리, 취득의 유무 및 효과를 검토하였다. 그 결과, CTC 및/또는 CTSC의 분리, 취득에는 AIM-V가 유용하고, 또한 AS 첨가가 그 효과를 증강시키는 것을 실증하였다.
또한, 상기 배양액의 결과를 기초로, 자가혈청 채취로 인한 환자 부담의 증가를 피하고, 나아가 피험자의 증상별 혈청 성분의 변동 영향을 배제하기 위해, 새로운 CTC의 분리취득 인자로서 팔미트산(Palmitic Acid)을 포함한 각종 후보, LPS, Con A, PHA, IL-1α, IL-1β를 검토하여, 가장 안전하고 효율적인 인자를 탐색하였다. 이 검토 경과에서 LPS에도 CTC의 유도 효과는 관찰되었지만, LPS는 매우 강한 독성을 지닌 물질이기 때문에, CTC 분리 후의 각종 연구, 임상 응용의 기술 개발이라는 목적을 감안하면, 시약으로서는 안전상 부적절하다고 판단하여, 이후의 실험에서는 제외하기로 하였다. 그 결과, CTC 취득에 있어, 그 공급이나 성질(그 외 감염시켜서는 안되는 바이러스 캐리어 등)상, 불안정 요인인 자가혈청을 배제하여도, 안전하고 안정적으로 CTC를 분산할 수 있는 신규 인자로서, 팔미트산(Palmitic Acid)이 매우 유용하다는 것을 실증하였다. 이상으로부터, CTC의 안정된 분리취득에는 AIM-V 배양액, 혹은, AIM-V 배양액에 피험자의 자가혈청, 건강한 사람 유래의 AB 혈청 및 팔미트산(Palmitic Acid) 또는 그 염으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 첨가한 배양액, 그 중에서도 특히, 팔미트산(Palmitic Acid) 또는 그 염을 첨가한 배양액이 유용하다는 사실을 실증하여, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.
즉, 구체적으로는, 본 발명은 다음과 같은 청구항으로 이루어진다.
[1] 이하의 (1) 내지 (4)의 처리 단계를 포함하는, 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법:
(1) 생체순환체액에서 채취한 시료를 전처리하여, 단핵구상을 얻는 제1단계,
(2) 웰 플레이트에 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액을 주입한 웰 플레이트를 준비하고, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여, 인큐베이션하는 제2단계,
(3) 제2단계에서 인큐베이션하여 얻은 플레이트 웰로부터 배양액을 제거하는 제3 단계,
(4) 제3단계 후, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 검출하거나 혹은 분리취득하는 제4단계.
[2] 제2단계에서, 제1 단계에서 얻은 단핵구를 파종하여 인큐베이션하기 위한 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액은 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액인 것을 특징으로 하는, 상기 [1]에 기재된 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
[3] 제2단계에서, 제1 단계에서 얻은 단핵구를 파종하여 인큐베이션하기 위한 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액은 AIM-V 배양액, 혹은, AIM-V 배양액에 피험자의 자가혈청, 건강한 사람 유래의 AB 혈청액 및 팔미트산 또는 그 염으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 첨가한 배양액인 것을 특징으로 하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
[4] 생체순환체액에서 채취한 시료는 말초혈로부터 채취한 혈액 시료인 것을 특징으로 하는, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
[5] 제1단계의 생체순환체액에서 채취한 시료의 전처리는 생체순환체액에 포함되는 액체 성분 및 비세포 성분의 제거인 것을 특징으로 하는, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
[6] 제2단계에서의 인큐베이션은 37℃, 3 내지 7일간을 증식 온도 및 증식 기간의 기준 조건으로 하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
[7] 제2단계에서의 인큐베이션은 5% CO2로 조정된 인큐베이터 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 상기 [6]에 기재된 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
본 발명은 혈액이나 림프액과 같은 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 순환종양세포 및 순환종양줄기세포를, 해당 종양세포가 어떠한 암의 세포인지 특정되어 있지 않은 상태, 또한, 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 상태에서도, 확실하고 안정적으로 검출·분리하는 것이 가능한 CTC의 검출·분리취득방법을 제공한다. 본 발명의 CTC의 검출·분리취득방법은 CTC뿐만 아니라, CTSC의 검출·분리를 가능하게 하는 것으로, 암의 기초적인 해명이나 임상적인 대응에 유력한 수단을 제공한다.
즉, 본 발명에 따라, CTC의 효율적이고 안정적인 분리취득이 가능하게 된 것은 암 연구에서 획기적인 진전 가능성을 부여한다. 지금까지, 암세포, 그 중에서도 CTSC를 말초혈 등으로부터 효율적이고 안정적으로 검출, 분리·분리취득할 수 없었던 것이 CTC 연구 지연의 주요한 원인이었다. 이 점을 감안하면, 본 발명의 기술에로 인해, CTC 연구가 비약적으로 촉진될 기반이 생기게 된 것이다. 본 발명에 따라, CTC의 기초적, 임상적 연구를 진행하는 것이 가능하고, CTC 제어 기술의 개발에 탄력을 받을 것으로 기대된다.
본 발명을 사용한 기초적 연구가 진행되면, CTC의 세포학적인 다양한 측면을 유전학적으로 실태로서의 유전자 등의 물질 레벨로 검토하는 것이 가능해진다. 이로써, 그 증식 제어에 관한 신규 약제나, 면역학적으로는 CTC의 살세포성 항체 등의 신규 약제 개발에 전망이 열린다. 또한, 임상적으로도 암 환자의 스테이지 분류와의 비교, 조직학적 분류와의 비교, 나아가서는 얻어진 각종 지표와의 상관성 추구가 가능하게 된다. 또한, 치료 효과와의 관련성 등도 밝힐 수 있기 때문에, 이제까지 없었던 진단, 치료, 예후의 평가 판정에 관해서도, 견고한 과학적 기반을 확립하는 것이 기대된다. 따라서, 본 발명은 암의 기초적인 해명, 임상적인 응용 등의 연구 개발에 매우 큰 공헌을 이루는 것이다.
도 1은 암세포(CTC) 취득에 효율적인 배양액의 선정 시험에서, 배양액으로서 AIM-V 배양액 및 RPMI-1640 배양액을 사용한 CTC 취득 시험에서 얻어진 것을 현미경으로 관찰한 결과(사진)를 나타낸 도면이다. 도 (1-a)는 AIM-V 배양액을 사용한 경우의 CTC 취득 결과를 나타내고, 도 (1-b)는 RPMI-1640 배양액을 사용한 경우의 CTC 취득 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른, CTC 증식용 배양액에서 얻은 암세포(CTC)의 형태변화 확인 시험에서, "AIM-V 배양액 단독으로 배양·취득한 CTC의 형태변화 관찰" 결과에 대해, 배양·취득한 CTC의 현미경 화상을 나타낸 도면이다. 도면 중, (2-a), (2-b)는 서로 다른 환자의 CTC에 대해 검토한 결과(서로 다른 환자로부터 채취한 암세포(CTC)의 현미경 사진)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른, CTC 증식용 배양액에서 얻은 암세포(CTC)의 형태변화 확인 시험에서, "AIM-V 배양액에 팔미트산(Palmitic Acid)(×1conc.)을 첨가 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰" 결과에 대해, 배양·취득한 CTC의 현미경 화상을 나타낸 도면이다. 도면 중, (3-a), (3-b)는 서로 다른 환자의 CTC에 대해 검토한 결과(서로 다른 환자로부터 채취한 암세포(CTC)의 현미경 사진)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른, CTC 증식용 배양액에서 얻은 암세포(CTC)의 형태변화 확인 시험에서, "AIM-V 배양액에 Palmitic Acid(×4conc.)을 첨가 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰" 결과에 대해, 배양·취득한 CTC의 현미경 화상을 나타낸 도면이다. 도면 중, (4-a), (4-b)는 서로 다른 환자의 CTC에 대해 검토한 결과(서로 다른 환자로부터 채취한 암세포(CTC)의 현미경 사진)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른, CTC 증식용 배양액에서 얻은 암세포(CTC)의 형태변화 확인 시험에서, "AIM-V + 5% Auto Serum 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰" 결과에 대해, 배양·취득한 CTC의 현미경 화상을 나타낸 도면이다. 도면 중, (5-a), (5-b)는 서로 다른 환자의 CTC에 대해 검토한 결과(서로 다른 환자로부터 채취한 암세포(CTC)의 현미경 사진)을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른, CTC 증식용 배양액에서 얻은 암세포(CTC)의 형태변화 확인 시험에서, "AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid(×1conc.) 조건하의 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰" 결과에 대해, 배양·취득한 CTC의 현미경 화상을 나타낸 도면이다. 도면 중, (6-a), (6-b)는 서로 다른 환자의 CTC에 대해 검토한 결과(서로 다른 환자로부터 채취한 암세포(CTC)의 현미경 사진)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른, CTC 증식용 배양액에서 얻은 암세포(CTC)의 형태변화 확인 시험에서, "AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid(×4conc.) 조건 하의 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰" 결과에 대해, 배양 ·취득한 CTC의 현미경 화상을 나타낸 도면이다. 도면 중, (7-a), (7-b)는 서로 다른 환자의 CTC에 대해 검토한 결과(서로 다른 환자로부터 채취한 암세포(CTC)의 현미경 사진)을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD44을 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자: K.H.(Gastric Ca. : 위암 : liver meta. 간전이)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈으로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : T.K.(Tongue Ca. 설암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : K.H.(Gastric Ca. : 위암 : liver meta. 간전이)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : T.K.(Tongue Ca. 설암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : S.K.(Kerato-cystic Ca. 각화 낭포암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : S.O.(Lung Ca. 폐암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : H.Y.(Breast Ca. 유방암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : Y.H.(Lung Ca. 폐암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD45를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : H.Y.(Breast Ca. 유방암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD45를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : H.Y.(Breast Ca. 유방암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD45를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : Y.H.(Lung Ca. 폐암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 19는 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD47을 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : G.N.(Breast Ca. 유방암 : multiple metastasis 다발 전이성)으로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD47을 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : S.K.(Kerato-cystic Ca. 각화 낭포암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 21은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD47을 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : S.O.(Lung Ca. 폐암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD47을 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : H.Y.(Breast Ca. 유방암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 23은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CD47을 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : Y.H.(Lung Ca. 폐암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 24는 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CKII를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : H.Y.(Breast Ca. 유방암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 25는 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 CKII를 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : Y.H.(Lung Ca. 폐암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 26은 본 발명의 실시예에 따른, 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정 시험의, "막 항원 EpCAM을 이용한 CTC의 확인 및 동정"에서, 환자 : H.Y.(Breast Ca. 유방암)로부터 분리취득한 CTC의 현미경 사진(a) 및 형광 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 27은 본 발명의 실시예에 따른, "누드마우스에서의 CTC의 종양원성(tumorigenicity) 또는 장기생존 확인 시험"에서, CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(비형광 발광 이미지) 이미지와, 막 항원 CD45를 이용한 형광 항체현미경(형광 발광 이미지) 사진을 나타낸 도면이다. 도면 중, (27-a), (27-b)는 환자 H.Y.로부터 채취한 시료에서 분리한 CTC(HY-1)를 "Nude1-1"에 이식한 경우의 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(Control) 및 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지)의 사진을 나타낸다.
