CN107345240A

CN107345240A - T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法

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Publication number: CN107345240A
Application number: CN201610316348.0A
Authority: CN
Inventors: 眭维国; 戴勇; 赖柳生
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2017-11-14

Abstract

一种T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法，包括以下步骤：设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；分离各所述外周血标本的T细胞，并分别提取所述外周血标本T细胞中的DNA；采用多重PCR技术，扩增出T细胞受体β链的CDR3区；对所述T细胞受体β链的CDR3区进行高通量测序，对所述实验组及对照组中T细胞受体β链进行DNA分析。上述T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法，设计合理可行，能够有效地获取作为中间结果的围手术期肾移植受者相关信息，对这些信息进一步进行验证分析和研究有助于研究排斥反应的发生机制并指导免疫抑制药物的个体化合理应用，进而有助于提高肾移植受者和移植物术后的短期及长期存活率。

Description

T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法

技术领域

本发明涉及一种获取作为中间结果的围手术期肾脏移植受者信息，特别是涉及一种T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法。

背景技术

肾脏移植是目前治疗慢性肾功能衰竭最有效的方法。随着慢性肾衰竭患者的增多，研究者们经过不断的探索，终于使肾移植成为了终末期肾病病人的最佳替代治疗方法。成功的肾移植可显著提高终末期肾病患者的生活质量。近年来，肾移植受者/移植肾的短期存活率明显得到改善，但受者/移植肾的长期存活率却没有进一步提高。Sellares等对美国移植研究数据库中不同时期的肾移植受者长期存活数据分析结果显示：与早期阶段(1982～1984年)相比，近年来(2005～2010年)肾移植的短期存活率已明显提高，而术后5年移植肾的存活率仍每年持续下降约3.6％。

目前排斥反应和感染是肾脏移植术后面临的两大问题。肾脏移植术后发生急性排斥反应是导致移植肾丢失的主要原因之一，发生率为20％-50％，其也是影响移植肾长期存活率和功能的独立危险因素。预防和减少早期急性排斥反应的发生有利于移植受者和移植物的长期存活。急性排斥反应跟很多因素有关，包括年龄、性别、透析时间、移植史、输血次数、女性的妊娠史、供体的冷、热缺血时间、配型、原发病、供体情况及免疫抑制方案等。

早期移植肾急性排斥反应的主要临床表现主要：①尿量减少；②发热，特别是中低热，一般常在下半夜和凌晨发生，常至午后退热，次日又再次出现，伴有感冒样全身症状；也没有明显的感染征象。③血压增高尤其是突然的血压升高且对降压药物反应较差者。④移植肾区肿胀触痛不适。患者一般自觉移植肾区胀痛、压痛，触诊可扪及肾脏比原来增大，质地变硬；⑤体重逐渐增加，因为尿少，体内水分未能排出导致的，严重者可出现明显水肿或腹水。⑥其他全身症状如肌肉关节酸痛腹胀，纳差等。目前临床监测肾移植术后免疫状态的方法包括受体的全身情况、血肌酐、彩色多普勒超声、免疫抑制剂的血药浓度监测、移植物穿剌组织病理学检查等。但是血肌酐敏感度和特异性较差，对临床上的预防及治疗等意义不大；彩色多普勒超声受到超声诊断医生主观影响较大；较为普遍的是监测免疫抑制剂的血药浓度，但是由于不同受者的体内药物代谢存在着个体差异，且机体内多种因素都可以影响免疫抑制药物的血药浓度，许多术后患者仍不可避免排斥反应的发生；而移植物穿刺组织病理学检查是一种有创性检查，且只能反映移植肾穿刺局部的情况,对患者具有一定的风险性，存在并发症如出血、休克、动静脉瘘、血尿、无尿、移植肾破裂、甚至引起移植肾丢失等，不宜反复监测。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种围手术期肾移植受者T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法。

一种T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法，包括以下步骤：

设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；

分离各所述外周血标本的T细胞，并分别提取所述外周血标本T细胞中的DNA；

采用多重PCR技术，扩增出T细胞受体β链的CDR3区；

对所述T细胞受体β链的CDR3区进行高通量测序，对所述实验组及对照组中T细胞受体β链进行DNA分析。

在其中一个实施例中，采用多重PCR技术之前，所述处理方法还包括测定DNA的含量以及检测DNA完整性的步骤。

在其中一个实施例中，采用荧光分析法测定DNA的含量，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA完整性。

在其中一个实施例中，利用Illumina MiSeq平台对CDR3区进行高通量测序。

在其中一个实施例中，采用多重PCR技术，扩增出T细胞受体β链的CDR3区，包括构建DNA文库，其具体包括：

计算所述实验组及对照组中DNA的取用量，称取，并加入V区引物及J区引物进行多重PCR；

电泳检测回收多重PCR产物；

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

在接头连接反应体系中进行接头连接；

通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，纯化回收，得到DNA文库。

在其中一个实施例中，所述V区引物包括TRBV2、TRBV3-1、TRBV4-1/2/3、TRBV5-1、TRBV5-4/5/6/8、TRBV6-4.1、TRBV6-8/5/1.2、TRBV6-9/7/1.1/6、TRBV6-4.2、TRRBV6-2/3、TRBV7-2/4/6/7/8、TRBV7-3、TRBV7-9、TRBV9、TRBV10-1、TRBV10-2/3、TRBV11-1/2/3、TRBV12-3.2/5.2、TRBV12-3.1/4/5.1、TRBV13、TRBV14、TRBV15、TRBV16、TRBV18、TRBV19、TRBV20-1、TRBV24-1、TRBV25-1、TRBV27-1、TRBV28、TRBV29-1及TRBV30-F5。

在其中一个实施例中，所述J区引物包括TRBJ1.1、TRBJ1.2、TRBJ1.3、TRBJ1.4、TRBJ1.5、TRBJ1.6、TRBJ2.1、TRBJ2.2、TRBJ2.3、TRBJ2.4、TRBJ2.5、TRBJ2.6及TRBJ2.7。

在其中一个实施例中，构建DNA文库后，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

在其中一个实施例中，分离各所述外周血标本的T细胞包括：分离出所述外周血标本的淋巴细胞及分离出所述淋巴细胞中的T细胞。

在其中一个实施例中，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞。

上述处理方法通过高通量测序为基础对围手术肾移植受者已经脱离人体的全血标本单个核细胞TCR的CDR3区域进行分析，发现围手术期肾脏受体的部分TRβV和TRβJ亚类的表达与正常人存在一定差异，且发现围手术期肾移植受者中存在特定的共有序列，这些共有序列是疾病的潜在生物标志物，对疾病诊断、病情判断及预后评估有重要价值。

上述T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法，设计合理可行，能够有效地获取作为中间结果的围手术期肾移植受者相关信息，可用于围手术期肾移植受者免疫状态的后续分析，对这些信息进一步进行验证分析和研究有助于研究排斥反应的发生机制并指导免疫抑制药物的个体化合理应用，进而有助于提高肾移植受者和移植物术后的短期及长期存活率。

附图说明

图1为本发明一实施例中T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

请参阅图1，本发明的一个实施例是，一种T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法，其包括如下步骤。

S110、设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本，例如，所述实验组包括术前1天组、术后1天组、术后7天组。

例如，本发明各实施例采用的外周血标本，分别来自于在南方医科大学附属桂林解放军第器官移植中心住院接受肾移植的肾功能不全尿毒症期患者(慢性肾小球肾炎引起)10例和在南方医科大学附属桂林解放军第181医院同一时间段体检的健康者10例。所有患者均符合2009KDIGO制定的慢性肾小球肾炎引起的肾功能不全尿毒症期诊断标准：确诊慢性肾小球肾炎患者出现尿毒症症状，实验室检查有尿液性质改变，不同程度贫血，代谢性酸中毒，水、电解质紊乱等；血尿素氮>22mmol/L，血肌酐>442umo/L；血清肌酐清除率<15mL/min。

其中尿毒症患者10例，女性3例，男性7例，年龄25～63岁，平均年龄40.3±12.83岁，病程0.6～12年。术前血液透析治疗时间平均8月(l月～5年)，所有受者均为首次移植、同种异体心死亡供体(donation after cardiac death，DCD)肾移植。供、受者ABO血型相容，受者群体反应性抗体(panel reactive antibody，PRA)阴性，淋巴毒实验均＜10％。供肾热缺血时间6～11分钟，冷缺血时间3～15小时。从术中至术后采用常规免疫抑制方案，免疫抑制方案：术中至术后2天用甲基强的松龙(MP)500mg/d，术后第2天开始口服他克莫司(tacrolimus，FK506)+甲泼尼龙(MP)+霉酚酸酯(骁悉，MMF)三联用药，FK506起始量0.15mg/kg/d，根据血药浓度和临床症状逐渐调整剂量，MP起始量为70mg/d,8mg/d开始减量，减至16mg/d或12mg/d并维持；MMP 0.5g，2次/d。避免使用清除淋巴细胞的免疫抑制剂。所有受者移植肾功能正常恢复，未发生延迟肾功能恢复(delayed graft function，DGF)，在术后2周内均未发生急性排斥反应。

健康对照组10例，其中女性5例，男性5例，年龄为24～47岁，平均年龄34.9±9.39岁，为南方医科大学附属桂林解放军第181医院同一时间段体检的健康者，无重大疾病史，无免疫方面的相关疾病、近期感染及肾脏方面疾病，直系亲属无自身免疫性疾病。

例如，在室温条件下，获取脱离人体的外周静脉血5mL置于5mL EDTA抗凝真空采血管，盖上盖子后，将EDTA抗凝真空采血管轻轻颠倒混匀数次后，放入-80℃超低温冰箱保存备用。采集每个健康对照者外周肝素抗凝静脉血约5mL，每个肾移植受者于术前1天、术后1天、术后7天共3个时间点各采集外周肝素抗凝静脉血5mL，一共40个标本，每个标本在收集后当天分离出T细胞。

S120、分离各所述外周血标本的T细胞，并分别提取所述外周血标本T细胞中的DNA。

例如，分离各所述外周血标本的T细胞包括：分离出所述外周血标本的淋巴细胞及分离出所述淋巴细胞中的T细胞。又如，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞。

又如，步骤S120包括如下步骤：

S121、分离出所述外周血标本的淋巴细胞。

具体地，步骤S121包括如下步骤：

(1)在离心管中按1：1比例加入适量淋巴细胞分离液，即淋巴细胞分离液与外周血的体积比为1：1。

(2)取肝素抗凝静脉血用滴管沿离心管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心800g×25分钟，即离心力rcf的值为800，离心时间为20min。

(3)离心后管内分为三层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

(4)用平头吸管吸出上、中层界面处絮状液体，转移至Eppendorf管；离心细胞液800g×15分钟，去液相，加入无菌PBS lmL洗涤，再用吸管吹匀细胞悬液；再次离心细胞液400g×15分钟，去液相。

(5)末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取20ul细胞悬液与20ul0.5％溴酚兰染液混合(1：1)，于血球计数板上计数。

S122、分离出淋巴细胞分离液中的T细胞。

具体地，步骤S122包括如下步骤：

(1)以400～900g离心已抗凝的全血。

(2)收集白膜层并用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，混匀。例如，取白膜层中部物质1～2mL并用等体积的PBS稀释，混匀。

(3)在5mL的管中最多加入2mL的白膜层/PBS混合液覆盖到1.5mL的Ficoll－Hypaque(密度为1.077)层上，并以1000g离心10分钟。例如，PBS混匀后的白膜层恒温保存并在10分钟之内使用，即在10分钟之内覆盖到1.5mL的Ficoll－Hypaque层上，并以1000g离心10分钟。

(4)从每个管中收集约1mL的界面液体转移到炮弹管中。1000g离心10分钟。

(5)弃去上清并用细胞培养液1640再次使小球混悬。以1000g离心5分钟(移去大部分血小板。)弃去上清，用1mL的20％的HIFCS/PBS再次混悬细胞。

(6)用吸液管移去上清，用1mL的细胞培养液1640再次混悬细胞。

(7)加入100μl的T荧光微珠到样品管中。

(8)在20～25℃旋混3分钟。

(9)去盖放在磁力架上1分钟。

(10)去上清液后保存到另一个管中，用B荧光微珠分离B淋巴细胞。

(11)1mL细胞培养液1640再次混悬细胞。轻击管子使得微珠再次混悬，放在磁力架上30秒，用吸液管移去上清。重复2次。

(12)用0.5mL的细胞培养液1640再次混悬细胞。

(13)将部分T淋巴细胞冻存，部分用于DNA提取。

S123、提取T细胞中的DNA。

具体地，步骤S123包括如下步骤：

(1)事先用80mL无水乙醇将DNA Wash Buffer稀释后室温保存。

(2)在超净工作台中，将无菌滤膜打开，用剪刀沿滤膜滤膜外缘约减去1cm的圆环，例如，以能盖住漏斗的孔径为宜，放入抽滤装置的无菌漏斗中。用0.22μm微孔滤膜过滤水样。需要说明的是，所用水样体积取决于所采集水样的浑浊度，对于浑浊度高的水样建议先用较大孔径的滤膜过滤以防阻塞微孔。

(3)用镊子将滤膜从漏斗中取出、折叠，用剪刀将其剪碎置入一个50mL的无菌离心管中。

(4)向离心管中加3mLSLX Buffer和500mg玻璃珠。

(5)最大转速涡旋震荡3min左右，使样品与溶液彻底混匀，使膜上菌体进入溶液。

(6)70℃或90℃水浴10min使菌体裂解涡旋震荡2～3次。

(7)向管中加1mL SP2Buffer涡旋震荡30s，冰浴5min。

(8)4℃，4000g离心10min。

(9)在超净台中将上清液转移至一新的15mL或50mL管中，加0.7倍体积的异丙醇，翻转混匀30～50次，在-20℃下至少放置30min。期间翻转几次。

(10)4℃，10000g离心20min使DNA沉降。

(11)将离心管平放，使以沉降的DNA贴于壁上在室外将液相倒掉后将管倒扣在吸水纸上沥干，若还有残留，则在超净台中用移液器吸去。

(12)向管中有DNA沉降处加400μL Elution Buffer，稀释混匀，使DNA溶解后将其转入1.5mL无菌离心管中，涡旋震荡彻底混匀20s。在65℃水浴10～30min以溶解DNA。

(13)向1.5mL离心管中，加100μL HTR Reagent。旋转震荡混合10s后室温放置2min。需要说明的是，用HTR Reagent前要用涡旋仪将其彻底震荡混匀。

(14)12000rpm高速离心3min使HTR Reagent沉降。需要说明的是，也可以选用较小的转速和较长的离心时间。若经HTR Reagent提取后样品仍然显棕色或深色，则用HTR Reagent重复步骤(13)～(14)提取。

(15)将上清液，例如，约400μL，转移至一新的1.5mL离心管中，加入等体积的XP1Buffer，通过旋转震荡充分混匀。

(16)将处理的DNA吸附柱放入一个2mL的收集管中。

(17)将样品全部转入该DNA吸附柱中，室温下，10000rpm离心1min。将离心后的液相倒掉，重新将吸附柱放回收集管中。需要说明的是，可以根据实验需要，多次重复步骤(17)。例如，重复步骤(17)直至离心后的液相体积小于步骤(17)初次离心后的液相体积的2％～5％，优选为2％或者更低。

(18)向吸附柱中加300μL XP1Buffer，室温下，10000rpm离心1min，弃去收集管中的液相。

(19)将吸附柱放入一个新的2mL收集管中，加750μL用无水乙醇稀释后的DNA Wash Buffer，10000rpm离心30s。弃去液相，将吸附柱重新放回收集管中。

(20)最大转速空离2～3min，使吸附柱干燥。需要说明的是，空离完后在超净台中开盖晾干2min。该步骤需要去除残余乙醇，乙醇残留可能会影响下游酶的使用。

(21)将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，将50～100μL DNA ElutionBuffer垂直悬空加至吸附柱中央，65℃水浴3min。最大转速离心1min后洗提回收DNA。需要说明的是，先加50μL Elution Buffer水浴离心完后换个1.5mL离心管，再加30μL Elution Buffer，水浴离心，将两次得到的DNA溶液合并后再分装，一个30μL、一个50μL，前者放4℃常用，后者-20℃低温储存。

(22)收集DNA并存放在2-8℃冰箱中待用。

S130、测定中DNA含量及完整性。

例如，步骤S130包括如下步骤：

S131、测定DNA含量，例如，采用荧光分析法测定DNA的含量。

具体地，步骤S131包括如下步骤：

配制DNA染料工作液；

例如，DNA染料为Quant-iT^TM reagent，通过用Quant-iT^TM buffer将其稀释200倍得到Quant-iT^TM Working Solution。

制备标准品溶液，并制作标准曲线；

例如，分别取Quant-iT^TM standard1(100ng/μL)和Quant-iT^TM standard2(100ng/μL)0～10μL混合后，其中Quant-iT^TM standard1和Quant-iT^TM standard2的总体积为10μL，再与190μL Quant-iT^TM Working Solution混合后，按照Fluorometer已设定好的程序进行标准曲线的制作。

将DNA待测液与DNA染料工作液混合，室温静置2分钟后，进行荧光检测；

分别取2～20μL的DNA待测液与180～198μL的Quant-iT^TM Working Solution混合后，其中，DNA待测液与Quant-iT^TM Working Solution总体积为200μL，室温静置2分钟，使DNA与染料充分结合，然后置于Fluorometer中进行荧光检测。

根据标准曲线，计算得出DNA待测液的DNA含量。

S132、测定DNA完整性，例如，采用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA的完整性。又如，测定DNA待测液的完整性包括如下步骤。

具体地，将DNA待测液在冰上融化后，充分混匀后离心，取3μL DNA样品与加样缓冲液混合后加入孔板，其中孔板中的一孔加入2μL DNA marker，选用0.6％的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳45分钟，电泳至溴酚蓝在凝胶中迁移出适当距离，切断电流，取出凝胶，在紫外灯下检查并扫描图像。

S140、采用多重PCR技术，扩增出T细胞受体β链的CDR3区。

例如，采用多重PCR技术，扩增出T细胞受体β链的CDR3区，包括构建DNA文库，其具体包括：

例如，取DNA含量为500ng的所述DNA待测液，加入预设计的V区家族引物和J区家族引物后用QIAGEN multiplex PCR Kit进行多重PCR，进行30循环(cycles)。

具体地，所述V区引物包括TRBV2、TRBV3-1、TRBV4-1/2/3、TRBV5-1、TRBV5-4/5/6/8、TRBV6-4.1、TRBV6-8/5/1.2、TRBV6-9/7/1.1/6、TRBV6-4.2、TRRBV6-2/3、TRBV7-2/4/6/7/8、TRBV7-3、TRBV7-9、TRBV9、TRBV10-1、TRBV10-2/3、TRBV11-1/2/3、TRBV12-3.2/5.2、TRBV12-3.1/4/5.1、TRBV13、TRBV14、TRBV15、TRBV16、TRBV18、TRBV19、TRBV20-1、TRBV24-1、TRBV25-1、TRBV27-1、TRBV28、TRBV29-1及TRBV30-F5。所述J区引物包括TRBJ1.1、TRBJ1.2、TRBJ1.3、TRBJ1.4、TRBJ1.5、TRBJ1.6、TRBJ2.1、TRBJ2.2、TRBJ2.3、TRBJ2.4、TRBJ2.5、TRBJ2.6及TRBJ2.7。具体地，本实施例中采用的V区引物及J区引物见表1。

表1：V区及J区引物

电泳检测回收多重PCR产物；

例如，电泳检测回收100～190bp的多重PCR产物，并使用QIAquick GelExtraction kit进行回收。

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

例如，在20℃条件下，加入10×End Repair buffer及End Repair Mix，进行末端修复反应，并使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化。

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

例如，利用NEBNext dA-tailing module在已补平末端的DNA片段3’端加入腺嘌呤(A)。又如，在37℃的条件下，加入NEBNext dA-tailing buffer及NEBNext dA-tailing enzyme，反应30分钟。

在接头连接反应体系中进行接头连接；

例如，用Adapter oligo mix和DNA ligase配制接头连接反应体系进行接头连接。

在本实施例中，将接头连接后的产物PCR扩增后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，使用QIAquick Gel Extraction kit进行胶纯化回收，溶于洗脱缓冲液中。

在本发明一实施例中，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

例如，检测所述基因文库包括检测所述基因文库的插入片段范围及定量测定所述基因文库的浓度。又如，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA 1000Reagents)检测文库的插入片段范围，又如，使用ABI StepOnePlus Real-Time PCRSystem(TaqMan Probe)对文库进行浓度的定量。

S150、对所述T细胞受体(TCR)β链的CDR3区进行高通量测序，对所述实验组及对照组中T细胞受体β链进行DNA分析。

对所述实验组及对照组中T细胞受体β链进行DNA分析，包括以下步骤：分析所述实验组及对照组中T细胞受体β链的各个基因家族的表达频率、V-J配对、碱基插入、缺失情况、以及CDR3区多样性与长度分布特征，筛选出所述实验组及对照组中高度克隆性扩增的DNA序列、氨基酸序列和V-J组合，及所述实验组与所述对照组中共有的DNA序列、氨基酸序列和V-J组合，并根据独特克隆数、辛普森指数和香农威纳系数分析所述实验组及对照组的T细胞受体多样性差异和克隆表达差异。

例如，按照预期上机数据量，在检测合格的基因文库加入0.5mmol/L的NaOH溶液，变性30分钟，使双链DNA片段变性形成单链DNA。并将变性后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头进行杂交，然后在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂完成桥式PCR扩增。最后将制备好的FlowCell采用HiSeq 2000测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。

例如，测序后还包括：对测序数据进行质控和预处理、对所述测序数据进行比对分析、对序列结构进行分析、构建免疫组库、免疫组库差异性分析及统计学分析。

例如，对所述测序数据进行质控和预处理具体包括：在所述测序数据的序列结构进行分析数据下机后，首先对原始数据做过滤处理，过滤的过程中，首先过滤掉含有接头的序列；将平局质量低于15(Illumina 0-41质量体系)的reads去掉；对于未知碱基(N碱基)，要求碱基数不能多于5％；针对序列尾部质量较差的序列，截取低质量部分(质量小于10的碱基)，保证截取后的序列平均质量高于15，同时，截取后剩余序列的长度要求大于60。根据以上过滤条件，获得过滤后的cleandata。过滤完成后，将Pair-end(PE)数据的两条序列拼接成一条完整的contig(片段重叠群)，在读长是100的情况下，拼接过程分为两步：1、将两条序列的尾部比对，寻找匹配序列，这样的拼接需要最小10个碱基的重叠，重叠区域碱基的匹配率要大于90％；2、鉴于免疫组库捕获区域的长短不同，在某些情况下会存在端序列被测通的情况，在第1部分尾部拼接剩下的序列中，尝试用头部将其继续拼接。最终得到的合并后的序列及合并的序列contig的长度分布图。

例如，利用高通量测序方法(Illumina2000基因组分析仪)，对实验组术前1天组、术后1天组、术后7天组和对照组共40标本的外周血T淋巴细胞TCRβ链CDR3区域进行测序。正常对照组中平均每个样本获得18772948.4条总读长(Total Reads)(大小范围为11705732条～23823568条)，术前1天组中平均每个样本获得20113287.5条总读长(大小范围为15354871条～26224954条)，术后1天组中平均每个样本获得23172759.2条总读长(大小范围为15911180条～34879146条)，术后7天组中平均每个样本获得18742521.1条总读长(大小范围为14365756条～23289408条)。然后对这些原始数据做过滤处理(过滤掉含有接头、平均质量低于15以及未知碱基(N碱基)多于5％的读长Reads)，得到的结果：对照组的平均过滤率为4.63％(滤掉范围从2.27％～7.58％)，术前1天组的平均过滤率为5.33％(滤掉范围从3.51％～6.78％)，术后1天组的平均过滤率为6.07％(滤掉范围从3.34％～9.04％)，术后7天组的平均过滤率为5.98％(滤掉范围从3.19％～7.30％)。过滤完成后，将Pair-end(PE)数据的两条序列拼接成一条完整的contig，最终得到合并后的完整优质序列。对照组中平均有10674277.8条优质序列(Total good sequences)(大小范围为2452132条～17046763条)，术前1天组中平均有12205989.7条优质序列(大小范围为3795908条～18798538条)，术后1天组中平均有10216958.4条优质序列(大小范围为230331条～20378545条)，术后7天组中平均有10382456.9条优质序列(大小范围为4635813条～15764819条)。而对照组的平均克隆(Clones)数为87125个(大小范围从65236个～120744个)，术前1天组的平均克隆(Clones)数为57125.7个(范围从15907个～148401个)，术后1天组的平均克隆(Clones)数为41966.5个(范围从5929个～127489个)，术后7天组的平均克隆(Clones)数为54634.6个(范围从21018个～142448个)。

例如，对所述测序数据进行比对分析具体包括：使用milaboratory开发的miTCR对T细胞受体进行自动校正，校正由PCR、测序等原因带来的序列错误。比对完成后，自动统计CDR3克隆的表达及插入缺失情况。

例如，对所述测序数据的序列结构进行分析具体包括：根据比对分析得到的结果，得到比对得到V基因序列的最后位点，D基因的起始位点，D基因的终止位点及J基因的起始位点，通过位点信息找到V-D-J插入缺失的碱基并统计其长度分布。根据比对找到的CDR3区域，并统计CDR3序列的长度分布。

又如，对10个慢性肾小球肾炎导致肾功能衰竭(尿毒症期)接受同种异体心死亡供体(donation after cardiac death，DCD)肾移植手术的受者围手术期三个时间点(术前1天、术后1天及术后7天)和10个正常健康者外周血T细胞的TCRβ链的CDR3、VD Indel以及DJ Indel长度分布进行统计并求平均值，发现在术前1天组、术后1天组、术后7天组和对照组中，TCRβ链CDR3、VDIndel和DJ Indel长度的分布频率相似。TCRβ链CDR3的长度分布在16nt～106nt之间，其中分布频率最大的5个CDR3长度为42，45，39，36和48nt；VD Indel长度分布在-1～71nt，其中分布频率最大的5个VD Indel长度为0，2，3，1，及4nt；DJ Indel长度分布在-1～73nt，其中分布频率最大的5个DJ Indel长度为4，0，3，1，及2nt。实验组各组外周血T淋巴细胞中的TCRβ链CDR3、VD Indel和DJ Indel长度分布频率和对照组中的分布频率相似，也无显著性差异(p＞0.05)。

例如，对所述测序结果进行分析还包括：

1、免疫组库的构建，其具体包括：根据比对分析得到的结果，统计每一个克隆的表达情况，分别统计DNA序列，氨基酸序列，V-J组合三种不同分辨率情况下得到的各个样本的表达情况。例如，为了衡量样品的多样性，分别统计和计算各个样本的distinct clone数，辛普森系数及香农威纳系数，三个系数分别针对DNA、氨基酸、V-J组合三种不同的分辨率。对于每一个样本中每个克隆的表达情况，按照DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的表达。筛选出各细胞亚群的高度克隆性扩增(频率大于0.5％)的DNA序列，氨基酸序列，V-J组合。在T细胞发育过程中，TCR的V、D、J基因片段发生重排，结果在V-J片段间或在V-D-J片段间可随机插入不同数量的核苷酸，形成具有高度多样性的可变区CDR3，其在长度和氨基酸序列上存在较大差异，即CDR3序列决定了一个独特的TCR克隆型，通过免疫组库的建立，统计每一个克隆的表达情况，为后续的分析提供数据支持。

2、免疫组库的差异分析，其主要包括：样本多样性差异和克隆表达差异两部分。其中，样本多样性差异旨在找出样品间整体克隆表达模式的差别，表达差异则旨在找出差异显著的克隆。样本多样性差异首先针对的是每个样本计算出的多样性系数，即Distinct(uniq)clone数，辛普森和香农威纳系数。根据不同组间样本属性，针对的是DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种分辨率，统计计算差异显著性。进一步地，在DNA序列、氨基酸序列和V-J组合三个层面进行分析，使用泊松分布等相应的检验方案计算出每一个差异对的P值，同时使用FDR和bonferroni对P值做校正。

例如，将克隆扩增程度划分为≥0.5％，0.05～0.5％，0.005～0.05％，0.0005～0.005％和<0.0005％五个等级，定义克隆频率大于0.5％的Clones为高度扩增性克隆(highly expanded clones，HEC)，并从DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的克隆扩增程度。每一个Clone的克隆性扩增程度的计算方法是：该Clone在测试样本中出现的次数/该样本的总Totalgood sequences数。在DNA序列中，发现实验组术前1天组(PRE-1)、术后1天组(POST-1)、术后7天组(POST-7)和对照组(NC)的高度扩增性克隆数(highly expanded clones，HECs)分别为326个、1321个、229个和333个；对应的在氨基酸序列中，术前1天组，术后1天组，术后7天组和对照组的高度扩增性克隆数分别为326个、1321个、229个和333个；在V-J组合中，术前1天组，术后1天组，术后7天组和对照组的高度扩增性克隆数分别1996个、1804个、2203个和2053个。在所有Clones中，高度扩增性克隆(HECs)所占的比例很小。以DNA序列为例，术前1天组中仅占8.72×10^-2±6.37×10^-2％的Clones为高度扩增性克隆HECs，术后1天组的高度扩增性克隆HECs为1.14±1.37％，术后7天组的高度扩增性克隆HECs为6.36×10^-2±4.92×10^-2％，而对照组中约占4.18×10^-2±2.33×10^-2％的Clones其克隆频率大于0.1％。术前一天组高度扩增性克隆HECs跟正常健康对照组相比，p＝0.05716，无明显差异；术后1天组高度扩增性克隆HECs跟术前一天组相比，p＝0.038，有显著性差异；术后1天组高度扩增性克隆HECs跟术后7天组相比，p＝0.035，有显著性差异；术后1天组高度扩增性克隆HECs跟正常健康对照组相比，p＝0.032，具有显著性差异；表明术后1天组中高度扩增性克隆数明显多于其他组。从整体克隆性扩增程度来看，术后1天组中克隆频率分布在≥0.1％，0.01～0.1％和0.001～0.01％区间的Clones数量都明显多于对照组；而对于分布在低扩增性克隆区间(0.0001～0.001％和<0.0001％)的Clones，其在术后1天组的数量明显少于对照组，该结果表明术后1天组中的Clones的扩增性程度明显高于正常对照组。

为了进一步定量术前1天组，术后1天组，术后7天组和对照组的TCRβ链CDR3多态性，进一步使用辛普森指数倒数(1/Ds)统计每一个Clone的频率。这个指数的变化范围从1到∞，该值越大表明所分析的样本中所有Clones的扩增性程度越相近，同时多态性越高。例如，从DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种分辨率分析术前1天组、术后1天组、术后7天组和对照组的TCRβ链CDR3多态性，三种分辨率显示对照组：DNA水平：1/Ds＝1.029；氨基酸和V-J组合水平：1.039；术后1天组的TCRβ链CDR3多态性：DNA水平：1/Ds≈1.011；氨基酸和V-J组合水平：1.018；术前一天组的TCRβ链CDR3多态性：DNA水平：1/Ds≈1.011；氨基酸和V-J组合水平：1.018；术后7天组的TCRβ链CDR3多态性(DNA水平：1/Ds≈1.002；氨基酸和V-J组合水平：1.012)，以上对比表明：与对照组比较，术前1天组及术后1天组的多态性相对抑制，在术后1天组及术后7天组之间TCRβ链CDR3多态性呈抑制趋势。

进一步地，对实验组术前1天组(PRE-1)、术后1天组(POST-1)、术后7天组(POST-7)和对照组(NC)的T细胞免疫图谱进行测序，在术前1天组中获得了5.52×10⁵个核苷酸序列，对应于5.09×10⁵个氨基酸序列；在术后1天组中获得了4.05×10⁵个核苷酸序列，对应于3.76×10⁵个氨基酸序列；在术后7天组中获得了5.31×10⁵个核苷酸序列，对应于4.93×105个氨基酸序列；而在对照组中获得了8.50×10⁵个核苷酸序列，对应于7.77×10⁵个氨基酸序列(非冗余序列)。例如，将各组的所有个体的非冗余TCRβ序列视为一个整体，发现绝大部分的CDR3核苷酸序列(其中术前1天组96.92％，术后1天组96.77％，术后7天组97.45％和对照组97.75％)和氨基酸序列(其中术前1天组94.59％，术后1天组94.87％，术后7天组95.21％和对照组94.57％)只在独立个体中发现。而有些序列却被多个个体共有，在术前1天组中，29个DNA序列和199个氨基酸序列被60％以上(n≥6)的个体所共有；在术后1天组中，38个DNA序列和84个氨基酸序列被60％以上(n≥6)的个体所共有；在术后7天组中，31个DNA序列和176个氨基酸序列被60％以上(n≥6)的个体所共有。而对照组中，91个DNA序列和721个氨基酸序列被60％以上(n≥6)的个体所共有。其中，4个氨基酸序列存在于术前1天组中的所有标本；4个核苷酸序列和9个氨基酸序列存在于术后7天组中的所有标本；15个核苷酸序列和30个氨基酸序列存在于对照组的所有标本。

表2各组中所有受试者共有的DNA和AA序列

例如，对所述实验组及对照组中T细胞受体β链进行DNA分析之后，还包括步骤：得到所述实验组及对照组的T细胞抗原受体β链CDR3的图谱模型得到围手术期肾脏受体者的图谱模型，例如，所述图谱模型包括：术前1天组中4个氨基酸序列，分别为CARVPRAV～NTGELFF、CAS～YF、CASSQGYEQYF、CSAR～TQYF；术后7天组中4个核苷酸序列和9个氨基酸序列，4个核苷酸序列分别为TGCGCCAGGGTCCCCAGGGCTGTGCGAACACCGGGGAGCTGTTTTTT、TGTGCTCTGGGGCCAACGTCCTGACTTTC、TGTGCTAACTATGGCTACACCTTC、TGCAGTGCTAGAGACCCAGTACTTC，9个氨基酸序列分别为：CASSLGGNTEAFF、CASSLSYEQYF、CARVPRAV～NTGE LFF、CASSLGETQYF、CANYGYTF、CALG～VLTF、CSAR～TQYF、CAS～FF、CAASRGC～AKNIQYF。

为了鉴定与围手术期肾移植受者免疫状态相关的TRβV和TRβJ亚类，进一步比较了受者术前1天组、术后1天组、术后7天组和对照组各组间TRβV和TRβJ亚类表达水平的差异。结果显示，在50个βV基因亚类中，术前1天组中的TRBV5-4(P＝0.049489)表达水平比对照组高；术后1天组中的TRBV7-6(P＝8.73*10^-4)，TRBV7-7(P＝0.044)表达水平比术前1天组低；术后7天组的TRBV16(P＝0.032)，TRBV5-8(P＝0.049)，TRBV6-6(P＝0.018)，TRBV7-6(P＝0.004)和TRBV7-7(P＝0.037)的表达水平跟术后1天组相比明显增高。在13个Jβ基因亚类中，术后1天组中的TRBJ1-4(P＝0.036)，TRBJ1-5(P＝0.013)，TRBJ2-4(P＝0.014)的表达水平比术前1天组低；术后7天组的TRBJ2-5(P＝0.032)，TRBJ2-6(P＝0.043)的表达水平跟术后1天组相比明显增高。

为了鉴定与围手术期肾移植受者免疫状态相关的TRβV和TRβJ亚类，进一步比较了受者术前1天组、术后1天组、术后7天组和正常对照组各组间TRβV和TRβJ亚类表达水平的差异。结果显示，在50个βV基因亚类中，术前1天组中的TRBV5-4(P＝0.049489)表达水平比对照组高；术后1天组中的TRBV7-6(P＝8.73*10^-4)，TRBV7-7(P＝0.044)表达水平比术前1天组低；术后7天组的TRBV16(P＝0.032)，TRBV5-8(P＝0.049)，TRBV6-6(P＝0.018)，TRBV7-6(P＝0.004)和TRBV7-7(P＝0.037)的表达水平跟术后1天组相比明显增高。在13个Jβ基因亚类中，术后1天组中的TRBJ1-4(P＝0.036)，TRBJ1-5(P＝0.013)，TRBJ2-4(P＝0.014)的表达水平比术前1天组低；术后7天组的TRBJ2-5(P＝0.032)，TRBJ2-6(P＝0.043)的表达水平跟术后1天组相比明显增高。

例如，所述围手术期肾脏受体者的图谱模型包括：6个TRβV和6个TRβJ亚类，所述6个TRβV亚类分别为TRBV5-4，TRBV7-6，TRBV7-7，TRBV16，TRBV5-8及TRBV6-6，所述5个TRβJ亚类分别为TRBJ1-4，TRBJ1-5，TRBJ2-4，TRBJ2-5及TRBJ2-6。

上述处理方法通过高通量测序为基础对围手术肾移植受者已经脱离人体的全血标本单个核细胞TCR的CDR3区域进行分析，发现围手术期肾脏受体的部分TRβV和TRβJ亚类的表达与正常人存在一定差异，且发现围手术期肾移植受者中存在特定的共有序列，这些共有序列是疾病的潜在生物标志物，对疾病诊断、病情判断及预后评估有重要价值。然而，本文的研究数据只是初步阶段，该图谱模型只能够作为后续分析诊断的参考依据，如何利用该图谱模型还有待于进一步的医学研究，需要更多的标本数以及更深入的研究才有可能作为更进一步的参考依据。

需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即外周血，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果，但是采用对所述实验组及对照组中T细胞受体β链进行DNA分析的结果或所述实验组及对照组的T细胞抗原受体β链CDR3的图谱模型，能够作为中间数据对围手术期肾移植受者的急性排斥反应作出进一步研究，以有利于移植受者和移植物的长期存活。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种T细胞抗原受体β链CDR3的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用多重PCR技术，扩增出T细胞受体β链的CDR3区；

2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，采用多重PCR技术之前，所述处理方法还包括测定DNA的含量以及检测DNA完整性的步骤。

3.根据权利要求2所述的处理方法，其特征在于，采用荧光分析法测定DNA的含量，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA完整性。

4.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，利用Illumina MiSeq平台对CDR3区进行高通量测序。

5.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，采用多重PCR技术，扩增出T细胞受体β链的CDR3区，包括构建DNA文库，其具体包括：

电泳检测回收多重PCR产物；

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

在接头连接反应体系中进行接头连接；

6.根据权利要求5所述的处理方法，其特征在于，所述V区引物包括TRBV2、TRBV3-1、TRBV4-1/2/3、TRBV5-1、TRBV5-4/5/6/8、TRBV6-4.1、TRBV6-8/5/1.2、TRBV6-9/7/1.1/6、TRBV6-4.2、TRRBV6-2/3、TRBV7-2/4/6/7/8、TRBV7-3、TRBV7-9、TRBV9、TRBV10-1、TRBV10-2/3、TRBV11-1/2/3、TRBV12-3.2/5.2、TRBV12-3.1/4/5.1、TRBV13、TRBV14、TRBV15、TRBV16、TRBV18、TRBV19、TRBV20-1、TRBV24-1、TRBV25-1、TRBV27-1、TRBV28、TRBV29-1及TRBV30-F5。

7.根据权利要求5所述的处理方法，其特征在于，所述J区引物包括TRBJ1.1、TRBJ1.2、TRBJ1.3、TRBJ1.4、TRBJ1.5、TRBJ1.6、TRBJ2.1、TRBJ2.2、TRBJ2.3、TRBJ2.4、TRBJ2.5、TRBJ2.6及TRBJ2.7。

8.根据权利要求5所述的处理方法，其特征在于，构建DNA文库后，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

9.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，分离各所述外周血标本的T细胞包括：分离出所述外周血标本的淋巴细胞及分离出所述淋巴细胞中的T细胞。

10.根据权利要求9所述的处理方法，其特征在于，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞。