CN107345241A

CN107345241A - B细胞抗原受体h链cdr3的处理方法

Info

Publication number: CN107345241A
Application number: CN201610317362.2A
Authority: CN
Inventors: 眭维国; 戴勇; 王磊; 薛雯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2017-11-14

Abstract

一种B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法，包括以下步骤：设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；分离各所述外周血标本的B细胞，并分别提取所述外周血标本B细胞中的DNA；采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区；对所述B细胞受体H链的CDR3区进行高通量测序，对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行DNA分析。上述B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法，设计合理可行，能够有效地获取作为中间结果的围手术期肾移植受者相关信息，对这些信息进一步进行验证分析和研究有助于研究排斥反应的发生机制并指导免疫抑制药物的个体化合理应用，而有助于提高终末期肾脏患者的治疗。

Description

B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法

技术领域

本发明涉及一种获取作为中间结果的终末期肾脏病信息，特别是涉及一种B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法。

背景技术

终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)，指各种慢性肾脏疾病的终末阶段，与尿毒症的概念类似，只是诊断标准有所差异。一般认为当小球滤过率降至15mL/(min.1.73m²)以下时即可诊断。也就是说当慢性肾脏病到了5期时就进入了终末期肾脏病阶段。ESRD患者往往伴有免疫功能极其低下，并发严重的感染是其生活质量低下、发生死亡的主要原因，所以了解慢性肾功能不全患者不同阶段的免疫状态对指导临床具有重要意义。在ESRD患者的早期可无明显不适，但随着肾功能的进行性下降，毒素在体内进一步蓄积，可引起尿毒症的各种症状，如恶心、呕吐、胃纳差、皮肤瘙痒、口氨臭味、水肿等，并可出现贫血等一系列并发症。肾脏疾病免疫发病机制认识逐步深入，在各种肾小球疾病的发展过程中，在多种损伤因子作用下，肾脏内炎症、单核或巨噬细胞浸润，各种趋化和粘附分子释放，细胞损伤、凋亡和增生，特别是足细胞的损伤，凋亡和转分化，引起大量蛋白尿，最后导致纤维化和肾小球硬化，是肾小球疾病发展、恶化、肾功能丧失的共同途径。

近年来许多研究表明，慢性肾功能不全患者尤其发展到晚期的尿毒症阶段，由于肾功能衰竭导致体内大量毒素的蓄积是引起机体的免疫抑制的重要原因。主要引起细胞免疫的缺陷，表现为辅助性/诱导性T细胞数量减低，抑制性/细胞毒性T细胞数量相对增高，其比值减低的一种免疫抑制状态，我们知道辅助性T细胞也参与调节B细胞的分化和增殖，所以也间接的影响了体液免疫(CDl9表达低下)，导致体液免疫缺陷，抗体产生障碍。细胞与体液免疫的缺陷都可以引起患者严重感染的发生。引起免疫抑制的原因可能由于：慢性肾功能不全患者体内脂质代谢是紊乱的，血清中抑制毒素如脂蛋白，特别是极低密度脂蛋白能改变淋巴细胞膜表面脂肪酸的结构，引起IL-2的生成减少，从而引起T细胞的增殖受到抑制，也影响了B细胞的生长和分化；而小分子的尿素氮、肌酐等亦可抑制淋巴细胞对植物血凝素的反应，使得T细胞的转化功能降低，这也是T细胞缺陷的一个重要原因。然而上述的研究并没有能完全阐明ESRD的免疫机制，治疗的手段仍没有根本变革。更为重要的是，由于ESRD是多因素的、遗传素质、性激素和环境因素等相互作用引起疾病，而且ESRD患者在体内毒素聚集后又会影响患者免疫状态。因此，从新的角度阐释ESRD的发病机制、对免疫系统影响以及寻找新的生物标志物及治疗靶点仍然是当前ESRD研究的主要目标和挑战之一。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种终末期肾脏病患者B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法。

一种B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法，包括以下步骤：

设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；

分离各所述外周血标本的B细胞，并分别提取所述外周血标本B细胞中的DNA；

采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区；

对所述B细胞受体H链的CDR3区进行高通量测序，并对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行数据分析。

在其中一个实施例中，采用多重PCR技术之前，所述处理方法还包括测定DNA的含量以及检测DNA完整性的步骤。

在其中一个实施例中，采用荧光分析法测定DNA的含量。

在其中一个实施例中，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA完整性。

在其中一个实施例中，利用Illumina MiSeq平台对CDR3区进行高通量测序。

在其中一个实施例中，采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区，包括构建DNA文库，其具体包括：

计算所述实验组及对照组中DNA的取用量，称取，并加入V区引物及J区引物多重PCR；

电泳检测回收多重PCR产物；

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

在接头连接反应体系中进行接头连接；

通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，纯化回收，得到DNA文库。

在其中一个实施例中，构建DNA文库后，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

在其中一个实施例中，对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行数据分析包括：对测序数据进行质控和预处理、对数据进行比对分析、对序列结构进行分析、构建免疫组库及对免疫组库进行差异分析。

在其中一个实施例中，分离各所述外周血标本的B细胞包括：分离出所述外周血标本的淋巴细胞及分离出所述淋巴细胞中的B细胞。

在其中一个实施例中，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞。

上述处理方法通过高通量测序为基础对终末期肾脏病患者已经脱离人体的全血标本单个核细胞BCR的CDR3区域进行分析，有助于阐明ESRD的发病机制，加深对这种疾病病因的理解，进而为ESRD疾病预防、诊断和治疗提供新的契机。

附图说明

图1为本发明一实施例中B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

请参阅图1，本发明的一个实施例是，一种B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法，其包括如下步骤。

S110、设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本。

例如，本发明各实施例采用的外周血标本，分别来自于在桂林解放军第181医院器官移植中心住院的ESRD患者和同一时间段体检的健康者6例。所有患者均符合美国肾脏病基金会K/DOQI专家组对ESRD患者诊断标准。ESRD患者诊断标准：1.肾小球滤过率(GFR)《15mL/min并大多数患者伴有尿毒症症状2.需要开始肾脏替代治疗(透析或肾移植)。

其中ESRD患者10例，女性3例，男性7例，年龄25～63岁，平均年龄35.64±11.27岁，病程0.2～8年。健康对照组6例，其中女性3例，男性3例，年龄为24～47岁，平均年龄33.47±9.61岁，为南方医科大学附属桂林解放军第181医院同一时间段体检的健康者，无重大疾病史，无免疫方面的相关疾病、近期感染及肾脏方面疾病，本人或直系亲属无ESRD病史。

例如，在室温条件下，获取脱离人体的外周静脉血5mL置于5mL EDTA抗凝真空采血管，盖上盖子后，将EDTA抗凝真空采血管轻轻颠倒混匀数次后，放入-80℃超低温冰箱保存备用，每个标本在收集后当天分离出B细胞。

S120、分离各所述外周血标本的B细胞，并分别提取所述外周血标本B细胞中的DNA。

例如，分离各所述外周血标本的B细胞包括：分离出所述外周血标本的淋巴细胞及分离出所述淋巴细胞中的B细胞。又如，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞。

又如，步骤S120包括如下步骤：

S121、分离出所述外周血标本的淋巴细胞。

具体地，步骤S122包括如下步骤：

(1)在离心管中按1：1比例加入适量淋巴细胞分离液，即淋巴细胞分离液与外周血的体积比为1：1。

(2)取肝素抗凝静脉血用滴管沿离心管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心800g×25分钟，即离心力rcf的值为800，离心时间为20min。

(3)离心后管内分为三层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

(4)用平头吸管吸出上、中层界面处絮状液体，转移至Eppendorf管；离心细胞液800g×15分钟，去液相，加入无菌PBS lmL洗涤，再用吸管吹匀细胞悬液；再次离心细胞液400g×15分钟，去液相。又如，离心细胞液400g×15分钟之后，静置1～5分钟，采用吸取法去液相。

(5)末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取20μL细胞悬液与20μL0.5％溴酚兰染液混合(1：1)，于血球计数板上计数。

S122、分离出淋巴细胞分离液中的B细胞。

S123、提取B细胞中的DNA。

具体地，步骤S123包括如下步骤：

(1)取5000μL B细胞样品放入10mL EDTA抗凝管中。

(2)加20mg/mL蛋白酶K20μL，室温放置15分钟，在此期间颠倒混匀几次，然后加入200μL结合液CB，立刻上下颠倒使其充分混匀，再在70℃水浴放置10分钟。

(3)加100μL异丙醇，混匀。

(4)将混合液加入吸附柱，然后将吸附柱放入收集管中，10000rpm离心30秒，弃废液。

(5)加500μL IR(抑制物去除液)，12000rpm离心30秒，弃废液。

(6)加700μL WB(漂洗液)，12000rpm离心30秒，弃废液。

(7)再加500μL WB，12000rpm离心30秒，弃废液。

(8)将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心2分钟，尽可能除去残留的漂洗液。

(9)将吸附柱放入另一离心管中，加100μL已预热的洗脱缓冲液EB，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。

(10)收集DNA并存放在2-8℃冰箱中待用。

S130、测定中DNA含量及完整性。

例如，步骤S130包括如下步骤：

S131、测定DNA含量，例如，采用荧光分析法测定DNA的含量。

具体地，步骤S131包括如下步骤：

配制DNA染料工作液；

例如，DNA染料为Quant-iT^TM reagent，通过用Quant-iT^TM buffer将其稀释200倍得到Quant-iT^TM Working Solution。

制备标准品溶液，并制作标准曲线；

例如，分别取Quant-iT^TM standard1(100ng/μL)和Quant-iT^TM standard2(100ng/μL)0～10μL混合后，其中Quant-iT^TM standard1和Quant-iT^TM standard2的总体积为10μL，再与190μL Quant-iT^TM Working Solution混合后，按照Fluorometer已设定好的程序进行标准曲线的制作。

将DNA待测液与DNA染料工作液混合，室温静置2分钟后，进行荧光检测；

分别取2～20μL的DNA待测液与180～198μL的Quant-iT^TM Working Solution混合后，其中，DNA待测液与Quant-iT^TM Working Solution总体积为200μL，室温静置2分钟，使DNA与染料充分结合，然后置于Fluorometer中进行荧光检测。

根据标准曲线，计算得出DNA待测液的DNA含量。

S132、测定DNA完整性，例如，采用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA的完整性。又如，测定DNA待测液的完整性包括如下步骤。

具体地，将DNA待测液在冰上融化后，充分混匀后离心，取3μL DNA样品与加样缓冲液混合后加入孔板，其中孔板中的一孔加入2μL DNA marker，选用0.6％的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳45分钟，电泳至溴酚蓝在凝胶中迁移出适当距离，切断电流，取出凝胶，在紫外灯下检查并扫描图像。

S140、采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区。

例如，采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区，包括构建DNA文库，其具体包括：

例如，取DNA含量为500ng的所述DNA待测液，加入设计好的V区家族引物和J区家族引物后用QIAGEN mμLtiplex PCR Kit进行多重PCR，进行30循环(cycles)。

电泳检测回收多重PCR产物；

例如，电泳检测回收100～190bp的多重PCR产物，并使用QIAquick GelExtraction kit进行回收。

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

例如，在20℃条件下，加入10×End Repair buffer及End Repair Mix，进行末端修复反应，并使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化，得到第二样本。

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

例如，利用NEBNext dA-tailing modμLe在已补平末端的DNA片段3’端加入腺嘌呤(A)。又如，在37℃的条件下，在第二样本中加入NEBNext dA-tailingbuffer及NEBNext dA-tailing enzyme，反应30分钟。

在接头连接反应体系中进行接头连接；

例如，用Adapter oligo mix和DNA ligase配制接头连接反应体系进行接头连接。

在本实施例中，将接头连接后的产物PCR扩增后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，使用QIAquick Gel Extraction kit进行胶纯化回收，溶于洗脱缓冲液中。

在本发明一实施例中，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

例如，检测所述基因文库包括检测所述基因文库的插入片段范围及定量测定所述基因文库的浓度。又如，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA 1000Reagents)检测文库的插入片段范围，又如，使用ABI StepOnePlus Real-Time PCRSystem(TaqMan Probe)对文库进行浓度的定量。

S150、对所述B细胞受体(BCR)H链的CDR3区进行高通量测序，对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行DNA分析。

对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行DNA分析，包括以下步骤：分析所述实验组及对照组中B细胞受体H链的各个基因家族的表达频率、V-J配对、碱基插入、缺失情况、以及CDR3区多样性与长度分布特征，筛选出所述实验组及对照组中高度克隆性扩增的DNA序列、氨基酸序列和V-J组合，及所述实验组与所述对照组中共有的DNA序列、氨基酸序列和V-J组合，并根据独特克隆数、辛普森指数和香农威纳系数分析所述实验组及对照组的B细胞受体多样性差异和克隆表达差异。

例如，按照预期上机数据量，在检测合格的基因文库加入0.5mmol/L的NaOH溶液，变性30分钟，使双链DNA片段变性形成单链DNA。并将变性后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头进行杂交，然后在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂完成桥式PCR扩增。最后将制备好的FlowCell采用Illumina MiSeq测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。

例如，测序后还包括：对测序数据进行质控和预处理、对所述测序数据进行比对分析、对序列结构进行分析、构建免疫组库、免疫组库差异性分析及统计学分析。

例如，对所述测序数据进行质控和预处理具体包括：在所述测序数据的序列结构进行分析数据下机后，首先对原始数据做过滤处理，过滤的过程中，首先过滤掉含有接头的序列；将平局质量低于15(Illumina 0-41质量体系)的reads去掉；对于未知碱基(N碱基)，要求碱基数不能多于5％；针对序列尾部质量较差的序列，截取低质量部分(质量小于10的碱基)，保证截取后的序列平均质量高于15，同时，截取后剩余序列的长度要求大于60。根据以上过滤条件，获得过滤后的cleandata。过滤完成后，将Pair-end(PE)数据的两条序列拼接成一条完整的contig(片段重叠群)，在读长是100的情况下，拼接过程分为两步：1、将两条序列的尾部比对，寻找匹配序列，这样的拼接需要最小10个碱基的重叠，重叠区域碱基的匹配率要大于90％；2、鉴于免疫组库捕获区域的长短不同，在某些情况下会存在端序列被测通的情况，在第1部分尾部拼接剩下的序列中，尝试用头部将其继续拼接。最终得到的合并后的序列及合并的序列contig的长度分布图。

例如，利用高通量测序方法(Illumina2000基因组分析仪)，对10个ESRD患者和6个正常人的外周血B淋巴细胞BCR H链CDR3区域进行测序。正常对照组中平均每个样本获得12243860.3条总比对数(Total Reads number)。ESRD患病组中平均每个样本获得14266181.6条总比对数。然后对这些原始数据做过滤处理(滤掉含有接头、平均质量低于15、N碱基(N表示无法确定碱基信息)多于10％的同时Reads)，将Pair-end(PE)数据的两条序列拼接成一条完整的contig，最终得到的合并后的序列。对照组中平均有10674277.8条优质序列，即，BCR H链CDR3序列(Total good sequences-Total BCR H CDR3sequences),ESRD患病组平均有11537754.7条优质序列。高克隆(Highly enpended clone)在本分析中的定义是某个CDR3序列的表达量超过了总的CDR3序列的0.1％。

例如，对所述测序数据进行比对分析具体包括：使用milaboratory开发的miTCR对B细胞受体进行自动校正，校正由PCR、测序等原因带来的序列错误。比对完成后，自动统计CDR3克隆的表达及插入缺失情况。

例如，对所述测序数据的序列结构进行分析具体包括：根据比对分析得到的结果，得到比对得到V基因序列的最后位点，D基因的起始位点，D基因的终止位点及J基因的起始位点，通过位点信息找到V-D-J插入缺失的碱基并统计其长度分布。根据比对找到的CDR3区域，并统计CDR3序列的长度分布。

例如，对所述测序结果进行分析还包括：

1、免疫组库的构建，其具体包括：根据比对分析得到的结果，统计每一个克隆的表达情况，分别统计DNA序列，氨基酸序列，V-J组合三种不同分辨率情况下得到的各个样本的表达情况。例如，为了衡量样品的多样性，分别统计和计算各个样本的distinct clone数，辛普森系数及香农威纳系数，三个系数分别针对DNA、氨基酸、V-J组合三种不同的分辨率。对于每一个样本中每个克隆的表达情况，按照DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的表达。筛选出各细胞亚群的高度克隆性扩增(频率大于0.5％)的DNA序列，氨基酸序列，V-J组合。在B细胞发育过程中，TCR的V、D、J基因片段发生重排，结果在V-J片段间或在V-D-J片段间可随机插入不同数量的核苷酸，形成具有高度多样性的可变区CDR3，其在长度和氨基酸序列上存在较大差异，即CDR3序列决定了一个独特的TCR克隆型，通过免疫组库的建立，统计每一个克隆的表达情况，为后续的分析提供数据支持。

2、免疫组库的差异分析，其主要包括：样本多样性差异和克隆表达差异两部分。其中，样本多样性差异旨在找出样品间整体克隆表达模式的差别，表达差异则旨在找出差异显著的克隆。样本多样性差异首先针对的是每个样本计算出的多样性系数，即Distinct(uniq)clone数，辛普森和香农威纳系数。根据不同组间样本属性，针对的是DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种分辨率，统计计算差异显著性。进一步地，在DNA序列、氨基酸序列和V-J组合三个层面进行分析，使用泊松分布等相应的检验方案计算出每一个差异对的P值，同时使用FDR和bonferroni对P值做校正。

例如，对BCR H链的V区基因使用频率分布，并对V基因使用频率做了T检验，其中，IGHV1-24在实验组的频率为1.098大于对照组0.76166，IGHV1-24是上调基因(P<0.05)。IGHV3-20在实验组的频率为0.41小于对照组0.685，IGHV3-20是下调的基因(P<0.05)。

又如，对BCR H链的D区基因使用频率分布，并对D基因使用频率做了T检验，其中，IGHD4/OR14-4a在实验组的使用频率为0.25小于对照组0.35，IGHD4/OR14-4a是下调基因(P<0.05)。IGHD4/OR14-4b在实验组的频率为0.208小于对照组0.293，IGHD4/OR14-4b是下调的基因(P<0.05)。

又如，对BCR H链的J区基因使用频率分布，并对J基因使用频率做了T检验，其中，IGHJ5在实验组的频率为11.42小于对照组13.13，IGHJ5是下调基因(P<0.05)。

进一步地，对BCR H链的V区基因和J区基因进行了组合分析，其中V-J组合(IGHV3-20，IGHJ5)在实验组的频率为0.021小于正常组0.083，V-J组合(IGHV3-20，IGHJ5)为下调基因(P<0.05)；V-J组合(IGHV3-64D，IGHJ3)在实验组的频率0小于对照组0.017，V-J组合(IGHV3-64D，IGHJ3)为下调基因(P<0.05)；V-J组合(IGHV3-20，IGHJ4)在实验组的频率为0.137小于对照组0.318，V-J组合(IGHV3-20，IGHJ4)为下调基因(P<0.05)；V-J组合(IGHV1-69，IGHJ1)在实验组的频率为0.042小于对照组0.11，V-J组合(IGHV1-69，IGHJ1)为下调基因(P<0.05)；V-J组合(IGHV3-9，IGHJ1)在实验组的频率为0.073大于对照组0.02，V-J组合(IGHV3-9，IGHJ1)为上调基因(P<0.05)；V-J组合(IGHV1-46，IGHJ3)在实验组的频率为0.216大于对照组0.143，V-J组合(IGHV1-46，IGHJ3)为上调基因(P<0.05)；V-J组合(IGHV3-48，IGHJ1)在实验组的频率为0.057大于对照组0.017，V-J组合(IGHV3-48，IGHJ1)为上调基因(P<0.05)；V-J组合(IGHV2-I，IGHJ3)在实验组的频率为0.054大于对照组0.03，V-J组合(IGHV2-I，IGHJ3)为上调基因(P<0.05)。

