CN109251970A

CN109251970A - 肾移植术后急性排斥反应受者t细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统

Info

Publication number: CN109251970A
Application number: CN201710576980.3A
Authority: CN
Inventors: 眭维国; 戴勇; 薛雯; 欧明林
Original assignee: 181ST HOSPITAL OF CHINESE PEOPLE'S LIBERATION ARMY
Current assignee: 181ST HOSPITAL OF CHINESE PEOPLE'S LIBERATION ARMY
Priority date: 2017-07-14
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2019-01-22

Abstract

一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统，其中，构建方法包括如下步骤：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；分离T淋巴细胞；提取T淋巴细胞中的DNA；以DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。通过对外周血中T细胞CDR3进行测序和分析，能够揭示急性排斥受者TCR CDR3的多样性，分析T淋巴细胞亚群中特异CDR3序列及TCR特征谱，评估急性排斥受者的免疫状态；发掘急性排斥发病过程的免疫组库改变，进一步研究肾移植术后急性排斥反应发病机制。

Description

肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统。

背景技术

肾小球滤过率(glomerμLar filtration rate，GFR)是反映肾功能的良好指标，它是指单位时间内两肾生成原尿的量，临床上通常将肾脏损伤或肾小球滤过率低于60ml/(min·1.73m²)即为诊断为慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)。各种CKD持续进展会导致慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)，目前我国CRF发病率大概为每一百万人口中有100人。当各种慢性肾脏疾病发展到终末阶段，患者肾小球滤过率低于15ml/(min·1.73m²)或者需要透析治疗时即为终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)。根据流行病学资料显示，美国成年人2011年CKD发病率已经达到15.1％，中国目前的慢性肾脏病发病率为10.8％，随着病情的进展，肾功能逐渐衰竭，CKD患者最终将不可避免的发展成为终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)。ESRD导致人类直接或间接死亡的数量相应的迅速增长，其防治已成为一个全球面临的严峻公共卫生难题。治疗ESRD，延缓甚至防止相关并发症的发生，如何提高该庞大群体的生活质量，已成为全世界共同关注的难题。肾脏移植是一种肾脏替代治疗的手段，肾移植可以明显提ESRD患者的生活水平。目前肾移植术后患者面临的主要问题有两个：排斥反应和感染。据统计，目前每年大概约5％的移植肾丢失(Cecka,J.,CLINICAL OUTCOME OF RENAL TRANSPLANTATION Factors InfluencingPatient and Graft Survival.RENAL TRANSPLANTATION:p.78:133)。排斥反应的发生是目前移植肾丢失的重要原因，其中急性排斥反应(acute rejection,AR)是各种排斥反应中最常见的。

器官移植排斥反应实质上是人体对异体器官的免疫反应，T细胞(T lymphocyte)在同种免疫反应中扮演者关键的起始者、介导者和效应者的“角色”，所以T细胞在同种异体移植物排斥反应中起至关重要的作用。急性排斥反应主要由细胞免疫反应造成，而晚期的急性排斥反应中有体液免疫的伴随。急性排斥反应发生时，受者体内会形成大量的细胞毒性T细胞直接对靶细胞造成杀伤，与此同时，T细胞辅助细胞活化产生各种细胞因子，帮助B细胞分化进而形成抗移植物抗体共同损伤移植物。

因此，需要更深层次的了解与肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体的基因序列信息和多样性变化，因为这能更深层次的揭开T淋巴细胞参与肾移植术后急性排斥反应的机理，客观准确地评估肾移植术后急性排斥反应时免疫状态，进一步阐明膀胱癌的病因学及发病机制，进而为疾病预防、诊断、治疗和预后监测提供新的理论依据。

发明内容

基于此，有必要提供一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法、构建系统及由构建方法制备得到的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，包括步骤：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；从外周血标本中分离T淋巴细胞；提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；采用高通量测序技术对CDR3基因文库进行测序；对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型，由如上任一实施例中所述的构建方法制备得到。

一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建系统，采用如上任一实施例中所述的构建方法实现。

上述肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，通过对外周血中T细胞CDR3进行测序和分析，能够揭示急性排斥受者TCR CDR3的多样性，分析T淋巴细胞亚群中特异CDR3序列及TCR特征谱，评估急性排斥受者的免疫状态；发掘急性排斥发病过程的免疫组库改变，进一步研究肾移植术后急性排斥反应发病机制。

附图说明

图1为本发明一实施方式的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法的步骤流程图；

图2为本发明另一实施方式的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法的步骤流程图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

例如，一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，请参阅图1，所述构建方法包括如下步骤：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；从外周血标本中分离T淋巴细胞；提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。为了进一步说明上述构建方法，又一个例子提供一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，请参阅图2，所述构建方法包括如下步骤。

S110：选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本。

例如，本发明各实施例采用的离体的外周血标本，来自于2014年10月至2016年6月于中国人民解放军第一八一中心医院全军器官移植和透析中心住院接受同种异体肾移植术的终末期肾病(均符合2009年美国KDIGO制定的ESRD诊断标准)且术后1个月内发生急性排斥反应的患者，在19例急性排斥反应患者中选取其中3例较为典型的患者进行回顾性研究，其中男性患者1例61岁，女性患者2例，分别51岁和55岁，3例患者原发病均为慢性肾小球肾炎的终末期肾病(ESRD)，接受血液透析时间均在2年以上，无肝炎、结核等传染性疾病及自身免疫性疾病病史。上述患者在住院期间接受同种异体心死亡供体(donation aftercardiac death，DCD)供肾移植，其中2名患者在术后第8天，另外一名患者则在术后第9天出现较为典型的急性排斥反应临床表现：低热、尿量骤减达平时水平的百分之五十以上、体重增加、移植肾区肿痛等；实验室检查显示患者血肌酐水平较基础值上升大于25％(最高者为3.2倍)，血尿、蛋白尿阳性伴有尿液淋巴细胞增多，外周血白细胞增多以淋巴细胞为主；当天行移植肾活检穿刺病理学检查，结果符合1997年修订的Baff分类中的细胞性急性排斥反应。实验方案经过中国人民解放军第一八一中心医院伦理委员会批准同意，并取得患者及其家属知情并签订《知情同意书》。又如，已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本的入选标准为：(1)符合2009年美国KDIGO制定的ESRD诊断标准，且原发病为慢性肾小球肾炎；(2)术后移植肾功能正常恢复并在2周内发现急性排斥反应者，病理学检查符合1997年修订的Baff分类的急性排斥反应诊断标准；(3)签署知情同意书；(4)临床资料齐全。又如，已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本的排除标准为：(1)诊断不明确；(2)取样期间有其他外科情况导致急性肾功能损害者，如尿路梗阻、肾血管异常等；(3)处于感染急性期；(4)有传染病史、自身免疫性疾病病史、合并肿瘤者；(5)未获得知情同意；(6)临床资料不全。例如，已离体的外周血标本分别采集于患者肾移植术手术前1天、术后1天及术后7天，又如，每次各采取外周静脉血5ml。又如，已离体的外周血标本中分别添加抗凝剂，或者预先将抗凝剂加入采血管中。又如，所述抗凝剂为EDTA抗凝剂。又如，所述抗凝剂为肝素，肝素加入血液后中的浓度为15U～60U/毫升。

S120：从外周血标本中分离T淋巴细胞；

通过从外周血标本中分离T淋巴细胞，以便于直接从T淋巴细胞提取DNA。例如，从外周血标本中分离T淋巴细胞，即步骤S120具体为：

S121：选用淋巴分离液分离外周血标本中的淋巴细胞，得到单个核细胞。需要说明的是，从外周血标本中分离淋巴细胞，已属于现有技术，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。例如，采用淋巴分离液从外周血标本中分离淋巴细胞。又如，选用合适的淋巴分离液，从其说明书中参阅分离步骤。具体的，例如，选用淋巴分离液分离外周血标本中的淋巴细胞具体包括如下步骤：(1)各取外周血3毫升，用pH7.2的Hanks液或生理盐水以1：1体积将外周血稀释。(2)用毛细吸管吸取3毫升淋巴细胞分层液加入到刻度离心管中，再使离心管倾斜水平面约45度角，用毛细滴管把稀释的样本血沿管壁缓慢滴入分离液面之上，此时应尽量保持两者界面清楚。(3)于16摄氏度～18摄氏度条件下，用水平离心机以2500r/分钟离心25min。离心后观察细胞分布。(4)使用毛细吸管缓慢插到白色云雾层混浊带中，沿管壁轻轻吸出此层细胞，此层细胞主要为单个核细胞，其中也包括淋巴细胞，将吸取的细胞加入至另一支离心管中。该操作要尽量取尽目标细胞，同时应要避免吸取其他液面的液体，减少非目标细胞混杂。(5)用Hanks液洗涤上述细胞3次-5次。第一次2500r/min，10min；第2～3次2000r/min，10min，此举主要去除大部分混杂的血小板。(6)将沉淀细胞置入悬浮液中备用。又如，所述悬浮液包括PBS、Hanks液、培养基、生理盐水或其它缓冲液中的任一一种。为了去除细胞沉淀中混杂的血小板，例如，使用Hanks液洗涤细胞3次～5次。第一次2500r/min，10min；第二～三次2000r/min，10min，此举主要去除大部分混杂的血小板。

S122：选用免疫磁珠间接法从单个核细胞悬浮液中分离T淋巴细胞。

例如，步骤S122具体为：(1)首先取磁珠悬液，用25倍体积的PBS和0.2％BSA(bovine serum albumin，牛血清蛋白)溶液重悬后，置磁架上6分钟。其中，磁珠与单个核细胞的比例为：0.5mg磁珠/1×10⁷个单个核细胞，如此，通过磁珠分离细胞，又如，磁珠提前被二抗包被，其中二抗为鼠抗人CD3单克隆抗体(Sigma公司产品)。(2)用毛细吸管吸去上清液，以清除储存过程中从磁珠上掉落的二抗。用150ul PBS+0.2％BSA溶液再次重悬磁珠。加入一抗，其中一抗与磁珠的比例为：5微克一抗/1毫克磁珠，置于26℃环境下20min，期间轻轻晃动二次。再次置于磁架上6分钟。例如，一抗为羊抗鼠IgG(挪威Dyna)。(3)加入3毫升PBS+1.2％BSA溶液，再置于磁架上6分钟。用毛细吸管吸去上清液，清除干净未能和二抗结合的一抗。重复上述操作一次。用150微升PBS+0.2％BSA溶液重悬磁珠。(4)使用PBS+30％FCS调节待分离细胞的浓度至1×10⁷细胞/毫升，把细胞加入到磁珠悬液中，置于26℃下20min，期间轻微晃动一次，然后置磁架上20分钟，吸去上清液。用1.5毫升的RPMI 1640再次混悬细胞。(5)加入150μL的T荧光微珠到样品试管中，在22℃～26℃条件下旋混6分钟，去盖放置于磁力架上90秒。(6)舍弃上清液并将剩余样品移至另一个试管中保存，用B荧光微珠把B淋巴细胞分离并去除。(7)用适当体积RPMI1640使细胞再次混悬。轻微敲击样品试管使微珠再次混悬均匀，置于磁力架上0.5分钟，用吸液管去除上清液。上述操作需重复3次～4次。(8)将分离提纯的T淋巴细胞低温保存备用。

S130：提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液。

通过直接从T淋巴细胞中的DNA，能够避免直接从血液中提取DNA时带来的污染。例如，所述步骤S130具体为：

S131：取5000μL单个核细胞悬浮液放入10ml离心管中。

S132：加入20mg/ml蛋白酶K 25微升，22℃～26℃条件下保存20分钟，中间颠倒离心管数次使其混合均匀，用200μL结合液CB加入到离心管中，马上颠倒数次使其充分混匀，于70℃～75℃水浴放置15分钟。需要说明的是，结合液CB为磁珠法DNA提取试剂盒中的磁珠结合液CB，本领域技术人员可以根据实际需要购买磁珠法DNA提取试剂盒，然后根据其说明书指示进行操作。

S133：加入100μL异丙醇，充分混匀，得到混合液。

S134：把混合液置于吸附柱当中，再使吸附柱置入收集管中，10000rpm离心0.5分钟，去除废液；又如，所述吸附柱为Qiagen quick吸附柱。

S135：加入4500μL抑制物去除液，12000rpm高速离心0.5分钟，舍弃废液；

又如，所述抑制物去除液为抑制物去除液IR。S136：加入漂洗液700μL，再次12000rpm离心0.5分钟，舍弃废液；

S137：再次加入漂洗液500μL，继续使用12000rpm离心0.5分钟，舍弃废液；又如，所述漂洗液为漂洗液WB。

S138：再次使吸附柱重新置入收集管中，13000rpm离心120秒，舍弃废液；

S139：把吸附柱置入另一离心管中，加入100μL提前预热洗脱缓冲液，26℃条件下放置4分钟，再次使用12000rpm离心60秒；将得到的溶液重新加入吸附柱中，26℃条件下放置120秒后使用12000rpm离心60秒；收集T细胞DNA并在2℃～8℃中保存。又如，洗脱缓冲液为洗脱缓冲液EB。

需要说明的是，抑制物去除液IR、漂洗液WB、洗脱缓冲液EB为磁珠法DNA提取试剂盒中的试剂，本领域技术人员可以根据实际需要购买磁珠法DNA提取试剂盒，然后根据其说明书指示进行操作。

S140：测定DNA提取液中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则执行下一步骤。例如，测定所述DNA提取液的完整性包括如下步骤：(1)将DNA提取液与加样缓冲液混合后加入孔板通电进行电泳，在电压为150V的条件下电泳40分钟；(2)取出凝胶，并在紫外灯下检查。

具体的，例如，在冰上把样本融化后，混匀充分并进行离心，选取5μl DNA样本与适量溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合后进行电泳，在其侧孔加入3μl DNA marker，使用0.7％的琼脂糖凝胶在150伏电压条件下电泳40min；待电泳至溴酚蓝在凝胶中迁移出合适距离。关闭电源，戴一次性手套将凝胶取出，把电泳缓冲液淋干，在254nm波长的紫外灯下进行观察。又如，所述电泳操作在大型电泳槽中进行。

例如，测定所述DNA待测液的DNA含量包括如下步骤：

(1)Quant-iTTM Working Solution的制备：DNA结合于Quant-iT^TM reagent染料后用Quant-iT buffer以1：200比例进行稀释，Quant-iT^TM Working Solution即制备完成。(2)制备标准品：取10μl Quant-iT^TM standard1(0ng/μl)与Quant-iT^TM standard2(100ng/μl)将其与Quant-iTTM Working Solution 190μl充分混匀；设定好Fluorometer程序，将以上标准品实施标准曲线制备。(3)样本DNA的定量：将5～25μl待测样本和175～195μlQuant-iTTM Working Solution充分混匀后(注意此时样本DNA与Quant-iTTM WorkingSolution总体积应恒定为200μl)，26℃条件下放置120秒使DNA与染色剂充分结合，再置入Fluorometer中进行荧光检测，然后直接从标准曲线上读取与其荧光强度相对应的样品DNA含量(ng/μl)。

例如，确定是否合格为确定全基因组DNA中的标本DNA的OD260/OD280的比值为1.8～2.0，是则执行下一步骤。

S150：以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；

本实施例中，通过对DNA提取液中的DNA进行PCR扩增，以扩增出TCR的CDR3区，来分别得到疾病组文库和对照组文库。又如，所述TCR的CDR3区为T淋巴细胞TCRβ链CDR3区域。需要说明的是，在肾移植术后患者的急性排斥反应中，T细胞参与对靶细胞攻击的过程是记性排斥反应的重要原因之一。T细胞的TCR具有抗原特异性的可变(V)区和恒定(C)区，其中V区是TCR识别抗原多样性和特异性主要取决区。而TCR分为TCRαβ和TCRδγ2种类型，分别由2条多肽链αβ或δγ通过二硫键连接而成的膜结合性异二聚体。TCR在个体发育过程中由V、D、J三个编码基因经过随机重排形成，一个T细胞只表达一个特异性的TCR，这样无数的TCR就形成了TCR的多样性，赋予了T细胞识别各种不同抗原、产生特异性抗体的巨大潜力。其中最能代表T细胞免疫应答特征的是TCR的互补决定区(complementarity determining regions,CDR)，包括CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，其长度和序列决定TCR的特异性，从而决定TCR与抗原的特异性结合，一种CDR3序列决定一个T细胞克隆。本实施例中，通过对T细胞TCR的CDR3区扩增，并对其进行分析，以此来探讨急性排斥受者TCR CDR3的多样性，分析T淋巴细胞亚群中特异CDR3序列及TCR特征谱，评估急性排斥受者的免疫状态；发掘急性排斥发病过程的免疫组库改变，进一步研究排斥反应发病机制并引导临床尽早实施干预治疗，阻断其进程乃至阻止其发生，从而提高受者及移植物术后早期及远期存活率。

例如，以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库具体，即步骤S150具体包括：S151：取DNA提取液中的DNA；例如，反应起始量为500ng，又如，DNA提取液中的DNA的最低浓度必须大于35ng/μL，又如，起始量为500ng，浓度为35ng/μL。S152：加入引物；例如，加入TRB V/J引物；又如，TRB V/J引物为TRB V引物和/或TRB J引物。例如，所述TRB V/J引物为专门针对CDR3的V区及J区两端设计的引物。

例如，TRB V引物包括TRBV2、TRBV3-1、TRBV4-1/2/3、TRBV5-1、TRBV5-4/5/6/8、TRBV6-4.1、TRBV6-8/5/1.2、TRBV6-9/7/1.1/6、TRBV6-4.2、TRRBV6-2/3、TRBV7-2/4/6/7/8、TRBV7-3、TRBV7-9、TRBV9、TRBV10-1、TRBV10-2/3、TRBV11-1/2/3、TRBV12-3.2/5.2、TRBV12-3.1/4/5.1、TRBV13、TRBV14、TRBV15、TRBV16、TRBV18、TRBV19、TRBV20-1、TRBV24-1、TRBV25-1、TRBV27-1、TRBV28、TRBV29-1和TRBV30-F5。

例如，TRB J引物包括TRBJ1.1、TRBJ1.2、TRBJ1.3、TRBJ1.4、TRBJ1.5、TRBJ1.6、TRBJ2.1、TRBJ2.2、TRBJ2.3、TRBJ2.4、TRBJ2.5、TRBJ2.6和TRBJ2.7。

又如，所述TRB V/J引物如表1所示：

表1 TRB V/J引物

如此，通过选用所述TRB V/J引物，能够较好地扩增出TCR的CDR3区。尤其需要说明的是，引物的设计对于TCR的CDR3区能否较好地扩增出至关重要。通过选用所述TRB V/J引物，能够较好地扩增出TCR的CDR3区，以此来探讨急性排斥受者TCR CDR3的多样性，分析T淋巴细胞亚群中特异CDR3序列及TCR特征谱。

S153：进行多重PCR扩增；又如，选用QIAGEN multiplex PCR Kit进行多重PCR扩增；又如，使用QIAGEN multiplex PCR Kit实行多重PCR扩增30cycles。

S154：电泳检测回收120bp～200bp的多重PCR产物，得到第一样本；

具体的，例如，使用QIAquick Gel Extraction kit进行电泳检测回收120bp～200bp的多重PCR产物；

例如，在多重PCR完成之后，通过使用QIAquick Gel Extraction kit进行电泳检测回收120bp～200bp的多重PCR产物。又如，所述QIAquick Gel Extraction kit为凝胶回收试剂盒。

S155：取所述第一样本进行末端修复反应，纯化得到第二样本；

具体的，例如，加入End Repair Mix进行末端修复反应，并对产物使用QIAquickPCR Purification Kit进行纯化；又如，所述末端修复反应的温度和/或所述纯化操作的温度为20摄氏度。

通过向回收的120bp～200bp的多重PCR产物中加入End Repair Mix进行末端修复反应，能够在经过PCR扩增后得到的DNA片段的3’端连上“A”碱基，如此，便于后续对DNA进行的连接操作。例如，所述End Repair Mix为Thermo Scientific^TM生产的Fast DNA EndRepair Kit，其货号为K0771。

S156：取3’末端具有T碱基的接头与所述第二样本连接，得到第三样本；

具体的，例如，利用Adapter oligo mix和DNA ligase配制接头连接反应体系对第二样本进行接头连接。例如，Adapter oligo mix为Illumina生产，其货号为1005711。又如，DNA ligase为Thermo Scientific^TM生产，其货号为EL0014。

S157：将所述第三样本进行多重PCR反应扩增，电泳，切取目的片段后，纯化回收，得到所述CDR3基因文库。

例如，通过PCR扩增反应富集经过接头修饰的DNA片段。又如，将第三样本经过多重PCR反应后的产物使用QIAquick Gel Extraction kit进行纯化，得到所述CDR3基因文库。又如，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目标片段之后，使用QIAquick Gel Extractionkit进行胶纯化回收并溶于Elution Buffer中，即文库构建完成，分别得到疾病组文库和对照组文库。又如，Elution Buffe为promega生产，其货号为A1655。

又如，通过多重PCR反应收集成功完成3’端修饰的DNA片段，再将PCR产物在0.7％琼脂糖凝胶上进行电泳，切取目的片段，再用QIAquick Gel Extraction kit胶纯化回收目标产物，再将经上述操作所得的DNA片段加至Elution Buffer液中溶解，文库构建完成。

一实施例中，在所述步骤S157之后，所述构建方法还包括：

S158：对所述CDR3基因文库进行检测。

例如，对文库的插入片段范围进行检测，和/或，对文库的浓度进行定量检测。又如，分别对所述疾病组文库和所述对照组文库进行片段范围检测和浓度定量。例如，在对文库的插入片段范围进行检测时，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA1000Reagents)进行检测，又如，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA1000Reagents)进行检测的过程如下：(1)准备凝胶染料混合液：取出Agilent DNA1000试剂盒中的红色DNA凝胶和蓝色DNA浓缩染料，放置室温下平衡试剂大约30min，直至室温；涡旋蓝色DNA浓缩染料，用移液器吸取25μL蓝色DNA浓缩染料，然后添加到一管红色DNA凝胶中；再充分涡旋蓝色DNA浓缩染料和红色DNA凝胶的混合液，通过离心后转移到过滤柱中，混合溶液在4℃避光保存。(2)加载凝胶染料混合液：在实验操作前30min取出蓝色DNA浓缩染料和红色DNA凝胶混合的凝胶染料混合液放置室温平衡，并取出一块新的DNA芯片，小心放置在芯片注胶平台上；用移液器吸取9μL凝胶染料混合液加到标记有G的孔内，安全确保注射器柱塞刚好定位在1ml，然后关闭芯片注胶平台；按压注射器柱塞，直到被夹子卡住，计时等待60S，然后松开夹子，计时等待5S，然后拉回注射器柱塞到1ml的位置；打开芯片注胶平台，用移液器吸取9μL凝胶染料混合液加到其他标记有G的孔内。(3)加载标记物：吸取5μL绿色加载标记物加到Ladder孔内和12个样品孔内，不要留有空孔。(4)加Ladder和加样：用移液器吸取1μL黄色的DNA Ladder液到有标记的孔内，放置到芯片涡旋振荡器上，涡旋1min(2400rpm)；然后5min内将芯片放在Agilent 2100上进行DNA电泳。(5)进行荧光检测，并分析片段范围。

又如，采用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(TaqMan Probe)对文库的浓度进行定量检测，又如，采用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(TaqMan Probe)对文库的浓度进行定量检测的过程如下：(1)配置PCR反应液：在冰上按标准组份配置PCR反应液。又如，所述在冰上应当理解为在低温下操作，实验中通常从制冰机中取各冰块，配置管放置于冰上或者冰块中，以维持低温的配置环境，这对于本领域技术人员，尤其是对于本领域的实验技术人员，是清楚的、确切的。(2)进行Real-Time PCR反应。(3)实验结果分析：Real-Time PCR反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，最后进行PCR定量时制作标准曲线。根据标准曲线确定出各文库的浓度。

S160：采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；

例如，所述步骤S160具体包括：S161：使所述CDR3基因文库中的DNA变性；例如，加入NaOH使目标DNA变性后分离成单链，例如，在检测合格的文库中加入NaOH使目标DNA变性后分离成单链。例如，加入NaOH使NaOH在文库稀释液中的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，优选为，0.4mol/L～0.5mol/L。S162：按照预期上机数据量，稀释；并将变性稀释后的述CDR3基因文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交；例如，根据既定上机数据量，将其稀释至适当浓度。本实施例中，所述FlowCell亦可理解为芯片。或者说，所述FlowCell亦可理解为基因芯片。本实施例中，将各文库中的基因片段上的接头与基因芯片Flow Cell基底上的Oligo序列接头互补连接，使各文库中的基因片段被“固定”在基因芯片上。S163：在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂完成桥式PCR扩增；本实施例中，桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增。又如，所述Flowcell表面所固定的接头为已知序列。本实施例中，桥式PCR以基因芯片Flowcell基座上所固定的序列接头为模板，进行桥形扩增。这样经过不断反复的扩增循环和变性循环，最终把每个DNA片段都在各自的位置上集中成一束。又如，所述桥式PCR具体包括若干循环反应，其中每一个循环反应包括：变形操作、退火操作及延伸操作。经过若干的循环反应后，把每个DNA片段都在各自被接头固定的位置上扩增多次，并集中成一束。又如，所述循环反应的次数为25次。更详细的PCR反应参数、细节及原理请参见现有技术，本发明在此不再赘述。本实施例中，通过将循环反应的次数设置为25次，如此，能够得到适宜于后续上机测试的浓度，便于测序。S164：将制备好的FlowCell采用Illumina MiSeq测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。本实施例中，制备好的FlowCell即为经过桥式PCR反应后在FlowCell接头附近生成若干产物后的FlowCell。本实施例中，簇生成后，会使特定于四个荧光标记的双脱氧核苷酸和过滤组合对簇进行成像。由此，通过对荧光标记进行依次识别，以完成对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序。

S170：对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

通过对测序结果进行分析，以构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。例如，所述步骤S170具体包括：

S171：测序数据质控和预处理。

例如，对测序结果数据的原始数据(Raw Reads)进行过滤处理，又如，所述过滤处理包括如下步骤：首先，将含有接头的序列和平均质量低于15(Illumina0-41质量体系)的读数(reads)进行过滤去掉。其次，对于未知碱基(N碱基)，要求其碱基数要小于5％，否则去掉不符合规定的序列；再次，对DNA序列末端质量较差的序列进行截取，去除低质量部分(质量小于10的碱基)，截取时还需确保截取后的序列的平均质量不低于15，同时，截取后剩余序列的长度要求不小于60。根据以上过滤条件进行过滤处理即可获得过滤后的cleandata。

S172：待数据过滤完成之后，将Pair-end数据的两条序列拼接成一条完整的contig；本实施例中，待数据过滤完成之后，将Pair-end(PE)数据的两条序列拼接成一条完整的contig，例如，在拼接过程中如读长是100的情况下分为两步：(1)将两条序列的尾部进行比对，然后寻找匹配序列。像这样的拼接需要最小10个碱基的重叠，并且重叠区域碱基的匹配率要不小于90％；(2)鉴于免疫组库所捕获区域长度不一，在某些情况下会出现末端序列被测通的情况，即在第一部分尾侧拼接剩下的序列中，尝试用头部将其继续进行拼接。如此，可得到拼接序列和合并的序列contig长度分布图。又如，contig即为重叠群。需要进一步说明的是，高通量测序时，在芯片上的每个反应，会读出一条序列，是比较短的，叫read，read是原始数据；有很多reads通过片段重叠，能够组装成一个更大的片段，称为contig；多个contigs通过片段重叠，组成一个更长的scaffold；一个contig被组成出来之后，鉴定发现contig编码蛋白质的基因，就叫singleton；多个contigs组装成scaffold之后，鉴定发现scaffold编码蛋白质的基因，叫unigene。

S173：数据比对分析。例如，步骤S173具体为：对contig进行数据比对分析。例如，使用milaboratory开发的miTCR进行数据比对分析；由于发明研究对象是TCR，因此比对分析使用milaboratory开发的miTCR：http://mitcr.milaborator y.com/downloads/，该软件自动校正由PCR、测序等原因带来的序列错误。当数据比对完成后，其自动统计CDR3克隆的表达和插入缺失的情况。又如，对contig进行比对分析具体包括：使用milaboratory开发的miTCR对T细胞受体进行自动校正，校正由PCR、测序等原因带来的序列错误。

S174：根据比对分析所得到的结果，统计出每一个克隆的表达情况，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

需要说明的是，TCR的CDR3由V、D、J三个基因编码，在淋巴细胞的成熟过程中，通过V、D、J基因的重排形成了各种重组序列片段，再加上DNA碱基的单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphisms，SNP)、indel突变形成了T细胞的多样性。但是在某种疾病或者某种特殊的状态下，机体循环或者某个器官内出现某个或某些特异的相关抗原，刺激TCR基因发生针对性和选择性重排，就出现选择性的表达某一些家族的T细胞，即所谓的优势表达。出现某些TCR特异性的T细胞克隆性增殖的现象，破坏了T细胞的多样性。虽然在某个或者某些特异性抗原的持续刺激下，机体T细胞发生了克隆性增殖，但由于机体免疫系统的自稳性使得机体的免疫细胞总数总是维持在一个相对变化不大的水平，因此，在某一数量单元的T细胞中，一种T细胞亚家族的优势生长会导致其它T细胞亚家族的相对抑制生长。从分子数量上来看，这种T细胞的优势表达表现为其相应TCR数量上的相对增加，而其它T细胞亚家族的TCR就会相对减少。例如，对所述测序数据的序列结构进行分析具体包括：根据比对分析得到的结果，得到比对得到V基因序列的终止位点，D基因的起始位点，D基因的终止位点及J基因的起始位点，通过位点信息找到V-D-J插入或缺失的碱基并统计其长度分布情况，作出其长度分布图。再根据比对结果确定TCRVβCDR3区域，同时统计CDR3序列长度分布情况，并作出长度分布图。

例如，根据比对分析所得到的结果，统计出每一个克隆的表达情况，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型，还包括：

1、免疫组库的构建，其具体包括：根据比对分析得到的结果，统计每一个样品TCRDNA的克隆的表达情况，分别统计DNA序列，氨基酸序列，V-J组合三种不同分辨率情况，获得各个样本的不同分子水平的表达情况。例如，为了衡量样品的多样性，分别统计和计算疾病组和对照组的独特克隆型(Distinct/uniq clone)数量、香农熵系数(Shannon entropy)和辛普森系多样性指数(Simpson’s diversity index，DS)，三个系数分别针对DNA序列、V-J基因组合及氨基酸序列三种不同分子水平的分辨率，以此来衡量样品的多样性。

对于每一个样品中每个克隆的表达情况，按照DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的表达。按照V-J基因组合表达特征谱信息作出二维热图和三维柱状图，同时筛选出各细胞亚群的高度克隆性扩增的DNA序列、氨基酸序列和V-J组合，其中，DNA序列的筛选标准为频率大于0.5％，即高克隆的定义是某一个CDR3序列表达的量超过总的CDR3的0.5％，氨基酸序列的筛选标准为频率大于0.5％，V-J组合的筛选标准为频率大于1％。在T细胞发育过程中，TCR的V、D、J基因片段发生重排，结果在V-J片段间或在V-D-J片段间可随机插入不同数量的核苷酸，形成具有高度多样性的可变区CDR3，其在长度和氨基酸序列上存在较大差异，即CDR3序列决定了一个独特的TCR克隆型，通过免疫组库的建立，统计每一个克隆的表达情况，为后续的分析提供数据支持。

2、免疫组库的差异性分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

例如，免疫组库差异性分析包括样品多样性差异与克隆表达差异，样品多样性差异的主要目的在于分析每个样品中整体克隆表达模式的差异；而克隆表达差异的意义在于寻找样品中有显著差异的克隆表达。多样性差异针对各个样品计算出的多样性系数指标：独特克隆型(Distinct/uniq clone)数量、辛普森系多样性指数(Simpson’s diversityindex，DS)和香农熵系数(Shannon entropy)。按照不同患者间样品特性，统计和计算出显著差异性。上述指标分别针对DNA序列、氨基酸序列、V-J基因组合情况三种分辨率。而针对每种独特单克隆型表达，根据之前3个患者的采样时间点，采用泊松分布等检验方法计算各个患者间差异的相关指标，再应用FDR与bonferroni对指标值进行校正。分别从DNA序列、氨基酸序列和V-J基因组合情况三个层面上进行分析。数据统计分析使用SPSS 19.0软件进行。

下面举例说明实验结果：

具体实施例中，采用第二代测序的方法(Illunima MiSeq测序平台)对3例急性排斥性反应的患者的不同时间点(术前1天、术后1天、术后7天)的外周静脉血(一共9个标本)的T淋巴细胞抗原受体β链V区互补决定区3(TCRVβCDR3)区域进行深度测序。其中，三个患者分别为患者L、患者Q和患者T。测序后获原始测序序列(Sequenced Reads)或者Raw Reads结果如下：肾移植术前1天患者L 811175条、患者Q 691452条、患者T 1157678条；肾移植术后1天患者L 908937条、患者Q 911265条、患者T 1843184条；肾移植术后7天患者L 1138984条、患者Q 840619条、患者T 1054863条。为了保证信息分析质量，对上述原始测序序列进行过滤处理(舍弃含有接头、平均质量＜15、未知碱基数＞总碱基数5％的Reads)。经过过滤处理后，把Pair-end(PE)数据拼接成一条完整的contig，最终得到完整优质序列(Cleanreads)：肾移植术前1天患者L 560733条、患者Q 572795条、患者T 922607条；肾移植术后1天患者L 609701条、患者Q 650859条、患者T 1304368条；肾移植术后7天患者L 889199条、患者Q 588477条、患者T 770650条。

随后对样本CDR3克隆表达进行了统计，并进行多样性比对检验、CDR3长度分布的正态性比较、九个样本克隆扩增情况分析、TCRβ链V区和J区基因的使用频率分布、TCRβ链V区基因和J区基因家族配对情况，其进一步结果如下：

一、多样性比对检验

患者L术前一天、术后第一天、术后第7天的香农熵分别为0.393340305、0.36887417、0.558752898；患者Q术前一天、术后第一天、术后第7天的香农熵分别为0.630085874、0.444244321、0.478910612；患者T术前一天、术后第一天、术后第7天的香农熵分别为0.575087094、0.397903582、0.447235297。香农熵在免疫组库研究领域中是免疫多样性的度量指标，其大小在0到1之间，其值越大表明机体的免疫多样性越高，其值越小接表明机体的免疫多样性越低。

同时，发现一个总的趋势均是随着时间变化，高克隆数量和比率都是先增后减，香农熵则是先减后增，推测可能是术前诱导药物及手术的创伤对病人有影响导致高克隆增加同时免疫多样性减小，而随着手术后的免疫功能恢复或者免疫抑制不足，病人体内高克隆数量及其比率减少，免疫多样性增加，病人抵抗能力增强，针对同种异体抗原的TCR克隆扩增，攻击移植肾，最终导致急性排斥的发生。

二、CDR3长度分布的正态性比较

三例肾移植急性排斥患者不同时间点的TCRβ链CDR3氨基酸序列长度分布的结果显示，患者L术前一天、术后第一天、术后第7天的高斯分布拟合值分别为0.8596、0.8717和0.9742，术前一天以11个长度的氨基酸(22.19％)和13个长度的氨基酸(25.90％)为主，术后一天以13个长度的氨基酸(35.72％)为主的异常高取用，而术后第七天(排斥反应前)则以11个至13个长度的氨基酸(20.29％-23.66％)为主的钟型分布。患者Q术前一天、术后第一天、术后第7天的高斯分布拟合值分别为0.9837、0.9585和0.9952，其不同时间点的CDR3氨基酸序列长度分布相似，均以12个和13个长度的氨基酸为主；患者T术前一天、术后第一天、术后第7天的高斯分布拟合值分别为0.998、0.9513和0.9829，其不同时间点的CDR3氨基酸序列长度分布相似，均以12个和13个长度的氨基酸为主。

通过对3例患者共9个样本的TCRβ链CDR3中高频扩增的前100条氨基酸序列进行了统计分析。将两个前后两个时间点克隆比例上升或下降0.5％以上的氨基酸序列定义为氨基酸序列克隆上调或下降。患者L在急性排斥前(术后第七天)较术后第一天克隆上调氨基酸序列有：AISESGWRNYGYT、ASSFKWAGEQY、ASSSGQDEQY、ASTKSTSFSYNEQF、ATSRDGTDSSSYNEQF；患者L在急性排斥前(术后第七天)较术后第一天克隆下调氨基酸序列有：ASIRGTSYEQY、ASKYRGYSNQPQH、ASLGQGNQPQH、ASRAGTSGDPLQETQY、ASRPLAGGQETQY、ASRPRATGGEQY、ASRRDRGDYGYT、ASRRRSSPLH、ASSFSPDGYEQY、ASSIDQAFLGGQPQH、ASSILAGGLKNEQF、ASSILAGISYNEQF、ASSILGQQETQY、ASSLGLSAYEQY、ASSLRATNYGYT、ASSLRWGAVGNEQF、ASSQGQPQH、ASSRASGTEAF、ASSSGKGGGEKLF、ASSSPADSNQPQH、ASSTGLWELF、ASSTGTGGDEQY、ASSWMIQGYEQY、ASYSGSGTGTDTQY、ATSDTGRGETQY、ATSRVAGETQY、AWDRGAGAGEQY、AWSRGGSAYEQY、AWSTFSYEQY、SARLSREPYEQY、SARPGGAKAGELF、SARTRDLAF。患者Q在急性排斥前(术后第七天)较术后第一天克隆上调氨基酸序列有：ASRLAGGNTGELF、ASSARGSLEQY、ASSDGGSGTGELF、ASSEEDLNGYT、ASSEIRGNYGYT、ASSFSGPSHEQY、ASSLDAGNQPQH、ASSPGQGYQPQH、ASSRTGENTGELF、ASSVEPYGYT、ASSYTDRGRQETQY、ASTLQREGHEQY、ATRQGADSPLH、ATSGLANEQF、ATSGLSNEQF、ATSRDLLAGGYGQETQY、AWSTGPNQPQH、ASKLRWAGELF、ASSGQNSYEQY、ASSGRQNYGYT、ASSGTGGEGYT、ASSKTEDGYT、ASSVESYGYT、ASSVGATQPQH；患者Q在急性排斥前(术后第七天)较术后第一天克隆下调氨基酸序列有：AIRGNTEAF、ASGLRTSGSTAAYEQY、ASGNFLTGLYEQY、ASIDTGSSYNSPLH、ASRGVRDLNTEAF、ASRLRLENTEAF、ASSAERSTEAF、ASSASTQAF、ASSDTSGLEQY、ASSEAGVRLNYGYT、ASSEEVLRY、ASSEGSDTQY、ASSGGAYGVEQY、ASSGRDTLRELF、ASSHGQGNSPLH、ASSIAPGSATNEKLF、ASSILGNGYT、ASSKDSTDTQY、ASSSSGSTDTQY、ASSSTYEQY、ASSVAYEQY、ASSYTDRGRQETQY、ASTTQGADTQY、ATSDFSAGAYEQY、ATSDGGYSDSYEQY、ATSDHTGINYGYT、ATSDNGQGAEAF、ATSEGGPTYEQY、ATSRDLAGYTGELF、ATSRDPAGANEKLF、ATSRQGYEQF、ATSRSGQGGTYEQY、AVGYAGTEAF、AWDKMNTEAF、AWGRGDGYT、AWRTGSYEQY、AWSATGNYGYT、AWSDDGYGYT、SAQSARVGGPQWY。患者Q在急性排斥前(术后第七天)较术后第一天克隆上调氨基酸序列有：ASMGDTNTEAF、ASRDGPTGELF、ASRDIGGYT、ASSEGVTLYEQY、ASSESRGREEKLF、ASSPAGVGEQY、ASTETGTGLSAPLH、ATSRDRTGANEKLF、ATSRTGDGYT、AWSPFDRHGYT、ASSSGVALGYT；患者T在急性排斥前(术后第七天)较术后第一天克隆下调氨基酸序列有：ASKGPLDNEQF、ASNEGRGTEAF、ASNVNGNGEAF、ASREETQY、ASRPVTNYGYT、ASRVGQENTEAF、ASRWAFTGANVLT、ASSAGTRGSGELF、ASSAQTYNSPLH、ASSDEGQEQY、ASSDRAPLGDEQF、ASSEIPSVNEQY、ASSFTEGTEAF、ASSGWGRDHEQY、ASSLEGGQNYEQY、ASSLPGMNTEAF、ASSQSPGELF、ASTLGTVNTEAF、ASTRIGPGRNTGYEQY、ATSDLKSRPGSGIYEQY、ATSGRGDYGYT、ATSPGTSGWDEQY、ATSRAEGTEAF、ATSRDVDNSYEQY、ATSRQQGAPNSPLH、AWSVGSDSELF。由此可见，上述氨基酸序列有潜力成为肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

三、TCRβ链的V区基因使用频率分布

L术前一天样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV2(19.41％)、TRBV7-3(9.37％)、TRBV6-5(8.67％)、TRBV7-2(8.29％)、TRBV20-1(6.98％)；L术后一天样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV2(20.42％)、TRBV12-4(8.90％)、TRBV12-3(8.69％)、TRBV19(7.38％)、TRBV7-2(6.72％)；L术后七天样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV2(15.03％)、TRBV10-3(8.80％)、TRBV19(8.48％)、TRBV7-2(6.76％)、TRBV20-1(6.21％)。患者L三个时间点均是优势取用的家族有TRBV2、TRBV7-2，而术前一天与术后七天均是优势取用的家族除上诉两者还有TRBV19，急性排斥前取用明显增加的家族有TRBV10-3、TRBV5-1。Q术前一天样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV2(13.89％)、TRBV19(7.99％)、TRBV20-1(7.35％)、TRBV7-2(6.38％)、TRBV7-9(4.96％)；Q术后1天样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV20-1(13.36％)、TRBV2(11.59％)、TRBV30(9.3％)、TRBV19(6.59％)、TRBV7-9(4.56％)；Q术后7天样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV2(17.64％)、TRBV19(11.69％)、TRBV20-1(10.04％)、TRBV7-2(7.83％)TRBV24-1(3.44％)。患者Q三个时间点均为优势取用的家族是TRBV2、TRBV20-1、TRBV19，急性排斥前取用明显增加的家族有TRBV2。TPre1样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV2(15.49％)、TRBV19(8.82％)、TRBV5-1(6.29％)、TRBV24-1(5.86％)、TRBV24/OR9-2(5.86％)、TRBV20-1(4.95％)。T术后1天样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV2(16.50％)、TRBV24-1(9.80％)、TRBV24/OR9-2(9.79％)、TRBV19(7.27％)、TRBV15(6.88％)；T术后7天样本中排名前五位的优势取用V基因家族是TRBV2(15.32％)、TRBV24-1(10.92％)、TRBV24/OR9-2(10.92％)、TRBV19(8.73％)、TRBV15(6.70％)。患者T三个时间点均为优势取用的家族是TRBV2、TRBV19、TRBV24/OR9-2，而术后1天和术后7天的优势取用家族一样，急性排斥前取用明显增加的家族有TRBV10-1、TRBV7-2。在不同时间点均没有发现取用丢失和新出现的V基因家族。上述TCRβ链的V区基因有潜力成为肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

四、TCRβ链的J区基因使用频率分布

L术前一天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(33.08％)、TRBJ2-1(14.32％)、TRBJ1-1(10.68％)、TRBJ1-5(8.59％)；L术后1天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(21.85％)、TRBJ1-2(17.41％)、TRBJ1-6(11.75％)、TRBJ2-5(11.95％)；L术后7天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(26.31％)、TRBJ1-2(13.68％)、TRBJ2-1(11.95％)、TRBJ1-1(8.93％)。在手术前后均为优势取用的家族有TRBJ2-7，术后均为优势取用家族的有TRBJ2-7、TRBJ1-2。Q术前一天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(17.57％)、TRBJ1-1(12.78％)、TRBJ2-2(11.34％)、TRBJ1-2(10.89％)；Q术后1天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(19.27％)、TRBJ2-3(18.24％)、TRBJ1-2(13.85％)、TRBJ1-1(12.61％)；Q术后7天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(19.01％)、TRBJ1-2(14.05％)、TRBJ2-3(12.38％)、TRBJ2-1(12.24％％)。在手术前后均为优势取用家族的有TRBJ2-7、TRBJ1-2，术后优势取用家族除上述2个还有TRBJ2-3。T术前一天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(21.58％)、TRBJ1-1(18.55％)、TRBJ1-2(15.78％)、TRBJ2-1(8.47％)；T术后1天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(24.19％)、TRBJ1-1(26.30％)、TRBJ1-2(14.94％)、TRBJ2-1(10.41％)；T术后7天样本中优势取用的J基因家族是TRBJ2-7(22.03％)、TRBJ1-1(21.22％)、TRBJ1-2(18.58％)、TRBJ2-2(8.49％)。在手术前后均为优势取用家族的有TRBJ2-7、TRBJ1-1、TRBJ1-2。所有样本均出现TRBJ2-7优势取用，且都没有TRBJ基因家族的取用丢失。由此可见，上述TCRβ链的J区基因有潜力成为肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

五、TCRβ链V区基因和J区基因家族配对情况

患者L在急性排斥前(L术后7天)的优势配对家族是TRBV10-3/TRBJ1-2(0.051％，组合频率33668)、TRBV12-3/TRBJ2-7(0.043％，组合频率28331)、TRBV6-5/TRBJ2-7(0.032％，组合频率21244)、TRBV2/TRBJ2-7(0.034％，组合频率22319)、TRBV6-5/TRBJ2-7(0.032％，组合频率21244)。TRBV10-3/TRBJ1-2组合在急性排斥前表达明显增加，在L术前一天和L术后1天样本中比例分别为0.016％(组合频率4643)和0.019％(组合频率5421)；TRBV12-3/TRBJ2-7组合在急性排斥前表达明显增加，在L术前一天和L术后1天样本中比例分别为0.0196％(组合频率6964)小于0.001％(组合频率275)；TRBV6-5/TRBJ2-7组合与术后第一天(L术后1天)相比无明显变化，但其较术前一天(L术前一天)表达明显增加；TRBV2/TRBJ2-7及TRBV6-5/TRBJ2-7组合3个时间点表达无明显变化。

患者Q在急性排斥前(Q术后7天)的优势配对家族是TRBV2/TRBJ1-2(0.071％，组合频率25604)、TRBV20-1/TRBJ2-3(0.058％，组合频率20750)、TRBV24-1/TRBJ2-1(0.046％，组合频率16669)、TRBV2/TRBJ2-7(0.037％，组合频率13398)、TRBV2/TRBJ2-2(0.033％，组合频率11963)。TRBV2/TRBJ1-2组合在急性排斥前表达较L术前一天和L术后1天明显增加，在L术前一天和L术后1天样本中比例分别为0.012％(组合频率4970)和0.011％(组合频率4078)；TRBV20-1/TRBJ2-3较Q术后1天表达下降，较Q术前一天表达增加不明显；TRBV24-1/TRBJ2-1较Q术后1天表达增加超过50％，较Q术前一天表达增加不明显；TRBV2/TRBJ2-7组合较Q术后1天增加不明显，较Q术前一天明显增加；TRBV2/TRBJ2-2组合较Q术后1天表达明显增加，较Q术前一天表达增加不明显。

患者T在急性排斥前(T术后7天)的优势配对家族是TRBV24-1/TRBJ1-2(0.093％，组合频率50034)、TRBV24-1/TRBJ1-1(0.088％，组合频率47126)、TRBV2/TRBJ2-7(0.040％，组合频率21567)、TRBV15/TRBJ2-7(0.030,组合频率15952)、TRBV12-3/TRBJ1-1(0.028％，组合频率15133)。TRBV24-1/TRBJ1-2组合在3个时间点均为优势配对家族，比例无明显变化；TRBV24-1/TRBJ1-1、TRBV2/TRBJ2-7、TRBV15/TRBJ2-7和TRBV15/TRBJ2-7组合T术后7天较TPos1表达增加不明显，但较术前表达明显增加。

3名患者术后7天样本中均为优势配对家族是TRBV2/TRBJ2-7，其表达较术后一天无明显变化，但较术前一天明显增加。

由此可见，上述TCRβ链V区基因和J区基因配对家族有潜力成为肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

上述肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，通过对外周血中T细胞CDR3进行测序和分析，能够揭示急性排斥受者TCR CDR3的多样性，分析T淋巴细胞亚群中特异CDR3序列及TCR特征谱，评估急性排斥受者的免疫状态；发掘急性排斥发病过程的免疫组库改变，进一步研究肾移植术后急性排斥反应发病机制。此外，通过全面了解围肾移植早期发生排斥反应受者TCR CDR3的多样性，深入挖掘T淋巴细胞亚群中独特的CDR3序列和TCR特征谱以客观准确地评估急性排斥患者的免疫状态。有望能够更深入的认识急性排斥发病过程的免疫组库改变，有助于进一步研究排斥反应的发生机制并指导临床及时对急性排斥反应患者进行干预治疗，从而提高肾移植受者和移植物术后的短期及长期存活率，真正造福肾移植受者。

本发明还提供一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型，由如上任一实施例中所述的构建方法制备得到。又如，肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型包括以上“有潜力成为肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型”中的至少一组。

本发明还提供一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建系统，采用如上任一实施例中所述的构建方法实现。

需要说明的是，现有的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建系统，需要较为繁琐的生物实验过程以及数据分析过程，构建过程极为繁琐，对人员实验技能要求较高。并且，实验过程中的人为操作过程，效率较低且极容易出现人为误差，从而使得构建出的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型准确性较差。为了解决上述问题，所述构建系统包括顺序连接的样品获取模组、分离模组、提取模组、扩增模组、测序模组和分析模组，其中，样品获取模组用于获取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；分离模组用于从外周血标本中分离T淋巴细胞；提取模组用于提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；扩增模组用于以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；测序模组用于采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；分析模组用于对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

上述构建系统能够自动生成肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型，提高了构建效率，避免了较为繁琐的实验操作，节省了大量的人力物力。同时，自动性能较好，还能够减少人为误差，以提高肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的准确性。

一实施例中，所述分离模组包括第一控制单元、以及分别连接所述第一控制单元的接收单元、淋巴细胞分离单元和T淋巴细胞分离单元，第一控制单元分别用于控制接收单元、淋巴细胞分离单元和T淋巴细胞分离单元，接收单元、淋巴细胞分离单元和T淋巴细胞分离单元依次顺序连接。

其中，接收单元用于从样品获取模组中接收外周血标本；淋巴细胞分离单元用于选用淋巴分离液分离外周血标本中的淋巴细胞，得到单个核细胞；T淋巴细胞分离单元用于选用免疫磁珠间接法从单个核细胞悬浮液中分离T淋巴细胞。上述分离模组，能够从样品获取模组中获取外周血标本，并从外周血标本中分离出T淋巴细胞，能够自动化操作，避免了传统中需要实验人员较高实验的技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高后续构建得到的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的准确性，还能够使得肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建过程效率较高。

一实施例中，淋巴细胞分离单元包括分别与第一控制单元连接的稀释子单元、加样子单元、第一离心子单元、吸液重悬子单元、第二离心子单元和收集子单元，第一控制单元还用于分别控制稀释子单元、加样子单元、第一离心子单元、吸液重悬子单元、第二离心子单元和收集子单元，稀释子单元、加样子单元、第一离心子单元、吸液重悬子单元、第二离心子单元和收集子单元依次顺序连接。其中，稀释子单元连接接收单元，收集子单元连接T淋巴细胞分离单元。

其中，稀释子单元用于各取外周血3毫升，并用pH7.2的Hanks液或生理盐水以1：1体积将外周血稀释。加样子单元用于吸取3毫升淋巴细胞分层液加入到离心管中，并将稀释的样本血沿管壁缓慢加入淋巴分离液液面上；第一离心子单元用于在16摄氏度～18摄氏度条件下，将加样后的离心管以2500转/分钟离心25min；吸液重悬子单元用于从离心后的离心管中吸取白膜层，并用Hanks液重悬；第二离心子单元用于将使重悬后的离心管2000r/min下离心10min；收集子单元用于将离心后的离心管舍弃上清，并将细胞使用悬浮液重悬，得到单个核细胞重悬液。如此，使得淋巴细胞分离单元能够自动从外周血中自动分离出单个核细胞。

一实施例中，提取模组包括第二控制单元，以及分别连接所述第二控制单元的单个核细胞取样单元、蛋白酶K加样处理单元、结合液CB加样处理单元、异丙醇加样处理单元、吸附柱上样处理单元、第一离心单元、抑制物去除液上样处理单元、第二离心单元、漂洗液上样处理单元、第三离心单元、漂洗液WB上样处理单元、第四离心单元、洗脱缓冲液上样处理单元、第五离心单元、二次吸附柱上样单元、第六离心单元和T细胞DNA收集处理单元。

第二控制单元分别用于控制单个核细胞取样单元、蛋白酶K加样处理单元、结合液CB加样处理单元、异丙醇加样处理单元、吸附柱上样处理单元、第一离心单元、抑制物去除液上样处理单元、第二离心单元、漂洗液上样处理单元、第三离心单元、漂洗液WB上样处理单元、第四离心单元、洗脱缓冲液上样处理单元、第五离心单元、二次吸附柱上样单元、第六离心单元和T细胞DNA收集处理单元。

单个核细胞取样单元、蛋白酶K加样处理单元、结合液CB加样处理单元、异丙醇加样处理单元、吸附柱上样处理单元、第一离心单元、抑制物去除液上样处理单元、第二离心单元、漂洗液上样处理单元、第三离心单元、漂洗液WB上样处理单元、第四离心单元、洗脱缓冲液上样处理单元、第五离心单元、二次吸附柱上样单元、第六离心单元和T细胞DNA收集处理单元依次顺序连接。

其中，单个核细胞取样单元连接T淋巴细胞分离单元，T细胞DNA收集处理单元连接扩增模组。单个核细胞取样单元用于取5000μL单个核细胞悬浮液并放入10ml离心管中。蛋白酶K加样处理单元用于向单个核细胞悬浮液中加入20mg/ml蛋白酶K 25微升，并于22℃～26℃条件下保存20分钟，中间颠倒离心管数次使其混合均匀。结合液CB加样处理单元用于向离心管中加入200μL结合液CB，并充分混匀，于70℃～75℃水浴放置15分钟。异丙醇加样处理单元用于向离心管中加入100μL异丙醇，充分混匀，得到混合液。吸附柱上样处理单元用于将混合液上样至吸附柱当中，并将吸附柱置入收集管中。第一离心单元用于将收集管10000rpm离心0.5分钟。抑制物去除液上样处理单元用于去除收集管离心后的上清液，并加入4500μL抑制物去除液。第二离心单元用于将加入4500μL抑制物去除液后的收集管12000rpm高速离心0.5分钟。漂洗液上样处理单元用于去除收集管离心后的上清液，并加入500μL漂洗液。第三离心单元用于将加入500μL漂洗液后的离心管使用12000rpm离心0.5分钟。漂洗液WB上样处理单元用于去除收集管离心后的上清液，并将吸附柱置入另一收集管中。第四离心单元用于将置入了吸附柱的另一离心管13000rpm离心120秒。洗脱缓冲液上样处理单元用于去除收集管离心后的上清液，并将吸附柱置入又一收集管中，并加入100μL提前预热洗脱缓冲液，26℃条件下放置4分钟。第五离心单元用于将放置之后的收集管12000rpm离心60秒，得到溶液。二次吸附柱上样单元用于将得到的溶液重新加离心管中的吸附柱中，26℃条件下放置120秒。第六离心单元用于将离心管12000rpm离心60秒。T细胞DNA收集处理单元用于收集T细胞DNA并在2℃～8℃中保存。

上述提取模组，能够自动从T淋巴细胞分离出DNA，能够自动化操作，避免了传统中需要实验人员较高实验的技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高后续构建得到的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的准确性，还能够使得肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建过程效率较高。

一实施例中，扩增模组包括第三控制单元，以及分别连接所述第三控制单元的取样单元、加样单元、扩增处理单元、扩增处理单元、回收单元、末端修复单元、第一纯化单元、接头连接单元、PCR富集单元及第二纯化单元。所述第二控制单元分别用于控制取样单元、加样单元、扩增处理单元、扩增处理单元、回收单元、末端修复单元、第一纯化单元、接头连接单元、PCR富集单元及第二纯化单元。所述取样单元、加样单元、扩增处理单元、扩增处理单元、回收单元、末端修复单元、第一纯化单元、接头连接单元、PCR富集单元及第二纯化单元依次顺序连接。

其中，所述取样单元连接所述T细胞DNA收集处理单元，所述第二纯化单元连接所述测序模组。取样单元用于从T细胞DNA收集处理单元中获取各标本的T细胞DNA，并将各标本的全基因组DNA分别加入至PCR管中；加样单元用于向PCR管中加入引物、dNTPs、Taq酶、镁离子及缓冲液，需要说明的是，dNTPs、Taq酶、镁离子及缓冲液的添加量，请参见现有技术。本实施例中，所述引物为TRB V/J引物。扩增处理单元用于将经过加样单元处理后的PCR管进行多重PCR反应。回收单元用于电泳检测并回收120bp～200bp的多重PCR产物；末端修复单元用于向120bp～200bp的多重PCR产物中加入End Repair Mix进行末端修复反应，第一纯化单元用于向末端修复反应的产物中使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化操作；接头连接单元用于利用Adapter oligo mix和DNA ligase配制接头连接反应体系对进行末端修复反应后的产物进行接头连接；PCR富集单元用于通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段；第二纯化单元用于使用QIAquick Gel Extraction kit对富集后的经过接头修饰的DNA片段进行纯化，分别得到CDR3基因文库。

上述扩增模组，能够从T细胞DNA收集处理单元中获取各标本的全基因组DNA，并将全基因组DNA自动PCR扩增、纯化成为CDR3基因文库，能够自动化操作，避免了传统中需要实验人员较高实验的技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高后续构建得到的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的准确性，还能够使得肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建过程效率较高。

一实施例中，构建系统还包括第一检测模组，所述第一检测模组用于检测DNA提取液中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则由扩增模组执行其操作。又如，所述第一检测模组包括第一检测单元、第二检测单元及判定执行单元，其中，第一检测单元，用于采用荧光定量测定DNA提取液中DNA含量；第二检测单元用于采用琼脂糖凝胶电泳检测全DNA提取液中DNA的完整性；判定执行单元用于根据第一检测单元及第二检测单元的检测结果，判定是否合格，是则由扩增模组执行其操作。如此，通过第一检测模组对全基因组进行检测，能够进一步提高后续构建得到的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的准确性。又如，所述第一检测模组分别连接所述DNA收集处理单元及所述第二控制单元。

一实施例中，测序模组包括第四控制单元，以及分别连接所述第四控制单元的取样单元、稀释变性单元、FlowCell上样处理单元、桥式PCR扩增单元及测序单元。所述第四控制单元用于分别控制取样单元、稀释变性单元、FlowCell上样处理单元、桥式PCR扩增单元及测序单元。取样单元、稀释变性单元、FlowCell上样处理单元、桥式PCR扩增单元及测序单元依次顺序连接。其中，所述取样单元连接所述第二纯化单元，所述测序单元连接所述分析模组。取样单元用于从第二纯化单元CDR3基因文库；稀释变性单元用于稀释各文库并使各文库中的DNA变性；FlowCell上样处理单元用于按照预期上机数据量，稀释变性后的各文库中的DNA；并将变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交；桥式PCR扩增单元用于在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂对杂交在FlowCell上的DNA完成桥式PCR扩增；测序单元用于将制备好的FlowCell采用IlluminaMiSeq测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。又如，所述测序单元还用于连接Illumina MiSeq高通量测序平台，所述测序单元用于将制备好的FlowCell上样至Illumina MiSeq高通量测序平台上并进行测序操作。上述测序模组，能够从第二纯化单元分别获取CDR3基因文库，并完成测序，能够自动化操作，避免了传统中需要实验人员较高实验的技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高后续构建得到的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的准确性，还能够使得肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建过程效率较高。

一实施例中，所述构建方法还包括第二检测模组，所述第二检测模组用于分别对CDR3基因文库进行片段范围检测和浓度定量。所述测序模组用于根据所述第二检测模组得到的片段范围值和浓度定量值采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序。如此，能够使各文库在后续进行测序时被准确控制上机量，从而使得测序结果更为准确。又如，所述第二检测模组分别连接所述第二纯化单元及所述第三控制单元。一实施例中，分析模组包括第五控制单元、以及分别连接所述第五控制单元的过滤单元、拼接单元、比对分析单元及图谱构建处理单元，所述第五控制单元用于分别控制过滤单元、拼接单元、比对分析单元及图谱构建处理单元，所述过滤单元连接所述测序单元。所述过滤单元连接所述测序单元依次顺序连接。过滤单元用于对测序结果数据进行过滤处理；拼接单元用于数据过滤完成之后，将Pair-end数据的两条序列拼接成一条完整的contig；比对分析单元用于对contig进行数据比对分析；图谱构建处理单元用于根据比对分析所得到的结果，统计出每一个克隆的表达情况，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

上述分析模组，能够对测序结果数据进行分析，构建出肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型，能够自动化操作，避免了传统中需要技人员较高分析处理技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高构建得到的肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的准确性，还能够使得肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建过程效率较高。

需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即外周血，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；

从外周血标本中分离T淋巴细胞；

提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；

以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；

采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；

对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液之后，以及在以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库之前，所述构建方法还包括：

测定DNA提取液中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则执行下一步骤。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA提取液的完整性。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，测定所述DNA待测液的完整性包括如下步骤：

将DNA提取液与加样缓冲液混合后加入孔板通电进行电泳，在电压为150V的条件下电泳40分钟；

取出凝胶，并在紫外灯下检查。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，从外周血标本中分离T淋巴细胞，具体为：

选用淋巴分离液分离外周血标本中的淋巴细胞，得到单个核细胞；

选用免疫磁珠间接法从单个核细胞悬浮液中分离T淋巴细胞。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液，具体为：

取5000μL单个核细胞悬浮液放入10ml离心管中；

加入20mg/ml蛋白酶K 25微升，22℃～26℃条件下保存20分钟，中间颠倒离心管数次使其混合均匀，用200μL结合液CB加入到离心管中，马上颠倒数次使其充分混匀，于70℃～75℃水浴放置15分钟；

加入100μL异丙醇，充分混匀，得到混合液；

把混合液置于吸附柱当中，再使吸附柱置入收集管中，10000rpm离心0.5分钟，去除废液；

加入4500μL抑制物去除液，12000rpm高速离心0.5分钟，舍弃废液；

加入漂洗液700μL，再次12000rpm离心0.5分钟，舍弃废液；

再次加入漂洗液500μL，继续使用12000rpm离心0.5分钟，舍弃废液；

再次使吸附柱重新置入收集管中，13000rpm离心120秒，舍弃废液；

把吸附柱置入另一离心管中，加入100μL提前预热洗脱缓冲液，26℃条件下放置4分钟，再次使用12000rpm离心60秒；将得到的溶液重新加入吸附柱中，26℃条件下放置120秒后使用12000rpm离心60秒；

收集T细胞DNA并在2℃～8℃中保存。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库，具体为：

取DNA提取液中的DNA；

加入引物；

进行多重PCR；

电泳检测回收120bp～200bp的多重PCR产物，得到第一样本；

取所述第一样本进行末端修复反应，纯化得到第二样本；

取3’末端具有T碱基的接头与所述第二样本连接，得到第三样本；

将所述第三样本进行多重PCR反应扩增，电泳，切取目的片段后，纯化回收，得到所述CDR3基因文库。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序，具体为：

使所述CDR3基因文库中的DNA变性；

按照预期上机数据量，稀释；并将变性稀释后的述CDR3基因文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交；

在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂完成桥式PCR扩增；

将制备好的FlowCell采用Illumina MiSeq测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。

9.一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型，其特征在于，由如权利要求1至8中任一项所述的构建方法制备得到。

10.一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建系统，采用如权利要求1至8中任一项所述的构建方法实现。