도 28은 본 발명의 실시예에 따른, "누드마우스에서의 CTC의 종양원성 또는 장기생존 확인 시험"에서, CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(비형광 발광 이미지) 이미지와, 막 항원 CD45를 이용한 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지) 사진을 나타낸 도면이다. 도면 중, (28-a), (28-b)는 환자 K.H.로부터 채취한 시료에서 분리한 CTC(KH-1)를 "Nude1-2"에 이식한 경우의 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(Control) 및 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지) 사진을 나타낸다.
도 29는 본 발명의 실시예에 따른, "누드마우스에서의 CTC의 종양원성 또는 장기생존 확인 시험"에서, CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(비형광 발광 이미지) 이미지와, 막 항원 CD45를 이용한 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지) 사진을 나타낸 도면이다. 도면 중, (29-a), (29-b)는 환자 H.Y.로부터 채취한 시료에서 분리된 CTC(HY-1)를 "Nude2-1"에 이식한 경우의 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(Control) 및 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지) 사진을 나타낸다.
도 30은 본 발명의 실시예에 따른, "누드마우스에서의 CTC의 종양원성 또는 장기생존 확인 시험"에서, CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(비형광 발광 이미지) 이미지와, 막 항원 CD45를 이용한 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지) 사진을 나타낸 도면이다. 도면 중, (30-a), (30-b)는 환자 K.H.로부터 채취한 시료에서 분리한 CTC(KH-1)를 "Nude2-2"에 이식한 경우의 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(Control) 및 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지)의 사진을 나타낸다.
도 31은 본 발명의 실시예에 따른, "누드 마우스에서의 CTC의 종양원성 또는 장기생존 확인 시험"에서, CTC를 이식하지 않은 대조군 누드마우스의 "정상 소장 조직 세포"에 대한 현미경 사진의 이미지(a)와, 막 항원 CD45를 이용한 형광 항체 현미경 사진(b)을 나타낸 도면이다.
도 32는 수립 암세포주(UTC-8)를 이용한 CD47 양성 세포(CTSC)의 검출 시험 (I)에서, 수립 암세포주(UTC-8)를 시료로서 사용하여, CTC 세포를 증식 취득한 후, 세포막 상의 CD47 항원에 의해, 상기 항원 양성 세포를 검출한 결과를 비형광 색소 염색의 현미경 이미지, 및 형광 색소 염색법에 의한 CD47 양성 세포 이미지로 표시한 사진이다. 도 32 중, (32-a)는 비형광 색소 염색의 현미경 이미지를 나타내고, (32-b)는 형광 색소 염색법에 의한 CD47 양성 세포 이미지를 나타낸다.
도 33은 수립 암세포주(UTC-8)를 이용한 CD47 양성 세포(CTSC)의 검출 시험 (II)에서, 수립 암세포주(UTC-8)를 시료로서 사용하여, CTC 세포를 증식 취득한 후, 세포막 상의 CD47 항원에 의해, 상기 항원 양성 세포를 검출한 결과를 비형광 색소 염색의 현미경 이미지, 및 형광 색소 염색법에 의한 CD47 양성 세포 이미지로 표시한 사진이다. 도 33 중, (33-a)는 비형광 색소 염색의 현미경 이미지를 나타내고, (33-b)는 형광 색소 염색법에 의한 CD47 양성 세포 이미지를 나타낸다.
본 발명은 이하의 (1) 내지 (4)의 처리 단계를 포함하는 증식법을 이용한 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법으로 이루어진다:
(1) 생체순환체액에서 채취한 시료를 전처리하여 단핵구상을 얻는 제1단계,
(2) 웰 플레이트에, CTC 및/또는 CTSC 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액을 주입한 웰 플레이트를 준비하고, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여, 인큐베이션하는 제2단계,
(3) 제2단계에서 인큐베이션하여 얻은 플레이트 웰로부터 배양액을 제거하는 제3 단계,
(4) 제3단계 후, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 검출하거나 혹은 분리취득하는 제4단계.
본 발명의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에서는 생체순환체액을 시료로 사용하여 수행할 수 있는데, 이 생체순환체액에서 채취한 시료로는 말초혈로부터 채취한 혈액 시료를, 가장 간단하게 조작될 수 있는 시료로서 또한 유효한 시료로서 들 수 있다. CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득을 위한 생체순환체액로부터의 시료 채취에 관해서는, 생체에 있어, 혈액, 체액의 순환으로부터 고립된 장기는 한 고체 내에는 존재할 수 없으며, 거기에 육안으로 암의 존재를 예측할 수 없더라도, 모든 장기로부터의 CTC 및/또는 CTSC가 분리취득 가능하다. 예를 들면, 누드마우스의 등부분 피하나 피내에 인간 유래의 CTC를 이식하고, 3개월 후에 비장을 적출하여, 말초혈로부터의 분리 조작을 실시함으로써, 인간 유래의 CTC를 분리하는 데에 성공하였다.
본 발명의 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 제1단계는 생체순환체액로부터 채취한 시료를 전처리하여, 단핵구상을 얻는 단계로 이루어진다. 이 단계는 생체순환체액에서 채취한 시료를 전처리하고, 생체순환체액에 포함되는 액체 성분 및 혈구 등의 비세포 성분의 제거를 위한 처리를 들 수 있다. 이 생체순환체액에 포함되는 액체 성분 및 혈구 등의 비세포 성분의 제거를 위한 처리는 특별히 한정되지 않고, 공지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 혈액 시료에서는 원심분리에 의해, 혈액 중의 적혈구, 백혈구를 분리 제거하는 방법(원심분리법), 세포의 밀도를 이용하여 혈액 중의 적혈구, 백혈구를 분리제거하는 방법(밀도 구배 원심법), 세포의 크기 차이를 이용한 혈구의 분리방법(필터를 이용한 분리법) 등을 들 수 있는데, 특히, 바람직한 방법으로는 밀도 구배 원심법을 들 수 있다. 이 경우에, 구체적으로는 Ficoll-Isopaque 밀도 구배 원심분리법의 처리 조건을 들 수 있다.
본 발명의 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 제2단계에서, 인큐베이션에 사용하는 CTC 및/또는 CTSC 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액으로는, AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액을 사용할 수 있다. AIM-V 배양액은 T세포 등의 증식용 배지로서 개발된 것인데, 상기 배양액 자체는 시판의 것으로부터 입수할 수 있다. 본 발명의 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에서의 제2단계에 대해 설명하면, 제2단계는 웰 플레이트에, 세포 증식용 무혈청 배지인 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액을 주입한 웰 플레이트를 준비하고, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여 인큐베이션하는 단계로 이루어진다. 상기 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액으로는 AIM-V 배양액, 혹은, AIM-V 배양액에 피험자의 자가혈청, 건강한 사람 유래의 AB 혈청 및 팔미트산 또는 그 염으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상을 첨가한 배양액을 사용할 수 있다. 제2단계에서의 인큐베이션 조건은 상황에 맞게 적절히 설정할 수 있는데, 바람직하게는 인큐베이터 내부, 5% CO2의 조건하에 37℃, 3 내지 7일간의 조건으로 수행할 수 있다. 특히 바람직하게는 5% CO2, 37℃, 7일간의 인큐베이터 내부 조건, 배양 온도 및 배양 기간의 조건으로 수행할 수 있다.
본 발명의 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 제3단계는 제2단계에서 인큐베이션하여 얻은 플레이트 웰로부터 배양액을 제거하는 단계로 이루어진다. 플레이트 웰로부터 배양액을 제거하는 것은 적절한 수단에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어서, 제4단계는 제3단계 후, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 검출하거나 혹은 분리취득하는 단계로 이루어진다. 상기 제4단계에서, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포는 현미경 검사, 염료 염색, 항원, 항체 염색 등의 검출수단을 사용하여 그대로 검출수단에 부가할 수 있다. 또한, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 분리하여 각종 검출용 암세포로서 취득할 수 있다.
본 발명의 생체순환체액 중의 CTC 및/또는 CTSC의 검출·분리취득방법에 있어, 분리취득된 암세포는 암의 진단, 치료, 예후의 평가판정 등, 암의 해명, 임상적 응용 등을 위한 연구용 암세포 시료로서 제공할 수 있다.
본 발명에서 분리하여 취득한 세포가 암세포임을 증명하는 것은 이하의 기준에서 적당한 것을 복수개 선택하여 확인할 수 있다. 예를 들어, (1) 내지 (5), (7), (9)를 선택하여 결정할 수 있다.
(확인 기준)
(1) 접촉저지현상이 보이지 않는 것.
(2) 연한천 내의 콜로니 형성능을 나타내는 것(해당 방법은 부유성 세포에 적용하는 방법이다.)
(3) 현미경 하에서 세포의 체적에 비해 비정상적인 염색체의 형태와 용적이 보이는 것.
(4) 계대배양 하 분열 횟수가 인간 정상 세포에서는 한계로 여겨지는 헤이플릭 한계(Hayflick Limit)인 약 50회 이상의 분열능을 나타내는 것, 즉 만일 일주일에 2회 내지 3회 분열한다고 해서 약 반년 이상 동안, 계대배양하여 영구 증식능·불사화를 나타내는 것.
(유전학적, 혈청학적으로는)
(5) 이미 판명되어 있는 암 줄기세포 CTSC의 세포 표면 마커인 CD44, CD45, CD47, CKII, EpCAM 등, 항원을 단독 혹은 복수 가지는 것.
(6) 해당 세포의 배양액 중에, 두경부·식도 편평 상피암에서는 SCC, 폐암에서는 CA125, 유방암에서는 CA15-3, 폐암에서는 AFP, CEA, 췌장암에서는 CEA, CA19-9, 대장암에서는 CA19-9 등, 일반적으로 종양 마커로 여겨지는 24종류의 마커 중, 적어도 하나 이상이 대조군에 비해 양성 반응을 나타내는 것.
(7) 해당 세포로부터 Total RNA을 정제하고, 유전자 분석하여 암 관련 유전자 및 암 줄기세포 유전자의 발현이 우위로 인정되는 것.
(취득 세포의 종양원성을 관찰하기 위해)
(8) 분리·취득한 암세포의 DNA를 정제하고, NIH3T3 세포에 도입하면 NIH3T3 세포의 접촉저지현상이 소실되어, 형태학적으로 암세포 형질을 발현하는 것이 관찰되는 것.
(9) 면역 결핍 누드마우스 또는 스키드마우스에 해당 세포를 이식했을 때, 이식 세포가 종양원성을 나타내는 것. 또한, 증식한 조직을 재배양하면 그 조직 세포가 증식하는 것.
상기와 같이, 본 발명의 방법에 의해, 예를 들면, 인간 생체 조직의 대표로서, 가장 간편하게 조작될 수 있는 말초혈로부터 효율적으로 분리·검출한 CTC는 그 분리·검출 결과를 암 치료법의 실시 전후 효과에 대한 비교 평가의 지표로서 사용할 수 있으며, 또한, 예후 평가에 이바지할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해, CTC의 효율이 높은 분리취득이 가능하게 됨으로써, 해당 암에 대한 유효한 약제 등의 개발과 같이, 신규 치료기술 등의 개발을 촉진할 수 있다. 즉, 본 발명에 따라, 어떠한 암인지, 불특정 암에 대해서도 CTC의 효율이 높은 분리취득이 가능하게 됨으로써, 암의 조기 발견이나 예후의 분석 평가를 가능하게 할 뿐만 아니라, 안정적으로 얻어진 CTC의 수적, 형태적 추이를 바탕으로 치료 전후의 평가 지표를 확립하여, CTC를 제어하는 약제의 개발이나 치료 방법의 개발을 촉진할 수 있다. 또한, 기초적, 임상적인 CTC 연구의 안정적인 기반을 확립하기 위한 재료로서 이용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
[실험 방법] :
본 발명의 실시예에서는 이하의 실험 방법에 따랐다. 즉, 실험 시료(혈액을 제공한 각종 암 환자로부터 채취한 말초혈)를 이하의 수순으로, 모두 무균적으로 처리하였다. 또한, 미리, 각 협력시설로부터 받은 정보로, HBV, HCV 등의 각종 바이러스 감염이 있는 경우에는 그 처리는 비감염군과는 별개로 시험하여, 의료 폐기물 처리 전문업체에 의한 적정한 의료 폐기물 처리를 실시하였다.
(시료의 채취 : 채혈)
1. 적당량의 항응고제 헤파린나트륨(0.05ml)이 든 일회용(disposable) 30ml 채혈주사기를 준비하고, 또한, 헤파린나트륨이 들어 있지 않은 혈청 입수용의 동일한 30ml 채혈주사기를 준비하였다. 이것을 L형 180°3방활전(three-way stopcock)의 각 삽입구에 결합하고, 18, 21, 24 게이지 날개형 바늘 중 적당한 것을 혈관측에 결합하여, 채혈 준비를 하였다. 혈액은 각각 30ml 채혈하고, 이하의 분리 조작을 실시하였다.
(시료의 정제 : 혈구 분리)
2. 혈청 채취는 채혈 주사통에 바늘을 장착한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 1시간 동안 정치 처리하고, 그 후, 4℃에서 3,000 회전(800G)으로 30분간 원심분리를 실시하였다. 상청액을 자가혈청(AS)으로 하여 4℃에서 냉소 저장하였다.
3. 한편, 말초혈 단핵구(PBMCs) 분리를 목표로 하는 헤파린 채혈관은 채혈 후 채혈관을 잘 롤링시켜 충분히 혼합하였다. 그 후, 동량의 (-)PBS를 넣고 혼합하여 혈액 점도를 저하시킨 후, 미리 준비한 Ficoll-Isopaque(F/I) 밀도 구배 원심분리제를 5ml 주입한 15ml 튜브에 각 5ml씩 F/I에 섞이지 않도록, 천천히 F/I 상면에 부어 정치하였다. 이것을 4℃에서 3,000 회전(1710G)으로 30분간 원심분리하고, F/I와 혈장과의 경계에 단핵구층을 얻었다. 이로부터 PBMCs를 흡인채취하여 (-)PBS를 첨가한 후, 4℃에서 1200 회전(270G)으로 15분간 원심분리를 실시하였다. 이를 두번 반복하고 상청액을 제거한 후, 예정된 실험 조건에 적합한 배양액(RPMI-1640, AIM-V)을 첨가하여, 이하의 실험에 사용하였다.
(배양액 중 인큐베이션)
4. 얻어진 PBMCs를 1×104/100μl가 되도록 조정하여, 96-well plate(BDFalcon사제, 96 Well, Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom), 또는 384-well plate(BD Falcon사제, 384 well, Clear, Tissue Culture Treated plate, Flat Bottom)의 각 웰에 실험 계획에 따라 실험 조건의 1그룹 3웰로 하고, 1×104/100μl(/well/96 well plate or 1x104/25μl/well/384 well plate)씩 주입하여, 세포의 파종을 마쳤다. 배양액 단독인 경우에는 그 웰에 추가로 100μl의 해당 배양액을 주입하고, 5% AS의 그룹 또는 각종 첨가약제(LPS, IL-1α, IL-1β, 팔미트산(Palmitic Acid))의 사용 그룹에 관해서는 계획에 따라 농도의 배분이 이루어지도록, 100μl의 용액을 각각 준비하여 주입하였다. 전체 배양액 양을 200μl/웰로 하여, 37℃, 5% CO2 조건하의 인큐베이터에 소정 시간 정치배양하여, 실험을 시작하였다.
(배양액의 제거 : 부착성 세포의 검출)
5. 배양 시작 1주일 후, 각 웰로부터 배양액을 흡인 제거하고, 거기에 (-) PBS를 100μl씩 주입하고, 웰 안을 잘 세정한 후, 폐기하여, 이 조작을 두번 반복하였다. 그 후, 다시 (-)PBS를 100μl 주입하고, 현미경으로 각 웰 중의 부착성 세포를 그 형태학적 특징(크기, 형상, 세포 내 과립의 존재 양식 등)으로부터 정상 PBMCs를 분별하여 산출하였다.
1그룹 3웰의 세포 수를 산출한 후, 그 평균값과 표준 오차(Average±SE)를 산출하였다.[이들 실험은 약 2년간에 걸쳐, 동일한 환자 등에서 복수회 실시하여, 병기(病期)(Stage I 내지 IV)나 증상(악화, 개선 경향)의 변화에도 불구하고, 암이 존재하고 있는 한, 그들 데이터에서 취득 CTCs 수의 감소가 보이지만, 항상 전체적으로 약제에 대한 반응으로서는 재현성을 가지며, 동일 경향을 나타내는 것을 확인하여, 정식 데이터로서 채용하였다.(각종 데이터 참조) 물론, 암이 치유된 것으로 간주되는 단계의 환자에서는 그 처리에 의한 부착성 암세포의 검출은 1개 이하가 되는 것도 판명되었다. 또한, 건강한 사람으로 생각되는 것으로부터는 해당 부착성 세포는 검출되지 않았다.]
(형광 염색에 의한 CTSC의 검출)
6. 미리 해당 처리에 의해 얻어진 부착 세포를, CTC(CTSC)의 표면 항원이 되는 CD44, CD45, CD47, CKII, EpCAM 등의 특이항체로 결합시키고, 그 후 FITC 결합 이차항체로 염색하여, 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 해당 처리로 취득한 부착성 세포가 CTC(CTSC)임을 실증하였다(염색 이미지 참조).
(사용약제의 유도 효과 검토)
7. 각종 배양 조건을 설정하고, 사용약제의 CTC(CTSC) 유도 효과에 대해 검토하였다. 사용한 각종 약제 농도 등에 관해서는 결과 표(Table) 안에 기재하였다.
(1) "배양액, 첨가약제의 검토 I":
배양액에 대해서는 CTC의 분리취득에 대해, 말초혈 단핵구의 표준적 배양액인 RPMI-1640 배양액(이하, RPMI-1640으로 기재)을 기준으로 무혈청 배지 AIM-V 배양액(이하, AIM-V라고 기재)과 비교하였다. 즉, 이들 배양액에 각각 5% 소태아혈청(FBS) 또는 말초혈 제공자의 자가혈청(Autologous Serum : AS) 또는 AB형 혈청을 첨가 배양하고, 그들 각 배양액 간의 CTC 분리, 취득의 유무 및 효과를 검토하였다. 그 결과, CTC의 분리취득에는 AIM-V가 유용하며, 또한, AS 첨가가 그 효과를 증강하는 것, AB형 혈청은 AS 혈청보다 약간 효과가 저하되는 것 등을 실증하였다.
(2) "배양액, 첨가 약제의 검토 II":
또한, 상기 배양액의 결과를 기초로, 자가혈청 채취로 인한 환자 부담의 증가를 회피하고, 또한 피험자의 질환 상태별 혈청 성분 변동의 영향을 배제하고, 참으로 암환자 혈청이 아닌지의 여부가 명확하지 않는 등, AB형 혈청이 가지는 본질적인 불안정성을 제거하기 위해, 신규 CTC 분리취득인자로서 팔미트산(Palmitic Acid)을 포함하는 각종 첨가 성분(LPS, ConA, PHA, IL-1α, IL-1β)의 후보를 검토하여, 가장 안전하고 효율적인 인자의 탐색을 실시하였다. 이 검토 경과에서, LPS에도 CTC 유도 효과는 약간 관찰되는 일도 있었지만, LPS는 매우 강한 독성을 가진 물질이기 때문에, CTC 분리 후의 각종 연구, 임상 응용의 기술개발이라는 목적을 감안하면, 시약으로는 안전상 부적절하다고 판단하여 이후의 실험에서는 제외하기로 하였다. 결과적으로, CTC의 안정된 분리취득에는 AIM-V 배양액과 팔미트산(Palmitic Acid) 첨가가 최상의 결과를 얻는 것을 확인하였다.
(공시 시료)
8. 본 발명의 실험에서, 공시 시료는 병원에서 제공된 설암, 하악 악성 종양, 악성 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 전립선암, 자궁 육종 등의 말기 암 환자로부터 제공받은 시료를 공시 시료로서 사용하였다.
실시예 2
[암세포(CTC) 취득에 효율적인 배양액의 선정 시험(I)]
<공시 배양액>
공시 배양액으로서, 이하의 배양액을 준비하여 사용하였다.
(1) RPMI-1640 + 5% FBS
(2) RPMI-1640 + 5% Auto Serum(자가혈청)
(3) AIM-V(무혈청 배지 단독)
(4) AIM-V + 5% FBS
(5) AIM-V + 5% Auto Serum(자가혈청)
<실험 방법>
상기 배양액을 사용하여, 실시예 1에 기재된 실험 방법에 따라, 각 배양액에서의 암세포(CTC) 취득 효율(암세포 검출 정밀도)에 대해 시험하였다.
(시험 1 : RPMI-1640을 사용한 CTC 유도능의 검토)
배양액으로서 RPMI-1640을 사용하고, 이를 공통의 배양액으로 하여, 그 배양액을 소태아혈청(FBS) 첨가군과 자가혈청(Auto Serum) 첨가군으로 나누어, 암환자 6명으로부터 채취한 시료에 대해, 그 CTC 유도능의 유무를 검토하였다.
<결과>
결과를 표 1에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, RPMI-1640 배양액에서는 자가혈청 첨가군과 FBS 첨가군간의 암세포 취득 효율에 현저한 차이는 보이지 않으며, 모두 취득 효율은 낮았다.
Figure pct00001
(시험 2 : RPMI-1640 및 팔미트산(Palmitic Acid)을 사용한 CTC 유도능의 검토)
배양액으로서, RPMI-1640에 팔미트산(Palmitic Acid)을 첨가한 것을 사용하고, 이를 공통의 배양액으로 하여, 그 배양액을 소태아혈청(FBS) 첨가군과 자가혈청(Auto Serum) 첨가군으로 나누어, 암환자 6명으로부터 채취한 시료에 대해, 그 CTC 유도능의 유무를 검토하였다.
<결과>
결과를 표 2에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, RPMI-1640 배양액에 팔미트산(Palmitic Acid)을 첨가한 것에서는 자가혈청 첨가군과 FBS 첨가군 사이에서, (*)를 제외하고, 암세포 취득 효율에 현저한 차이는 보이지 않으며, 양쪽 모두 취득 효율은 낮았다.
Figure pct00002
(시험 3 : RPMI-1640 및 AIM-V를 사용한 CTC 유도능의 검토)
RPMI-1640 배양액과 AIM-V 배양액 사이에서의 CTC 유도능의 유무를 비교 검토하였다. RPMI-1640에 대해서는 소태아혈청(FBS) 첨가군과 자가혈청(Auto Serum) 첨가군의 2군으로 나누어, 암환자 6명으로부터 채취한 시료에 대해, 그 CTC 유도능의 유무를 검토하였다.
<결과>
결과를 표 3에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, AIM-V 배양액은 혈청 없는 모노발렌트(monovalent)로, 소태아혈청(FBS) 또는 자가혈청(Auto Serum)을 첨가한 RPMI-1640 배양액 중의 어느 한 배양액에 비해, 높은 암세포 취득 효율을 나타내었다.
Figure pct00003
(시험 4 : AIM-V 배양액에 FBS를 첨가한 배양액의 CTC 유도능의 검토)
AIM-V 배양액에 소태아혈청(FBS)을 첨가한 조건에서의 CTC 유도능의 유무를 검토하였다.
<결과>
결과를 표 4에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, AIM-V 배양액에 소태아혈청(FBS)을 첨가한 군에서는 높은 암세포 취득 효율을 나타내었지만, 환자 소스간에 암세포 취득 효율에 큰 차이가 확인되었다.
Figure pct00004
(시험 5. AIM-V에 FBS를 첨가한 배양액에 팔미트산(Palmitic Acid)을 첨가한 배양액의 CTC 유도능의 검토)
AIM-V 배양액에 소태아혈청(FBS)을 첨가한 배양액을 공통으로 하고, 그 배양액에 팔미트산(Palmitic Acid)을 첨가한 군을 작성하여, 팔미트산(Palmitic Acid) 비첨가군과의 사이에서 CTC 유도능을 비교 검토하였다.
<결과>
결과를 표 5에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, 팔미트산(Palmitic Acid) 비첨가군에서는 시험 4의 경우와 마찬가지로, 환자간에 CTC 취득 효율의 차이가 보였지만, 팔미트산(Palmitic Acid) 비첨가군에서, CTC 취득 효율이 나빴던 환자 소스에서도 팔미트산(Palmitic Acid)의 첨가에 의해(군), CTC 취득 효율의 개선, 증강이 확인되었다.
Figure pct00005
(시험 6. AIM-V 배양액 단독과, AIM-V에 자가혈청(Auto Serum)을 첨가한 배양액의 CTC 유도능의 검토)
AIM-V 배양액 단독군과, AIM-V에 환자의 자가혈청(Auto Serum)을 첨가한 군을 준비하여, 양 배양액간의 CTC 유도능의 비교 검토를 실시하였다.
<결과>
결과를 표 6에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, AIM-V에 환자의 자가혈청(Auto Serum)을 첨가한 군에서는 (*)의 경우를 제외하고, 대부분의 환자 소스에서 CTC 취득 효율은 향상되었다. 어느 경우에도 모두 높은 CTC 취득 효율이 확인되었다.
Figure pct00006
(시험 7. AIM-V에 자가혈청(Auto Serum)을 첨가한 배양액에 팔미트산(Palmitic Acid)을 첨가한 배양액의 CTC 유도능의 검토)
AIM-V 배양액에 환자 자가혈청(Auto Serum)을 첨가한 배양액을 공통 배양액으로 하고, 그 배양액에 팔미트산(Palmitic Acid)을 첨가한 군을 작성하여, 팔미트산(Palmitic Acid) 비첨가군과의 사이에서 CTC 유도능을 비교 검토하였다.
<결과>
결과를 표 7에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, AIM-V 배양액에 환자 자가혈청(Auto Serum)을 첨가한 배양액의 군에, 팔미트산(Palmitic Acid)을 첨가한 군과 첨가하지 않은 비첨가군 사이에서, CTC 취득 효율에서 대조적인 두가지 경향이 나타났다. 즉, 팔미트산 비첨가로 CTC 취득 효율이 높았던 환자 소스에서는 팔미트산(Palmitic Acid) 첨가로 저하 경향을 보였다. 한편, 팔미트산 비첨가로 CTC 취득 효율이 낮았던 환자 소스에서는 팔미트산(Palmitic Acid) 첨가로 CTC 취득 효율의 상승이 확인되었다.
Figure pct00007
(형광 현미경에 의한 관찰)
상기 시험 1 및 시험 2에서 검토한, AIM-V 배양액 및 RPMI-1640 배양액을 사용한 CTC 취득 시험에서 얻어진 것을 형광 현미경으로 관찰한 결과(사진)를 도 1에 나타내었다. 도 (1-a)는 AIM-V 배양액을 사용한 CTC 취득 결과를 나타내고, 도 (1-b)는 RPMI-1640 배양액을 사용한 경우의 CTC 취득 결과를 나타낸다. AIM-V 배양액을 사용한 경우에는 다수의 CTC 세포가 확인되고, CTC 유도능이 나타났는데, RPMI-1640 배양액을 사용한 경우에는 CTC 세포는 확인되지 않았다.
(종합평가)
이상의 시험 결과로부터 이하의 결론이 얻어졌다.
(i) RPMI-1640 단독, 및 RPMI-1640 + 5% Auto Serum(자가혈청) 첨가의 양 그룹에서는 파종한 말초혈 유래 단핵구(PBMC) 개수(1×104/Well)의 0.1% 이상의 단위로, CTC의 유도·분리·취득은 할 수 없었다.
(ii) AIM-V 단독으로는 파종한 말초혈 유래 단핵구(PBMC)의 0.1 내지 0.2%의 범위에서 CTC의 유도·분리·취득이 가능하였다.
(iii) AIM-V + 5% Auto Serum(자가혈청) 첨가 그룹에서는 CTC 취득율이 2.2 내지 2.7%로, AIM-V 단독인 경우의 14배에서 20배로 증가하였다.
(iv) AIM-V에 50%의 비율로 RPMI-1640을 첨가하면, CTC 취득률이 RPMI-1640 + 5% Auto Serum(자가혈청) 첨가 그룹과 동일한 %로 저하되었다.
(v) 상기 (iv)의 경향은 RPMI-1640의 25% 첨가, RPMI-1640의 12.5% 첨가에서도 마찬가지로, CTC의 취득 효과 상승은 관찰되지 않았다.
이 시험결과로부터, CTC의 유도·분리·취득에 사용하는 배양액으로서 AIM-V가 유용하며, 그 배양액에 Auto Serum(AS)를 첨가함으로써, CTC 취득 효과를 높일 수 있음이 확인되었다.
실시예 3
[암세포(CTC) 취득에 효율적인 배양액의 선정 시험(II) - 첨가물의 영향]
<공시 배양액>
공시 배양액으로서 이하의 배양액을 준비하여, 사용하였다.
(1) AIM-V(무혈청 배지)
(2) AS(Auto Serum : 자가혈청)
(3) LPS(Lipopolysaccharide)
(4) IL-1α(Interleukin 1α)
(5) IL-1β(Interleukin 1β)
(6) Palmitic Acid
<실험 방법>
상기 배양액을 사용하여, 실시예 1에 기재된 실험 방법에 따라, 준비한 암 환자 말초혈 단핵구(PBMCs)를 각 웰에 파종하여, 각 배양액에서의 암세포(CTC) 취득 효율(암세포 검출 정밀도)에서의 첨가물의 영향에 대해 시험하였다.
(시험 8 : AIM-V 배양액에서의 LPS 첨가의 영향)
AIM-V 배양액(AIM-V : Group A)을 기본으로 하고, 거기에 AS(자가혈청)를 첨가한 그룹(AIM-V+AS : Group B), 또한, 이들 그룹에 LPS(Lipopolysaccharide)를 기본 농도를 1conc.(Group E, F)로 하여, 0.1conc. 내지 100conc.의 농도를 각각 첨가한 각 그룹(Group GH, GD)을 작성하였다. 그리고, 그들 그룹 사이에서의 CTC 분리취득 효과를 검토하였다.
<결과>
결과를 표 8에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, AIM-V 배양액에 LPS를 첨가한 그룹에서는 LPS의 첨가량이 적은 그룹에서, AIM-V 단독보다 효과는 보였지만, AIM-V + AS 그룹의 LPS 첨가군에서는 어떤 LPS 농도 첨가 그룹에서도 CTC 분리취득 효율은 격감하였다.
Figure pct00008
(시험 9 : AIM-V 배양액에서의 IL-1α 첨가의 영향)
AIM-V 배양액(AIM-V : Group A)을 기본으로 하고, 거기에 AS(자가혈청)를 첨가한 그룹(AIM-V + AS : Group B), 또한, 이들 그룹에 IL-1α(Interleukin 1α)를 기본 농도를 1conc.(Group E, F)로 하여, 0.1conc. 내지 100conc.의 농도를 각각 첨가한 각 그룹(Group GH, GD)을 작성하였다. 그리고, 그들 그룹 간의 CTC 분리취득 효과를 검토하였다.
<결과>
결과를 표 9에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, AIM-V 배양액에 IL-1α를 첨가한 그룹에서는 IL-1α 첨가량의 많고 적음에 관계없이 AIM-V 단독과 동등하거나 그 이하의 효과밖에 확인되지 않았다(Group C, E, G). AIM-V + AS 그룹의 IL-1α 첨가군에서는 어떤 IL-1α 농도첨가 그룹에서도 비첨가군보다 CTC 취득 효율은 감소하였다.
Figure pct00009
(시험 10 : AIM-V 배양액에서의 IL-1β 첨가의 영향)
AIM-V 배양액(AIM-V : Group A)을 기본으로 하고, 거기에 AS(자가혈청)를 첨가한 그룹(AIM-V + AS : Group B), 또한, 이들 그룹에 IL-1β(Interleukin 1β)를 기본 농도를 1conc.(Group E, F)로 하고, 0.1conc. 내지 100conc.의 농도를 각각 첨가한 각 그룹(Group GH, GD)을 작성하였다. 그리고, 그룹 간의 CTC 분리취득 효과를 검토하였다.
<결과>
결과를 표 10에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, AIM-V 배양액에 IL-1β를 첨가한 그룹에서는 IL-1β의 첨가량에 따라 AIM-V 단독과 동등하거나 조금 웃도는 정도의 효과밖에 확인되지 않았다(Group C, E, G). AIM-V + AS 그룹의 IL-1β 첨가군에서는, 어떤 IL-1β 농도 첨가 그룹에서도 비첨가군과 동등 정도의 CTC 취득 효율밖에 확인되지 않았다.
Figure pct00010
(시험 11 : AIM-V 배양액에서의 Palmitic Acid 첨가의 영향)
AIM-V 배양액(AIM-V : Group A)을 기본으로 하고, 거기에 AS(자가혈청)를 첨가한 그룹(AIM-V + AS : Group B), 또한, 이들 그룹에 Palmitic Acid를 기본 농도를 1conc.(Group G, H)로 하여, 0.25conc. 내지 4conc.의 농도를 각각 첨가한 각 그룹(Group KL, IJ, GH, EF, CD)를 작성하였다. 그리고, 그들 그룹간의 CTC 분리취득 효과를 검토하였다.
<결과>
결과를 표 11에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, AIM-V 배양액에 Palmitic Acid를 첨가한 그룹에서는, Palmitic Acid의 첨가량과 거의 무관하게 비첨가군에 비해 2배 내지 3배의 CTC 취득 효율의 상승이 확인되었다(Group C, E, G, I, K). AIM-V + AS 그룹의 Palmitic Acid 첨가군에서는, 어떤 Palmitic Acid 농도 첨가 그룹에서도 농도의존성은 보이지 않았으며, 비첨가군과 동등 정도이거나 그 이하의 CTC 취득효율밖에 확인되지 않았다.
Figure pct00011
(종합 평가)
이상의 시험 결과로부터 다음과 같은 결론이 얻어졌다 : AIM-V 배양액에 첨가 성분을 첨가함으로써 CTC 취득 효과를 높이는 것을 검토하고, 새로운 CTC 분리취득 인자로서 팔미트산(Palmitic Acid)을 포함하는 각종 첨가성분(LPS, ConA, PHA, IL-1α, IL-1β)의 후보를 검토하여, 가장 안전하고 효율적인 인자의 탐색을 실시한 결과, 결과적으로, CTC의 안정된 분리취득에는 AIM-V 배양액에 팔미트산(Palmitic Acid)을 첨가하는 것이 최상의 결과를 얻는 것을 확인하였다. 또한, 그 검토 경과에서, LPS에도 CTC 유도 효과는 약간 관찰되는 경우도 있었지만, LPS는 극히 강한 독성을 가진 물질이기 때문에, CTC 분리 후의 각종 연구, 임상 응용의 기술 개발이라는 목적을 감안하면, 시약으로서는 안전상 부적절하다고 판단하여, 이후의 실험에서는 제외하기로 하였다.
실시예 4
[CTC 증식용 배양액에서 얻어진 암세포(CTC)의 형태변화 확인]
실시예 1의 시험 방법에 따라, 실시예 2에서 CTC 증식용 배양액을 사용하여 취득된 암세포(CTC)의 형태 변화에 대해 현미경 화상을 통해 검증하였다. 현미경 사진을 도 2 내지 도 7에 나타내었다. 각 도면 중, (도-a) (도-b)는 CTC 세포 증식 실험에서의 배양 조건, 즉 증식용 배양액과 혈청, 또는 팔미트산 등의 인자의 유무나 농도 등에 의한 배양 조건에 따른 CTC의 형태적인 특징을 서로 다른 환자의 CTC에 대해 검토한 결과(서로 다른 환자로부터 채취한 암세포(CTC)의 현미경 사진)을 나타낸다. 이 실험은 각 증식조건의 차이에 따른 CTC 세포의 형태적 차이 발현의 유무를 검토하는 것을 목적으로 하며, (a), (b)는 다른 환자 유래에 대해, 다른 환자 유래일지라도, 동일 배양 조건에서는 동일한 세포 형태를 나타내는 것을 검증하기 위한 것이다.
공시 배양액의 농도에서, 팔미트산(Palmitic Acid)의 농도는 이하의 표 12에 따랐다.
Figure pct00012
<1. AIM-V 배양액 단독으로 배양·취득한 CTC의 형태변화 관찰>
AIM-V 배양액 단독으로 배양·취득한 CTC의 형광 현미경 화상을 도 2(2-a; 2-b)에 나타낸다. AIM-V 배양액 단독으로 배양·취득한 CTC의 세포형태에서, 세포질 내의 핵이나 과립 성분에 특별히 크기가 이상하거나 농염한 부분은 눈에 띄지 않는다.
<2. AIM-V 배양액에 Palmitic Acid(×1conc.)를 첨가 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰>
AIM-V 배양액 + Palmitic Acid(×1농도)를 첨가 배양하여, 취득한 CTC의 형광 현미경 화상을 도 3(3-a; 3-b)에 나타낸다. AIM-V 배양액 + Palmitic Acid(×1농도)를 첨가배양·취득한 CTC의 세포형태에서, 세포질 내의 핵이나 과립 성분에, Palmitic Acid 비첨가군의 경우에 비해 다소 핵성분의 증가가 보이지만, 특별히 크기의 확대나 농염한 부분은 보이지 않았다.
<3. AIM-V 배양액에 Palmitic Acid(×4conc.)를 첨가 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰>
AIM-V 배양액 + Palmitic Acid(×4농도)를 첨가 배양하여, 취득한 CTC의 형광 현미경 화상을 도 4(4-a; 4-b)에 나타낸다. AIM-V 배양액 + Palmitic Acid(×4농도)를 첨가배양·취득한 CTC의 세포형태에서, 세포의 크기 확대, 융합 경향이 보이며(도 4-b), 세포질 내의 핵이나 과립 성분에 Palmitic Acid 비첨가군(도 2-a; 2-b)이나, (×1농도) 첨가군(도 3-a; 3-b)인 경우에 비해 핵 성분이나 세포질 내의 핵이나 과립 성분의 현저한 증가나 농염이 관찰된다.
<4. AIM-V + 5% Auto Serum 배양액으로 배양하고, 취득한 CTC의 형태변화 관찰>
AIM-V + 5% Auto Serum 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 형광 현미경 화상을 도 5(5-a; 5-b)에 나타낸다. AIM-V + 5% Auto Serum 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 세포형태에서, 세포, 세포질 내의 핵이나 과립 성분에 특별히 크기가 이상하거나 농염한 부분은 보이지 않는다.
<5. AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid(×1conc.) 조건하의 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰>
AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid(×1농도) 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 형광 현미경 화상을 도 6(6-a; 6-b)에 나타낸다. AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid(×1농도) 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 세포형태에서, 세포, 세포질 내의 핵이나 과립 성분에 특별히 크기가 이상하거나 농염한 부분은 보이지 않는다.
<6. AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid(×4conc.) 조건하의 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 형태변화 관찰>
AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid(×4농도) 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 형광 현미경 화상을 도 7(7-a; 7-b)에 나타낸다. AIM-V + 5% Auto Serum + Palmitic Acid(×4농도) 배양액으로 배양하여, 취득한 CTC의 세포 형태에서, 세포의 크기 확대, 융합 경향이 보이며(도 7-a), 세포질 내의 핵이나 과립 성분에 Palmitic Acid 비첨가군(도 5-a; 5-b)이나, ×1농도 첨가군(도 6-a; 6-b)에 비해, 핵 성분이나 세포질 내 과립 성분의 현저한 증가나 농염이 관찰된다. 이 형태변화는 Palmitic Acid(×4농도) 배양액의 조건하에서, CTC 세포의 증식·활성화에 의해, 핵의 이상 증식과 세포내 소기관, 에너지 생산의 주역인 미토콘드리아 등을 증가시킨다고 생각되며, 그 결과, 현미경 이미지에서는 핵산이나 세포내 과립이 증가하고, 핵이나 세포질이 빛 투과성을 더욱 방해하여, 농염한 상태가 관찰되는 것으로 생각된다.
(종합 평가)
상술한 CTC(CTSC)의 형태변화의 시험 결과로부터 다음과 같은 결론이 얻어졌다: AIM-V 배양액, 혹은, 이 배양액에 Auto Serum 및/또는 Palmitic Acid와 같은 첨가성분을 첨가한 CTC 증식 배양액을 사용하여, CTC를 증식 취득함으로써 CTC를 확실하고 효과적으로 취득할 수 있으며, 그 때에, CTC의 세포 형태에는 형태변화를 일으키지 않고, 증식 취득하는 것이 가능함이 확인되었다. 즉, CTC(CTSC)를 증식, 취득하는 경우에는, 취득한 세포의 형태에는 인공적인 변화를 유도하지 않는 것이, CTC의 성질이나 특성을 확인하기 위해 중요하게 되며, 따라서 CTC의 형태나 성상(性狀)에 특별한 변화를 유도하지 않는 조건에서, 또한 안정적으로 CTC를 증식, 취득할 수 있는 방법인 것이 요구된다. 상기 실험 결과로부터는 상기 조건을 만족하면서 확실하게 CTC(CTSC)를 증식, 취득할 수 있는 방법임이 확인되었다.
실시예 5
[취득한 CTC의 세포막 항원을 이용한 확인 및 동정]
이하의 실시예에 표시된 대로, 각 환자 말초혈로부터 분리취득한 CTC에 대해, 막 표면의 CD44, CD45, CD47, CKII, EpCAM의 각 항원을 이용하여, 형광 항체 염색법에 의해 확인 및 동정을 실시하였다. 각 시험에서 결과의 각 도면의 사진에서, 각 (도-a)는 CTC의 현미경에 의한 사진 이미지를 나타내고, 각 (도-b)은 막 표면 항원을 이용하여 염색한 형광 현미경에 의한 사진 이미지를 나타낸다.
<항원 염색 방법>
항원 염색 방법은 FITIC(fluorescein isothiocyanate) label에 따른, 이하의 수순에 따라, 시료를 조제하여, 염색, 현미경 검사, 관찰·사진촬영하였다.
(I. 각종 말초혈 분리 세포의 조제, 및 FITC label 일차 항체에 의한 항원 염색)
(1) 부착 세포의 효소 처리.(비부착 세포는 (4)에서부터 시작한다.)
(2) Trypsin EDTA 처리.
(3) 싱글 세포군에, 5% FBS 첨가 RPMI medium 첨가, 효소 반응 정지, 흡인.
(4) 원심분리(1200 내지 1500 회전, 4℃, 7분).
(5) 4℃ 보냉하 (-)PBS로 세정·볼텍스, 원심×2회.
(6) 세포 수의 계측·분주 : 1×106/100μl/TUBE.
(7) 세포의 각 튜브 주위를 차광을 위해 알루미늄 호일로 덮고, 4℃ 보냉하에 30분간 방치하여, 세포의 대사 활동을 저하시킨다(표면 항원의 세포막 내외로의 운동·이동의 저지).
(8) 항체의 첨가 : 1μg/2μl/1×106 spin down cells(medium 제거 세포군) 4℃ 보냉하·차광하에서 1시간 염색.
(9) 4℃ 보냉하, (-)PBS로 세정·볼텍스. 원심×2회 : 원심분리(1200 내지 1500 회전, 4℃, 7분).
(10) 적량의 (-)PBS를 세포에 첨가하고, 슬라이드 글라스 또는 플레이트에 첨가하여 현미경 검사한다.
(11) 형광 현미경으로 관찰·사진 촬영.
(II. 각종 말초혈 분리 세포의 조제, 및 각 항원에 대한 일차 항체 염색, 이어서 FITC label 이차 항체에 의한 항원 염색)
(1) 부착 세포의 효소 처리.(비부착 세포는 (4)에서부터 시작한다.)
(2) Trypsin EDTA 처리.
(3) 싱글 세포군에 5% FBS 첨가 RPMI medium 첨가, 효소 반응 정지, 흡인.
(4) 원심분리(1200 내지 1500 회전, 4℃, 7분).
(5) 4℃ 보냉하 (-)PBS로 세정·볼텍스, 원심×2회.
(6) 세포수의 계측·분주 : 1×106/100μl/TUBE.
(7) 세포의 각 튜브 주위를 차광을 위해 알루미늄 호일로 덮고, 4℃ 보냉하에 30분간 방치하여, 세포의 대사 활동을 저하시킨다(표면 항원의 세포막 내외로의 운동·이동의 저지).
(8) 일차 항체의 첨가 : 1μg/2μl/1×106 spin down cells(medium 제거 세포군) 4℃ 보냉하·차광하에서 1시간 염색.
(9) 4℃ 보냉하, (-)PBS로 세정·볼텍스, 원심×2회 : 원심분리(1200 내지 1500 회전, 4℃, 7분).
(10) 이차 항체의 첨가 : 1μg/2μl/1×106 spin down cells(medium 제거 세포군) 4℃ 보냉하·차광하에서 1시간 염색.
(11) 4℃ 보냉하, (-)PBS로 세정·볼텍스, 원심×2회 : 원심분리(1200 내지 1500 회전, 4℃, 7분).
(12) 적량의 (-)PBS를 세포에 첨가하고, 슬라이드 글라스 또는 플레이트에 첨가하여, 현미경 검사한다.
(13) 형광 현미경으로 관찰·사진 촬영.
실시예 6
[막 항원 CD44을 이용한 CTC의 확인 및 동정]
실시예 1의 방법에 의해, 각 환자의 말초혈로부터 취득한 CTC에 대해, 막 항원 CD44를 이용하여, 그 CTC의 확인 및 동정을 실시하였다.
<막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정(I)>
3명의 환자 : (1) K.H.(Gastric Ca.: 위암 : liver meta. 간전이), (2) T.K.(Tongue Ca. 설암), (3) K.H.(Gastric Ca. : 위암 : liver meta. 간전이)의 말초혈로부터 취득한 CTC의 현미경 사진 이미지와, 막 항원 CD44를 이용한 형광 항체 현미경 사진을 도 8 내지 도 10에 나타내었다. (도 8-a 내지 10-a)는 현미경 사진의 이미지를 나타내고, (도 8-b 내지 10-b)는 형광 항체 현미경 사진을 나타낸다. 사진에 나타난 바와 같이, 상기 (1) 내지 (3)의 환자로부터 취득된 CTC는 CD44에 의한 염색은 보이지 않았다.
<막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정(II)>
3명의 환자 : (1) T.K.(Tongue Ca. 설암), (2) S.K.(Kerato-cystic Ca. 각화 낭포암), (3) S.O.(Lung Ca. 폐암)의 말초혈로부터 취득한 CTC의 현미경 사진 이미지와, 막 항원 CD44를 이용한 형광 항체 현미경 사진을 도 11 내지 13에 나타낸다. (도 12-a 내지 13-a)는 현미경 사진의 이미지를 나타내고, (도 12-b 내지 13-b)는 형광 항체 현미경 사진을 나타낸다. 사진(도 12 내지 13)에 나타난 바와 같이, 상기 (2) 내지 (3)의 환자로부터 취득된 CTC는 CD44에 의한 염색이 나타나며, 현미경 사진의 이미지와 형광 항체 현미경 사진이 일치하여, 취득한 CTC가 상기 암의 CTC인 것이 확인되었다.
<막 항원 CD44를 이용한 CTC의 확인 및 동정(III)>
2명의 환자 : (1) H.Y.(Breast Ca. 유방암), (2) Y.H.(Lung Ca. 폐암)의 말초혈로부터 취득한 CTC의 현미경 사진의 이미지와, 막 항원 CD44를 이용한 형광 항체 현미경 사진을 도 14 내지 15에 나타낸다. (도 14-a 내지 15-a)는 현미경 사진의 이미지를 나타내고, (도 14-b 내지 15-b)는 형광 항체 현미경 사진을 나타낸다. 사진(도 14 내지 15)에 나타난 바와 같이, 상기 (1) 내지 (2)의 환자로부터 취득된 CTC는 CD44에 의한 염색이 나타나며, 현미경 사진의 이미지와 형광 항체 현미경 사진이 일치하여, 취득한 CTC가 상기 암의 CTC인 것이 확인되었다.
실시예 7
[막 항원 CD45를 이용한 CTC의 확인 및 동정]
실시예 1의 방법에 의해, 각 환자의 말초혈로부터 취득한 CTC에 대해, 막 항원 CD45를 이용하여, 그 CTC의 확인 및 동정을 실시하였다.
2명의 환자 : (1) H.Y.(Breast Ca. 유방암), (2) Y.H.(Lung Ca. 폐암)의 말초혈로부터 취득한 CTC의 현미경 사진 이미지와, 막 항원 CD45을 이용한 형광 항체 현미경 사진을 도 16 내지 도 18에 나타낸다. (도 16-a 내지 18-a)는 현미경 사진의 이미지를 나타내고, (도 16-b 내지 18-b)는 형광 항체 현미경 사진을 나타낸다. 사진(도 16 내지 18)에 나타난 바와 같이, 상기 (1) 내지 (2)의 환자로부터 취득된 CTC는 CD45에 의한 염색이 나타나며, 현미경 사진의 이미지와 형광 항체 현미경 사진이 일치하여, 취득한 CTC가 상기 암의 CTC인 것이 확인되었다. CTC(CTSC)의 현미경 사진 중, CTSC 세포의 존재를 화살표로 나타낸다. 각 사진 그룹(사진 1-3 : 도 16 내지 18) 중, 왼쪽의 현미경 사진에서 보여지는 CTC(CTSC) 중, 오른쪽 형광 현미경 이미지에서 볼 수 있듯이, 대부분의 세포가 CD45 양성 CTSC 세포인 것을 나타내고 있다. 양끝 화살표로 나타낸 바와 같이, 그들 CD45 양성 CTSC 세포는 그 형태도 크기도 다양성을 가지며, 하나의 지표로 판별할 수 있는 세포가 아닌 것이 분명하다.
실시예 8
[막 항원 CD47을 이용한 CTC의 확인 및 동정]
실시예 1의 방법에 의해, 각 환자의 말초혈로부터 취득한 CTC에 대해, 막 항원 CD47을 이용하여, 그 CTC의 확인 및 동정을 실시하였다.
5명의 환자 : (1) G.N.(Breast Ca. 유방암 : multiple metastasis 다발 전이성), (2) S.K.(Kerato-cystic Ca. 각화 낭포암), (3) S.O.(Lung Ca. 폐암), (4) H.Y.(Breast Ca. 유방암), (5) Y.H.(Lung Ca. 폐암)의 말초혈로부터 취득한 CTC의 현미경 사진 이미지와 막 항원 CD47을 이용한 형광 항체 현미경 사진을 도 19 내지 23에 나타낸다. (도 19-a 내지 23-a)는 현미경 사진의 이미지를 나타내고, (도 19-b 내지 23-b)는 형광 항체 현미경 사진을 나타낸다. 사진(도 19 내지 23)에 나타난 바와 같이, 상기 (1) 내지 (5)의 환자로부터 취득된 CTC는 CD47에 의한 염색이 나타나며, 현미경 사진의 이미지와 형광 항체 현미경 사진이 일치하여, 취득한 CTC가 상기 암의 CTC인 것이 확인되었다. 각 도면의 사진 중, 화살표는 CD47 양성 CTSC를 나타낸다. 흰색 화살표로 표시되는 CTSC는 CTC(CTSC)로서 증식 배양되어 있는 암세포에서, CD47 양성 CTSC를 나타내는 것으로, 세포의 크기나 형태의 크고 작음에 상관없이 관찰되는 것으로 나타나 있다. 즉, CD47 양성 CTSC는 정해진 형태나 크기를 갖는 세포가 아니라, 다양한 베리에이션(variation)을 가진 것이 확인되었다.
실시예 9
[막 항원 CKII를 이용한 CTC의 확인 및 동정]
실시예 1의 방법에 의해, 각 환자의 말초혈로부터 취득한 CTC에 대해, 막 항원 CKII를 이용하여, 그 CTC의 확인 및 동정을 실시하였다.
2명의 환자 : (1) H.Y.(Breast Ca. 유방암), (2) Y.H.(Lung Ca. 폐암)의 말초혈로부터 취득한 CTC의 현미경 사진 이미지와 막 항원 CKII를 이용한 형광 항체 현미경 사진을 도 24 내지 25에 나타낸다. (도 24-a 내지 25-a)는 현미경 사진의 이미지를 나타내고, (도 24-b 내지 25-b)는 형광 항체 현미경 사진을 나타낸다. 사진 (도 24 내지 도 25)에 나타난 바와 같이, 상기 (1) 내지 (2)의 환자로부터 취득된 CTC는 CKII에 의한 염색이 나타나며, 현미경 사진의 이미지와 형광 항체 현미경 사진이 일치하여, 취득한 CTC가 상기 암의 CTC인 것이 확인되었다.
실시예 10
[막 항원 EpCAM을 이용한 CTC의 확인 및 동정]
실시예 1의 방법에 의해, 각 환자의 말초혈로부터 취득한 CTC에 대해, 막 항원 EpCAM을 이용하여, 그 CTC의 확인 및 동정을 실시하였다.
환자 : (1) H.Y.(Breast Ca. 유방암)의 말초혈로부터 취득한 CTC의 현미경 사진 이미지와 막 항원 EpCAM을 이용한 형광 항체 현미경 사진을 도 26에 나타낸다. (도 26-a)는 현미경 사진의 이미지를 나타내고, (도 26-b)는 형광 항체 현미경 사진을 나타낸다. 사진(도 26)에 나타난 바와 같이, 상기 환자로부터 취득된 CTC는, EpCAM을 세포막 상에 발현하는 세포는 극소수밖에 확인되지 않았다.
실시예 11
[누드마우스에서의 CTC의 종양원성 또는 장기생존의 검토]
실시예 1의 방법에 의해, 환자의 말초혈로부터 취득한 CTC가, CTC 세포 기능을 유지할지 여부를 검토하기 위해, 상기 취득한 CTC의 종양원성 또는 장기생존을 확인하였다.
<시험 방법>
환자 H.Y.(Breast Ca. 유방암)로부터 채취된 시료에서 분리한 CTC : CTC-HY-1(HY-1)과 환자 K.H.(Gastric Ca. : 위암 : liver meta. 간전이)에서 분리한 CTC : CTC-KH-1(KH-1)을 "실험군 A"와 "실험군 B"의 두 실험군으로 나누어, 다음과 같이, 환자로부터 증식 분리채취한 CTC를 이식하였다.
(실험군 A) : 2마리의 누드마우스(Nude1-1; Nude1-2)에 대해, "Nude1-1"에는 CTC(HY-1)를, "Nude1-2"에는 CTC(KH-1)를 누드마우스의 등부분 피하에 1×106 이식하고, 전체 관찰기간 3개월 동안 종양원성 유무를 검토하였다. 기간 후, 해당 누드마우스의 말초혈과 비장을 채취하여, CTC 분리, 배양을 실시하였다. 증식하고 있는 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포에 대해, 살아남아 있는 세포가 이식한 CTC인 것을, 비형광 발광 이미지(Control) 및 막 표면 CD45 항원을 이용한 형광 항체법으로 염색 검토하여, CTC의 잔존을 확인하였다.
(실험군 B) : 2마리의 누드마우스(Nude2-1; Nude2-2)에 대해, "Nude2-1"에는 CTC(HY-1)를, "Nude2-2"에는 CTC(KH-1)를 누드마우스의 등부분 피하에 1×106 이식하고, 같은 양의 세포를 복강 내에도 이식하였다. 실험군 A의 경우와 마찬가지로, 증식하고 있는 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포에 대해, 살아남아 있는 세포가 이식한 CTC인 것을 확인하였다.
<결과>
CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(비형광 발광 이미지) 이미지와, 막 항원 CD45를 이용한 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지)의 사진을 도 27 내지 30에 나타낸다. 도면 중, (27-a), (27-b)는 CTC(HY-1)를 "Nude1-1"에 이식한 경우의 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(Control), 및 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지)의 사진을 나타내고, (28-a), (28-b)는 CTC(KH-1)를 "Nude1-2"에 이식한 경우의 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(Control), 그리고 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지)의 사진을 나타낸다. 도면 중, (29-a), (29-b)는 CTC(HY-1)를 "Nude2-1"에 이식한 경우의 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(Control), 및 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지)의 사진을 나타내고, (30-a), (30-b)는 CTC(KH-1)를 "Nude2-2"에 이식한 경우의 CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포의 현미경 사진(Control), 및 형광 항체 현미경(형광 발광 이미지)의 사진을 나타낸다. 사진 (도 27 내지 30)에 나타난 바와 같이, CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포는 막 항원 CD45에 의한 염색이 나타나며, 현미경 사진의 이미지와 일치하여, CTC 이식군에 잔존하고 있는 세포가 상기 암의 CTC인 것이 확인되었다. 참고로, 정상 소장 조직 세포의 현미경 사진의 이미지(31-a)와, 상기 세포의 CD45 염색에 의한 형광 현미경 사진의 이미지(31-b)를 나타낸다. 도 31과 같이, 정상 소장 조직 세포에서는 CD45에 의한 염색은 전혀 나타나지 않았다.
실시예 12
[수립 암세포주(UTC-8)를 이용한 CD47 양성 세포(CTSC)의 검출(I)]
기존의 수립 암세포주(UTC-8 : 독립행정법인 산업기술종합연구소, 특허생물 기탁센터 기탁번호 : FERM BP-08611)를 이용하여, 그 수립 암세포주에서의 CD47 양성 세포(CTSC)의 검출에 대해 시험하였다.
<시험방법>
수립 암세포주(UTC-8)를 시료로서 사용하고, 실시예 1의 방법에 의해, CTC 세포를 증식취득한 후, 세포막 상의 CD47 항원에 의해, 그 항원 양성 세포의 검출을 실시하였다. 결과를 비형광 색소 염색의 현미경 이미지, 및 형광 색소 염색법에 의한 CD47 양성 세포 이미지로 표시하였다.
결과를 도 32에 나타내었다. 도 32 중, (32-a)는 비형광 색소 염색의 현미경 이미지를 나타내고, (32-b)는 형광 색소 염색법에 의한 CD47 양성 세포 이미지를 나타낸다. 도면 중, 굵은 화살표(⇒)는 CD47 양성의 CTSC를 나타내고, 양끝 화살표(← →)는 CD47 비양성의 세포 크기도 형태도 다른 CTC 암세포를 나타낸다. 결과적으로, 20년 남짓 형태배양된 대부분의 암세포에서는 본 현미경의 시야(×200배)에서 볼 수 있듯이, CD47 양성 CTSC는 극히 소수인 것으로 관찰되었다. 또한, 암세포는 형태상, 원형이나 방추형, 및 그에 가까운 것에서부터, 상하 및 좌우 대칭을 나타내지 않는 불규칙한 형태의 세포가 대부분이라는 것도 나타났다. 한편, CD47 양성 CTSC는, 그 형상은 수지상 세포와 유사하게 불규칙한 돌기를 내뻗은 특이한 형상을 띠고 있는 것으로 판명되었다.
실시예 13
[수립 암세포주(UTC-8)를 이용한 CD47 양성 세포(CTSC)의 검출(II)]
실시예 12의 경우와 마찬가지로, 기존의 수립 암세포주(UTC-8 : FERM BP-08611)를 이용하여, 그 수립 암세포주에서의 CD47 양성 세포(CTSC)의 검출에 대해 재차 시험하였다.
<시험 방법>
실시예 12의 경우와 마찬가지로, 수립 암세포주(UTC-8)를 시료로서 사용하여, 실시예 1의 방법에 의해, CTC 세포를 증식 취득한 후, 세포막 상의 CD47 항원에 의해, 그 항원 양성 세포의 검출을 실시하였다. 결과를 비형광 색소 염색의 현미경 이미지, 및 형광 색소 염색법에 의한 CD47 양성 세포 이미지로 표시하였다.
결과를 도 33에 나타낸다. 도 33 중, (33-a)는 비형광 색소 염색의 현미경 이미지를 나타내고, (33-b)는 형광 색소 염색법에 의한 CD47 양성 세포 이미지를 나타낸다. 도면 중, 굵은 화살표(⇒)는 CD47 양성의 CTSC를 나타내고, 양끝 화살표(← →)는 CD47 비양성의 세포 크기도 형태도 다른 CTC 암세포를 나타낸다. 그 결과, 실시예 12의 경우와 동일한 결과가 얻어졌다. 즉, 그 수립 암세포주(UTC-8)에서는 본 현미경의 시야(×200배)에서 볼 수 있듯이, CD47 양성 CTSC는 극히 소수인 것이 관찰되었다. 또한, 암세포는 형태상, 원형이나 방추형, 및 그에 가까운 것에서부터, 상하 및 좌우 대칭성을 나타내지 않는 불규칙한 형태의 세포가 대부분이라는 것도 나타났다. 한편, CD47 양성 CTSC는 그 형상은 수지상 세포와 유사하게 불규칙한 돌기를 내뻗은 특이한 형상을 띠고 있는 것도 판명되었으며, 그 형태의 특징이 선명하게 확인되었다.
본 발명은 혈액이나 림프액과 같은 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 순환종양세포 및 순환종양줄기세포를, 해당 종양세포가 어떠한 암의 세포인지 특정되어 있지 않은 상태에서도, 또한, 생체순환체액 중에 미량으로 존재하는 상태에서도, 확실하고 안정적으로 검출·분리취득할 수 있는 CTC의 검출·분리취득방법을 제공한다. 본 발명의 CTC의 검출·분리취득방법은 CTC뿐만 아니라, CTSC의 검출·분리를 가능하게 하는 것으로, 암의 기초적인 해명이나 임상적인 대응에 유력한 수단을 제공한다.

Claims (7)

  1. 이하의 (1) 내지 (4)의 처리 단계를 포함하는, 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법:
    (1) 생체순환체액에서 채취한 시료를 전처리하여 단핵구상을 얻는 제1단계,
    (2) 웰 플레이트에 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액을 주입한 웰 플레이트를 준비하고, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여, 인큐베이션하는 제2단계,
    (3) 제2단계에서 인큐베이션하여 얻은 플레이트 웰로부터 배양액을 제거하는 제3 단계,
    (4) 제3단계 후, 플레이트 웰에 부착된 부착성 종양세포를 검출하거나 혹은 분리취득하는 제4단계.
  2. 제1항에 있어서,
    제2단계에서, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여 인큐베이션하기 위한 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포 증식용 무혈청 배지로 이루어진 배양액은 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액인 것을 특징으로 하는 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제2단계에서, 제1단계에서 얻은 단핵구를 파종하여 인큐베이션하기 위한 AIM-V 배양액을 기본으로 하는 배양액은 AIM-V 배양액, 혹은, AIM-V 배양액에 피험자의 자가혈청, 건강한 사람 유래의 AB 혈청 및 팔미트산 또는 그 염으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 첨가한 배양액인 것을 특징으로 하는 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    생체순환체액에서 채취한 시료는 말초혈로부터 채취한 혈액 시료인 것을 특징으로 하는 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1단계의 생체순환체액에서 채취한 시료의 전처리는 생체순환체액에 포함되는 액체 성분 및 비세포 성분의 제거인 것을 특징으로 하는 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2단계에서의 인큐베이션은 37℃, 3 내지 7일간을 증식 온도 및 증식 기간의 기준 조건으로 하여 수행되는 것을 특징으로 하는 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
  7. 제6항에 있어서,
    제2단계에서의 인큐베이션은 5% CO2로 조정된 인큐베이터 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생체순환체액 중의 순환종양세포 및/또는 순환종양줄기세포의 검출·분리취득방법.
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