例如，对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行DNA分析之后，还包括步骤：得到所述实验组及对照组的B细胞抗原受体H链CDR3的图谱模型得到ESRD患者的图谱模型，例如，所述图谱模型包括：上调基因：IGHV1-24，V-J组合(IGHV3-9，IGHJ1)，V-J组合(IGHV1-46，IGHJ3)，V-J组合(IGHV3-48，IGHJ1)，V-J组合(IGHV2-I，IGHJ3)；下调基因：IGHV3-20，IGHD4/OR14-4a，IGHD4/OR14-4b，IGHJ5，V-J组合(IGHV3-20，IGHJ5)，V-J组合(IGHV3-49，IGHJ5)，V-J组合(IGHV3-64D，IGHJ3)，V-J组合(IGHV3-20，IGHJ4)，V-J组合(IGHV1-69，IGHJ1)。这些上调基因可能参与某些BCR特异性的B淋巴细胞克隆性增殖的现象，破坏BCR的多样性。而BCR的多样性对健康起着至关重要的作用，免疫蛋白的亚型越多，越能有效抵抗病原体，亚型越少越容易感染疾病。这些下调基因可能参与抑制某些BCR特异性的B淋巴细胞克隆性增殖,而使得某些B淋巴细胞亚型显著减少。

上述处理方法通过高通量测序为基础对终末期肾脏病患者已经脱离人体的全血标本单个核细胞BCR的CDR3区域进行分析，有助于阐明ESRD的发病机制，加深对这种疾病病因的理解，进而为ESRD疾病预防、诊断和治疗提供新的契机。然而，本文的研究数据只是初步阶段，该图谱模型只能够作为后续分析诊断的参考依据，如何利用该图谱模型还有待于进一步的医学研究，需要更多的标本数以及更深入的研究才有可能作为更进一步的参考依据。

上述B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法，设计合理可行，能够有效地获取作为中间结果的终末期肾脏患者的相关信息，这些信息可用于终末期肾脏患者免疫状态的后续分析，对这些信息进一步进行验证分析和研究有助于研究排斥反应的发生机制并指导免疫抑制药物的个体化合理应用，进而有助于提高终末期肾脏患者的治疗。

需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即外周血，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果，但是采用对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行DNA分析的结果或所述实验组及对照组的B细胞抗原受体H链CDR3的图谱模型，能够作为中间数据对ESRD疾病预防、诊断和治疗提供新的契机。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区；

2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，采用多重PCR技术之前，所述处理方法还包括测定DNA的含量以及检测DNA完整性的步骤。

3.根据权利要求2所述的处理方法，其特征在于，采用荧光分析法测定DNA的含量。

4.根据权利要求2所述的处理方法，其特征在于，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA完整性。

5.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，利用Illumina MiSeq平台对CDR3区进行高通量测序。

6.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区，包括构建DNA文库。

7.根据权利要求6所述的处理方法，其特征在于，构建DNA文库后，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

8.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行数据分析包括：对测序数据进行质控和预处理、对数据进行比对分析、对序列结构进行分析、构建免疫组库及对免疫组库进行差异分析。

9.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，分离各所述外周血标本的B细胞包括：分离出所述外周血标本的淋巴细胞及分离出所述淋巴细胞中的B细胞。

10.根据权利要求9所述的处理方法，其特征在于，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞。