WO2015075939A1 - Ｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトアの解析システムならびにその治療および診断への利用 - Google Patents

Ｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトアの解析システムならびにその治療および診断への利用 Download PDF

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隆二 鈴木
新井　理
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Definitions

  • the present invention relates to a technique for amplifying a gene generated from a biological sample by gene reconstruction without bias, a system for analyzing the obtained genetic information, and treatment and diagnosis thereof.
  • T cells and B cells do not react with their own cells or molecules, but can specifically recognize and attack foreign pathogens such as viruses and bacteria. Therefore, T cells and B cells have a mechanism capable of recognizing and distinguishing various antigens derived from other organisms together with self-antigens by receptor molecules expressed on the cell surface.
  • T cell receptor TCR
  • BCR receptor BCR
  • Intracellular signals are transmitted by stimulation from these antigen receptors, production of inflammatory cytokines and chemokines is enhanced, cell proliferation is enhanced, and various immune responses are initiated.
  • TCR recognizes a peptide (peptide-MHC complex, pMHC) bound to the peptide binding groove of a major histocompatibility complex (MHC) expressed on an antigen-presenting cell, and thereby recognizes self and non-self. It recognizes and recognizes an antigenic peptide (Non-patent Document 1).
  • TCR is a heterodimeric receptor molecule composed of two TCR polypeptide chains, and there are an ⁇ type TCR expressed by normal T cells and a ⁇ type TCR having a special function.
  • ⁇ and ⁇ chain TCR molecules form a complex with a plurality of CD3 molecules (CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain, CD3 ⁇ chain), transmit intracellular signals after antigen recognition, and initiate various immune responses.
  • Endogenous antigens such as viral antigens that have proliferated in cells with viral infection and cancer antigens derived from cancer cells are presented as antigenic peptides on MHC class I molecules.
  • an antigen derived from a foreign microorganism is taken up into an antigen-presenting cell by endocytosis, processed and then presented on an MHC class II molecule.
  • These antigens are recognized by TCRs expressed by CD8 + T cells or CD4 + T cells, respectively.
  • costimulatory molecules such as CD28, ICOS and OX40 molecules are important for stimulation via TCR molecules.
  • the TCR gene has a large number of V regions (variable regions, V), J regions (joining region, J), D regions (diversity region, D) and constant regions C regions (constant regions) encoded in different regions on the genome. , C). In the T cell differentiation process, these gene fragments are rearranged in various combinations.
  • the ⁇ -chain and ⁇ -chain TCR are VJ-C genes, and the ⁇ -chain and ⁇ -chain TCRs are VDJ-. A gene consisting of C is expressed.
  • TCR V gene fragments there are 43 functional ⁇ chain TCR V gene fragments (TRAV), 50 TCR J gene fragments (TRAJ), and functional ⁇ chain TCR V gene fragments (TRBV).
  • TRBD TCR D gene fragment
  • TRBJ TCR J gene fragment
  • TRGV functional ⁇ chain V gene fragment
  • TRGJ TCR J gene fragment
  • TRDV Three types of functional ⁇ chain V gene fragments (TRDV), three types of TCR D gene fragments (TRDD), and four types of TCR J gene fragments (TRDJ) are known (Non-patent Document 2). Reconstruction of these gene fragments creates diversity, and insertion or deletion of one or more bases between V and D or D and J gene fragments results in the formation of random amino acid sequences. More diverse TCR gene sequences have been created.
  • the region where the TCR molecule and the pMHC complex surface directly bind is composed of the complementarity determining region (CDR) CDR1, CDR2 and CDR3 regions rich in diversity within the V region.
  • CDR3 region includes a part of the V region, a VDJ region formed by a random sequence, and a part of the J region, and forms the most diverse antigen recognition site.
  • the other region is called FR (framework region) and plays a role of forming a structure that becomes a skeleton of the TCR molecule.
  • the ⁇ chain TCR is first reconstituted and associates with the pT ⁇ molecule to form a pre-TCR complex molecule.
  • the ⁇ chain TCR is then reconstituted to form an ⁇ TCR molecule and, if no functional ⁇ TCR is formed, reconstitution occurs in the other ⁇ chain TCR gene allele. It is known that a positive or negative selection in the thymus is performed, and a TCR having an appropriate affinity is selected to acquire antigen specificity (Non-patent Document 3).
  • BCR is known as immunoglobulin (Ig), and the membrane-bound type of Ig functions as an antigen receptor molecule as BCR, and its secreted protein is secreted extracellularly as an antibody.
  • Antibodies are secreted in large quantities from plasma cells (plasma cells) from which B cells have finally differentiated, and bind to pathogen molecules such as viruses and bacteria, and then eliminate pathogens by immune reactions such as complement-binding reactions.
  • plasma cells plasma cells
  • pathogen molecules such as viruses and bacteria
  • complement-binding reactions have a job.
  • BCR is expressed on the surface of B cells and, after binding to an antigen, transmits intracellular signals to initiate various immune responses and cell proliferation. The specificity of BCR is borne by the diversity of amino acid sequences at the antigen binding site.
  • variable region The sequence of the antigen binding site varies greatly between BCR molecules and is called the variable region (V region).
  • the sequence of the constant region (C region) is highly conserved between BCR molecules or antibody molecules, and has an antibody effector function and a receptor signal transduction function.
  • An Ig molecule consists of a polypeptide chain of two heavy chains (heavy chain, H chain) and two light chains (light chain, L chain). In one Ig molecule, two H chains, and one H chain and one L chain are linked by a disulfide bond.
  • Ig has five different H chain classes (isotypes) called ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain, which are called IgM, IgA, IgG, IgD, and IgE, respectively.
  • IgG type antibodies such as IgA type antibodies involved in mucosal immunity and IgE type antibodies important for allergy, asthma, and atopic dermatitis. It is known that the roles are different. Furthermore, it is known that there are several subclasses of isotypes such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. There are two types of L chain, ⁇ chain (IgL) and ⁇ chain (IgK), which can bind to any class of H chains, and it is considered that there is no functional difference (Non-Patent Document 4). ).
  • the BCR gene is formed by gene rearrangement that occurs in somatic cells, like the TCR gene.
  • the variable region is encoded by being divided into several gene fragments on the genome, and they undergo somatic gene recombination during the differentiation process of cells.
  • the gene sequence of the variable region of the H chain consists of a C region (constant region, C) that defines an isotype different from the V region, J region, and D region.
  • C constant region
  • each gene fragment exists in the genome, it is expressed as a series of VDJC genes by gene rearrangement.
  • IgM is first produced by immature B cells. Naive B cells not exposed to antigen co-express IgM and IgD, and after activation upon stimulation with the antigen, the variable region sequences remain as they are, and the C region of IgM C region and the C region sequence of IgG.
  • a class switch isotype switch that converts some C ⁇ occurs. Similarly, C ⁇ is converted to the C region (C ⁇ ) of IgA or the C region (C ⁇ ) of IgE to produce IgA and IgG. These class switch recombination will produce the type of antibody needed to eliminate the pathogen where needed.
  • Non-Patent Document 5 In the process of proliferation of B cells that have undergone class switching, mutations frequently occur in variable regions of IgG, IgA, or IgE regions (somatic hypermutation, somatic hypermutation). As a result, B cells that have acquired higher specificity for the antigen are further stimulated and proliferated, and antibody-producing B cells having higher specificity are selected through this process (affinity maturation, affinity maturation). (Non-Patent Document 5).
  • T cells or B cells produce one type of TCR or BCR with high specificity for a specific antigen. Since a large number of antigen-specific T cells and B cells are present in the living body, various TCR repertoires (repertoires) and BCR repertoires are formed, and can effectively function as a defense mechanism against various pathogens. Therefore, analysis of TCR and BCR repertoire, which are important indicators of immune cell specificity and diversity, is a useful analysis tool for analysis of monoclonality and immune abnormalities. If T cells or B cells proliferate in response to an antigen, it is observed that the ratio of specific TCR or BCR genes increases among various repertoires (increased clonality).
  • Non-patent Document 6 Attempts have been made to detect tumorigenicity of lymphoid cells expressing TCR or BCR as an increase in clonality by TCR or BCR repertoire analysis. Further, it has been reported that the frequency of use of a specific V ⁇ chain increases when exposed to a molecule that selectively stimulates a TCR having a specific V ⁇ chain such as a superantigen (Non-patent Document 7). . For the purpose of investigating antigen-specific immune responses, it is also frequently used for analysis of intractable autoimmune diseases caused by immune abnormalities such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Sjogren's syndrome, idiopathic thrombocytopenic purpura, etc. Sex has been shown.
  • the conventional TCR repertoire analysis is an analysis method for examining how much each T cell in a sample uses each V chain.
  • One is a method of analyzing the ratio of T cells expressing individual V ⁇ chains by flow cytometry using a specific V ⁇ chain specific antibody (FACS analysis).
  • FACS analysis a specific V ⁇ chain specific antibody
  • this method requires a relatively large number of cells, it is useful for analysis of peripheral blood containing a large amount of lymphocytes, but cannot be applied to a sample derived from tissue material.
  • no antibody corresponding to all V chains is available at present, a comprehensive analysis cannot be performed.
  • TCR repertoire analysis by molecular biological techniques has been devised based on TCR gene information obtained from human genome sequences.
  • RNA is extracted from a cell sample, complementary DNA is synthesized, and then the TCR gene is PCR amplified and quantified.
  • a method of designing many individual TCR V chain specific primers and individually quantifying them by a real-time PCR method or the like, or a method of simultaneously amplifying these specific primers (Multiple PCR) method has been used.
  • Multiple PCR multiple PCR
  • the multiple PCR method has a drawback that a difference in amplification efficiency between primers causes a bias during PCR amplification.
  • next-generation sequence analysis technology In recent years, it has become possible to determine the base sequence of large-scale genes by the next-generation sequence analysis technology that has advanced rapidly.
  • next-generation sequencing analysis technology By PCR amplification of TCR genes from human samples and using next-generation sequencing analysis technology, conventional TCR repertoire analysis, which obtains limited information such as V-chain usage frequency, more detailed gene information at the clone level
  • the next generation TCR repertoire analysis method that can be obtained and analyzed can be realized. Under such circumstances, several next-generation TCR repertoire analysis methods have been developed (Patent Documents 1 and 2), and other attempts have been made (Patent Documents 3 to 11).
  • the present invention includes (1) a technique for uniformly amplifying TCR or BCR gene sequences generated by gene rearrangement from gene fragments on a plurality of genomes without applying a bias (unbiased gene amplification technique), (2) A technique for analyzing the TCR repertoire and BCR repertoire by determining the base sequence of the TCR or BCR gene amplified by the non-biased gene amplification technique on a large scale by the next generation sequencing method and assigning the V, D, J, and C regions.
  • a technique for uniformly amplifying TCR or BCR gene sequences generated by gene rearrangement from gene fragments on a plurality of genomes without applying a bias (unbiased gene amplification technique) (2) A technique for analyzing the TCR repertoire and BCR repertoire by determining the base sequence of the TCR or BCR gene amplified by the non-biased gene amplification technique on a large scale by the next generation sequencing method and assigning the V, D, J, and C regions.
  • TCR and BCR create various gene sequences by gene rearrangement of gene fragments of multiple V, D, J, and C regions existing on the genome.
  • a large number of primers specific to the V region or J region are created in the same reaction solution or in separate reactions.
  • a technique for amplifying in liquid is widely used.
  • PCR amplification in which a few genes are amplified exponentially, a difference in amplification efficiency between primers becomes a fatal problem.
  • the primers set in the V region and the J region need to correspond to all known allele sequences.
  • BCR point mutations are introduced with high frequency (about 20%) into the variable region of IgG, IgA or IgE by the mechanism of somatic hypermutation. Therefore, if a 20-base primer is set, about 4 bases are mismatched and it is difficult to achieve uniform gene amplification by the conventional method. That is, in the existing method of designing a V chain specific primer based on the genome sequence, mismatch with the actual BCR gene sequence cannot be avoided, and quantitative gene amplification is not guaranteed. Furthermore, BCR has isotypes and subclasses defined by C region sequences. It is necessary to develop a quantification method for each isotype or subclass using the difference in nucleotide sequence between these isotypes or subclasses.
  • the inventors of the present invention used all the isotypes and a single set of primers consisting of one forward primer and one reverse primer.
  • a TCR or BCR gene containing a subtype gene was amplified without changing the presence frequency, and a method for determining a base sequence using a next-generation sequence on a large scale was completed.
  • a gene containing all V regions is amplified by adding an adapter sequence to its 5 ′ end without setting a primer in the highly diverse V region. .
  • This adapter has an arbitrary length and sequence on the base sequence, and about 20 base pairs is optimal, but sequences of 10 to 100 bases can be used.
  • the adapter added to the 3 'end is removed by a restriction enzyme and all TCR or BCR genes are amplified by amplifying with an adapter primer of the same sequence as the 20 base pair adapter and a reverse primer specific to the C region which is a common sequence. Amplify.
  • Complementary strand DNA is synthesized from the TCR or BCR gene messenger RNA by reverse transcriptase, and then double-stranded complementary DNA is synthesized. Double-stranded complementary DNAs containing V regions of different lengths are synthesized by reverse transcription reaction or double-stranded synthesis reaction, and an adapter consisting of 20 base pairs and 10 base pairs at the 5 ′ end of these genes is subjected to DNA ligase reaction. Add by.
  • a reverse primer can be set to amplify these genes.
  • the reverse primers set in the C region correspond to the sequences of C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , and C ⁇ for TCR, match the sequences of C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , and C ⁇ for BCR, and others.
  • a primer having a mismatch that does not prime is set in the C region sequence.
  • the reverse primer in the C region is optimally prepared taking into account the base sequence, base composition, DNA melting temperature (Tm), and the presence or absence of a self-complementary sequence so that amplification with the adapter primer is possible.
  • IgG subtype ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4) and IgA subtype ( ⁇ 1, ⁇ 2) can be amplified with the same primers, and the subtype can be determined by sequencing.
  • Alleles can be uniformly amplified by setting primers in the region excluding base sequences that differ between allele sequences in the C region sequence.
  • the length (number of bases) of the candidate primer sequence is not particularly limited with respect to a sequence in which none of the primers includes a sequence that differs between allele sequences, but is 10 to 100 bases, preferably 15 to 50 bases. The number is more preferably 20 to 30 bases. Accordingly, the present invention also provides the following. ⁇ In silico> In one aspect, the present invention relates to a technique for analyzing a TCR or BCR repertoire based on a group of expressed TCR or BCR gene sequences derived from a biological sample.
  • a sequence of nucleic acids of V (-D) -JC does not depend on the sequencer model. Classification is possible without being biased. Either the positive strand or the complementary strand can be input.
  • reference sequences that serve as the basis for classification
  • a method of setting a reference database for each of V, D, and J is also conceivable.
  • V the difference from the reference sequence is increased due to random mutation, and the region for D and J is short.
  • the possibility of oversight cannot be ignored in the homology search method.
  • a method of translating the entire nucleic acid sequence to be analyzed into an amino acid sequence and classifying it as a material can be considered, but it is particularly vulnerable to sequencing / deleting sequencing errors. The correspondence becomes unclear, making it difficult to use known information.
  • the reference database used in the present invention is prepared for each V, D, J (in addition to C in the case of BCR) gene region.
  • nucleic acid sequence data sets for each region and allele published by IMGT are used, but not limited thereto, any data set in which a unique ID is assigned to each sequence can be used.
  • the input sequence set used in the present invention is generally trimmed from an adapter sequence and a low quality region in advance, and only a sequence having a length sufficient for analysis is extracted to constitute a high quality set. This step is not necessary, but is used in the preferred embodiment. This is because the LQ sequence just becomes “classification impossible” even if it is as it is.
  • the input sequence set used in the present invention performs homology search with a reference database for each gene region, and records the closest reference allele and its alignment with the sequence.
  • an algorithm with high mismatch tolerance is used for the homology search.
  • general BLAST is used as a homology search program
  • settings such as a reduction in window size, a reduction in mismatch penalty, and a reduction in gap penalty are performed for each region.
  • the homology score, alignment length, kernel length (length of consecutively matched base sequences) and the number of matching bases are used as indices, and these are applied according to a predetermined priority order.
  • the CDR3 sequence is extracted with the CDR3 head on the reference V and the CDR3 end on the reference J as markers. By translating this into an amino acid sequence, it is used for classification of the D region.
  • the reference database for the D region is prepared, a combination of the homology search result and the amino acid sequence translation result is set as the classification result.
  • the present invention provides the following.
  • a method for analyzing a TCR or BCR repertoire comprising the following steps: (1) Providing a reference database for each gene region including at least one of V region, D region, J region and optionally C region: (2) Step of providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3) performing a homology search with the reference database for each gene region with respect to the input sequence set, and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele; (4) assigning a V region and a J region with respect to the input sequence set, and extracting a nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result; (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence, and classifying the D region using the amino acid sequence; (6) Based on the classification in (5), the TCR or BCR repertoire is calculated by calculating the appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region, and if necessary, the C region, or a combination thereof.
  • the gene region includes all of a V region, a D region, a J region, and, if necessary, a C region.
  • the reference database is a database in which a unique ID is assigned to each sequence.
  • the input array set is a non-biased array set.
  • the array set is trimmed.
  • ⁇ 6> The trimming deletes the low quality region from both ends of the lead; deletes the region matching the adapter sequence by 10 bp or more from both ends of the lead; and if the remaining length is 200 bp or more (TCR) or 300 bp or more (BCR) Item 6.
  • ⁇ 7> The method according to item ⁇ 6>, wherein the low quality is a QV value having a 7 bp moving average of less than 30.
  • ⁇ 8> The method according to any one of items ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the approximate sequence is the closest sequence.
  • the approximate sequence is as follows. 1. Number of matching bases 2.
  • step (5) if there is a D region reference database, the combination of the homology search result with the CDR3 nucleic acid sequence and the amino acid sequence translation result is used as the classification result, items ⁇ 1> to ⁇ 13>
  • ⁇ 15> The method according to any one of items ⁇ 1> to ⁇ 14>, wherein in step (5), when there is no D region reference database, classification is performed based only on the appearance frequency of the amino acid sequence. .
  • step (5) when there is no D region reference database, classification is performed based only on the appearance frequency of the amino acid sequence. .
  • ⁇ 16> The method according to any one of items ⁇ 1> to ⁇ 15>, wherein the appearance frequency is determined in gene name units and / or allyl units.
  • the step (4) includes a step of assigning a V region and a J region to the input sequence set, and extracting a CDR3 sequence with the CDR3 head on the reference V region and the CDR3 end on the reference J as markers.
  • the method according to any one of items ⁇ 1> to ⁇ 16>. ⁇ 18> Any of items ⁇ 1> to ⁇ 17>, wherein the step (5) includes a step of translating the CDR3 nucleic acid sequence into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence. 2. The method according to item 1.
  • a system for analyzing a TCR or BCR repertoire comprising: (1) Means for providing a reference database for each gene region including at least one of a V region, a D region, a J region, and if necessary, a C region: (2) Means for providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3) Means for performing homology search with the reference database for each gene region for the input sequence set and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele; (4) Means for assigning a V region and a J region for the input sequence set, and extracting a nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result; (5) means for translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence; (6) Means for deriving a TCR or a BCR repertoire by calculating an appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region, and if necessary, the C region
  • ⁇ 19A> The system according to item ⁇ 19>, including any one or more of the items ⁇ 1> to ⁇ 18>.
  • a recording medium storing a computer program that causes a computer to execute processing of a method of analyzing a TCR or BCR repertoire, the method including the following steps: (1) Providing a reference database for each gene region including at least one of V region, D region, J region and optionally C region: (2) Step of providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3) performing a homology search with the reference database for each gene region with respect to the input sequence set, and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele; (4) assigning a V region and a J region with respect to the input sequence set, and extracting a nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result; (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence, and classifying the D region using the amino acid sequence; (6) Deriving a T
  • the present invention provides (1) a technique (unbiased gene amplification technique) for uniformly amplifying a TCR or BCR gene sequence generated by gene rearrangement from gene fragments on a plurality of genomes without applying a bias. ), (2) TCR or BCR gene amplified by the non-biased gene amplification technique is determined on a large scale by next-generation sequencing, and V, D, J, and C regions are assigned to perform TCR repertoire and BCR It is a technique for analyzing repertoire.
  • a technique unbiased gene amplification technique for uniformly amplifying a TCR or BCR gene sequence generated by gene rearrangement from gene fragments on a plurality of genomes without applying a bias.
  • TCR or BCR gene amplified by the non-biased gene amplification technique is determined on a large scale by next-generation sequencing, and V, D, J, and C regions are assigned to perform TCR repertoire and BCR It is a technique for analyzing repertoire.
  • TCR and BCR create various gene sequences by gene rearrangement of gene fragments of multiple V, D, J, and C regions existing on the genome.
  • a large number of primers specific to the V region or J region are created in the same reaction solution or in separate reactions.
  • a technique for amplifying in liquid is widely used.
  • PCR amplification in which a few genes are amplified exponentially, a difference in amplification efficiency between primers becomes a fatal problem.
  • the primers set in the V region and the J region need to correspond to all known allele sequences.
  • BCR point mutations are introduced with high frequency (about 20%) into the variable region of IgG, IgA or IgE by the mechanism of somatic hypermutation. Therefore, if a 20-base primer is set, about 4 bases are mismatched and it is difficult to achieve uniform gene amplification by the conventional method. That is, in the existing method of designing a V chain specific primer based on the genome sequence, mismatch with the actual BCR gene sequence cannot be avoided, and quantitative gene amplification is not guaranteed. Furthermore, BCR has isotypes and subclasses defined by C region sequences. It is necessary to develop a quantification method for each isotype or subclass using the difference in nucleotide sequence between these isotypes or subclasses.
  • the inventors of the present invention used all the isotypes and a single set of primers consisting of one forward primer and one reverse primer.
  • a TCR or BCR gene containing a subtype gene was amplified without changing the presence frequency, and a method for determining a base sequence using a next-generation sequence on a large scale was completed.
  • a gene containing all V regions is amplified by adding an adapter sequence to its 5 ′ end without setting a primer in the highly diverse V region. .
  • This adapter has an arbitrary length and sequence on the base sequence, and about 20 base pairs is optimal, but sequences of 10 to 100 bases can be used.
  • the adapter added to the 3 'end is removed by a restriction enzyme and all TCR or BCR genes are amplified by amplifying with an adapter primer of the same sequence as the 20 base pair adapter and a reverse primer specific to the C region which is a common sequence. Amplify.
  • Complementary strand DNA is synthesized from the TCR or BCR gene messenger RNA by reverse transcriptase, and then double-stranded complementary DNA is synthesized. Double-stranded complementary DNAs containing V regions of different lengths are synthesized by reverse transcription reaction or double-stranded synthesis reaction, and an adapter consisting of 20 base pairs and 10 base pairs at the 5 ′ end of these genes is subjected to DNA ligase reaction. Add by.
  • a reverse primer can be set to amplify these genes.
  • the reverse primers set in the C region correspond to the sequences of C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , and C ⁇ for TCR, match the sequences of C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , and C ⁇ for BCR, and others.
  • a primer having a mismatch that does not prime is set in the C region sequence.
  • the reverse primer in the C region is optimally prepared taking into account the base sequence, base composition, DNA melting temperature (Tm), and the presence or absence of a self-complementary sequence so that amplification with the adapter primer is possible.
  • IgG subtype ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4) and IgA subtype ( ⁇ 1, ⁇ 2) can be amplified with the same primers, and the subtype can be determined by sequencing.
  • Alleles can be uniformly amplified by setting primers in the region excluding base sequences that differ between allele sequences in the C region sequence.
  • the length (number of bases) of the candidate primer sequence is not particularly limited with respect to a sequence in which none of the primers includes a sequence that differs between allele sequences, but is 10 to 100 bases, preferably 15 to 50 bases. The number is more preferably 20 to 30 bases. Accordingly, the present invention also provides the following.
  • ⁇ A1> A method for preparing a sample for quantitative analysis of a repertoire of a variable region of a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR) by gene sequence analysis using a database.
  • a step of synthesizing complementary DNA using an RNA sample derived from a target cell as a template (2) a step of synthesizing a double-stranded complementary DNA using the complementary DNA as a template; (3) adding a common adapter primer sequence to the double-stranded complementary DNA to synthesize an adapter-added double-stranded complementary DNA; (4) A first PCR amplification reaction is performed using the adapter-added double-stranded complementary DNA, the common adapter primer comprising the common adapter primer sequence, and the first TCR or BCR C region-specific primer.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR is It contains a sequence that is sufficiently specific for the target C region of the TCR or BCR, has no homology to other gene sequences, and contains a mismatched base between subtypes downstream when amplified.
  • a step of performing a second PCR amplification reaction using the PCR amplification product of (4), the common adapter primer, and a second TCR or BCR C region-specific primer The TCR or BCR C region-specific primer has a sequence perfectly matched to the TCR or BCR C region in a sequence downstream from the sequence of the first TCR or BCR C region-specific primer, but other genes
  • the PCR amplification product of (5), the additional common adapter primer containing the first additional adapter nucleic acid sequence in the nucleic acid sequence of the common adapter primer, the second additional adapter nucleic acid sequence and the molecular identification (MID Tag) sequence A third PCR amplification reaction using a third TCR or BCR C region-specific primer with an adapter to which is added to the C region specific sequence of the third TCR or BCR,
  • the first additional adapter nucleic acid sequence is a sequence suitable for binding to a DNA capture bead and emPCR reaction;
  • the second additional adapter nucleic acid sequence is a sequence suitable for an emPCR reaction;
  • the molecular identification (MID Tag) sequence is a sequence for imparting uniqueness so that an amplification product can be identified; Including the method.
  • the C region-specific primer contains a sequence perfectly matched to the target isotype C region selected from the group consisting of IgM, IgA, IgG, IgE and IgD, and other C If the region has no homology, and for IgA or IgG, it is a sequence that perfectly matches a subtype that is either IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, or either IgA1 or IgA2, or is a TCR
  • the C region specific primer perfectly matches the C region of the target chain selected from the group consisting of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain, and has no homology to other C regions.
  • the method according to item ⁇ A1> which is an array.
  • ⁇ A3> The method according to item 1 or ⁇ A2>, wherein the C region-specific primer selects a sequence portion that completely matches all C region allele sequences of the same isotype in the database.
  • the common adapter primer is designed so that homodimer and intramolecular hairpin structures are difficult to form and can form a double strand stably, and is not highly homologous to all TCR gene sequences in the database, and The method according to any one of items ⁇ A1> to ⁇ A3>, which is designed to have the same melting temperature (Tm) as that of the C region-specific primer.
  • Tm melting temperature
  • the common adapter primer is designed not to have a homodimer and an intramolecular hairpin structure, and is selected to have no homology to other genes including BCR or TCR.
  • Method. ⁇ A6> The method according to item ⁇ A5>, wherein the common adapter primer is P20EA (SEQ ID NO: 2) and / or P10EA (SEQ ID NO: 3).
  • the first, second and third TCR or BCR C region-specific primers are each independently for BCR repertoire analysis, and are IgM, IgG, IgA, IgD, or IgE.
  • the common adapter primer sequence has a base length suitable for amplification, is difficult to form a homodimer and an intramolecular hairpin structure, can be stably formed into a double strand, and has all TCR gene sequences in the database.
  • Each of the first, second and third TCR or BCR C region-specific primers is independently for TCR or BCR repertoire analysis, and each primer is one ⁇ chain (TRAC) Sequences that perfectly match two types of ⁇ chains (TRBC01 and TRBC02), two types of ⁇ chains (TRGC1 and TRGC2), and one type of ⁇ chain (TRDC1). Selected so as to include a mismatched base between subtypes downstream of the primer,
  • the common adapter primer sequence has a base length suitable for amplification, is difficult to form a homodimer and an intramolecular hairpin structure, can be stably formed into a double strand, and has all TCR gene sequences in the database. Item 6.
  • the method according to any one of items ⁇ A1> to ⁇ A7> which is designed so as not to have high homology and to have the same Tm as that of the C region-specific primer.
  • the C region specific primer of the third TCR or BCR is set to a region of about 150 bases from the C region 5 ′ end side, and the first TCR or BCR C region specific primer and the second TCR or BCR C region specific primer.
  • the first, second and third TCR or BCR C region-specific primers are each independently for quantitative analysis of BCR, Designed to have specific primers separately for the five isotype sequences, perfectly matched to the target sequence, and to ensure a mismatch of 5 bases or more for other isotypes, and similar IgG subtypes (IgG1 , IgG2, IgG3 and IgG4) or IgA subtypes (IgA1 and IgA2) are designed to perfectly match all subtypes so that they can be handled by one primer each, items ⁇ A1> to ⁇ A9 The method of any one of>.
  • the primer design parameters are set to base sequence length 18-22 bases, melting temperature 54-66 ° C.,% GC (% guanine / cytosine content) 40-65%, items ⁇ A1> to ⁇ A10 The method of any one of>.
  • the primer design parameters were set to base sequence length 18-22 bases, melting temperature 54-66 ° C,% GC (% guanine / cytosine content) 40-65%, self-annealing score 26, self-terminal annealing
  • the method according to any one of items ⁇ A1> to ⁇ A11>, which is set to a score of 10 and a secondary structure score of 28.
  • ⁇ A13> The following conditions 1.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR is 41 to 300 bases based on the first base of the first codon of the C region sequence generated by splicing, and the C region specific of the second TCR or BCR.
  • the primary primer is up to 21-300 bases based on the first base
  • the third TCR or BCR C region specific primer is within 150 bases based on the first base
  • subtype and / or allele mismatch The method according to any one of items ⁇ A1> to ⁇ A13>, which is set at a position including a part.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR has the following structures: CM1 (SEQ ID NO: 5), CA1 (SEQ ID NO: 8), CG1 (SEQ ID NO: 11), CD1 (SEQ ID NO: 14), CE1
  • CM1 SEQ ID NO: 5
  • CA1 SEQ ID NO: 8
  • CG1 SEQ ID NO: 11
  • CD1 SEQ ID NO: 14
  • CE1 CE1
  • the second TCR or BCR C region-specific primer has the following structure: CM2 (SEQ ID NO: 6), CA2 (SEQ ID NO: 9), CG2 (SEQ ID NO: 12), CD2 (SEQ ID NO: 15), CE2
  • CM2 SEQ ID NO: 6
  • CA2 SEQ ID NO: 9
  • CG2 SEQ ID NO: 12
  • CD2 SEQ ID NO: 15
  • CE2 CE2
  • the third TCR or BCR C region-specific primer has the following structure: CM3-GS (SEQ ID NO: 7), CA3-GS (SEQ ID NO: 10), CG3-GS (SEQ ID NO: 13), CD3- The method according to any one of items ⁇ A1> to ⁇ A16>, which has GS (SEQ ID NO: 16) or CE3-GS (SEQ ID NO: 19).
  • ⁇ A18> The TCR or BCR C region-specific primer according to any one of items ⁇ A1> to ⁇ A17>, which is provided in a set corresponding to all subclasses of TCR or BCR. Method.
  • ⁇ A19> A method for performing gene analysis using the sample produced by the method according to any one of items ⁇ A1> to ⁇ A18>.
  • ⁇ A20> The method according to item ⁇ A19>, wherein the gene analysis is a quantitative analysis of a repertoire of a variable region of a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR).
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • ⁇ Analysis system> A method of quantitatively analyzing a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using a ⁇ B1> database, the method comprising: (1) providing a nucleic acid sample comprising a nucleic acid sequence of a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR), amplified non-biased from the subject; (2) determining the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample; and (3) calculating the appearance frequency of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence, and deriving the TCR or BCR repertoire of the subject Including the method.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the nucleic acid sample includes a plurality of types of nucleic acid sequences of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR), and the item (2) is a method in which the nucleic acid sequence is determined by single sequencing.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the item (2) is a method in which the nucleic acid sequence is determined by single sequencing.
  • ⁇ B3> In the single sequencing, in the amplification from the nucleic acid sample to the sequencing sample, at least one of the sequences used as a primer has the same sequence as the nucleic acid sequence encoding the C region or its complementary strand.
  • ⁇ B4> The method according to item ⁇ B2> or ⁇ B3>, wherein the single sequencing is performed using a common adapter primer.
  • ⁇ B5> The method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B4>, wherein the non-biased amplification is not V-region specific amplification.
  • ⁇ B6> The method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B5>, wherein the repertoire is a repertoire of a BCR variable region, and the nucleic acid sequence is a BCR nucleic acid sequence.
  • ⁇ B7> A method for analyzing the disease, disorder or condition of the subject based on the TCR or BCR repertoire derived based on any one of items ⁇ B1> to ⁇ B6>.
  • ⁇ B8> The method according to item ⁇ B7>, wherein the subject's disease, disorder, or condition is selected from the group consisting of blood tumors and colorectal cancer.
  • a method for treating or preventing a disease, disorder or condition in the subject comprising selecting a means for proper treatment or prevention.
  • ⁇ B10> The method according to item ⁇ B9>, wherein the disease, disorder, or condition of the subject is selected from the group consisting of a blood tumor and a colorectal cancer.
  • a system for quantitatively analyzing a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using a ⁇ B11> database comprising: (1) A kit for providing a nucleic acid sample containing a nucleic acid sequence of a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR) amplified from the subject in a biased manner; (2) an apparatus for determining the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample; and (3) An apparatus for calculating the appearance frequency of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence and deriving the TCR or BCR repertoire of the subject
  • a system comprising: ⁇ B12>
  • the nucleic acid sample includes the nucleic acid sequences of a plurality of types of T cell receptors (TCR) or B cell receptors (BCR), and (2) is determined by single sequencing.
  • the system according to item ⁇ B11>. ⁇ B13> The item ⁇ B12> is characterized in that in the single sequencing, at least one of the sequences used as primers in the amplification from the nucleic acid sample to the sequencing sample has the same sequence as the C region.
  • System. ⁇ B14> The system according to item ⁇ B12> or ⁇ B13>, wherein the single sequencing is performed using a common adapter primer.
  • ⁇ B15> The system according to any one of items ⁇ B11> to ⁇ B14>, wherein the non-biased amplification is not V region specific amplification.
  • ⁇ B16> The system according to any one of items ⁇ B11> to ⁇ B15>, wherein the repertoire is a repertoire of a BCR variable region, and the nucleic acid sequence is a BCR nucleic acid sequence.
  • ⁇ B17> The system according to any one of items ⁇ B11> to ⁇ B16>, and means for analyzing the disease, disorder or condition of the subject based on the TCR or BCR repertoire derived based on the system; A system for analyzing a disease, disorder or condition of a subject.
  • ⁇ B18> The system according to item ⁇ B17>, wherein the subject's disease, disorder, or condition is selected from the group consisting of a blood tumor and a colorectal cancer.
  • ⁇ B19> Means for quantitatively associating the TCR or BCR repertoire with the disease, disorder or condition of the subject determined by the system according to item ⁇ B17> or ⁇ B18>, and the quantitative relationship,
  • a means for treating or preventing a disease, disorder or condition in said subject comprising means for selecting a means for proper treatment or prevention.
  • ⁇ B20> The system according to item ⁇ B19>, wherein the subject's disease, disorder, or condition is selected from the group consisting of blood tumors and colon cancer.
  • T-LGL Monoclonal T cells that express T cell large granular lymphocytic leukemia
  • TRAC ⁇ / TRAJ15 / CVVRATGTALIFG (SEQ ID NO: 1450) or a nucleic acid encoding the same in TCR ⁇ and / or TRBV29-1 / TRBJ2-7 / CSVERGGSLGEQYFG (SEQ ID NO: 1500) or a nucleic acid encoding the same in TCR ⁇ , Use as a diagnostic indicator of cellular large granular lymphocytic leukemia (T-LGL).
  • T-LGL T-cell large granular lymphocytic leukemia
  • TRAV10 / TRAJ15 / CVVRATGITALIFG (SEQ ID NO: 1450) in TCR ⁇ or a nucleic acid encoding the same, and / or TRBV29-1 / TRBJ2-7 / CSVERGGSLGEQYFG (SEQ ID NO: 1500) in TCR ⁇ or the nucleic acid encoding the same Detection agent.
  • T-LGL T-cell large granular lymphocytic leukemia
  • ⁇ B27> A peptide that is an indicator of mucosa-associated invariant T (MAIT) cells, comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1648 to 1651, 1653 to 1654, 1666 to 1667, 1844 to 1848, and 1851.
  • ⁇ B28> A nucleic acid encoding the peptide according to item ⁇ B27>.
  • ⁇ B29> Use of the peptide according to item ⁇ B27> or ⁇ B28> or a nucleic acid encoding the peptide as a diagnostic index for colorectal cancer.
  • ⁇ B30> A peptide that is an indicator of natural killer T cells (NKT), comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1668.
  • ⁇ B31> A nucleic acid encoding the peptide according to item ⁇ B30>.
  • ⁇ B32> Use of the peptide according to item ⁇ B30> or ⁇ B31> or a nucleic acid encoding the peptide as a diagnostic index for colorectal cancer.
  • ⁇ B33> A peptide that is specific for colon cancer, comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1652, 1655 to 1665, 1669 to 1843, 1849 to 1850, and 1852 to 1860.
  • ⁇ B34> A nucleic acid encoding the peptide according to item ⁇ B33>.
  • ⁇ B35> Use of the peptide according to item ⁇ B33> or ⁇ B34> or a nucleic acid encoding the peptide as a diagnostic index for colorectal cancer.
  • ⁇ B36> a peptide that is specific for colorectal cancer, comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1861 to 1865 and 1867 to 1909 ⁇ B37> A nucleic acid encoding the peptide according to item ⁇ B36>.
  • ⁇ B38> Use of the peptide according to item ⁇ B36> or ⁇ B37> or a nucleic acid encoding the peptide as a diagnostic index for colorectal cancer.
  • ⁇ B39> Cell population, T cell line, or recombination in which T cells having a peptide according to item ⁇ B33>, ⁇ B34>, ⁇ B36> or ⁇ B37> or a nucleic acid sequence encoding the peptide are induced at high frequency Expressed T cells.
  • ⁇ B40> A therapeutic agent for colorectal cancer comprising the cell population, T cell line or T cell according to item ⁇ B39>.
  • ⁇ B41> A method for treating or preventing colorectal cancer using the cell population, T cell line or T cell according to item ⁇ B39>.
  • ⁇ B42> Using the method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system according to any one of items ⁇ B11> to ⁇ B20> to detect the frequency of use of the V gene how to.
  • ⁇ B43> A method for detecting the frequency of use of the J gene using the method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system according to items ⁇ B11> to ⁇ B20>.
  • ⁇ B44> Using the method described in any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system described in items ⁇ B11> to ⁇ B20>, the frequency of subtype frequency analysis (BCR) is determined. How to detect.
  • ⁇ B45> A method of analyzing a CDR3 sequence length pattern using the method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system according to items ⁇ B11> to ⁇ B20>.
  • ⁇ B46> A method of analyzing the clonality of TCR or BCR using the method described in any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system described in items ⁇ B11> to ⁇ B20>.
  • ⁇ B47> A method for extracting duplicate leads using the method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system according to items ⁇ B11> to ⁇ B20>.
  • ⁇ B48> A method for searching for a disease-specific TCR or BCR clone using the method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system according to items ⁇ B11> to ⁇ B20>.
  • ⁇ B49> A method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10>, or a method of analyzing a target using a diversity index using the system according to items ⁇ B11> to ⁇ B20>.
  • ⁇ B50> Use the method described in any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system described in items ⁇ B11> to ⁇ B20> to support analysis of the target using the diversity index Method.
  • ⁇ B51> In item ⁇ B49> or ⁇ B50>, wherein the diversity index is used as an index for measuring the degree of recovery of the immune system after bone marrow transplantation, or as an index for detecting abnormality of immune system cells accompanying hematopoietic tumor The method described.
  • the diversity index is based on Shannon-Wiener diversity index (H ′), Simpson diversity index ( ⁇ , 1- ⁇ or 1 / ⁇ ), Pierou equality index (J ′), and Chao1 index.
  • ⁇ B54> Use the method described in any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10> or the system described in items ⁇ B11> to ⁇ B20> to support analysis of the target using the similarity index Method.
  • ⁇ B55> Item ⁇ B53> or ⁇ B54>, wherein the similarity index is used as an evaluation of repertoire similarity between HLA-type matches or mismatches, and evaluation of repertoire similarity between recipient and donor after bone marrow transplantation The method described in 1.
  • ⁇ B56> The method according to item ⁇ B53> or ⁇ B54>, wherein the similarity index is selected from the group consisting of a Morisita-Horn index, a Kimoto C ⁇ index, and a Pianka ⁇ index.
  • ⁇ B57> (1) is the following process (1-1) a step of synthesizing complementary DNA using an RNA sample derived from a target cell as a template; (1-2) synthesizing double-stranded complementary DNA using the complementary DNA as a template; (1-3) adding a common adapter primer sequence to the double-stranded complementary DNA to synthesize an adapter-added double-stranded complementary DNA; (1-4) The first PCR amplification reaction using the adapter-added double-stranded complementary DNA, the common adapter primer comprising the common adapter primer sequence, and the first TCR or BCR C region specific primer A process of performing The first TCR or BCR C region specific primer comprises a sequence that is sufficiently specific for the C region of interest of the TCR or BCR and has no homology to other gene sequences; and Designed to contain mismatched bases between subtypes downstream when amplified (1-5) A step of performing a second PCR amplification reaction using the PCR amplification product of (1-4), the common adapter primer, and a
  • the second TCR or BCR C region specific primer has a perfect match sequence to the TCR or BCR C region in a sequence downstream from the sequence of the first TCR or BCR C region specific primer.
  • are designed to contain sequences that are not homologous to other gene sequences and, when amplified, contain mismatched bases between subtypes downstream; and (1-6) PCR amplification product of (1-5), additional common adapter primer containing the first additional adapter nucleic acid sequence in the nucleic acid sequence of the common adapter primer, second additional adapter nucleic acid sequence and molecular identification ( MID Tag) is a step of performing a third PCR amplification reaction using a third TCR or BCR C region specific primer with an adapter to which a sequence is added to the third TCR or BCR C region specific sequence.
  • the third TCR or BCR C region-specific primer has a sequence perfectly matched to the TCR or BCR C region in a sequence downstream from the sequence of the second TCR or BCR C region specific primer.
  • the first additional adapter nucleic acid sequence is a sequence suitable for binding to a DNA capture bead and emPCR reaction;
  • the second additional adapter nucleic acid sequence is a sequence suitable for an emPCR reaction;
  • the molecular identification (MID Tag) sequence is a sequence for imparting uniqueness so that an amplification product can be identified; Including The method according to item ⁇ B1>.
  • the (1) kit is as follows: (1-1) Means for synthesizing complementary DNA using an RNA sample derived from a target cell as a template; (1-2) Means for synthesizing double-stranded complementary DNA using the complementary DNA as a template; (1-3) means for adding adapter-added double-stranded complementary DNA by adding a common adapter primer sequence to the double-stranded complementary DNA; (1-4) The first PCR amplification reaction using the adapter-added double-stranded complementary DNA, the common adapter primer comprising the common adapter primer sequence, and the first TCR or BCR C region specific primer Means for performing The first TCR or BCR C region specific primer comprises a sequence that is sufficiently specific for the C region of interest of the TCR or BCR and has no homology to other gene sequences; and Means designed to contain mismatched bases between subtypes downstream when amplified (1-5) Means for performing a second PCR amplification reaction using the PCR amplification product of (1-4), the common adapter primer,
  • the second TCR or BCR C region specific primer has a perfect match sequence to the TCR or BCR C region in a sequence downstream from the sequence of the first TCR or BCR C region specific primer.
  • Means that comprises a sequence that is not homologous to other gene sequences and is designed to contain mismatched bases between subtypes downstream when amplified; and (1-6) PCR amplification product of (1-5), additional common adapter primer containing the first additional adapter nucleic acid sequence in the nucleic acid sequence of the common adapter primer, second additional adapter nucleic acid sequence and molecular identification ( MID Tag) is a means for performing a third PCR amplification reaction using a third TCR or BCR C region-specific primer with an adapter in which a sequence is added to a third TCR or BCR C region specific sequence.
  • the third TCR or BCR C region-specific primer has a sequence perfectly matched to the TCR or BCR C region in a sequence downstream from the sequence of the second TCR or BCR C region specific primer.
  • the first additional adapter nucleic acid sequence is a sequence suitable for binding to a DNA capture bead and emPCR reaction;
  • the second additional adapter nucleic acid sequence is a sequence suitable for an emPCR reaction;
  • the molecular identification (MID Tag) sequence is a sequence for imparting uniqueness so that an amplification product can be identified; means; Including The system according to item ⁇ B11>.
  • the C region-specific primer contains a sequence perfectly matched to the target isotype C region selected from the group consisting of IgM, IgA, IgG, IgE and IgD, and others Is a sequence that perfectly matches a subtype of either IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, or either IgA1 or IgA2, or has no homology in the C region of In some cases, the C region specific primer perfectly matches the C region of the target chain selected from the group consisting of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain, and has homology to other C regions.
  • ⁇ B58-3> The method according to item ⁇ B57> or ⁇ B58-2>, wherein the C region-specific primer selects a sequence part that completely matches all C region allele sequences of the same isotype in the database Or the system according to ⁇ B58> or ⁇ B58-2>.
  • the common adapter primer is designed so that it is difficult to form a homodimer and an intramolecular hairpin structure and can form a double strand stably, and is not highly homologous to all TCR gene sequences in the database.
  • any one of items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58-3> which is designed to have the same melting temperature (Tm) as the C region-specific primer or The system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-3>.
  • Tm melting temperature
  • ⁇ B58-5> The common adapter primer is selected not to have a homodimer and an intramolecular hairpin structure, and is selected to have no homology to other genes including BCR or TCR, ⁇ B57> and The method according to any one of ⁇ B58-2> to ⁇ B58-4> or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-4>.
  • the common adapter primer is P20EA (SEQ ID NO: 2) and / or P10EA (SEQ ID NO: 3), any of items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58-5> Or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-5>.
  • the first, second and third TCR or BCR C region-specific primers are each independently for BCR repertoire analysis, and include IgM, IgG, IgA, IgD, Or a sequence that perfectly matches each isotype C region of IgE, and in the case of IgG and IgA, it is a sequence that also perfectly matches subtypes and has no homology to other sequences contained in the database, And selected such that a mismatched base is included between subtypes downstream of the primer,
  • the common adapter primer sequence has a base length suitable for amplification, is difficult to form a homodimer and an intramolecular hairpin structure, can be stably formed into a double strand, and has all TCR gene sequences in the database.
  • ⁇ B58-8> The first, second and third TCR or BCR C region-specific primers are each independently for TCR or BCR repertoire analysis.
  • Alpha chain (TRAC), two ⁇ chains (TRBC01 and TRBC02), two ⁇ chains (TRGC1 and TRGC2), one sequence of ⁇ chains (TRDC1), and a perfect match, included in the database Selected so as to include a mismatched base between subtypes downstream of the primer,
  • the common adapter primer sequence has a base length suitable for amplification, is difficult to form a homodimer and an intramolecular hairpin structure, can be stably formed into a double strand, and has all TCR gene sequences in the database.
  • the method according to any one of items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58-7>, which is designed not to have high homology and to have the same Tm as the C region-specific primer.
  • the C region-specific primer of the third TCR or BCR is set to a region of about 150 bases from the C region 5 ′ end, and the first TCR or BCR C region-specific primer and 2 TCR or BCR C region-specific primers are set between C region 5 ′ end and about 300 bases, and any of items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58-8> The method described in the above or the system described in ⁇ B58> to ⁇ B58-8>.
  • the C region-specific primers of the first, second and third TCR or BCR are each independently for quantitative analysis of BCR, Designed to have specific primers separately for the five isotype sequences, perfectly matched to the target sequence, and to ensure a mismatch of 5 bases or more for other isotypes, and similar IgG subtypes (IgG1 , IgG2, IgG3 and IgG4) or IgA subtypes (IgA1 and IgA2), respectively, designed to perfectly match all subtypes so that one primer can correspond, items ⁇ B57> and ⁇ B58 -2> to ⁇ B58-9> or the system according to any of ⁇ B58> to ⁇ B58-9>.
  • the primer design parameters are set to a base sequence length of 18-22 bases, a melting temperature of 54-66 ° C., and a% GC (% guanine / cytosine content) of 40-65%, items ⁇ B57> and The method according to any one of ⁇ B58-2> to ⁇ B58-10> or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-10>.
  • ⁇ B58-12> The primer design parameters were set to base sequence length 18-22 bases, melting temperature 54-66 ° C,% GC (% guanine / cytosine content) 40-65%, self-annealing score 26, self The method according to any one of items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58-11>, or any of ⁇ B58> to ⁇ B58-11> set in the terminal annealing score 10 and the secondary structure score 28 The system described in Crab. ⁇ B58-13> The following conditions 1. Incorporating a plurality of subtype sequences and / or allele sequences into a base sequence analysis software and aligning them; 2. Search for multiple primers that satisfy the parameter conditions in the C region using primer design software; 3.
  • the C region-specific primer of the first TCR or BCR is a C region of the second TCR or BCR up to 41-300 bases based on the first base of the first codon of the C region sequence generated by splicing. Region-specific primers are up to 21-300 bases based on the first base, C region-specific primers of the third TCR or BCR are within 150 bases based on the first base, and subtypes and / or alleles.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR has the following structure: CM1 (SEQ ID NO: 5), CA1 (SEQ ID NO: 8), CG1 (SEQ ID NO: 11), CD1 (SEQ ID NO: 14) , CE1 (SEQ ID NO: 17), CA1 (SEQ ID NO: 35), or CB1 (SEQ ID NO: 37), the method according to any of items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58-14> or ⁇ The system according to any one of B58> to ⁇ B58-14>.
  • the second TCR or BCR C region-specific primer has the following structure: CM2 (SEQ ID NO: 6), CA2 (SEQ ID NO: 9), CG2 (SEQ ID NO: 12), CD2 (SEQ ID NO: 15) , CE2 (SEQ ID NO: 18), CA2 (SEQ ID NO: 35), or CB2 (SEQ ID NO: 37), the method according to any of items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58-15> or ⁇ The system according to any one of B58> to ⁇ B58-15>.
  • the third TCR or BCR C region-specific primer has the following structure: CM3-GS (SEQ ID NO: 7), CA3-GS (SEQ ID NO: 10), CG3-GS (SEQ ID NO: 13), The method according to any of items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58-16>, or ⁇ B58> to ⁇ B58, which has CD3-GS (SEQ ID NO: 16) or CE3-GS (SEQ ID NO: 19) The system according to any one of -16>.
  • TCR or BCR C region-specific primers are provided in sets corresponding to all subclasses of TCR or BCR, items ⁇ B57> and ⁇ B58-2> to ⁇ B58- 17> or the system according to ⁇ B58> to ⁇ B58-17>.
  • ⁇ B58-19> Item ⁇ B57> and a sample produced by the method according to any one of ⁇ B58-2> to ⁇ B58-18> or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-18>
  • Method or system for performing gene analysis using ⁇ B58-20> The method according to any one of items ⁇ B58-19>, wherein the gene analysis is a quantitative analysis of a T cell receptor (TCR) or a repertoire of a variable region of a B cell receptor (BCR). Or system. ⁇ B59> (3) Derivation of the TCR or BCR repertoire is as follows.
  • (3-1) Means for providing a reference database for each gene region including at least one of the V region, the D region, the J region, and, if necessary, the C region:
  • (3-2) Means for providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary;
  • (3-3) means for performing a homology search with the reference database for each gene region for the input sequence set and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele;
  • (3-4) means for assigning a V region and a J region to the input sequence set, and extracting a nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result;
  • (3-5) Means for translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence;
  • (3-6) Based on the classification in (3-5), by calculating the appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region and, if necessary, the C region, or a combination thereof, the TCR Or means for
  • the reference database is a database in which a unique ID is assigned to each sequence. Items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, and ⁇ B60-2> Or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, ⁇ B60> to ⁇ B60-2>.
  • the input array set is an unbiased array set, items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-3> Or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, ⁇ B60> to ⁇ B60-3>.
  • ⁇ B60-5> Any of items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-4>, wherein the array set is trimmed Or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, ⁇ B60> to ⁇ B60-4>.
  • ⁇ B60-6> The trimming deletes the low quality region from both ends of the lead; deletes the region matching the adapter sequence by 10 bp or more from both ends of the lead; and the remaining length is 200 bp or more (TCR) or 300 bp or more (BCR ), Any of items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-5> achieved by the step used for analysis as high quality Or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, ⁇ B60> to ⁇ B60-5>.
  • ⁇ B60-7> The low quality is such that the 7 bp moving average of the QV value is less than 30, items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59> and ⁇ B60-2> ⁇
  • the approximate sequence is the closest sequence of items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-7>
  • ⁇ B60-9> The approximate sequence is as follows. 1. Number of matching bases 2. kernel length; Score, 4.
  • ⁇ B60-10> The homology search is performed under conditions that allow random mutations to be scattered throughout, items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, and The method according to any one of ⁇ B60-2> to ⁇ B60-9> or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, ⁇ B60> to ⁇ B60-9>.
  • ⁇ B60-11> In the homology search, (1) the window size is reduced, (2) the mismatch penalty is reduced, (3) the gap penalty is reduced, and (4) the index priority is the top.
  • ⁇ B60-13> The D region is classified according to the frequency of appearance of the amino acid sequence, items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-2>.
  • step (5) if there is a D region reference database, the combination of the homology search result with the CDR3 nucleic acid sequence and the amino acid sequence translation result is used as the classification result, item ⁇ B57 >, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59> and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-13>, or ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59> ⁇ B60> to ⁇ B60-13>.
  • ⁇ B60-15> In the step (5), when there is no D region reference database, classification is performed only by the appearance frequency of the amino acid sequence, items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20 >, ⁇ B59> and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-14>, or any of ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, ⁇ B60> to ⁇ B60-14> The system described in Crab.
  • ⁇ B60-16> The appearance frequency is determined in gene name units and / or allyl units, items ⁇ B57>, ⁇ B58-2> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-2> The method according to any one of B60-15> or the system according to any one of ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, ⁇ B60> to ⁇ B60-15>.
  • ⁇ B60-17> In the step (4), a V region and a J region are assigned to the input sequence set, and a CDR3 sequence is extracted using the CDR3 head on the reference V region and the CDR3 end on the reference J as markers.
  • the step (5) includes the steps of translating the nucleic acid sequence of CDR3 into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence, ⁇ B57>, ⁇ B58-2 > To ⁇ B58-20>, ⁇ B59> and ⁇ B60-2> to ⁇ B60-17>, or ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, ⁇ B60> to ⁇ B B60-17>.
  • ⁇ B60-19> (3)
  • the apparatus for deriving the TCR or BCR repertoire is as follows.
  • (3-1) Means for providing a reference database for each gene region including at least one of the V region, the D region, the J region, and, if necessary, the C region:
  • (3-2) Means for providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary;
  • (3-3) means for performing a homology search with the reference database for each gene region for the input sequence set and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele;
  • (3-4) means for assigning a V region and a J region to the input sequence set, and extracting a nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result;
  • (3-5) Means for translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence;
  • (3-6) Means for deriving TCR or BCR repertoire by calculating the appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region, and if necessary, the C region, or a combination thereof in the input
  • ⁇ Application example of analysis> ⁇ C1> A method of providing cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy to a subject, the method comprising: (1) The method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10>, ⁇ B57>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> and / or By the system according to any one of items ⁇ B11> to ⁇ B20>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21>, the subject's T cell receptor (TCR ) Or analyzing a B cell receptor (BCR) repertoire; (2) A step of determining a TCR or BCR derived from the cancer cell of the subject based on the result of the analysis, wherein the determination is in the frequency ranking of the TCR or BCR gene derived from the cancer cell of the subject.
  • TCR T cell receptor
  • a step wherein the higher rank sequence is made by selecting as a TCR or BCR from the cancer cell; (3) A step of determining a candidate amino acid sequence of an HLA test peptide based on the determined TCR or BCR derived from the cancer, wherein the determination is a score calculated using an HLA-binding peptide prediction algorithm Made on the basis of a process; (4) synthesizing the determined peptide; A method comprising the step of (5) treating with a synthesized peptide as necessary.
  • ⁇ C2> The method according to item ⁇ C1>, wherein the candidate for the HLA test peptide in the step (3) is determined using BIMAS, SYFPEITHI, RANKPEP, or NetMHC.
  • ⁇ C3> ⁇ Improved CTL method> After the step (4), the peptide, the dendritic cell or antigen-presenting cell derived from the subject, and the CD8 + T cell derived from the subject are mixed and cultured, and the mixture after the culture is treated with a patient.
  • ⁇ C4> ⁇ DC vaccine therapy> After the step (4), the steps comprising mixing the peptide and the dendritic cell derived from the subject and culturing, and administering the cultured mixture to a patient ⁇ C1> to ⁇ The method according to any one of C3>.
  • the peptide, the dendritic cell or antigen-presenting cell derived from the subject, and the CD8 + T cell derived from the subject are mixed and cultured to obtain CD8 + T cell-dendritic cell /
  • ⁇ D1> isolation of custom-made cancer-specific T cell receptor gene, isolation of cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation>
  • A an antigen protein or antigen peptide derived from a subject or a lymphocyte derived from the subject or the determined peptide according to any one of items ⁇ C1> to ⁇ C5> and inactivation derived from the subject Mixing tumor cells and T lymphocytes derived from the subject and culturing to produce tumor-specific T cells;
  • the TCR of the tumor-specific T cell is the item ⁇ B1> to ⁇ B10>, ⁇ B57>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> According to any of the methods and / or items ⁇ B11> to ⁇ B20>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21>
  • C a method for is
  • ⁇ D1-1> The step comprises mixing and culturing an antigen protein or antigen peptide derived from a subject, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject, to produce tumor-specific T cells.
  • the method according to item ⁇ D1> which is a production step.
  • ⁇ D1-2> A process mixes and culture
  • Step is a tumor-specific T cell obtained by mixing and culturing the determined peptide according to item C1, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject.
  • the method according to any one of items ⁇ D1> to ⁇ D1-2>, wherein ⁇ D2> ⁇ Isolation of tailor-made cancer-specific T cell receptor gene, isolation of cancer-specific TCR gene by consensus sequence search> (A) isolating lymphocytes or cancer tissue from subjects having a common HLA; (B) analyzing the TCR of the tumor-specific T cell by the method according to item B1 for the lymphocyte or cancer tissue; and (C) a T cell having a sequence common to the tumor-specific T cell.
  • a method for isolating a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search comprising a step of isolating.
  • ⁇ E1> ⁇ CPC> A) collecting T lymphocytes from the patient; B) After antigen stimulation of the T lymphocytes, items ⁇ B1> to ⁇ B10>, ⁇ B57>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> Any of the methods and / or items ⁇ B11> to ⁇ B20>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> Analyzing TCR based on the antigen, wherein the antigen stimulation is performed by an antigen protein or antigen peptide derived from the subject, an inactivated cancer cell derived from the subject, or a tumor-derived idiotype peptide ; C) selecting an optimal antigen and an optimal TCR in the analyzed TCR; D) producing
  • ⁇ E1-1> The cell processing therapy according to Item ⁇ E1>, wherein the antigen stimulation is performed by an antigen protein or an antigen peptide derived from the subject.
  • ⁇ E1-2> The cell processing therapy according to item ⁇ E1> or ⁇ E1-1>, wherein the antigen stimulation is performed by inactivated cancer cells derived from the subject.
  • ⁇ E1-3> The cell processing therapy according to any one of items ⁇ E1> and ⁇ E1-1> to ⁇ E1-2>, wherein the antigen stimulation is performed by the tumor-derived idiotype peptide.
  • Step C) is any one of items ⁇ E1>, ⁇ E1-1> to ⁇ E1-4>, comprising selecting an antigen that most strongly activates T cells in an antigen-specific lymphocyte stimulation test.
  • Method. ⁇ E1-6> Step C) includes any of items ⁇ B1> to ⁇ B10>, ⁇ B57>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> before and after antigen stimulation.
  • the method and / or item ⁇ B11> to ⁇ B20>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> The method according to any one of items ⁇ E1> and ⁇ E1-1> to ⁇ E1-5>, comprising selecting an antigen that most increases the frequency of a specific TCR from a repertoire analysis.
  • ⁇ E2> ⁇ CPCRAC> A method for evaluating efficacy and / or safety by conducting an in vitro stimulation test using a cancer-specific TCR gene isolated by the method according to item ⁇ D2>.
  • ⁇ CC1> A method of preparing a composition for use in cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy in a subject, the method comprising: (1) The method according to any one of items ⁇ B1> to ⁇ B10>, ⁇ B57>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> and / or By the system according to any one of items ⁇ B11> to ⁇ B20>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21>, the subject's T cell receptor (TCR ) Or analyzing a B cell receptor (BCR) repertoire; (2) A step of determining a TCR or BCR derived from the cancer cell of the subject based on the result of the analysis, wherein the determination is in the frequency ranking of the TCR or BCR gene derived from the cancer cell of the subject.
  • TCR T cell receptor
  • BCR
  • a step wherein the higher rank sequence is made by selecting as a TCR or BCR from the cancer cell; (3) A step of determining a candidate amino acid sequence of an HLA test peptide based on the determined TCR or BCR derived from the cancer, wherein the determination is a score calculated using an HLA-binding peptide prediction algorithm And (4) synthesizing the determined peptide; Including the method.
  • ⁇ CC2> The method according to item ⁇ CC1>, wherein the candidate for the HLA test peptide in the step (3) is determined using BIMAS, SYFPEEITHI, RANKPEEP, or NEETMHHC.
  • ⁇ CC3> ⁇ Improved CTL method> Item ⁇ CC1>, comprising the step of mixing and culturing the peptide, dendritic cells or antigen-presenting cells derived from the subject, and CD8 + T cells derived from the subject after the step (4) The method according to ⁇ CC2>.
  • ⁇ CC4> ⁇ DC vaccine therapy> The method according to any one of items ⁇ CC1> to ⁇ CC2>, comprising a step of mixing and culturing the peptide and the dendritic cell derived from the subject after the step (4).
  • the peptide, the dendritic cell or antigen-presenting cell derived from the subject, and the CD8 + T cell derived from the subject are mixed and cultured to obtain CD8 + T cell-dendritic cell / Comprising the steps of producing an antigen-presenting cell-peptide mixture, and producing a dendritic cell-peptide mixture by mixing and culturing the peptide and dendritic cells derived from the subject.
  • A An antigen protein or antigen peptide derived from a subject, a lymphocyte derived from the subject, or the determined peptide according to any one of items ⁇ CC1> to ⁇ CC5> and inactivation derived from the subject Mixing tumor cells and T lymphocytes derived from the subject and culturing to produce tumor-specific T cells;
  • the TCR of the tumor-specific T cell is the item ⁇ B1> to ⁇ B10>, ⁇ B57>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> According to any of the methods and / or items ⁇ B11> to ⁇ B20>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21>
  • ⁇ DD1-1> The step comprises mixing and culturing an antigen protein or antigen peptide derived from a subject, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject, to produce tumor-specific T cells.
  • the method according to item ⁇ DD1> which is a production step.
  • ⁇ DD1-2> A process mixes and culture
  • Step is a tumor-specific T cell obtained by mixing and culturing the determined peptide according to item CC1, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject.
  • the method according to any one of items ⁇ DD1> to ⁇ DD1-2>, which is a step of producing ⁇ DD2> ⁇ Isolation of tailor-made cancer-specific T cell receptor gene, isolation of cancer-specific TCR gene by consensus sequence search>
  • A providing lymphocytes or cancer tissue isolated from subjects having a common HLA
  • B For the lymphocytes or cancer tissues, the TCR of the tumor-specific T cells is determined in items ⁇ B1> to ⁇ B10>, ⁇ B57>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B59>
  • ⁇ EE1> ⁇ CCPCC> A) providing T lymphocytes collected from a patient; B) After antigen stimulation of the T lymphocytes, items ⁇ B1> to ⁇ B10>, ⁇ B57>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> Any of the methods and / or items ⁇ B11> to ⁇ B20>, ⁇ B58> to ⁇ B58-20>, ⁇ B59>, or ⁇ B60> to ⁇ B60-21> TCCR analysis based on the step, wherein the antigen stimulation is performed by an antigen protein or antigen peptide derived from the subject, an inactivated cancer cell derived from the subject, or a tumor-derived idiotype peptide ; CC) selecting the optimal antigen and optimal TCR in the analyzed TCR; and DD) for cell processing therapy comprising the steps of producing a tumor-specific ⁇ and ⁇ TCR
  • ⁇ EE1-1> The method according to item ⁇ EE1>, wherein the antigen stimulation is performed by an antigen protein or an antigen peptide derived from the subject.
  • ⁇ EE1-2> The method according to item ⁇ EE1> or ⁇ EE1-1>, wherein the antigen stimulation is performed by inactivated cancer cells derived from the subject.
  • ⁇ EE1-3> The method according to any one of items ⁇ EE1> to ⁇ EE1-2>, wherein the antigen stimulation is performed by the tumor-derived idiotype peptide.
  • step C) comprises selecting an antigen highly expressed in the cancer tissue of the subject.
  • Step C) includes any one of items ⁇ EE1> to ⁇ EE1-5> including selecting an antigen that most increases the frequency of a specific TCCR from a repertoire analysis performed based on item B1 before and after antigen stimulation.
  • ⁇ EE2> ⁇ CCPCRACC> A method for evaluating efficacy and / or safety by conducting an in vitro stimulation test using a cancer-specific TCCR gene isolated by the method according to item ⁇ DD2>. Specific steps of this efficacy and / or safety assessment can be exemplified as follows.
  • ⁇ Efficacy> For example, a T cell into which a cancer-specific TCR gene has been introduced and an antigen protein or antigen peptide derived from the subject described in ⁇ EE1-1>, an inactivity derived from the subject described in ⁇ EE1-2> Measuring the amount of cytokines (such as interferon ⁇ ) secreted extracellularly in response to activation of T cells after culturing with cancerous cells or the tumor-derived idiotype peptide according to ⁇ EE1-3> Efficacy can be evaluated by measuring the expression level of a specific gene that increases in response to cell activation, or by measuring cell surface molecules that are expressed or increased in response to T cell activation. .
  • cytokines such as interferon ⁇
  • Safety For example, when T cells derived from the subject into which a cancer-specific TCR gene has been introduced and normal cells derived from the subject are mixed, cytokines secreted in response to the activation of the T cells, Safety can be evaluated by measuring gene expression or expression of cell surface molecules and confirming that the TCR gene-introduced T cells are not activated by normal cells.
  • the present invention has an effect that it can cope with a “large-scale” sequence as compared with the prior art.
  • BCR since a large number of mutations are observed, it can be said that there is a particularly advantageous effect in that it can be amplified “unbiased” regardless of the mutation and an accurate determination can be made.
  • conventional systems for amplification method and sequencing method using V-strand specific primer, 1. Be non-biased; 2. Therefore, it can be said that the quantitative property is excellent.
  • technologies such as SMART PCR 1. “Non-bias degree” is remarkably improved. This is advantageous in that it does not have the inherent disadvantages of each technology. For example, SMART reports Repeated Template Switching as a problem, but this problem does not occur in this system. 3.
  • the ability to perform comprehensive analysis including identification of isotypes and subtypes can also be cited as an advantageous effect.
  • TCR derives TCR and BCR repertoire for ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains
  • BCR derives IgM, IgD, IgA, IgG, IgE heavy chain and IgL, IgL light chain
  • Changes in the repertoire from various aspects can be detected.
  • the position of the C region primer for sequencing is arranged at an appropriate position. Furthermore, the position of the primer is devised so that the type of isotype or subtype can be identified from the amplified gene sequence, and the gene associated with the disease can be easily identified.
  • invariant TCR screening can be performed.
  • invariant TCR can be screened by searching for leads that overlap in many samples regardless of HLA in the TCR ⁇ chain.
  • MAIT-derived TCRs that recognize MR1, which is a non-classical MHC, could be detected.
  • NKT and MAIT that express invariant TCR play an important role in immune responses such as infectious immunity, antitumor, and inflammation. It is expected that the novel invariant TCRs in various tissue samples can be screened and used for the purpose of searching for cells having unique functions.
  • TCR ⁇ and TCR ⁇ are receptor molecules that form heterodimers.
  • Antigen-specific T cells that proliferate in response to antigens consist of specific unique TCR ⁇ and TCR ⁇ chains.
  • TCR repertoire analysis amplifies the TCR ⁇ or TCR ⁇ gene separately, it cannot know which TCR ⁇ and which TCR ⁇ form a pair. Therefore, by examining whether or not a combination of individuals in which specific TCR ⁇ chain reads overlap is coincident with a TCR ⁇ chain overlapping individual, a pair of TCR ⁇ and TCR ⁇ chain genes can be estimated (FIG. 44).
  • a matching TCR ⁇ chain could be inferred using an individual with a specific TCR ⁇ chain as an index (Table 3-11). Although there is an example in which a plurality of reads are assigned, it is considered that this is a useful search method for identifying a paired TCR gene.
  • a highly accurate and unbiased sample for large-scale gene analysis is provided, which is particularly useful in clinical applications where quantitative analysis is particularly required.
  • the ability to identify a “low frequency” (1 / 10000-1 / 100,000 or less) gene leads to more accurate diagnosis and treatment of leukemia, for example. This was not possible due to the detection limit (about 1%) in the prior art (method of combining the plate method with the adapter, or method of combining the plate method with the SMART method).
  • the conventional method takes one night, but this is advantageous because it takes only a few minutes in this case.
  • the conventional method takes one night, but this is advantageous because it takes only a few minutes in this case.
  • IMGT / High-V-QUEST there is no C region classification function, and the repertoire classification is "gene name unit""allylunit" (That is, (*) V (gene name) -D (gene name) -J (gene name) or V (allyl) -D (allyl) -J (allyl)).
  • the CDR3 classification can be performed separately from the repertoire, but there is no degree of freedom.
  • the C region can be classified.
  • “gene name unit” and “allyl unit” can be selected for each region. It is also possible to use CDR3 instead of D.
  • V gene name
  • V gene name
  • V gene name
  • V gene name
  • V gene name
  • V (allyl) -J (allyl)
  • V (allyl) -CDR3-J (allyl)
  • CDR3 can be used as a part of the repertoire classification, and can be classified independently.
  • IMGT / High-V-QUEST has 150,000 as the maximum number of sequences that can be processed in one batch, whereas the analysis method of the present invention is unlimited. The time required for processing the same data is approximately 1/10 in this system.
  • the cancer idiotype peptide therapy of the present invention is used for patients who do not have a specific marker (molecular target) effective for treatment in the target cancer cells or are ineffective in treatment with existing specific molecular target drugs. It is valid. That is, since peptides are prepared based on genetic information of cancer cells derived from individual patients, they are effective against many tumors that express TCR or BCR. Lymphoma cells and leukemia cells have T-cell and B-cell tumors from their origin, and this technology can be applied to any tumor type and is useful for the treatment of many patients. In addition, when targeting tumorized B cell subpopulations, antibody drugs that target cell surface molecules expressed on most B cells, such as anti-CD20 antibodies, are used.
  • Existing CTL therapy induces patient-specific killer T cells or tumor-specific DC by co-culturing patient lymphocytes and patient tumor cells, and existing DC therapy co-cultures patient DC cells and patient tumor cells.
  • treatment targeting anti-tumor effects is performed by stimulating lymphocytes or DC cells using cancer antigens from the population and transferring them to patients.
  • cancer antigen protein is more effective and has fewer side effects than the protein as the antigen that imparts specificity, rather than using the whole tumor cell.
  • peptides also have the advantage that they can be easily chemically synthesized directly based on gene sequence information. Peptides do not use biomaterials such as cells, culture media, and infectious substances in the production process, so safety can be ensured.
  • CTL cells are expected to work as cells that have already been stimulated and activated by an antigen and exert an early therapeutic effect.
  • Tumor-specific DC cells induce CTL cells in the transferred patient and thus have a sustained anti-tumor effect, and a synergistic anti-tumor effect is expected when these different cells are used in combination.
  • cancer-specific TCR gene therapy it is important that expression of the target antigen is limited to cancer cells.
  • antigens that are localized in limited tissues such as cancer cells and testis tissue, such as cancer-testis antigens, are selected, but these antigens are also known to be expressed in some normal cells.
  • the tailor-made cancer TCR gene therapy of the technology of the present invention identifies T cells that infiltrate patient tumor tissue and uses the gene sequence of the TCR. Therefore, a higher effect is expected because a functional TCR that is considered to actually work on an antitumor in a patient is used.
  • it is a T cell present in a patient its action on normal cells is likely to be limited.
  • TCR gene therapy is limited to patients with specific HLA and expressing the target cancer antigen. On the other hand, if it is made to order, it can be applied to patient HLA, TCR specific to the cancer antigen derived from the patient can be individually prepared, and treatment for a wider range of patients becomes possible. Isolation of a cancer-specific TCR gene by in vitro stimulation is performed by stimulating patient lymphocytes with antigen protein, antigen peptide, inactivated cancer cell, idiotype peptide, or the like. The TCR gene isolated through an experimental process for each patient is a TCR that matches the patient's HLA type, cancer cell type, cancer antigen type, and other genetic backgrounds, and is considered to be more effective for treatment.
  • FIG. 1 shows the cross-reactivity of isotype specific primers.
  • the left panel is an example for the second IgM sample, the left end (L) shows the lane of molecular weight markers.
  • M, G, A, D and E show the results with specific primers for IgM, IgG, IgA, IgD and IgE, respectively.
  • the middle panel shows the results with the second IgG sample on the left and the second IgA sample on the right and the right end (L) shows the lane of molecular weight markers.
  • M, G, A, D and E show the results with specific primers for IgM, IgG, IgA, IgD and IgE, respectively.
  • the right panel shows the second IgD sample on the left and the second IgE sample on the right.
  • the left end (L) shows a lane for molecular weight markers.
  • M, G, A, D and E show the results with specific primers for IgM, IgG, IgA, IgD and IgE, respectively.
  • amplification with another isotype-specific primer together with the target immunoglobulin isotype-specific primer was performed to confirm the presence or absence of cross-reactivity. 10 ⁇ L of the GS-PCR amplification product was electrophoresed in 2% agarose gel in TAE buffer and evaluated by ethidium bromide staining.
  • FIG. 2 shows the examination result of the optimum dilution concentration.
  • the optimum conditions for GS-PCR in each isotype were examined.
  • a 2-fold serial dilution series of 2nd PCR amplification products was prepared, and 20 cycles of GS-PCR were performed. From the left, the results of 1-fold, 2-fold, 4-fold, 8-fold and 16-fold dilutions of IgM, IgG, IgA, IgD and IgE are shown for the 2nd PCR amplification product.
  • the leftmost L indicates a lane of molecular weight marker.
  • FIG. 3 shows the examination result of the optimum number of cycles. PCR was performed for 10, 15, and 20 cycles using a 16-fold diluted 2nd PCR amplification product. The upper panel shows the results of 20 cycles, the middle panel shows the results of 15 cycles, and the lower panel shows the results of 10 cycles. In each panel, the leftmost L indicates a lane of molecular weight marker, and IgM, IgG, IgA, IgD and IgE are shown from the left. In IgM, IgG, IgA, and IgD, good amplification was confirmed in 10 cycles. Further, it was confirmed that 20 cycles is appropriate for IgE.
  • FIG. 4 shows the read length of the next generation sequence.
  • the graph shows the number of library reads (vertical axis), and the horizontal axis shows the analysis result of the lead length.
  • the read length of the next generation sequence of the BCR gene is shown.
  • the number of leads of raw data was 130,000, and the number of leads passed through Filter pass was 90,000 or more.
  • Table 2 shows the number of leads derived from each isotype labeled.
  • FIG. 5 shows the analysis result of the lead length by MID. IgM, IgG and IgA are shown from the upper panel left, and IgD and IgE are shown from the lower panel left.
  • the vertical axis indicates the number of reads
  • the horizontal axis indicates the read length (base length). The number of leads divided by MID and the distribution of lead lengths were also uniform.
  • FIG. 6A shows the analysis results of the frequency of use of C region sequences by isotype. IgM, IgG and IgA are shown from the upper panel left, and IgD and IgE are shown from the lower panel left. In each graph, the vertical axis indicates% and the horizontal axis indicates the identified C region gene name. The obtained leads for each isotype were subjected to a homology search with immunoglobulin isotype C region sequences including subclasses.
  • FIG. 6A shows the result of analysis by IMGT HighV-Quest. The result similar to FIG. 6A was analyzed with the improved software (Repertoire genesis). Similar results were obtained with this software, and a no-hit result indicating reads that were not classified into any isotype or subtype was also obtained.
  • FIGS. 7A and 7B show the results of analysis of the V region repertoire by isotype. From the top, IgM, IgG, IgA, IgD and IgE are shown, respectively. The horizontal axis shows each isotype name.
  • the repertoire (BCR V repertoire) of the V region sequence by isotype is shown.
  • the BCR V repertoire was very similar among IgM, IgG, IgA, and IgD, but only the lead with IGHV3-30 was obtained for IgE. This is because the number of IgE positive cells in peripheral blood is very small compared to other classes, suggesting the possibility that a biased repertoire was detected.
  • FIGS. 7A and 7B show the results of analysis by IMGT HighV-Quest.
  • FIGS. 7A and 7B show the results of analysis of the V region repertoire by isotype. From the top, IgM, IgG, IgA, IgD and IgE are shown, respectively. The horizontal axis shows each isotype name.
  • the repertoire (BCR V repertoire) of the V region sequence by isotype is shown.
  • the BCR V repertoire was very similar among IgM, IgG, IgA, and IgD, but only the lead with IGHV3-30 was obtained for IgE. This is because the number of IgE positive cells in peripheral blood is very small compared to other classes, suggesting the possibility that a biased repertoire was detected.
  • FIGS. 7A and 7B show the results of analysis by IMGT HighV-Quest. FIGS.
  • FIGS. 7C and D show the results of performing the same analysis as FIGS. 7A and B with improved software (Repertoire genesis). Similar results were obtained with this software, and a no hit result was also obtained.
  • FIGS. 7C and D show the results of performing the same analysis as FIGS. 7A and B with improved software (Repertoire genesis). Similar results were obtained with this software, and a no hit result was also obtained.
  • 8A and B show the analysis results of the V region repertoire by subtype. IgA1, IgA2, IgG1 and IgG2 are shown from the top. The horizontal axis shows each isotype name of each subclass. Shown are BCR V repertoires by IgA and IgG subclass.
  • IgA The subclasses of IgA differed in the frequency of several V chains between IgA1 and IgA2.
  • IGHV1-18 and IGHV4-39 were higher in IgA1 than IgA2, while IGHV3-23 and IGHV3-74 were higher in IgA2 than IgA1.
  • the frequency of IGHV3-23 and IGHV3-74 which showed an increase in IgA2, was higher in IgG2 compared to IgG1.
  • the number of reads of IgG3 and IgG4 is small (10 reads).
  • FIGS. 8A and 8B show the results of analysis by IMGT HighV-Quest.
  • 8A and B show the analysis results of the V region repertoire by subtype. IgA1, IgA2, IgG1 and IgG2 are shown from the top. The horizontal axis shows each isotype name of each subclass. Shown are BCR V repertoires by IgA and IgG subclass.
  • IgA The subclasses of IgA differed in the frequency of several V chains between IgA1 and IgA2.
  • IGHV1-18 and IGHV4-39 were higher in IgA1 than IgA2, while IGHV3-23 and IGHV3-74 were higher in IgA2 than IgA1.
  • the frequency of IGHV3-23 and IGHV3-74 which showed an increase in IgA2, was higher in IgG2 compared to IgG1.
  • the number of reads of IgG3 and IgG4 is small (10 reads).
  • FIGS. 8A and 8B show the results of analysis by IMGT HighV-Quest.
  • 8C and D show the results of the same analysis as in FIGS. 8A and 8 performed by improved software (Repertoire genesis). Similar results were obtained with this software, and a no hit result was also obtained.
  • 8C and D show the results of the same analysis as in FIGS. 8A and 8 performed by improved software (Repertoire genesis).
  • FIG. 9A shows the analysis result of BCRJ repertoire by subclass.
  • BCRJ repertoires by subclass are shown.
  • the upper panel shows IgM, IgG, IgA, IgD and IgE, respectively, and the horizontal axis shows the name of each isotype.
  • the lower panel is a display by subclass, showing IgA1, IgA2, IgG1 and IgG2 from the left.
  • the horizontal axis indicates the name of each isotype in each subclass.
  • IgM, IgG, IgA, and IgD IGHJ4 was used in about half of the leads while IGHJ2 was rarely used.
  • IgE only IGHJ1 was used.
  • FIG. 9A shows the result of analysis by IMGT HighV-Quest. The same analysis as that of FIG. 9A is performed with the improved software. The same result was obtained with the pending software (Repertoire genesis) together with this patent, and the result of no hit could also be obtained.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of a TCR gene amplification method. The description about the primer pair illustrated in the Example is shown.
  • FIG. 11 shows the results of electrophoresis of 10 ⁇ L of GS-PCR amplification products derived from 10 healthy subjects on a 2% agarose gel. Upper row: GS-PCR (TRA), TCR ⁇ chain amplification product, lower row: GS-PCR (TRB), TCR ⁇ chain amplification product. The number indicates the sample number.
  • TRA GS-PCR
  • TRB GS-PCR
  • FIG. 12 shows parameter settings of TCR / BCR repertoire analysis software (Repertoire genesis).
  • FIG. 13 (AD) shows the analysis results of TRAV repertoire in healthy individuals. The TRAV repertoire for each sample (see number) is shown. The horizontal axis indicates the name of each TRAV gene, and the vertical axis indicates the presence frequency. Mean represents an average. The TRBV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown. The presence frequency of TRAV9-2, 12 and 13 was high, TRAV20 in # 1, TRAV21 in # 5 was higher than other healthy individuals, and individual differences were also observed.
  • FIG. 13 (AD) shows the analysis results of TRAV repertoire in healthy individuals. The TRAV repertoire for each sample (see number) is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRAV gene, and the vertical axis indicates the presence frequency. Mean represents an average.
  • the TRBV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • the presence frequency of TRAV9-2, 12 and 13 was high, TRAV20 in # 1, TRAV21 in # 5 was higher than other healthy individuals, and individual differences were also observed.
  • FIG. 13 (AD) shows the analysis results of TRAV repertoire in healthy individuals.
  • the TRAV repertoire for each sample is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRAV gene, and the vertical axis indicates the presence frequency.
  • Mean represents an average.
  • the TRBV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • FIG. 13 shows the analysis results of TRAV repertoire in healthy individuals.
  • the TRAV repertoire for each sample is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRAV gene, and the vertical axis indicates the presence frequency.
  • Mean represents an average.
  • the TRBV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • the presence frequency of TRAV9-2, 12 and 13 was high, TRAV20 in # 1, TRAV21 in # 5 was higher than other healthy individuals, and individual differences were also observed.
  • FIG. 14 shows the analysis results of TRBV repertoire in healthy individuals.
  • the TRBV repertoire for each sample (see number) is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRBV gene, and the vertical axis indicates the presence frequency.
  • Mean represents an average.
  • the TRBV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • the presence frequency of TRBV20-1, 28, and 29-1 was high.
  • TRBV3-1 was higher than other healthy individuals, and individual differences were observed.
  • FIG. 14 (AD) shows the analysis results of TRBV repertoire in healthy individuals.
  • the TRBV repertoire for each sample (see number) is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRBV gene, and the vertical axis indicates the presence frequency.
  • Mean represents an average.
  • the TRBV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • the presence frequency of TRBV20-1, 28, and 29-1 was high.
  • FIG. 14 (AD) shows the analysis results of TRBV repertoire in healthy individuals.
  • the TRBV repertoire for each sample (see number) is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRBV gene, and the vertical axis indicates the presence frequency.
  • Mean represents an average.
  • the TRBV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • the presence frequency of TRBV20-1, 28, and 29-1 was high.
  • TRBV3-1 was higher than other healthy individuals, and individual differences were observed.
  • FIG. 14 (AD) shows the analysis results of TRBV repertoire in healthy individuals.
  • the TRBV repertoire for each sample (see number) is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRBV gene, and the vertical axis indicates the presence frequency.
  • FIGS. 15A to 15D show the results of TRAJ repertoire analysis in healthy individuals. The horizontal axis indicates the name of each TRAJ gene, and the vertical axis indicates the presence frequency. Mean represents an average. TRAJ repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown. TRAJ repertoires of healthy individuals show that within about 5% of all AJ families, TRAJ12 in # 1, TRAJ27 in # 4, TRAJ37 in # 5, TRAJ45 in # 8 are higher than other healthy individuals, and individual differences are observed It was. FIGS.
  • FIGS. 15A to 15D show the results of TRAJ repertoire analysis in healthy individuals.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRAJ gene, and the vertical axis indicates the presence frequency.
  • Mean represents an average.
  • TRAJ repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • TRAJ repertoires of healthy individuals show that within about 5% of all AJ families, TRAJ12 in # 1, TRAJ27 in # 4, TRAJ37 in # 5, TRAJ45 in # 8 are higher than other healthy individuals, and individual differences are observed It was.
  • FIGS. 15A to 15D show the results of TRAJ repertoire analysis in healthy individuals.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRAJ gene, and the vertical axis indicates the presence frequency.
  • Mean represents an average. TRAJ repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • FIGS. 15A to 15D show the results of TRAJ repertoire analysis in healthy individuals.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRAJ gene, and the vertical axis indicates the presence frequency. Mean represents an average.
  • TRAJ repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • TRAJ repertoires of healthy individuals show that within about 5% of all AJ families, TRAJ12 in # 1, TRAJ27 in # 4, TRAJ37 in # 5, TRAJ45 in # 8 are higher than other healthy individuals, and individual differences are observed It was.
  • FIG. 16 shows the results of TRBJ repertoire analysis in healthy individuals.
  • the horizontal axis indicates the name of each TRBJ gene, and the vertical axis indicates the presence frequency. Mean represents an average.
  • the TRBJ repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown. In the healthy person, TRBJ repertoire had a high frequency of TRBJ2-1, 2-3, and 2-7, and in # 8, TRBJ2-2 was high, showing individual differences.
  • FIG. 17 shows the result of electrophoresing each 2 nd PCR amplification product synthesized in Preparation Example 3 on a 2% agarose gel, and confirming the amplification product of the desired size in visual observation.
  • the target sequence is an artificially spliced functional TRAC exon region sequence. It consists of exons EX1, EX2, and EX3, and is a primer over the entire length. Setting is possible.
  • the possible primer setting regions of TRBC are shown in the lower row (the target sequence is an exon region sequence of functionally spliced functional TRBC. It consists of exons EX1, EX2, EX3 and EX4, and allows primer setting over the entire length. is there.).
  • the TRAC sequence to be the target sequence can be used in addition to the one shown in the figure (SEQ ID NO: 1376) or a variant thereof.
  • the target TRBC sequence can be those shown in the figure (SEQ ID NO: 1377), as well as those of SEQ ID NOs: 1392, 1393, and other variants. 18 to 25, each setting sequence in this full-length sequence is merely an example, and the C region-specific primer of the first TCR or BCR should be set most on the 5 ′ end side of the complementary DNA. Once the first TCR or BCR C region specific primer is set, the second TCR or BCR C region specific primer can be set downstream. Further, once a third TCR or BCR C region specific primer is set, a third TCR or BCR C region specific primer can be set. FIG.
  • the target sequence is an exon region sequence of functional TRGC artificially spliced. It consists of exons EX1, EX2 and EX3, and is a primer over the entire length. Setting is possible.
  • the upper and lower tiers show possible TRDC primer setting regions (the target sequence is an artificially spliced functional TRDC exon region sequence. It consists of exons EX1, EX2, EX3 and EX4, and allows primer setting over the entire length.
  • the TRGC sequence to be the target sequence can be those shown in the figure (SEQ ID NO: 1378), as well as those of SEQ ID NOS: 1394, 1395, 1396, 1397, 1398, 1399, and variants thereof. Is done. It is understood that the target TRDC sequence can be used in addition to the one shown in the figure (SEQ ID NO: 1379) or a variant thereof.
  • FIG. 20 shows an example of possible primer setting regions of IGHM (the target sequence is an artificially spliced functional IGHM exon region sequence. The secreted forms are exons CH1, CH2, CH3, CH4 and CH ⁇ . S, membrane-bound type consists of CH1, CH2, CH3, CH4, M1 and M2.
  • the figure shows an example of membrane-bound type.
  • the target sequence IGHM sequence is the one shown in the figure (SEQ ID NO: 1380) It is understood that those of SEQ ID NOs: 1447, 1448, 1449, and variants thereof can also be used.
  • FIG. 21 shows an example of a possible primer setting region of IGHA (the target sequence is an artificially spliced functional IGHA exon region sequence. Secretory forms are exons CH1, H, CH2, CH3 and CH ⁇ .
  • S, membrane-bound type is composed of CH1, H, CH2, CH3, M1 and M2.
  • FIG. 22 shows an example of a possible primer setting region of IGHG (the target sequence is an artificially spliced functional IGHG exon region sequence.
  • Secretion types are exons CH1, H (H1, H2, H3, H4), CH2, CH3 and CH-S, and the membrane-bound type is composed of CH1, H (H1, H2, H3, H4), CH2, CH3, M1 and M2.
  • the figure shows an example of the secreted type.
  • FIG. 23 shows an example of a possible primer setting region of IGHD (the target sequence is an artificially spliced functional IGHD exon region sequence.
  • Secretory forms are exons CH1, H1, H2, CH2, CH3 and CH-S, membrane-bound type is composed of CH1, H1, H2, CH2, CH3, M1 and M2.
  • the figure shows an example of membrane-bound type.
  • the target sequence IGHD sequence is the one shown in the figure (SEQ ID NO: 1383), it is understood that those of SEQ ID NOs: 1404 to 1406 and variants thereof can also be used.
  • FIG. 24 shows an example of possible primer setting regions of IGHE (the target sequence is an artificially spliced functional IGHE exon region sequence. Secretory forms are exon CH1, exon CH2, exon CH3 and CH- S, membrane-bound type is composed of CH1, exon CH2, exon CH3, M1 and M2.
  • FIG. 25 shows an example of a primer setting region capable of IGKC in the upper part (the target sequence is a functional IGKC CL sequence.
  • the IGKC sequence serving as the target sequence is that shown in the figure (SEQ ID NO: 1379)).
  • Primers can be set over the entire length.
  • the possible primer setting region of IGLC is shown in the lower row (the target sequence is a functional IGLC CL sequence.
  • FIG. 26 shows an RNA electrophoresis image by Agilent 2100 Bioanalyzer. Total RNA was extracted from the cell serial dilution, and the amount of RNA was measured using an Agilent bioanalyzer. RNA was separated using a microchip electrophoresis apparatus, and RNA quality was checked. In any sample, 28S (upper band) and 18S rRNA (lower band) were detected, indicating that RNA that had not undergone degradation was obtained.
  • FIG. 27 shows TCR reads in Molt-4 cell serially diluted samples.
  • TCR leads obtained from 10%, 1%, 0.1% and 0.01% of each Molt-4 serially diluted sample are indicated. Ranking in order of the number of leads, showing the top 40. Rankings 365 to 404 are shown for 0.01% samples.
  • the TRBV, TRBJ and CDR3 amino acid sequences of each lead and the number of reads are shown.
  • a functional TCR lead derived from Molt-4 (TRBV20-1 / TRBJ2-1 / CSARESTTSDPKNEQFFG) is shown in bold and gray background, and the other functional defect is suspected (TRBV10-3 / TRBJ2-5 / CAISEPTGIRRDPVLR) Is shown in bold.
  • TCR reads in Molt-4 cell serially diluted samples (SEQ ID NOs: 1165-1324). TCR leads obtained from 10%, 1%, 0.1% and 0.01% of each Molt-4 serially diluted sample are indicated. Ranking in order of the number of leads, showing the top 40. Rankings 365 to 404 are shown for 0.01% samples. The TRBV, TRBJ and CDR3 amino acid sequences of each lead and the number of reads are shown.
  • FIG. 27 shows TCR reads in Molt-4 cell serially diluted samples. (SEQ ID NOs: 1165-1324). TCR leads obtained from 10%, 1%, 0.1% and 0.01% of each Molt-4 serially diluted sample are indicated. Ranking in order of the number of leads, showing the top 40. Rankings 365 to 404 are shown for 0.01% samples.
  • FIG. 27 shows TCR reads in Molt-4 cell serially diluted samples. (SEQ ID NOs: 1165-1324). TCR leads obtained from 10%, 1%, 0.1% and 0.01% of each Molt-4 serially diluted sample are indicated. Ranking in order of the number of leads, showing the top 40.
  • Rankings 365 to 404 are shown for 0.01% samples.
  • the TRBV, TRBJ and CDR3 amino acid sequences of each lead and the number of reads are shown.
  • a functional TCR lead derived from Molt-4 (TRBV20-1 / TRBJ2-1 / CSARESTTSDPKNEQFFG) is shown in bold and gray background, and the other functional defect is suspected (TRBV10-3 / TRBJ2-5 / CAISEPTGIRRDPVLR) Is shown in bold.
  • FIG. 28 shows the number of TCR reads and detection sensitivity in a Molt-4 cell serially diluted sample.
  • FIG. 29 is a schematic diagram showing a flow of TCR data analysis.
  • FIG. 30 is a schematic diagram showing a flow of BCR data analysis.
  • FIG. 31 is a diagram showing the frequency of C for each class.
  • FIG. 32 (A and B) is a diagram showing a comparison of V repertoires between classes. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 32 (A and B) is a diagram showing a comparison of V repertoires between classes. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 33 is a diagram showing a comparison of J repertoires between classes. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name.
  • FIG. 34 shows a comparison of V repertoires between subclasses.
  • the vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 34 (A and B) shows a comparison of V repertoires between subclasses. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 35 is a diagram showing a comparison of J repertoires between subclasses. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 34 shows a comparison of V repertoires between subclasses. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 34 (A and B) shows a comparison of V repertoires between subclasses. The vertical axis
  • FIG. 36 (A and B) shows a comparison of IgM V repertoires between specimens.
  • the vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 36 (A and B) shows a comparison of IgM V repertoires between specimens. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 37 is a diagram showing a comparison of IgM J repertoire between samples. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents gene name. No-hit indicates the frequency that did not correspond to any of them.
  • FIG. 38 (AD) shows a TRAV repertoire comparison between specimens.
  • FIG. 38 (AD) shows a TRAV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 38 (AD) shows a TRAV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 38 (AD) shows a TRAV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 38 (AD) shows a TRAV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 38 (AD) shows a TRAV repertoire comparison between specimens.
  • FIG. 39 shows a TRBV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 39 (AD) shows a TRBV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 39 (AD) shows a TRBV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 39 (AD) shows a TRBV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 39 (AD) shows a TRBV repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%)
  • FIG. 39 shows a TRBV repertoire comparison between specimens.
  • Vertical axis frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 40 (AD) shows a TRAJ repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 40 (AD) shows a TRAJ repertoire comparison between specimens. The vertical axis represents frequency (%), and the horizontal axis represents the name of the child. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 40 (AD) shows a TRAJ repertoire comparison between specimens.
  • FIG. 40 shows a TRAJ repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 41 shows a TRBJ repertoire comparison between specimens. Vertical axis: frequency (%), horizontal axis: gene name. “Average” is the average of all specimens, and error bars indicate ⁇ standard deviation.
  • FIG. 42 shows a block diagram of the system of the present invention.
  • FIG. 43 shows a flowchart for the processing of the present invention.
  • FIG. 44 shows the distribution of unique reads in the TCR ⁇ and TCR ⁇ chain repertoire analysis.
  • the distribution of the unique reads of all sequence reads was examined with the copy number as the horizontal axis. In TCR ⁇ , only one lead was detected (single), 73.3% (1250 reads), and 70.5% (6502 reads) in the TCR ⁇ chain.
  • FIG. 45 shows TRAV and TRAJ repertoire. The frequency of use of each TRAV and TRAJ in all leads is shown.
  • the horizontal axis shows the TRAV gene (upper graph) and the TRAJ gene (lower graph).
  • the vertical axis shows the ratio (% Usage) in all leads.
  • FIG. 46 shows a 3D plot of the TRA repertoire.
  • FIG. 47 shows TRBV and TRBJ repertoire. The frequency of use of each TRBV and TRBJ in all leads is shown. The horizontal axis shows the TRBV gene (upper graph) and the TRBJ gene (lower graph). The vertical axis shows the ratio (% Usage) in all leads.
  • FIG. 48 shows a 3D plot of the TRB repertoire.
  • FIG. 49 is a schematic diagram of a TCR ⁇ pair read estimation method (see Example 3 of the analysis system).
  • FIG. 50 is a schematic diagram of MiSeq Dual-indexed Paired-end Sequencing according to the fourth embodiment of the analysis system.
  • FIG. 51 shows the use of TRAV and TRAJ in 20 healthy individuals. The number of TCR sequences with TRAV and TRAJ, respectively, was counted.
  • the frequency percentage of 54 TRAV and 61 TRAJ was calculated and presented as a scatter plot. Each dot indicates the frequency percentage of TRAV or TRAJ in each individual. The horizontal line shows an average value of 20.
  • P pseudogene
  • ORF open reading frame.
  • FIG. 52 shows the use of TRBV and TRBJ in 20 healthy individuals. The frequency percentage of 65 TRBV and 14 TRBJ is shown as a scatter plot. Each dot indicates the frequency percentage of TRBV or TRBJ in each individual. Red bars indicate average values.
  • FIG. 53 shows the frequency of occurrence of genetic recombination in TRAV TRAJ in read data pooled from 20 healthy individuals.
  • the number of TCR sequence reads having the respective gene recombination of TRAV and TRAJ was counted.
  • the occurrence tendency of recombination is visualized by a heat map display of each recombination number.
  • the color of each pixel indicates the number of each recombination.
  • TRAV8-5 there are 8 pseudogenes (TRAV8-5, TRAV11, TRAV15, TRAV28, TRAV31, TRAV32, TRAV33 and TRAV37), one ORF (TRAV8-7, a gene that was not fully expressed (TRAV7, TRAV9- 1, TRAV18 and TRAV36) for TRAJ, 3 pseudogenes (TRAJ51, TRAJ55, and TRAJ60), 6 ORFs (TRAJ1, TRAJ2, TRAJ19, TRAJ25, TRAJ59, and TRAJ61), and fully Genes that were not expressed (TRAJ14 and TRAJ46) were excluded, including two ORFs that were found to be expressed (TRAJ35 and TRAJ48), and 2,050 recombination events (4 It shows a heat map display of individual TRAV ⁇ 50 pieces of TRAJ).
  • FIG. 54 shows a 3D image of the TCR ⁇ repertoire.
  • the number of TCR sequence reads having a given gene recombination in TRAJ of TRAV was counted.
  • the average frequency percentage of 3,294 (54 TRAV ⁇ 61 TRAJ) in 20 healthy individuals is shown as a 3D bar graph.
  • the X axis and Y axis indicate TRAV and TRAJ, respectively. Recombination of TRAV1-2 with TRAJ33 (AV1-2 / AJ33) was most expressed (0.99 ⁇ 0.85).
  • P pseudogene
  • (ORF) open reading frame.
  • FIG. 55 shows a 3D image of the TCR ⁇ repertoire.
  • FIG. 56 shows the digital CDR3 chain length distribution of TCR ⁇ and TCR ⁇ . CDR3 length was determined in 172,109 TCR ⁇ and 94,928 TCR ⁇ sequence reads obtained from pooled data of 20 individuals.
  • the length of the nucleotide sequence from the conserved cysteine at position 104 (Cys104) (IMGT designation) to the conserved phenylalanine at position 118 (Phe118) was automatically calculated using RG software.
  • the CDR3 chain length distribution in TCR ⁇ (top) and TCR ⁇ (bottom) is shown as a histogram.
  • FIG. 57 shows the diversity of TCR ⁇ and TCR ⁇ repertoires in healthy individuals.
  • the copy number (read number) of the unique sequence read (USR) was calculated.
  • the average number of copies per unique sequence read in each individual is shown as a white circle (left).
  • FIG. 58 shows the similarity of TCR ⁇ and TCR ⁇ repertoires in healthy individuals.
  • the frequency of occurrence of TCR sequence reads shared among pairs of all 20 individuals was calculated (Tables 4-6 and 4-7).
  • FIG. 59 shows that the public TCR had a CDR3 with a shorter chain length than the private TCR.
  • the length of CDR3 was calculated with 7,237 USR (grey) for public TCR and 83,997 USR (black) for private TCR.
  • the frequency percentage of USR at each CDR3 length was plotted as a bar graph.
  • FIG. 60 shows the correlation of gene usage of TRAV, TRAJ, TRBV and TRBJ among healthy individuals.
  • FIG. 61 shows coincidence correlation coefficients for TRAV, TRAJ, TRBV and TRBJ.
  • the correlation coefficient between two samples from healthy individuals was calculated by Spearman's correlation test. Each dot indicates a correlation coefficient value between individual pairs.
  • FIG. 62 shows an overview of cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy.
  • Lymphocytes are collected from the upper left patient and a repertoire analysis for TCR or BCR is performed to predict HLA-binding peptides. Thereafter, using the predicted HLA-binding peptide, tailored peptide-sensitized CTL therapy or tailored peptide-sensitized DC vaccine therapy is performed.
  • tailored peptide-sensitized CTL therapy or tailored peptide-sensitized DC vaccine therapy is performed.
  • FIG. 63 shows an overview of the improved CTL method.
  • FIG. 64 shows an overview of DC vaccine therapy.
  • Dendritic cells are isolated from the left patient and mixed with the antigenic peptide.
  • DC vaccine therapy since individualized peptides are created based on sequence information obtained from patient-derived tumor cells, they do not act on normal cells but act more specifically on tumor cells, resulting in high therapeutic effects. I can expect. Since peptides are used as antigens, there is an advantage that they can be easily chemically synthesized unlike proteins.
  • FIG. 65 shows an overview of patient autoimmune cell therapy. In improved CTL therapy (left), CD8 + T cells and dendritic cells are isolated from the peripheral blood of a patient, and co-culture stimulation is performed using an antigenic peptide. Both cytotoxic T cells and antigen presenting cells are transferred to the patient.
  • FIG. 66 shows the outline of the isolation of a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and the isolation of a cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation.
  • a tumor-specific TCR gene is obtained by co-culturing an antigenic peptide, a patient-derived inactivated cancer, and a patient-derived T cell.
  • Preparation of an isolated cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation can be performed using any technique known in the art once the genetic information is obtained.
  • FIG. 67 shows an outline of preparation of an isolated cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation. As shown, the resulting TCR ⁇ and TCR ⁇ genes are introduced into a TCR-expressing viral vector (middle) and transformed by infecting patient-derived T lymphocytes.
  • FIG. 68 shows an overview of cell processing therapy. As shown, a tumor-specific TCR gene obtained by TCR repertoire analysis is introduced into a patient-derived T lymphocyte from a T lymphocyte isolated from the upper right patient, and the tumor-specific T lymphocyte is transferred to the patient. .
  • FIG. 69 shows an outline of a method for evaluating efficacy and / or safety by performing a stimulation test in vitro. Evaluation of the efficacy and / or safety of tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes is performed by an in vitro stimulation test (downward arrow). Based on these in vitro evaluations, T lymphocytes suitable for treatment are selected (upward arrow). Evaluation of efficacy is performed by co-culturing tumor-specific TCR gene-introduced lymphocytes and patient-derived cancer cells and testing the reactivity. When evaluating safety, the same test is performed using normal cells instead of cancer cells.
  • the “database” refers to an arbitrary database relating to a gene, and particularly refers to a database including a T cell receptor and a B cell receptor repertoire in the present invention.
  • databases include the IMGT (the international ImmunGeneTics information system, www.imgt.org) database, the Japan DNA Databank (DDBJ, DNA Data Bank of Japan, www.ddbj.jp. US Biotechnology Information Center, www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) database, ENA (EMBL (European Institute for Molecular Biology), www.ebi.ac.uk/ena) database, etc. However, it is not limited to this.
  • gene sequence analysis refers to analysis of nucleic acid sequence and / or amino acid sequence constituting a gene. Determination of base or residue, determination of homology, determination of domain, potential function, etc. Any analysis related to the gene is included.
  • T cell receptor is also referred to as a T cell receptor, a T cell antigen receptor, or a T cell antigen receptor.
  • the TCR consisting of the former combination is called ⁇ TCR
  • the TCR consisting of the latter combination is called ⁇ TCR
  • T cells having the respective TCRs are called ⁇ T cells and ⁇ T cells. It is structurally very similar to the Fab fragment of an antibody produced by B cells and recognizes antigen molecules bound to MHC molecules.
  • TCR Since the TCR gene of a mature T cell has undergone gene rearrangement, one individual has a variety of TCRs and can recognize various antigens.
  • the TCR further binds to an invariable CD3 molecule present in the cell membrane to form a complex.
  • CD3 has an amino acid sequence called ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) in the intracellular region, and this motif is considered to be involved in intracellular signal transduction.
  • ITAM immunoimmunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • Each TCR chain is composed of a variable part (V) and a constant part (C), and the constant part penetrates through the cell membrane and has a short cytoplasmic part.
  • the variable region exists outside the cell and binds to the antigen-MHC complex.
  • the variable region has three regions called hypervariable regions or complementarity determining regions (CDRs), and these regions bind to the antigen-MHC complex.
  • the three CDRs are called CDR1, CDR2 and CDR3, respectively.
  • CDR1 and CDR2 bind to MHC
  • CDR3 binds to an antigen.
  • TCR gene rearrangement is similar to the process of the B cell receptor known as immunoglobulin. In the gene rearrangement of ⁇ TCR, first, VDJ rearrangement of ⁇ chain is performed, and then VJ rearrangement of ⁇ chain is performed.
  • the ⁇ chain gene When the ⁇ chain is rearranged, the ⁇ chain gene is deleted from the chromosome, so that T cells having ⁇ TCR do not have ⁇ TCR at the same time.
  • this TCR-mediated signal suppresses ⁇ -chain expression, so that T cells having ⁇ TCR do not have ⁇ TCR at the same time.
  • B cell receptor is also called a B cell receptor, a B cell antigen receptor, or a B cell antigen receptor, and Ig ⁇ / Ig ⁇ associated with a membrane-bound immunoglobulin (mIg) molecule ( CD79a / CD79b) refers to those composed of heterodimers ( ⁇ / ⁇ ).
  • the mIg subunit binds to the antigen and causes receptor aggregation, while the ⁇ / ⁇ subunit transmits a signal into the cell. Aggregation of BCR is said to rapidly activate Src family kinases Lyn, Blk, and Fyn, similar to tyrosine kinases Syk and Btk.
  • the complexity of BCR signaling produces many different results, including survival, tolerance (anergy; lack of hypersensitivity to antigen) or apoptosis, cell division, differentiation into antibody-producing cells or memory B cells, etc. Is included.
  • Hundreds of millions of T cells with different TCR variable region sequences are generated, and hundreds of millions of B cells with different BCR (or antibody) variable region sequences are generated.
  • the antigen specificity of T cells and B cells can be determined by determining the TCR / BCR genomic sequence or mRNA (cDNA) sequence. You can get a clue.
  • V region refers to the variable region (V) region of the variable region of the TCR chain or BCR chain.
  • D region refers to the D region of the variable region of the TCR chain or BCR chain.
  • J region refers to a J region region of a variable region of a TCR chain or a BCR chain.
  • C region refers to a constant region (C) region of a TCR chain or a BCR chain.
  • variable region repertoire refers to a set of V (D) J regions arbitrarily created by gene rearrangement by TCR or BCR. Although it is used in idioms such as TCR repertoire and BCR repertoire, these may be referred to as T cell repertoire, B cell repertoire and the like.
  • T cell repertoire refers to a collection of lymphocytes characterized by expression of a T cell receptor (TCR) that plays an important role in antigen recognition. Because changes in T cell repertoires provide a significant indicator of immune status in physiological and disease states, T cell repertoire analysis identifies antigen-specific T cells involved in disease development and T lymphocyte abnormalities Has been done for diagnosis.
  • variable regions by fluorescence activated cell sorter analysis using a larger panel of antibodies specific for TCR variable regions (van den Beemd Ret al. (2000) Cytometry 40: 336-345; MacIsaac C et al. ( 2003) J Immunol Methods283: 9-15; Tembhare P et al. (2011) Am J Clin Pathol 135: 890-900; Langerak AWet al. (2001) Blood 98: 165-173), polymerase chain using multiple primers Reaction (PCR) (Rebai N et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91: 1529-1533) or PCR-based enzyme-linked immunosorbent assay (Matsutani T et al.
  • quantitative analysis refers to quantitative analysis, and in the present invention, repertoire analysis refers to analysis in a format that reflects the amount originally present in each clone.
  • sample can include components derived from the subject (body fluids such as blood), but is not limited thereto.
  • complementary DNA refers to DNA that forms a complementary strand with respect to RNA contained in a target nucleic acid molecule, for example, an RNA sample derived from a target cell.
  • double-stranded complementary DNA refers to DNAs that are complementary to each other and form a double strand.
  • a complementary DNA that forms a complementary strand with respect to RNA contained in an RNA sample or the like derived from a target cell can be generated as a template.
  • the “common adapter primer sequence” means any sequence in the adapter-added double-stranded complementary DNA used as a primer in the first PCR amplification reaction and the second PCR amplification reaction of the present invention. Also refers to the sequence of commonly added portions.
  • adaptive-added double-stranded complementary DNA is DNA used as a primer in the first PCR of the present invention, and is a common adapter for various double-stranded complementary DNAs in a sample.
  • a primer sequence is added. Used as a template in the first primer amplification reaction.
  • the “common adapter primer” is DNA used as a primer in the first PCR reaction and the second PCR amplification reaction of the present invention, and a single common sequence is used for each reaction. Say what you can.
  • the “first TCR or BCR C region-specific primer” is a primer used in the first PCR amplification reaction of the present invention, and is a sequence specific to the C region of TCR or BCR.
  • FIG. 18 shows an example of a TRAC-possible primer setting region in the upper part (the target sequence is an artificially spliced functional TRAC exon region sequence. It consists of exons EX1, EX2, and EX3, and is a primer over the entire length. Setting is possible.)
  • An example of a possible primer setting region of TRBC is shown in the lower row (the target sequence is an artificially spliced functional TRBC exon region sequence. It consists of exons EX1, EX2, EX3 and EX4.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR can be set to the 5 ′ end side of the most complementary DNA, and once the C region specific primer of the first TCR or BCR is set, The C region specific primer of the second TCR or BCR can be set downstream. Further, once a third TCR or BCR C region specific primer is set, a third TCR or BCR C region specific primer can be set. That is, when the first setting is made, the second is downstream, and the third is further downstream. Theoretically, it is understood that it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • FIG. 19 shows an example of a possible primer setting region of TRGC in the upper row (the target sequence is an artificially spliced functional TRGC exon region sequence. It consists of exons EX1, EX2 and EX3 and covers the entire length. Primer setting is possible.)
  • An example of a possible primer setting region of TRDC is shown in the bottom row (the target sequence is an exon region sequence of a functionally spliced functional TRDC. It consists of exons EX1, EX2 and EX3, and allows primer setting over the entire length.
  • the first TCR or BCR C region-specific primer can be set at the 5 ′ end of the most complementary DNA, and once the first TCR or BCR C region-specific primer is set.
  • the C region specific primer of the second TCR or BCR can be set downstream. Further, once a third TCR or BCR C region specific primer is set, a third TCR or BCR C region specific primer can be set. That is, when the first setting is made, the second is downstream, and the third is further downstream. Theoretically, it is understood that it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • FIG. 20 shows an example of a possible primer setting region of IGHM (the target sequence is an artificially spliced functional IGHM exon region sequence. It consists of exons CH1, CH2, CH3 and CH4. Primer setting is possible.)
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR can be set to the 5 ′ end side of the most complementary DNA, and once the C region specific primer of the first TCR or BCR is set, The C region specific primer of the second TCR or BCR can be set downstream. Further, once a third TCR or BCR C region specific primer is set, a third TCR or BCR C region specific primer can be set. That is, when the first setting is made, the second is downstream, and the third is further downstream. Theoretically, it is understood that it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • FIG. 21 shows an example of a possible primer setting region of IGHA (the target sequence is an artificially spliced functional IGHA exon region sequence.
  • Secretion types are exons CH1, H, CH2, CH3 and CH.
  • -S the membrane-bound type is composed of CH1, H, CH2, CH3, M1 and M2, all of which can be set with primers over the entire length.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR can be set to the 5 ′ end side of the most complementary DNA, and once the C region specific primer of the first TCR or BCR is set, The C region specific primer of the second TCR or BCR can be set downstream.
  • a third TCR or BCR C region specific primer can be set. That is, when the first setting is made, the second is downstream, and the third is further downstream. Theoretically, it is understood that it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • FIG. 22 shows an example of a possible primer setting region of IGHG (the target sequence is an artificially spliced functional IGHG exon region sequence.
  • Secretion types are exons CH1, H (H1, H2, H3). , H4), CH2, CH3 and CH-S, and the membrane-bound type is CH1, H (H1, H2, H3, H4), CH2, CH3, M1 and M2, all of which can be set with primers over the entire length. ).
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR can be set to the 5 ′ end side of the most complementary DNA, and once the C region specific primer of the first TCR or BCR is set, The C region specific primer of the second TCR or BCR can be set downstream.
  • a third TCR or BCR C region specific primer can be set. That is, when the first setting is made, the second is downstream, and the third is further downstream. Theoretically, it is understood that it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • FIG. 23 shows examples of possible primer setting regions of IGHD (the target sequence is an artificially spliced functional IGHD exon region sequence.
  • Secretion types are exons CH1, H1, H2, CH2, CH3.
  • CH—S the membrane-bound type is composed of CH1, H1, H2, CH2, CH3, M1 and M2, all of which can be set with primers over the entire length.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR can be set to the 5 ′ end side of the most complementary DNA, and once the C region specific primer of the first TCR or BCR is set, The C region specific primer of the second TCR or BCR can be set downstream.
  • a third TCR or BCR C region specific primer can be set. That is, when the first setting is made, the second is downstream, and the third is further downstream. Theoretically, it is understood that it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • FIG. 24 shows an example of a possible primer setting region of IGHE (the target sequence is an artificially spliced functional IGHE exon region sequence.
  • Secretion types are exon CH1, exon CH2, exon CH3 and CH.
  • -S the membrane-bound type consists of CH1, exon CH2, exon CH3, M1 and M2, all of which can be set as primers.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR can be set to the 5 ′ end side of the most complementary DNA, and once the C region specific primer of the first TCR or BCR is set, The C region specific primer of the second TCR or BCR can be set downstream.
  • a third TCR or BCR C region specific primer can be set. That is, when the first setting is made, the second is downstream, and the third is further downstream. Theoretically, it is understood that it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • FIG. 25 shows an example of a primer setting region capable of IGKC in the upper row (the target sequence is a functional IGKC CL sequence. Primer setting is possible over the entire length).
  • An example of a primer setting region capable of IGLC is shown in the lower part (the target sequence is a functional IGLC CL sequence. Primer setting is possible over the entire length).
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR can be set to the 5 ′ end side of the most complementary DNA, and once the C region specific primer of the first TCR or BCR is set, The C region specific primer of the second TCR or BCR can be set downstream. Further, once a third TCR or BCR C region specific primer is set, a third TCR or BCR C region specific primer can be set. That is, when the first setting is made, the second is downstream, and the third is further downstream. Theoretically, it is understood that it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR has the following structure: CM1 (SEQ ID NO: 5), CA1 (SEQ ID NO: 8), CG1 (SEQ ID NO: 11), CD1 for BCR Examples of (SEQ ID NO: 14), CE1 (SEQ ID NO: 17), and TCR include CA1 (SEQ ID NO: 35) and CB1 (SEQ ID NO: 37), but are not limited thereto.
  • such primer sequences can be set within the following ranges, but are not limited thereto, and the first, second, and third ranges can be set over the entire range, but determined mutually. can do.
  • TCR ⁇ sequence base number 213 to base number 235 of SEQ ID NO: 1376 (FIG. 18)
  • TCR ⁇ sequence base number 278 to base number 300 of SEQ ID NO: 1377 (FIG. 18)
  • TCR ⁇ sequence base number 184 to base number 201 of SEQ ID NO: 1378 (FIG. 19)
  • TCR ⁇ sequence base number 231 to base number 249 of SEQ ID NO: 1379 (FIG. 19)
  • BCR IgM heavy chain sequence base number 77 to base number 95 of SEQ ID NO: 1380 (FIG. 20)
  • BCR IgA heavy chain sequence base number 189 to base number 208 of SEQ ID NO: 1381 (FIG.
  • IgG heavy chain sequence of BCR base number 262 to base number 282 of SEQ ID NO: 1382
  • BCR IgD heavy chain sequence base number 164 to base number 183 of SEQ ID NO: 1383
  • BCR IgE heavy chain sequence base number 182 to base number 199 of SEQ ID NO: 1384
  • BCR Ig ⁇ chain constant region sequence base number 230 to base number 248 of SEQ ID NO: 1385
  • BCR Ig ⁇ chain sequence base number 273 to base number 291 of SEQ ID NO: 1386 (FIG. 25).
  • specific binds to a sequence of interest, but binds to other sequences at least in all TCR or BCR sequences present, preferably in a pool of TCR or BCR of interest. Is low, preferably not bound.
  • the specific sequence is preferably, but not necessarily limited to, perfectly complementary to the sequence of interest.
  • “sufficiently specific (to the target C region)” means having sufficient specificity to perform a gene amplification reaction.
  • the same sequence as the target C region is advantageous, but not necessarily limited thereto.
  • the “first PCR amplification reaction” is a PCR amplification reaction performed in the first stage in the method for preparing a sample of the present invention.
  • “having no homology with other gene sequences” means that the gene has no homology with a sequence other than the target sequence (for example, the target C region of TCR or BCR) to the extent that no gene amplification reaction occurs. Say low.
  • “including a mismatched base downstream (between subtypes)” means that a mismatched base is included between subtypes downstream of a sequence when set as a primer.
  • the “second TCR or BCR C region-specific primer” is a primer used in the second PCR amplification reaction of the present invention, and is a sequence specific to the C region of TCR or BCR.
  • a primer containing The second TCR or BCR C region specific primer has a sequence perfectly matched to the C region of the TCR or BCR in a sequence downstream from the sequence of the first TCR or BCR C region specific primer. It is designed to include a sequence having no homology to the gene sequence of and to include mismatched bases between subtypes downstream when amplified.
  • CM2 SEQ ID NO: 6
  • CA2 SEQ ID NO: 9
  • CG2 SEQ ID NO: 12
  • CD2 SEQ ID NO: 15
  • CE2 SEQ ID NO: 18
  • CA2 sequence ID for TCR No. 36
  • CB2 SEQ ID NO: 38
  • primer sequences can be set within the following ranges, but are not limited thereto, and the first, second, and third ranges can be set over the entire range, but determined mutually. can do. That is, when the first setting is made, the second is downstream, the third is further downstream, and theoretically, it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • TCR ⁇ sequence base number 146 to base number 168 of SEQ ID NO: 1376 (FIG. 18)
  • T ⁇ ⁇ sequence base number 205 to base number 227 of SEQ ID NO: 1377 (FIG. 18)
  • T ⁇ gamma sequence SEQ ID NO: 1378 (FIG. 19) base number 141 to base number 160
  • TCR ⁇ sequence base number 135 to base number 155 of SEQ ID NO: 1379
  • BCR IgM heavy chain sequence base number 43 to base of SEQ ID NO: 1380 (Fig. 20) No. 62
  • BCR IgA heavy chain sequence base number 141 to base number 161 of SEQ ID NO: 1381 (FIG.
  • BCR IgG heavy chain sequence base number 163 to base number 183 of SEQ ID NO: 1382 (FIG. 22) IgD heavy of BCR Chain sequence: base number 125 to base number 142 of SEQ ID NO: 1383 (FIG. 23) BCR IgE heavy chain sequence: SEQ ID NO: 1384 (FIG. 24) base number 155 to base number 173 BCR Ig ⁇ chain constant region sequence: SEQ ID NO: 1385 (FIG. 25) base number 103 to base number 120 BCR Ig ⁇ chain sequence: SEQ ID NO: 1386 (FIG. 25) Base number 85 to base number 100.
  • the “second PCR amplification reaction” refers to a PCR amplification reaction that is performed using the product as a template after the first PCR reaction in the sample production for the analysis of the present invention. ) A reaction that takes place in the form.
  • a common adapter primer and a second TCR or BCR C region-specific primer are used.
  • the C region specific primer of the second TCR or BCR has a perfect match sequence with the C region of the TCR or BCR in a sequence downstream from the sequence of the C region specific primer of the first TCR or BCR. Is designed to contain sequences that are not homologous to other gene sequences and, when amplified, contain mismatched bases between subtypes downstream.
  • the “third PCR amplification reaction” is a PCR amplification reaction that is performed using the product as a template after the second nested PCR reaction in the sample production for the analysis of the present invention.
  • the third PCR amplification reaction includes an additional common adapter primer containing the first additional adapter nucleic acid sequence in the nucleic acid sequence of the common adapter primer and a second additional adapter using the product after the second nested PCR reaction as a template. It is made using a third TCR or BCR C region-specific primer with an adapter in which a nucleic acid sequence and a molecular identification sequence (MID Tag sequence) are added to the C region specific sequence of the third TCR or BCR.
  • MID Tag sequence molecular identification sequence
  • the C region-specific primer of the third TCR or BCR with an adapter may contain a sequence for confirming the nucleic acid sequence position called a key sequence.
  • Adapter B SEQ ID NO: 1375) -TAATACGACTCCGAATTCCC can be used
  • a third TCR or BCR C region-specific primer with an adapter for example, Adapter A (SEQ ID NO: 39) -key (TCAG) -MID1- (SEQ ID NO: 40) AAAGGGTTGGGGCGGAGC (SEQ ID NO: 1387) (primer is SEQ ID NO: 7), Adapter A (SEQ ID NO: 39) -key (TCAG) -MID2 (sequence No.
  • the “first additional adapter nucleic acid sequence” is a sequence added to the primer used in the third PCR amplification reaction of the present invention, and is used by adding to the nucleic acid sequence of the common adapter primer. Is an array.
  • the first additional adapter nucleic acid sequence and the second additional adapter nucleic acid sequence may be different or the same.
  • this nucleic acid sequence includes DNA capture bead binding and emPCR reaction (for example, Chee-Seng, Ku; En Yun, Loy; Yudi, Pawitan; and Kee-Seng, Chia. Next Generation Sequencing Technologies and Their Applications. In: Encyclopedia of Life Sciences (ELS). John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.
  • the “second additional adapter nucleic acid sequence” is a sequence added to a primer used in the third PCR amplification reaction of the present invention, and a molecular identification sequence (for example, ( MID Tag sequence)) and / or key sequence, and added to the third TCR or BCR C region specific sequence to construct a third TCR or BCR C region specific primer with adapter It is an array to do.
  • the second additional adapter nucleic acid sequence and the second additional adapter nucleic acid sequence may be different or the same.
  • the nucleic acid sequence is a sequence suitable for emPCR reaction, and any sequence may be used as long as it has such characteristics. Specifically, CCATCTCATCCCTGCGTGTCCGCAC (SEQ ID NO: 39) is used, but is not limited thereto.
  • the “key sequence” used in the present specification is a sequence added to a primer used in the third PCR amplification reaction of the present invention, and a molecular identification sequence (for example, (MID Tag Sequence)), and is added to the third TCR or BCR C region-specific sequence to constitute a third TCR or BCR C region-specific primer with an adapter.
  • a molecular identification sequence for example, (MID Tag Sequence)
  • TCAG 4-base key sequence
  • the “molecular identification (MID Tag) sequence is a sequence for imparting uniqueness so that an amplification product can be identified. Therefore, it is preferably different from the target sequence.
  • examples of such sequences include, but are not limited to, those of SEQ ID NOS: 1325 to 1374. Criteria for identification sequences (tag sequences) and representative examples thereof That is, the tag sequence determination criteria will be described below.
  • a tag sequence is a base sequence added to identify each sample when a plurality of samples are mixed and sequenced simultaneously.
  • One tag sequence is associated with reads from one sample, and the acquired read sequence is assigned to which sample. It is an arbitrary sequence of four types of A, C, G, and T.
  • the base sequence length is preferably 2 to 40 bases, more preferably 6 to 10 bases, including a continuous sequence (AA, CC, GG, TT).
  • Typical tags that can be used herein are as follows: ACGAGTGGT (SEQ ID NO: 1325), ACGTCTCGACA (SEQ ID NO: 1326), AGAGCCGACTC (SEQ ID NO: 1327), AGCACTGTTAG (SEQ ID NO: 1) No.
  • ACACAGTGCGGT SEQ ID NO: 1370
  • ACGATCTGCGGT SEQ ID NO: 1371
  • AGAGACGGAGT SEQ ID NO: 1372
  • ACTCGTAGAGT SEQ ID NO: 1373
  • ACGACGGGGAGT SEQ ID NO: 1374
  • the “third TCR or BCR C region-specific sequence” is a sequence specific to the C region of the TCR or BCR, the first TCR or BCR C region specific sequence and the It is a sequence existing downstream of the C region specific sequence of 2 TCRs or BCRs. This is the sequence used to construct the third TCR or BCR C region specific primer.
  • CM3-GS CM3-GS
  • CA3-GS CA3-GS
  • CD3-GS SEQ ID NO: 1390
  • CE3-GS CE3-GS
  • TCR TCR in Table 6 in HuVaF and HuVbF Specific sequences
  • such a primer sequence can be specifically set in the following ranges, but is not limited thereto, the first, second, and third ranges can be set in the entire range, It can be determined mutually. That is, when the first setting is made, the second is downstream, the third is further downstream, and theoretically, it is only necessary to be downstream by the length of the primer.
  • TCR ⁇ sequence of TCR base number 51 to base number 73 of SEQ ID NO: 1376 (FIG. 18)
  • TCR ⁇ sequence base number 69 to base number 91 of SEQ ID NO: 1377 (FIG. 18)
  • TCR ⁇ sequence base number 34 to base number 53 of SEQ ID NO: 1378 (FIG. 19)
  • TCR ⁇ sequence base number 61 to base number 78 of SEQ ID NO: 1379 (FIG. 19)
  • BCR IgM heavy chain sequence base number 7 to base number 25 of SEQ ID NO: 1380 (FIG. 20)
  • BCR IgA heavy chain sequence base number 115 to base number 134 of SEQ ID NO: 1381 (FIG.
  • IgG heavy chain sequence of BCR base number 109 to base number 129 of SEQ ID NO: 1382
  • BCR IgD heavy chain sequence base number 78 to base number 96 of SEQ ID NO: 1383
  • BCR IgE heavy chain sequence base number 45 to base number 64 of SEQ ID NO: 1384
  • BCR Ig ⁇ chain constant region sequence base number 75 to base number 92 of SEQ ID NO: 1385
  • BCR Ig ⁇ chain sequence base number 52 to base number 69 of SEQ ID NO: 1386 (FIG. 25) (this SEQ ID NO is also used for CM).
  • third TCR or BCR C region-specific primer refers to a primer used in the third PCR amplification reaction of the present invention, which is specific to the second TCR or BCR C region. Including a sequence having a perfect match in the C region of the TCR or BCR in the sequence downstream from the sequence of the target primer but not homologous to other gene sequences, and when amplified, between subtypes downstream Designed to contain mismatched bases. Furthermore, an adapter sequence, a key sequence and an identification sequence are further included.
  • CM3-GS SEQ ID NO: 7
  • CA3-GS SEQ ID NO: 10
  • CG3-GS SEQ ID NO: 13
  • CD3-GS SEQ ID NO: 16
  • CE3-GS SEQ ID NO: 19
  • isotype refers to types that belong to the same type in IgM, IgA, IgG, IgE, IgD, etc., but have different sequences. Isotypes are displayed using various gene abbreviations and symbols.
  • the “subtype” is a type within the types existing in IgA and IgG in the case of BCR, and IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 is present for IgG, and IgA1 or IgA2 is present for IgA.
  • TCR is also known to exist in ⁇ and ⁇ chains, and TRBC1 and TRBC2 or TRGC1 and TRGC2 exist, respectively.
  • perfect match means 100% identity when sequences are compared.
  • “completely match all C region allele sequences of the same isotype” means that all sequences match when C region allele sequences belonging to the same isotype are aligned. Since the C region sequences are not all the same even in the same isotype, using a sequence that completely matches all the C region allele sequences of the same isotype, the isotype is immediately determined when the amplification product is sequenced. It is advantageous to determine.
  • “difficult to form homodimer and intramolecular hairpin structure” means that a dimer is formed for pairing with a complementary strand or the like with respect to a state of a nucleic acid molecule, particularly a common adapter primer, A sequence that hardly forms a hairpin structure or the like due to pairing with a complementary strand.
  • the term “difficult to remove” allows, for example, the degree to which homodimers and hairpins do not substantially affect the subsequent analysis. For example, 10% or less, 5% or less, 1% or less, 0.5% % Or less, 0.1% or less, 0.05% or less, or 0.01% or less.
  • “does not take a homodimer and an intramolecular hairpin structure” means that a nucleic acid molecule state, particularly a common adapter primer, forms a dimer for pairing with a complementary strand, etc.
  • Such sequences are known in the art (SantaLucia, J. Proc Natl Acad Sci US A, 95 (4): 1460-1465. (1998), Bombarito et al., Nucleic Acids Res, 28 (9 ): 1929-1934. (2000), SantaLucia, J. Proc Natl Acad Sci U S A, 95 (4): 1460-1465.
  • a structure that “can stably form a double strand” refers to a structure in which a nucleic acid molecule, particularly a common adapter primer, forms a double strand with other nucleic acid molecules such as a template stably. Is formed. Such stability can be evaluated mainly by temperature, pH, melting temperature (Tm) calculated from the base composition, pHm, and structure stabilization energy ( ⁇ G 37 ° C. ). Such sequences are known in the art (Santa Lucia, J. Proc Natl Acad Sci USA, 95 (4): 1460-1465. (1998), Bommarito et al., Nucleic Acids Res, 28 (9) : 1929-1934. (2000), Santa Lucia, J.
  • not having high homology refers to nucleic acid molecules, in particular, common adapter primers.
  • characteristics such as not having high homology with all TCR gene sequences in the database. It means having.
  • the degree of homology is, for example, 80% or less, 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15 % Or less and preferably 10% or less.
  • “same melting temperature (Tm)” means that the DNA melting temperature (Tm) of the primer or sequence used is substantially the same. This is a preferable condition for appropriately performing the PCR amplification reaction.
  • “Same degree” means Tm within ⁇ 15 ° C, within ⁇ 14 ° C, within ⁇ 13 ° C, within ⁇ 12 ° C, within ⁇ 11 ° C, within ⁇ 10 ° C, within ⁇ 9 ° C, within ⁇ 8 ° C, ⁇ It can be within 7 ° C, within ⁇ 6 ° C, within ⁇ 5 ° C, within ⁇ 4 ° C, within ⁇ 3 ° C, within ⁇ 2 ° C, within ⁇ 1 ° C, within ⁇ 0.5 ° C.
  • appropriate base length for amplification refers to a length appropriate for the amplification reaction for the primer or sequence used. Such a length can be obtained by, for example, a commercially available computer program or the like (CLC Main Workbench or Primer 3) used in the examples, and the following documents can be referred to: Santa Lucia, J. Proc Natl Acad Sci US A, 95 (4): 1460-1465. (1998), Bommarito et al., Nucleic Acids Res, 28 (9): 1929-1934. (2000), Santa Lucia, J. Proc Natl Acad Sci U S A, 95 (4): 1460-1465. (1998), and von Ahsen et al., Clin Chem, 47 (11): 1956-11961. (2001)).
  • mismatch means that there are bases that are not identical to each other when gene sequences are aligned.
  • % GC % guanine / cytosine content
  • G guanine
  • C cytosine
  • T thymine
  • U uracil
  • a set corresponding to all subclasses of TCR or BCR means a known subclass of a target TCR or BCR (TRBC1, TRBC2, or TRGC1, TRGC2, etc. for TCR).
  • TCR target TCR or BCR
  • IgG IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4
  • IgA means IgA1 or IgA2, etc.
  • protein protein
  • polypeptide oligopeptide
  • peptide refers to a polymer of amino acids having an arbitrary length.
  • This polymer may be linear, branched, or cyclic.
  • the amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid.
  • the term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is done.
  • amino acid may be natural or non-natural as long as the object of the present invention is satisfied.
  • polynucleotide As used herein, “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a nucleotide polymer of any length. The term also includes “oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives”. “Oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives” refer to oligonucleotides or polynucleotides that include derivatives of nucleotides or that have unusual linkages between nucleotides, and are used interchangeably.
  • oligonucleotide examples include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotide, an oligonucleotide derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide.
  • oligonucleotide derivatives in which ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond uracil in oligonucleotide is C— Oligonucleotide derivatives substituted with 5-propynyluracil, oligonucleotide derivatives wherein uracil in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, cytosine in the oligonucleotide is C-5 propynylcytosine Substituted oligonucleotide derivatives, oligonucleotide derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives in which the ribose in DNA is replaced with 2'-O-
  • a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell .Probes 8: 91-98 (1994)).
  • nucleic acid is also used interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide.
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged in a certain order on the chromosome. A gene that defines the primary structure of a protein is called a structural gene, and a gene that affects its expression is called a regulatory gene. As used herein, “gene” may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid”. A “gene product” is a substance produced based on a gene and refers to a protein, mRNA, and the like.
  • homology of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally “having homology” means that the degree of identity or similarity is high. Say. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes are homologous.
  • a “homolog” or “homologous gene product” is a protein in another species, preferably a mammal, that performs the same biological function as the protein component of the complex further described herein. Means.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by a generally recognized one letter code.
  • BLAST is a sequence analysis tool.
  • the identity search can be performed using, for example, NCBI BLAST 2.2.9 (issued May 12, 2004).
  • the identity value usually refers to a value when the above BLAST is used and aligned under default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is set as the identity value. When identity is evaluated in a plurality of areas, the highest value among them is set as the identity value. Similarity is a numerical value calculated for similar amino acids in addition to identity.
  • polynucleotide hybridizing under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art.
  • a polynucleotide can be obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method or the like using a polynucleotide selected from among the polynucleotides of the present invention as a probe.
  • hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which colony or plaque-derived DNA was immobilized, and then a 0.1 to 2-fold concentration was obtained.
  • a polynucleotide that can be identified by washing the filter under conditions of 65 ° C using an SSC (saline-sodium citrate) solution (composition of a 1-fold concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate).
  • SSC saline-sodium citrate
  • composition of a 1-fold concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate.
  • Hybridization is described in experimental documents such as Molecular Cloning 2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Prac1tical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995). It can be carried out according to the method.
  • the sequence containing only the A sequence or only the T sequence is preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions.
  • a polypeptide (for example, transthyretin) used in the present invention is a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule encoding a polypeptide particularly described in the present invention.
  • the polypeptide encoded by is also encompassed. These low stringency conditions are: 35% formamide, 5 ⁇ SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% polyvinylpyrrolidone (PVP), 0.02% BSA, 100 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA , And 10% (weight / volume) dextran sulfate in buffer solution at 40 ° C.
  • a “purified” substance or biological factor refers to a substance from which at least a part of the factor naturally associated with the biological factor has been removed.
  • the purity of a biological agent in a purified biological agent is higher (ie, enriched) than the state in which the biological agent is normally present.
  • the term “purified” as used herein is preferably at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight, Means the presence of the same type of biological agent.
  • the materials used in the present invention are preferably “purified” materials.
  • a “corresponding” amino acid or nucleic acid has or has the same action as a predetermined amino acid or nucleotide in a reference polypeptide or polynucleotide in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule.
  • a reference polypeptide or polynucleotide in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule in particular, in the case of an enzyme molecule, it means an amino acid that is present at the same position in the active site and contributes similarly to the catalytic activity.
  • an antisense molecule can be a similar part in an ortholog corresponding to a particular part of the antisense molecule.
  • Corresponding amino acids are identified as, for example, cysteinylation, glutathioneation, SS bond formation, oxidation (eg, oxidation of methionine side chain), formylation, acetylation, phosphorylation, glycosylation, myristylation, etc.
  • the corresponding amino acid can be an amino acid responsible for dimerization.
  • Such “corresponding” amino acids or nucleic acids may be a range of regions or domains (eg, V region, D region, etc.). Thus, in such cases, it is referred to herein as a “corresponding” region or domain.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n ⁇ 1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n).
  • the length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose.
  • the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg 11 etc.) are also suitable as lower limits obtain.
  • examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides.
  • Non-integer lengths may also be appropriate as a lower limit.
  • a fragment falls within the scope of the present invention as long as the full-length fragment functions as a marker, as long as the fragment itself also functions as a marker.
  • the term “activity” refers herein to the function of a molecule in the broadest sense. Activities are not intended to be limiting, but generally include the biological function, biochemical function, physical function, therapeutic activity, diagnostic activity or chemical function of a molecule. Activity activates, promotes, stabilizes, inhibits, suppresses, or destabilizes, for example, enzyme activity, the ability to interact with other molecules, and the function of other molecules Ability, stability, and ability to localize to specific intracellular locations. Where applicable, the term also relates to the function of the protein complex in the broadest sense.
  • expression of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo to take another form.
  • a gene, polynucleotide or the like is transcribed and translated into a polypeptide form.
  • transcription and production of mRNA can also be an aspect of expression.
  • polypeptide forms may be post-translationally processed (derivatives as referred to herein).
  • search refers to another nucleic acid having a specific function and / or property using a certain nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods, preferably electronically. This refers to finding the base sequence.
  • Electronic searches include BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444- 2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol.
  • BLAST is typically used.
  • Biological searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, microarrays affixed to glass plates (microarray assays), PCR and in situ hybridization, etc. It is not limited to. In the present specification, it is intended that the gene used in the present invention should include a corresponding gene identified by such an electronic search or biological search.
  • an amino acid sequence having one or more amino acid insertions, substitutions or deletions, or those added to one or both ends can be used.
  • “insertion, substitution or deletion of one or a plurality of amino acids in the amino acid sequence, or addition to one or both ends thereof” means a well-known technical method such as site-directed mutagenesis.
  • site-directed mutagenesis means that the amino acid has been altered by substitution of a plurality of amino acids to the extent that it can occur naturally.
  • the modified amino acid sequence of the molecule is, for example, an insertion or substitution of 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 2, amino acids. Alternatively, it can be deleted or added to one or both ends.
  • the modified amino acid sequence is preferably an amino acid whose amino acid sequence has one or more (preferably one or several or 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions in the amino acid sequence of a molecule such as CD98. It may be an array.
  • conservative substitution means substitution of one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the function of the protein. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • marker refers to a certain state (eg, normal cell state, transformed state, disease state, disordered state, proliferative ability, differentiation state level, presence / absence, etc. ) Or a substance that serves as an indicator for tracking whether there is a danger or not.
  • detection, diagnosis, preliminary detection, prediction or pre-diagnosis for a certain condition is a drug, agent, factor or means specific for the marker associated with the condition, or It can be realized by using a composition, kit or system containing them.
  • a certain condition eg, a disease such as differentiation disorder
  • gene product refers to a protein or mRNA encoded by a gene.
  • the “subject” refers to a target (for example, a human or other organism or an organ or cell taken out from the organism) that is a target of diagnosis or detection of the present invention.
  • sample refers to any substance obtained from a subject or the like, and includes, for example, eye cells. Those skilled in the art can appropriately select a preferable sample based on the description of the present specification.
  • drug drug
  • drug may also be a substance or other element (eg energy such as light, radioactivity, heat, electricity).
  • Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, RNA such as mRNA), poly Saccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (for example, hormones, ligands, signaling substances, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (for example, small molecule ligands, etc.)) , These complex molecules are included, but not limited thereto.
  • a polynucleotide having a certain sequence homology to the sequence of the polynucleotide (for example, 70% or more sequence identity) and complementarity examples include, but are not limited to, a polypeptide such as a transcription factor that binds to the promoter region.
  • Factors specific for a polypeptide typically include an antibody specifically directed against the polypeptide or a derivative or analog thereof (eg, a single chain antibody), and the polypeptide is a receptor.
  • specific ligands or receptors in the case of ligands, and substrates thereof when the polypeptide is an enzyme include, but are not limited to.
  • detection agent refers to any drug that can detect a target object in a broad sense.
  • diagnostic agent refers to any drug capable of diagnosing a target state (for example, a disease) in a broad sense.
  • the detection agent of the present invention may be a complex or a complex molecule in which another substance (for example, a label or the like) is bound to a detectable moiety (for example, an antibody or the like).
  • a detectable moiety for example, an antibody or the like.
  • complex or “complex molecule” means any construct comprising two or more moieties.
  • the other part may be a polypeptide or other substance (eg, sugar, lipid, nucleic acid, other hydrocarbon, etc.).
  • two or more parts constituting the complex may be bonded by a covalent bond, or bonded by other bonds (for example, hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic interaction, van der Waals force, etc.). May be.
  • the “complex” includes a molecule formed by linking a plurality of molecules such as a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a sugar, and a small molecule.
  • interaction refers to two substances. Force (for example, intermolecular force (van der Waals force), hydrogen bond, hydrophobic interaction between one substance and the other substance. Etc.). Usually, two interacting substances are in an associated or bound state.
  • bond means a physical or chemical interaction between two substances or a combination thereof. Bonds include ionic bonds, non-ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, hydrophobic interactions, and the like.
  • a physical interaction can be direct or indirect, where indirect is through or due to the effect of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and does not involve other substantial chemical intermediates. By measuring the binding or interaction, the degree of expression of the marker of the present invention can be measured.
  • a “factor” (or drug, detection agent, etc.) that interacts (or binds) “specifically” to a biological agent such as a polynucleotide or a polypeptide is defined as that
  • the affinity for a biological agent such as a nucleotide or polypeptide thereof is typically equal or greater than the affinity for other unrelated (especially less than 30% identity) polynucleotides or polypeptides. Includes those that are high or preferably significantly (eg, statistically significant). Such affinity can be measured, for example, by hybridization assays, binding assays, and the like.
  • a first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to a second substance or factor means that the first substance or factor has a relationship to the second substance or factor. Interact (or bind) with a higher affinity than a substance or factor other than the second substance or factor (especially other substances or factors present in the sample containing the second substance or factor) That means. Specific interactions (or bindings) for a substance or factor involve both nucleic acids and proteins, for example, ligand-receptor reactions, hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, enzyme-substrate reactions, etc.
  • Examples include, but are not limited to, protein-lipid interaction, nucleic acid-lipid interaction, and the like, such as a reaction between a transcription factor and a binding site of the transcription factor.
  • the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the first substance or factor has the second substance Or having at least a part of complementarity to the factor.
  • both substances or factors are proteins
  • the fact that the first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to the second substance or factor is, for example, by antigen-antibody reaction Examples include, but are not limited to, interaction by receptor-ligand reaction, enzyme-substrate interaction, and the like.
  • the first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to the second substance or factor by the transcription factor and its Interaction (or binding) between the transcription factor and the binding region of the nucleic acid molecule of interest is included.
  • “detection” or “quantification” of polynucleotide or polypeptide expression uses suitable methods, including, for example, mRNA measurement and immunoassay methods, including binding or interaction with marker detection agents. In the present invention, it can be measured by the amount of PCR product.
  • molecular biological measurement methods include Northern blotting, dot blotting, and PCR.
  • immunological measurement methods include ELISA using a microtiter plate, RIA, fluorescent antibody method, luminescence immunoassay (LIA), immunoprecipitation (IP), immunodiffusion method (SRID), immunization. Examples are turbidimetry (TIA), Western blotting, immunohistochemical staining, and the like.
  • Examples of the quantitative method include an ELISA method and an RIA method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (eg, DNA array, protein array).
  • the DNA array is widely outlined in (edited by Shujunsha, separate volume of cell engineering "DNA microarray and latest PCR method”).
  • Examples of gene expression analysis methods include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, in vitro translation and the like.
  • expression level refers to the amount of polypeptide or mRNA expressed in a target cell, tissue or the like. Such expression level is evaluated by any appropriate method including immunoassay methods such as ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western blot method, and immunohistochemical staining method using the antibody of the present invention. The amount of expression of the polypeptide of the present invention at the protein level, or the polypeptide used in the present invention evaluated by any suitable method including molecular biological measurement methods such as Northern blotting, dot blotting, and PCR. The expression level of the peptide at the mRNA level can be mentioned.
  • “Change in expression level” means expression at the protein level or mRNA level of the polypeptide used in the present invention evaluated by any appropriate method including the above immunological measurement method or molecular biological measurement method. Means that the amount increases or decreases. By measuring the expression level of a certain marker, various detection or diagnosis based on the marker can be performed.
  • “decrease” or “suppression” or synonyms for activity, expression products (eg, proteins, transcripts (RNA, etc.)) or a synonym is a decrease in the quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein. Or activity to decrease.
  • an expression product eg, a protein, transcript (such as RNA)
  • a synonym thereof refers to a quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein.
  • the activity of the immune system can be detected and screened using the ability of the marker of the present invention such as decrease, inhibition, increase or activation as an index.
  • “means” refers to any tool that can achieve a certain purpose (for example, detection, diagnosis, treatment).
  • a certain purpose for example, detection, diagnosis, treatment.
  • “means for selective recognition (detection)” means capable of recognizing (detecting) a certain object differently from others.
  • the present invention is useful as an index of the state of the immune system.
  • an indicator of the state of the immune system can be identified and used to know the state of the disease.
  • nucleic acid primer refers to a substance necessary for the initiation of a reaction of a polymer compound to be synthesized in a polymer synthase reaction.
  • a nucleic acid molecule for example, DNA or RNA
  • the primer can be used as a marker detection means.
  • a nucleic acid sequence is preferably at least 12 contiguous nucleotides long, at least 9 contiguous nucleotides, more preferably at least 10 contiguous nucleotides, and even more preferably at least 11 contiguous nucleotides.
  • Nucleic acid sequences used as probes are nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Is included.
  • a sequence suitable as a primer may vary depending on the nature of the sequence intended for synthesis (amplification), but those skilled in the art can appropriately design a primer according to the intended sequence. Such primer design is well known in the art, and may be performed manually or using a computer program (eg, LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar).
  • the primer according to the present invention can also be used as a primer set composed of two or more kinds of the primers.
  • the primer and primer set according to the present invention can be prepared according to conventional methods in known methods for detecting a target gene using a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an in situ PCR method, or a LAMP method. It can be used as a primer and a primer set.
  • a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an in situ PCR method, or a LAMP method. It can be used as a primer and a primer set.
  • the primer set according to the present invention can be selected so that the nucleotide sequence of a target protein such as a T cell receptor molecule can be amplified by a nucleic acid amplification method such as a PCR method.
  • Nucleic acid amplification methods are well known, and selection of primer pairs in nucleic acid amplification methods is obvious to those skilled in the art.
  • one of two primers (primer pair) is paired with a plus strand of a double-stranded DNA of a target protein of a T cell receptor molecule, and the other primer is a minus strand of a double-stranded DNA.
  • the primer can be selected so that the other primer is paired with the extended strand that has been paired with the other and extended with one primer.
  • the primer of the present invention can be chemically synthesized based on the nucleotide sequence disclosed herein. Preparation of the primer is well known, for example, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2 nd ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987-1997)).
  • the term “probe” refers to a substance that serves as a search means used in biological experiments such as screening in vitro and / or in vivo.
  • a nucleic acid molecule containing a specific base sequence or a specific Examples include, but are not limited to, peptides containing amino acid sequences, specific antibodies or fragments thereof.
  • the probe is used as a marker detection means.
  • the detection agent of the present invention may be labeled.
  • the detection agent of the present invention may have a tag bound thereto.
  • the “label” refers to a presence (for example, a substance, energy, electromagnetic wave, etc.) for distinguishing a target molecule or substance from others.
  • a labeling method include RI (radioisotope) method, fluorescence method, biotin method, chemiluminescence method and the like.
  • the labeling is performed with fluorescent substances having different fluorescence emission maximum wavelengths. The difference in the maximum fluorescence emission wavelength is preferably 10 nm or more.
  • Alexa TM Fluor is preferred as the fluorescent substance.
  • Alexa TM Fluor is a water-soluble fluorescent dye obtained by modifying coumarin, rhodamine, fluorescein, cyanine, etc., and is a series corresponding to a wide range of fluorescent wavelengths. Compared with other applicable fluorescent dyes, Stable, bright and low pH sensitive. Examples of combinations of fluorescent dyes having a fluorescence maximum wavelength of 10 nm or more include a combination of Alexa TM 555 and Alexa TM 633, a combination of Alexa TM 488 and Alexa TM 555, and the like. Any nucleic acid can be used as long as it can bind to its base moiety.
  • a cyanine dye eg, CyDye TM series Cy3, Cy5, etc.
  • rhodamine 6G reagent N-acetoxy-N2— Acetylaminofluorene (AAF), AAIF (iodine derivative of AAF) or the like
  • the fluorescent substance having a difference in fluorescence emission maximum wavelength of 10 nm or more include a combination of Cy5 and rhodamine 6G reagent, a combination of Cy3 and fluorescein, a combination of rhodamine 6G reagent and fluorescein, and the like.
  • the target object by using such a label, the target object can be modified so that it can be detected by the detection means used. Such modifications are known in the art, and those skilled in the art can appropriately carry out such methods depending on the label and the target object.
  • a “tag” is a substance for sorting molecules by a specific recognition mechanism such as a receptor-ligand, more specifically, a binding for binding a specific substance.
  • a substance that plays the role of a partner eg, having a relationship such as biotin-avidin, biotin-streptavidin
  • label can be included in the category of “label”.
  • a specific substance to which a tag is bound can be selected by bringing the substrate to which the binding partner of the tag sequence is bound into contact.
  • tags or labels are well known in the art.
  • Representative tag sequences include, but are not limited to, myc tag, His tag, HA, Avi tag and the like. Such a tag may be bound to the marker or marker detection agent of the present invention.
  • test sample may be a sample that is considered to include a target cell or a substance derived from the target cell and capable of gene expression.
  • diagnosis refers to identifying various parameters related to a disease, disorder, or condition in a subject and determining the current state or future of such a disease, disorder, or condition.
  • conditions within the body can be examined, and such information can be used to formulate a disease, disorder, condition, treatment to be administered or prevention in a subject.
  • various parameters such as methods can be selected.
  • diagnosis in a narrow sense means diagnosis of the current state, but in a broad sense includes “early diagnosis”, “predictive diagnosis”, “preliminary diagnosis”, and the like.
  • the diagnostic method of the present invention is industrially useful because, in principle, the diagnostic method of the present invention can be used from the body and can be performed away from the hands of medical personnel such as doctors.
  • diagnosis, prior diagnosis or diagnosis may be referred to as “support”.
  • the prescription procedure as a medicine such as the diagnostic agent of the present invention is known in the art, and is described in, for example, the Japanese Pharmacopoeia, the US Pharmacopoeia, and the pharmacopoeia of other countries. Accordingly, those skilled in the art can determine the amount to be used without undue experimentation as described herein.
  • trimming means removing inappropriate parts in gene analysis. Trimming is performed by deleting a low quality region from both ends of the lead, a partial sequence of the artificial nucleic acid sequence added in the experimental procedure, or both. Trimming is performed using software and literature known in the art (eg, cutadapt http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200/(EMBnet.journal,2011); fastq-mcf Aronesty E., The Open BioinformaticsJournal (2013) 7, 1-8 (DOI: 10.2174 / 1875036201307010001); and fastx-toolkit http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2009)) .
  • trimming removes the low quality region from both ends of the lead; removes the region that matches the adapter sequence by 10 bp or more from both ends of the lead; and the remaining length is 200 bp or more.
  • TCR or more than 300 bp (BCR) is achieved by the step used for analysis as high quality.
  • the “appropriate length” means a length suitable for analysis when performing analysis such as alignment in the gene analysis of the present invention. Such length can be determined, for example, from the sequence determination start position on the C region so as to be not less than a length including 100 bases near the D region on the V region.
  • TCR it may be 200 nucleotides or more, preferably 250 nucleotides or more
  • BCR it may be 300 nucleotides or more, preferably 350 nucleotides or more, but is not limited thereto.
  • the “input sequence set” refers to a set of sequences to be analyzed for TCR or BCR repertoire in the gene analysis of the present invention.
  • gene region refers to each region such as V region, D region, J region and C region. Such a gene region is known in the art and can be appropriately determined in consideration of a database or the like.
  • homology of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally “having homology” means that the degree of identity or similarity is high. Say. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions.
  • homoology search refers to homology search. Preferably, it can be performed in silico using a computer.
  • “approximate” means that the degree of homology is high when homology search is performed.
  • software that performs homology search BLAST, FASTA, etc.
  • it is usually listed in the order of high homology, and therefore it can be approximated by appropriately selecting the ones with high rank.
  • “closest” means that the degree of homology is highest when homology search is performed.
  • homology search is performed by software, the one displayed in the first place is selected.
  • reference allele refers to a reference allele that is hit in the reference database when homology search is performed.
  • alignment is a bioinformatics that is arranged so that regions similar to the primary structure of biomolecules such as DNA, RNA, and protein can be identified, And to line up. Provides clues to know functional, structural, or evolutionary sequence relationships.
  • assignment refers to assigning information such as a specific gene name, function, characteristic region (eg, V region, J region, etc.) to a certain sequence (eg, nucleic acid sequence, protein sequence, etc.). . Specifically, this can be achieved by inputting or linking specific information to a certain array.
  • CDR3 refers to a third complementarity-determining region (CDR), where the CDR is a variable region, and the region directly contacting the antigen is particularly changed. Largely refers to this hypervariable region. There are three CDRs (CDR1 to CDR3) and four FRs (FR1 to FR4) surrounding the three CDRs in the light chain and heavy chain variable regions, respectively. Since the CDR3 region is said to exist across the V region, D region, and J region, it is said to hold the key to the variable region and is used as an analysis target.
  • the top of the CDR3 on the reference V region refers to a sequence corresponding to the top of the CDR3 in the V region targeted by the present invention.
  • end of CDR3 on reference J refers to a sequence corresponding to the end of CDR3 in the J region targeted by the present invention.
  • condition that allow random mutations to be scattered throughout refers to any conditions that result in random mutations being scattered, for example, BLAST / FASTA optimal parameters. It is well expressed with the following conditions: allows up to 33% mismatch over the entire alignment length and allows up to 60% non-matching mismatches for any 30 bp therein.
  • Functional equivalents such as isotypes of molecules such as IgG used in the present invention can be found by searching a database or the like.
  • search refers to another nucleic acid having a specific function and / or property using a certain nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods, preferably electronically. This refers to finding the base sequence.
  • BLAST Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)
  • FASTA Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444- 2448 (1988)
  • Smith and Waterman method Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195-197 (1981)
  • Needleman and Wunsch method Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443). -453 (1970)
  • BLAST is typically used.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, microarrays affixed to glass plates (microarray assays), PCR and in situ hybridization, etc. It is not limited to. In the present specification, it is intended that the gene used in the present invention should include a corresponding gene identified by such an electronic search or biological search.
  • the present invention can adjust samples for quantitative analysis of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using next generation sequencing technology. . These sequencing techniques can obtain 1 million or more leads from a sample at a reasonable cost. Even genotypes present at a frequency of 1 / 1,000,000 or less can be detected in a specific and unbiased manner using these techniques. Unbiased amplification methods are achieved to amplify all different types of sequences of specific portions of genes or transcripts from samples derived from DNA such as blood or bone marrow.
  • the present invention prepares a sample for quantitative analysis of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire by gene sequence analysis using a database.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • Providing a method for In this method (1) a step of synthesizing complementary DNA using an RNA sample derived from a target cell as a template; (2) a step of synthesizing double-stranded complementary DNA using the complementary DNA as a template; A step of adding a common adapter primer sequence to the double-stranded complementary DNA to synthesize an adapter-added double-stranded complementary DNA; (4) from the adapter-added double-stranded complementary DNA and the common adapter primer sequence; A first PCR amplification reaction using a common adapter primer and a first TCR or BCR C region specific primer, wherein the first TCR or BCR C region specific primer comprises: It contains a sequence that is sufficiently specific for the target C region of the TCR or BCR, has no homology to other gene sequences
  • the second TCR or BCR C region specific primer comprises a sequence of the TCR or BCR in a sequence downstream of the first TCR or BCR C region specific primer.
  • the third TCR or BCR C region specific primer is a sequence downstream of the second TCR or BCR C region specific primer in the TCR or BCR sequence.
  • the first addition is designed to include a sequence having a perfect match in the C region of the gene but not homologous to other gene sequences, and to include a mismatched base between subtypes downstream when amplified.
  • the adapter nucleic acid sequence is a sequence suitable for binding to the DNA capture bead and the emPCR reaction
  • the second additional adapter nucleic acid sequence is emPC This is a sequence suitable for the R reaction
  • the molecular identification (MID Tag) sequence includes a step for providing uniqueness so that an amplification product can be identified.
  • the SMART PCR method uses the terminal transferase activity of the reverse transcriptase derived from Moloney MurineLeukemia Virus (MMLV). That is, when the reverse transcriptase reaches the 5 'end of the mRNA that is the template in the complementary strand DNA synthesis reaction, it uses a secondary reaction that mainly adds a C base to the 3' end of the newly synthesized complementary DNA. is doing.
  • MMLV Moloney MurineLeukemia Virus
  • TS oligo By using a primer (TS oligo) having a base sequence (GGG) complementary to the added base (CCC) at the 3 ′ end, the template is changed during the reverse transcription reaction and double-stranded synthesis occurs. Therefore, it is known that TS oligo addition reactions occur continuously and TS oligo concatamers are formed (Villanyi Z, Mai, A, Szabad J. Repeated template switching: Obstacles in cDNA libraries and ways to avoid them The open genomics journal, 2012, 5, 1-6).
  • TS oligo inhibits the progression of polymerase, resulting in bias (Tang DT, Plessy C, Salimullah M , Suzuki AM, Calligaris R, Gustincich S, Carninci P. Suppression of artifacts and barcodes bias in high-throughput transcriptome analyses utilizing template switching.
  • the C region-specific primer when performing quantitative analysis of the BCR variable region repertoire, is present in a target isotype C region selected from the group consisting of IgM, IgA, IgG, IgE, and IgD. It has a sequence that contains a perfect match and has no homology to other C regions.
  • the C region specific primer is a sequence that, for IgA or IgG, perfectly matches a subtype that is either IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, or either IgA1 or IgA2.
  • the C region-specific primer when performing quantitative analysis of the repertoire of the variable region of TCR, is a target strand selected from the group consisting of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain. A sequence that perfectly matches the C region and has no homology to other C regions.
  • the C region-specific primer preferably selects a sequence portion that completely matches all C region allele sequences of the same isotype in the database. By selecting such a perfect match, a highly accurate analysis can be performed.
  • the common adapter primer is designed so that homodimer and intramolecular hairpin structures are difficult to form and can form a stable double strand, and is not highly homologous to all TCR gene sequences in the database. And it is designed to have the same Tm as the C region specific primer.
  • Examples of such common adapter primer sequences include TAATACGACTCCGAATTCCC (SEQ ID NO: 2), GGGAATTCGG (P10EA; SEQ ID NO: 3), and the like.
  • the common adapter primer is selected so as not to have a homodimer and an intramolecular hairpin structure, and has no homology to other genes including BCR or TCR.
  • Examples of such common adapter primer sequences include P20EA, P10EA, and the like.
  • the common adapter primer is P20EA and / or P10EA, and the sequences thereof are TAATACGACTCCGAATTTCCC (P20EA; SEQ ID NO: 2), GGGATTTCGG (P10EA; SEQ ID NO: 3).
  • the first, second and third TCR or BCR C region specific primers are each independently for BCR repertoire analysis, and include IgM, IgG, IgA, IgD, Or a sequence that perfectly matches each isotype C region of IgE, and in the case of IgG and IgA, it is a sequence that also perfectly matches subtypes and has no homology to other sequences contained in the database,
  • the common adapter primer sequence is selected so as to contain mismatched bases between subtypes downstream of the primer, the base length is suitable for amplification, and it is difficult to take homodimer and intramolecular hairpin structures.
  • sequences include, but are not limited to, P20EA (TAATACGACTCCGAATTCCC (SEQ ID NO: 2)) and P10EA (GGGAATTCGG (SEQ ID NO: 3)).
  • the first, second and third TCR C region specific primers are each independently for TCR repertoire analysis, each primer comprising one alpha chain (TRAC).
  • TRBC01, TRBC02 two types of ⁇ chains
  • TRGC1, TRGC2 two types of ⁇ chains
  • TRDC1 one type of ⁇ chain
  • the common adapter primer sequence has a base length suitable for amplification, and is selected to include a mismatched base between subtypes downstream of the primer. Designed so that the inner hairpin structure is difficult to form and can form a stable double strand, homology with all TCR gene sequences in the database Not high, and is designed to be the Tm of the same extent as the C region-specific primers. Examples of such sequences include, but are not limited to, P20EA (TAATACGACTCCGAATTCCC (SEQ ID NO: 2)) and P10EA (GGGAATTCGG (SEQ ID NO: 3)).
  • the third TCR or BCR C region-specific primer is set to a region of about 150 bases from the C region 5 ′ end, and the first TCR or BCR C region-specific primer and Two TCR or BCR C region-specific primers are set between the C region 5 ′ end and about 300 bases.
  • the first, second and third TCR or BCR C region-specific primers are each independently for quantitative BCR analysis, and the five isotype sequences include Designed separately with specific primers, perfectly matched to the target sequence and designed to ensure a mismatch of 5 bases or more for other isotypes and similar IgG subtypes (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) Alternatively, for IgA subtypes (IgA1, IgA2), each subtype is designed to be a perfect match so that it can be handled with one primer.
  • the primer design parameters are set to a base sequence length of 18-22 bases, a melting temperature of 54-66 ° C., and% GC (% guanine / cytosine content) of 40-65%.
  • These preferable values such as the base sequence length may vary depending on the model, but those skilled in the art can appropriately set them depending on the model.
  • the conditions of the method for determining the sequence of the C region specific primer of the first, second and third TCR or BCR include the following. 1. 1. Incorporate a plurality of subtype sequences and / or allele sequences into base sequence analysis software and align them; Search for multiple primers that satisfy the parameter conditions in the C region using the primer design software; select a primer in a region without mismatched bases in the alignment sequence of 3.1; according to 4.3 Confirm that there are multiple mismatched sequences for each subtype and / or allele downstream of the determined primer, and if not, search for the primer further upstream and repeat this as necessary.
  • the C region specific primer of the first TCR or BCR is up to 41-300 bases relative to the first base of the first codon of the C region sequence resulting from splicing up to the C of the second TCR or BCR.
  • Region-specific primers are up to 21-300 bases based on the first base
  • C region-specific primers of the third TCR or BCR are within 150 bases based on the first base
  • subtypes and / or alleles It is set at a position including the non-matching part.
  • the first TCR or BCR C region specific primer has the following structure: CM1 (SEQ ID NO: 5), CA1 (SEQ ID NO: 8), CG1 (SEQ ID NO: 11), CD1 (SEQ ID NO: 14), CE1 (SEQ ID NO: 17), CA1 (SEQ ID NO: 35), CB1 (SEQ ID NO: 37) and the like, but are not limited thereto.
  • the second TCR or BCR C region specific primer has the following structure: CM2 (SEQ ID NO: 6), CA2 (SEQ ID NO: 9), CG2 (SEQ ID NO: 12), CD2 (SEQ ID NO: 15), CE2 (SEQ ID NO: 18), CA2 (SEQ ID NO: 35), CB2 (SEQ ID NO: 37) and the like, but are not limited thereto.
  • the third TCR or BCR C region specific primer has the following structure: CM3-GS (SEQ ID NO: 7), CA3-GS (SEQ ID NO: 10), CG3-GS (SEQ ID NO: 13 ), CD3-GS (SEQ ID NO: 16) or CE3-GS (SEQ ID NO: 19).
  • all of the TCR or BCR C region specific primers are provided in sets corresponding to all subclasses of TCR or BCR.
  • the specific sequences are as follows: CM1 (SEQ ID NO: 5), CA1 (SEQ ID NO: 8), CG1 (SEQ ID NO: 11), CD1 (SEQ ID NO: 14), CE1 (SEQ ID NO: 17), CM2 (SEQ ID NO: 6), CA2 (SEQ ID NO: 9), CG2 (SEQ ID NO: 12), CD2 (SEQ ID NO: 15), CE2 (SEQ ID NO: 18), CM3-GS (SEQ ID NO: 7), CA3-GS (SEQ ID NO: 10), CG3-GS ( SEQ ID NO: 13), CD3-GS (SEQ ID NO: 16) or CE3-GS (SEQ ID NO: 19), CA1 (SEQ ID NO: 35), CB1 (SEQ ID NO: 37), CA2 (SEQ ID NO: 35), CB2 (SEQ ID NO: 37)
  • the present invention provides a method for performing gene analysis using a sample produced by the method of the present invention.
  • the gene analysis can be performed using any analysis method.
  • V, D, J obtained from the well-known IMGT (the international ImMgeneTics information system, http://www.imgt.org) database.
  • IMGT the international ImMgeneTics information system, http://www.imgt.org
  • new software Repetoire Genesis
  • the gene analysis is a quantitative analysis of a repertoire of a variable region of a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR).
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • a method for determining the profile of recombinant DNA sequences in T cells and / or B cells. The method can include the steps of isolating a sample from the subject, including one or more rounds of nucleic acid amplification, spatially isolating individual nucleic acids, and sequencing the nucleic acids.
  • a method for determining the correlation of one or more repertoires in a subject or individual is provided.
  • a method is provided for developing an algorithm that can predict the correlation of one or more repertoires in any sample from a subject having a disease.
  • an algorithm that can predict the correlation of one or more repertoires in any sample derived from a subject is used to discover the correlation of one or more repertoires of an individual Providing a method for
  • a method is provided for creating an algorithm for calculating a disease activity score.
  • a method for monitoring an individual's disease state is provided.
  • the present invention provides bioinformatics for quantitative analysis of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using next generation sequencing technology.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the present invention is a method for analyzing TCR or BCR repertoire, which comprises the following steps: (1) a gene comprising at least one of a V region, a D region, a J region, and optionally a C region Step of providing a reference database for each area: (2) Step of providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3) About the input sequence set Performing a homology search with the reference database for each gene region and recording an alignment with the approximate reference allele and the sequence of the reference allele; (4) assigning the V region and the J region to the input sequence set; And extracting the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result (preferably, the V region for the input sequence set).
  • the J region are assigned, and the CDR3 sequence is extracted using the CDR3 beginning on the reference V region and the CDR3 end on the reference J as markers, and (5) the nucleic acid sequence of the D region is translated into an amino acid sequence;
  • a step of classifying the D region using an amino acid sequence preferably, a step of translating the nucleic acid sequence of the CDR3 into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence;
  • (6) in (5) The step of deriving a TCR or a BCR repertoire by calculating the appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region, and, if necessary, the appearance frequency of the C region, or a combination thereof, based on the above classification is included.
  • FIG. 43 is a flowchart showing a processing flow showing a method of analyzing TCR or BCR repertoire in the gene analysis system of the present invention.
  • each symbol S1 to S6 in the figure corresponds to each step (1) to step (6) in the following description.
  • the step of providing a reference database for each gene region including at least one of V region, D region, J region and optionally C region is, This can be achieved by appropriately selecting and providing a database including information on the V region.
  • the step of (2) trimming as necessary and providing an input sequence set in which an appropriate length is extracted as necessary includes functions such as software as needed. This is achieved by providing trimming and, if necessary, selecting the length as appropriate and providing the extracted input sequence set.
  • the input sequence can be, for example, a set of amplification products amplified by known methods, or a set of amplification products PCR amplified by an unbiased method as described in the application filed on the same day as this application.
  • (3) performing a homology search with the reference database for each gene region for the input sequence set, and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele Uses a software for performing homology search as appropriate, and performs a homology search with the reference database for each gene region (for example, V region, etc.) on the input sequence set, and the resulting approximate reference allele and This is done by recording an alignment with the sequence of the reference allele.
  • the “BLAST” or “BLAST analysis” box, the IMGT database below it, and the place where they are connected by a vertical double line are applicable.
  • the step of (4) assigning the V region and J region to the input sequence set and extracting the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result is based on known information from the sequence alignment.
  • an extraction which can be achieved by determining the V region and / or the J region, preferably the V region and the J region are assigned to the input sequence set, and the CDR3 head on the reference V region is assigned. It can be achieved by extracting the CDR3 sequence with the end of CDR3 on the reference J as a landmark.
  • FIG. 29 and FIG. 30 using the horizontal arrow below V and the horizontal arrow below J as markers, it is possible to determine both ends of this region as indicated by the horizontal arrow below Dno.
  • the step of translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence comprises translating into the amino acid using a method known in the art. This can be achieved by extracting the sequence corresponding to the D region by homology search or the like for the amino acid sequence.
  • the CDR3 nucleic acid sequence can be translated into an amino acid sequence, and the D region can be classified using the amino acid sequence.
  • the step of deriving the TCR or BCR repertoire can be calculated by, for example, arranging the appearance frequencies of the V region, D region, J region and / or C region calculated in the above steps in a list. Thereby, a TCR or a BCR repertoire can be derived.
  • a reference database is provided. This may be stored in the external storage device 1405, but can usually be acquired as a publicly provided database through the communication device 1411. Alternatively, it may be input using the input device 1409 and recorded in the RAM 1403 or the external storage device 1405 as necessary.
  • a database including a target area such as the V area is provided.
  • an input array set is provided.
  • a set of sequence information obtained from, for example, a set of amplification products amplified by a PCR amplification reaction is input using the input device 1409 or via the communication device 1411.
  • a device for receiving the amplification product of the PCR amplification reaction and analyzing the gene sequence may be connected. Such a connection is made through the system bus 1420 or through the communication device 1411.
  • trimming and / or extraction of an appropriate length can be performed as necessary.
  • Such processing is performed by the CPU 1401.
  • Programs for trimming and / or extracting can be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • step (3) alignment is performed.
  • the input sequence set is searched for homology with the reference database for each gene region.
  • This homology search is performed with respect to the reference database obtained via the communication device 1411 or the like.
  • Perform program processing This process is performed by the CPU 1401. Further, the obtained result is analyzed and approximated with a reference allele and / or a sequence of the reference allele. This process is also performed by the CPU 1401. Programs for executing these can be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • step (4) the nucleic acid sequence of D information is detected.
  • This process is also performed by the CPU 1401.
  • Programs for executing these can be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • the V region and the J region are assigned to the input array set.
  • Assignment processing is also performed by the CPU 1401.
  • the CPU 1401 also extracts the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result.
  • Programs for assignment and extraction processing may also be provided via an external storage device or a communication device or an input device, respectively.
  • it can be preferably achieved by determining the V region and / or the J region from the sequence alignment based on known information or the like.
  • the result can be saved in the RAM 1403 or the external storage device 1405.
  • Such extraction is preferably achieved by assigning a V region and a J region to the input sequence set, and extracting a CDR3 sequence with the CDR3 head on the reference V region and the CDR3 end on the reference J as markers. can do.
  • Such processing can also be performed by the CPU 1401.
  • Programs for this purpose can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • Step (5) classifies the D region.
  • the nucleic acid sequence of the D region is translated into an amino acid sequence, and the D region is classified using the amino acid sequence.
  • a program for this processing can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively, by extracting a sequence corresponding to the D region by homology search etc. with respect to the obtained amino acid sequence.
  • Such processing is also performed by the CPU 1401.
  • a program for this processing can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively. It can be translated into an amino acid sequence, and the D region can be classified using the amino acid sequence. Made in 401. Program for this process it may also be respectively provided via an external storage device or communication device or the input device.
  • step (6) by calculating the appearance frequency of each of the V region, D region, J region and, if necessary, the C region or a combination thereof based on the above classification, the TCR or BCR repertoire is calculated. Is derived. Processing for this calculation and derivation is also performed by the CPU 1401. A program for this processing can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • the gene region used in the present invention includes all of the V region, D region, J region and optionally the C region.
  • the reference database is a database in which a unique ID is assigned to each array. By uniquely assigning IDs, gene sequences can be analyzed based on a simple index called ID.
  • the input array set is an unbiased array set.
  • Unbiased sequence sets can be performed by PCR amplification by an unbiased method as described herein. If the accuracy of the non-bias method is not required, a “pseudo non-bias method” having a relatively low level such as the Smart method may be used. Therefore, in this specification, the term “unbiased” refers to an unbiased accuracy that can be achieved by the method of the present invention, and a “pseudo-unbiased method” when the level is not reached.
  • non-bias methods as described herein may be referred to as “accurate unbias” when distinguished from each other. It is understood that this is the level achieved using the methods described in the specification.
  • the array set is trimmed. By performing trimming, unnecessary or inappropriate nucleic acid sequences can be removed, and the efficiency of analysis can be increased.
  • trimming removes low quality regions from both ends of the lead; removes regions that match the adapter sequence by 10 bp or more from both ends of the lead; and a remaining length of 200 bp or more (TCR) or 300 bp or more (BCR) If so, it is achieved by the steps used for analysis as high quality.
  • the low quality is a QV value with a 7 bp moving average of less than 30.
  • the approximate sequence is the closest sequence.
  • the approximating array is: 1. Number of matching bases 2. kernel length; Score, 4. Determined by the rank of the alignment length.
  • the homology search is performed under conditions that allow random mutations to be scattered throughout. Such conditions are well expressed, for example, for BLAST / FASTA optimal parameters: allow up to 33% mismatch over the entire alignment length and up to 60 for any 30 bp in it.
  • the homology search includes (1) reduced window size, (2) reduced mismatch penalty, (3) reduced gap penalty, and ( 4)
  • the top index priority includes at least one condition for the number of matching bases.
  • This condition can be used, for example, in a situation where only a part of the region is classified using a shorter ( ⁇ 200 bp) sequence (a situation that deviates from the “preferred example”), and a situation where an Illumina sequencer is used. But it can be used. In this case, the possibility of using bwa or bowtie for the homology search is considered.
  • the D region is classified based on the appearance frequency of the amino acid sequence.
  • step (5) if there is a D region reference database, the combination of the homology search result with the CDR3 nucleic acid sequence and the amino acid sequence translation result is used as the classification result.
  • the classification is made only by the appearance frequency of the amino acid sequence.
  • the appearance frequency is made in gene name units and / or allyl units.
  • the step (4) assigns a V region and a J region to the input sequence set, and extracts a CDR3 sequence with the CDR3 head on the reference V region and the CDR3 end on the reference J as markers. Is included.
  • the step (5) includes translating the CDR3 nucleic acid sequence into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence.
  • the present invention is a system for analyzing a TCR or BCR repertoire, the system comprising: (1) a gene region comprising at least one of a V region, a D region, a J region, and optionally a C region Means for providing a reference database for each: (2) Means for providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3) About the input sequence set; Means for performing homology search with the reference database for each gene region and recording an alignment with the approximate reference allele and / or sequence of the reference allele; (4) V region and J region for the input sequence set; Means for assigning and extracting the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result; (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence; Means for classifying the D region using the non-acid sequence; (6) Each appearance frequency of the V region, the D region, the J region and, if necessary, the C region based on the classification in (5), or a combination thereof A system is
  • the present invention is a computer program that causes a computer to execute processing of a method of analyzing a TCR or BCR repertoire, the method comprising the following steps: (1) V region, D region, J region, and necessary A step of providing a reference database for each gene region including at least one of the C regions according to: (2) Trimming as necessary, and extracting an input sequence set having an appropriate length as necessary (3) performing a homology search with the reference database for each of the gene regions with respect to the input sequence set, and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele; 4) Assign V region and J region for the input sequence set, and based on the assignment result, nucleic acid of D region (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence, and classifying the D region using the amino acid sequence; (6) based on the classification in (5), V Deriving a TCR or a BCR repertoire by calculating the appearance frequency of each region, region D, region J, and, if necessary, region
  • the present invention is a recording medium storing a computer program that causes a computer to execute processing of a method for analyzing a TCR or BCR repertoire, the method comprising the following steps: (1) V region, D Step of providing a reference database for each gene region including at least one of region, J region, and C region as necessary: (2) Trimming as necessary, and having an appropriate length as necessary Providing the extracted input sequence set; (3) performing a homology search with the reference database for each gene region for the input sequence set, and aligning with the reference allele and / or the sequence of the reference allele (4) assigning V region and J region to the input array set, and assigning result And (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence; (6) in (5) Deriving a TCR or BCR repertoire by calculating the appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region, and, if necessary, the C region, or a combination thereof based on the classification of A recording
  • the gene analysis system 1 includes a CPU 1401 built in a computer system via a system bus 1420, a RAM 1403, an external storage device 1405 such as a flash memory such as a ROM, HDD, magnetic disk, or USB memory, and an input / output interface (I). / F) 1425 is connected.
  • An input device 1409 such as a keyboard and a mouse, an output device 1407 such as a display, and a communication device 1411 such as a modem are connected to the input / output I / F 1425, respectively.
  • the external storage device 1405 includes an information database storage unit 1430 and a program storage unit 1440. Both are fixed storage areas secured in the external storage device 1405.
  • the reference database In the database storage unit 1430, the reference database, the input sequence set, the generated classification data, TCR or BCR repertoire data, etc., or information acquired via the communication device 1411 or the like is written and updated as needed.
  • the information belonging to the sample to be accumulated can be identified by the ID defined in each master table. It becomes possible to manage.
  • the database storage unit 1430 stores sample provider ID, sample information, nucleic acid analysis results, known individual / physiology information, and TCR or BCR repertoire analysis results in association with the sample IDs as input sequence set entry information.
  • the TCR or BCR repertoire analysis result is information obtained by processing the nucleic acid analysis result by the processing of the present invention.
  • the computer program stored in the program storage unit 1440 configures the computer as the above-described processing system, for example, a system that performs processing such as trimming, extraction, alignment, assignment, classification, translation, and the like.
  • Each of these functions is an independent computer program, its module, routine, etc., and is executed by the CPU 1401 to configure the computer as each system or device. In the following, it is assumed that each function in each system cooperates to constitute each system.
  • the present invention provides a method for quantitatively analyzing a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using a database.
  • the method comprises (1) providing a nucleic acid sample comprising a T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequence, amplified unbiased from the subject; (2) contained in the nucleic acid sample And (3) calculating the frequency of occurrence of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence, and deriving the TCR or BCR repertoire of the subject.
  • This method and methods that include one or more additional features described herein are also referred to herein as “the repertoire analysis method of the present invention”.
  • a system for realizing the repertoire analysis method of the present invention is also referred to as a “repertoire analysis system of the present invention”.
  • (1) providing a nucleic acid sample comprising a T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequence amplified in a biased manner from the subject in the method of the present invention comprises determining the nucleic acid sequence; Any sample may be used as long as the sample is suitable.
  • Reverse transcriptase-PCR in addition to the above-mentioned preferred amplification method of the present invention, Reverse transcriptase-PCR, real-time PCR, digital PCR, emulsion PCR, amplified fragment length polymorphism (AFLP) PCR, allele-specific PCR, assembled PCR, asymmetric PCR , Colony PCR, helicase-dependent amplification, hot start PCR, inverse PCR, in situ PCR nested PCR, Touchdown PCR, loop-mediated isometric PCR (LAMP), Nucleic acid sequence based amplification (a NASB) Reaction, Branch DNA Amplification, Rolling Circle Amplification, Circle to circle Amplification, SPIA amplification, Trget Amplification by Capture and Ligation (TACL), 5'-Rapid amplification of cDNA end (5'-RACE), 3'-Rapid amplification of cDNA End (3'-RACE), Switching Mechanism at 5'-endof the RNA Transscript (SMART
  • any method may be used as long as the nucleic acid sequence can be determined.
  • an automated large-scale sequencing method include sequencing using the Roche 454 sequencer (GS FLX +, GS Junior), sequencing using the ion torrent sequencer (Ion PGM TM Sequencer) method, Illumina's method (GenomeAnalyzer IIx, There is sequencing using Hiseq, Miseq).
  • Other sequence methods include Helicescope TM Sequencer, Helicos True Single Molecule Sequencing (tSMA) (Harris. TD et al.
  • the Roche 454 sequence creates a single-stranded DNA in which two types of adapters that specifically bind to the 3 ′ end and the 5 ′ end are bound.
  • the single-stranded DNA binds to the bead via an adapter, and wraps in a water-in-oil emulsion to form a microreactor with the bead and the DNA fragment.
  • emulsion PCR is performed in a water-in-oil emulsion to amplify the target gene.
  • the beads are applied to a pico titer plate and sequenced.
  • ATP is produced by sulfurylase using pyrophosphate generated when dNTP is taken into DNA by DNA polymerase (Pyrosequencing).
  • Luciferase emits fluorescence using this ATP and Luciferin as substrates, and the base sequence is determined by detecting with a CCD camera.
  • the ion torrent method after emulsion PCR is performed in the same manner as Roche, the beads are transferred to a microchip and a sequence reaction is performed on the microchip. In the detection, the hydrogen ion concentration released when DNA is extended by polymerase is detected on a semiconductor chip and converted into a base sequence.
  • Illumina sequencing is a method in which the target DNA is amplified on a flow cell by the bridge PCR method and Sequencing-by-synthesis, and sequencing is performed while synthesis.
  • the bridge PCR method creates a single-stranded DNA with different adapter sequences added to both ends.
  • An adapter sequence on the 5 ′ end side is fixed in advance on the flow cell, and is fixed to the flow cell by performing an extension reaction.
  • an adapter on the 3 ′ end side is fixed at an adjacent position, and is combined with the 3 ′ end of the synthesized DNA to synthesize a double-stranded DNA in a so-called bridge form.
  • bridge binding ⁇ extension ⁇ denaturation a large number of single-stranded DNA fragments are locally amplified to form an accumulated cluster. Sequencing is performed using this single-stranded DNA as a template. Sequencing-by-synthesis performs a one-base synthesis reaction with 3 ′ end block fluorescent dNTPs by DNA polymerase after adding a sequence primer.
  • a fluorescent substance bound to a base is excited by laser light, and light emission is recorded as a photograph by a fluorescence microscope.
  • the base sequence is determined by removing the fluorescent substance and blocking, performing the next extension reaction, and proceeding with the step of detecting fluorescence.
  • the nucleic acid sample includes a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences, and in the step of determining the sequence of (2), single sequencing is performed.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • single sequencing is performed.
  • the method of the present invention can reduce or eliminate the bias that can arise from performing multiple types of sequencing by performing a single sequencing. Therefore, it is particularly useful for accurately detecting TCR or BCR leads that occur only infrequently.
  • At least one of the sequences used as a primer in the single sequencing, in the amplification from the nucleic acid sample to the sample for sequencing, at least one of the sequences used as a primer is the same as the nucleic acid sequence encoding the C region or a complementary strand thereof. It has the arrangement.
  • a primer having the same sequence as the nucleic acid sequence encoding the C region or its complementary strand similar amplification can be performed in any TCR or BCR, and unbiased can be achieved.
  • the single sequencing is performed using a common adapter primer.
  • the common adapter primer is of a base length suitable for amplification, is designed to be able to form stable duplexes with less difficulty in homodimers and intramolecular hairpin structures, and all TCRs in the database.
  • the gene sequence is not highly homologous and / or designed to have the same melting temperature (T m ) as the C region specific primer.
  • T m melting temperature
  • common adapter primers are selected that do not have homodimer and intramolecular hairpin structures and are not homologous to other genes, including BCR or TCR.
  • the common adapter primer is P20EA (SEQ ID NO: 2) and / or P10EA (SEQ ID NO: 3).
  • the non-biased amplification includes not being V region specific amplification.
  • the bias can be further reduced or eliminated as compared with the case where non-biased amplification is performed by devising a multiplex using a V-specific primer.
  • the repertoire targeted by the present invention is a BCR variable region repertoire
  • the nucleic acid sequence is a BCR nucleic acid sequence.
  • BCR is likely to be mutated, and in particular, it is said that many mutations occur in the V region, and accurate analysis of BCR repetoa is difficult by the technique using V region specific amplification.
  • the present invention provides a method for analyzing a disease, disorder or condition of the subject based on a TCR or BCR repertoire derived based on the repertoire analysis method of the present invention.
  • a technique for analyzing the disease, disorder or condition of the subject based on the TCR or BCR repertoire derived based on the repertoire analysis method of the present invention is a disease, disorder or the like.
  • Clinical information such as status, and derived lead type, number of leads, read frequency, V data, J data, C data, CDR3 data, etc., are linked, and a database is created using a spreadsheet such as EXCEL It starts from doing.
  • a TCR having a known function such as NKT or MAIT is searched. 2. Search existing public database and collate with TCR or BCR whose functions such as antigen specificity are known. 3.
  • the subject's disease, disorder or condition is a blood tumor, colon cancer, immune condition, rheumatoid arthritis, adult T-cell leukemia, T-cell large granular lymphocytic leukemia, Examples include idiopathic thrombocytopenic purpura, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a method for quantitatively associating a disease, disorder or condition of a subject determined by the method of the present invention with the TCR or BCR repertoire, Methods are provided for treating or preventing a disease, disorder or condition in the subject comprising selecting a means for treatment or prevention.
  • the disease, disorder or condition of the subject targeted in the method for treatment or prevention of the present invention is a blood tumor, colon cancer, immune condition, rheumatoid arthritis, adult T cell leukemia, T cell.
  • examples include, but are not limited to, large granular lymphocytic leukemia and idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • the present invention provides a system (analysis system) for quantitatively analyzing a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using a database.
  • the system comprises: (1) a kit for providing a nucleic acid sample comprising a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR) nucleic acid sequence, amplified unbiased from the subject; (2) the nucleic acid sample An apparatus for determining the nucleic acid sequence contained in the gene; and (3) calculating the appearance frequency of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence, and deriving the TCR or BCR repertoire of the subject
  • a device for A system that includes such a system and one or more additional features described herein is referred to as a “repertoire analysis system of the present invention”.
  • the repertoire analysis system of the present invention realizes the “repertoire analysis method of the present invention”.
  • the nucleic acid sample comprises a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences
  • the device of (2) uses a single sequencing to extract the nucleic acid sequences. Configured to be able to determine.
  • the single sequencing is characterized in that at least one of the sequences used as primers in the amplification from the nucleic acid sample to the sequencing sample has the same sequence as the C region.
  • the system of the present invention can reduce or eliminate the bias that can arise from performing multiple types of sequencing by performing a single sequencing.
  • the system of the present invention is particularly useful for accurately detecting TCR or BCR leads that occur only infrequently.
  • At least one of the sequences used as a primer in the single sequencing, in the amplification from the nucleic acid sample to the sample for sequencing, at least one of the sequences used as a primer is the same as the nucleic acid sequence encoding the C region or a complementary strand thereof. It has the arrangement.
  • a primer may be provided in this apparatus, may be included in a kit, or may be provided separately.
  • the single sequencing is performed using a common adapter primer.
  • a common adapter primer may be provided in this apparatus, may be included in a kit, or may be provided separately.
  • the common adapter primer is of a base length suitable for amplification, is designed to be able to form stable duplexes with less difficulty in homodimers and intramolecular hairpin structures, and all TCRs in the database. It is not homologous to the gene sequence and / or is designed to have the same melting temperature (Tm) as the C region specific primer. More preferably, common adapter primers are selected that do not have homodimer and intramolecular hairpin structures and are not homologous to other genes, including BCR or TCR.
  • the common adapter primer is P20EA (SEQ ID NO: 2) and / or P10EA (SEQ ID NO: 3).
  • the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample provided by the kit of the present invention is subjected to the unbiased amplification, but the amplification is not V region specific amplification.
  • the bias can be further reduced or eliminated as compared with the case where non-biased amplification is performed by devising a multiplex using a V region specific primer.
  • the repertoire to be analyzed by the system of the present invention is a BCR variable region repertoire
  • the nucleic acid sequence is a BCR nucleic acid sequence.
  • BCR is likely to be mutated, and in particular, it is said that many mutations occur in the V region, and accurate analysis of BCR repetoa is difficult by the technique using V region specific amplification. By using the system of the present invention, it has become possible to accurately analyze BCR repeaters.
  • the present invention comprises a subject's analysis system, and means for analyzing the subject's disease, disorder or condition based on a TCR or BCR repertoire derived based on the system.
  • a system for analyzing a disease, disorder or condition is provided.
  • the means for analyzing the disease, disorder or condition of the subject based on the TCR or BCR repertoire derived based on the analysis system of the present invention includes clinical information such as the disease, disorder or condition and the derived lead. It begins with connecting read data consisting of type, number of reads, read frequency, V region, J region, C region, CDR3 array, etc., and creating a database using a spreadsheet such as EXCEL.
  • a TCR having a known function such as NKT or MAIT is searched. 2. Search existing public database and collate with TCR or BCR whose functions such as antigen specificity are known. 3. Search in the constructed database or existing public database, and relate to the disease, disorder or condition from the origin, characteristics or function of the common sample. Next, regarding the lead arrangement in the sample, 1. Determine if the frequency of a particular lead increases (increases clonality). 2. It is examined whether the frequency of use of a specific V chain or J chain increases or decreases depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 3. It is examined whether the CDR3 sequence length in a specific V chain is increased or decreased depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 4).
  • composition and sequence of the CDR3 region that changes depending on the onset of the disease and the state of the disorder are examined. 5. Search for leads that appear or disappear depending on the onset of the disease or the state of the disorder. 6). Search for leads that increase or decrease depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 7). Leads that appear or increase / decrease in response to the onset of the disease or the state of the disorder are searched in other samples and associated with the disease, disorder or condition. 8). Diversity index or similarity index is calculated using statistical analysis software such as ESTIMATES or R (vegan) using data such as number of samples, lead type and number of leads. 9. Changes in diversity index or similarity index can be associated with disease onset and disorder status.
  • the disease, disorder or condition of the subject that can be analyzed by the analysis system of the present invention includes blood tumor, colon cancer, immune condition, rheumatoid arthritis, adult T cell leukemia, T cell large granules.
  • examples thereof include, but are not limited to, lymphocytic leukemia and idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • the present invention provides a means for quantitatively associating a disease, disorder or condition of a subject determined by the analysis system of the present invention with the TCR or BCR repertoire,
  • a system treatment system or prevention system for treating or preventing a disease, disorder or condition in the subject, comprising means for selecting a means for treatment or prevention.
  • the means for associating the subject's disease, disorder or condition with the TCR or BCR repertoire quantitatively in the system of the present invention can be realized by the following configuration. That is, repertoire information derived by the analysis system of the present invention can be read, and this can be realized by reading information on a subject's disease, disorder or condition and associating them.
  • the V region, the J region, and the C region are assigned from the collation operation with respect to the existing reference sequence, and the CDR3 sequence is determined.
  • the corresponding reads are counted, and the number of reads detected in the sample and the ratio to the total number of reads for each unique lead (the other lead that does not have the same sequence) ( Frequency) is calculated.
  • This information (read sequence, number of reads, read frequency, V region, J region, C region, CDR3 sequence) and clinical information of the subject (history, disease name, disease type, progression, severity, HLA type, immune status, etc.) )
  • a spreadsheet such as EXCEL or software having a database creation function.
  • the lead array in the sample is sorted by the number of reads and frequency, and ranking processing is performed.
  • the number of reads is totaled for each V area or J area, and the V area usage frequency or J area usage frequency is calculated. Based on these information, 1. Determine if the frequency of a particular lead increases (increases clonality). 2. It is examined whether the frequency of use of a specific V chain or J chain increases or decreases depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 3. It is examined whether the CDR3 sequence length in a specific V chain is increased or decreased depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 4). The composition and sequence of the CDR3 region that changes depending on the onset of the disease and the state of the disorder are examined. 5. Search for leads that appear or disappear depending on the onset of the disease or the state of the disorder. 6).
  • a means for selecting an appropriate treatment or prevention means from a quantitative relationship can be configured as follows. In other words, the selection of this means of selection is realized by associating data showing quantitativeness with past information on treatment, treatment or prevention, or information currently available, and realizing selection of those whose subsequent courses improve. Can do.
  • the disease, disorder or condition of the subject is a blood tumor, colon cancer, immune condition, rheumatoid arthritis, adult T cell leukemia, T cell large granular lymphocytic leukemia, idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • a blood tumor colon cancer
  • immune condition rheumatoid arthritis
  • adult T cell leukemia T cell large granular lymphocytic leukemia
  • idiopathic thrombocytopenic purpura idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • the present invention relates to TRCR10 / TRAJ15 / CVVRTAGTALIFG (SEQ ID NO: 1450) or TCR ⁇ containing a nucleic acid encoding the same, and / or TRBV29-1 / TRBJ2-7 / CSVERGGSLGEQYFG ( SEQ ID NO: 1500) or a monoclonal T cell for T cell large granular lymphocytic leukemia (T-LGL) that expresses TCR ⁇ comprising the nucleic acid encoding it.
  • T-LGL T cell large granular lymphocytic leukemia
  • T cell has various usefulness as shown in Examples and the like.
  • TRAV10 / TRAJ15 / CVVRATGITALIFG SEQ ID NO: 1450
  • a nucleic acid encoding the same in TCR ⁇ and / or TRBV29-1 / TRBJ2-7 / CSVERGGSLGEQYFG SEQ ID NO: 1500
  • T-LGL large granular lymphocytic leukemia
  • the “detection agent” broadly refers to any drug that can detect a target object (eg, peptide, nucleic acid, cell, etc.).
  • a target object eg, peptide, nucleic acid, cell, etc.
  • “detection” or “quantification” of polynucleotide or polypeptide expression includes, for example, measurement of mRNA and immunology, including binding or interaction with a marker detection agent. It can be achieved using any suitable method, including measurement methods. Examples of molecular biological measurement methods include Northern blotting, dot blotting, and PCR.
  • immunological measurement methods include ELISA using a microtiter plate, RIA, fluorescent antibody method, luminescence immunoassay (LIA), immunoprecipitation (IP), immunodiffusion method (SRID), immunization. Examples are turbidimetry (TIA), Western blotting, immunohistochemical staining, and the like. Examples of the quantitative method include an ELISA method and an RIA method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (eg, DNA array, protein array). The DNA array is widely outlined in (edited by Shujunsha, separate volume of cell engineering "DNA microarray and latest PCR method”). For protein arrays, see Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32.
  • gene expression analysis methods include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, in vitro translation and the like.
  • Such further analysis methods are described in, for example, Genome Analysis Experimental Method / Yusuke Nakamura Laboratory Manual, Editing / Yusuke Nakamura Yodosha (2002), etc., all of which are incorporated herein by reference. Is done.
  • the “expression amount” refers to an amount in which a polypeptide or mRNA is expressed in a target cell, tissue or the like.
  • Such expression level is evaluated by any appropriate method including immunoassay methods such as ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western blot method, and immunohistochemical staining method using the antibody of the present invention.
  • the expression level of the peptide at the mRNA level can be mentioned.
  • “Change in expression level” means expression at the protein level or mRNA level of the polypeptide used in the present invention evaluated by any appropriate method including the above immunological measurement method or molecular biological measurement method. Means that the amount increases or decreases.
  • the present invention also provides an agent for detecting TRAV10 / TRAJ15 / CVVRATGTALIFG (SEQ ID NO: 1450) or a nucleic acid encoding the same in TCR ⁇ , and / or TRBV29-1 / TRBJ2-7 / CSVERGGSLGEQYFG (SEQ ID NO: 1500) in TCR ⁇ or encoding the same.
  • a diagnostic agent for T-cell large granular lymphocytic leukemia (T-LGL) is provided.
  • “decrease” or “suppression” or synonyms for activity, expression products (eg, proteins, transcripts (RNA, etc.)) or a synonym is a decrease in the quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein. Or activity to decrease.
  • an expression product eg, a protein, transcript (such as RNA)
  • a synonym thereof refers to a quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein.
  • drugs having various activities can be detected and screened using the ability of the marker of the present invention to reduce, suppress, increase or activate as an index.
  • drug drug
  • drug may also be a substance or other element (eg energy such as light, radioactivity, heat, electricity).
  • Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, RNA such as mRNA), poly Saccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (for example, hormones, ligands, signaling substances, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (for example, small molecule ligands, etc.)) , These complex molecules are included, but not limited thereto.
  • a polynucleotide having a certain sequence homology to the sequence of the polynucleotide (for example, 70% or more sequence identity) and complementarity examples include, but are not limited to, a polypeptide such as a transcription factor that binds to the promoter region.
  • Factors specific for a polypeptide typically include an antibody specifically directed against the polypeptide or a derivative or analog thereof (eg, a single chain antibody), and the polypeptide is a receptor.
  • specific ligands or receptors in the case of ligands, and substrates thereof when the polypeptide is an enzyme include, but are not limited to.
  • detecting agent broadly means that a target object (eg, a normal cell (eg, normal corneal endothelial cell) or a transformed cell (eg, transformed corneal endothelial cell)) is detected. Any drug that can be used.
  • a target object eg, a normal cell (eg, normal corneal endothelial cell) or a transformed cell (eg, transformed corneal endothelial cell)
  • diagnostic agent refers to any drug capable of diagnosing a target state (for example, a disease) in a broad sense.
  • the detection agent of the present invention may be a complex or a complex molecule in which another substance (for example, a label or the like) is bound to a detectable moiety (for example, an antibody or the like).
  • a detectable moiety for example, an antibody or the like.
  • complex or “complex molecule” means any construct comprising two or more moieties.
  • the other part may be a polypeptide or other substance (eg, sugar, lipid, nucleic acid, other hydrocarbon, etc.).
  • two or more parts constituting the complex may be bonded by a covalent bond, or bonded by other bonds (for example, hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic interaction, van der Waals force, etc.). May be.
  • the “complex” includes a molecule formed by linking a plurality of molecules such as a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a sugar, and a small molecule.
  • interaction refers to two substances. Force (for example, intermolecular force (van der Waals force), hydrogen bond, hydrophobic interaction between one substance and the other substance. Etc.). Usually, two interacting substances are in an associated or bound state.
  • bond means a physical or chemical interaction between two substances or a combination thereof. Bonds include ionic bonds, non-ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, hydrophobic interactions, and the like.
  • a physical interaction can be direct or indirect, where indirect is through or due to the effect of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and does not involve other substantial chemical intermediates. By measuring the binding or interaction, the degree of expression of the marker of the present invention can be measured.
  • a “factor” (or drug, detection agent, etc.) that interacts (or binds) “specifically” to a biological agent such as a polynucleotide or a polypeptide is defined as that
  • the affinity for a biological agent such as a nucleotide or polypeptide thereof is typically equal or greater than the affinity for other unrelated (especially less than 30% identity) polynucleotides or polypeptides. Includes those that are high or preferably significantly (eg, statistically significant). Such affinity can be measured, for example, by hybridization assays, binding assays, and the like.
  • a first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to a second substance or factor means that the first substance or factor has a relationship to the second substance or factor. Interact (or bind) with a higher affinity than a substance or factor other than the second substance or factor (especially other substances or factors present in the sample containing the second substance or factor) That means. Specific interactions (or bindings) for a substance or factor involve both nucleic acids and proteins, for example, ligand-receptor reactions, hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, enzyme-substrate reactions, etc.
  • Examples include, but are not limited to, protein-lipid interaction, nucleic acid-lipid interaction, and the like, such as a reaction between a transcription factor and a binding site of the transcription factor.
  • the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the first substance or factor has the second substance Or having at least a part of complementarity to the factor.
  • both substances or factors are proteins
  • the fact that the first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to the second substance or factor is, for example, by antigen-antibody reaction Examples include, but are not limited to, interaction by receptor-ligand reaction, enzyme-substrate interaction, and the like.
  • the first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to the second substance or factor by the transcription factor and its Interaction (or binding) between the transcription factor and the binding region of the nucleic acid molecule of interest is included.
  • antibody broadly refers to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, multispecific antibodies, chimeric antibodies, and anti-idiotype antibodies, and fragments thereof such as Fv fragments, Fab ′ fragments, F (ab ′). 2 and Fab fragments, and other recombinantly produced conjugates or functional equivalents (eg, chimeric antibodies, humanized antibodies, multifunctional antibodies, bispecific or oligospecific antibodies, single chains Antibody, scFV, diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ), scFv-Fc).
  • antibodies may be covalently linked or recombinantly fused to enzymes such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, alpha galactosidase, and the like.
  • enzymes such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, alpha galactosidase, and the like.
  • the antibodies to various leads used in the present invention may be bound to specific various leads, respectively, and their origin, type, shape, etc. are not questioned.
  • known antibodies such as non-human animal antibodies (eg, mouse antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies can be used.
  • monoclonal or polyclonal antibodies can be used as antibodies, but monoclonal antibodies are preferred.
  • the binding of the antibody to a particular lead is preferably specific binding.
  • antigen refers to any substrate that can be specifically bound by an antibody molecule.
  • immunogen refers to an antigen capable of initiating lymphocyte activation that produces an antigen-specific immune response.
  • epitope or “antigenic determinant” refers to a site in an antigen molecule to which an antibody or lymphocyte receptor binds. Methods for determining epitopes are well known in the art, and such epitopes can be determined by those skilled in the art using such well known techniques once the primary sequence of the nucleic acid or amino acid is provided.
  • the “means” refers to anything that can be an arbitrary tool for achieving a certain purpose (for example, detection, diagnosis, treatment).
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the detection agent, diagnostic agent or other medicine of the present invention can take the form of probes and primers.
  • the probes and primers of the present invention can specifically hybridize with specific leads.
  • the expression of a particular lead is, for example, an indicator of whether it is colorectal cancer and is useful as an indicator of the degree of disease.
  • nucleic acid primer refers to a substance necessary for the initiation of a reaction of a polymer compound to be synthesized in a polymer synthase reaction.
  • a nucleic acid molecule for example, DNA or RNA
  • the primer can be used as a marker detection means.
  • a nucleic acid sequence is preferably at least 12 contiguous nucleotides long, at least 9 contiguous nucleotides, more preferably at least 10 contiguous nucleotides, and even more preferably at least 11 contiguous nucleotides.
  • Nucleic acid sequences used as probes are nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Is included.
  • a sequence suitable as a primer may vary depending on the nature of the sequence intended for synthesis (amplification), but those skilled in the art can appropriately design a primer according to the intended sequence. Such primer design is well known in the art, and may be performed manually or using a computer program (eg, LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar).
  • the primer according to the present invention can also be used as a primer set composed of two or more kinds of the primers.
  • the primer and primer set according to the present invention can be prepared according to conventional methods in known methods for detecting a target gene using a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an in situ PCR method, or a LAMP method. It can be used as a primer and a primer set.
  • a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an in situ PCR method, or a LAMP method. It can be used as a primer and a primer set.
  • the term “probe” refers to a substance that serves as a search means used in biological experiments such as screening in vitro and / or in vivo.
  • a nucleic acid molecule containing a specific base sequence or a specific Examples include, but are not limited to, peptides containing amino acid sequences, specific antibodies or fragments thereof.
  • the probe is used as a marker detection means.
  • the detection agent of the present invention may be labeled.
  • the detection agent of the present invention may have a tag bound thereto.
  • the “label” refers to a presence (for example, a substance, energy, electromagnetic wave, etc.) for distinguishing a target molecule or substance from others.
  • a labeling method include RI (radioisotope) method, fluorescence method, biotin method, chemiluminescence method and the like.
  • the labeling is performed with fluorescent substances having different fluorescence emission maximum wavelengths. The difference in the maximum fluorescence emission wavelength is preferably 10 nm or more.
  • Alexa TM Fluor is preferred as the fluorescent substance.
  • Alexa TM Fluor is a water-soluble fluorescent dye obtained by modifying coumarin, rhodamine, fluorescein, cyanine, etc., and is a series corresponding to a wide range of fluorescent wavelengths. Compared with other applicable fluorescent dyes, Stable, bright and low pH sensitive. Examples of combinations of fluorescent dyes having a fluorescence maximum wavelength of 10 nm or more include a combination of Alexa TM 555 and Alexa TM 633, a combination of Alexa TM 488 and Alexa TM 555, and the like. Any nucleic acid can be used as long as it can bind to its base moiety.
  • a cyanine dye eg, CyDye TM series Cy3, Cy5, etc.
  • rhodamine 6G reagent N-acetoxy-N2— Acetylaminofluorene (AAF), AAIF (iodine derivative of AAF) or the like
  • the fluorescent substance having a difference in fluorescence emission maximum wavelength of 10 nm or more include a combination of Cy5 and rhodamine 6G reagent, a combination of Cy3 and fluorescein, a combination of rhodamine 6G reagent and fluorescein, and the like.
  • the target object by using such a label, the target object can be modified so that it can be detected by the detection means used. Such modifications are known in the art, and those skilled in the art can appropriately carry out such methods depending on the label and the target object.
  • a “tag” is a substance for sorting molecules by a specific recognition mechanism such as a receptor-ligand, more specifically, a binding for binding a specific substance.
  • a substance that plays the role of a partner eg, having a relationship such as biotin-avidin, biotin-streptavidin
  • label can be included in the category of “label”.
  • a specific substance to which a tag is bound can be selected by bringing the substrate to which the binding partner of the tag sequence is bound into contact.
  • tags or labels are well known in the art.
  • Representative tag sequences include, but are not limited to, myc tag, His tag, HA, Avi tag and the like. Such a tag may be bound to the marker or marker detection agent of the present invention.
  • the method of the present invention comprises contacting a target sample with the detection agent or diagnostic agent of the present invention, and whether the target target lead or the gene of these leads is present in the sample, or the level or amount thereof. It can be implemented by measuring.
  • contacting refers to a polypeptide that can function as a marker, a detection agent, a diagnostic agent, a ligand, and the like of the present invention either directly or indirectly. It means physical proximity to the polynucleotide.
  • the polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like. Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, microtiter plate, cell culture flask or microarray (eg, gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof.
  • the present invention provides a peptide that is a novel invariant TCR comprising any of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1627 to 1647.
  • a peptide can be used as an invariant and used as various indicators (for example, indicators such as diseases).
  • the invention provides a mucosal associated invariant T (MAIT) comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1648-1651, 1653-1654, 1666-1667, 1844-1848, and 1851.
  • MAIT mucosal associated invariant T
  • TCR peptides carried by cells and nucleic acids encoding these peptides are provided.
  • Such peptides and nucleic acids can be used as mucosa-associated invariant T (MAIT) and used as various indicators (for example, indicators of diseases, etc.).
  • peptides that are TCRs possessed by the mucosa-associated invariant T (MAIT) cells of the present invention, and nucleic acids encoding these peptides may be used as a diagnostic indicator for colorectal cancer. it can.
  • the present invention provides a peptide that is a TCR possessed by natural killer T (NKT) cells, which contains the sequence shown in SEQ ID NO: 1668, and a nucleic acid encoding this peptide.
  • NKT natural killer T
  • peptides that are TCRs possessed by the NKT of the present invention and nucleic acids encoding these peptides can be used as a diagnostic indicator for colorectal cancer.
  • the present invention provides peptides that are specific for colorectal cancer comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1652, 1655 to 1665, 1669 to 1843, 1849 to 1850, and 1852 to 1860, and these A nucleic acid encoding is provided.
  • these peptides and the nucleic acids that encode them can be used as a diagnostic indicator for colorectal cancer.
  • the present invention provides a peptide that is specific for colorectal cancer, including a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1861 to 1865, and 1867 to 1909, and nucleic acids encoding them.
  • these peptides and the nucleic acids that encode them can be used as a diagnostic indicator for colorectal cancer.
  • the invention provides a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1652, 1655-1665, 1669-1843, 1849-1850, and 1852-1860, and SEQ ID NOs: 1861-1865, and 1867-1909.
  • a cell population, a T cell line, or a recombinantly expressed T cell with high frequency induction of T cells having a peptide containing or a nucleic acid sequence encoding the peptide is provided.
  • a peptide of a colorectal cancer-specific TCR or a nucleic acid sequence, cell, cell population, or cell line encoding the peptide is useful for diagnosis or treatment.
  • colorectal cancer is found by examining that the sequence is found only in colorectal cancer patients, that the sequence is often found in colorectal cancer patients, or is accumulated in the cancer tissue of the same patient. Prognosis can be predicted.
  • a cell population in which T cells having a colon cancer-specific sequence are frequently induced, a T cell line having a colon cancer-specific sequence, and a T cell in which a colon cancer-specific sequence is artificially expressed can be used for the treatment of colorectal cancer (reference: 1: Uttenthal BJ, Chua I, Morris EC, Stauss HJ. Challenges in T cell receptor gene therapy. J Gene Med. 2012 Jun; 14 (6): 386-99.
  • the present invention provides a therapeutic or preventive agent for colorectal cancer comprising the above cell population, T cell line or T cell.
  • the base sequence (read) of the TCR or BCR gene identified by a large-scale sequence and the appearance frequency thereof can be calculated on software, and a list, distribution, or graph can be drawn. Based on such information, the change of the repertoire is detected by using various indicators as follows. Based on the changes, the association with diseases and disorders can be clarified.
  • the present invention provides a method for detecting the use frequency of a V gene using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the V gene of each lead can be identified, and the proportion of each V gene in the total TCR or BCR gene can be calculated.
  • the increase or decrease in the frequency of use of V related to the disease or condition can be clarified.
  • the present invention provides a method for detecting the frequency of use of the J gene using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the J gene of each lead can be identified, and the proportion of each J gene in the total TCR or BCR gene can be calculated.
  • the increase or decrease in the frequency of use of J related to the disease or condition can be clarified.
  • the present invention provides a method for detecting the frequency of subtype frequency analysis (BCR) using the analysis method or analysis system of the present invention. Based on the sequencing of the C region, the presence frequency of IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 subtypes can be calculated. Can reveal increases or decreases in specific subtypes associated with a disease or condition.
  • BCR subtype frequency analysis
  • the present invention provides a method for analyzing a CDR3 sequence length pattern using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the CDR3 base sequence length of each read can be calculated to clarify the distribution.
  • a normal TCR or BCR shows a normal distribution-like peak pattern, but a peak deviating from the normal distribution can be detected to clarify the relationship with a disease or disease state.
  • the present invention provides a method for analyzing TCR or BCR clonality using the analysis method or analysis system of the present invention. Based on the V sequence, J sequence and CDR3 sequence of each lead, reads having the same sequence are classified, and the copy number is calculated. By calculating the ratio of the number of copies of each lead to the total number of reads, it is possible to clarify the presence of a lead that exists frequently. The degree of clonality is evaluated by sorting the descending order according to the appearance frequency, and comparing the number and ratio of leads that exist frequently with normal samples. Therefore, the change of TCR or BCR clonality related to the disease or pathological condition is examined. In particular, it can be used for detection of leukemia cells and the like.
  • the present invention provides a method for extracting duplicate leads using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the present invention provides a method for searching for a disease-specific TCR or BCR clone using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • Search for TCR or BCR leads associated with a specific disease or disorder condition in a test sample, revealing its appearance, disappearance, increase or decrease, and predicting the onset or progression of disease can do.
  • the present invention provides a method for analyzing an object using a diversity index using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the present invention provides a method for supporting analysis of an object using a diversity index using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the number of read sequences identified based on the CDR3 sequence is counted, the number of read species and the number of individuals are calculated, and the diversity of TCR or BCR repertoire is indexed. Contrast with normal samples using Shannon-Wiener diversity index (H ′), Simpson diversity index ( ⁇ , 1- ⁇ or 1 / ⁇ ), Pierou uniformity index (J ′), Chao1 index, etc.
  • H ′ Shannon-Wiener diversity index
  • Simpson diversity index ⁇ , 1- ⁇ or 1 / ⁇
  • Pierou uniformity index J ′
  • Chao1 index etc.
  • It can be used as an index for measuring the degree of recovery of the immune system after bone marrow transplantation. It can also be used as an indicator for detecting abnormalities in immune system cells associated
  • the diversity in the method for analyzing a subject using a diversity index, is used as an index for measuring the degree of recovery of the immune system after bone marrow transplantation or detecting an abnormality of immune system cells associated with a hematopoietic tumor.
  • Use sex index. Analysis using such diversity indexes has been difficult with conventional systems.
  • various diversity indexes are obtained from the data of the number of samples, the type of lead, and the number of leads, EXCEL spreadsheet, ESTIMATES (Colwell, RK et al. Journal of Plant Ecology 5: 3-21.) Or R It can be calculated using software such as a package (vegan).
  • the Shannon-Wiener diversity index (H ′), the Simpson diversity index ( ⁇ , 1- ⁇ or 1 / ⁇ ), the Pierou uniformity index (J ′), or the Chao1 index are obtained by the following formulas.
  • N total number of leads
  • n i number of leads in lead i Shannon-Weaver index H ′
  • the present invention is a method of analyzing an object using a similarity index using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the present invention provides a method for supporting analysis of an object using a similarity index using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the number of species and individuals of the lead sequence identified based on the CDR3 sequence are calculated, and the similarity of TCR or BCR repertoire between samples to be compared is clarified.
  • the Morisita-Horn index, Kimoto's C ⁇ index or Pianka's ⁇ index the degree of similarity between samples is clarified. It can be used for evaluation of repertoire similarity between HLA type agreement or mismatch, evaluation of repertoire similarity between recipient and donor after bone marrow transplantation, and the like.
  • the similarity index is used as an assessment of repertoire similarity between HLA-type matches or mismatches, and an assessment of repertoire similarity between recipient and donor after bone marrow transplantation. Analysis using such a similarity index is difficult with a conventional system.
  • Various similarity indices can be calculated using the following formulas using ESTIMATES (Colwell, R. K. et al. Journal of Plant Ecology 5: 3-21.) Or R package (vegan).
  • the Morisita-Horn index, Kimoto's C ⁇ index, or Pianka's ⁇ index is obtained by the following equation.
  • Morosita-Horn index X i number of leads i appearing in all X leads derived from one sample
  • y i number of leads i appearing in all Y leads derived from the other sample S: number of unique reads
  • the present invention can adjust samples for quantitative analysis of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using next generation sequencing technology.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • These sequencing techniques can obtain 1 million or more leads from a sample at a reasonable cost. Even genotypes present at a frequency of 1 / 1,000,000 or less can be detected in a specific and unbiased manner using these techniques.
  • Unbiased amplification methods are achieved to amplify all different types of sequences of specific portions of genes or transcripts from samples derived from DNA such as blood or bone marrow.
  • the present invention provides a method of preparing a composition for use in cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy in a subject.
  • This method comprises (1) analyzing the T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) repertoire of the subject by the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; (2) A step of determining a TCR or BCR derived from the cancer cell of the subject based on the result, wherein the determination is based on the highest ranking sequence in the frequency ranking of the TCR or BCR gene derived from the cancer cell of the subject.
  • a step of selecting the TCR or BCR derived from the cancer cell (3) determining a candidate amino acid sequence of the HLA test peptide based on the determined TCR or BCR derived from the cancer The determination is based on a score calculated using an HLA-binding peptide prediction algorithm; And (4) comprising the step of combining the determined peptide.
  • the peptide synthesized here can be used for cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy. This method is sometimes referred to herein as "cancer idiotype peptide sensitized immune cell therapy".
  • cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy specifically, it can be performed clinically using the following procedure. For example, briefly, (1) peripheral blood cells of a cancer patient suffering from a blood tumor can be collected, lymphocyte cells can be isolated, and then the repertoire analysis method of the present invention can be performed, and this can be used. Cancer idiotype peptide sensitized immune cell therapy. In another embodiment, the repertoire analysis method of the present invention can be performed for a TCR in the case of a T cell tumor and for a BCR in the case of a B cell tumor.
  • the higher rank sequence is selected as the TCR or BCR derived from the cancer cell, and the cancer separately determined from the sequence containing the CDR3 region of the TCR or BCR gene
  • Peptides that bind to a patient's human leukocyte antigen (HLA) are predicted using an HLA-binding peptide prediction program (any known program can be used as described elsewhere herein).
  • an HLA binding peptide is synthesize
  • patient peripheral blood mononuclear cells are collected, added to the mixture of mononuclear cells or patient-derived antigen-presenting cells and CD8 + T cells, cultured, Stimulation with peptides can be performed.
  • the peptide-stimulated lymphocyte cells can be transferred to a patient and subjected to CTL therapy.
  • peptide-sensitized DC vaccine therapy after collecting peripheral blood mononuclear cells from patients, monocytes are isolated and induced to differentiate into dendritic cells (DC) in the presence of differentiation-inducing factors. Then, the peptide can be added and cultured, and the peptide-sensitized dendritic cells can be transferred to a patient and subjected to dendritic cell therapy.
  • DC dendritic cells
  • Cancer idiotype peptide sensitized immune cell therapy includes, for example, acute myeloid leukemia and related progenitor cell tumors, lymphoblastic leukemia / lymphoma, T lymphoblastic leukemia / lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma B cell prolymphocytic leukemia, hairy cell leukemia, T cell prolymphocytic leukemia, T cell large granular lymphocytic leukemia, adult T cell leukemia / lymphoma and other hematological cancers, multiple myeloma, bone marrow Can be used for leukemia-related diseases such as dysplasia syndrome, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases such as type I diabetes, patients with various infectious diseases, etc.
  • leukemia-related diseases such as dysplasia syndrome, rheumatoid arthritis, systemic lup
  • the candidate for the HLA test peptide in step (3) of the present invention is determined using BIMAS, SYFPEITHI, RANKPEP, or NetMHC.
  • the present invention comprises, after step (4) of the present invention, mixing the peptide, the subject-derived dendritic cell or antigen-presenting cell, and the subject-derived CD8 + T cell. Including the step of culturing. This is also called an improved CTL method.
  • the improved CTL method for example, unlike the widespread activation of T cells by existing anti-CD3 antibodies and IL-2, antigen specificity is imparted to CD8 + T cells using an antigen peptide, resulting in higher specificity. Treatment with fewer side effects can be expected. Moreover, since the individualized peptide created based on the information obtained from the tumor cells of the patient is used, a high therapeutic effect can be expected.
  • Improved CTL methods include, for example, acute myeloid leukemia and related progenitor cell tumors, lymphoblastic leukemia / lymphoma, T lymphoblastic leukemia / lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma, B cell prolymphocyte Leukemia, hairy cell leukemia, T-cell prolymphocytic leukemia, T-cell large granular lymphocytic leukemia, blood cancer such as adult T-cell leukemia / lymphoma, multiple myeloma, leukemia such as myelodysplastic syndrome Can be used for related diseases, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases such as type I diabetes, patients with various infectious diseases, etc. Patients with end-stage cancer patients, refractory autoimmune diseases, severe infections Can be used.
  • the present invention includes a step of mixing and culturing the peptide and the dendritic cell derived from the subject after the step (4) of the present invention. This is also called DC vaccine therapy.
  • DC vaccine therapy for example, since individualized peptides are created based on sequence information obtained from tumor cells derived from the patient, they do not act on normal cells, but act more specifically on tumor cells and are high A therapeutic effect can be expected. Since a peptide is used as an antigen, there is an advantage that it can be easily chemically synthesized unlike a protein.
  • DC vaccine therapy includes, for example, acute myeloid leukemia and related progenitor cell tumors, lymphoblastic leukemia / lymphoma, T lymphoblastic leukemia / lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma, B cell prolymphocytic Leukemia such as leukemia, hairy cell leukemia, T-cell prolymphocytic leukemia, T-cell large granular lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia / lymphoma, etc., multiple myeloma, myelodysplastic syndrome Can be used for diseases, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases such as type I diabetes, patients with various infectious diseases, etc. For patients with terminal cancer patients, refractory autoimmune diseases, severe infections Can be used).
  • the present invention comprises, after step (4) of the present invention, mixing the peptide, the subject-derived dendritic cell or antigen-presenting cell, and the subject-derived CD8 + T cell. Culturing to produce a CD8 + T cell-dendritic cell / antigen-presenting cell-peptide mixture, and mixing the peptide and dendritic cells derived from the subject to culture, Including the process of producing. This is also called patient autoimmune cell therapy.
  • Patient autoimmune cell therapy includes, for example, blood cancer (leukemia, etc.), acute myeloid leukemia and related progenitor cell tumors, lymphoblastic leukemia / lymphoma, T lymphoblastic leukemia / lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphoma Hematopoietic lymphoma, B cell prolymphocytic leukemia, hairy cell leukemia, T cell prolymphocytic leukemia, T cell large granular lymphocytic leukemia, blood cancer such as adult T cell leukemia / lymphoma, multiple bone marrow It can be used for leukemia-related diseases such as myeloma, myelodysplastic syndrome, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases such as type I diabetes, various infectious disease patients, etc., terminal cancer patients, refractory autoimmunity It can be used for patients with diseases and serious
  • the present invention provides a method of giving cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy to a subject.
  • This method comprises (1) analyzing the T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) repertoire of the subject by the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; (2) A step of determining a TCR or BCR derived from the cancer cell of the subject based on the result, wherein the determination is based on the highest ranking sequence in the frequency ranking of the TCR or BCR gene derived from the cancer cell of the subject.
  • a step of selecting the TCR or BCR derived from the cancer cell (3) determining a candidate amino acid sequence of the HLA test peptide based on the determined TCR or BCR derived from the cancer The determination is based on a score calculated using an HLA-binding peptide prediction algorithm; Comprising the step of performing treated with optionally (5) synthesized peptide; 4) a step of synthesizing the determined peptide.
  • This method includes both a method of producing a therapeutic agent and a method of performing the treatment itself. When excluding medical practice, it can be completed in the steps up to (5).
  • the candidate for the HLA test peptide in the step (3) is determined using BIMAS, SYFPEITHI, RANKPEP, or NetMHC.
  • BIMAS is an estimation program for HLA peptide binding provided at www-bimas.cit.nih.gov/.
  • SYFPEITHI is a database and search engine for MHC ligands and peptide motifs provided at www.syfpeithi.de/.
  • RANKPEP is a peptide bond prediction program for class I and class II MHC molecules provided at http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html.
  • NetMHC is a program server that predicts the binding of peptides to many HLA alleles, which is provided at www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/.
  • the present invention comprises, after the step (4), the peptide, the dendritic cell or antigen-presenting cell derived from the subject, and the CD8 + T cell derived from the subject.
  • the present invention comprises a step of mixing and culturing the peptide and dendritic cells derived from the subject after the step (4), and treating the cultured mixture with a patient.
  • the present invention comprises, after the step (4), the peptide, dendritic cells or antigen-presenting cells derived from the subject, and CD8 + T cells derived from the subject. Culturing the mixture to produce a CD8 + T cell-dendritic cell / antigen-presenting cell-peptide mixture, and mixing the peptide with the subject-derived dendritic cell and culturing the dendritic cell. Performing the step of producing a peptide mixture and administering the CD8 + T cell-dendritic cell / antigen presenting cell-peptide mixture, and the dendritic cell-peptide mixture to a patient.
  • the present invention provides a technique for isolating a bespoke cancer-specific T cell receptor gene and a technique for isolating a cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation.
  • the present invention relates to (A) an antigen protein or antigen peptide derived from a subject or a lymphocyte derived from the subject or a peptide determined in the “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy” of the present invention, Mixing inactivated cancer cells derived from a subject and T lymphocytes derived from the subject and culturing to produce tumor-specific T cells; (B) TCR of the tumor-specific T cells of the present invention Analyzing with the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; and (C) isolating a desired tumor-specific T cell based on the result of the analysis, Methods are provided for preparing isolated cancer-specific TCR genes.
  • Preparation of such an isolated cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation can be carried out using any technique known in the art once genetic information is obtained.
  • Such isolated tailored cancer-specific T cell receptor genes and cancer-specific TCR genes can be used for the treatment and prevention of various cancers.
  • Such an isolated tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and cancer-specific TCR gene can be specifically carried out clinically using the following procedure.
  • tumor cells are removed from a cancer patient.
  • the patient-derived tumor cells are crushed, separated into single cells, and inactivated by chemical treatment such as mitomycin C or irradiation.
  • Isolating peripheral blood cells from the whole blood of the cancer patient. (4) Extract RNA from cells using a part of peripheral blood cells as an untreated control sample. (5) Activate and proliferate tumor-specific T cells by mixing and culturing inactivated tumor cells and peripheral blood cells. .
  • peripheral blood cells are collected, and RNA is extracted from the cells as a sample after stimulation.
  • the repertoire analysis method of the present invention is performed from the RNA sample extracted in (4) and (6).
  • TCR genes greatly increased in the stimulation sample as compared with the control sample, rank them, and then select the upper TCR ⁇ and TCR ⁇ genes.
  • These full-length TCR ⁇ and TCR ⁇ genes are cloned and introduced into a retrovirus vector for gene expression.
  • a virus for gene transfer is prepared from these TCR ⁇ and TCR ⁇ gene expression retroviral vectors.
  • (11) Transform by infecting lymphocytes collected from the patient with TCR ⁇ and TCR ⁇ alone, or by creating a gene expression retroviral vector containing both TCR ⁇ and TCR ⁇ genes at the same time. Transform genes.
  • (12) Confirm the expression of TCR ⁇ / TCR ⁇ heterodimer on the cell surface.
  • (13) Using an isolated tailored cancer-specific T cell receptor gene and a cancer-specific TCR gene by transferring a tumor-specific patient lymphocyte expressing a target TCR ⁇ / TCR ⁇ into a patient. could be realized.
  • TCR or BCR determined by the method described in “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy” is used as an antigen or peptide.
  • Can do is used as an antigen or peptide.
  • any cancer antigen or inactivated cancer tissue derived from a patient is assumed here, the following methods can be typically used: any antigen protein or any antigen peptide, T lymphocyte and antigen-presenting cell A method of mixing a subject-derived lymphocyte and a subject-derived inactivated cancer cell; a TCR or BCR-derived peptide determined by a repertoire analysis provided in “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy” A method of mixing T lymphocytes and antigen presenting cells is provided.
  • the step (A) in the present invention comprises an antigen protein or antigen peptide derived from a subject, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject. Mixing and culturing to produce tumor-specific T cells.
  • the step (A) in the present invention comprises mixing and culturing lymphocytes derived from the subject, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject. This is a process for producing tumor-specific T cells.
  • step (A) in the present invention is derived from the peptide determined in “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy”, inactivated cancer cells derived from the subject, and the subject. This is a step of producing tumor-specific T cells by mixing and culturing with T lymphocytes.
  • Treatments using such isolated tailored cancer-specific T cell receptor genes and cancer-specific TCR genes include, for example, adrenal cancer, anal cancer, bile duct cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer , Chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing tumor, gallbladder cancer, Hodgkin's disease, hypopharyngeal cancer, laryngeal cancer, oral cavity cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer , Non-Hodgkin lymphoma, melanoma, mesothelioma, multiple myeloma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, etc. .
  • the present invention provides isolation of a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and isolation of a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search. Accordingly, the present invention provides (A) providing lymphocytes or cancer tissue isolated from subjects having a common HLA; (B) for the lymphocytes or cancer tissue, the tumor-specific T cells.
  • a common sequence search comprising the steps of: analyzing the TCR of the subject by the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; Provides a method for preparing an isolated cancer-specific TCR gene by Preparation of an isolated cancer-specific TCR gene by such a common sequence search can be performed using any technique known in the art once genetic information is obtained.
  • Such a gene obtained by isolation of a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and isolation of a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search can be used for the treatment and prevention of various cancers. it can.
  • This method is also referred to as “isolation of a customized cancer-specific T cell receptor gene of the present invention and isolation of a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search”.
  • the gene obtained by the isolation of such a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and the isolation of a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search is specifically as follows in clinical practice. Can be implemented.
  • (2) Repertoire analysis is performed using tumor tissue or lymphocyte cells containing tumor cell infiltrating T cells.
  • a tumor-specific T cell that ranks based on its presence frequency in each sample and shows a higher presence frequency in tumor cells than in peripheral blood cells is selected.
  • a sequence common to a plurality of HLA-matched cancer patients is searched.
  • a tumor-specific TCR gene common to most cancer patients is selected as a therapeutic tumor-specific TCR.
  • TCR ⁇ and TCR ⁇ genes are cloned and introduced into a retrovirus vector for gene expression.
  • a virus for gene transfer is prepared from these TCR ⁇ and TCR ⁇ gene expression retroviral vectors.
  • Tumor-specific patient lymphocytes expressing the target TCR ⁇ / TCR ⁇ are transferred to a patient to isolate a custom-made cancer-specific T cell receptor gene, and a cancer-specific TCR by consensus sequence search Treatment using a gene obtained by gene isolation can be realized.
  • the treatment using the gene obtained by the isolation of such a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and the isolation of the cancer-specific TCR gene by consensus sequence search includes, for example, adrenocortical cancer, anal cancer, Bile duct cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing tumor, gallbladder cancer, Hodgkin's disease, hypopharyngeal cancer, laryngeal cancer,
  • adrenocortical cancer anal cancer
  • Bile duct cancer bladder cancer
  • breast cancer cervical cancer
  • the present invention provides (A) an antigen protein or antigen peptide derived from a subject or a peptide determined in lymphocyte or cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy derived from the subject, Mixing inactivated cancer cells derived from a subject and T lymphocytes derived from the subject and culturing to produce tumor-specific T cells; (B) TCR of the tumor-specific T cells of the present invention Analyzing by the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; and (C) isolating a desired tumor-specific T cell based on the result of the analysis, by in vitro antigen stimulation.
  • a method for isolating cancer-specific TCR genes is provided.
  • Preparation of such an isolated cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation can be performed using any technique known in the art once the genetic information is obtained.
  • Such isolated tailored cancer-specific T cell receptor genes and cancer-specific TCR genes can be used for the treatment and prevention of various cancers.
  • step (A) in the present invention is derived from an antigen protein or antigen peptide derived from a subject and the subject.
  • the step (A) in the present invention comprises mixing and culturing lymphocytes derived from the subject, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject. This is a process for producing tumor-specific T cells.
  • step (A) in the present invention is derived from the peptide determined in “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy”, inactivated cancer cells derived from the subject, and the subject. This is a step of producing tumor-specific T cells by mixing and culturing with T lymphocytes.
  • the present invention provides a technique for isolating a bespoke cancer-specific TCR gene by isolating a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and searching for a common sequence.
  • B a step of analyzing a TCR of the tumor-specific T cell for the lymphocyte or cancer tissue by the repertoire analysis method of the present invention
  • C A method for isolating a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search, comprising the step of isolating T cells having a sequence common to tumor-specific T cells.
  • Such isolated tailored cancer-specific T cell receptor genes and cancer-specific TCR genes can be used for the treatment and prevention of various cancers.
  • the present invention provides cell processing therapy. Specifically, the present invention is based on A) the step of providing T lymphocytes collected from a patient; B) after the antigen stimulation of the T lymphocytes, and the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention.
  • Analyzing the TCR wherein the antigen stimulation is performed by an antigen protein or antigen peptide derived from the subject, an inactivated cancer cell derived from the subject, or a tumor-derived idiotype peptide; C) selecting the optimal antigen and optimal TCR in the analyzed TCR; and D) for cell processing therapy comprising the steps of producing a tumor-specific alpha and beta TCR expressing viral vector of the TCR gene of the optimal TCR
  • a method for preparing the tumor-specific TCR transgenic T lymphocytes for use in the present invention is provided. This cell processing therapy using tumor-specific TCR gene-transferred T lymphocytes can be used for the treatment and prevention of various cancers.
  • the cell processing therapy using such tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes can be specifically carried out clinically using the following procedure.
  • ⁇ isolation of tailor-made cancer-specific T cell receptor gene, isolation of cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation> or ⁇ isolation of tailor-made cancer-specific T cell receptor gene, Tumor-specific TCR gene-introduced lymphocytes can be used by the method described in> Isolation of cancer-specific TCR gene by consensus sequence search.
  • any cancer antigen or cancer peptide can be produced or synthesized as an antigen by production or synthesis, and the collected inactivated patient cancer cells can be used, or a tumor-derived idio Type peptides can be used.
  • a selection method an antigen highly expressed in cancer tissue can be selected, or a peptide that binds to a patient HLA type can be selected as an antigen.
  • an optimal antigen for example, (1) an antigen highly expressed in patient cancer tissue, (2) the T cell is most strongly activated in an antigen-specific lymphocyte stimulation test Antigen, (3) From the repertoire analysis before and after antigen stimulation, it can be envisaged to select an antigen that most increases the frequency of a specific TCR, but is not limited thereto.
  • (3) a method of selecting the most increased TCR as the optimum TCR in an example in which the frequency of a specific TCR is most increased from repertoire analysis before and after antigen stimulation can be assumed.
  • an optimal TCR candidate is artificially introduced into a patient lymphocyte, and the one that exhibits the highest reactivity with an actual patient cancer tissue can be selected as the optimal TCR.
  • T lymphocytes include, for example, adrenocortical cancer, anal cancer, bile duct cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia Colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing tumor, gallbladder cancer, Hodgkin's disease, hypopharyngeal cancer, laryngeal cancer, oral cavity cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, non-Hodgkin lymphoma, melanoma, mesothelioma It can be used for a wide range of cancer patients such as multiple myeloma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, etc., but is not limited thereto.
  • adrenocortical cancer anal cancer, bile duct cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia Colore
  • the antigen stimulation of the method of the present invention is performed by an antigen protein or an antigen peptide derived from the subject.
  • the antigen stimulation of the present invention is performed by inactivated cancer cells derived from the subject.
  • the antigen stimulation of the method of the present invention is performed by the tumor-derived idiotype peptide.
  • step C) of the method of the present invention comprises selecting an antigen that is highly expressed in the cancer tissue of the subject.
  • step C) of the method of the invention comprises selecting the antigen that most strongly activates T cells in an antigen-specific lymphocyte stimulation test.
  • step C) of the method of the present invention most increases the frequency of a specific TCR from a repertoire analysis performed based on the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention before and after antigen stimulation. Selecting an antigen.
  • the present invention is isolated by “isolation of a customized cancer-specific T cell receptor gene of the present invention, a method for isolating a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search”.
  • the present invention provides a method for evaluating efficacy and / or safety by conducting an in vitro stimulation test using a cancer-specific TCR gene.
  • the effectiveness is derived from a subject, for example, an antigenic protein or antigenic peptide derived from the subject that has been stimulated by an antigenic protein or antigenic peptide derived from the subject and a T cell into which a cancer-specific TCR gene has been introduced.
  • cytokine interferon ⁇ , etc.
  • Safety For example, when T cells derived from the subject into which a cancer-specific TCR gene has been introduced and normal cells derived from the subject are mixed, cytokines secreted in response to the activation of the T cells, Safety can be evaluated by measuring gene expression or expression of cell surface molecules and confirming that the TCR gene-introduced T cells are not activated by normal cells.
  • the specific steps of efficacy and / or safety assessment can be realized as follows. That is, for example, (1) tumor-specific TCR ⁇ and TCR ⁇ gene-introduced T lymphocyte cells are produced using a retrovirus gene expression system. (2) When evaluating the effectiveness, cancer cells derived from a patient are removed and separated, immortalized, and then mixed and cultured with tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes. (3) Using the above cultured cells, a cell proliferation test (such as a thymidine incorporation test, an MTT test, or an IL-2 production test) is performed to quantitatively evaluate the reactivity with tumor cells, and more strongly to tumor cells. A reactive TCR gene can be selected.
  • a cell proliferation test such as a thymidine incorporation test, an MTT test, or an IL-2 production test
  • the present invention is based on A) the step of collecting T lymphocytes from a patient; B) after the antigen stimulation of the T lymphocytes, and the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention. Analyzing the TCR, wherein the antigen stimulation is performed by an antigen protein or antigen peptide derived from the subject, an inactivated cancer cell derived from the subject, or a tumor-derived idiotype peptide; C) selecting an optimal antigen and optimal TCR in the analyzed TCR; D) producing a tumor-specific ⁇ and ⁇ TCR-expressing viral vector of the TCR gene of the optimal TCR; E) introducing the tumor-specific TCR gene Introducing a T lymphocyte into the patient.
  • the method for carrying out the step of introducing the obtained tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes into the patient is as follows: A) Step of producing tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes; B) Tumor-specific TCR ⁇ and TCR ⁇ C) a step of instilling tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes from a vein.
  • the antigen stimulation in the cell processing therapy of the present invention is performed by an antigen protein or an antigen peptide derived from the subject.
  • antigen stimulation in the cell processing therapy of the present invention is performed by inactivated cancer cells derived from the subject.
  • antigen stimulation in the cell processing therapy of the present invention is performed by the tumor-derived idiotype peptide.
  • step C) in the cell processing therapy of the present invention includes selecting an antigen that is highly expressed in the cancer tissue of the subject.
  • step C) in the cell processing therapy of the present invention comprises selecting an antigen that most strongly activates T cells in an antigen-specific lymphocyte stimulation test.
  • the step C) in the cell processing therapy of the present invention selects an antigen that most increases the frequency of a specific TCR from repertoire analysis performed based on the repertoire analysis method of the present invention before and after antigen stimulation. including.
  • BCR gene repertoire analysis is performed using the repertoire analysis method of the present invention, and a human-type antibody specific for a target antigen can be rapidly obtained by the method described below (A) And a cell population containing antibody-producing B cells (eg, spleen, lymph nodes, peripheral blood cells) is isolated from the mouse, and immunoglobulin is analyzed by BCR repertoire analysis using the repertoire analysis method of the present invention.
  • BCR gene repertoire analysis is performed using the repertoire analysis method of the present invention, and a human-type antibody specific for a target antigen can be rapidly obtained by the method described below (A)
  • a cell population containing antibody-producing B cells eg, spleen, lymph nodes, peripheral blood cells
  • immunoglobulin is analyzed by BCR repertoire analysis using the repertoire analysis method of the present invention.
  • A1 Method A in which immunized mice are KM mice capable of producing fully human antibodies while maintaining antibody diversity
  • the immunized mice are NOD / scid Humans in NOG (NOD / Shi-scid, IL-2R ⁇ null) mice with severe combined immunodeficiency created by mating IL-2 receptor ⁇ chain knockout mice to mice
  • Method A of humanized mice produced by transplanting cells B) immunoglobulin heavy and light chain gene sequences obtained from samples from mice derived from control mice and immunized mice, or mice before and after antigen immunization Compare frequency (C) Identify immunoglobulin heavy and light chain genes that are strongly expressed in immunized mice or increase after immunization (D) Select immunoglobulin heavy and light chain genes selected from step C And inserting the immunoglobulin heavy chain and light chain gene expression vectors prepared in the step (E) D into a single antibody expression vector or by separately inserting them into two different antibody expression vectors.
  • eukaryotic cells such as CHO (Chinese HamsterOvary), and perform cell culture (F) Isolate and purify antibody molecules produced and secreted by genetically modified cells, target
  • eukaryotic cells such as CHO (Chinese HamsterOvary)
  • F cell culture
  • Isolate and purify antibody molecules produced and secreted by genetically modified cells target
  • the antigen can be directly and rapidly changed without being changed into a chimeric antibody or humanized antibody with a human antibody.
  • This is a method for obtaining a specific human antibody and can be used for the development and production of an antibody drug comprising a human antibody.
  • NOD / SCID / gamma (c) (null) mouse an excellent recipient mouse model for engraftment of human. Nov 1; 100 (9): 3175-82.
  • Jayapal KP Wlaschin KF, Hu WS, Yap MGS. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and Count.Chem Eng Prog. 2007; 103: 40? 47.; Chusainow J, Yang YS, Yeo JH, Toh PC, Asvadi P, Wong NS, Yap MG.
  • a study of monoclonal antigen-producing CHO cell lines whatwhat You can refer to stable high producer? Biotechnol Bioeng. 2009 Mar 1; 102 (4): 1182-96.
  • a human-type antibody specific for a target antigen can be rapidly obtained by the method described below using the BCR gene repertoire analysis method.
  • A Target antigen protein or antigen A method in which a mouse is immunized with a peptide, a cell population containing antibody-producing B cells (eg, spleen, lymph nodes, peripheral blood cells) is isolated from the mouse, and immunoglobulin heavy chain and light chain genes are analyzed by BCR repertoire analysis ( A1) Method A in which the immunized mouse is a KM mouse that can produce fully human antibodies while maintaining antibody diversity (A2) The immunized mouse is a NOD / scid mouse and an IL-2 receptor ⁇ chain knockout mouse A humanized mouse produced by transplanting human stem cells into NOG (NOD / Shi-scid, IL-2R ⁇ null) mice exhibiting severe combined immunodeficiency produced by mating Method (B) Compare the frequency of immunoglobulin heavy and light chain
  • the immunoglobulin heavy and light chain genes that increase after immunization are identified (D)
  • the immunoglobulin heavy and light chain genes selected from step C are selected and inserted in accordance with one antibody expression vector.
  • the method of inserting each into the two antibody expression vectors separately (E)
  • the immunoglobulin heavy chain and light chain gene expression vectors prepared in step D are introduced into eukaryotic cells such as CHO (Chinese HamsterOvary),
  • F) Incubate F) Isolate and purify antibody molecules produced and secreted by genetically modified cells, and test their specificity for the target antibody protein or peptide
  • mice are immunized with MyelinOligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55, MOG), an antigenic peptide of experimental autoimmune encephalomyelitis.
  • MOG35-55 MyelinOligodendrocyte Glycoprotein
  • An equal volume of 2 mg / mL MOG peptide and complete Freund's adjuvant are mixed to make an emulsion, 200 ⁇ g MOG is immunized subcutaneously, and 400 ng pertussis toxin is simultaneously immunized to the peritoneal cavity.
  • Control mice are immunized with PBS and complete Freund's adjuvant.
  • 400 ng of pertussis toxin is immunized.
  • Next generation BCR repertoire analysis will be performed using the spleen of the affected and control mice.
  • IgG immunoglobulin heavy chains and immunoglobulin light chains the frequency of occurrence of individual BCR sequences and the ranking are performed. 4).
  • BCR sequences whose frequency of occurrence is greatly increased in the affected mice compared to the control mice are extracted and ranked. A combination of the highest ranking BCR sequences induced by administration of these antibodies is identified as a MOG-specific antibody gene. 5.
  • the full-length human immune fibrillin sequence is cloned from the BCR gene amplification product amplified from the affected mouse by PCR-cloning method.
  • Each of an IgG immunoglobulin heavy chain and an immunoglobulin light chain is cloned into an antibody expression vector.
  • CHO Choinese Hamster Ovary
  • the CHO cell culture medium is recovered, and the secreted antibody protein is recovered by purification with a Protein A affinity column and concentration by gel filtration. 8).
  • the binding activity against MOG35-55 or MOG protein is measured by ELISA assay using the collected antibody, and the specificity of the antibody is verified. 9.
  • an antibody expression stable expression cell line is obtained, and a human anti-MOG antibody is produced by a mass culture system.
  • peptide of the present invention or the nucleic acid encoding it can be used for immunotherapy. This will be described below.
  • Peptides provided by the present invention are derived from antigens associated with tumorigenesis, and bind sufficiently to MHC (HLA) class II molecules to human leukocyte immune responses, particularly lymphocytes, particularly T lymphocytes.
  • HLA MHC
  • it may be capable of initiating a TH1-type immune response provided by CD4-positive T lymphocytes, particularly CD4-positive T lymphocytes.
  • protein protein
  • polypeptide oligopeptide
  • peptide refers to a polymer of amino acids having an arbitrary length.
  • This polymer may be linear, branched, or cyclic.
  • the amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid.
  • the term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • amino acid may be natural or non-natural as long as it satisfies the object of the present invention.
  • polynucleotide refers to a polymer of nucleotides of any length.
  • the term also includes “oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives”.
  • Oligonucleotide derivatives or “polynucleotide derivatives” refer to oligonucleotides or polynucleotides that include derivatives of nucleotides or that have unusual linkages between nucleotides, and are used interchangeably.
  • oligonucleotides include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotides, oligonucleotide derivatives in which phosphodiester bonds in oligonucleotides are converted to phosphorothioate bonds, and phosphodiester bonds in oligonucleotides.
  • oligonucleotide derivative in which ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond uracil in oligonucleotide is C- Oligonucleotide derivatives substituted with 5-propynyluracil, oligonucleotide derivatives wherein uracil in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, oligonucleotides in which cytosine in the oligonucleotide is substituted with C-5 propynylcytosine Leotide derivatives, oligonucleotide derivatives in which the cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives in which the ribose in DNA is replaced with 2
  • a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzeret al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolinet al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).
  • nucleic acid is also used interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide.
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait
  • gene may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid”.
  • a variant thereof in addition to the identified peptide, a variant thereof may be used.
  • Such variants include, but are not limited to those having homology to the identified peptide.
  • homology of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally “having homology” means that the degree of identity or similarity is high. Say. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes have homology.
  • a “homolog” or “homologous gene product” is a protein in another species, preferably a mammal, that performs the same biological function as the protein component of the complex further described herein. Means. Such homologues may also be referred to as “ortholog gene products”. It will be understood that such homologues, homologous gene products, orthologous gene products and the like can be used as long as they meet the objectives of the present invention.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides can also be referred to by the generally recognized one letter code.
  • comparison of similarity, identity and homology between amino acid sequences and base sequences is calculated using default parameters using BLAST, which is a sequence analysis tool.
  • the identity search can be performed, for example, using NCBI's BLAST 2.2.28 (issued 2013.4.2).
  • the identity value usually refers to a value when the above BLAST is used and aligned under default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is the identity value. When identity is evaluated in a plurality of areas, the highest value among them is set as the identity value. Similarity is a numerical value calculated for similar amino acids in addition to identity.
  • “several” may be, for example, 10, 8, 6, 5, 4, 3, or 2, and may be any value or less.
  • Polypeptides that have undergone deletion, addition, insertion, or substitution with other amino acids of one or several amino acid residues are known to maintain their biological activity (Market al., ProcNatl Acad). Sci U S A.1984 Sep; 81 (18): 5662-5666., Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25; 10 (20): 6487-6500., Wang et al., Science. 1984 Jun29 ; 224 (4656): 1431-1433.).
  • Antibodies with deletions and the like can be prepared by, for example, site-specific mutagenesis, random mutagenesis, or biopanning using an antibody phage library.
  • site-specific mutagenesis method for example, KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.) Can be used. It is possible to select an antibody having the same activity as that of the wild type from mutant antibodies into which deletion or the like has been introduced by performing various characterizations such as FACS analysis and ELISA.
  • “90% or more” may be, for example, 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% or more, and is within the range of any two values thereof. Also good.
  • the above-mentioned “homology” may be calculated according to a method known in the art, based on the ratio of the number of amino acids homologous in two or more amino acid sequences. Before calculating the ratio, the amino acid sequences of the group of amino acid sequences to be compared are aligned, and a gap is introduced into a part of the amino acid sequence when necessary to maximize the ratio of the same amino acids.
  • polynucleotide hybridizing under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art.
  • a polynucleotide can be obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method or the like using a polynucleotide selected from among the polynucleotides of the present invention as a probe.
  • hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which colony or plaque-derived DNA was immobilized, and then a 0.1 to 2-fold concentration was obtained.
  • a polynucleotide that can be identified by washing the filter under conditions of 65 ° C using SSC (saline-sodium citrate) solution (composition of 1x concentrated SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate) .
  • SSC saline-sodium citrate
  • composition of 1x concentrated SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate
  • stringent conditions for example, the following conditions can be adopted.
  • Hybridization MolecularCloning 2nd. it can.
  • a sequence that contains only the A sequence or only the T sequence is preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions.
  • Moderate stringent conditions can be readily determined by those skilled in the art based on, for example, the length of the DNA, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Vol.
  • a polypeptide used in the present invention is encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under highly or moderately stringent conditions to a nucleic acid molecule encoding a polypeptide specifically described in the present invention. Are also included.
  • a “purified” substance or biological factor refers to a substance from which at least a part of the factor naturally associated with the substance or biological factor has been removed. .
  • the purity of a biological agent in a purified biological agent is higher (ie, enriched) than the state in which the biological agent is normally present.
  • the term “purified” as used herein is preferably at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight, Means the presence of the same type of biological agent.
  • the substance or biological agent used in the present invention is preferably a “purified” substance.
  • an “isolated” substance or biological agent is substantially free of the factors that naturally accompany the substance or biological agent. Say things.
  • the term “isolated” as used herein does not necessarily have to be expressed in purity, as it will vary depending on its purpose, but is preferably at least 75% by weight, more preferably if necessary. Means that there is at least 85%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% by weight of the same type of biological agent.
  • the materials used in the present invention are preferably “isolated” materials or biological agents.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n ⁇ 1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n).
  • the length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose.
  • the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) may also be appropriate as lower limits.
  • examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides.
  • Non-integer lengths may also be appropriate as a lower limit.
  • such a fragment falls within the scope of the present invention as long as the full-length fragment functions as a marker or target molecule as long as the fragment itself also functions as a marker or target molecule. Is understood.
  • the “functional equivalent” refers to any object having the same target function but different structure from the target original entity. Functional equivalents can be found by searching a database or the like.
  • search refers to finding another nucleobase sequence having a specific function and / or property using a nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods.
  • Electronic searches include BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444-2448 ( 1988), Smith and Waterman method (Smithand Waterman, J. Mol. Biol.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, microarrays affixed to glass plates (microarray assays), PCR and in situ hybridization. It is not limited. In the present specification, it is intended that the gene used in the present invention should include a corresponding gene identified by such an electronic search or biological search.
  • an amino acid sequence having one or more amino acid insertions, substitutions or deletions, or those added to one or both ends can be used.
  • “insertion, substitution or deletion of one or a plurality of amino acids in the amino acid sequence, or addition to one or both ends thereof” is a well-known technical method such as site-directed mutagenesis. It means that a modification has been made by substitution of a plurality of amino acids to the extent that can occur naturally by a method or by natural mutation.
  • the modified amino acid sequence has, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 9, further preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 2 amino acid insertions, substitutions or deletions. Lost or added to one or both ends thereof.
  • the modified amino acid sequence preferably has one or more (preferably 1 or several, or 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions in the amino acid sequence such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc.
  • the amino acid sequence may have.
  • conservative substitution means substitution of one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the function of the protein. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the “subject (person)” refers to a subject of diagnosis or detection or treatment of the present invention.
  • drug drug
  • drug may also be a substance or other element (eg energy such as light, radioactivity, heat, electricity).
  • Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, RNA such as mRNA), poly Saccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (for example, hormones, ligands, signaling substances, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (for example, small molecule ligands, etc.)) , These complex molecules are included, but not limited thereto.
  • a factor specific for a polynucleotide is a polynucleotide having complementarity with a certain sequence homology to the sequence of the polynucleotide (eg, 70% or more sequence identity), Examples include, but are not limited to, a polypeptide such as a transcription factor that binds to the promoter region.
  • Factors specific for a polypeptide typically include an antibody specifically directed against the polypeptide or a derivative or analog thereof (eg, a single chain antibody), and the polypeptide is a receptor.
  • specific ligands or receptors in the case of ligands, and substrates thereof when the polypeptide is an enzyme include, but are not limited to.
  • treatment refers to prevention of worsening of a disease or disorder when it becomes such a condition or disease (for example, cerebral malaria). Preferably, it refers to reduction, more preferably elimination, and includes the ability to exert a symptom improving effect or a preventive effect on one or more symptoms associated with a patient's disease or disease. Diagnosing in advance and performing appropriate treatment is referred to as “companion treatment”, and the diagnostic agent therefor is sometimes referred to as “companion diagnostic agent”.
  • the term “therapeutic agent (agent)” broadly refers to any drug capable of treating a target condition (for example, a disease such as cerebral malaria), and an inhibitor (for example, provided by the present invention) Antibody).
  • the “therapeutic agent” may be a pharmaceutical composition comprising an active ingredient and one or more pharmacologically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition can be produced by any method known in the technical field of pharmaceutics, for example, by mixing the active ingredient and the carrier.
  • the form of use of the therapeutic agent is not limited as long as it is a substance used for treatment, and it may be an active ingredient alone or a mixture of an active ingredient and an arbitrary ingredient.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and may be, for example, a solid or a liquid (for example, a buffer solution).
  • prevention means that a certain disease or disorder (for example, cerebral malaria) is prevented from becoming such a state before it becomes such a state. Diagnosis can be performed using the drug of the present invention, and for example, cerebral malaria can be prevented or a preventive measure can be taken using the drug of the present invention as necessary.
  • a certain disease or disorder for example, cerebral malaria
  • prophylactic agent refers to any agent that can prevent a target condition (for example, a disease such as cerebral malaria) in a broad sense.
  • the present invention relates to human leukocytes, in particular lymphocytes, in particular T lymphocytes, in particular CD8 positive cytotoxic T lymphocytes, derived from antigens associated with tumorigenesis and fully bound to MHC (HLA) class I molecules It also provides peptides that have the ability to trigger the immune response of, and also provides a combination of two peptides that are particularly useful as vaccinations for cancer patients.
  • lymphocytes in particular T lymphocytes, in particular CD8 positive cytotoxic T lymphocytes, derived from antigens associated with tumorigenesis and fully bound to MHC (HLA) class I molecules
  • HLA MHC
  • the peptide of the present invention can be derived from a tumor-related antigen, particularly a tumor-related antigen having functions in proteolysis, angiogenesis, cell growth, cell cycle control, cell division, transcriptional regulation, tissue invasion and the like.
  • the peptide can be chemically synthesized and can be used as an active pharmaceutical ingredient of a pharmaceutical
  • the peptide provided by the present invention can be used for immunotherapy, preferably cancer immunotherapy.
  • composition of the present invention further comprises additional peptides and / or excipients to increase the effect, as will be further described below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a peptide identified in the present invention, the peptide comprising 8 to 100 amino acids, preferably 8 to 30 amino acids, most preferably 8 to 16 amino acids. Has as a full length.
  • peptide or variant can be further modified to improve stability and / or binding to MHC molecules to elicit a stronger immune response.
  • Methods for optimizing such peptide sequences are well known to those skilled in the art and include, for example, the introduction of reverse peptide bonds or non-peptide bonds.
  • a pharmaceutical composition in which at least one peptide or variant comprises a non-peptide bond.
  • U.S. Patent No. 4,897,445 non-peptide bonds in the polypeptide chain provides a method for the solid phase synthesis of (-CH 2 -NH), the polypeptide synthesized by standard procedures to this, the amino aldehyde It involves non-peptide bonds synthesized by reacting amino acids in the presence of NaCNBH 3 .
  • Peptides having the sequences of the present invention can be synthesized with additional chemical groups at their amino terminus and / or carboxy terminus, for example, to enhance the stability, bioavailability, and / or affinity of the peptides.
  • a hydrophobic group such as a carbobenzoxyl group, a dansyl group, or a t-butyloxycarbonyl group can be added to the amino terminus of the peptide.
  • an acetyl group or a 9-fluorenylmethoxy-carbonyl group can be placed at the amino terminus of the peptide.
  • the above-mentioned hydrophobic group t-butyloxycarbonyl group or amide group can be added to the carboxy terminus of the peptide.
  • the peptides used in the present invention can be synthesized so as to change their configuration.
  • the D-isomer of one or more amino acid residues of the peptide can be used in place of the normal L-isomer.
  • at least one amino acid residue of the peptides of the invention can be replaced with one of the well-known unnatural amino acid residues. Such modifications can serve to increase the stability, bioavailability, and / or binding action of the peptides of the invention.
  • the peptide or variant of the present invention can be chemically modified by reacting a specific amino acid before or after the synthesis of the peptide used in the present invention. Examples of such modifications are well known in the art and are summarized, for example, in R. Lundblad, ChemicalReagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, which is hereby incorporated by reference.
  • Chemical modifications of amino acids include acylation, amidination, lysine pyridoxylation, reductive alkylation, trinitrobenzeneation of amino groups with 2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic acid TN (TNBS), amide modification of carboxyl groups and excess Sulfidyl modification with formic acid, oxidation of cysteine to cysteic acid, formation of mercury derivatives, formation of mixed disulfides with other thiol compounds, reaction with maleimide, carboxymethyl hatching with iodoacetic acid or iodoacetamide, and at alkaline pH Including, but not limited to, modification by carbamoylation of cyanide with cyanate.
  • one skilled in the art can refer to a broader methodology for chemical modification of proteins by Current Protocols In Protein Science, Eds. Colligan et al. (John Wiley & Sons NY NY 1995-2000).
  • modification of protein arginine residues is often the formation of adducts based on the reaction of adjacent dicarbonyl compounds such as phenylglyoxal, 2,3-butanedione, and 1,2-cyclohexanedione.
  • Another example is the reaction of methylglycosal with an arginine residue.
  • Cysteine can be modified without simultaneous modification of other nucleophilic sites such as lysine and histidine. Therefore, a large number of reagents can be used for cysteine modification. Specific reagent information is provided by Pierce Chemical Company, Sigma-Aldrich, and other websites.
  • Disulfide bonds can be formed and oxidized during heat treatment of biopharmaceuticals.
  • Woodward's ReagentK can be used to modify specific glutamate residues.
  • N- (3- (dimethylamino) propyl) -N′-ethylcarbodiimide can be used to form intramolecular crosslinks between lysine residues and glutamic acid residues.
  • diethyl pyrocarbonate is a reagent that modifies histidyl residues in proteins. Histidine can also be modified with 4-hydroxy-2-nonenal.
  • lysine residues with other ⁇ -amino groups are useful, for example, for peptide-surface binding or protein / peptide cross-linking.
  • Lysine is a site to which poly (ethylene) glycol is attached and is a major site of modification in protein glycation.
  • the methionine residue of the protein can be modified with, for example, iodoacetamide, bromoethylamine, chloramine T. Tetranitromethane and N-acetylimidazole can be used to modify tyrosyl residues.
  • Crosslinking due to the formation of dityrosine can be achieved by hydrogen peroxide / copper ions.
  • peptides and variants used in the present invention are disclosed in Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 and references thereof, as disclosed therein.
  • it can be synthesized using the Fmoc-polyamide form of solid phase peptide synthesis. Purification is one of techniques such as recrystallization, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and (usually) reversed-phase high-performance liquid chromatography using acetonitrile / water gradient separation. Or it can carry out by the combination.
  • Peptide analysis includes thin layer chromatography, electrophoresis, especially capillary electrophoresis, solid phase extraction (CSPE), reversed-phase high performance liquid chromatography, amino acid analysis after acid hydrolysis, fast atom bombardment (FAB) mass spectrometry , MALDI and ESI-Q-TOF mass spectrometry.
  • CSPE solid phase extraction
  • FAB fast atom bombardment
  • Still another aspect of the present invention provides a nucleic acid (eg, polynucleotide) encoding the peptide of the present invention or a variant thereof.
  • the polynucleotide include DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, single-stranded and / or double-stranded, or a natural or stable polynucleotide such as a polynucleotide having a phosphorothioate backbone, Intron inclusion is not essential as long as combinations are possible and the polynucleotide encodes the peptide.
  • an expression vector capable of expressing a polypeptide according to the invention Expression vectors for different cell types are well known in the art and can be selected without special experimentation.
  • DNA is inserted into an expression vector such as a plasmid in the correct orientation and with the correct reading frame for expression.
  • the DNA can be linked to appropriate transcriptional and translational regulatory administrative nucleotide sequences recognized by the desired host, but such administrative functions are generally contained in expression vectors.
  • the vector is then introduced into the host by standard techniques. For this, reference can be made to Sambrook1989et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ⁇ NY.
  • the optimal amount of the nuclear peptide contained in the vaccine and the optimal dosage regimen can be determined by those skilled in the art without special experimentation.
  • the peptide or variant thereof can be intravenous (iv) injection, subcutaneous (sc) injection, intradermal (id) injection, intraperitoneal (ip) injection, intramuscular. (Im) Can be prepared as an injection.
  • the preferred route of administration for peptide injection is s. c. I. d. I. p. I. m. I. v. It is.
  • the preferred route of administration for DNA injection is i. d. I. m. , S. c. I. p. I. v. It is.
  • 1 to 500 mg, 50 ⁇ g to 1.5 mg, preferably 125 ⁇ g to 500 ⁇ g of peptide or DNA can be administered, and the dose depends on each peptide or DNA.
  • Dose in this range has been used in previous trials and has been successfully used (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Muller M, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase peptide vaccination: a phase I / II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer ImmunolImmunother. 2006; 55 (12): 1553-1564; M.
  • the selection, number and / or amount of peptides present in the composition can be specific to tissue, cancer and / or patient.
  • side effects can be avoided by guiding the correct selection of peptides by the protein expression pattern of a given patient tissue. This choice may depend on the type of cancer specific to the patient being treated and the disease state, previous treatment regimen, the patient's immune status, and, of course, the patient's HLA haplotype.
  • the vaccine according to the invention can comprise individual components according to the personal needs of a particular patient. Examples are the amount of different peptides in a particular patient depending on the expression of the relevant TAA, the side effects of individual allergies or other treatments, and the adjustment of secondary treatment after a series of initial treatment regimens.
  • Peptides in which the parent protein is expressed in high amounts in normal tissues are avoided or present in low amounts in the composition of the present invention.
  • each pharmaceutical composition for the treatment of this cancer can be present in high amounts and / or this particular protein or pathway A plurality of peptides specific to can be included.
  • Those skilled in the art will be able to determine in vitro T cell formation, their efficacy, and overall presentation, proliferation, affinity, expansion, and functionality of a particular T cell for a particular peptide, such as IFN- ⁇ . By testing by production analysis, preferred combinations of immunogenic peptides can be selected (see also the examples below). Usually, the most efficient peptides are then combined as a vaccine for the purposes described above.
  • Suitable vaccines are preferably 1-20 peptides, more preferably 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, or 20 different peptides, more preferably 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14 different peptides, most preferably 14 different peptides.
  • the length of the peptide used as a cancer vaccine may be any suitable peptide. Specifically, a suitable 9-mer peptide or a suitable 7-mer or 8-mer or 10-mer or 11-mer peptide or 12-mer, 13-mer, 14-mer or 15-mer peptide It can be.
  • the peptide of the present invention constitutes a tumor or cancer vaccine.
  • the tumor or cancer vaccine is administered directly to the patient in its diseased organ or systemic, or is administered to the patient ex vivo applied to cells or human cell lines from the patient, or used in vitro A sub-population from the patient's immune cells can be selected and administered to the patient again.
  • the peptide can be substantially pure or can be used in combination with an immunostimulatory adjuvant (see below), or in combination with an immunostimulatory cytokine, or administered with an appropriate delivery system (e.g., a liposome). .
  • the peptide can also be conjugated to a suitable carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) or mannan (see WO95 / 18145 and Longgenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci.690,276-291). ).
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • mannan see WO95 / 18145 and Longgenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci.690,276-291).
  • the peptide can also be tagged, a fusion protein, or a hybrid molecule. Peptides whose sequences are given in the present invention are expected to stimulate CD4 or CD8CTL.
  • the pharmaceutical composition of a preferred embodiment of the present invention further comprises at least one suitable adjuvant.
  • the adjuvant used in the present invention is a substance that non-specifically enhances or promotes an immune response ⁇ to an antigen (e.g., an immune response mediated by CTL and helper T (TH) cells), and thus is considered useful for the agent of the present invention. It is done.
  • an adjuvant such as Freund's incomplete or GM-CSF is preferred.
  • An adjuvant such as Freund's incomplete or GM-CSF is preferred.
  • Several immunological adjuvants specific to dendritic cells e.g. MF59
  • their formulations have already been described (Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendriticcells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol.1998; 186 (1): 18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92: 3-11).
  • cytokines e.g. MF59
  • cytokines have been described as accelerating the process of dendritic cells to mature into antigen-presenting cells effective against T lymphocytes (e.g., GM-CSF, IL-1, IL-4) (U.S. Patent No. 5,849,589). This reference is incorporated in its entirety)) and also acts as an immunoadjuvant IL (e.g. IL-12) (Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immuneotherapy of Cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6): 414-418), some directly linked to the effect on migration of dendritic cells to lymphocyte tissue (eg TNF- ⁇ ).
  • TNF- ⁇ lymphocyte tissue
  • CpG immunostimulatory oligonucleotides also enhance the effectiveness of adjuvants in vaccine settings.
  • CpG oligonucleotides have the effect of activating the innate (non-adaptive) immune system via toll-like receptors (TLR) (mainly TLR9).
  • TLR9 toll-like receptors
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • the TH1 bias induced by stimulation of TLR9 is maintained even in the presence of vaccine adjuvants such as alum or Freund's incomplete adjuvant (IFA) that normally promote TH2 bias.
  • CpG oligonucleotides exhibit higher adjuvant activity when co-formulated or co-administered with other adjuvants, or in microparticles, nanoparticles, lipid emulsions or similar formulations, for relatively weak antigens This is especially necessary to induce a strong response.
  • adjuvants useful in the present invention include chemically modified CpGs (eg CpR, Idera), poly (I: C) (eg poly I: C12U), non-CpG bacterial DNA or RNA, And imidazoquinoline, cyclophosphamide, sunitinib, bivacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafinib, XL-999, CP-547632, pazopanib, ZD2171, AZD2171, ipilimumab, tremelimumab, SC58175 They can act as therapeutic agents and / or adjuvants.
  • adjuvants and additives useful in the context of the present invention can be readily determined by one skilled in the art without undue experimentation.
  • Preferred adjuvants are dSLIM, BCG, OK432, imiquimod, PeviTer, and JuvImmune.
  • the adjuvant is selected from the group comprising a colony stimulating factor such as granulocytic macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, sargramostim).
  • GM-CSF granulocytic macrophage colony stimulating factor
  • the adjuvant is imiquimod.
  • composition of the present invention is used for parenteral or oral administration such as subcutaneous, intradermal and intramuscular.
  • the peptide and optionally other molecules for this purpose are dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable, preferably aqueous carrier.
  • the composition can include buffers, binders, blasting agents, diluents, flavoring agents, excipients such as lubricants, and the like.
  • the peptide can also be administered with an immunostimulatory substance such as a cytokine.
  • An extensive list of excipients that can be used in such compositions is obtained, for example, from A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3 Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press.
  • the composition can be used as a prophylaxis and / or therapy for tumors or cancer, preferably CRC.
  • Cytotoxic T cells recognize peptide-shaped antigens bound to MHC molecules and not intact foreign antigens themselves.
  • the MHC molecule itself is on the cell surface of the antigen-presenting cell. Therefore, CTL activation is only possible in the presence of peptide antigen trimer complex, MHC molecule and APC.
  • the pharmaceutical composition of the invention additionally comprises at least one antigen presenting cell.
  • Antigen presenting cells typically have MHC class I or II molecules on their surface, and in one embodiment, load themselves with the selected MHC class I or II molecule with the selected antigen. It is virtually impossible to do. As described in detail below, the MHC class I or II molecule can be easily loaded with the selected antigen in vitro.
  • a pharmaceutical composition of the invention comprising a nucleic acid of the invention is administered in the same manner as a pharmaceutical composition comprising a peptide of the invention, i.e., intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradermal, It can be administered intratumorally, orally, transdermally, nasally, orally, rectally, vaginally, or by inhalation or topical administration.
  • the pharmaceutical composition is administered in conjunction with a second anticancer agent.
  • the second agent used in the present invention can be administered before, after, or simultaneously with the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Co-administration can be performed, for example, by mixing the pharmaceutical composition of the present invention with the second anticancer agent if the chemical properties are compatible.
  • Another method of simultaneous administration is, for example, by injecting the pharmaceutical composition of the present invention and administering the second anticancer agent, for example, orally, so that the composition and the anticancer agent are administered on an independent route on the same day.
  • the pharmaceutical composition and the second anticancer agent may be administered on different days within the same course of treatment and / or within separate courses of treatment.
  • a method for treating or preventing cancer in a patient comprises administering to the patient any one of the pharmaceutical compositions of the invention in a therapeutically effective amount.
  • a therapeutically effective amount is an amount sufficient to elicit an immune response, particularly to activate a subpopulation of CTLs.
  • One skilled in the art can readily determine the effective amount using standard immunological methods, such as those provided in the Examples herein.
  • Another way of monitoring the effect of a particular amount of the pharmaceutical composition of the invention is to observe the growth and / or recurrence of the treated tumor.
  • the pharmaceutical composition is used as an anti-cancer vaccine.
  • composition containing the peptide or peptide-encoding nucleic acid of the present invention can constitute a tumor or cancer vaccine.
  • the tumor or cancer vaccine is administered directly to the patient in its diseased organ or systemically, or administered ex vivo to cells or human cell lines from the patient, or used in vitro A sub-population from the patient's immune cells can then be selected and administered to the patient again.
  • the composition of the present invention can be used as a method for treating cancer or as a vaccine.
  • the cancer includes oral cavity, pharyngeal cancer, gastrointestinal cancer, colon, rectum, anal cancer, airway cancer, breast cancer, uterus, vagina, vulvar cancer, uterine body, ovarian cancer, male reproductive tract cancer, urethral cancer, Bone and soft tissue cancer, Kaposi's sarcoma, cutaneous melanoma, ocular melanoma, non-melanoma eye cancer, brain, central nervous system cancer, thyroid and other endocrine cancers, Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, myeloma, preferred Is kidney cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, stomach cancer, brain cancer, GIST or glioblastoma.
  • the preferred amount of peptide can vary between about 0.1-100 mg, preferably about 0.1-1 mg, most preferably about 300-800 ⁇ g in a 500 ⁇ l solution.
  • the term “about” means +/ ⁇ 10 percent of a given value unless otherwise stated.
  • One skilled in the art can adjust the actual amount of peptide used based on several factors, such as the individual's immune status and / or the amount of TUMAP presented in a particular type of cancer. I will.
  • the peptide of the present invention may be provided in other suitable forms (such as a sterilized solution) other than the frozen lysate.
  • the pharmaceutical composition of the present invention having a peptide and / or nucleic acid according to the present invention is administered to a patient with an adenoma or cancer disease associated with each corresponding peptide or antigen.
  • a T cell-mediated immune response is triggered, preferably a pharmaceutical composition of the present invention, wherein the peptide composition (especially tumor-related peptide) or nucleic acid of the pharmaceutical composition of the present invention, or the
  • the amount of the expression vector of the invention present in the composition is specific to the tissue, cancer, and / or patient.
  • the vaccine of the invention is a nucleic acid vaccine. It is well known that vaccination with a nucleic acid vaccine, such as a DNA vaccine encoding a polypeptide, elicits a T cell response.
  • a nucleic acid vaccine such as a DNA vaccine encoding a polypeptide
  • the tumor or cancer vaccine can be administered directly to the patient in its diseased organ or systemically, or in vitro applied to cells or human cell lines from the patient, or in vitro
  • the sub-population from the patient's immune cells can be selected and administered to the patient again.
  • the nucleic acid is administered to cells in vitro, it may be useful to transfer the cells so as to co-express immunostimulatory cytokines such as interleukin-2 or GM-CSF.
  • the nucleic acid can be substantially pure, or combined with an immunostimulatory adjuvant, used in combination with an immunostimulatory cytokine, or administered with an appropriate delivery system (eg, a liposome).
  • the nucleic acid vaccine may be administered with an adjuvant as described for the peptide vaccine above. Preferably, the nucleic acid vaccine is administered without an adjuvant.
  • the polynucleotide of the present invention may be substantially pure or contained in a suitable vector or delivery system.
  • suitable vectors and delivery systems include those that are viral, such as adenoviruses, vaccinia viruses, retroviruses, herpesviruses, adeno-associated viruses, or hybrid-based systems that contain multiple viral elements . Included as non-viral delivery systems are cationic lipids and cationic polymers well known in the DNA delivery art. Physical delivery such as a “gene gun” can also be used.
  • the peptide, or peptide encoded by the nucleic acid can be a fusion protein, for example, a fusion protein with an epitope from a tetanus toxoid that stimulates CD4 positive T cells.
  • nucleic acid vaccine can have any nucleic acid delivery means.
  • the nucleic acid, preferably DNA, can be delivered in liposomes or as part of a viral vector delivery system.
  • Nucleic acid vaccines such as sputum DNA vaccines, are preferably administered intramuscularly, and peptide vaccines are preferably administered at s.c. or i.d. It is also preferred to administer the vaccine intradermally.
  • Nucleic acid uptake by professional antigen-presenting cells such as dendritic cells and expression of the encoded polypeptide may be the priming mechanism of the immune response.
  • dendritic cells may not be transferred, it is still important because they can take up the expressed peptide from the transferred cells in the tissue (“cross-priming”, eg Thomas : AM, Santarsiero LM).
  • cross-priming eg Thomas : AM, Santarsiero LM
  • Lutz ER Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM.
  • Mesothelin-specific CD8 (+) T cell responses provide creativic cross-primingpresentaccv cancerpatients. J Exp Med. 2004 Aug 2; 200 (3): 297-306).
  • the target of the vaccine of the present invention is directed to a specific cell population, such as antigen presenting cells, by use of an injection site, targeting vector and delivery system, or selective purification of a specific cell population from a patient.
  • a targeting vector can have a tissue or tumor specific promoter that directs expression of the antigen at the appropriate location.
  • the vaccine of the present invention may depend on the type of cancer specific to the patient being treated and the disease state, previous treatment regimen, the patient's immune status, and, of course, the patient's HLA haplotype.
  • the vaccine according to the invention can comprise individual components according to the personal needs of a particular patient. Examples are the amount of different peptides in a particular patient depending on the expression of the relevant TAA, the side effects of individual allergies or other treatments, and the adjustment of secondary treatment after a series of initial treatment regimens.
  • the peptide of the present invention is useful not only for cancer treatment but also for diagnosis. Since these peptides are produced from glioblastoma, and it has been specified that these peptides are not present in normal tissues, the presence of cancer can be diagnosed using these peptides.
  • Pathologists can aid in the diagnosis of cancer by the presence of the peptides of the present invention on tissue biopsy.
  • a pathologist can know whether the tissue is malignant, inflamed or generally affected by detection of specific peptides of the invention, mass spectrometry, or other methods well known in the art using antibodies. it can.
  • the presence of the group of peptides of the present invention allows the classification or subclassification of affected tissues.
  • Detection of the peptides of the present invention in diseased tissue specimens allows decisions on the benefits of therapy involving the immune system, especially when T lymphocytes are known or expected to be involved in the mechanism of action. To do. Loss of MHC expression is a well-understood mechanism that allows malignant cells to escape immune surveillance. Thus, the presence of the peptides of the present invention indicates that this mechanism is not utilized by the analyzed cells.
  • the peptide of the present invention can be used for analysis of lymphocyte response to the peptide of the present invention.
  • a T cell response or antibody response to the peptide of the present invention or a peptide of the present invention which is a complex with an MHC molecule can be used.
  • These lymphocyte responses can be used as prognostic markers to determine further treatment steps.
  • These responses can also be used as surrogate markers in immunotherapy approaches that seek to elicit lymphocyte responses by different means such as, for example, vaccination of proteins, nucleic acids, self-substances, lymphocyte immune transfer.
  • lymphocyte responses to the peptides of the invention can be taken into account in the evaluation of side effects. Monitoring of lymphocyte responses may be useful in follow-up testing after transplantation therapy, for example, in detecting graft-to-host and host-to-graft disease.
  • the peptide of the present invention can be used for production and development of an antibody specific to the MHC / peptide complex. They can be used in therapy to target the affected tissue and apply a toxin or radioactive material. Another use of these antibodies is to target them against radionuclides against diseased tissue for imaging methods such as PET. This method of use can help detect small metastases or determine the size and exact location of diseased tissue.
  • the peptides can be used for verification of cancer diagnosis based on biopsy specimens performed by a pathologist.
  • kits are a unit provided with a portion to be provided (eg, a test agent, a diagnostic agent, a therapeutic agent, an antibody, a label, instructions, etc.) usually divided into two or more compartments.
  • a portion to be provided eg, a test agent, a diagnostic agent, a therapeutic agent, an antibody, a label, instructions, etc.
  • This kit form is preferred when it is intended to provide a composition that should not be provided in admixture for stability or the like, but preferably used in admixture immediately before use.
  • kits preferably include instructions or instructions that describe how to use the provided parts (eg, test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, or how the reagents should be processed).
  • the kit when the kit is used as a reagent kit, the kit usually contains instructions including usage of test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, antibodies, etc. Is included.
  • the invention relates to a kit comprising: (a) a container containing the pharmaceutical composition of the invention in solution or lyophilized form; and (b) selected A second container containing a diluent or reconstitution liquid for the lyophilized formulation, and (c) optionally (i) use of the solution or (ii) reconstitution of the lyophilized formulation and And / or instructions for use.
  • the kit further comprises one or more (iii) a buffer, (iv) a diluent, (v) a filter, (vi) a needle, or (v) a syringe.
  • the container is preferably a bottle, vial, syringe, or test tube and may be a versatile container.
  • the pharmaceutical composition is preferably dried and frozen.
  • the kit of the present invention preferably has the dry frozen formulation of the present invention and instructions regarding its reconstitution and / or use in a suitable container.
  • suitable containers include, for example, bottles, vials (eg, dual chamber vials), syringes (such as dual champ syringes), and test tubes.
  • the container can be formed from a variety of materials such as glass or plastic.
  • the kit and / or container includes instructions on how to reconstitute and / or use that are on or associated with the container.
  • the label can indicate that the dried frozen formulation is reconstituted to the peptide concentration described above.
  • the label can further indicate that the formulation is useful for or for subcutaneous injection.
  • the container for the formulation may be a versatile vial that can be used for repeated administration (eg, 2-6 administrations).
  • the kit can further include a second container having a suitable diluent (eg, a baking soda solution).
  • the kit further includes other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and instructions inserted into the package. Can do.
  • the kit of the present invention has a single container containing the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention with or without other components (e.g., other compounds or pharmaceutical compositions of these other compounds). Or, each component can have a separate container.
  • the kit of the invention comprises a second compound (adjuvant (eg GM-CSF), chemotherapeutic agent, natural product, hormone or antagonist, anti-angiogenesis agent or angiogenesis inhibitor, apoptosis inducer or chelate Etc.) or a formulation of the invention packaged for use in combination with the co-administration of the pharmaceutical composition.
  • a second compound eg GM-CSF
  • chemotherapeutic agent eg GM-CSF
  • natural product e.g. GM-CSF
  • hormone or antagonist e.g., anti-angiogenesis agent or angiogenesis inhibitor, apoptosis inducer or chelate Etc.
  • a formulation of the invention packaged for use in combination with the co-administration of the pharmaceutical composition.
  • the components of the kit can be pre-made as a complex, or each component can be in a separate container until administered to a patient.
  • the kit components can be provided as one or more liquid solutions, preferably an aqueous solution, more preferably
  • the container of the therapy kit can be a vial, test tube, flask, bottle, syringe, or any other means of sealing a solid or liquid.
  • the kit includes a second vial or other container so that it can be dispensed separately.
  • the kit can also include another container for a pharmaceutically acceptable liquid.
  • the treatment kit includes a device (eg, one or more needles, syringes, eye drops, pipettes, etc.) that allows administration of an agent of the invention that is a component of the kit.
  • the pharmaceutical composition of the present invention administers the peptide by any acceptable route such as oral (enteral), nasal, ocular, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, or transdermal. It is suitable for. Preferably the administration is subcutaneous, most preferably intradermal. Administration can be performed by an infusion pump.
  • the “instruction sheet” describes the method for using the present invention for a doctor or other user.
  • This instruction manual includes a word indicating that the detection method of the present invention, how to use a diagnostic agent, or administration of a medicine or the like is given.
  • the instructions may include a word indicating that the administration site is oral or esophageal administration (for example, by injection).
  • This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national supervisory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc.) It is clearly stated that it has been received.
  • the instruction sheet is a so-called package insert and is usually provided in a paper medium, but is not limited thereto, and is in a form such as an electronic medium (for example, a homepage or an e-mail provided on the Internet). But it can be provided.
  • RNA extraction 5 mL of whole blood was collected from a healthy human subject in a heparin-containing blood vessel, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated by ficoll density gradient centrifugation. Isolated 5 ⁇ 10 6 RNeasy Lipid from PBMC cells Tissue Mini Kit (QIAGEN, Germany) was used to extract and purify total RNA. The obtained RNA was quantified by the absorbance of A260 using an absorptiometer. The concentration was 232 ng / ⁇ L at an eluate volume of 30 ⁇ L.
  • E. coli in the following double-stranded DNA synthesis buffer solution was used.
  • Coli DNA polymerase I E.I.
  • Double-stranded complementary DNA was synthesized by incubating at 16 ° C. for 2 hours in the presence of E. coli DNA Ligase and RNase H. Further, T4 DNA polymerase was reacted at 16 ° C. for 5 minutes to perform a 5 ′ end blunting reaction.
  • Double-stranded DNA was column purified by High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche) and then in the following T4 ligase buffer at 16 ° C in the presence of P20EA / 10EA adapter (Table 1-1) and T4 ligase. The ligation reaction was carried out by incubating overnight.
  • the adapter-added double-stranded DNA purified by the column as described above was digested with NotI restriction enzyme (50 U / ⁇ L, Takara) with the following composition in order to remove the adapter added to the 3 ′ end.
  • NotI restriction enzyme 50 U / ⁇ L, Takara
  • PCR Primary PCR amplification (1 st PCR) from double-stranded complementary DNA is performed using the common adapter primer P20EA and each immunoglobulin isotype C region specific primer (CM1, CA1, CG1, CD1, CE1). 20 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute were performed.
  • the primer sequences used are shown in Table 1-1.
  • PCR cycle was 20 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute.
  • the primer sequences used are shown in Table 1-1.
  • the DNA amounts of the recovered amplification products derived from the respective isotypes were IgM (1611 ng / mL), IgG (955 ng / mL), IgA (796 ng / mL), IgD (258 ng / mL), IgE (871 ng / mL), respectively. there were. These isotype amplification products were mixed so that the amounts of DNA were uniform, 10 million DNA was used for emulsion PCR, and sequence analysis was performed using a next-generation sequence analyzer (GS Junior bench top system) manufactured by Roche.
  • the crossover property of isotype-specific primers is shown in FIG.
  • amplification with another isotype-specific primer together with the target immunoglobulin isotype-specific primer was performed to confirm the presence or absence of cross-reactivity.
  • 10 ⁇ L of the GS-PCR amplification product was electrophoresed in 2% agarose gel in TAE buffer and evaluated by ethidium bromide staining.
  • the 2nd PCR amplification product amplified with each isotype-specific primer was confirmed to have high primer specificity without being amplified with other isotype-specific GS-PCR primers.
  • Fig. 2 shows the optimum dilution concentration.
  • the optimum conditions for GS-PCR in each isotype were examined. A 2-fold serial dilution series of 2nd PCR amplification products was prepared, and 20 cycles of GS-PCR were performed. Good results were obtained at 16-fold dilution.
  • Figure 3 shows the optimum number of cycles. PCR was performed for 10, 15, and 20 cycles using a 16-fold diluted 2nd PCR amplification product. In IgM, IgG, IgA, and IgD, good amplification was confirmed in 10 cycles. Further, it was confirmed that 20 cycles is appropriate for IgE.
  • FIG. 4 shows the read length of the next generation sequence of the BCR gene.
  • the number of leads of raw data was 130,000, and the number of leads passed through Filter pass was 90,000 or more.
  • Table 1-2 shows the number of leads derived from each isotype labeled.
  • the lead length by MID is shown in FIG.
  • the number of leads divided by MID and the distribution of lead lengths were also uniform.
  • the lead length having a length sufficient for the analysis of the V region is counted as 400 bp or more, it is considered that about half of the 10,000 leads are effective for the BCR repertoire analysis.
  • the frequency of use of isotype-specific C region sequences is shown in FIG.
  • the obtained leads for each isotype were subjected to a homology search with immunoglobulin isotype C region sequences including subclasses.
  • the frequency of reads by subclass was 73% for IgA1 and 27% for IgA2 in the IgA subclass, 62% for IgG1 and 36% for IgG2, and almost no IgG3 and IgG4 reads were obtained. .
  • the specificity of the primer could be reconfirmed at the sequence level.
  • the V region repertoires by isotype are shown in Fig. 7 (AD).
  • the repertoire (BCR V repertoire) of the V region sequence by isotype is shown.
  • the BCR V repertoire was very similar among IgM, IgG, IgA, and IgD, but only the lead with IGHV3-30 was obtained for IgE. This is because the number of IgE positive cells in peripheral blood is very small compared to other classes, suggesting the possibility that a biased repertoire was detected.
  • the V region repertoire by subtype is shown in Fig. 8 (AD).
  • BCR V repertoires by IgA and IgG subclass are shown.
  • the subclasses of IgA differed in the frequency of several V chains between IgA1 and IgA2.
  • IGHV1-18 and IGHV4-39 were higher in IgA1 than IgA2, while IGHV3-23 and IGHV3-74 were higher in IgA2 than IgA1.
  • the frequency of IGHV3-23 and IGHV3-74 which showed an increase in IgA2, was higher in IgG2 compared to IgG1.
  • the number of reads of IgG3 and IgG4 is small (10 reads).
  • IgG3 clones with IGHV4-59-IGHJ4-IGHD1-7 have a high clonality of 3/10, and IGHV3-23-IGHJ4-IGHD3- is also used for IgG4. Leads with 10 accounted for 5/10 (Table 1-3).
  • Figure 9 shows BCRJ repertoires by subclass.
  • IgM IgG, IgA, and IgD
  • IGHJ4 was used in about half of the leads while IGHJ2 was rarely used.
  • IgE only IGHJ1 was used.
  • IGHJ repertoires in the IgM and IgA subclasses were also examined. Unlike the IGHV repertoire, there was no significant difference between subclasses.
  • TCR repertoire was analyzed in peripheral blood of healthy individuals.
  • RNA extraction From 10 healthy individuals, 5 mL of whole blood was collected in heparin-containing blood collection tubes, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated by ficoll density gradient centrifugation. Total RNA was extracted and purified from the isolated PBMC using RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Germany). The obtained RNA was quantified using an Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent). The obtained RNA amounts are shown in the following Table 1-4.
  • Adapter-ligation PCR was performed using the extracted RNA sample. The method was carried out according to the method shown in Preparation Example 1. Specifically, BSL-18E primer (Table 1-5) and RNA were mixed and annealed, and then complementary strand DNA was synthesized using reverse transcriptase. Subsequently, double-stranded complementary DNA was synthesized, and a 5 ′ end blunting reaction was performed using T4 DNA polymerase. After column purification by High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche), a P20EA / P10EA adapter was added by a ligation reaction. The adapter-added double-stranded complementary DNA purified by the column was digested with NotI restriction enzyme.
  • PCR From the double-stranded complementary DNA, using the common adapter primer P20EA shown in Table 1-1 and the TCR ⁇ -chain or ⁇ -chain C region specific primer (CA1 or CB1), 1 st which is the product of the first PCR amplification reaction PCR amplification was performed. PCR had the following composition, and 20 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute were performed.
  • 2nd PCR was performed using the P20EA primer and the TCR ⁇ chain or ⁇ chain C region specific primer (CA2 or CB2) with the following reaction composition.
  • the PCR cycle was 20 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute.
  • the primer was removed from the obtained 2nd PCR amplification product, which was the product of the second PCR amplification reaction, using High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche), and further 10-fold diluted 2nd PCR amplification product was used as a template. Analysis was performed using a generation sequence analyzer (GS Junior Bench Top System).
  • a B-P20EA primer obtained by adding an adapter B sequence to the P20EA adapter primer shown in FIG. 10, an adapter A sequence and a TCR ⁇ chain or ⁇ chain C region specific sequence, and each MID tag sequence (MID-1 to 26) HuVaF-01 to HuVaF10 ( ⁇ chain) and HuVbF-01 to HuVbF-10 ( ⁇ chain) to which was added were used.
  • the primer sequences used are shown in Table 1-6.
  • the PCR cycle was 10 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute.
  • 10 ⁇ L of the amplified product was amplified by 2% agarose gel electrophoresis (FIG. 11).
  • a band containing an amplification product of about 600 bp was visually cut out and purified using a DNA purification kit (QIAEX II Gel Extraction Kit, Qiagen).
  • the recovered PCR amplification product was measured for the amount of DNA by Quant-T TM PicoGreen (registered trademark) dsDNA Assay Kit (Invitrogen).
  • Table 1-7 shows the amount of DNA recovered from 10 healthy individuals.
  • the obtained sequence data (SFF file) was classified into read sequences for each MID Tag by using GS Junior attached software (sffile or sffinfo), and a Fasta format sequence file was generated.
  • the average number of leads obtained was TRA: 17840 leads, TRB: 5122 leads, and the ratio of raw data of 200 bp or more was TRA: 34.9-63.7% (average 42.2%), TRB: 68.8- It was 78.7% (average 73.1%) (Table 1-8).
  • the reference sequence of the IMGT the international ImmunGeneTics information system, www.imgt.org
  • FIGS. 13 (A to D), 14 (A to D), 15 (A to D), and FIG. 16 show TRV and TRJ repertoire generated using leads obtained by Repertoire Genesis.
  • FIG. 10 shows a method for amplifying the TCR gene. Amplification was performed using a B-P20EA primer with B-adaptor added to the P20EA adapter primer and a primer with A-adaptor and MID tag sequences (MID-1 to 26) added to the 3rd nested primer.
  • the confirmation of the GS-PCR amplification product is shown in FIG.
  • Ten ⁇ L of GS-PCR amplification products derived from 10 healthy subjects were electrophoresed on a 2% agarose gel.
  • the upper row shows GS-PCR (TRA) (TCR ⁇ chain amplification product), and the lower row shows GS-PCR (TRB) (TCR ⁇ chain amplification product).
  • TRA GS-PCR
  • TRB GS-PCR
  • the TRAV repertoire for healthy individuals is shown in FIG.
  • the TRAV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • the presence frequency of TRAV9-2, 12 and 13 was high, TRAV20 in # 1, TRAV21 in # 5 was higher than other healthy individuals, and individual differences were also observed.
  • the TRBV repertoire for healthy individuals is shown in FIG. The TRBV repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown. The presence frequency of TRBV20-1, 28, and 29-1 was high. In # 8, TRBV3-1 was higher than other healthy individuals, and individual differences were observed. *
  • TRAJ repertoire in healthy individuals is shown in FIG. TRAJ repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown. TRAJ repertoires of healthy individuals show that within about 5% of all AJ families, TRAJ12 in # 1, TRAJ27 in # 4, TRAJ37 in # 5, TRAJ45 in # 8 are higher than other healthy individuals, and individual differences are observed It was.
  • FIG. 16 shows the TRBJ repertoire for healthy individuals.
  • the TRBJ repertoire and average values of 10 healthy subjects were shown.
  • TRBJ repertoire had a high frequency of TRBJ2-1, 2-3, and 2-7, and in # 8, TRBJ2-2 was high, showing individual differences.
  • TCR and BCR gene amplification by non-biased Adapter-ligation PCR method TCR and BCR gene amplification by non-biased Adapter-ligation PCR method.
  • RNA extraction From one healthy subject, 5 mL of whole blood was collected in a heparin-containing blood collection tube, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated by Ficoll density gradient centrifugation. Isolated 5 ⁇ 10 6 RNeasy Lipid from PBMC cells Tissue Mini Kit (QIAGEN, Germany) was used to extract and purify total RNA.
  • E. coli in the following double-stranded DNA synthesis buffer solution was used.
  • Coli DNA polymerase I E.I.
  • Double-stranded complementary DNA was synthesized by incubating at 16 ° C. for 2 hours in the presence of E. coli DNA Ligase and RNase H. Further, T4 DNA polymerase was reacted at 16 ° C. for 5 minutes to perform a 5 ′ end blunting reaction.
  • Double-stranded DNA was purified by column using High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche) and then in the following T4 ligase buffer at 16 ° C in the presence of P20EA / 10EA adapter (Table 1-1) and T4 ligase. The ligation reaction was carried out by incubating overnight.
  • the adapter-added double-stranded DNA purified by the column as described above was digested with NotI restriction enzyme (50 U / ⁇ L, Takara) with the following composition in order to remove the adapter added to the 3 ′ end.
  • NotI restriction enzyme 50 U / ⁇ L, Takara
  • the 1st PCR from double-stranded complementary DNA was performed using P20EA and TCRC region specific primers (CA1, CB1, CG1, CD1) or immunoglobulin isotype C region specific primers (CM1, CA1, CG1, CD1). , CE1, CK1, CL1).
  • Primers were set on the 3 ′ end, center or 5 ′ side of the C region so as to amplify the sequence including the full length of the C region. With the reaction composition shown, a cycle of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute was performed 20 cycles.
  • the primer sequences used are shown in Table 1-1.
  • PCR cycle was 20 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute.
  • the primer sequences used are shown in Table 1-1.
  • FIGS. The primer positions relative to the template are shown in FIGS. This indicates that a considerable range of regions are suitable as the PCR primer for the purpose of the present invention, and it is understood that a specific sequence can be determined as appropriate based on the principle of the present invention.
  • Example Normal human peripheral blood mononuclear cells, MOLT-4 human acute lymphoblastic leukemia cell line (Method) (1. Culture of T cell leukemia cell line) As a T cell line expressing T cell receptor (TCR), human acute lymphoblastic leukemia cell line Molt-4 was used. The cells were cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 100 IU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine at 37 ° C. under 5% CO 2 to give a total cell count of 1 ⁇ 10 7. Cells were collected. The cells were washed with RPMI-1640 medium, and the cells were suspended at 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • RNA extraction and RNA amount measurement Total RNA was extracted and purified from the serially diluted cell suspension using RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, Germany). Elution was performed with 20 ⁇ L of the eluate, and the amount of RNA was quantified based on the absorbance of A260 using an Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent). The RNA electrophoresis image is shown in FIG. 26, and the amount of RNA obtained from each sample is shown in Table 1-4B.
  • RNAsin RNase inhibitor
  • E. coli in the following double-stranded DNA synthesis buffer solution was used.
  • Coli DNA polymerase I E.I.
  • Double-stranded complementary DNA was synthesized by incubating at 16 ° C. for 2 hours in the presence of E. coli DNA Ligase and RNase H. Further, T4 DNA polymerase was reacted at 16 ° C. for 5 minutes to perform a 5 ′ end blunting reaction.
  • Double-stranded DNA was purified by column using High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche) and then in the following T4 ligase buffer at 16 ° C in the presence of P20EA / 10EA adapter (Table 1-4E) and T4 ligase. The ligation reaction was carried out by incubating overnight.
  • the adapter-added double-stranded DNA purified by the column as described above was digested with NotI restriction enzyme (50 U / ⁇ L, Takara) with the following composition in order to remove the adapter added to the 3 ′ end.
  • NotI restriction enzyme 50 U / ⁇ L, Takara
  • PCR From double-stranded complementary DNA, using a common adapter primer P20EA and TCR ⁇ chain or ⁇ chain C region-specific primers shown in Table 1-1 (CB1), it was performed 1 st PCR amplification. PCR had the following composition, and 20 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute were performed.
  • PCR cycle was 20 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute.
  • Primers were removed from the obtained 2nd PCR amplification product using High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche), and further 10-fold diluted 2nd PCR amplification product was used as a template, Roche's next-generation sequencing analyzer (GS Junior bench top system) ) was conducted.
  • a B-P20EA primer obtained by adding an adapter B sequence to a P20EA adapter primer and a HuVbF Primer obtained by adding an adapter A sequence and each MID tag sequence to a TCR ⁇ chain C region specific sequence were used.
  • the PCR cycle was 10 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute.
  • the obtained sequence data (SFF file) was classified into read sequences according to MID Tag by GS Junior attached software (sfffile or sffinfo), and a Fasta format sequence file was generated. The number of effective leads obtained was 11,651.
  • the repertoire analysis software (Repertoire Genesis)
  • the reference sequence of the IMGT database was compared, and the assignment of the BV region and BJ region of each read and the determination of the CDR3 sequence were performed.
  • an in-frame TCR lead (Read 1) having a functional sequence and a frame-shifted TCR lead (Read 2) were observed (Table 1-4J). All were detected with a similar frequency, and were assumed to be TCR genes derived from Molt-4 cells.
  • RNA electrophoresis image by Agilent 2100 bioanalyzer is shown in FIG.
  • Total RNA was extracted from the cell serial dilution, and the amount of RNA was measured using an Agilent bioanalyzer.
  • RNA was separated using a microchip electrophoresis apparatus, and RNA quality was checked. In both samples, 28S (upper band) and 18S rRNA (lower band) were detected, indicating that RNA that had not undergone degradation was obtained.
  • TCR reads in Molt-4 cell serially diluted samples are shown in FIGS. 27 (A to D) (SEQ ID NOS: 1165 to 1324).
  • the TCR leads obtained from 10%, 1%, 0.1% and 0.01% of each Molt-4 serially diluted sample are listed in Table 1. Ranking in order of the number of leads, showing the top 40. Rankings 365-404 were shown for 0.01% samples.
  • the TRBV, TRBJ and CDR3 amino acid sequences of each lead and the number of reads are shown.
  • a functional TCR lead derived from Molt-4 (TRBV20-1 / TRBJ2-1 / CSARESTTSDPKNEQFFG (SEQ ID NO: 1166)) is shown in bold and background gray, and the other functional defect is predicted (TRBV10-3 / TRBJ2) ⁇ 5 / CAISEPTTGIRRDDPVLR (SEQ ID NO: 1165)) is shown in bold.
  • FIG. 28 shows the number of TCR leads and detection sensitivity in the Molt-4 cell serially diluted sample.
  • Two TCR reads were detected from Molt-4 cells ( ⁇ : TRBV20-1 / TRBJ2-1 / CSARESTSDPKNEQFFG (SEQ ID NO: 1166), ⁇ : TRBV10-3 / TRBJ2-5 / CAISEPTGIRRDPVLR (SEQ ID NO: 1165)).
  • the percentage of Molt-4 derived TCR reads detected in TCR reads obtained from 10%, 1%, 0.1% and 0.01% of each Molt-4 serially diluted sample is shown.
  • the detection limit (Detection limit) of each read was 0.1% ( ⁇ ) and 0.01% ( ⁇ ).
  • a lead set was used in which BCR cDNA obtained in an unbiased manner from RNA obtained from peripheral blood mononuclear cells of one healthy subject was sequenced by Roche GS-Junior. It is a lead set for each class of IgM, IgG, IgA, IgD, and IgE.
  • FIG. 30 An overall view of the method is shown in FIG. 30 (FIG. 29 shows a TCR analysis scheme).
  • the previously reported allele nucleic acid sequence was obtained from IMGT and used. Although BLASTN was used for the homology search, the following parameters were set for each region.
  • the indicators for selecting the closest reference allele were applied in the following order of priority:
  • Table 2-3 and Table 2-4 show a comparison of D repertoires between classes. The number of appearance reads was described for each gene name and CDR3 amino acid sequence, and the gene name and amino acid sequence of lead number 1 were omitted.
  • FIG. 32 (A and B) shows the V repertoire
  • FIG. 33 shows the J repertoire.
  • FIG. 34 (A and B) shows a comparison of V repertoires between subclasses.
  • FIG. 35 shows a comparison of J repertoires between subclasses.
  • the frequency is derived for the combination of the D gene name and the CDR3 amino acid sequence.

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Abstract

非バイアスの遺伝子配列解析を用いてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うこと。本発明は以下を提供する：データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法であって、該方法は、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程を包含する、方法。

Description

Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体レパトアの解析システムならびにその治療および診断への利用
　本発明は、生体試料から遺伝子再構成によって生じる遺伝子についてバイアスをかけることなく増幅する技術と得られた遺伝情報を解析するシステムならびにその治療および診断に関する。
　免疫システムによる生体防御機構は、主にＴ細胞やＢ細胞によって担われる特異的免疫に大きく依存している。Ｔ細胞やＢ細胞は自己の細胞や分子には反応せず、ウイルスや細菌などの外来性の病原体を特異的に認識して攻撃することができる。そのために、Ｔ細胞やＢ細胞は細胞表面上に発現した受容体分子によって自己抗原とともに他の生物由来の多様な抗原を認識し、識別できる機構を有している。Ｔ細胞ではＴ細胞受容体（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　ＴＣＲ）が、Ｂ細胞ではＢ細胞受容体（Ｂ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　ＢＣＲ）が抗原受容体として働く。それら抗原受容体からの刺激によって細胞内シグナルが伝達され、炎症性サイトカインやケモカインなどの産生が亢進し、細胞増殖が増進され、様々な免疫応答が開始される。　ＴＣＲは、抗原提示細胞上に発現する主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ，　ＭＨＣ）のペプチド結合溝に結合したペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣ　ｃｏｍｐｌｅｘ，　ｐＭＨＣ）を認識することで、自己と非自己を識別するとともに抗原ペプチドを認識している（非特許文献１）。ＴＣＲは、２つのＴＣＲポリペプチド鎖からなるヘテロダイマー受容体分子であり、通常のＴ細胞が発現するαβ型ＴＣＲと特殊な機能をもつγδ型ＴＣＲが存在する。αおよびβ鎖ＴＣＲ分子は複数のＣＤ３分子（ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖）と複合体を形成し、抗原認識後の細胞内シグナルを伝達し、様々な免疫応答を開始させる。ウイルス感染に伴い細胞内で増殖したウイルス抗原やがん細胞由来のがん抗原などの内在性抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原ペプチドとして提示される。また、外来微生物由来の抗原はエンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、プロセシングを受けたのちにＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。これらの抗原は、それぞれＣＤ８＋　Ｔ細胞あるいはＣＤ４＋　Ｔ細胞の発現するＴＣＲにより認識される。ＴＣＲ分子を介した刺激には、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０分子などの共刺激分子が重要であることも知られている。
　ＴＣＲ遺伝子は、ゲノム上では異なる領域にコードされた多数のＶ領域（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ）、Ｊ領域（ｊｏｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、Ｊ）、Ｄ領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｒｅｇｉｏｎ、Ｄ）と定常領域のＣ領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ，　Ｃ）から成る。Ｔ細胞の分化過程において、これら遺伝子断片が様々な組み合わせで遺伝子再構成され、α鎖およびγ鎖ＴＣＲはＶ－Ｊ－Ｃから成る遺伝子を、β鎖およびδ鎖ＴＣＲはＶ－Ｄ－Ｊ－Ｃから成る遺伝子を発現する。現在、ＩＭＧＴ（ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏ　ＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｐｒｏｊｅｃｔ）のデータベースでは、機能的α鎖ＴＣＲ　Ｖ遺伝子断片（ＴＲＡＶ）は４３種、ＴＣＲ　Ｊ遺伝子断片（ＴＲＡＪ）は５０種、機能的β鎖ＴＣＲ　Ｖ遺伝子断片（ＴＲＢＶ）４０－４２種、ＴＣＲ　Ｄ遺伝子断片（ＴＲＢＤ）２種、ＴＣＲ　Ｊ遺伝子断片（ＴＲＢＪ）１３種、機能的γ鎖Ｖ遺伝子断片（ＴＲＧＶ）４～６種、ＴＣＲ　Ｊ遺伝子断片（ＴＲＧＪ）５種、機能的δ鎖Ｖ遺伝子断片（ＴＲＤＶ）３種、ＴＣＲ　Ｄ遺伝子断片（ＴＲＤＤ）３種、ＴＣＲ　Ｊ遺伝子断片（ＴＲＤＪ）４種が知られる（非特許文献２）。これら遺伝子断片の再構成により多様性が創出されるとともに、ＶとＤあるいはＤとＪ遺伝子断片の間に１つ以上の塩基の挿入や欠失が起こることにより、ランダムなアミノ酸配列が形成され、より多様性の高いＴＣＲ遺伝子配列が作り出されている。
　ＴＣＲ分子とｐＭＨＣ複合体表面が直接結合する領域（ＴＣＲフットプリント）は、Ｖ領域内の多様性に富んだ相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から構成される。中でもＣＤＲ３領域はＶ領域の一部、ランダム配列により形成されるＶ－Ｄ－Ｊ領域とＪ領域の一部を含み、最も多様性に富んだ抗原認識部位を形成している。一方、他の領域はＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれ、ＴＣＲ分子の骨格となる構造を形成する役割を果たしている。胸腺におけるＴ細胞の分化成熟過程において、β鎖ＴＣＲが最初に遺伝子再構成され、ｐＴα分子と会合してｐｒｅ－ＴＣＲ複合体分子を形成する。その後、α鎖ＴＣＲが再構成され、αβＴＣＲ分子が形成されるとともに、機能的αβＴＣＲが形成されない場合はもう一方のα鎖ＴＣＲ遺伝子アレルにおいて再構成が起こる。胸腺における正・負の選択を受け、適切な親和性をもったＴＣＲが選択され、抗原特異性を獲得することが知られる（非特許文献３）。
　ＢＣＲは、免疫グロブリン（Ｉｇ）として知られ、Ｉｇの膜結合型はＢＣＲとして抗原受容体分子として働き、その分泌型蛋白は抗体として細胞外に分泌される。抗体はＢ細胞が最終分化した形質細胞（プラズマ細胞）から大量に分泌され、ウイルスや細菌などの病原体分子に結合することで、またその後に続く補体結合反応などの免疫反応によって病原体を排除する働きを持つ。ＢＣＲはＢ細胞表面に発現され、抗原に結合したのち細胞内シグナルを伝達し、様々な免疫応答や細胞増殖を開始させる。ＢＣＲの特異性は抗原結合部位のアミノ酸配列の多様性によって担われている。抗原結合部位の配列はＢＣＲ分子間で大きく異なり、可変部（Ｖ領域）と呼ばれている。一方、定常領域（Ｃ領域）の配列は、ＢＣＲ分子間あるいは抗体分子間で高度に保存され、抗体のエフェクター機能や受容体のシグナル伝達機能を有している。
　ＢＣＲと抗体は膜結合ドメインの有無を除いて同一である。Ｉｇ分子は、２本の重鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ、Ｈ鎖）と２本の軽鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、Ｌ鎖）のポリペプチド鎖からなる。一つのＩｇ分子では、２本のＨ鎖どうしが、また１本のＨ鎖と１本のＬ鎖がジスルフィド結合によって結合している。Ｉｇには、μ鎖、α鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖と呼ばれる異なる５つのＨ鎖クラス（アイソタイプ）が存在し、それぞれＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥと呼ばれている。通常、生体防御に働く高い特異性を持った抗体はＩｇＧ型抗体であり、粘膜免疫に関与するＩｇＡ型抗体やアレルギー、喘息、アトピー性皮膚炎に重要なＩｇＥ型抗体など、アイソタイプによりその機能や役割が異なることが知られる。さらに、アイソタイプには、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などの数種のサブクラスが存在することが知られる。Ｌ鎖にはλ鎖（ＩｇＬ）とκ鎖（ＩｇＫ）の２種類が存在し、どのクラスのＨ鎖とも結合することができ、機能的な違いはないと考えられている（非特許文献４）。
　ＢＣＲ遺伝子は、ＴＣＲ遺伝子と同様に体細胞内で起こる遺伝子再構成によって形成される。可変部はゲノム上でいくつかの遺伝子断片に分かれてコードされ、それらが細胞の分化過程において体細胞遺伝子組み換えを起こす。Ｈ鎖の可変部の遺伝子配列は、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｄ領域と異なるアイソタイプを規定しているＣ領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ）からなる。それぞれの遺伝子断片はゲノム上では離れて存在するが、遺伝子再構成によって一連のＶ－Ｄ－Ｊ－Ｃ遺伝子として発現される。ＩＭＧＴのデータベースでは、機能的ＩｇＨ鎖Ｖ遺伝子断片（ＩＧＨＶ）は３８～４４種、Ｄ遺伝子断片（ＩＧＨＤ）は２３種、Ｊ遺伝子断片（ＩＧＨＪ）は６種、機能的ＩｇＫ鎖Ｖ遺伝子断片（ＩＧＫＶ）３４種、Ｊ遺伝子断片（ＩＧＫＪ）５種、機能的ＩｇＬ鎖Ｖ遺伝子断片（ＩＧＬＶ）２９～３０種、Ｊ遺伝子断片（ＩＧＬＪ）５種が知られる。これらの遺伝子断片が遺伝子再構成をすることでＢＣＲの多様性を確保している。さらに、ＴＣＲ同様にランダムなアミノ酸配列の挿入や欠失によって高度な多様性をもつＣＤＲ３領域が形成される（非特許文献２）。
　Ｂ細胞の分化成熟過程において、未熟なＢ細胞によって最初にＩｇＭが産生される。抗原に晒されていないナイーブＢ細胞はＩｇＭとＩｇＤを共発現し、抗原の刺激を受けて活性化した後に、可変部の配列はそのままでＩｇＭのＣ領域であるＣμとＩｇＧのＣ領域配列であるＣγを変換させるクラススイッチ（アイソタイプスイッチ）が起こる。同様に、Ｃμは、ＩｇＡのＣ領域（Ｃα）あるいはＩｇＥのＣ領域（Ｃε）と変換して、ＩｇＡやＩｇＧを産生するようになる。これらクラススイッチ組換えにより、病原体を排除するために必要な種類の抗体が必要な場所で産生されることになる。さらに、クラススイッチを受けたＢ細胞の増殖過程において、ＩｇＧ、ＩｇＡあるいはＩｇＥ領域の可変部において高頻度に突然変異が起こる（体細胞超変異、ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）。その結果、抗原に対してより高い特異性を獲得したＢ細胞がさらに刺激を受け、増殖し、この過程を通してより高い特異性を持った抗体産生Ｂ細胞が選択される（親和性成熟、ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）（非特許文献５）。
　Ｔ細胞またはＢ細胞は、特定の抗原に対し高い特異性を持った１種類のＴＣＲまたはＢＣＲを産生する。生体には多数の抗原特異的Ｔ細胞やＢ細胞が存在することで、多様なＴＣＲレパートリー（レパトア）やＢＣＲレパトアが形成され、様々な病原体に対する防御機構として有効に機能することができる。したがって、免疫細胞の特異性や多様性の重要な指標であるＴＣＲやＢＣＲレパトアの解析は、単クローン性や免疫異常の解析に有用な解析ツールである。仮に、Ｔ細胞あるいはＢ細胞が抗原に反応して増殖した場合、多様なレパトアの中で特定のＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子の割合が増加することが観察される（クローナリティーの増加）。ＴＣＲやＢＣＲレパトア解析により、ＴＣＲあるいはＢＣＲを発現するリンパ系細胞の腫瘍化をクローナリティーの増加として検出する試みがなされてきた（非特許文献６）。また、スーパー抗原のような特定のＶβ鎖を有するＴＣＲを選択的に刺激する分子に暴露された場合は、特定のＶβ鎖の使用頻度が増加することが報告されている（非特許文献７）。抗原特異的免疫応答を調べる目的で、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、シェーグレン症候群、特発性血小板減少性紫斑病などの免疫異常により発症する難治性の自己免疫疾患の解析にも多く利用され、その有用性が示されてきた。
　従来のＴＣＲレパトア解析とは、試料中のＴ細胞が個々のＶ鎖をどれくらい使用するかを調べる解析法である。その一つは、特定のＶβ鎖特異的抗体を用いて、個々のＶβ鎖を発現するＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析する方法である（ＦＡＣＳ解析）。この手法には、比較的多くの細胞を必要とすることからリンパ球を多く含む末梢血の解析には有用であるが、組織材料由来の試料には適応できない。また、現在でもすべてのＶ鎖に対応する抗体が入手できないことから、網羅的な解析を行うことはできない。
　その他に、ヒトゲノム配列から入手されるＴＣＲ遺伝子の情報をもとに、分子生物学的手法によるＴＣＲレパトア解析が考案されてきた。細胞試料からＲＮＡを抽出し、相補的ＤＮＡを合成後、ＴＣＲ遺伝子をＰＣＲ増幅して定量する方法である。個々のＴＣＲ　Ｖ鎖特異的プライマーを多数設計して、別個にリアルタイムＰＣＲ法等で定量する方法、あるいはそれら特異的プライマーを同時に増幅する方法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲ）法が用いられてきた。しかしながら、各Ｖ鎖について内在性コントロールを用いて定量する場合でも、利用するプライマーが多いと正確な解析ができない。さらに、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲ法ではプライマー間の増幅効率の差が、ＰＣＲ増幅時のバイアスを引き起こす欠点がある。このＭｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲ法の欠点を克服するため、鶴田らはＴＣＲ遺伝子の二本鎖相補的ＤＮＡの５’末端にアダプターを付加した後に、共通のアダプタープライマーとＣ領域特異的プライマーによってすべてのγδＴＣＲ遺伝子を増幅するＡｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲ法を報告した（非特許文献８）。さらに、αβＴＣＲ遺伝子の増幅にも応用し、個々のＶ鎖に特異的なオリゴプローブによって定量するＲｅｖｅｒｓｅ　ｄｏｔ　ｂｌｏｔ法（非特許文献９）やＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ法（非特許文献１０）が開発された。これらの方法は、バイアスを生じることなくＴＣＲ遺伝子を増幅する優れた方法であるが、Ｖ鎖使用頻度以外の情報はほとんど得ることができない。Ｊ鎖、Ｄ鎖あるいは抗原認識部位であるＣＤＲ３領域の塩基配列情報などは、その後のＴＣＲ遺伝子の相補鎖ＤＮＡのクローニングと塩基配列決定によって行う必要があった。
　近年、急速に進歩した次世代シーケンス解析技術により大規模な遺伝子の塩基配列決定が可能になった。ヒト試料からＴＣＲ遺伝子をＰＣＲ増幅し、次世代シーケンス解析技術を利用することで、従来は小規模かつＶ鎖使用頻度など限られた情報を得るＴＣＲレパトア解析から、クローンレベルのより詳細な遺伝子情報を入手して解析する次世代ＴＣＲレパトア解析法が実現できるようになった。そのような中、いくつかの次世代ＴＣＲレパトア解析法が開発され（特許文献１および２）、他の試みもなされている（特許文献３～１１）。
国際公開ＷＯ２００９／１３７２５５ 国際公開ＷＯ２０１３／０５９７２５ 特開平１０－２２９８９７ 特表２００７－５１５１５４ 特表２０１２－５０８０１１ 特開２０１３－１１６１１６ 特表２０１３－５２４８４８ 特表２０１３－５２４８４９ 国際公開２０１３／０３３７２１Ａ１ 国際公開２０１３／０４３９２２Ａ１ 国際公開２０１３／０４４２３４Ａ１
Cell 1994, 76, 287-299 Nucleic Acid Research, 2009, 37 (suppl1), D1006-D1012. Annual Review Immunology, 1993, 6,309-326 Annual Review Immunology, 2000, 18,495-527 Proc Natl Acad Sci, 1993, 90, 2385-2388 Leukemia Research, 2003, 27, 305-312 Immunology 1999, 96, 465-72. Journal of Immunological Methods, 1994,169, 17-23 Journal of Immunological Methods, 1997,201, 145-15. Human Immunology, 1997, 56, 57-69
　本発明は、（１）複数のゲノム上の遺伝子断片から遺伝子再構成により生成されたＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子配列を、バイアスをかけることなく均一に増幅する技術（非バイアス遺伝子増幅技術）、（２）その非バイアス遺伝子増幅技術により増幅したＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子を次世代シーケンス法により大規模に塩基配列決定し、Ｖ、Ｄ、Ｊ、Ｃ領域のアサインメントを行ってＴＣＲレパトアやＢＣＲレパトアを解析する手法を応用した解析方法および解析システムに関する発明である。
　ＴＣＲやＢＣＲはゲノム上に存在する複数のＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ領域の遺伝子断片の遺伝子再構成によって、多様な遺伝子配列を創出している。次世代シーケンス技術によってＴＣＲやＢＣＲ遺伝子の塩基配列を決定するため、多数存在するＶ領域に特異的なプライマーあるいはＪ領域に特異的なプライマーを多数作成し、同一の反応液中、あるいは別個の反応液中で増幅する手法が広く利用されている。しかしながら、僅かな遺伝子を指数関数的に増幅させるＰＣＲ増幅においては、プライマー間の増幅効率の違いが致命的な問題となる。また、Ｖ領域やＪ領域に設定したプライマーが、すべての既知のアレル配列に対応する必要がある。ＢＣＲ遺伝子については、体細胞高頻度突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）の機構によりＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥの可変部領域に高頻度に（～２０％程度）点突然変異が導入される。したがって、仮に２０塩基のプライマーを設定した場合、約４塩基がミスマッチとなり均一な遺伝子増幅を実現することは従来の方法では難しい。すなわち、ゲノム配列をもとにＶ鎖特異的プライマーを設計する既存の方法では、実際のＢＣＲ遺伝子配列とのミスマッチは避けられず、定量的な遺伝子増幅が保証されない。さらに、ＢＣＲにはＣ領域配列によって規定されるアイソタイプとサブクラスが存在する。これらアイソタイプ間あるいはサブクラス間の塩基配列上の差異を利用したアイソタイプ別あるいはサブクラス別の定量法を開発する必要がある。本発明者らは、現在利用されているＶ鎖特異的プライマーを用いた手法の欠点を克服するため、１種のフォーワードプライマーと１種のリバースプライマーからなる１セットのプライマーですべてのアイソタイプやサブタイプ遺伝子を含むＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子を存在頻度を変えることなく増幅し、大規模に次世代シーケンスを用いて塩基配列決定する方法を完成するに至った。
　ＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子の遺伝子構造に着目し、高度な多様性をもつＶ領域にプライマーを設定することなく、その５’末端にアダプター配列を付加することにより、すべてのＶ領域を含む遺伝子を増幅する。
　このアダプターは塩基配列上において任意の長さと配列であり、２０塩基対程度が最適であるが、１０塩基から１００塩基までの配列を使用することができる。
　３’末端に付加されたアダプターは制限酵素により除去され、２０塩基対のアダプターと同一配列のアダプタープライマーと共通配列であるＣ領域に特異的なリバースプライマーにより増幅することですべてのＴＣＲもしくはＢＣＲ遺伝子を増幅する。
　ＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子メッセンジャーＲＮＡから逆転写酵素により相補鎖ＤＮＡを合成し、続いて二本鎖相補的ＤＮＡを合成する。逆転写反応や二本鎖合成反応によって異なる長さのＶ領域を含む二本鎖相補的ＤＮＡが合成され、それら遺伝子の５’末端部に２０塩基対と１０塩基対からなるアダプターをＤＮＡリガーゼ反応によって付加する。
　ＴＣＲに関しては、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ＢＣＲに関しては、μ鎖、α鎖、δ鎖、γ鎖、ε鎖の重鎖、κ鎖、λ鎖の軽鎖のＣ領域にリバースプライマーを設定し、これらの遺伝子を増幅することができる。
　Ｃ領域に設定されるリバースプライマーは、ＴＣＲに関しては各Ｃβ、Ｃα、Ｃγ、Ｃδの配列に、ＢＣＲに関しては各Ｃμ、Ｃα、Ｃδ、Ｃγ、Ｃε、Ｃκ、Ｃλの配列に一致し、かつ他のＣ領域配列にはプライミングしない程度のミスマッチをもつプライマーを設定する。
　Ｃ領域のリバースプライマーはアダプタープライマーとの増幅ができるように、塩基配列、塩基組成、ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）、自己相補配列の有無を考慮し、最適に作製する。
　ＢＣＲ遺伝子ＩｇＧサブタイプ（γ１、γ２、γ３、γ４）およびＩｇＡサブタイプ（α１、α２）はそれぞれ同一プライマーで増幅し、塩基配列決定によってサブタイプを決定できる。
　Ｃ領域配列におけるアレル配列間で異なる塩基配列を除く領域にプライマーを設定することで、すべてのアレルを均一に増幅することができる。
　増幅反応の特異性を高めるため、複数段階のｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行う。
　いずれのプライマーもアレル配列間で異なる配列を含まない配列に対して、プライマー候補配列の長さ（塩基数）は、特に制限されないが、１０～１００塩基数であり、好ましくは、１５～５０塩基数であり、より好ましくは、２０～３０塩基数である。したがって、本発明は以下をも提供する。
＜インシリコ＞
　１つの局面では、本発明は、生体試料に由来する一群の発現ＴＣＲもしくはＢＣＲ遺伝子配列を元に、そのＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する手法に関する。
　本発明では、Ｖ（－Ｄ）－Ｊ－Ｃ一連の核酸配列であれば、シーケンサ機種に依存しない。非バイアスでなくても分類そのものは可能である。なお、正鎖、相補鎖どちらが入力でも可能である。
　核酸配列の分類では、分類の基準となる標準的配列（以下、参照配列）を集積した参照データベースを設定し、相同性検索の手法によって各核酸配列を参照配列のいずれかにアサインすることが一般的である。しかしながら本件では、Ｖ、Ｄ、Ｊの各領域の組合せにより膨大な参照配列を準備する必要があり、現実的ではない。Ｖ、Ｄ、Ｊごとに参照データベースを設定する手法も考えられるが、Ｖにおいてはランダム突然変異により参照配列との相違が大きくなるため、またＤおよびＪについてはその領域が短いため、一般的な相同性検索の手法では見落としの可能性が無視できない。解析対象の核酸配列全体をアミノ酸配列に翻訳し、それを素材に分類する手法も考えられるが、特に挿入・欠失のシーケンシングエラーに対して脆弱となるほか、既報の遺伝子名やアリルとの対応が不明となって、公知の情報の利用が困難になる。
　本発明で使用される参照データベースは、Ｖ、Ｄ、Ｊ（ＢＣＲの場合は加えてＣ）遺伝子領域ごとに準備する。典型的にはＩＭＧＴより公開されている領域ごと、アリルごとの核酸配列データセットを使用するが、それに限らず、各配列に一意のＩＤが割り振られているデータセットであれば利用可能である。
　本発明で使用される入力配列セットは、一般には事前にアダプタ配列や低クオリティ領域をトリミングし、さらに解析に十分な長さを持つ配列のみを抽出し、高クオリティセットを構成しておく。このステップは必ずしも必要ではないが、好ましい実施形態では使用される。そのままでもＬＱ配列が「分類不能」となるだけであるからである。
　本発明で使用される入力配列セットは、遺伝子領域ごとの参照データベースと相同性検索し、最も近しい参照アリルおよびその配列とのアラインメントを記録する。ここで相同性検索には、Ｃを除きミスマッチ許容性の高いアルゴリズムを使用することになる。例えば相同性検索プログラムとして一般的なＢＬＡＳＴを使用する場合、ウィンドウサイズの短縮、ミスマッチペナルティの低減、ギャップペナルティの低減といった設定を、領域ごとに行うことになる。最も近しい参照アリルの選択においては、相同性スコア、アラインメント長、カーネル長（連続して一致する塩基列の長さ）、一致塩基数を指標とし、これらを定められた優先順位にしたがって適用する。
　本発明で使用されるＶおよびＪが確定した入力配列については、参照Ｖ上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出する。これをアミノ酸配列に翻訳することで、Ｄ領域の分類に使用する。Ｄ領域の参照データベースが準備できている場合は、相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする。
　上記により、入力セット中の各配列についてＶ、Ｄ、Ｊ（ＢＣＲの場合は加えてＣ）の各アリルがアサインされる。続いて、入力セット全体でＶ、Ｄ、Ｊ（ＢＣＲの場合は加えてＣ）の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する。分類に要請される精確さに応じて、出現頻度はアリル単位もしくは遺伝子名単位で算出される。後者は、各アリルを遺伝子名に翻訳することで可能となる。従って、本発明は以下を提供する。
＜１＞ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法であって、以下のステップ：
（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：
（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；
（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；
（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；
（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；
（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；
を包含する、方法。
＜２＞前記遺伝子領域は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の全部を含む、項目＜１＞に記載の方法。
＜３＞前記参照データベースは、各配列に一意のＩＤが割り振られたデータベースである、項目＜１＞～＜２＞のいずれか１項に記載の方法。
＜４＞前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである、項目＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜５＞前記配列セットはトリミングされたものである、項目＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜６＞　前記トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し；リード両端からアダプタ配列と１０ｂｐ以上マッチする領域を削除し；および残った長さが２００ｂｐ以上（ＴＣＲ）もしくは３００ｂｐ以上（ＢＣＲ）なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される、項目＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜７＞前記低クオリティーは、ＱＶ値の７ｂｐ移動平均が３０未満のものである、項目＜６＞に記載の方法。
＜８＞前記近似する配列は、最も近しい配列である、項目＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜９＞前記近似する配列は、１．　一致塩基数、２．　カーネル長、３．　スコア、４．　アラインメント長の順位によって決定される、項目＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１０＞前記相同性検索は、ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件で行われる、項目＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１１＞前記相同性検索は、デフォルト条件に比べて（１）ウィンドウサイズの短縮、（２）ミスマッチペナルティの低減、（３）ギャップペナルティの低減および（４）指標の優先順位のトップが一致塩基数の少なくとも１つの条件を含む、項目＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１２＞前記相同性検索は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡにおいて以下の条件
　　Ｖ  ミスマッチペナルティ＝－１、最短アラインメント長＝３０、最短カーネル長＝１５
　　Ｄ  ワード長＝７（ＢＬＡＳＴの場合）またはＫ－ｔｕｐ＝３（ＦＡＳＴＡの場合）、ミスマッチペナルティ＝－１、ギャップペナルティ＝０、
        最短アラインメント長＝１１、最短カーネル長＝８
　　Ｊ  ミスマッチペナルティ＝－１、最短ヒット長＝１８、最短カーネル長＝１０
　　Ｃ  最短ヒット長＝３０、最短カーネル長＝１５
で実施される、項目＜１＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１３＞前記Ｄ領域の分類は、前記アミノ酸配列の出現頻度によってなされる、項目＜１＞～＜１２＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１４＞前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在する場合は、前記ＣＤＲ３の核酸配列との相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする、項目＜１＞～＜１３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１５＞前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在しない場合、前記アミノ酸配列の出現頻度のみによって分類がなされる、項目＜１＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１６＞前記出現頻度は、遺伝子名単位および／またはアリル単位でなされる、項目＜１＞～＜１５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１７＞前記ステップ（４）は該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出するステップを包含する、項目＜１＞～＜１６＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１８＞前記ステップ（５）は、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップを包含する、項目＜１＞～＜１７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１９＞ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析するシステムであって、該システムは：
（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：
（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；
（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；
（６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；
を包含する、システム。
＜１９Ａ＞項目＜１＞～＜１８＞のいずれか１項または複数の特徴を有する、項目＜１９＞に記載のシステム。
＜２０＞ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであって、該方法は以下のステップ：
（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：
（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；
（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；
（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；
（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；
（６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；
を包含する、プログラム。
＜２０Ａ＞項目＜１＞～＜１８＞のいずれか１項または複数の特徴を有する、項目＜２０＞に記載のプログラム。
＜２１＞ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は以下のステップ：
（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：
（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；
（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；
（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；
（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；
（６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；
を包含する、記録媒体。
＜２１Ａ＞項目＜１＞～＜１８＞のいずれか１項または複数の特徴を有する、項目＜２１＞に記載の記録媒体。
 
　＜ウェット＞
　別の局面では、本発明は、（１）複数のゲノム上の遺伝子断片から遺伝子再構成により生成されたＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子配列を、バイアスをかけることなく均一に増幅する技術（非バイアス遺伝子増幅技術）、（２）その非バイアス遺伝子増幅技術により増幅したＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子を次世代シーケンス法により大規模に塩基配列決定し、Ｖ、Ｄ、Ｊ、Ｃ領域のアサインメントを行ってＴＣＲレパトアやＢＣＲレパトアを解析する手法である。
　ＴＣＲやＢＣＲはゲノム上に存在する複数のＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ領域の遺伝子断片の遺伝子再構成によって、多様な遺伝子配列を創出している。次世代シーケンス技術によってＴＣＲやＢＣＲ遺伝子の塩基配列を決定するため、多数存在するＶ領域に特異的なプライマーあるいはＪ領域に特異的なプライマーを多数作成し、同一の反応液中、あるいは別個の反応液中で増幅する手法が広く利用されている。しかしながら、僅かな遺伝子を指数関数的に増幅させるＰＣＲ増幅においては、プライマー間の増幅効率の違いが致命的な問題となる。また、Ｖ領域やＪ領域に設定したプライマーが、すべての既知のアレル配列に対応する必要がある。ＢＣＲ遺伝子については、体細胞高頻度突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）の機構によりＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥの可変部領域に高頻度に（～２０％程度）点突然変異が導入される。したがって、仮に２０塩基のプライマーを設定した場合、約４塩基がミスマッチとなり均一な遺伝子増幅を実現することは従来の方法では難しい。すなわち、ゲノム配列をもとにＶ鎖特異的プライマーを設計する既存の方法では、実際のＢＣＲ遺伝子配列とのミスマッチは避けられず、定量的な遺伝子増幅が保証されない。さらに、ＢＣＲにはＣ領域配列によって規定されるアイソタイプとサブクラスが存在する。これらアイソタイプ間あるいはサブクラス間の塩基配列上の差異を利用したアイソタイプ別あるいはサブクラス別の定量法を開発する必要がある。本発明者らは、現在利用されているＶ鎖特異的プライマーを用いた手法の欠点を克服するため、１種のフォーワードプライマーと１種のリバースプライマーからなる１セットのプライマーですべてのアイソタイプやサブタイプ遺伝子を含むＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子を存在頻度を変えることなく増幅し、大規模に次世代シーケンスを用いて塩基配列決定する方法を完成するに至った。
　ＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子の遺伝子構造に着目し、高度な多様性をもつＶ領域にプライマーを設定することなく、その５’末端にアダプター配列を付加することにより、すべてのＶ領域を含む遺伝子を増幅する。
　このアダプターは塩基配列上において任意の長さと配列であり、２０塩基対程度が最適であるが、１０塩基から１００塩基までの配列を使用することができる。
　３’末端に付加されたアダプターは制限酵素により除去され、２０塩基対のアダプターと同一配列のアダプタープライマーと共通配列であるＣ領域に特異的なリバースプライマーにより増幅することですべてのＴＣＲもしくはＢＣＲ遺伝子を増幅する。
　ＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子メッセンジャーＲＮＡから逆転写酵素により相補鎖ＤＮＡを合成し、続いて二本鎖相補的ＤＮＡを合成する。逆転写反応や二本鎖合成反応によって異なる長さのＶ領域を含む二本鎖相補的ＤＮＡが合成され、それら遺伝子の５’末端部に２０塩基対と１０塩基対からなるアダプターをＤＮＡリガーゼ反応によって付加する。
　ＴＣＲに関しては、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ＢＣＲに関しては、μ鎖、α鎖、δ鎖、γ鎖、ε鎖の重鎖、κ鎖、λ鎖の軽鎖のＣ領域にリバースプライマーを設定し、これらの遺伝子を増幅することができる。
　Ｃ領域に設定されるリバースプライマーは、ＴＣＲに関しては各Ｃβ、Ｃα、Ｃγ、Ｃδの配列に、ＢＣＲに関しては各Ｃμ、Ｃα、Ｃδ、Ｃγ、Ｃε、Ｃκ、Ｃλの配列に一致し、かつ他のＣ領域配列にはプライミングしない程度のミスマッチをもつプライマーを設定する。
　Ｃ領域のリバースプライマーはアダプタープライマーとの増幅ができるように、塩基配列、塩基組成、ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）、自己相補配列の有無を考慮し、最適に作製する。
　ＢＣＲ遺伝子ＩｇＧサブタイプ（γ１、γ２、γ３、γ４）およびＩｇＡサブタイプ（α１、α２）はそれぞれ同一プライマーで増幅し、塩基配列決定によってサブタイプを決定できる。
　Ｃ領域配列におけるアレル配列間で異なる塩基配列を除く領域にプライマーを設定することで、すべてのアレルを均一に増幅することができる。
　増幅反応の特異性を高めるため、複数段階のｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行う。
　いずれのプライマーもアレル配列間で異なる配列を含まない配列に対して、プライマー候補配列の長さ（塩基数）は、特に制限されないが、１０～１００塩基数であり、好ましくは、１５～５０塩基数であり、より好ましくは、２０～３０塩基数である。したがって、本発明は以下をも提供する。
＜Ａ１＞データベースを用いた遺伝子配列解析により、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うための試料を調製するための方法であって、
（１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；
（２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
（３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
（４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
　該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、
該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
（５）（４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および
（６）（５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
　該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
　該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
　該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
　該分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程；
を包含する、方法。
＜Ａ２＞ＢＣＲである場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群より選択される目的とするアイソタイプＣ領域に完全マッチの配列を含み、かつ他のＣ領域に相同性を持たず、ＩｇＡまたはＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のいずれか、またはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２のいずれかであるサブタイプに完全マッチする配列であるか、あるいはＴＣＲである場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、α鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖からなる群より選択される目的とする鎖のＣ領域に完全マッチし、かつ他のＣ領域に相同性を持たない配列である、項目＜Ａ１＞に記載の方法。
＜Ａ３＞前記Ｃ領域特異的プライマーは、前記データベース中の同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列部分を選択する、項目１または＜Ａ２＞に記載の方法。
＜Ａ４＞前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度の融解温度（Ｔｍ）になるように設計される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ５＞前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造をとらないよう設計され、ＢＣＲまたはＴＣＲを含む他の遺伝子に対して相同性がないものを選択される、項目＜Ａ４＞に記載の方法。
＜Ａ６＞前記共通アダプタープライマーは、Ｐ２０ＥＡ（配列番号２）および／またはＰ１０ＥＡ（配列番号３）である、項目＜Ａ５＞に記載の方法。
＜Ａ７＞　前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＢＣＲのレパトア解析のためのものであり、ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，またはＩｇＥの各アイソタイプＣ領域に完全マッチする配列であって、該ＩｇＧおよびＩｇＡの場合は、サブタイプについても完全マッチし、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、
　該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ６＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ８＞　前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＴＣＲまたはＢＣＲのレパトア解析のためのものであり、各プライマーは１種のα鎖（ＴＲＡＣ）、２種のβ鎖（ＴＲＢＣ０１およびＴＲＢＣ０２）、２種のγ鎖（ＴＲＧＣ１およびＴＲＧＣ２）、１種のδ鎖（ＴＲＤＣ１）に対して完全マッチする配列であり、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、
　該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される項目＜Ａ１＞～＜Ａ７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ９＞前記第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはＣ領域５’末端側から約１５０塩基までの領域に設定され、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーおよび第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはＣ領域５’末端側から約３００塩基までの間に設定される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ８＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１０＞前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＢＣＲの定量解析を行うためのものであり、
５種のアイソタイプ配列には別個に特異的プライマーを設定し、標的配列には完全マッチして、かつ他のアイソタイプには５塩基以上のミスマッチを確保するよう設計され、類似するＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）あるいはＩｇＡサブタイプ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）に対しては、それぞれ１種のプライマーで対応できるようすべてのサブタイプに完全マッチするよう設計される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１１＞プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長１８―２２塩基、融解温度５４－６６℃、％ＧＣ（％グアニン・シトシン含量）は４０－６５％に設定される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ１０＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１２＞プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長１８―２２塩基、融解温度５４－６６℃、％ＧＣ（％グアニン・シトシン含量）は４０－６５％に設定し、自己アニーリングスコア２６、自己末端アニーリングスコア１０、二次構造スコア２８に設定される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ１１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１３＞以下の条件
１．複数のサブタイプ配列および／またはアレル配列を塩基配列解析ソフトに取り込み、アライメントすること；
２．プライマーデザイン用のソフトウェアを用いて、Ｃ領域内にパラメータ条件を満たすプライマーを複数検索すること；
３．１のアライメント配列の中で不一致塩基のない領域にあるプライマーを選択すること；
４．３により決定されたプライマーの下流に各サブタイプおよび／またはアレル毎に不一致配列が複数あることを確認し、ない場合は、さらに上流にプライマーを検索し、必要に応じてさらにこれを反復すること
により、前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列が決定される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ１２＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１４＞第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、スプライシングにより生じるＣ領域配列の第一コドンの第一塩基を基準として４１－３００塩基まで、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として２１－３００塩基まで、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として１５０塩基以内で、かつサブタイプおよび／またはアレルの不一致部位を含む位置で設定される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ１３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１５＞第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ１（配列番号５）、ＣＡ１（配列番号８）、ＣＧ１（配列番号１１）、ＣＤ１（配列番号１４）、ＣＥ１（配列番号１７）、ＣＡ１（配列番号３５）、またはＣＢ１（配列番号３７）を有する、項目＜Ａ１＞～＜Ａ１４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１６＞第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ２（配列番号６）、ＣＡ２（配列番号９）、ＣＧ２（配列番号１２）、ＣＤ２（配列番号１５）、ＣＥ２（配列番号１８）、ＣＡ２（配列番号３５）、またはＣＢ２（配列番号３７）を有する、項目＜Ａ１＞～＜Ａ１５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１７＞第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ３－ＧＳ（配列番号７）、ＣＡ３－ＧＳ（配列番号１０）、ＣＧ３－ＧＳ（配列番号１３）、ＣＤ３－ＧＳ（配列番号１６）またはＣＥ３－ＧＳ（配列番号１９）を有する、項目＜Ａ１＞～＜Ａ１６＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１８＞前記ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、いずれも、ＴＣＲまたはＢＣＲのすべてのサブクラスに対応するセットで提供される、項目＜Ａ１＞～＜Ａ１７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ａ１９＞項目＜Ａ１＞～＜Ａ１８＞のいずれか1項に記載の方法で製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法。
＜Ａ２０＞ 前記遺伝子解析は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析である、項目＜Ａ１９＞に記載の方法。
＜解析システム＞
＜Ｂ１＞データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法であって、該方法は、
（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；
（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および
（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程
を包含する、方法。
＜Ｂ２＞前記核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）は単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、項目＜Ｂ１＞に記載の方法。
＜Ｂ３＞前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする、項目＜Ｂ２＞に記載の方法。
＜Ｂ４＞前記単一の配列決定は、共通アダプタープライマーを用いて行われることを特徴とする、項目＜Ｂ２＞または＜Ｂ３＞に記載の方法。
＜Ｂ５＞前記非バイアス的な増幅が、Ｖ領域特異的な増幅ではない、項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ｂ６＞前記レパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である、項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ｂ７＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ６＞のいずれか１項に基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する方法。
＜Ｂ８＞前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍および大腸がんからなる群より選択される、項目＜Ｂ７＞に記載の方法。
＜Ｂ９＞項目＜Ｂ７＞または＜Ｂ８＞に記載の方法で決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける工程、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する工程を含む、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するための方法。
＜Ｂ１０＞前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍および大腸がんからなる群より選択される、項目＜Ｂ９＞に記載の方法。
＜Ｂ１１＞データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット；
（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および
（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するための装置
を備えるシステム。
＜Ｂ１２＞前記核酸試料は、前記核酸配列を複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）は単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、項目＜Ｂ１１＞に記載のシステム。
＜Ｂ１３＞前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域と同一配列を有することを特徴とする、項目＜Ｂ１２＞に記載のシステム。
＜Ｂ１４＞前記単一の配列決定は、共通アダプタープライマーを用いて行われることを特徴とする、項目＜Ｂ１２＞または＜Ｂ１３＞に記載のシステム。
＜Ｂ１５＞前記非バイアス的な増幅が、Ｖ領域特異的な増幅ではない、項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ１４＞のいずれか１項に記載のシステム。
＜Ｂ１６＞前記レパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である、項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ１５＞のいずれか１項に記載のシステム。
＜Ｂ１７＞項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ１６＞のいずれか１項に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するシステム。
＜Ｂ１８＞前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍および大腸がんからなる群より選択される、項目＜Ｂ１７＞に記載のシステム。
＜Ｂ１９＞項目＜Ｂ１７＞または＜Ｂ１８＞に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。
＜Ｂ２０＞前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍および大腸がんからなる群より選択される、項目＜Ｂ１９＞に記載のシステム。
＜Ｂ２１＞ＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）もしくはこれをコードする核酸を含むＴＣＲα、および／またはＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）もしくはこれをコードする核酸を含むＴＣＲβを発現する、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）に関するモノクローナルなＴ細胞。
＜Ｂ２２＞ＴＣＲαにおいてＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）もしくはこれをコードする核酸、および／またはＴＣＲβにおいてＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）もしくはこれをコードする核酸の、T細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）の診断指標としての使用。
＜Ｂ２３＞ＴＣＲαにおいてＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）もしくはこれをコードする核酸、および／またはＴＣＲβにおいてＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）もしくはこれをコードする核酸を検出する工程を包含する、T細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）の検出する方法。
＜Ｂ２４＞ＴＣＲαにおけるＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）またはこれをコードする核酸の検出剤、および／またはＴＣＲβにおけるＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）またはこれをコードする核酸の検出剤。
＜Ｂ２５＞TCRαにおけるＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）またはこれをコードする核酸の検出剤、および／またはＴＣＲβにおけるＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）またはこれをコードする核酸の検出剤を含む、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）の診断薬。
＜Ｂ２６＞配列番号１６２７～１６４７に示す配列のいずれかを含む、新規インバリアントＴＣＲであるペプチド。
＜Ｂ２７＞配列番号１６４８～１６５１、１６５３～１６５４、１６６６～１６６７、１８４４～１８４８、および１８５１からなる群より選択されるの配列を含む、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞の指標であるペプチド。
＜Ｂ２８＞項目＜Ｂ２７＞に記載のペプチドをコードする核酸。
＜Ｂ２９＞項目＜Ｂ２７＞または＜Ｂ２８＞に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸の、大腸がんの診断指標としての使用。
＜Ｂ３０＞配列番号１６６８に示す配列を含む、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）の指標であるペプチド。
＜Ｂ３１＞項目＜Ｂ３０＞に記載のペプチドをコードする核酸。
＜Ｂ３２＞項目＜Ｂ３０＞または＜Ｂ３１＞に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸の、大腸がんの診断指標としての使用。
＜Ｂ３３＞配列番号１６５２、１６５５～１６６５、１６６９～１８４３、１８４９～１８５０、および１８５２～１８６０からなる群より選択される配列を含む、大腸がん特異的であるペプチド。
＜Ｂ３４＞項目＜Ｂ３３＞に記載のペプチドをコードする核酸。
＜Ｂ３５＞項目＜Ｂ３３＞または＜Ｂ３４＞に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸の、大腸がんの診断指標としての使用。
＜Ｂ３６＞配列番号１８６１～１８６５、および１８６７～１９０９からなる群より選択される配列を含む、大腸がん特異的であるペプチド
＜Ｂ３７＞項目＜Ｂ３６＞に記載のペプチドをコードする核酸。
＜Ｂ３８＞項目＜Ｂ３６＞または＜Ｂ３７＞に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸の、大腸がんの診断指標としての使用。
＜Ｂ３９＞項目＜Ｂ３３＞、＜Ｂ３４＞、＜Ｂ３６＞または＜Ｂ３７＞に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸配列を有するＴ細胞を高頻度に誘導した細胞集団、Ｔ細胞株、または組み換え発現させたＴ細胞。
＜Ｂ４０＞項目＜Ｂ３９＞に記載の細胞集団、Ｔ細胞株またはＴ細胞を含む大腸がんの治療剤。
＜Ｂ４１＞項目＜Ｂ３９＞に記載の細胞集団、Ｔ細胞株またはＴ細胞を用いる大腸がんの治療または予防のための方法。
＜Ｂ４２＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞のいずれか１項に記載のシステムを用いて、V遺伝子の使用頻度を検出する方法。
＜Ｂ４３＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、J遺伝子の使用頻度を検出する方法。
＜Ｂ４４＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、サブタイプの頻度解析（BCR）の使用頻度を検出する方法。
＜Ｂ４５＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、CDR3配列長のパターンを分析する方法。
＜Ｂ４６＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、TCRあるいはBCRのクローナリティを分析する方法。
＜Ｂ４７＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、重複リードを抽出する方法。
＜Ｂ４８＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、疾患特異的ＴＣＲあるいはＢＣＲクローンを検索する方法。
＜Ｂ４９＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、多様性指数を使って対象を分析する方法。
＜Ｂ５０＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、多様性指数を使って対象を分析を支援する方法。
＜Ｂ５１＞骨髄移植後の免疫系の回復度を測る指標、または、造血器腫瘍に伴う免疫系細胞の異常を検出する指標として前記多様性指数を使用する、項目＜Ｂ４９＞または＜Ｂ５０＞に記載の方法。
＜Ｂ５２＞前記多様性指数は、Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒの多様性指数（Ｈ’）、Ｓｉｍｐｓｏｎの多様性指数（λ、１－λあるいは１／λ）、Ｐｉｅｌｏｕ均等度指数（Ｊ’）およびＣｈａｏ１指数からなる群より選択されるものである、項目＜Ｂ４９＞または＜Ｂ５０＞に記載の方法。
＜Ｂ５３＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、類似性指数を使って対象を分析する方法。
＜Ｂ５４＞項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞のいずれか１項に記載の方法、または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞に記載のシステムを用いて、類似性指数を使って対象を分析を支援する方法。
＜Ｂ５５＞HLA型一致あるいは不一致間のレパトアの類似度の評価、骨髄移植後のレシピエントとドナー間のレパトアの類似度の評価として前記類似性指数を使用する、項目＜Ｂ５３＞または＜Ｂ５４＞に記載の方法。
＜Ｂ５６＞前記類似性指数は、Ｍｏｒｉｓｉｔａ―Ｈｏｒｎ指数、木元のＣπ指数およびＰｉａｎｋａのα指数からなる群より選択されるものである、項目＜Ｂ５３＞または＜Ｂ５４＞に記載の方法。
＜Ｂ５７＞前記（１）は、以下の工程
（１－１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１－２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１－３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１－４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
　該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
（１－５）（１－４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および
（１－６）（１－５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
　該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
　該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
　該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
　該分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程；
を包含する、
項目＜Ｂ１＞に記載の方法。
＜Ｂ５８＞前記（１）キットは、以下：
（１－１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する手段；
（１－２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する手段；
（１－３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する手段；
（１－４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、
　該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段
（１－５）（１－４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段；および
（１－６）（１－５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、
　該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
　該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
　該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
　該分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、手段；
を包含する、
項目＜Ｂ１１＞に記載のシステム。
＜Ｂ５８－２＞ＢＣＲである場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群より選択される目的とするアイソタイプＣ領域に完全マッチの配列を含み、かつ他のＣ領域に相同性を持たず、ＩｇＡまたはＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のいずれか、またはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２のいずれかであるサブタイプに完全マッチする配列であるか、あるいはＴＣＲである場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、α鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖からなる群より選択される目的とする鎖のＣ領域に完全マッチし、かつ他のＣ領域に相同性を持たない配列である、項目＜Ｂ５７＞に記載の方法または＜Ｂ５８＞に記載のシステム。
＜Ｂ５８－３＞前記Ｃ領域特異的プライマーは、前記データベース中の同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列部分を選択する、項目＜Ｂ５７＞もしくは＜Ｂ５８－２＞に記載の方法または＜Ｂ５８＞もしくは＜Ｂ５８－２＞に記載のシステム。
＜Ｂ５８－４＞前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度の融解温度（Ｔｍ）になるように設計される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－３＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－３＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－５＞前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造をとらないよう設計され、ＢＣＲまたはＴＣＲを含む他の遺伝子に対して相同性がないものを選択される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－４＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－４＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－６＞前記共通アダプタープライマーは、Ｐ２０ＥＡ（配列番号２）および／またはＰ１０ＥＡ（配列番号３）である、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－５＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－５＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－７＞　前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＢＣＲのレパトア解析のためのものであり、ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，またはＩｇＥの各アイソタイプＣ領域に完全マッチする配列であって、該ＩｇＧおよびＩｇＡの場合は、サブタイプについても完全マッチし、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、
　該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－６＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－６＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－８＞　前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＴＣＲまたはＢＣＲのレパトア解析のためのものであり、各プライマーは１種のα鎖（ＴＲＡＣ）、２種のβ鎖（ＴＲＢＣ０１およびＴＲＢＣ０２）、２種のγ鎖（ＴＲＧＣ１およびＴＲＧＣ２）、１種のδ鎖（ＴＲＤＣ１）に対して完全マッチする配列であり、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、
　該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－７＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－７＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－９＞前記第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはＣ領域５’末端側から約１５０塩基までの領域に設定され、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーおよび第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはＣ領域５’末端側から約３００塩基までの間に設定される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－８＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－８＞に記載のシステム。
＜Ｂ５８－１０＞前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＢＣＲの定量解析を行うためのものであり、
５種のアイソタイプ配列には別個に特異的プライマーを設定し、標的配列には完全マッチして、かつ他のアイソタイプには５塩基以上のミスマッチを確保するよう設計され、類似するＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）あるいはＩｇＡサブタイプ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）に対しては、それぞれ１種のプライマーで対応できるようすべてのサブタイプに完全マッチするよう設計される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－９＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－９＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－１１＞プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長１８―２２塩基、融解温度５４－６６℃、％ＧＣ（％グアニン・シトシン含量）は４０－６５％に設定される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１０＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１０＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－１２＞プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長１８―２２塩基、融解温度５４－６６℃、％ＧＣ（％グアニン・シトシン含量）は４０－６５％に設定し、自己アニーリングスコア２６、自己末端アニーリングスコア１０、二次構造スコア２８に設定される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１１＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１１＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－１３＞以下の条件
１．複数のサブタイプ配列および／またはアレル配列を塩基配列解析ソフトに取り込み、アライメントすること；
２．プライマーデザイン用のソフトウェアを用いて、Ｃ領域内にパラメータ条件を満たすプライマーを複数検索すること；
３．１のアライメント配列の中で不一致塩基のない領域にあるプライマーを選択すること；
４．３により決定されたプライマーの下流に各サブタイプおよび／またはアレル毎に不一致配列が複数あることを確認し、ない場合は、さらに上流にプライマーを検索し、必要に応じてさらにこれを反復すること
により、前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列が決定される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１２＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１２＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－１４＞第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、スプライシングにより生じるＣ領域配列の第一コドンの第一塩基を基準として４１－３００塩基まで、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として２１－３００塩基まで、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として１５０塩基以内で、かつサブタイプおよび／またはアレルの不一致部位を含む位置で設定される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１３＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１３＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－１５＞第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ１（配列番号５）、ＣＡ１（配列番号８）、ＣＧ１（配列番号１１）、ＣＤ１（配列番号１４）、ＣＥ１（配列番号１７）、ＣＡ１（配列番号３５）、またはＣＢ１（配列番号３７）を有する、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１４＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１４＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－１６＞第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ２（配列番号６）、ＣＡ２（配列番号９）、ＣＧ２（配列番号１２）、ＣＤ２（配列番号１５）、ＣＥ２（配列番号１８）、ＣＡ２（配列番号３５）、またはＣＢ２（配列番号３７）を有する、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１５＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１５＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－１７＞第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ３－ＧＳ（配列番号７）、ＣＡ３－ＧＳ（配列番号１０）、ＣＧ３－ＧＳ（配列番号１３）、ＣＤ３－ＧＳ（配列番号１６）またはＣＥ３－ＧＳ（配列番号１９）を有する、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１６＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１６＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ５８－１８＞前記ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、いずれも、ＴＣＲまたはＢＣＲのすべてのサブクラスに対応するセットで提供される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１７＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１７＞に記載のシステム。
＜Ｂ５８－１９＞項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－１８＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－１８＞のいずれかに記載のシステムで製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法またはシステム。
＜Ｂ５８－２０＞ 前記遺伝子解析は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析である、項目＜Ｂ５８－１９＞のいずれかに記載の方法またはシステム。
＜Ｂ５９＞（３）前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの導出は以下の工程
（３－１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程：
（３－２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程；
（３－３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程；
（３－４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する工程；
（３－５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する工程；
（３－６）（３－５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程；
を包含する方法によって達成される、項目＜Ｂ５７＞および＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０＞（３）前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの導出のための装置は以下
（３－１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：
（３－２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
（３－３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
（３－４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；
（３－５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；
（３－６）（３－５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；
を備える、項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞または５９に記載のシステム。
＜Ｂ６０－２＞前記遺伝子領域は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の全部を含む、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞および＜Ｂ５９＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－３＞前記参照データベースは、各配列に一意のＩＤが割り振られたデータベースである、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－４＞前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－３＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－３＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－５＞前記配列セットはトリミングされたものである、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－４＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－４＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－６＞　前記トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し；リード両端からアダプタ配列と１０ｂｐ以上マッチする領域を削除し；および残った長さが２００ｂｐ以上（ＴＣＲ）もしくは３００ｂｐ以上（ＢＣＲ）なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－５＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－５＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－７＞前記低クオリティーは、ＱＶ値の７ｂｐ移動平均が３０未満のものである、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－６＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－６＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－８＞前記近似する配列は、最も近しい配列である、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－７＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－７＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－９＞前記近似する配列は、１．　一致塩基数、２．　カーネル長、３．　スコア、４．　アラインメント長の順位によって決定される、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－８＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－８＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１０＞前記相同性検索は、ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件で行われる、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－９＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－９＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１１＞前記相同性検索は、デフォルト条件に比べて（１）ウィンドウサイズの短縮、（２）ミスマッチペナルティの低減、（３）ギャップペナルティの低減および（４）指標の優先順位のトップが一致塩基数の少なくとも１つの条件を含む、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－１０＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１０＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１２＞前記相同性検索は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡにおいて以下の条件
　　Ｖ  ミスマッチペナルティ＝－１、最短アラインメント長＝３０、最短カーネル長＝１５
　　Ｄ  ワード長＝７（ＢＬＡＳＴの場合）またはＫ－ｔｕｐ＝３（ＦＡＳＴＡの場合）、ミスマッチペナルティ＝－１、ギャップペナルティ＝０、
        最短アラインメント長＝１１、最短カーネル長＝８
　　Ｊ  ミスマッチペナルティ＝－１、最短ヒット長＝１８、最短カーネル長＝１０
　　Ｃ  最短ヒット長＝３０、最短カーネル長＝１５
で実施される、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－１１＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１１＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１３＞前記Ｄ領域の分類は、前記アミノ酸配列の出現頻度によってなされる、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－１２＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１２＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１４＞前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在する場合は、前記ＣＤＲ３の核酸配列との相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－１３＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１３＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１５＞前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在しない場合、前記アミノ酸配列の出現頻度のみによって分類がなされる、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－１４＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１４＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１６＞前記出現頻度は、遺伝子名単位および／またはアリル単位でなされる、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－１５＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１５＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１７＞前記ステップ（４）は該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出するステップを包含する、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－１６＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１６＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１８＞前記ステップ（５）は、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップを包含する、項目＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８－２＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞および＜Ｂ６０－２＞～＜Ｂ６０－１７＞のいずれかに記載の方法または＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１７＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－１９＞（３）前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの導出のための装置は以下
（３－１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：
（３－２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
（３－３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
（３－４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；
（３－５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；
（３－６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；
を包含する、項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞または＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１８＞のいずれかにに記載のシステム。
＜Ｂ６０－２０＞
前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理は、以下のステップ：
（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：
（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；
（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；
（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；
（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；
（６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；
を含むコンピュータに実行させるコンピュータプログラムによって実現される、
項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－１９＞のいずれかに記載のシステム。
＜Ｂ６０－２１＞ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させる項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２０＞のいずれかに記載のシステムであって、該方法は以下のステップ：
（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：
（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；
（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；
（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；
（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；
（６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；
を包含する、システム。
　＜解析応用例＞
＜Ｃ１＞
被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法を付与する方法であって、該方法は、
（１）項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞、＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載の方法および／または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載のシステムによって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；
（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；
（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；
（４）決定されたペプチドを合成する工程；
必要に応じて（５）合成したペプチドを用いて治療を行う工程
を包含する、方法。
＜Ｃ２＞
前記（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＰまたはＮｅｔＭＨＣを用いて決定される、項目＜Ｃ１＞に記載の方法。
＜Ｃ３＞＜改良型ＣＴＬ法＞
前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程、および該培養後の混合物を患者に投与する工程を包含する、項目＜Ｃ１＞または＜Ｃ２＞に記載の方法。
＜Ｃ４＞＜ＤＣワクチン療法＞
前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程、および該培養された混合物を患者に投与する工程を包含する、項目＜Ｃ１＞～＜Ｃ３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ｃ５＞＜患者自己免疫細胞療法＞
前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞－ペプチド混合物を生産する工程を行い、該ＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物、および該樹状細胞－ペプチド混合物を患者に投与する工程を包含する、項目＜Ｃ１＞～＜Ｃ５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜Ｄ１＞＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞
（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または項目＜Ｃ１＞～＜Ｃ５＞のいずれかに記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；
（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞、＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載の方法および／または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載のシステムによって解析する工程；および
（Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程
を包含する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法。
＜Ｄ１－１＞
（Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、項目＜Ｄ１＞に記載の方法。
＜Ｄ１－２＞
（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、項目＜Ｄ１＞～＜Ｄ１－１＞のいずれかに記載の方法。
＜Ｄ１－３＞
（Ａ）工程は、項目Ｃ１に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、項目＜Ｄ１＞～＜Ｄ１－２＞のいずれかに記載の方法。
＜Ｄ２＞
＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞
（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体からリンパ球またはがん組織を単離する工程；
（Ｂ）該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを項目Ｂ１に記載の方法によって解析する工程；および
（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程
を包含する、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離する方法。
＜Ｅ１＞＜CPC＞
　A)患者からＴリンパ球を採取する工程；
　B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞、＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載の方法および／または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載のシステムに基づいてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；
　Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程； 
　Ｄ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程；
　E)該腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を該患者に導入する工程；
を包含する細胞加工療法。
＜Ｅ１－１＞
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる、項目＜Ｅ１＞に記載の細胞加工療法。
＜Ｅ１－２＞
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる、項目＜Ｅ１＞または＜Ｅ１－１＞に記載の細胞加工療法。
＜Ｅ１－３＞
前記抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、項目＜Ｅ１＞、＜Ｅ１－１＞～＜Ｅ１－２＞のいずれかに記載の細胞加工療法。
＜Ｅ１－４＞
Ｃ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む、項目＜Ｅ１＞、＜Ｅ１－１＞～＜Ｅ１－３＞のいずれかに記載の方法。
＜Ｅ１－５＞
Ｃ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む、項目＜Ｅ１＞、＜Ｅ１－１＞～＜Ｅ１－４＞のいずれかに記載の方法。
＜Ｅ１－６＞
Ｃ）工程は、抗原刺激前後において項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞、＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載の方法および／または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載のシステムに基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む、項目＜Ｅ１＞、＜Ｅ１－１＞～＜Ｅ１－５＞のいずれかに記載の方法。
＜Ｅ２＞＜CPCのRAC＞
項目＜Ｄ２＞に記載の方法で単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および／または安全性評価を行う方法。
＜ＣＣ１＞
被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法であって、該方法は、
（１）項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞、＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載の方法および／または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載のシステムによって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；
（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；
（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；および
（４）決定されたペプチドを合成する工程；
を包含する、方法。
＜ＣＣ２＞
前記（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＥＰまたはＮＥＥｔＭＨＣＣを用いて決定される、項目＜ＣＣ１＞に記載の方法。
＜ＣＣ３＞＜改良型ＣＴＬ法＞
前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程を包含する、項目＜ＣＣ１＞または＜ＣＣ２＞に記載の方法。
＜ＣＣ４＞＜ＤＣワクチン療法＞
前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程を包含する、項目＜ＣＣ１＞～＜ＣＣ２＞のいずれかに記載の方法。
＜ＣＣ５＞＜患者自己免疫細胞療法＞
前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞－ペプチド混合物を生産する工程を包含する、項目＜ＣＣ１＞～＜ＣＣ４＞のいずれかに記載の方法。
＜ＤＤ１＞＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞
（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または項目＜ＣＣ１＞～＜ＣＣ５＞のいずれかに記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；
（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞、＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載の方法および／または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載のシステムによって解析する工程；および
（ＣＣ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程
を包含する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法。
＜ＤＤ１－１＞
（Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、項目＜ＤＤ１＞に記載の方法。
＜ＤＤ１－２＞
（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、項目＜ＤＤ１＞または＜ＤＤ１－１＞に記載の方法。
＜ＤＤ１－３＞
（Ａ）工程は、項目ＣＣ１に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、項目＜ＤＤ１＞～＜ＤＤ１－２＞のいずれかに記載の方法。
＜ＤＤ２＞
＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞
（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体から単離されたリンパ球またはがん組織を提供する工程；
（Ｂ）該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞、＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載の方法および／または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載のシステムによって解析する工程；および
（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程
を包含する、共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法。
＜ＥＥ１＞＜CCPCC＞
　A)患者から採取されたＴリンパ球を提供する工程；
　B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、項目＜Ｂ１＞～＜Ｂ１０＞、＜Ｂ５７＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載の方法および／または項目＜Ｂ１１＞～＜Ｂ２０＞、＜Ｂ５８＞～＜Ｂ５８－２０＞、＜Ｂ５９＞、または＜Ｂ６０＞～＜Ｂ６０－２１＞のいずれかに記載のシステムに基づいてＴＣＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；
　ＣＣ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程； および
　ＤＤ）該最適ＴＣＲのＴＣＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程
を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を調製する方法。
＜ＥＥ１－１＞
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる、項目＜ＥＥ１＞に記載の方法。
＜ＥＥ１－２＞
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる、項目＜ＥＥ１＞または＜ＥＥ１－１＞に記載の方法。
＜ＥＥ１－３＞
前記抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、項目＜ＥＥ１＞～＜ＥＥ１－２＞のいずれかに記載の方法。
＜ＥＥ１－４＞
Ｃ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む、項目＜ＥＥ１＞～＜ＥＥ１－３＞のいずれかに記載の方法。
＜ＥＥ１－５＞
Ｃ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む、項目＜ＥＥ１＞～＜ＥＥ１－４＞のいずれかに記載の方法。
＜ＥＥ１－６＞
Ｃ）工程は、抗原刺激前後において項目Ｂ１に基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む、項目＜ＥＥ１＞～＜ＥＥ１－５＞のいずれかに記載の方法。
＜ＥＥ２＞＜CCPCCのRACC＞
項目＜ＤＤ２＞に記載の方法で単離されたがん特異的ＴＣＣＲ遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および／または安全性評価を行う方法。この有効性および／または安全性評価の具体的なステップを以下を例示することができる。
　＜有効性＞例えば、がん特異的ＴＣＲ遺伝子を導入したＴ細胞と＜ＥＥ１－１＞記載の該被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、＜ＥＥ１－２＞記載の該被験者に由来する不活性化がん細胞、または＜ＥＥ１－３＞に記載の腫瘍由来イディオタイプペプチドと培養した後に、Ｔ細胞の活性化に応じて細胞外に分泌されるサイトカイン（インターフェロンγ等）量を測定する、Ｔ細胞の活性化に応じて上昇する特定の遺伝子の発現量を測定する、あるいはＴ細胞の活性化に応じて発現または発現増加する細胞表面分子を測定することで、有効性を評価することができる。
　＜安全性＞例えば、がん特異的ＴＣＲ遺伝子を導入した前記被験者に由来するＴ細胞と該被験者に由来する正常細胞を混合した場合に、上記Ｔ細胞の活性化に応じて分泌されるサイトカイン、遺伝子発現、あるいは細胞表面分子の発現を測定し、該ＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞が正常細胞により活性化されないことを確認することにより安全性を評価することができる。
　本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本発明は、従来技術に対して、「大規模」シーケンスに対応できるという効果がある。特にBCRに関しては、変異が多数観察されることから変異に関係なく「非バイアス」で増幅することができ正確な判定をすることができる点で特に有利な効果があるといえる。従来のシステムのうち、Ｖ鎖特異的プライマーを利用した増幅法および配列決定法に対しては、１．非バイアスであること、２．そのため定量性に優れているといえる。SMART PCR法などの技術に対しても、１．「非バイアス度」が顕著に改善しており、２．各技術がもつ特有の欠点を持たないという点で有利である。たとえば、SMARTではRepeated Template Switchingが問題として報告されているところ、本システムではそのような問題は発生しない。また、３．アイソタイプ、サブタイプの同定も含め網羅的な解析ができることも有利な効果として挙げることができる。
　本発明のシステムおよび方法では、TCRはα、β、γ、δ鎖について、BCRはIgM、IgD、IgA、IgG、IgEの重鎖とIgL、IgLの軽鎖についてTCRおよびBCRレパトアを導出し、様々な側面からのレパトアの変化を検出することができる。疾患特異的TCRあるいはBCRの同定に重要なCDR3領域塩基配列を正確に決定するために、シーケンス用のC領域プライマーの位置を適切な位置に配置している。さらに、増幅した遺伝子の配列から、アイソタイプあるいはサブタイプの種類を同定でき、疾患と関連する遺伝子の特定が容易にできるように、プライマーの位置が工夫されている。
　従来技術ではいずれも多数のＶ鎖特異的プライマーを用いたＭｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲ法が採用され、定量性や精度に大きな問題を残していたところ、このような問題が解決された。　また、本発明の解析システムを利用することで以下も達成される。たとえば、インバリアントＴＣＲのスクリーニングを行うことができる。大規模塩基配列のＴＣＲレパトア解析において、ＴＣＲα鎖においてＨＬＡに関係なく多数の試料に重複するリードを検索することから、インバリアントＴＣＲをスクリーニングできることを見出した。実際、ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ＭＨＣであるＭＲ１を認識するＭＡＩＴ由来のＴＣＲを多数検出することができた。インバリアントＴＣＲを発現するＮＫＴやＭＡＩＴなどは、感染免疫、抗腫瘍、炎症などの免疫応答において重要な役割を果たしていることが知られる。様々な組織試料における新規インバリアントＴＣＲをスクリーニングし、ユニークな機能をもつ細胞を探索する目的に利用できると期待される。
　さらに、抗原特異的ＴＣＲのＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子ペアの推定を行うことができる。ＴＣＲαおよびＴＣＲβはヘテロダイマーを形成する受容体分子である。抗原に反応して増殖する抗原特異的Ｔ細胞は、特定のユニークなＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖から成る。しかし、ＴＣＲレパトア解析は、ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子を別個に増幅するため、どのＴＣＲαとどのＴＣＲβがペアを形成するか知ることができない。そこで、特定のＴＣＲβ鎖リードが重複する個体の組み合わせについて、ＴＣＲα鎖の重複個体と一致するかどうかを調べることで、ペアとなるＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖遺伝子を推測することができる（図４４）。特定のＴＣＲβ鎖の重複個体を指標にして、一致するＴＣＲα鎖を推測することができた（表３－１１）。複数のリードに割り当てられる例もあるが、ペアＴＣＲ遺伝子の特定に有用な検索方法であると考えられる。
　精確度の高い非バイアスでの大規模遺伝子解析のための試料が提供され、定量的な分析が特に必要とされる臨床応用場面において特に有用である。また、本発明では、「低頻度」（１／１００００－１／１０００００またはそれ以下）遺伝子を同定できることで、たとえば白血病のより正確な診断、治療につながることになる。これは、従来技術（アダプターにプレート法を組み合わせる方法、またはＳＭＡＲＴ法にプレート法を組み合わせる方法）では検出限界（１％程度）のためできなかった。
　また、Ｖ特異的な手法の場合、Ｖ特異的プライマー間で増幅効率が異なるため、定量性は低いが、この手法は１セットのプライマーで増幅するため真の意味での精確度の高い定量を可能にする。
　また、１セットのプライマーですべてのＴＣＲもしくはＢＣＲを増幅できるため、増幅に要するプライマーや容器を節減できる。
　また、ＢＣＲについては、変異が起こる特性があるため、Ｖ鎖特異的プライマーを用いる方法では、事実上増幅できない、あるいは増幅効率が低下する等遺伝子がでる欠点があり、本発明の方法は、ＢＣＲにおいての課題も解決することができる。
　また、本発明を用いた解析法では、従来法では一晩かかっていたのが本件では数分で終わるためこのような点でも有利である。
　＜ウェット関連の効果＞
　精確度の高い非バイアスでの大規模遺伝子解析のための試料が提供され、定量的な分析が特に必要とされる臨床応用場面において特に有用である。また、本発明では、「低頻度」（１／１００００－１／１０００００）遺伝子を同定できることで、たとえば白血病のより正確な診断、治療につながることになる。これは、従来技術（アダプターにプレート法を組み合わせる方法、またはＳＭＡＲＴ法にプレート法を組み合わせる方法）では検出限界（１％程度）のためできなかった。
　また、Ｖ特異的な手法の場合、Ｖ特異的プライマー間で増幅効率が異なるため、定量性は低いが、この手法は１セットのプライマーで増幅するため真の意味での精確度の高い定量を可能にする。
　また、１セットのプライマーですべてのＴＣＲもしくはＢＣＲを増幅できるため、増幅に要するプライマーや容器を節減できる。
　また、ＢＣＲについては、変異が起こる特性があるため、Ｖ鎖特異的プライマーを用いる方法では、事実上増幅できない、あるいは増幅効率が低下する等遺伝子がでる欠点があり、本発明の方法は、ＢＣＲにおいての課題も解決することができる。
　また、本発明を用いた解析法では、従来法では一晩かかっていたのが本件では数分で終わるためこのような点でも有利である。
　＜インシリコ関連の効果＞
　従来汎用されるＩＭＧＴ／Ｈｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴとの大きな相違点は以下が挙げられる：ＩＭＧＴ／Ｈｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴでは、Ｃ領域の分類機能は無く、レパトア分類は「遺伝子名単位」「アリル単位」どちらかである（すなわち、（＊）Ｖ（遺伝子名）－Ｄ（遺伝子名）－Ｊ（遺伝子名）、もしくは、Ｖ（アリル）－Ｄ（アリル）－Ｊ（アリル）となる）。また、ＣＤＲ３分類は、上記レパトアとは別個に行うことなら可能であるが、自由度がない。他方、本発明の解析方法ではＣ領域の分類が可能であり、レパトア分類では領域ごとに「遺伝子名単位」「アリル単位」を選択可能である。また、Ｄの代わりにＣＤＲ３を用いることも可能である。
　また、ＩＭＧＴ／Ｈｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴの分類方法に加えて、本発明では、Ｖ（遺伝子名）－Ｄ（アリル）－Ｊ（アリル）や、Ｖ（アリル）－ＣＤＲ３－Ｊ（アリル）などの組合せも可能である。なお、ＣＤＲ３は、上記レパトア分類の一部として使用できる他、単独の分類も可能である。また、ＩＭＧＴ／Ｈｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴは１バッチで処理できる配列の最大数は１５０，０００であるのに対して、本発明の解析方法では無制限である。同一データを処理する際の所要時間は、本システムではおおよそ１／１０である。
　＜治療による効果＞
　標的となる癌細胞において治療に有効な特異的マーカー（分子標的）が存在しない、あるいは既存の特定の分子標的薬による治療では効果がない患者に対して、本発明のがんイディオタイプペプチド療法は有効である。すなわち、個別患者由来の癌細胞の遺伝子情報に基づいてペプチドが作製されるため、TCRもしくはBCRを発現する多くの腫瘍に対して効果を発揮する。リンパ腫細胞や白血病細胞はその起源からT細胞系腫瘍とB細胞系腫瘍が存在し、いずれの腫瘍型においても本技術が適応可能であり、多くの患者の治療に有用である。また、腫瘍化したB細胞亜集団を標的とする場合、抗CD20抗体のような大部分のB細胞に発現する細胞表面分子を標的とした抗体医薬が使用される。こららの抗体医薬は正常B細胞にも働くため、癌細胞のみならず正常細胞にも働き免疫能の低下などの副作用を引き起こす。他方、本発明のように癌細胞だけを標的とした治療は安全性も高い。癌ペプチドを利用する場合も、癌細胞に対するより特異性の高いペプチドを使用することにより、安全性の高い治療を実現することができる。また、既存のがんペプチドを使用した治療は、その結合する特定のHLAを有する患者に限定される。他方、本発明のように患者の遺伝情報に基づいてペプチドが設計されるため、HLA型に限定されず、広範な患者に適応できる利点がある。
　既存のCTL療法は患者リンパ球と患者腫瘍細胞を、既存のDC療法は患者DC細胞と患者腫瘍細胞を共培養することで腫瘍特異的なキラーT細胞または腫瘍特異的DCを誘導する。その他に、人口のがん抗原を用いて、リンパ球またはDC細胞を刺激して、患者に移入することで抗腫瘍効果を狙った治療が行われる。特異性を付与する抗原として、腫瘍細胞全体を使用するよりもがん抗原タンパク質が、タンパク質よりもペプチドがより効果的で副作用の少ないと考えられる。タンパク質と異なりペプチドは容易に遺伝子配列情報に基づいて直接化学合成することができる利点もある。ペプチドは、その製造過程で細胞、培地、感染性物質などのバイオマテリアルを使用しないため、安全性も確保できる。癌細胞の遺伝情報に基づいて患者HLAに対応した個別のペプチドを設計することで、広範な患者に適合した安全な治療を実現することができる。
　患者自己免疫療法においては、CTL細胞と腫瘍特異的DC細胞の移入による相乗効果が期待される。CTL細胞は、既に抗原により刺激、活性化された細胞として働き、早期治療効果を発揮すると期待される。腫瘍特異的DC細胞は、移入された患者においてCTL細胞を誘導することから持続的な抗腫瘍効果があり、これら異なる細胞を併用することで相乗的な抗腫瘍効果が期待される。
　がん特異的TCR遺伝子治療では、標的抗原の発現が癌細胞に限られることが重要である。治療においては、がん-精巣抗原のように癌細胞と精巣組織などの限られた組織に局在する抗原が選択されるが、これら抗原も一部の正常細胞に発現することが知られ、時に治療の安全性に関わる問題となる。本発明の技術のオーダーメイドがんTCR遺伝子治療は、患者腫瘍組織に浸潤するT細胞を同定し、そのTCRの遺伝子配列を利用する。従って、実際に患者体内で抗腫瘍に働くと考えられる機能的なTCRを利用するため、より高い効果が期待される。また、患者体内に存在するT細胞であることから、正常細胞への作用も限られたものである可能性が高い。既存のTCR遺伝子治療では、特定のHLAを持ち、かつ対象となるがん抗原を発現する患者に限定される。一方、オーダーメイドであれば患者HLAに適応し、患者に由来する癌抗原に特異的なTCRを個別に作製することができ、より広範な患者を対象とした治療が可能になる。in vitro刺激による癌特異的TCR遺伝子の単離は、患者リンパ球を抗原蛋白、抗原ペプチド、不活化癌細胞、あるいはイディオタイプペプチド等で刺激して行われる。この患者ごとに実験的工程を経て単離されるTCR遺伝子は、患者HLA型、癌細胞型、がん抗原種、その他遺伝的背景に適合したTCRであり、より治療に有効であると考えられる。
図１は、アイソタイプ特異的プライマーの交差性を示す。左パネルは、第２のＩｇＭサンプルに関する例であり、左端（Ｌ）は分子量マーカーのレーンを示す。Ｍ、Ｇ、Ａ、ＤおよびＥは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＧ，ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの特異的プライマーでの結果を示す。中央パネルは、左側に第２のＩｇＧサンプル、右側に第２のＩｇＡサンプルでの結果を示し、右端（Ｌ）は分子量マーカーのレーンを示す。Ｍ、Ｇ、Ａ、ＤおよびＥは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＧ，ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの特異的プライマーでの結果を示す。右パネルは左側に第２のＩｇＤサンプルおよび右側に第２のＩｇＥサンプルを示す。左端（Ｌ）は分子量マーカーのレーンを示す。Ｍ、Ｇ、Ａ、ＤおよびＥは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＧ，ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの特異的プライマーでの結果を示す。使用した免疫グロブリンアイソタイプ特異的プライマーの特異性を評価するため、目的の免疫グロブリンアイソタイプ特異的プライマーとともに他のアイソタイプ特異的プライマーによる増幅を行い、交差反応性の有無を確認した。１０μＬのＧＳ－ＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲルにてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動後、エチジウムブロマイド染色により評価した。各アイソタイプ特異的プライマーで増幅された２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物は、他のアイソタイプ特異的ＧＳ－ＰＣＲプライマーで増幅されることなく、プライマーの特異性が高いことが確認された。 図２は至適希釈濃度の検討結果を示す。各アイソタイプにおけるＧＳ－ＰＣＲ至適条件を検討した。２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物の２倍階段希釈系列を作成し、２０サイクルのＧＳ－ＰＣＲを行った。２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物について、左からＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの、それぞれ１倍、２倍、４倍、８倍および１６倍希釈の結果を示す。左端のＬは、分子量マーカーのレーンを示す。１６倍希釈において良好な結果が得られた。 図３は、至適サイクル数の検討結果を示す。１６倍希釈２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を用いて、１０、１５、２０サイクルのＰＣＲを行った。上パネルは２０サイクルの結果、中パネルは１５サイクルの結果、および下パネルは１０サイクルの結果を示す。それぞれのパネルにおいて、左端のＬは、分子量マーカーのレーンを示し、左からＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを示す。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤにおいては、１０サイクルで良好な増幅が確認された。また、ＩｇＥにおいては、２０サイクルが適当であることが確認された。 図４は次世代シーケンスのリード長を示す。グラフはライブラリーリードの数を示し（縦軸）、横軸にはリード長の解析結果を示す。ＢＣＲ遺伝子の次世代シーケンスのリード長を示している。Ｒａｗ　ｄａｔａのリード数は１３万、Ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｓｓを経たものは９万以上のリード数が得られた。Ｔａｇ標識した各アイソタイプ由来のリード数は表２に示す。 図５はＭＩＤ別リード長の解析結果を示す。上パネル左からＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡを示し、下パネル左からＩｇＤおよびＩｇＥを示す。各グラフにおいて、縦軸はリード数を示し、横軸はリード長（塩基長）を示す。ＭＩＤ別に分割したリード数、リード長の分布も均等であった。Ｖ領域の解析に十分な長さを持つリード長を４００ｂｐ以上としてカウントすると、約半数の１万リードがＢＣＲレパトア解析に有効なリードであると考えられた。 図６Ａは、アイソタイプ別Ｃ領域配列の使用頻度の解析結果を示す。上パネル左からＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡを示し、下パネル左からＩｇＤおよびＩｇＥを示す。各グラフにおいて、縦軸は％を示し、横軸は識別されたＣ領域遺伝子名を示す。得られた各アイソタイプ別のリードに対して、サブクラスも含めた免疫グロブリンアイソタイプのＣ領域配列との相同性検索を行った。サブクラス別のリード数の頻度は、ＩｇＡサブクラスでは、ＩｇＡ１が７３％、ＩｇＡ２が２７％であり、ＩｇＧサブクラスはＩｇＧ１が６２％、ＩｇＧ２が３６％で、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のリードはほとんど得られなかった。また、得られた各サブクラス別のリードは、他のクラスに分類されることがほとんどなかったため、プライマーの特異性がシークエンスレベルで再確認できた。図６Ａでは、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔで解析したものを示す。 図６Ａと同様の分析を、改良型ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ）で行った結果を示す。本ソフトウェアでも同様の結果が得られ、さらにどのアイソタイプやサブタイプにも分類されないリードを示すｎｏ　ｈｉｔの結果も得ることができた。 図７Ａおよび７Ｂはアイソタイプ別Ｖ領域レパトアの分析結果を示す。上からそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを示す。横軸は各アイソタイプ名を示す。アイソタイプ別のＶ領域配列のレパトア（ＢＣＲ　Ｖレパトア）を示した。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤの間でＢＣＲ　Ｖレパトアは非常に類似したが、ＩｇＥはＩＧＨＶ３－３０を有するリードのみ得られた。この理由として、末梢血中のＩｇＥ陽性細胞数は他のクラスと比較して非常に少なく、偏ったレパトアが検出された可能性が示唆される。図７ＡおよびＢでは、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔで解析したものを示す。 図７Ａおよび７Ｂはアイソタイプ別Ｖ領域レパトアの分析結果を示す。上からそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを示す。横軸は各アイソタイプ名を示す。アイソタイプ別のＶ領域配列のレパトア（ＢＣＲ　Ｖレパトア）を示した。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤの間でＢＣＲ　Ｖレパトアは非常に類似したが、ＩｇＥはＩＧＨＶ３－３０を有するリードのみ得られた。この理由として、末梢血中のＩｇＥ陽性細胞数は他のクラスと比較して非常に少なく、偏ったレパトアが検出された可能性が示唆される。図７ＡおよびＢでは、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔで解析したものを示す。 図７ＣおよびＤは、図７ＡおよびＢと同様の分析を、改良型ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ）で行った結果を示す。本ソフトウェアでも同様の結果が得られ、さらにｎｏ　ｈｉｔの結果も得ることができた。 図７ＣおよびＤは、図７ＡおよびＢと同様の分析を、改良型ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ）で行った結果を示す。本ソフトウェアでも同様の結果が得られ、さらにｎｏ　ｈｉｔの結果も得ることができた。 図８ＡおよびＢは、サブタイプ別Ｖ領域レパトアの分析結果を示す。上からＩｇＡ１，ＩｇＡ２、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２を示す。横軸は、各サブクラスの各アイソタイプ名を示す。ＩｇＡとＩｇＧサブクラス別のＢＣＲ　Ｖレパトアを示した。ＩｇＡのサブクラスはＩｇＡ１とＩｇＡ２で数種のＶ鎖における頻度が異なった。ＩＧＨＶ１－１８とＩＧＨＶ４－３９の存在頻度はＩｇＡ２に比較してＩｇＡ１で高く、一方、ＩＧＨＶ３－２３とＩＧＨＶ３－７４の存在頻度はＩｇＡ１よりＩｇＡ２で高かった。ＩｇＧサブクラスに関し、ＩｇＡ２で増加が認められたＩＧＨＶ３－２３とＩＧＨＶ３－７４の頻度は、ＩｇＧ１と比較してＩｇＧ２で高かった。ＩｇＧ３とＩｇＧ４のリード数は少なく（１０リード）、ＩｇＧ３ではＩＧＨＶ４－５９－ＩＧＨＪ４－ＩＧＨＤ１－７をもつクローンの頻度が３／１０とクローナリティが高く、ＩｇＧ４についてもＩＧＨＶ３－２３－ＩＧＨＪ４－ＩＧＨＤ３－１０をもつリードが５／１０を占めた（表１－３）。図８ＡおよびＢでは、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔで解析したものを示す。 図８ＡおよびＢは、サブタイプ別Ｖ領域レパトアの分析結果を示す。上からＩｇＡ１，ＩｇＡ２、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２を示す。横軸は、各サブクラスの各アイソタイプ名を示す。ＩｇＡとＩｇＧサブクラス別のＢＣＲ　Ｖレパトアを示した。ＩｇＡのサブクラスはＩｇＡ１とＩｇＡ２で数種のＶ鎖における頻度が異なった。ＩＧＨＶ１－１８とＩＧＨＶ４－３９の存在頻度はＩｇＡ２に比較してＩｇＡ１で高く、一方、ＩＧＨＶ３－２３とＩＧＨＶ３－７４の存在頻度はＩｇＡ１よりＩｇＡ２で高かった。ＩｇＧサブクラスに関し、ＩｇＡ２で増加が認められたＩＧＨＶ３－２３とＩＧＨＶ３－７４の頻度は、ＩｇＧ１と比較してＩｇＧ２で高かった。ＩｇＧ３とＩｇＧ４のリード数は少なく（１０リード）、ＩｇＧ３ではＩＧＨＶ４－５９－ＩＧＨＪ４－ＩＧＨＤ１－７をもつクローンの頻度が３／１０とクローナリティが高く、ＩｇＧ４についてもＩＧＨＶ３－２３－ＩＧＨＪ４－ＩＧＨＤ３－１０をもつリードが５／１０を占めた（表１－３）。図８ＡおよびＢでは、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔで解析したものを示す。 図８ＣおよびＤでは、図８ＡおよびＢと同様の分析を、改良型ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ）で行った結果を示す。本ソフトウェアでも同様の結果が得られ、さらにｎｏ　ｈｉｔの結果も得ることができた。 図８ＣおよびＤでは、図８ＡおよびＢと同様の分析を、改良型ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ）で行った結果を示す。本ソフトウェアでも同様の結果が得られ、さらにｎｏ　ｈｉｔの結果も得ることができた。 図９Ａはサブクラス別のＢＣＲＪレパトアの分析結果を示す。サブクラス別のＢＣＲＪレパトアを示した。上パネルは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを示し、横軸は各アイソタイプ名を示す。下パネルは、サブクラス別の表示であり、左からＩｇＡ１，ＩｇＡ２、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２を示す。横軸は各サブクラスの各アイソタイプ名を示す。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤにおいて、約半数のリードにおいてＩＧＨＪ４が使用されており、一方ＩＧＨＪ２はほとんど使用されていなかった。ＩｇＥではＩＧＨＪ１のみが使用されていた。ＩｇＭおよびＩｇＡのサブクラスにおけるＩＧＨＪレパトアについても検討した。ＩＧＨＶレパトアとは異なり、サブクラス間での顕著な差は認められなかった図９Ａでは、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔで解析したものを示す。 図９Ａと同様の分析を、改良型ソフトウェアで行った結果を示す。本特許と合わせて出願中のソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ）で同様の結果が得られ、さらにｎｏ　ｈｉｔの結果も得ることができた。 図１０はＴＣＲ遺伝子の増幅方法の模式図を示す。実施例で例示したプライマー対についての説明を示す。Ｐ２０ＥＡアダプタープライマーにアダプター配列であるＢ－ａｄａｐｔｏｒを付加したＢ－Ｐ２０ＥＡプライマーと３ｒｄ　ｎｅｓｔｅｄプライマーにアダプター配列であるＡ－ａｄａｐｔｏｒおよび識別配列であるＭＩＤ　Ｔａｇ配列（ＭＩＤと表示、ＭＩＤ－１～２６）を付加したプライマーを用いて増幅した。ＫｅｙはＴＣＡＧを示す。 図１１は、１０例の健常人由来ＧＳ－ＰＣＲ増幅産物の１０μＬを２％アガロースゲルにて電気泳動を行った結果を示す。上段：ＧＳ－ＰＣＲ（ＴＲＡ）、ＴＣＲα鎖増幅産物、下段：ＧＳ－ＰＣＲ（ＴＲＢ）、ＴＣＲβ鎖増幅産物を示す。番号はサンプル番号を示す。 図１２はＴＣＲ／ＢＣＲレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ）のパラメータ設定を示す。 図１３（Ａ～Ｄ）は、健常人におけるＴＲＡＶレパトアの分析結果を示す。おのおの、各サンプル（番号参照）についての、ＴＲＡＶレパトアを示す。横軸は各ＴＲＡＶ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＡＶ９－２、１２および１３の存在頻度が高く、＃１においてＴＲＡＶ２０、＃５においてＴＲＡＶ２１が他の健常人よりも高く、個人差も認められた。 図１３（Ａ～Ｄ）は、健常人におけるＴＲＡＶレパトアの分析結果を示す。おのおの、各サンプル（番号参照）についての、ＴＲＡＶレパトアを示す。横軸は各ＴＲＡＶ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＡＶ９－２、１２および１３の存在頻度が高く、＃１においてＴＲＡＶ２０、＃５においてＴＲＡＶ２１が他の健常人よりも高く、個人差も認められた。 図１３（Ａ～Ｄ）は、健常人におけるＴＲＡＶレパトアの分析結果を示す。おのおの、各サンプル（番号参照）についての、ＴＲＡＶレパトアを示す。横軸は各ＴＲＡＶ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＡＶ９－２、１２および１３の存在頻度が高く、＃１においてＴＲＡＶ２０、＃５においてＴＲＡＶ２１が他の健常人よりも高く、個人差も認められた。 図１３（Ａ～Ｄ）は、健常人におけるＴＲＡＶレパトアの分析結果を示す。おのおの、各サンプル（番号参照）についての、ＴＲＡＶレパトアを示す。横軸は各ＴＲＡＶ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＡＶ９－２、１２および１３の存在頻度が高く、＃１においてＴＲＡＶ２０、＃５においてＴＲＡＶ２１が他の健常人よりも高く、個人差も認められた。 図１４（Ａ～Ｄ）は健常人におけるＴＲＢＶレパトアの分析結果を示す。おのおの、各サンプル（番号参照）についての、ＴＲＢＶレパトアを示す。横軸は各ＴＲＢＶ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＢＶ２０－１、２８および２９－１の存在頻度が高く、＃８においてＴＲＢＶ３－１が他の健常人より高く、個人差が認められた。 図１４（Ａ～Ｄ）は健常人におけるＴＲＢＶレパトアの分析結果を示す。おのおの、各サンプル（番号参照）についての、ＴＲＢＶレパトアを示す。横軸は各ＴＲＢＶ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＢＶ２０－１、２８および２９－１の存在頻度が高く、＃８においてＴＲＢＶ３－１が他の健常人より高く、個人差が認められた。 図１４（Ａ～Ｄ）は健常人におけるＴＲＢＶレパトアの分析結果を示す。おのおの、各サンプル（番号参照）についての、ＴＲＢＶレパトアを示す。横軸は各ＴＲＢＶ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＢＶ２０－１、２８および２９－１の存在頻度が高く、＃８においてＴＲＢＶ３－１が他の健常人より高く、個人差が認められた。 図１４（Ａ～Ｄ）は健常人におけるＴＲＢＶレパトアの分析結果を示す。おのおの、各サンプル（番号参照）についての、ＴＲＢＶレパトアを示す。横軸は各ＴＲＢＶ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＢＶ２０－１、２８および２９－１の存在頻度が高く、＃８においてＴＲＢＶ３－１が他の健常人より高く、個人差が認められた。 図１５（Ａ～Ｄ）は、健常人におけるＴＲＡＪレパトアの分析結果を示す。横軸は各ＴＲＡＪ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＡＪレパトアとその平均値を示した。健常人のＴＲＡＪレパトアは、どのＡＪファミリーも概ね５％以内を示し、＃１においてＴＲＡＪ１２、＃４においてＴＲＡＪ２７、＃５においてＴＲＡＪ３７、＃８においてＴＲＡＪ４５が他の健常人よりも高く、個人差が認められた。 図１５（Ａ～Ｄ）は、健常人におけるＴＲＡＪレパトアの分析結果を示す。横軸は各ＴＲＡＪ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＡＪレパトアとその平均値を示した。健常人のＴＲＡＪレパトアは、どのＡＪファミリーも概ね５％以内を示し、＃１においてＴＲＡＪ１２、＃４においてＴＲＡＪ２７、＃５においてＴＲＡＪ３７、＃８においてＴＲＡＪ４５が他の健常人よりも高く、個人差が認められた。 図１５（Ａ～Ｄ）は、健常人におけるＴＲＡＪレパトアの分析結果を示す。横軸は各ＴＲＡＪ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＡＪレパトアとその平均値を示した。健常人のＴＲＡＪレパトアは、どのＡＪファミリーも概ね５％以内を示し、＃１においてＴＲＡＪ１２、＃４においてＴＲＡＪ２７、＃５においてＴＲＡＪ３７、＃８においてＴＲＡＪ４５が他の健常人よりも高く、個人差が認められた。 図１５（Ａ～Ｄ）は、健常人におけるＴＲＡＪレパトアの分析結果を示す。横軸は各ＴＲＡＪ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＡＪレパトアとその平均値を示した。健常人のＴＲＡＪレパトアは、どのＡＪファミリーも概ね５％以内を示し、＃１においてＴＲＡＪ１２、＃４においてＴＲＡＪ２７、＃５においてＴＲＡＪ３７、＃８においてＴＲＡＪ４５が他の健常人よりも高く、個人差が認められた。 図１６は、健常人におけるＴＲＢＪレパトアの分析結果を示す。横軸は各ＴＲＢＪ遺伝子名を示し、縦軸はその存在頻度を示す。ｍｅａｎは平均を示す。健常人１０例のＴＲＢＪレパトアとその平均値を示した。健常人のＴＲＢＪレパトアは、ＴＲＢＪ２－１、２－３および２－７の存在頻度が高く、＃８においてはＴＲＢＪ２－２が高く、個人差が認められた。 図１７は、調製実施例３で合成した各２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲルで電気泳動した結果、目視化において目的のサイズの増幅産物を確認したものである。 図１８は、上段にＴＲＡＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＴＲＡＣのエクソン領域配列である。エクソンＥＸ１、ＥＸ２、ＥＸ３からなり、全長にわたりプライマー設定が可能である。）。下段にＴＲＢＣの可能なプライマー設定領域を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＴＲＢＣのエクソン領域配列である。エクソンＥＸ１、ＥＸ２、ＥＸ３およびＥＸ４からなり、全長にわたりプライマー設定が可能である。）。標的配列となるＴＲＡＣ配列は、図に示したもの（配列番号１３７６）のほか、その変異体も使用することができることが理解される。標的配列となるＴＲＢＣ配列は、図に示したもの（配列番号１３７７）のほか、配列番号１３９２、１３９３、および他の変異体のものも使用することができることが理解される。なお、図１８～２５について説明すると、この全長配列における各々の設定配列は単なる例示であり、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。 図１９は、上段にＴＲＧＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＴＲＧＣのエクソン領域配列である。エクソンＥＸ１、ＥＸ２およびＥＸ３からなり、全長にわたりプライマー設定が可能である。）。上下段にＴＲＤＣの可能なプライマー設定領域を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＴＲＤＣのエクソン領域配列である。エクソンＥＸ１、ＥＸ２、ＥＸ３およびＥＸ４からなり、全長にわたりプライマー設定が可能である。）。標的配列となるＴＲＧＣ配列は、図に示したもの（配列番号１３７８）のほか、配列番号１３９４、１３９５、１３９６、１３９７、１３９８、１３９９、およびそれらの変異体のものも使用することができることが理解される。標的配列となるＴＲＤＣ配列は、図に示したもの（配列番号１３７９）のほか、その変異体のものも使用することができることが理解される。 図２０は、ＩＧＨＭの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＭのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｍ１およびＭ２からなる。図は膜結合型の一例を示す。標的配列となるＩＧＨＭ配列は、図に示したもの（配列番号１３８０）のほか、配列番号１４４７、１４４８、１４４９、およびそれらの変異体のものも使用することができることが理解される。全長にわたりプライマー設定が可能である。）。 図２１は、ＩＧＨＡの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＡのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１およびＭ２からなる。図は分泌型の一例を示す。標的配列となるＩＧＨＡ配列は、図に示したもの（配列番号１３８１）のほか、配列番号１４００、１４０１、１４０２、１４０３、およびそれらの変異体のものも使用することができることが理解される。いずれも全長にわたりプライマー設定が可能である。）。 図２２は、ＩＧＨＧの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＧのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、Ｈ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、Ｈ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１およびＭ２からなる。図は分泌型の一例を示す。標的配列となるＩＧＨＧ配列は、図に示したもの（配列番号１３８２）のほか、配列番号１４１２～１４４６、およびそれらの変異体のものも使用することができることが理解される。いずれも全長にわたりプライマー設定が可能である）。 図２３は、ＩＧＨＤの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＤのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、Ｈ１、Ｈ２、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、Ｈ１、Ｈ２、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１およびＭ２からなる。図は膜結合型の一例を示す。標的配列となるＩＧＨＤ配列は、図に示したもの（配列番号１３８３）のほか、配列番号１４０４～１４０６、およびそれらの変異体のものも使用することができることが理解される。いずれも全長にわたりプライマー設定が可能である。）。 図２４は、ＩＧＨＥの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＥのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、エクソンＣＨ２、エクソンＣＨ３およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、エクソンＣＨ２、エクソンＣＨ３、Ｍ１およびＭ２からなる。図は分泌型の一例を示す。標的配列となるＩＧＨＥ配列は、図に示したもの（配列番号１３８４）のほか、配列番号１４０７～１４１１、およびそれらの変異体のものも使用することができることが理解される。いずれも全長にわたりプライマー設定が可能である。）。 図２５は、上段にＩＧＫＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は機能的なＩＧＫＣのＣＬ配列である。標的配列となるＩＧＫＣ配列は、図に示したもの（配列番号１３７９）のほか、その変異体のものも使用することができることが理解される。全長にわたりプライマー設定が可能である。）。下段にＩＧＬＣの可能なプライマー設定領域を示す（標的配列は機能的なＩＧＬＣのＣＬ配列である。標的配列となるＩＧＬＣ配列は、図に示したもの（配列番号１３７９）のほか、その変異体のものも使用することができることが理解される。全長にわたりプライマー設定が可能である。）。 図２６は、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　バイオアナライザによるＲＮＡ電気泳動像を示す。細胞段階希釈液より全ＲＮＡを抽出して、Ａｇｉｌｅｎｔ社製バイオアナライザを用いてＲＮＡ量を測定した。マイクロチップ型電気泳動装置でＲＮＡを分離し、ＲＮＡの品質チェックを行った。いずれの試料においても、２８Ｓ（上バンド）および１８Ｓ　ｒＲＮＡ（下バンド）が検出され、分解を受けていないＲＮＡが得られたことを示している。 図２７（Ａ～Ｄ）は、Ｍｏｌｔ－４細胞段階希釈試料におけるＴＣＲリードを示す。（配列番号１１６５～１３２４）。１０％、１％、０．１％、０．０１％の各Ｍｏｌｔ－４段階希釈試料から獲得されたＴＣＲリードを表記する。リード数の多い順にランキングし、上位４０位までを示した。０．０１％試料についてはランキング３６５～から４０４を示した。各リードのＴＲＢＶ、ＴＲＢＪおよびＣＤＲ３アミノ酸配列、リード数を示す。Ｍｏｌｔ－４由来の機能的ＴＣＲリード（ＴＲＢＶ２０－１／ＴＲＢＪ２－１／ＣＳＡＲＥＳＴＳＤＰＫＮＥＱＦＦＧ）は太字および背景灰色で示し、もう一方の機能欠損が推測されるＴＣＲリード（ＴＲＢＶ１０－３／ＴＲＢＪ２－５／ＣＡＩＳＥＰＴＧＩＲＲＤＰＶＬＲ）は太字で示した。 図２７（Ａ～Ｄ）は、Ｍｏｌｔ－４細胞段階希釈試料におけるＴＣＲリードを示す。（配列番号１１６５～１３２４）。１０％、１％、０．１％、０．０１％の各Ｍｏｌｔ－４段階希釈試料から獲得されたＴＣＲリードを表記する。リード数の多い順にランキングし、上位４０位までを示した。０．０１％試料についてはランキング３６５～から４０４を示した。各リードのＴＲＢＶ、ＴＲＢＪおよびＣＤＲ３アミノ酸配列、リード数を示す。Ｍｏｌｔ－４由来の機能的ＴＣＲリード（ＴＲＢＶ２０－１／ＴＲＢＪ２－１／ＣＳＡＲＥＳＴＳＤＰＫＮＥＱＦＦＧ）は太字および背景灰色で示し、もう一方の機能欠損が推測されるＴＣＲリード（ＴＲＢＶ１０－３／ＴＲＢＪ２－５／ＣＡＩＳＥＰＴＧＩＲＲＤＰＶＬＲ）は太字で示した。 図２７（Ａ～Ｄ）は、Ｍｏｌｔ－４細胞段階希釈試料におけるＴＣＲリードを示す。（配列番号１１６５～１３２４）。１０％、１％、０．１％、０．０１％の各Ｍｏｌｔ－４段階希釈試料から獲得されたＴＣＲリードを表記する。リード数の多い順にランキングし、上位４０位までを示した。０．０１％試料についてはランキング３６５～から４０４を示した。各リードのＴＲＢＶ、ＴＲＢＪおよびＣＤＲ３アミノ酸配列、リード数を示す。Ｍｏｌｔ－４由来の機能的ＴＣＲリード（ＴＲＢＶ２０－１／ＴＲＢＪ２－１／ＣＳＡＲＥＳＴＳＤＰＫＮＥＱＦＦＧ）は太字および背景灰色で示し、もう一方の機能欠損が推測されるＴＣＲリード（ＴＲＢＶ１０－３／ＴＲＢＪ２－５／ＣＡＩＳＥＰＴＧＩＲＲＤＰＶＬＲ）は太字で示した。 図２７（Ａ～Ｄ）は、Ｍｏｌｔ－４細胞段階希釈試料におけるＴＣＲリードを示す。（配列番号１１６５～１３２４）。１０％、１％、０．１％、０．０１％の各Ｍｏｌｔ－４段階希釈試料から獲得されたＴＣＲリードを表記する。リード数の多い順にランキングし、上位４０位までを示した。０．０１％試料についてはランキング３６５～から４０４を示した。各リードのＴＲＢＶ、ＴＲＢＪおよびＣＤＲ３アミノ酸配列、リード数を示す。Ｍｏｌｔ－４由来の機能的ＴＣＲリード（ＴＲＢＶ２０－１／ＴＲＢＪ２－１／ＣＳＡＲＥＳＴＳＤＰＫＮＥＱＦＦＧ）は太字および背景灰色で示し、もう一方の機能欠損が推測されるＴＣＲリード（ＴＲＢＶ１０－３／ＴＲＢＪ２－５／ＣＡＩＳＥＰＴＧＩＲＲＤＰＶＬＲ）は太字で示した。 図２８は、Ｍｏｌｔ－４細胞段階希釈試料におけるＴＣＲリード数と検出感度を示す。Ｍｏｌｔ－４細胞から２つのＴＣＲリードが検出された（▲：ＴＲＢＶ２０－１／ＴＲＢＪ２－１／ＣＳＡＲＥＳＴＳＤＰＫＮＥＱＦＦＧ、○：ＴＲＢＶ１０－３／ＴＲＢＪ２－５／ＣＡＩＳＥＰＴＧＩＲＲＤＰＶＬＲ）。１０％、１％、０．１％、０．０１％の各Ｍｏｌｔ－４段階希釈試料から獲得されたＴＣＲリード中に検出されたＭｏｌｔ－４由来のＴＣＲリードの割合を示す。それぞれＲｅａｄの検出限界（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ）は、０．１％（▲）と０．０１％（○）であった。 図２９は、ＴＣＲデータ解析の流れを示す模式図である。 図３０は、ＢＣＲデータ解析の流れを示す模式図である。 図３１はクラスごとのＣの頻度を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３２（ＡおよびＢ）は、クラス間のＶレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３２（ＡおよびＢ）は、クラス間のＶレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３３は、クラス間のＪレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３４（ＡおよびＢ）はサブクラス間のＶレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３４（ＡおよびＢ）はサブクラス間のＶレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３５はサブクラス間のＪレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３６（ＡおよびＢ）は検体間のＩｇＭ　Ｖレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３６（ＡおよびＢ）は検体間のＩｇＭ　Ｖレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３７は検体間のＩｇＭ　Ｊレパトアの比較を示す図である。縦軸は頻度（％）を示し、横軸は遺伝子名を示す。Ｎｏ－ｈｉｔはいずれにも該当しなかった頻度を示している。 図３８（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＶレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図３８（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＶレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図３８（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＶレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図３８（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＶレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図３９（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＢＶレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図３９（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＢＶレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図３９（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＢＶレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図３９（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＢＶレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図４０（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＪレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図４０（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＪレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図４０（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＪレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図４０（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＪレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図４１は、検体間のＴＲＢＪレパトア比較を示す。縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名を示す。「平均」は全検体の平均で、エラーバーは±標準偏差を示す。 図４２は、本発明のシステムのブロック図を示す。 図４３は、本発明の処理のためのフローチャートを示す。 図４４はＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖レパトア解析におけるユニークリード数の分布を示す。全シーケンスリードのユニークリード（他のリードと共通性のない塩基配列）について、コピー数を横軸に分布を調べた。ＴＣＲαにおいては、１リードしか検出されなかったリード（シングル）は全体の７３．３％（１２５０リード）、ＴＣＲβ鎖においては７０．５％（６５０２リード）であった。 図４５はＴＲＡＶおよびＴＲＡＪレパトアを示す。全リードにおける各ＴＲＡＶとＴＲＡＪの使用頻度を示した。横軸は、ＴＲＡＶ遺伝子(上グラフ)およびＴＲＡＪ遺伝子（下グラフ）を示す。縦軸は、全リードに占める割合（％Ｕｓａｇｅ）を示す。 図４６はＴＲＡレパトアの３Ｄプロットを示す。全リードにおける各ＴＲＡＶとＴＲＡＪの組み合わせの使用頻度を３次元プロットで示す。横軸はＴＲＡＪ遺伝子、奥行き軸はＴＲＡＶ遺伝子、縦軸は使用頻度（％Ｕｓａｇｅ）を示す。最も高い使用頻度を示したのはＴＲＡＶ１０とＴＲＡＪ１５の組み合わせである（１２．５３％）。 図４７はＴＲＢＶおよびＴＲＢＪレパトアを示す。全リードにおける各ＴＲＢＶとＴＲＢＪの使用頻度を示した。横軸は、ＴＲＢＶ遺伝子(上グラフ)およびＴＲＢＪ遺伝子（下グラフ）を示す。縦軸は、全リードに占める割合（％Ｕｓａｇｅ）を示す。 図４８はＴＲＢレパトアの３Ｄプロットを示す。全リードにおける各ＴＲＢＶとＴＲＢＪの組み合わせの使用頻度を３次元プロットで示す。横軸はＴＲＢＶ遺伝子、奥行き軸はＴＲＢＪ遺伝子、縦軸は使用頻度（％Ｕｓａｇｅ）を示す。最も高い使用頻度を示したのはＴＲＢＶ２９－１とＴＲＢＪ２－７の組み合わせである（２８．５７％）。 図４９はＴＣＲαβペアリードの推定方法の模式図である（解析システムの実施例３を参照）。 図５０は解析システムの実施例４のＭｉＳｅｑ　Ｄｕａｌ－ｉｎｄｅｘｅｄ　Ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇの模式図を示す。 図５１は、２０例の健常人におけるＴＲＡＶおよびＴＲＡＪの使用を示す。それぞれＴＲＡＶおよびＴＲＡＪを有するＴＣＲ配列数をカウントした。５４個のＴＲＡＶおよび６１個のＴＲＡＪの頻度パーセンテージを計算し、散布図として示した。各ドットは、各個体におけるＴＲＡＶまたはＴＲＡＪの頻度パーセンテージを示している。水平線は、２０の平均値を示す。（Ｐ）：偽遺伝子、（ＯＲＦ）：オープンリーディングフレーム。 図５２は、２０例の健常人におけるＴＲＢＶおよびＴＲＢＪの使用を示す。６５個のＴＲＢＶおよび１４個のＴＲＢＪの頻度パーセンテージを散布図として示した。各ドットは、各個体におけるＴＲＢＶまたはＴＲＢＪの頻度パーセンテージを示している。赤のバーは平均値を示す。（Ｐ）：偽遺伝子、（ＯＲＦ）：オープンリーディングフレーム。 図５３は、２０例の健常人からプールされたリードデータにおけるＴＲＡＶのＴＲＡＪでの遺伝子組換えの発生頻度を示す。ＴＲＡＶおよびＴＲＡＪのそれぞれの遺伝子組換えを有するＴＣＲシーケンスリード数をカウントした。組換えの発生傾向を、各組換え数のヒートマップ表示によって可視化する。各ピクセルの色は各組換え数を示す。ＴＲＡＶに関しては、８個の偽遺伝子（ＴＲＡＶ８－５、ＴＲＡＶ１１、ＴＲＡＶ１５、ＴＲＡＶ２８、ＴＲＡＶ３１、ＴＲＡＶ３２、ＴＲＡＶ３３およびＴＲＡＶ３７）、１個のＯＲＦ（ＴＲＡＶ８－７、十分に発現されなかった遺伝子（ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ１８およびＴＲＡＶ３６）を除外した。ＴＲＡＪに関しては、３個の偽遺伝子（ＴＲＡＪ５１、ＴＲＡＪ５５、およびＴＲＡＪ６０）、６個のＯＲＦ（ＴＲＡＪ１、ＴＲＡＪ２、ＴＲＡＪ１９、ＴＲＡＪ２５、ＴＲＡＪ５９、およびＴＲＡＪ６１）、および十分に発現されなかった遺伝子（ＴＲＡＪ１４およびＴＲＡＪ４６）を除外した。発現されたことが見出された２個のＯＲＦ（ＴＲＡＪ３５およびＴＲＡＪ４８）を含めた。２，０５０個の組換え事象（４１個ＴＲＡＶ×５０個のＴＲＡＪ）のヒートマップ表示を示す。 図５４は、ＴＣＲαレパトアの３Ｄイメージを示す。ＴＲＡＶのＴＲＡＪでの所定の遺伝子組換えを有するＴＣＲシーケンスリード数をカウントした。２０例の健常人における３，２９４個（５４個のＴＲＡＶ×６１個のＴＲＡＪ）の平均頻度パーセンテージを、３Ｄ棒グラフとして示す。Ｘ軸およびＹ軸は、それぞれＴＲＡＶおよびＴＲＡＪを示す。ＴＲＡＶ１－２のＴＲＡＪ３３での組換え（ＡＶ１－２／ＡＪ３３）は、最も発現した（０．９９±０．８５）。（Ｐ）：偽遺伝子、（ＯＲＦ）：オープンリーディングフレーム。 図５５は、ＴＣＲβレパトアの３Ｄイメージを示す。ＴＲＢＶのＴＲＢＪでの所定の遺伝子組換えを有するＴＣＲシーケンスリード数をカウントした。２０例の健常人における９１０個（６５個のＴＲＢＶ×１４個のＴＲＢＪ）の平均頻度パーセンテージを、３Ｄ棒グラフとして示す。Ｘ軸およびＹ軸は、それぞれＴＲＢＶおよびＴＲＢＪを示す。（Ｐ）：偽遺伝子、（ＯＲＦ）：オープンリーディングフレーム。 図５６は、ＴＣＲαおよびＴＣＲβのデジタルＣＤＲ３鎖長分布を示す。ＣＤＲ３の長さを、２０例の個体のプールされたデータから得られた１７２，１０９個のＴＣＲαおよび９４，９２８個のＴＣＲβシーケンスリードにおいて決定した。１０４位の保存されたシステイン（Ｃｙｓ１０４）（ＩＭＧＴの命名）から１１８位の保存されたフェニルアラニン（Ｐｈｅ１１８）までのヌクレオチド配列の長さを、ＲＧソフトウェアを使用して自動的に計算した。ＴＣＲα（上）およびＴＣＲβ（下）におけるＣＤＲ３の鎖長分布を、ヒストグラムとして示す。 図５７は、健常人におけるＴＣＲαおよびＴＣＲβレパトアの多様性を示す。ユニークシーケンスリード（ＵＳＲ）のコピー数（リード数）を計算した。各個体におけるユニークシーケンスリード当たりの平均コピー数を白丸として示す（左）。シンプソン指数の逆数（中央）およびシャノン・ウェーバー指数（右）を、解析システムの実施例５の材料および方法欄に記載される式に従ってＲプログラムを用いて計算した。各白丸は個体の指数を示す。ＴＣＲαとＴＣＲβとの間の平均コピー数、シンプソン指数の逆数およびシャノン・ウェーバー指数に有意な違いはなかった。 図５８は、健常人におけるＴＣＲαおよびＴＣＲβレパトアの類似性を示す。２０例すべての個体のペア間で共有されるＴＣＲシーケンスリードの発生頻度を計算した（表４－６および表４－７）。共有されたリードの平均頻度パーセンテージを、ＴＣＲαとＴＣＲβとの間で比較した（左、ｎ＝３８０）。同様の指数であるＭｏｒｉｓｉｔａ－Ｈｏｒｎ指数を、解析システムの実施例５の材料および方法欄に記載される式に従ってＲプログラムを用いて計算した。共有されたリードの頻度およびＴＣＲαとＴＣＲβとの間の類似性指数に有意な違いはなかった（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）。 図５９は、パブリックＴＣＲは、プライベートＴＣＲより短い鎖長のＣＤＲ３を有していたことを示す。ＣＤＲ３の長さを、パブリックＴＣＲの７，２３７個のＵＳＲ（灰色）およびプライベートＴＣＲの８３，９９７個のＵＳＲ（黒）で計算した。各ＣＤＲ３の長さにおけるＵＳＲの頻度パーセンテージを棒グラフとしてプロットした。パブリックおよびプライベートＴＣＲにおけるＣＤＲ３の長さの中央値は、それぞれ３９および４２である。 図６０は、健常人の間のＴＲＡＶ、ＴＲＡＪ、ＴＲＢＶおよびＴＲＢＪの遺伝子使用の相関を示す。個体のすべてのペア間のＴＲＡＶ（左上）、ＴＲＡＪ（右上）、ＴＲＢＶ（左下）およびＴＲＢＪ（右下）の頻度パーセンテージをプロットしている。対角線（ｙ＝ｘ）より下にずれたドットは、よりよい相関を示す。 図６１は、ＴＲＡＶ、ＴＲＡＪ、ＴＲＢＶおよびＴＲＢＪにおける一致相関係数を示す。健常人由来の２つの試料間の相関係数を、スピアマンの相関試験により計算した。各ドットは、個体ペア間の相関係数値を示す。平均相関係数を水平線で示す（ｎ＝１９０）。 図６２は、がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法の概要を示す。左上の患者からリンパ球を採取し、ＴＣＲまたはＢＣＲについてのレパトア解析を実施し、ＨＬＡ結合ペプチドを予測する。その後、予測されたＨＬＡ結合ペプチドを用いて、オーダーメイドペプチド感作ＣＴＬ療法またはオーダーメイドペプチド感作ＤＣワクチン療法を行う。特に、腫瘍細胞を標的とした抗体療法などを行なう場合、腫瘍細胞に標的抗原が発現していないか、または標的抗原が正常細胞にも発現することで問題となる。それと比し、腫瘍細胞に特異的な配列を選択して利用するため、より特異性の高い、副作用の少ない治療が期待される。 図６３は、改良型ＣＴＬ法の概要を示す。既存のＬＡＫ療法（右上）またはＣＴＬ療法（右下）の場合、患者末梢血から分離されたリンパ球が、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ－２により活性化される。これに対し、改良型ＣＴＬ療法（左）は、患者末梢血からＣＤ８＋Ｔ細胞および樹状細胞を分離し、抗原ペプチドを用いて共培養刺激を行う。既存の抗ＣＤ３抗体やＩＬ－２による広範なＴ細胞の活性化とは異なり、抗原ペプチドを利用したＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原特異性の付与により、より特異性が高く副作用の少ない治療が期待できる。また、患者の腫瘍細胞から得られた情報をもとに作成した個別化ペプチドを利用するため、高い治療効果が期待できるのが特徴である。 図６４は、ＤＣワクチン療法の概要を示す。左の患者から樹状細胞を分離し、抗原ペプチドと混合培養する。ＤＣワクチン療法では、患者由来の腫瘍細胞から得られた配列情報をもとに個別化ペプチドを作出するため、正常細胞には作用せず、腫瘍細胞により特異的に作用して、高い治療効果が見込める。抗原としてペプチドを用いるため、タンパク質とは異なり容易に化学合成することができる利点がある。 図６５は、患者自己免疫細胞療法の概要を示す。改良型ＣＴＬ療法（左）は、患者末梢血からＣＤ８＋Ｔ細胞および樹状細胞を分離し、抗原ペプチドを用いて共培養刺激を行う。細胞障害性Ｔ細胞および抗原提示細胞の両方を患者に移入する。そのため、特異性を付与したＣＴＬによる急性効果と抗原提示細胞として利用した樹状細胞による持続的効果の相乗効果が期待できるのが特徴である。 図６６は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離の概要を示す。示されるように、抗原ペプチドと患者由来の不活性化癌と患者由来のＴ細胞とを共培養することにより、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を得る。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。 図６７は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子の調製の概要を示す。示されるように、得られたＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子を、ＴＣＲ発現ウイルスベクター（中央）に導入し、患者由来Ｔリンパ球に感染させることにより形質転換する。 図６８は、細胞加工療法の概要を示す。示されるように、右上の患者から分離されたＴリンパ球から、ＴＣＲレパトア解析によって得られた腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を患者由来Ｔリンパ球に導入し、腫瘍特異的Ｔリンパ球を患者に移入する。最適ＴＣＲ候補を患者リンパ球に人為的に遺伝子導入し、実際の患者がん組織に最も高い反応性を示したものを最適ＴＣＲとして選択することができる。 図６９は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激試験を行い有効性および／または安全性の評価を行う方法の概要を示す。腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球の有効性および／または安全性の評価をｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激試験により行う（下向きの矢印）。これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの評価を基に治療に適切なＴリンパ球を選定する（上向きの矢印）。有効性の評価は、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球と患者由来の癌細胞とを共培養し、反応性を試験することにより行う。安全性を評価する場合は、癌細胞の代わりに正常細胞を使用して同様の試験を行う。
　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　本明細書において「データベース」とは、遺伝子に関する任意のデータベースをいい、特に本発明では、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体レパトアを含むデータベースをいう。このようなデータベースとしては、ＩＭＧＴ（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，　ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベース、日本ＤＮＡデータバンク　（ＤＤＢＪ、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ，ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）データベース、ＧｅｎＢａｎｋ（米国生物工学情報センター、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）データベース、ＥＮＡ（ＥＭＢＬ（欧州分子生物学研究所）、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ）データベース等をあげることができるがこれに限定されない。
　本明細書において「遺伝子配列解析」とは、遺伝子を構成する核酸配列および／またはアミノ酸配列を解析することをいい、塩基または残基の決定、相同性の決定、ドメインの決定、潜在的機能等を決定する等遺伝子に関連する任意の解析が含まれる。
　本明細書において「Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）」とは、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞抗原レセプター、Ｔ細胞抗原受容体ともいい、免疫系をつかさどるＴ細胞の細胞膜に発現する受容体（レセプター）をいい、抗原を認識する。α鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖が存在し、αβまたはγδの二量体を構成する。前者の組み合わせからなるＴＣＲをαβＴＣＲ、後者の組み合わせからなるＴＣＲをγδＴＣＲと呼び、それぞれのＴＣＲを持つＴ細胞はαβＴ細胞、γδＴ細胞と呼ばれる。構造的にＢ細胞の産生する抗体のＦａｂフラグメントと非常に類似しており、ＭＨＣ分子に結合した抗原分子を認識する。成熟Ｔ細胞の持つＴＣＲ遺伝子は遺伝子再編成を経ているため、一個体は多様性に富んだＴＣＲを持ち、様々な抗原を認識することができる。ＴＣＲはさらに細胞膜に存在する不可変なＣＤ３分子と結合し複合体を形成する。ＣＤ３は細胞内領域にＩＴＡＭ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｏｔｉｆ）と呼ばれるアミノ酸配列を持ち、このモチーフが細胞内のシグナル伝達に関与するとされている。それぞれのＴＣＲ鎖は可変部（Ｖ）と定常部（Ｃ）から構成され、定常部は細胞膜を貫通して短い細胞質部分を持つ。可変部は細胞外に存在して、抗原－ＭＨＣ複合体と結合する。可変部には超可変部、あるいは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域が３つ存在し、この領域が抗原－ＭＨＣ複合体と結合する。３つのＣＤＲはそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれるが、ＴＣＲの場合、この内ＣＤＲ１とＣＤＲ２はＭＨＣと結合し、ＣＤＲ３が抗原と結合すると考えられている。ＴＣＲの遺伝子再構成は免疫グロブリンとして知られるＢ細胞受容体の過程と同様である。αβＴＣＲの遺伝子再編成ではまず、β鎖のＶＤＪ再編成が行われ、続いてα鎖のＶＪ再編成が行われる。α鎖の再編成が行われる際にδ鎖の遺伝子は染色体上から欠失するため、αβＴＣＲを持つＴ細胞がγδＴＣＲを同時に持つことはない。逆にγδＴＣＲを持つＴ細胞ではこのＴＣＲを介したシグナルがβ鎖の発現を抑制するため、γδＴＣＲを持つＴ細胞がαβＴＣＲを同時に持つこともない。
　本明細書において「Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）」とは、Ｂ細胞受容体、Ｂ細胞抗原レセプター、Ｂ細胞抗原受容体とも呼ばれ、膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）分子と会合したＩｇα／Ｉｇβ（ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ）ヘテロ二量体（α／β）から構成されるものをいう。ｍＩｇサブユニットは抗原に結合し、受容体の凝集を起こすが、一方、α／βサブユニットは細胞内に向かってシグナルを伝達する。ＢＣＲが凝集すると、チロシンキナーゼのＳｙｋ及びＢｔｋと同様に、ＳｒｃファミリーキナーゼのＬｙｎ、Ｂｌｋ、及びＦｙｎを速やかに活性化するといわれる。ＢＣＲシグナル伝達の複雑さによって多くの異なる結果が生じるが、その中には、生存、耐性（アネルギー；抗原に対する過敏反応の欠如）またはアポトーシス、細胞分裂、抗体産生細胞または記憶Ｂ細胞への分化などが含まれる。ＴＣＲの可変領域の配列が異なるＴ細胞が何億種類も生成し、またＢＣＲ（または抗体）の可変領域の配列が異なるＢ細胞が何億種類も生成する。ＴＣＲとＢＣＲの個々の配列はゲノム配列の再構成や変異導入により異なるので、Ｔ細胞やＢ細胞の抗原特異性については、ＴＣＲ・ＢＣＲのゲノム配列またはｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の配列を決定することにより手掛かりを得ることができる。
　本明細書において「Ｖ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域の可変部（Ｖ）領域をいう。
　本明細書において「Ｄ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域のＤ領域をいう。
　本明細書において「Ｊ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域のＪ領域領域をいう。
　本明細書において「Ｃ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の定常部（Ｃ）領域をいう。
　本明細書において「可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」とは、ＴＣＲまたはＢＣＲで遺伝子再構成により任意に作り出されたＶ（Ｄ）Ｊ領域の集合をいう。ＴＣＲレパトア、ＢＣＲレパトア等と熟語で使用されるが、これらは例えば、Ｔ細胞レパトア、Ｂ細胞レパトアなどと称されることもある。例えば、「Ｔ細胞レパトア」とは、抗原認識において重要な役割を果たすＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の発現によって特徴づけられるリンパ球の集合をいう。Ｔ細胞レパトアの変化は、生理的状態および疾患状態における免疫状態の有意な指標をもたらすため、Ｔ細胞レパトア解析は、疾患の発症に関与する抗原特異性Ｔ細胞の同定およびＴリンパ球の異常の診断のために行われてきた。ＴＣＲ可変領域に特異的な抗体のより大きなパネルを用いた蛍光活性化セルソーター分析による可変領域の使用の比較（van den Beemd Ret al. (2000) Cytometry 40: 336-345; MacIsaac C et al. (2003) J Immunol Methods283: 9-15; Tembhare P et al. (2011) Am J Clin Pathol 135: 890-900; Langerak AWet al. (2001) Blood 98: 165-173）、複数のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Rebai N et al.(1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91: 1529-1533）、またはＰＣＲに基づく酵素結合免疫吸着検定法（Matsutani T et al. (1997) Hum Immunol 56:57-69; Matsutani T et al. (2000) Br J Haematol 109: 759-769）は、Ｔ細胞レパトアの変化を検出するために広く使用されてきた。ＣＤＲ３スペクトラタイピングとして公知の鎖長分布の分析は、Ｖ－（Ｄ）－Ｊ領域における非鋳型ヌクレオチドの付加に基づいており、Ｔ細胞のクローナリティおよび多様性を評価するために使用されてきた（Matsutani T etal. (2007) Mol Immunol 44: 2378-2387; Matsutani T et al. (2011) Mol Immunol 48:623-629）。Ｔ細胞の抗原特異性をさらに同定するために、ＴＣＲクローンタイプのＰＣＲクローニングおよびその後の抗原認識領域、ＣＤＲ３の配列決定が必要であった。これらの従来のアプローチが、一般的に使用されるが、ＴＣＲレパトアを研究するのに時間がかかり労力を有する方法である。
　本明細書において「定量解析」とは、定量的な解析をいい、本発明では、レパトア解析において、各クローンのもともと存在していた量を反映した形式で解析することをいう。
　本明細書において「試料」は、被験体に由来する成分（血液等の体液等）を挙げることができるが、それらに限定されない。
　本明細書において「相補的ＤＮＡ」とは、対象となる核酸分子、例えば、標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料等に含まれるＲＮＡに対して相補鎖を形成するＤＮＡをいう。
　本明細書において「二本鎖相補的ＤＮＡ」とは、互いに相補的なＤＮＡであって、二本鎖を形成したものを言う。本発明では、例えば、標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料等に含まれるＲＮＡに対して相補鎖を形成する相補的ＤＮＡを鋳型として生成することができる。
　本明細書において「共通アダプタープライマー配列」とは、本発明の第１のＰＣＲ増幅反応および第２のＰＣＲ増幅反応において、プライマーとして使用されるアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡにおいて、いずれの配列にも共通して付加される部分の配列を指す。
　本明細書において「アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡ」とは、本発明の１回目のＰＣＲにおいて、プライマーとして使用されるＤＮＡであって、試料中の種々の二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列が付加されたものをいう。第１のプライマー増幅反応において、鋳型として用いられる。
　本明細書において「共通アダプタープライマー」とは、本発明の第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ増幅反応において、プライマーとして使用されるＤＮＡであって、単一の共通の配列が各反応に用いられるものをいう。
　本明細書において「第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、本発明の第１のＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーであって、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列を含むプライマーをいう。
　図１８に、上段にＴＲＡＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＴＲＡＣのエクソン領域配列である。エクソンＥＸ１、ＥＸ２、ＥＸ３からなり、全長にわたりプライマー設定が可能である。）。下段にＴＲＢＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＴＲＢＣのエクソン領域配列である。エクソンＥＸ１、ＥＸ２、ＥＸ３およびＥＸ４からなり、全長にわたりプライマー設定が可能である。）。そして、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になる。理論的には、プライマーの長さだけ下流であればよいことが理解される。
　図１９には、上段にＴＲＧＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＴＲＧＣのエクソン領域配列である。エクソンＥＸ１、ＥＸ２およびＥＸ３からなり、全長にわたりプライマー設定が可能である。）。下段にＴＲＤＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＴＲＤＣのエクソン領域配列である。エクソンＥＸ１、ＥＸ２およびＥＸ３からなり、全長にわたりプライマー設定が可能である。）そして、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になる。理論的には、プライマーの長さだけ下流であればよいことが理解される。
　図２０には、ＩＧＨＭの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＭのエクソン領域配列である。エクソンＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４からなる。全長にわたりプライマー設定が可能である。）。そして、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になる。理論的には、プライマーの長さだけ下流であればよいことが理解される。
　図２１には、ＩＧＨＡの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＡのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１およびＭ２からなる。いずれも全長にわたりプライマー設定が可能である。）。そして、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になる。理論的には、プライマーの長さだけ下流であればよいことが理解される。
　図２２には、ＩＧＨＧの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＧのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、Ｈ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、Ｈ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１およびＭ２からなる。いずれも全長にわたりプライマー設定が可能である。）。そして、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になる。理論的には、プライマーの長さだけ下流であればよいことが理解される。
　図２３には、ＩＧＨＤの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＤのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、Ｈ１、Ｈ２、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、Ｈ１、Ｈ２、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｍ１およびＭ２からなる。いずれも全長にわたりプライマー設定が可能である。）。そして、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になる。理論的には、プライマーの長さだけ下流であればよいことが理解される。
　図２４には、ＩＧＨＥの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は人為的にスプライスされた機能的なＩＧＨＥのエクソン領域配列である。分泌型はエクソンＣＨ１、エクソンＣＨ２、エクソンＣＨ３およびＣＨ－Ｓ、膜結合型はＣＨ１、エクソンＣＨ２、エクソンＣＨ３、Ｍ１およびＭ２からなる。いずれも全長にわたりプライマー設定が可能である。）。そして、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になる。理論的には、プライマーの長さだけ下流であればよいことが理解される。
　図２５には、上段にＩＧＫＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は機能的なＩＧＫＣのＣＬ配列である。全長にわたりプライマー設定が可能である。）。下段にＩＧＬＣの可能なプライマー設定領域の例を示す（標的配列は機能的なＩＧＬＣのＣＬ配列である。全長にわたりプライマー設定が可能である。）。そして、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはもっとも相補的ＤＮＡの５’末端側に設定することができ、いったん第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、その下流に設定することができる。さらに、いったん第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーが設定されると、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを設定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になる。理論的には、プライマーの長さだけ下流であればよいことが理解される。
　具体的には、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造を有する：ＢＣＲについて、ＣＭ１（配列番号５）、ＣＡ１（配列番号８）、ＣＧ１（配列番号１１）、ＣＤ１（配列番号１４）、ＣＥ１（配列番号１７）、ＴＣＲについてＣＡ１（配列番号３５）、ＣＢ１（配列番号３７）等を挙げることができるが、それらに限定されない。このようなプライマー配列は具体的には以下のような範囲で設定することができるがこれらに限定されず、第１、第２、第３の範囲の設定は全範囲でできるが、相互に決定することができる。
　ＴＣＲのα配列：配列番号１３７６（図１８）の塩基番号２１３～塩基番号２３５
　ＴＣＲのβ配列：配列番号１３７７（図１８）の塩基番号２７８～塩基番号３００
　ＴＣＲのγ配列：配列番号１３７８（図１９）の塩基番号１８４～塩基番号２０１
　ＴＣＲのδ配列：配列番号１３７９（図１９）の塩基番号２３１～塩基番号２４９
　ＢＣＲのＩｇＭ重鎖配列：配列番号１３８０（図２０）の塩基番号７７～塩基番号９５
　ＢＣＲのＩｇＡ重鎖配列：配列番号１３８１（図２１）の塩基番号１８９～塩基番号２０８
　ＢＣＲのＩｇＧ重鎖配列：配列番号１３８２（図２２）の塩基番号２６２～塩基番号２８２
　ＢＣＲのＩｇＤ重鎖配列：配列番号１３８３（図２３）の塩基番号１６４～塩基番号１８３
　ＢＣＲのＩｇＥ重鎖配列：配列番号１３８４（図２４）の塩基番号１８２～塩基番号１９９
　ＢＣＲのＩｇκ鎖定常領域配列：配列番号１３８５（図２５）の塩基番号２３０～塩基番号２４８
　ＢＣＲのＩｇλ鎖配列：配列番号１３８６（図２５）の塩基番号２７３～塩基番号２９１。
　本明細書において「特異的」とは、対象となる配列に結合するが、少なくとも対象となるＴＣＲまたはＢＣＲのプールにおいて、好ましくは存在するＴＣＲまたはＢＣＲの配列すべてにおいて、他の配列とは結合性が低い、好ましくは結合しないことをいう。特異的な配列は好ましくは対象となる配列に対して完全に相補的であることが有利であるが、必ずしも限定されない。
　本明細書において「（目的とするＣ領域に）十分に特異的である」とは、遺伝子増幅反応を行うのに十分な特異性を有することをいう。好ましくは、対象となるＣ領域と同一の配列が有利であるが、必ずしもこれに限定されない。
　本明細書において「第１のＰＣＲ増幅反応」とは、本発明の試料を調製するための方法において第１段階で行われるＰＣＲ増幅反応である。
　本明細書において「他の遺伝子配列に相同性のない」とは、目的とする配列（例えば、ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域）以外の配列と遺伝子増幅反応を起こさない程度に相同性が低いことを言う。
　本明細書において「下流に（サブタイプ間に）不一致塩基を含む」とは、プライマーとして設定する場合の配列の下流に、サブタイプ間で不一致塩基が含まれることをいう。このような配列を設定することにより、増幅後の増幅産物がサブタイプごとに異なる配列を有することになり、配列を決定することによってどのサブタイプ化を識別することができる。
　本明細書において「第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、本発明の第２のＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーであって、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列を含むプライマーをいう。第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される。このような配列としては、ＢＣＲについて、ＣＭ２（配列番号６）、ＣＡ２（配列番号９）、ＣＧ２（配列番号１２）、ＣＤ２（配列番号１５）、ＣＥ２（配列番号１８）、ＴＣＲについてＣＡ２（配列番号３６）、ＣＢ２（配列番号３８）を挙げることができるがこれらに限定されない。このようなプライマー配列は具体的には以下のような範囲で設定することができるがこれらに限定されず、第１、第２、第３の範囲の設定は全範囲でできるが、相互に決定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になり、理論的は、プライマーの長さだけ下流であればよい。
　ＴＣＲのα配列：配列番号１３７６（図１８）の塩基番号１４６～塩基番号１６８　ＴＣＲのβ配列：配列番号１３７７（図１８）の塩基番号２０５～塩基番号２２７　ＴＣＲのγ配列：配列番号１３７８（図１９）の塩基番号１４１～塩基番号１６０　ＴＣＲのδ配列：配列番号１３７９（図１９）の塩基番号１３５～塩基番号１５５　ＢＣＲのＩｇＭ重鎖配列：配列番号１３８０（図２０）の塩基番号４３～塩基番号６２　ＢＣＲのＩｇＡ重鎖配列：配列番号１３８１（図２１）の塩基番号１４１～塩基番号１６１　ＢＣＲのＩｇＧ重鎖配列：配列番号１３８２（図２２）の塩基番号１６３～塩基番号１８３　ＢＣＲのＩｇＤ重鎖配列：配列番号１３８３（図２３）の塩基番号１２５～塩基番号１４２　ＢＣＲのＩｇＥ重鎖配列：配列番号１３８４（図２４）の塩基番号１５５～塩基番号１７３　ＢＣＲのＩｇκ鎖定常領域配列：配列番号１３８５（図２５）の塩基番号１０３～塩基番号１２０　ＢＣＲのＩｇλ鎖配列：配列番号１３８６（図２５）の塩基番号８５～塩基番号１００。
　本明細書において「第２のＰＣＲ増幅反応」とは、本発明の解析のための試料生産において、第１のＰＣＲ反応の後その産物を鋳型としてなされるＰＣＲ増幅反応であって、ネスティド（Ｎｅｓｔｅｄ）形式でなされる反応をいう。本発明では、共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて行う。ここで、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列においてＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される。
　本明細書において「第３のＰＣＲ増幅反応」とは、本発明の解析のための試料生産において、第２のＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応の後その産物を鋳型としてなされるＰＣＲ増幅反応であって、その産物は、本発明の解析のための試料生産に使用されるものとなる。第３のＰＣＲ増幅反応は、第２のＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応の後その産物を鋳型として、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定配列（ＭＩＤ　Ｔａｇ配列）を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いてなされる。アダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーにおいては、キー配列と呼ばれる核酸配列位置の確認のための配列を含んでいてもよい。具体的には、付加共通アダプタープライマーとしては、たとえば、Ａｄａｐｔｏｒ　Ｂ（配列番号１３７５）－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣを用いることができ、アダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとしては、例えば、Ａｄａｐｔｏｒ　Ａ（配列番号３９）－ｋｅｙ（ＴＣＡＧ）－ＭＩＤ１－（配列番号４０）ＡＡＡＧＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣ（配列番号１３８７）（プライマー全体は配列番号７）、Ａｄａｐｔｏｒ　Ａ（配列番号３９）－ｋｅｙ（ＴＣＡＧ）－ＭＩＤ２（配列番号４１）－ＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣ（配列番号１３８８）（プライマー全体は配列番号１０）、Ａｄａｐｔｏｒ　Ａ（配列番号３９）－ｋｅｙ（ＴＣＡＧ）－ＭＩＤ３（配列番号４２）－ＴＧＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣ（配列番号１３８９）（プライマー全体は配列番号１３）、Ａｄａｐｔｏｒ　Ａ（配列番号３９）－ｋｅｙ（ＴＣＡＧ）－ＭＩＤ４（配列番号４３）－ＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＡＡＧＣＡＴＧＣＣ（配列番号１３９０）（全長の配列が配列番号１６）、Ａｄａｐｔｏｒ　Ａ（配列番号３９）－ｋｅｙ（ＴＣＡＧ）－ＭＩＤ５（配列番号４４）－ＣＡＴＴＧＧＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号１３９１）（プライマー全体は配列番号１９）などが使用される。
　本明細書において「第１の追加アダプター核酸配列」とは、本発明の第３のＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーに付加される配列であって、共通アダプタープライマーの核酸配列に付加されて使用される配列である。第１の追加アダプター核酸配列と第２の追加アダプター核酸配列とは異なっていてもよく同じであってもよい。この配列の特性についていうと、この核酸配列としては、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応（たとえば、Chee-Seng,　Ku;　En　Yun,　Loy;　Yudi,　Pawitan;　and　Kee-Seng,　Chia.　Next　Generation　Sequencing　Technologies　and　Their　Applications.　In:　Encyclopedia　of　Life　Sciences　(ELS).John　Wiley　&　Sons,　Ltd:　Chichester.　April　2010；　Metzker　ML.　Sequencing　technologies　-　the　next　generation.　Nat　Rev　Genet.　2010Jan;11(1):31-46を参照。）に適切な配列であり、そのような特性を有する限りどのような配列を用いてもよい。具体的には、ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣ(配列番号１３７５）、が使用されるがそれに限定されない。
　本明細書において「第２の追加アダプター核酸配列」とは、本発明の第３のＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーに付加される配列であって、必要に応じて分子同定配列（たとえば、（ＭＩＤ　Ｔａｇ配列））および／またはキー配列とともに用いられ、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加されることによって、アダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを構成する配列である。第２の追加アダプター核酸配列と第２の追加アダプター核酸配列とは異なっていてもよく同じであってもよい。この配列の特性についていうと、この核酸配列としては、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、そのような特性を有する限りどのような配列を用いてもよい。具体的には、ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣ（配列番号３９）が使用されるがそれに限定されない。
　本明細書において使用される「キー配列」とは、本発明の第３のＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーに付加される配列であって、必要に応じて分子同定配列（たとえば、（ＭＩＤ　Ｔａｇ配列））とともに用いられ、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加されることによって、アダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを構成する配列である。そのようなキー配列としては、核酸配列位置の確認が確認できる限りどのような配列でもよく、４塩基のキー配列（ＴＣＡＧ）のものが用いられるがそれらに限定されない。
　本明細書において「分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列とは、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である。したがって、目的とする配列とは異なることが好ましい。また、増幅に影響しない配列であることが好ましい。そのような配列としては、たとえば、配列番号１３２５～１３７４のものが挙げられるがこれらに限定されない。同定配列（タグ配列）についての判定基準およびその代表例については以下のとおりである。すなわち、タグ配列の判定基準について説明すると、タグ配列は、複数のサンプルを混合して同時にシーケンスする際に、各サンプルを識別するために付加する塩基配列である。一つのサンプル由来のリードには、一つのタグ配列が対応付けられ、獲得されたリード配列がどのサンプルに由来するかを識別することができる。Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの４種の塩基の任意配列であり、理論的には１０塩基で約１００万、２０塩基で約１兆種類の配列を作り出すことができる。塩基配列長は、好ましくは、２塩基以上４０塩基以下であり、より好ましくは、６塩基以上１０塩基以下である。同時に、連続する配列（ＡＡ，ＣＣ，ＧＧ，ＴＴ）を含まない配列を用いることが望ましい。本明細書で使用されうる代表的なタグは以下のとおりである：ＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴ（配列番号１３２５）、ＡＣＧＣＴＣＧＡＣＡ（配列番号１３２６）、ＡＧＡＣＧＣＡＣＴＣ（配列番号１３２７）、ＡＧＣＡＣＴＧＴＡＧ（配列番号１３２８）、ＡＴＣＡＧＡＣＡＣＧ（配列番号１３２９）、ＡＴＡＴＣＧＣＧＡＧ（配列番号１３３０）、ＣＧＴＧＴＣＴＣＴＡ（配列番号１３３１）、ＣＴＣＧＣＧＴＧＴＣ（配列番号１３３２）、ＴＡＧＴＡＴＣＡＧＣ（配列番号１３３３）、ＴＣＴＣＴＡＴＧＣＧ（配列番号１３３４）、ＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴ（配列番号１３３５）、ＴＡＣＴＧＡＧＣＴＡ（配列番号１３３６）、ＣＡＴＡＧＴＡＧＴＧ（配列番号１３３７）、ＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣ（配列番号１３３８）、ＡＴＡＣＧＡＣＧＴＡ（配列番号１３３９）、ＴＣＡＣＧＴＡＣＴＡ（配列番号１３４０）、ＣＧＴＣＴＡＧＴＡＣ（配列番号１３４１）、ＴＣＴＡＣＧＴＡＧＣ（配列番号１３４２）、ＴＧＴＡＣＴＡＣＴＣ（配列番号１３４３）、ＡＣＧＡＣＴＡＣＡＧ（配列番号１３４４）、ＣＧＴＡＧＡＣＴＡＧ（配列番号１３４５）、ＴＡＣＧＡＧＴＡＴＧ（配列番号１３４６）、ＴＡＣＴＣＴＣＧＴＧ（配列番号１３４７）、ＴＡＧＡＧＡＣＧＡＧ（配列番号１３４８）、ＴＣＧＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号１３４９）、ＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴ（配列番号１３５０）、ＡＣＡＣＧＡＣＧＡＣＴ（配列番号１３５１）、ＡＣＡＣＧＴＡＧＴＡＴ（配列番号１３５２）、ＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＴ（配列番号１３５３）、ＡＣＧＡＣＡＣＧＴＡＴ（配列番号１３５４）、ＡＣＧＡＧＴＡＧＡＣＴ（配列番号１３５５）、ＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＴ（配列番号１３５６）、ＡＣＧＴＡＣＡＣＡＣＴ（配列番号１３５７）、ＡＣＧＴＡＣＴＧＴＧＴ（配列番号１３５８）、ＡＣＧＴＡＧＡＴＣＧＴ（配列番号１３５９）、ＡＣＴＡＣＧＴＣＴＣＴ（配列番号１３６０）、ＡＣＴＡＴＡＣＧＡＧＴ（配列番号１３６１）、ＡＣＴＣＧＣＧＴＣＧＴ（配列番号１３６２）、ＡＧＴＣＧＴＧＧＴＧＴ（配列番号１３６３）、ＡＴＡＣＴＡＧＧＴＧＴ（配列番号１３６４）、ＡＣＧＡＧＴＧＧＴＧＴ（配列番号１３６５）、ＡＴＡＣＧＴＧＧＣＧＴ（配列番号１３６６）、ＡＧＴＣＴＡＣＧＣＧＴ（配列番号１３６７）、ＡＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴ（配列番号１３６８）、ＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴ（配列番号１３６９）、ＡＣＡＣＡＧＴＧＣＧＴ（配列番号１３７０）、ＡＣＧＡＴＣＴＧＣＧＴ（配列番号１３７１）、ＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴ（配列番号１３７２）、ＡＣＴＣＧＴＡＧＡＧＴ（配列番号１３７３）、ＡＣＧＡＣＧＧＧＡＧＴ（配列番号１３７４）が、これらに限定されない。
　本明細書において「第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列」とは、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列であって、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列および第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列よりも下流に存在する配列である。第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーを構成するために使用される配列である。具体的には、ＢＣＲについて、ＣＭ３－ＧＳ中の特異的部分の配列（配列番号１３８７）、ＣＡ３－ＧＳ中の特異的部分の配列（配列番号１３８８）、ＣＧ３－ＧＳ中の特異的部分の配列（配列番号１３８９）、ＣＤ３－ＧＳ中の特異的部分の配列（配列番号１３９０）、ＣＥ３－ＧＳ中の特異的部分の配列（配列番号１３９１）、ＴＣＲについて表６にある、ＨｕＶａＦやＨｕＶｂＦ内の特異的配列（配列番号４０～６０）等を挙げるこことができる（配列番号１３７６（図１８）の塩基番号５１～塩基番号７３；配列番号１３７７（図１８）の塩基番号６９～塩基番号９１に該当する。）。より特定するとこのようなプライマー配列は具体的には以下のような範囲で設定することができるがこれらに限定されず、第１、第２、第３の範囲の設定は全範囲でできるが、相互に決定することができる。すなわち、第１の設定をすると第２はそれより下流になり、第３はさらに下流になり、理論的は、プライマーの長さだけ下流であればよい。
　ＴＣＲのα配列：配列番号１３７６（図１８）の塩基番号５１～塩基番号７３
　ＴＣＲのβ配列：配列番号１３７７（図１８）の塩基番号６９～塩基番号９１
　ＴＣＲのγ配列：配列番号１３７８（図１９）の塩基番号３４～塩基番号５３
　ＴＣＲのδ配列：配列番号１３７９（図１９）の塩基番号６１～塩基番号７８
　ＢＣＲのＩｇＭ重鎖配列：配列番号１３８０（図２０）の塩基番号７～塩基番号２５
　ＢＣＲのＩｇＡ重鎖配列：配列番号１３８１（図２１）の塩基番号１１５～塩基番号１３４
　ＢＣＲのＩｇＧ重鎖配列：配列番号１３８２（図２２）の塩基番号１０９～塩基番号１２９
　ＢＣＲのＩｇＤ重鎖配列：配列番号１３８３（図２３）の塩基番号７８～塩基番号９６
　ＢＣＲのＩｇＥ重鎖配列：配列番号１３８４（図２４）の塩基番号４５～塩基番号６４
　ＢＣＲのＩｇκ鎖定常領域配列：配列番号１３８５（図２５）の塩基番号７５～塩基番号９２
　ＢＣＲのＩｇλ鎖配列：配列番号１３８６（図２５）の塩基番号５２～塩基番号６９（この配列番号はＣＭにも使っている。）。
　本明細書において「第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、本発明の第３のＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーであって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される。また、さらにアダプター配列、キー配列および同定配列を含む。具体的には、ＣＭ３－ＧＳ（配列番号７）、ＣＡ３－ＧＳ（配列番号１０）、ＣＧ３－ＧＳ（配列番号１３）、ＣＤ３－ＧＳ（配列番号１６）またはＣＥ３－ＧＳ（配列番号１９）を挙げることができるがそれらに限定されない。上述した、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列として設定しうる配列はいずれも用いることができる。
　本明細書において「アイソタイプ」とは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤ等において、同じタイプに属するが、相互に配列が異なるタイプを言う。アイソタイプは種々の遺伝子の略称や記号を用いて表示される。
　本明細書において「サブタイプ」とは、ＢＣＲの場合ＩｇＡおよびＩｇＧにおいて存在するタイプ内のタイプであって、ＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、ＩｇＡについてはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２が存在する。ＴＣＲについても、β鎖およびγ鎖において存在することが知られており、それぞれＴＲＢＣ１，ＴＲＢＣ２、あるいはＴＲＧＣ１，ＴＲＧＣ２が存在する。
　本明細書において「完全マッチ」とは、配列同士を比較したときに１００％同一であることをいう。
　本明細書において「同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチ」とは、同じアイソタイプに属するＣ領域アレル配列について、アラインメントしたときに、そのすべての配列が一致するこという。同じアイソタイプでもＣ領域の配列がすべてが同一であるということはないため、同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列を使用すると、増幅産物の配列を決定した場合に即座にアイソタイプを決定するために有利である。
　本明細書において「ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくい」とは、核酸分子の状態について、特に、共通アダプタープライマーについて、相補鎖等とでの対合のためダイマーを形成したり、あるいは分子内での相補鎖との対合のためにヘアピン構造等を形成しにくいような配列をいう。「とりにくい」とは、たとえば、ホモダイマーやヘアピンがその後の解析に実質的に影響しない程度は許容するものであって、たとえば、全体の１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０１％以下程度の形成を許容することをいう。当該分野で公知の手法（SantaLucia,　J.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,95(4):1460-1465.　(1998),　Bommarito　et　al.,　Nucleic　Acids　Res,28(9):1929-1934.(2000),　SantaLucia,　J.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,95(4):1460-1465.　(1998)　,　and　von　Ahsen　et　al.,　ClinChem,　47(11):1956-1961.(2001)）を用いて、たとえば、実施例で使用したような市販のコンピュータプログラム等（ＣＬＣ　Ｍａｉｎ　ＷｏｒｋｂｅｎｃｈやＰｒｉｍｅｒ３）でこのような配列を決定することができる。
　本明細書において「ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造をとらない」とは、核酸分子の状態について、特に、共通アダプタープライマーについて、相補鎖等とでの対合のためダイマーを形成したり、あるいは分子内での相補鎖との対合のためにヘアピン構造等を形成しない配列をいう。このような配列は、当該分野で公知の手法（SantaLucia,　J.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,95(4):1460-1465.　(1998),　Bommarito　et　al.,　Nucleic　Acids　Res,28(9):1929-1934.(2000),　SantaLucia,　J.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,95(4):1460-1465.　(1998)　,　and　von　Ahsen　et　al.,　ClinChem,　47(11):1956-1961.(2001)）を用いて、たとえば、実施例で使用したような市販のコンピュータプログラム等（ＣＬＣ　Ｍａｉｎ　ＷｏｒｋｂｅｎｃｈやＰｒｉｍｅｒ３）でこのような配列を決定することができる。
　本明細書において「安定して２本鎖を形成できる」構造は、核酸分子について、特に、共通アダプタープライマーについて、鋳型等の他の核酸分子と２本鎖を形成したときに安定してその鎖が形成されることをいう。このような安定性は、主に、温度、pH、塩基組成からの計算される融解温度（Tm）、pHm、構造安定化エネルギー（－ΔＧ３７℃）で評価することができる。このような配列は、当該分野で公知の手法（Santa　Lucia,　J.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,95(4):1460-1465.　(1998),　Bommarito　et　al.,　Nucleic　Acids　Res,28(9):1929-1934.(2000),　Santa　Lucia,　J.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,95(4):1460-1465.　(1998),　and　von　Ahsen　et　al.,　Clin　Chem,　47(11):1956-1961.(2001)）を用いて、たとえば、実施例で使用したような市販のコンピュータプログラム等（ＣＬＣ　Ｍａｉｎ　ＷｏｒｋｂｅｎｃｈやＰｒｉｍｅｒ３）でこのような配列を決定することができる。
　本明細書において「相同性が高くない」とは、核酸分子、特に、共通アダプタープライマーについていい、たとえば、識別性を高めるため、データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くない等の特徴を有することをいう。解析を十分にするためには、相同性の高さはたとえば、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下であることが好ましい。
　本明細書において「同じ程度の融解温度（Ｔｍ）」とは、使用されるプライマーまたは配列のＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）が実質的に同じであることをいう。ＰＣＲ増幅反応を適切に行うために好ましい条件である。「同じ程度」とは、Ｔｍが±１５℃以内、±１４℃以内、±１３℃以内、±１２℃以内、±１１℃以内、±１０℃以内、±９℃以内、±８℃以内、±７℃以内、±６℃以内、±５℃以内、±４℃以内、±３℃以内、±２℃以内、±１℃以内、±０．５℃以内であり得る。実施例においても、１０．９℃の相違で本発明を実施することができていることから、同じ程度としては、これらの１５℃以内程度で許容されることが理解される。Ｔｍは、ＤＮＡ分子の５０％が変性して一本鎖となる温度であって、当該分野で公知の手法で特定することができる。Ｔｍは、たとえば、以下のようにして求めることができる（ａ）１８ｂより短いオリゴヌクレオチドの場合：Ｔｍ＝（Ａ＋Ｔ）×２℃＋（Ｇ＋Ｃ）×４℃、（ｂ）１８ｂ以上の長さのオリゴヌクレオチドの場合：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）、（※Ａ：オリゴヌクレオチド内のＡの数、Ｃ：オリゴヌクレオチド内のＣの数、Ｇ：オリゴヌクレオチド内のＧの数、Ｔ：オリゴヌクレオチド内のＴの数、％Ｇ＋Ｃ：オリゴヌクレオチド内のＧ＋Ｃの％、Ｎ：オリゴヌクレオチドの長さ（ｍｅｒ）、［Ｎａ＋］：溶液中のＮａ＋濃度（Ｍ））。
　本明細書において「増幅に適切な塩基長」とは、使用されるプライマーまたは配列について、増幅反応に適切な長さをいう。このような長さとは、たとえば、実施例で使用したような市販のコンピュータプログラム等（ＣＬＣ　Ｍａｉｎ　ＷｏｒｋｂｅｎｃｈやＰｒｉｍｅｒ３)で求めることができ、次のような文献を参酌できる：Santa　Lucia,　J.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,95(4):1460-1465.　(1998),　Bommarito　et　al.,　Nucleic　Acids　Res,28(9):1929-1934.(2000),　Santa　Lucia,　J.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,95(4):1460-1465.　(1998)　,　and　von　Ahsen　et　al.,　Clin　Chem,　47(11):1956-1961.(2001)）。
　本明細書において「ミスマッチ」とは、遺伝子配列をアラインメントしたときに、互いに同一ではない塩基が存在することをいう。
　本明細書において「％ＧＣ（％グアニン・シトシン含量）」とは、ある核酸配列中のＧ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の塩基全体（Ａ（アデノシン）、Ｔ（チミン）またはＵ（ウラシル）をも含む）に対する割合を言う。この割合が高ければ、融解温度は高く、遺伝子密度や染色体のバンド構造とも関係する。
　本明細書において「ＴＣＲまたはＢＣＲのすべてのサブクラスに対応するセット」とは、対象となるＴＣＲまたはＢＣＲについて、公知となっているサブクラス（ＴＣＲについていえば、ＴＲＢＣ１，ＴＲＢＣ２、あるいはＴＲＧＣ１，ＴＲＧＣ２等をいい、ＢＣＲについていえば、ＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、ＩｇＡについてはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２等をいう）についてすべてに対して本明細書の記載にしたがって準備されたプライマーをいう。
　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
　本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ－５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified　cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’－メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzer　et　al.,　Nucleic　Acid　Res.19:5081(1991);　Ohtsuka　et　al.,　J.Biol.Chem.　260:　2605-2608(1985);　Rossolini　et　al.,　Mol.Cell.Probes　8:91-98(1994)）。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。「遺伝子産物」とは、遺伝子に基づいて産生された物質でありタンパク質、ｍＲＮＡなどをさす。
　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。
　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC－IUB　Biochemical　Nomenclature　Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのBLAST　2．2.9（2004．5.12発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
　本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（saline－sodium　citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular　Cloning　2nd　ed.,Current　Protocols　in　Molecular　Biology,Supplement　1～38、DNA　Cloning　1:Core　Techniques,A　Prac1tical　Approach,Second　Edition,　Oxford　University　Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ　Tris－HCl（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　EDTA、０．０２％　ポリビニルピロリドン（PVP）、０．０２％ＢＳＡ、100μｇ／ｍｌ変性サケ精子DNA、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８～２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ　Tris－HCl（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　EDTA、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１～５時間洗浄し、そして２ｘSSC、２５ｍＭ　Tris－HCl（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　EDTA、および０．１％SDSからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間洗浄することを含む。
　本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。
　本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ－Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメイン（例えば、V領域、D領域等）であってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
　本明細書において「フラグメント（断片）」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１～ｎ－１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
　本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能、治療活性、診断活性または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
　本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。
　本発明で用いられるIgG等の分子のアイソタイプ等の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、好ましくは電子的に、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul　et　al.,　J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson　&　Lipman,　Proc.Natl.Acad.Sci.,USA　85:2444-2448(1988)）、Smith　and　Waterman法（Smith　and　Waterman,　J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman　and　Wunsch法（Needleman　and　Wunsch,　J.Mol.Biol.48:　443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。BLASTが代表的に用いられている。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、PCRおよびin　situハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
　本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。分子の改変アミノ酸配列は、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＣＤ９８等の分子のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　本明細書において「マーカー（物質、タンパク質または遺伝子（核酸））」とは、ある状態（例えば、正常細胞状態、形質転換状態、疾患状態、障害状態、あるいは増殖能、分化状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子（核酸＝ＤＮＡレベル）、遺伝子産物（ｍＲＮＡ、タンパク質など）、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、分化障害などの疾患）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。
　本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した器官あるいは細胞等）をいう。
　本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、眼の細胞等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において「検出剤」とは、広義には、目的の対象を検出することができるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「診断剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を診断することができるあらゆる薬剤をいう。
　本発明の検出剤は、検出可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
　本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
　本明細書中で使用される用語「結合」は、２つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。結合または相互作用を測定することによって、本発明のマーカーの発現の度合い等を測定することができる。
　従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する（または結合する）「因子」（または、薬剤、検出剤等）とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
　本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用する（または結合する）ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用（または結合）としては、例えば、リガンド－レセプター反応、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素－基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質－脂質相互作用、核酸－脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター－リガンド反応による相互作用、酵素－基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用（または結合）が包含される。
　本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、マーカー検出剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得るが、本発明では、PCR産物の量をもって測定することができる。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat　Genet．2002　Dec；32　Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT－PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two－hybridシステム、in　vitro翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
　本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。
　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。
　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
　従って、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、免疫系の活性を検出、スクリーニングすることができることが理解される。
　本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識（検出）する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識（検出）することができる手段をいう。
　本発明により、免疫系の状態の指標として有用である。従って、本発明によって、免疫系の状態の指標を識別し、疾患の状態を知るために用いることができる。
　本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
　通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子（例えば、本発明のマーカー）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。
　本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。
　本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
　本発明によるプライマーセットはT細胞受容体の分子等の目的のタンパク質のヌクレオチド配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマー（プライマー対）の一方がT細胞受容体の分子目的のタンパク質の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。本発明のプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、『Molecular　Cloning，　A　Laboratory　Manual　2nd　ed．』（Cold　Spring　Harbor　Press（1989））、『Current　Protocols　in　Molecular　Biology』（John　Wiley　＆　Sons（1987－1997））に従って実施することができる。
　本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。
　通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも約７０％相同な、より好ましくは、少なくとも約８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも約９０％相同な、少なくとも約９５％相同な核酸配列が含まれる。
　１つの実施形態において、本発明の検出剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤は、タグを結合させたものであってもよい。
　本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒが望ましい。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５との組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ－アセトキシ－Ｎ2－アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、AAIF（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
　本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体－リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカー検出剤にはこのようなタグを結合させてもよい。
　ここで、「被験試料」とは、目的とする細胞またはそれに由来する物質であって遺伝子発現を可能にするものを含むと考えられる試料であればよい。
　本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
　本発明の診断薬等の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
　本明細書において「同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチ」とは、同じアイソタイプに属するＣ領域アレル配列について、アラインメントしたときに、そのすべての配列が一致するこという。同じアイソタイプでもＣ領域の配列がすべて同一であるということはないため、同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列を使用すると、増幅産物の配列を決定した場合に即座にアイソタイプを決定するために有利である。
　本明細書において「トリミング」とは、遺伝子解析において、不適切な部分の除去を行うこという。トリミングは、リード両端から低クオリティ領域、もしくは実験手順において付与された人工的核酸配列の部分配列、もしくはその両方を削除することで行われる。トリミングは、当該分野で公知のソフトウエアおよび文献（例えば、cutadapt  http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200/(EMBnet.journal,2011)；fastq-mcf    Aronesty E., The Open BioinformaticsJournal(2013) 7, 1-8 (DOI:10.2174/1875036201307010001)；およびfastx-toolkit  http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2009)）を参照しておこなうことができる。好ましくは、アダプタ配列が人工的核酸配列においていうと、トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し；リード両端からアダプタ配列と１０ｂｐ以上マッチする領域を削除し；および残った長さが２００ｂｐ以上（ＴＣＲ）もしくは３００ｂｐ以上（ＢＣＲ）なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される。
　本明細書において「適切な長さ」とは、本発明の遺伝子解析において、アラインメント等の分析を行う際に、分析に適合するような長さをいう。そのような長さは、例えば、Ｃ領域上の配列決定開始位置から、Ｖ領域上のＤ領域寄りの１００塩基を含む長さ以上とするようにして決定することができ、例えば、本発明では、ＴＣＲの場合、２００ヌクレオチド長以上、好ましくは２５０ヌクレオチド長以上であってよく、ＢＣＲの場合、３００ヌクレオチド長以上、好ましくは３５０ヌクレオチド長以上であってよいが、これらに限定されない。
　本明細書において「入力配列セット」とは、本発明の遺伝子解析において、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの解析の対象となる配列のセットをいう。
　本明細書において「遺伝子領域」とはＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域およびＣ領域等の各領域をさす。このような遺伝子領域は、当該分野で公知であり、データベース等を参酌して適宜決定することができる。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。本明細書において「相同性検索」とは、相同性の検索をいう。好ましくは、コンピュータを用いてインシリコで行うことができる。
　本明細書において「近似する」とは、相同性検索を行った際に、相同性の程度が高いことをいう。相同性検索を行うソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を行った際には通常相同性の高い順序で列挙されるため、順位の高いものを適宜選択することで近似することができる。
　本明細書において「最も近しい」とは、相同性検索を行った際に、相同性の程度が最も高いことをいう。ソフトウェアで相同性検索を行った場合は１位で表示されるものを選択する。
　本明細書において「参照アリル」とは、相同性検索を行った際に、参照データベースにおいてヒットする参照アリルをいう。
　本明細書において「アラインメント」（英語では、ａｌｉｇｎｍｅｎｔまたはａｌｉｇｎ）とは、バイオインフォマティクスにおいて、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質等の生体分子の一次構造の類似した領域を特定できるように並ぶように並べたもの、および並べることをいう。機能的、構造的、あるいは進化的な配列の関係性を知る手がかりを与えることができる。
　本明細書において「アサイン」とは、ある配列（例えば、核酸配列、タンパク質配列等）に、特定の遺伝子名、機能、特徴領域（例えば、Ｖ領域、Ｊ領域など）等情報を割り当てることをいう。具体的には、ある配列に特定の情報を入力またはリンクさせる等により達成することができる。
　本明細書において「ＣＤＲ３」とは、３つめの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：　ＣＤＲ）をいい、ここで、ＣＤＲとは、可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、この超可変領域のことをいう。軽鎖と重鎖の可変領域に、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と、３つのＣＤＲを取り囲む４つのＦＲ（ＦＲ１～ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ３領域は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域にまたがって存在するとされているため、可変領域の鍵を握るといわれており、分析対象として用いられる。
　本明細書において「参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭」とは、本発明が対象とするＶ領域中のＣＤＲ３の先頭に該当する配列をいう。
　本明細書において「参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾」とは、本発明が対象とするＪ領域中のＣＤＲ３の末尾に該当する配列をいう。
　本明細書において「ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件」とは、ランダム変異が、結果として散在することになる任意の条件をいい、例えば、ＢＬＡＳＴ／ＦＡＳＴＡ最適パラメータであれば、以下の条件でよく表現される：アラインメント全長にわたり最大３３％の不一致を許容し、かつ、その中の任意の３０ｂｐについて、最大６０％の一連でない不一致を許容する。本発明で用いられるＩｇＧ等の分子のアイソタイプ等の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、好ましくは電子的に、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul　et　al.,　J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson　&　Lipman,　Proc.Natl.Acad.Sci.,USA　85:2444-2448(1988)）、Smith　and　Waterman法（Smith　and　Waterman,J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman　and　Wunsch法（Needleman　and　Wunsch,　J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。BLASTが代表的に用いられている。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
　（好ましい実施形態）
　以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
　（非バイアスでの試料増幅）
　本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うための試料の調整を行うことができる。これらのシークエンシング技術は、妥当なコストで、試料から100万またはそれ以上のリードを得ることができる。1/1,000,000またはそれよりも低い頻度で存在する遺伝子型でさえ、これらの技術を用いて特異的様式で、しかもバイアスのかかっていない様式で検出することができる。血液または骨髄等のDNA由来の試料から、遺伝子または転写物の特定部分の配列の異なる型をすべて増幅するための非バイアス増幅方法が達成される。
　１つの局面において、本発明は、データベースを用いた遺伝子配列解析により、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うための試料を調製するための方法を提供する。この方法は、（１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；（２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；（３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；（４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；（５）（４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および（６）（５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、該分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程を包含する。
　従来の方法では、真の意味での非バイアスは達成し得なかったが、本発明では、非バイアスの増幅を達成することができており、正確な分析を行うことができる。非バイアスについては、たとえば、SMART　PCR法が使用されることがあるが、この方法は、精確な非バイアスを達成することができない。その理由は以下のとおりである。SMART　PCR法はMoloney　MurineLeukemia　Virus(MMLV)由来の逆転写酵素が持つターミナルトランスフェラーゼ活性を利用した方法である。即ち、逆転写酵素が相補鎖DNA合成反応において鋳型となるmRNAの5′末端に到達した際に、新たに合成した相補的DNAの３′末端に主にＣ塩基を付加する副次反応を利用している。付加された塩基（ＣＣＣ）に相補的な塩基配列（ＧＧＧ）を３′末端に持つプライマー（ＴＳオリゴ）を用いることで、逆転写反応時に鋳型を変更して二本鎖の合成が起こる。従って、TSオリゴの付加反応が連続して起こり、TSオリゴコンカテマーが形成される欠点が知られている（Villanyi　Z,　Mai,　A,　Szabad　J.　Repeated　template　switching:　Obstacles　in　cDNA　libraries　and　ways　to　avoid　them.　The　open　genomics　journal,　2012,　5,　1-6）。また、TSオリゴの３′側配列に同一もしくは類似した配列を持つ遺伝子では、TSオリゴによりポリメラーゼの進行が阻害され、結果としてバイアスを生じる欠点も知られている（Tang　DT,　Plessy　C,　Salimullah　M,　Suzuki　AM,　Calligaris　R,　Gustincich　S,　Carninci　P.　Suppression　of　artifacts　and　barcode　bias　in　high-throughput　transcriptome　analyses　utilizing　template　switching.　Nucleic　Acids　Res.　2013　Feb　1;41(3):e44）。実際に、マイクロアレイ解析を用いてSMART　PCR法と標準的逆転写反応あるいはインビトロ転写法の間では相関が低いことが報告されている（Puskas　LG,　Zvara　A,　Hackler　L　Jr,　Van　Hummelen　P.RNA　amplification　results　in　reproducible　microarray　data　with　slight　ratio　bias.　Biotechniques.　2002　Jun;32(6):1330-4,　1336,　1338,　1340.）。また、各検出法の繰り返し試験においても、SMARTPCR法は他の２法より低い再現性を示すことが報告されている（Puskas LG, et al., Biotechniques.　2002　Jun;32(6):1330-4,　1336,　1338,　1340.）。
　１つの実施形態では、ＢＣＲの可変領域のレパトアの定量解析を行う場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群より選択される目的とするアイソタイプＣ領域に完全マッチの配列を含み、かつ他のＣ領域に相同性を持たない配列を有する。好ましくは、前記Ｃ領域特異的プライマーは、ＩｇＡまたはＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のいずれか、またはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２のいずれかであるサブタイプに完全マッチする配列である。別の実施形態では、ＴＣＲの可変領域のレパトアの定量解析を行う場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、α鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖からなる群より選択される目的とする鎖のＣ領域に完全マッチし、かつ他のＣ領域に相同性を持たない配列である。
　別の実施形態では、前記Ｃ領域特異的プライマーは、前記データベース中の同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列部分を選択することが好ましい。このような完全マッチを選択することによって、精度の高い分析を行うことができる。
　好ましい実施形態では、前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される。このような共通アダプタープライマー配列の例は、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣ（配列番号２）、ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧ（Ｐ１０ＥＡ；配列番号３）等をあげることができる。
　好ましい実施形態では、前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造をとらないよう設計され、ＢＣＲまたはＴＣＲを含む他の遺伝子に対して相同性がないものを選択される。このような共通アダプタープライマー配列の例は、Ｐ２０ＥＡ、Ｐ１０ＥＡ、等をあげることができる。
　具体的な実施形態では、前記共通アダプタープライマーは、Ｐ２０ＥＡおよび／またはＰ１０ＥＡであり、その配列は、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣ（Ｐ２０ＥＡ；配列番号２）、ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧ（Ｐ１０ＥＡ；配列番号３）である。
　好ましい実施形態では、前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＢＣＲのレパトア解析のためのものであり、ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，またはＩｇＥの各アイソタイプＣ領域に完全マッチする配列であって、該ＩｇＧおよびＩｇＡの場合は、サブタイプについても完全マッチし、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のターゲット配列以外の遺伝子配列と相同性がなく（あるいは、ターゲット配列以外のＢＣＲまたはＴＣＲを含む他の遺伝子に対して相同性がなく）、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される。このような配列の例としては、たとえば、Ｐ２０ＥＡ（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣ（配列番号２））、Ｐ１０ＥＡ（ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧ（配列番号３））を挙げることができるがこれに限定されない。
　好ましい実施形態では、前記第１、第２および第３のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＴＣＲのレパトア解析のためのものであり、各プライマーは１種のα鎖（ＴＲＡＣ）、２種のβ鎖（ＴＲＢＣ０１，　ＴＲＢＣ０２）、２種のγ鎖（ＴＲＧＣ１，　ＴＲＧＣ２）、１種のδ鎖（ＴＲＤＣ１）に対して完全マッチする配列であり、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される。このような配列の例としては、たとえば、Ｐ２０ＥＡ（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣ（配列番号２））、Ｐ１０ＥＡ（ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧ（配列番号３））を挙げることができるがこれに限定されない。
　好ましい実施形態では、前記第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはＣ領域５’末端側から約１５０塩基までの領域に設定され、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーおよび第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーはＣ領域５’末端側から約３００塩基までの間に設定される。
　好ましい実施形態では、前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＢＣＲの定量解析を行うためのものであり、５種のアイソタイプ配列には別個に特異的プライマーを設定し、標的配列には完全マッチして、かつ他のアイソタイプには５塩基以上のミスマッチを確保するよう設計され、類似するＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）あるいはＩｇＡサブタイプ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）に対しては、それぞれ１種のプライマーで対応できるようすべてのサブタイプに完全マッチするよう設計される。このような配列の例は、実施例で使用されているものを挙げることができ、以下のとおりである：ＣＭ１（配列番号５）、ＣＡ１（配列番号８）、ＣＧ１（配列番号１１）、ＣＤ１（配列番号１４）、ＣＥ１（配列番号１７）、ＣＭ２（配列番号６）、ＣＡ２（配列番号９）、ＣＧ２（配列番号１２）、ＣＤ２（配列番号１５）、ＣＥ２（配列番号１８）、ＣＭ３－ＧＳ（配列番号７）、ＣＡ３－ＧＳ（配列番号１０）、ＣＧ３－ＧＳ（配列番号１３）、ＣＤ３－ＧＳ（配列番号１６）またはＣＥ３－ＧＳ（配列番号１９）を挙げることができるがそれらに限定されない。
　好ましい実施形態では、プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長１８―２２塩基、融解温度５４－６６℃、％ＧＣ（％グアニン・シトシン含量）は４０－６５％に設定される。好ましくは、これらのパラメータに加え、塩基配列長１８―２２塩基、融解温度５４－６６℃、％ＧＣ（％グアニン・シトシン含量）は４０－６５％に設定し、自己アニーリングスコア２６、自己末端アニーリングスコア１０、二次構造スコア２８に設定される（実施例で使用されるＲｏｃｈｅ製のシークエンサの場合）。塩基配列長等のこれらの好ましい値は、機種に応じて変動しうるが、当業者は機種に応じて適宜設定することができる。
　好ましい実施形態では、前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列の決定方法の条件は以下を含む。１．複数のサブタイプ配列および／またはアレル配列を塩基配列解析ソフトに取り込み、アライメントすること；２．プライマーデザイン用のソフトウェアを用いて、Ｃ領域内にパラメータ条件を満たすプライマーを複数検索すること；３．１のアライメント配列の中で不一致塩基のない領域にあるプライマーを選択すること；４．３により決定されたプライマーの下流に各サブタイプおよび／またはアレル毎に不一致配列が複数あることを確認し、ない場合は、さらに上流にプライマーを検索し、必要に応じてさらにこれを反復すること。
　好ましい実施形態では、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、スプライシングにより生じるＣ領域配列の第一コドンの第一塩基を基準として４１－３００塩基まで、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として２１－３００塩基まで、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として１５０塩基以内で、かつサブタイプおよび／またはアレルの不一致部位を含む位置で設定される。
　好ましい実施形態では、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造を有する：ＣＭ１（配列番号５）、ＣＡ１（配列番号８）、ＣＧ１（配列番号１１）、ＣＤ１（配列番号１４）、ＣＥ１（配列番号１７）、ＣＡ１（配列番号３５）、ＣＢ１（配列番号３７）等を挙げることができるがそれらに限定されない。
　好ましい実施形態では、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造を有する：ＣＭ２（配列番号６）、ＣＡ２（配列番号９）、ＣＧ２（配列番号１２）、ＣＤ２（配列番号１５）、ＣＥ２（配列番号１８）、ＣＡ２（配列番号３５）、ＣＢ２（配列番号３７）等を挙げることができるがそれらに限定されない。
　好ましい実施形態では、第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造を有する：ＣＭ３－ＧＳ（配列番号７）、ＣＡ３－ＧＳ（配列番号１０）、ＣＧ３－ＧＳ（配列番号１３）、ＣＤ３－ＧＳ（配列番号１６）またはＣＥ３－ＧＳ（配列番号１９）を挙げることができるがそれらに限定されない。
　好ましい実施形態では、前記ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、いずれも、ＴＣＲまたはＢＣＲのすべてのサブクラスに対応するセットで提供される。その具体的な配列は以下：ＣＭ１（配列番号５）、ＣＡ１（配列番号８）、ＣＧ１（配列番号１１）、ＣＤ１（配列番号１４）、ＣＥ１（配列番号１７）、ＣＭ２（配列番号６）、ＣＡ２（配列番号９）、ＣＧ２（配列番号１２）、ＣＤ２（配列番号１５）、ＣＥ２（配列番号１８）、ＣＭ３－ＧＳ（配列番号７）、ＣＡ３－ＧＳ（配列番号１０）、ＣＧ３－ＧＳ（配列番号１３）、ＣＤ３－ＧＳ（配列番号１６）またはＣＥ３－ＧＳ（配列番号１９）、ＣＡ１（配列番号３５）、ＣＢ１（配列番号３７）、ＣＡ２（配列番号３５）、ＣＢ２（配列番号３７）等を含む。
　（大規模解析）
　別の局面において、本発明は、本発明の方法で製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法を提供する。
　遺伝子解析としては、任意の解析手法を用いて行うことができ、たとえば、公知のＩＭＧＴ　（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベースから入手されるＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ配列をリファレンス配列として各リード配列のＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ配列をアサインして、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔを利用する手法、あるいは、同日付で出願し、本明細書においても解析システムの好ましい例として記載される出願人が開発した新たなソフトウェア（Ｒｅｐｅｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ）を使用することができる。
　１つの好ましい実施形態では、前記遺伝子解析は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析である。
　個々の増幅分子を配列決定することで、異なる配列を識別することができ、したがって配列決定はクローン増殖における量的変化を検出するための感度を有する。概して、提供する本発明の１つの態様において、Ｔ細胞および／またはＢ細胞における組換えＤＮＡ配列のプロファイルを決定するための方法を提供する。本方法は、対象から試料を単離する工程、１ラウンドまたは複数ラウンドの核酸増幅、個々の核酸を空間的に単離する工程、および核酸を配列決定する工程を含む工程を含み得る。
　１つの局面において、対象または個体における１つまたは複数のレパトアの相関関係を決定するための方法を提供する。別の局面において、疾患を有する対象に由来する任意の試料における１つまたは複数のレパトアの相関関係を予測することができるアルゴリズムを開発するための方法を提供する。別の局面において、対象に由来する任意の試料における１つまたは複数のレパトアの相関関係を予測することができるアルゴリズムを用いて、個体の１レパトアの相関関係または複数のレパトアの相関関係を発見するための方法を提供する。別の局面において、疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを作成するための方法を提供する。別の局面において、個体の疾患状態をモニターするための方法を提供する。
　（解析システム）
　本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うためのバイオインフォマティクスを提供する。
　１つの局面において、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法であって、以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ（好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出するステップ）；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ（好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ）；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップを包含する。
　本発明の各ステップを図４３のフローチャートを参照して、各システムや装置の具体的な動作を説明する。
　図４３は、本発明の遺伝子解析システムにおいて、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法を示す処理フローを示すフローチャートである。また、図中の各　符号Ｓ１～Ｓ６は、以下の説明中の各ステップ（１）～ステップ（６）に対応するものである。
　本発明の方法において（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップは、例えば、Ｖ領域について言えば、そのＶ領域の情報を含むデータベースを適宜選択し、これを提供することで達成されうる。
　本発明の方法において、（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップは、必要な場合には適宜ソフトウェア等の機能を用いてトリミングを行い、また、必要な場合は、長さを適宜選択した上で、抽出した入力配列セットを提供することで達成する。入力配列は、例えば、公知の方法で増幅した増幅産物のセット、または本出願と同日に提出した出願で記載されるような非バイアス方法によってＰＣＲ増幅した増幅産物のセットでありうる。
　本発明の方法において、（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップは、相同性検索を行うソフトウェアを適宜用いて、遺伝子領域（例えば、Ｖ領域等）ごとに、参照データベースとの相同性検索を入力配列セットに対して行い、その結果得られる近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録することによって行われる。図２９および図３０においては、「ＢＬＡＳＴ」もしくは「ＢＬＡＳＴ解析」のボックスと、その下のＩＭＧＴデータベース、それらが縦二重線でつながっているところまでが該当する。
　本発明の方法において（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップは、配列アラインメントから、既知の情報などを元に、Ｖ領域および／またはＪ領域を決定することによって達成することができる、このような抽出においては、好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出することで達成することができる。図２９および図３０においては、Ｖの下にある横矢印およびＪの下にある横矢印を目印にして、Ｄｎｏ下にある横矢印にあるようにこの領域の両端を確定することが、ＣＤＲ３配列の抽出に対応する。
　本発明の方法において、５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップは、当該分野で公知の方法を用いてアミノ酸への翻訳を行い、そのアミノ酸配列について相同性検索等により、Ｄ領域に該当する配列を抜き出すことなどで達成することができる。好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類することができる。
　本発明の方法において、（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップは、上記までのステップで算出したＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および／またはＣ領域の出現頻度を、例えば、リストで整理するなどにより算出することができる。これにより、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出することができる。
　以上のステップを図４２も参照しながらさらに説明する。
　Ｓ１（ステップ（１））において、参照データベースが提供される。これは、外部記憶装置１４０５に保存されたものであってもよいが、通常は、通信デバイス１４１１を通じて、公共で提供されるデータベースとして取得することができる。あるいは入力装置１４０９を用いて入力し、必要に応じてＲＡＭ１４０３または外部記憶装置１４０５に記録してもよい。ここでは、Ｖ領域などの目的とする領域を含むデータベースが提供される。
　Ｓ２（ステップ（２））では、入力配列セットが提供される。ここでは、入力装置１４０９を用いるか通信デバイス１４１１を介して、例えばＰＣＲ増幅反応で増幅した増幅産物のセットから得られる配列情報のセットが入力される。ここでは、ＰＣＲ増幅反応の増幅産物を受け取り、それを遺伝子配列解析する装置が接続されていてもよい。そのような接続はシステムバス１４２０を通じて行われるかまたは通信デバイス１４１１を通じて行われる。ここでは、必要に応じてトリミングおよび／または適切な長さのものの抽出を行うことができる。そのような処理は、ＣＰＵ１４０１で行われる。トリミングおよび／または抽出をするためのプログラムはそれぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　Ｓ３（ステップ（３））では、アラインメントがなされる。ここでは、該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行うが、この相同性検索は、通信デバイス１４１１等を介して得られた参照データベースに対して相同性検索プログラム処理を行う。この処理はＣＰＵ１４０１で行われる。また、その結果得られた結果を分析して近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを行う。この処理もまたＣＰＵ１４０１で行われる。これらを実行するためのプログラムは、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　Ｓ４（ステップ（４））では、Ｄ情報の核酸配列を検出する。この処理もまたＣＰＵ１４０１で行われる。これらを実行するためのプログラムは、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。ここでは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインする。アサイン処理もまたＣＰＵ１４０１でなされる。また、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出することもまたＣＰＵ１４０１でなされる。アサインおよび抽出の処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。ここでは、好ましくは、配列アラインメントから、既知の情報などを元に、Ｖ領域および／またはＪ領域を決定することによって達成することができる。結果は、ＲＡＭ１４０３または外部記憶装置１４０５に保存することができる。このような抽出においては、好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出することで達成することができる。このような処理もまたＣＰＵ１４０１において行うことができる。そのためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　Ｓ５（ステップ（５）では、Ｄ領域を分類する。該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する処理がなされるが、これもまたＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。得られたアミノ酸配列について相同性検索等により、Ｄ領域に該当する配列を抜き出してもよい。このような処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類することができる。この処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　Ｓ６（ステップ（６））では、上記分類に基づいてＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する。この算出および導出のための処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　１つの好ましい実施形態では、本発明において使用される遺伝子領域は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の全部を含む。
　１つの実施形態では、前記参照データベースは、各配列に一意のＩＤが割り振られたデータベースである。ＩＤが一意に割り振られることによって、ＩＤという簡単な指標を元に遺伝子の配列を分析することができる。
　１つの実施形態では、前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである。非バイアスの配列セットは、本明細書において記載されるような非バイアス方法によってＰＣＲ増幅することによって実施することができる。非バイアス方法の精度を求めない場合は、Ｓｍａｒｔ法等の比較的低い程度の「擬似非バイアス法」を用いてもよい。したがって、本明細書において「非バイアス」というときは本発明の方法によって達成されるような精度を有する非バイアスをいい、そのレベルに達しない場合は「擬似非バイアス方法」という。本明細書において記載されるような非バイアス方法を特に、区別していう場合は「精確な非バイアス」ということもあるが、特に「精確な」との記載がない場合でも本明細書においては本明細書において記載される方法を用いて達成されるレベルであることが理解される。
　別の実施形態では、前記配列セットはトリミングされたものである。トリミングを行うことによって、不要なあるいは不適切な核酸配列を除くことができ、分析の効率を上げることができる。
　好ましい実施形態では、トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し；リード両端からアダプタ配列と１０ｂｐ以上マッチする領域を削除し；および残った長さが２００ｂｐ以上（ＴＣＲ）もしくは３００ｂｐ以上（ＢＣＲ）なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される。好ましくは、前記低クオリティは、ＱＶ値の７ｂｐ移動平均が３０未満のものである。
　好ましい実施形態では、前記近似する配列は、最も近しい配列である。具体的な実施形態では、前記近似する配列は、１．一致塩基数、２．カーネル長、３．スコア、４．アラインメント長の順位によって決定される。
　別の実施形態では、前記相同性検索は、ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件で行われる。このような条件は、例えば、ＢＬＡＳＴ／ＦＡＳＴＡ最適パラメータであれば、以下の条件でよく表現される：アラインメント全長にわたり最大３３％の不一致を許容し、かつ、その中の任意の３０ｂｐについて、最大６０％の一連でない不一致を許容する１つの実施形態では、前記相同性検索は、デフォルト条件に比べて（１）ウィンドウサイズの短縮、（２）ミスマッチペナルティの低減、（３）ギャップペナルティの低減および（４）指標の優先順位のトップが一致塩基数の少なくとも１つの条件を含む。
　別の実施形態では、前記相同性検索は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡにおいて以下の条件
　　Ｖ ミスマッチペナルティ＝－１、最短アラインメント長＝３０、最短カーネル長＝１５
　　Ｄ ワード長＝７（ＢＬＡＳＴの場合）またはＫ－ｔｕｐ＝３（ＦＡＳＴＡの場合）、ミスマッチペナルティ＝－１、ギャップペナルティ＝０、最短アラインメント長＝１１、最短カーネル長＝８
　　Ｊ ミスマッチペナルティ＝－１、最短ヒット長＝１８、最短カーネル長＝１０
　　Ｃ 最短ヒット長＝３０、最短カーネル長＝１５で実施される。この条件は、例えば、より短い（～２００ｂｐ）配列を用いて一部の領域だけでも分類する状況（「好ましい例」から外れる状況）であれば使用することができ、イルミナ製シーケンサを利用する状況でも使用することができる。この場合は、相同性検索にｂｗａもしくはｂｏｗｔｉｅを用いる可能性が考えられる。
　特定の実施形態では、前記Ｄ領域の分類は、前記アミノ酸配列の出現頻度によってなされる。
　さらなる実施形態では、前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在する場合は、前記ＣＤＲ３の核酸配列との相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする。
　別の実施形態では、前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在しない場合、前記アミノ酸配列の出現頻度のみによって分類がなされる。
　具体的な実施形態では、前記出現頻度は、遺伝子名単位および／またはアリル単位でなされる。
　別の実施形態では、前記ステップ（４）は該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出するステップを包含する。
　更なる実施形態では、前記ステップ（５）は、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップを包含する。
　１つの局面では、本発明はＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析するシステムであって、該システムは：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；を包含する、システムを提供する。
　別の局面では、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであって、該方法は以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；を包含する、プログラムを提供する。
　さらに別の局面では、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；を包含する、記録媒体を提供する。
　（システム構成）
　次に、図４２の機能ブロック図を参照して、本発明のシステム１の構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示している。
　本発明の遺伝子分析システム１は、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵ１４０１にシステムバス１４２０を介してＲＡＭ１４０３、ＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置１４０５及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）１４２５が接続されて構成される。入出力Ｉ／Ｆ１４２５には、キーボードやマウスなどの入力装置１４０９、ディスプレイなどの出力装置１４０７、及びモデムなどの通信デバイス１４１１がそれぞれ接続されている。外部記憶装置１４０５は、情報データベース格納部１４３０とプログラム格納部１４４０とを備えている。何れも、外部記憶装置１４０５内に確保された一定の記憶領域である。
　このようなハードウェア構成において、入力装置１４０９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１４１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１４０５にインストールされたソフトウェアプログラムがＣＰＵ１４０１によってＲＡＭ１４０３上に呼び出されて展開され実行されることで、ＯＳ（オペレーションシステム）と協働してこの発明の機能を奏するようになっている。
　データベース格納部１４３０には、参照データベースや入力配列セットあるいは生成した分類データやＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアのデータ等、もしくは通信デバイス１４１１等を介して取得した情報が随時書き込まれ、更新される。各入力配列セット中の各々の配列、参照データベースの各遺伝子情報ＩＤ等の情報を各マスタテーブルで管理することにより、蓄積対象となるサンプルに帰属する情報を、各マスタテーブルにおいて定義されたＩＤにより管理することが可能となる。
　データベース格納部１４３０には、入力配列セットエントリー情報として、試料提供者ＩＤ、試料情報、核酸分析結果、既知の個体・生理情報、及びＴＣＲもしくはＢＣＲレパトア分析結果が試料ＩＤに関連付けて格納される。ここで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトア分析結果は、核酸分析結果を本発明の処理によって処理して得られる情報である。
　また、プログラム格納部１４４０に格納されるコンピュータプログラムは、コンピュータを、上記した処理システム、例えば、トリミング、抽出、アラインメント、アサイン、分類、翻訳等を行う処理を実施するシステムとして構成するものである。これらの各機能は、それぞれが独立したコンピュータプログラムやそのモジュール、ルーチンなどであり、上記ＣＰＵ１４０１によって実行されることでコンピュータを各システムや装置として構成させるものである。なお、以下においては、それぞれのシステムにおける各機能が協働してそれぞれのシステムを構成しているものとする。
　（レパトアの解析システム・解析方法）
　１つの局面において、本発明は、データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法を提供する。この方法は、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程を包含する。この方法および本明細書で説明される１つまたは複数の更なる特徴を含む方法を、本明細書において「本発明のレパトア解析法」とも呼ぶ。そして本発明のレパトア解析法を実現するシステムを「本発明のレパトア解析システム」ともいう。
　本発明の方法における（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程は、核酸配列を決定するのに適切な試料となっている限り、どのような試料であってもよい。そのような手法として、本発明の上記の好ましい増幅方法のほか、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ, エマルジョンＰＣＲ、ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　（ＡＦＬＰ）ＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、アッセンブルＰＣＲ，非対称ＰＣＲ，コロニーＰＣＲ，ヘリカーゼ依存性増幅、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲ　ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ、Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ　ＰＣＲ、ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ＰＣＲ　（ＬＡＭＰ），Ｎｕｃｌｅｉｄ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（ＮＡＳＢＡ）、Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｒａｎｃｈ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｃｉｒｃｌｅ　ｔｏ　ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＰＩＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｔｒｇｅｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　（ＴＡＣＬ）、５’－Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄ　（５’－ＲＡＣＥ）、３’－Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄ　（３’－ＲＡＣＥ）、Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｔ　５’－ｅｎｄｏｆ　ｔｈｅ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＳＭＡＲＴ）を用いることもできる。
　本発明の方法における（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程は、核酸配列を決定することができる限り、どのような方法を用いてもよい。通常は、大量の配列決定を要するため、自動化された大規模配列決定方法を用いることが好ましい。そのような配列決定方法としては、Ｒｏｃｈｅ　４５４シーケンサを用いた配列決定（ＧＳ　ＦＬＸ＋、ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ）、イオントレントシーケンサ（Ｉｏｎ　ＰＧＭＴＭ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）の手法を用いた配列決定、イルミナ社の手法（ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ　ＩＩｘ，Ｈｉｓｅｑ，Ｍｉｓｅｑ）を用いた配列決定がある。その他のシーケンス法としては、ＨｅｌｉｓｃｏｐｅＴＭ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｓ　Ｔｒｕｅ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（ｔＳＭＡ）（Ｈａｒｒｉｓ．Ｔ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００８，３２０－１６０－１０９），ＳｏｌｉＤＴＭ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．），Ｓｉｎｇｌｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　（ＳＭＲＴＴＭ）ＰａｃＢｉｏシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　ＣＡ），Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ），ＬａｓｅｒＧｅｎＴＭ（ＬａｓｅｒＧｅｎ，Ｉｎｃ．ＣＡ)（文献：Litosh VA et al., Nucleic Acids Res. 2011　Mar;39(6):e39）、Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ　ＧｅｎｏｍｉｃｓＴＭ（Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＣＡ）、ＧｎｕＢＩＯ（ＧｎｕＢＩＯ　Ｉｎｃ．、ＭＡ）、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｍ．Ｄａｎａｈｅｒ／Ｄｏｖｅｒ，Ａｚｃｏ　Ｂｉｏｔｅｃ．　Ｉｎｃ．，　ＣＡ），Ｍｅｂｉｏｕｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｍｅｂｉｏｕｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ），Ｍｉｌｌｉｋａｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃａｅｒｕｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，　Ｉｎｃ）、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｂｉｏ－Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｉｎｃ．（文献：HutterD,et al Nucleosides Nucleotides　Nucleic Acid 2010;29(11):879-95.），Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｎａｂｓｙｓ　Ｉｎｃ．，　ＲＩ），Ｎａｎｏｐｏｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｎｏｂｌｅｇｅｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｉｎｃ．），Ｎａｎｏｐｏｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｂｉｏｓｃｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ），Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＧＥＮＩＵＳＴＭ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｇｅｎａｐｓｙｓ、Ｉｎｃ．，ＣＡ），ＣＡＥＲＵＳ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＤＩＡＧＮＯＴＩＣＳ，ＩＮＣ，ＣＡ，Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ｒａｐｉｄ　Ｎａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒ　（ＩＭＰＲＮＴ）（Ｈａｌｃｙｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ），Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ－ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ｄｕａｌ－ｂｅａｍ　ｌｏｗ　ｅｎｅｒｇｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｏｐｔｉｃａ，　Ｉｎｃ．，ＣＡ），ＺＳ　Ｇｅｎｅｓｉｓ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＺＳ　Ｇｅｎｅｔｙｉｃｓ，Ｉｎｃ）等を挙げることができる。Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンスは、３´末端と５´末端に特異的に結合する２種類のアダプターを結合させた１本鎖ＤＮＡを作成する。その１本鎖ＤＮＡはアダプターを介してビーズに結合し、油中水滴エマルジョンの中に包み込むことにより、ビーズとＤＮＡフラグメントを持つマイクロリアクターを形成する。その後、油中水滴エマルション内でエマルションＰＣＲを行って目的遺伝子を増幅する。このビーズをピコタイタープレートへアプライし、シーケンスを行う。ＤＮＡポリメラーゼによりｄＮＴＰがＤＮＡに取りこまれるときに発するピロリン酸を基質として、ｓｕｌｆｒｙｌａｓｅによりＡＴＰを生成する（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。このＡＴＰとＬｕｃｉｆｅｒｉｎを基質としてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅが蛍光を発し、ＣＣＤカメラで検出することで塩基配列を決定する。イオントレント社の手法は、Ｒｏｃｈｅ社と同様の方法でエマルジョンＰＣＲを行った後、ビーズをマイクロチップに移し、マイクロチップ上でシーケンス反応を行う。検出は、ポリメラーゼによってＤＮＡが伸長する際に放出される水素イオン濃度を半導体チップ上で検出して、塩基配列に変換する。イルミナ社のシーケンスは、ブリッジＰＣＲ法とＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓという手法により、フローセル上で目的ＤＮＡを増幅させ、合成しながらシーケンシングを行う方法である。ブリッジＰＣＲ法は、両末端に異なるアダプター配列を付加した1本鎖ＤＮＡを作成する。フローセル上には予め５′末端側のアダプター配列が固定されており、伸長反応を行うことによりフローセルに固定する。同様に近接する位置に３′末端側のアダプターが固定され、合成されたＤＮＡの３′末端と結合して、いわゆるブリッジを形成した状態で２本鎖ＤＮＡを合成する。その後、ブリッジ結合→伸長→変性を繰り返すことにより、多数の１本鎖ＤＮＡ断片が局所的に増幅し、集積したクラスターが形成される。この１本鎖ＤＮＡを鋳型として、シーケンシングを行う。Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓは、シーケンスプライマーを添加後、ＤＮＡポリメレースによって３′末端ブロック蛍光ｄＮＴＰによる1塩基合成反応を行う。レーザー光により塩基に結合している蛍光物質を励起させて、蛍光顕微鏡により発光を写真として記録する。次に、蛍光物質とブロックを外して次の伸長反応を行い、蛍光を検出するというステップを進めていくことで塩基配列を決定する。好ましくは、複数の配列を単一の配列決定で行うことが有利である。より長い配列長を一度に配列決定できることも有利である。　
　本発明における（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程は、遺伝子の出現頻度およびその組み合わせを算出することができ、ＴＣＲレパトアおよび／またはＢＣＲレパトアを導出することができるかぎり、どのような技術であっても用いることができる。たとえば、上述の解析方法の好ましい例のほか、ＩＭＧＴが提供する分析ツールＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔが利用できる。他の手法ではアライメント機能あるいはマッピング機能を実装したソフトウェアであるＡｂＭａｐｐｅｒ，　ＡＬＬＰＡＴＨＳ，　Ａｒａｃｈｎｅ，　ＢＡＣＣａｒｄｌ，　Ｂｆａｓｔ，　ＢＬＡＴ，　Ｂｏｗｔｉｅ，　ＢＷＡ－ＭＥＭ，　ＢＷＡ－ＳＷ，　ＢＷＡ，　ＣＣＲａ　ＶＡＴ　＆　ＱｕＴｉｅ，　ＣＬＣ　ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，　ＣＮＶ－ｓｅｑ，　Ｅｌｖｉｒａ，　ＥＲＮＥ－ｍａｐ　（ｒＮＡ），　ＧＳＭａｐｐｅｒ，　Ｇｌｉｍｍｅｒ，　ｇｎｕｍａｐ，　Ｇｏｓｅｑ　，　ＩＣＡｔｏｏｌｓ，　ＬＯＣＡＳ，　ＭａｐＳｐｌｉｃｅ，　Ｍａｑ，　ＭＥＭＥ，　Ｍｏｓａｉｋ，　ＮＧＳＶｉｅｗ，　Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ，　ＯＳＬａｙ，　Ｐａｒｔｅｋ，　Ｐｅｒｍ，　Ｐｒｏｊｅｃｔｏｒ，　Ｑｐａｌｍａ，　ＲａｚｅｒＳ，　ＳＨＡＲＣＧＳ，　ＳＨＲｉＭＰ２，　ＳＮＰ－ｏ－ｍａｔｉｃ，　Ｓｐｌｉｃｅｍａｐ，　ＳＳＡＨＡ２，　Ｓｔａｍｐｙ，　Ｔａｂｌｅｔ，　ＴＭＡＰ，　Ｔｏｐｈａｔ，　Ｖｅｌｖｅでも行うことができる。
　１つの実施形態において、前記核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）の配列を決定する工程では、単一の配列決定により前記核酸配列が決定される。本発明の方法は、単一の配列決定を行うことにより、複数種類の配列決定を行うことにより生じ得るバイアスを低減または消滅させることができる。したがって、特に低頻度でしか生じないＴＣＲまたはＢＣＲのリードを正確に検出するのに有用である。
　別の実施形態において、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする。Ｃ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有するプライマーを用いることにより、どのようなＴＣＲまたはＢＣＲにおいても同様の増幅を行うことができ、非バイアスを達成することができる。
　別の実施形態において、前記単一の配列決定は、共通アダプタープライマーを用いて行われることを特徴とする。好ましい実施形態では、共通アダプタープライマーは、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、および／または、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度の融解温度（Ｔｍ）になるように設計される。さらに好ましくは、共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造をとらないよう設計され、ＢＣＲまたはＴＣＲを含む他の遺伝子に対して相同性がないものを選択される。具体的な実施形態では、共通アダプタープライマーは、Ｐ２０ＥＡ（配列番号２）および／またはＰ１０ＥＡ（配列番号３）である。
　１つの実施形態では、前記非バイアス的な増幅はＶ領域特異的な増幅ではないことを含む。Ｖ特異的なプライマーを用いたマルチプレックス等の工夫をして非バイアス的な増幅を行う場合に比べて、バイアスがさらに減少または消失させることができる。
　１つの実施形態において、本発明が対象とするレパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である。ＢＣＲは、変異が入りやすく、特にＶ領域に変異が多発するとされており、Ｖ領域特異的な増幅を用いた手法では、ＢＣＲレペトアの正確な分析は困難である。
　１つの局面において、本発明は、本発明のレパトア解析方法に基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する方法を提供する。
　本発明の疾患、障害または状態の分析方法において、本発明のレパトア解析方法に基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手法としては、疾患、障害、状態などの臨床情報と導出されたリードの種類、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列などから成るリードデータを連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートを使ってデータベース化することからはじまる。まず、導出した個々のリード配列について、１．ＮＫＴやＭＡＩＴなどの既知の機能を有するＴＣＲを検索する。２．既存の公共データベース内を検索し、抗原特異性などの機能が知られるＴＣＲあるいはＢＣＲと照合する。３．構築したデータベース内あるいは既存の公共データベース内で検索し、共通する試料の由来、特性あるいは機能から疾患、障害または状態と関連付ける。次に、試料中のリード配列について、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。
　１つの実施形態では、本発明の分析方法において、前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　別の実施形態では、本発明は、本発明の方法で決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける工程、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する工程を含む、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するための方法を提供する。
　１つの実施形態において、本発明の処置または予防するための方法において対象とされる被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　別の局面では、本発明は、データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析するためのシステム（解析システム）を提供する。このシステムは、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するための装置を備える。このようなシステムおよび本明細書で説明される１つまたは複数の更なる特徴を含むシステムを「本発明のレパトア解析システム」という。本発明のレパトア解析システムは、「本発明のレパトア解析法」を実現する。
　別の実施形態では、前記核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）の装置は単一の配列決定により前記核酸配列を決定することができるように構成される。
　別の実施形態では、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域と同一配列を有することを特徴とする。本発明のシステムは、単一の配列決定を行うことにより、複数種類の配列決定を行うことにより生じ得るバイアスを低減または消滅させることができる。したがって、本発明のシステムは、特に低頻度でしか生じないＴＣＲまたはＢＣＲのリードを正確に検出するのに有用である。
　別の実施形態において、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする。このようなプライマーは、この装置に備え付けられていてもよいし、キットに含まれていてもよく、別途提供されてもよい。Ｃ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有するプライマーを用いることにより、どのようなＴＣＲまたはＢＣＲにおいても同様の増幅を行うことができ、非バイアスを達成することができる。
　別の実施形態において、前記単一の配列決定は、共通アダプタープライマーを用いて行われることを特徴とする。このような共通アダプタープライマーは、この装置に備え付けられていてもよいし、キットに含まれていてもよく、別途提供されてもよい。好ましい実施形態では、共通アダプタープライマーは、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＴＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、および／または、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度の融解温度（Ｔｍ）になるように設計される。さらに好ましくは、共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造をとらないよう設計され、ＢＣＲまたはＴＣＲを含む他の遺伝子に対して相同性がないものを選択される。具体的な実施形態では、共通アダプタープライマーは、Ｐ２０ＥＡ（配列番号２）および／またはＰ１０ＥＡ（配列番号３）である。
　１つの実施形態では、本発明のキットが提供する核酸試料に含まれる核酸配列は、前記非バイアス的な増幅になされるところ、その増幅は、Ｖ領域特異的な増幅ではない。Ｖ領域特異的なプライマーを用いたマルチプレックス等の工夫をして非バイアス的な増幅を行う場合に比べて、バイアスをさらに減少または消失させることができる。
　１つの実施形態において、本発明のシステムの分析の対象となるレパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である。ＢＣＲは、変異が入りやすく、特にＶ領域に変異が多発するとされており、Ｖ領域特異的な増幅を用いた手法では、ＢＣＲレペトアの正確な分析は困難である。本発明のシステムを用いることによって、ＢＣＲレペトアも正確に分析することが可能になった。
　別の局面においては、本発明は、本発明の解析システムと、該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するシステム（分析システム）を提供する。本発明の分析システムの該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段は、疾患、障害、状態などの臨床情報と導出されたリードの種類、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列などから成るリードデータを連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートを使ってデータベース化することからはじまる。まず、導出した個々のリード配列について、１．ＮＫＴやＭＡＩＴなどの既知の機能を有するＴＣＲを検索する。２．既存の公共データベース内を検索し、抗原特異性などの機能が知られるＴＣＲあるいはＢＣＲと照合する。３．構築したデータベース内あるいは既存の公共データベース内で検索し、共通する試料の由来、特性あるいは機能から疾患、障害または状態と関連付ける。次に、試料中のリード配列について、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。
　１つの実施形態では、本発明の分析システムが分析することがでいる前記被験者の疾患、障害または状態として、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析システムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム（処置システムまたは予防システム）を提供する。
　本発明のシステムにおける被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段は、以下のような構成により実現することができる。すなわち、本発明の解析システムによって導出されたレパトアの情報を読み取り、これを、被験者の疾患、障害または状態に関する情報を読み取り、これらを関連付けることで実現することができる。導出されたリード集計データは、既存のリファレンス配列に対する照合作業からＶ領域、Ｊ領域、Ｃ領域がアサインされ、ＣＤＲ３配列が決定されている。Ｖ領域、Ｊ領域、ＣＤＲ３配列をもとに一致するリードを集計し、ユニークリード（他に同じ配列をもたないリード）別に、試料中に検出されたリード数および全リード数に占める割合（頻度）が算出される。この情報（リード配列、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列）と被験者の臨床情報（病歴、疾患名、病型、進行度、重症度、ＨＬＡ型、免疫状態など）を連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートあるいはデータベース化機能をもつソフトウェアを使ってデータベース化を行う。試料中のリード配列は、リード数や頻度でソートし、ランキング処理を行う。また、各Ｖ領域別あるいはＪ領域別にリード数を集計し、Ｖ領域使用頻度あるいはＪ領域使用頻度を算出する。これらの情報に基づいて、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段は、以下のような構成をとることができる。すなわち、定量性を示すデータと、処置、治療または予防に関するこれまでの情報または現在入手できる情報とを関連付け、その後の経過が改善するものの選択を実現することでこの選択手段の選択を実現することができる。
　１つの実施形態において、前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　（有用な細胞、ペプチド等）　１つの局面において、本発明は、ＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）もしくはこれをコードする核酸を含むＴＣＲα、および／またはＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）もしくはこれをコードする核酸を含むＴＣＲβを発現する、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）に関するモノクローナルなＴ細胞を提供する。
　この特定のＴ細胞は、実施例等で示されているように、種々の有用性を有する。例えば、ＴＣＲαにおいてＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）もしくはこれをコードする核酸、および／またはＴＣＲβにおいてＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）もしくはこれをコードする核酸は、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）の診断指標として使用することができることが示されている。このようなペプチドおよびこれをコードする核酸は、当該分野において公知の任意の手法を用いて検出することができる。本明細書において「検出剤」とは、広義には、目的の対象（例えば、ペプチド、核酸、細胞等）を検出することができるあらゆる薬剤をいう。例えば、そのような方法としては、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、マーカー検出剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat　Genet．2002　Dec；32　Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT－PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two－hybridシステム、in　vitro翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。
　本発明はまた、ＴＣＲαにおけるＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）またはこれをコードする核酸の検出剤、および／またはＴＣＲβにおけるＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）またはこれをコードする核酸の検出剤を含む、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）の診断薬を提供する。
　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。
　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
　従って、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、種々の活性を有する薬剤を検出、スクリーニングすることができることが理解される。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において「検出剤」とは、広義には、目的の対象（例えば、正常細胞（例えば、正常角膜内皮細胞）または形質転換細胞（例えば、形質転換角膜内皮細胞））を検出することができるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「診断剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を診断することができるあらゆる薬剤をいう。
　本発明の検出剤は、検出可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
　本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
　本明細書中で使用される用語「結合」は、２つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。結合または相互作用を測定することによって、本発明のマーカーの発現の度合い等を測定することができる。
　従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する（または結合する）「因子」（または、薬剤、検出剤等）とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
　本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用する（または結合する）ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用（または結合）としては、例えば、リガンド－レセプター反応、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素－基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質－脂質相互作用、核酸－脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター－リガンド反応による相互作用、酵素－基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用（または結合）が包含される。
　本明細書において「抗体」は、広義にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらのフラグメント、例えばＦｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、ならびにその他の組換えにより生産された結合体または機能的等価物（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（oligospecific）抗体、単鎖抗体、ｓｃＦＶ、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（single　chain　（Fv）2）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ）を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられる各種リードに対する抗体は、それぞれ、特定の各種リードに結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体の特定のリードへの結合は特異的な結合であることが好ましい。
　本明細書において「抗原」（antigen）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（immunogen）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
　本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいう。
　本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
　本発明の検出剤または診断剤あるいはその他医薬は、プローブおよびプライマーの形態を採ることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、特定のリードと特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に記載されるように、特定のリードの発現は例えば、大腸がんであるかどうかの指標であり、また、疾患の度合いの指標として有用である。
　本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
　通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子（例えば、本発明のマーカー）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。
　本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。
　本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
　本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。
　通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも約７０％相同な、より好ましくは、少なくとも約８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも約９０％相同な、少なくとも約９５％相同な核酸配列が含まれる。
　１つの実施形態において、本発明の検出剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤は、タグを結合させたものであってもよい。
　本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒが望ましい。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５との組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ－アセトキシ－Ｎ2－アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、AAIF（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
　本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体－リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカー検出剤にはこのようなタグを結合させてもよい。
　本発明の方法は、本発明の検出剤または診断剤を目的とする試料に接触させ、その試料中に目的とする対象であるリードまたはこれらのリードの遺伝子があるかどうか、あるいはそのレベルまたは量を測定することで実施することができる。
　本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、物質を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカー、検出剤、診断剤、リガンド等として機能しうるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
　別の局面では、本発明は配列番号１６２７～１６４７に示す配列のいずれかを含む、新規インバリアントＴＣＲであるペプチドを提供する。このようなペプチドは、インバリアントとして用い種々の指標（たとえば疾患等の指標）として活用することができる。
　さらに別の局面では、本発明は、配列番号１６４８～１６５１、１６５３～１６５４、１６６６～１６６７、１８４４～１８４８、および１８５１からなる群より選択されるの配列を含む、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞が保有するＴＣＲペプチド、およびこれらのペプチドをコードする核酸を提供する。このようなペプチドおよび核酸は、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）として用い種々の指標（たとえば疾患等の指標）として活用することができる。１つの具体的な実施形態では、本発明の粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞が保有するＴＣＲであるペプチド、およびこれらのペプチドをコードする核酸は、大腸がんの診断指標として使用することができる。
　別の局面では、本発明は、配列番号１６６８に示す配列を含む、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞が保有するＴＣＲであるペプチドおよびこのペプチドをコードする核酸を提供する。１つの具体的な実施形態では、本発明のＮＫＴが保有するＴＣＲであるペプチド、およびこれらのペプチドをコードする核酸は、大腸がんの診断指標として使用することができる。
　別の局面では、本発明は、配列番号１６５２、１６５５～１６６５、１６６９～１８４３、１８４９～１８５０、および１８５２～１８６０からなる群より選択される配列を含む、大腸がん特異的であるペプチドならびにこれらをコードする核酸を提供する。１つの具体的な実施形態では、これらのペプチドおよびこれらをコードする核酸は、大腸がんの診断指標として使用することができる。
　さらなる局面では、本発明は、配列番号１８６１～１８６５、および１８６７～１９０９からなる群より選択される配列を含む、大腸がん特異的であるペプチドならびにこれらをコードする核酸を提供する。１つの具体的な実施形態では、これらのペプチドおよびこれらをコードする核酸は、大腸がんの診断指標として使用することができる。
　別の局面では、本発明は、配列番号１６５２、１６５５～１６６５、１６６９～１８４３、１８４９～１８５０、および１８５２～１８６０、ならびに配列番号１８６１～１８６５、および１８６７～１９０９からなる群より選択される配列を含むペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸配列を有する、Ｔ細胞を高頻度に誘導した細胞集団、Ｔ細胞株、または組み換え発現させたＴ細胞を提供する。大腸がん特異的ＴＣＲのペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸配列、細胞、細胞集団、細胞株は、診断や治療に有用である。診断については、その配列が大腸がん患者にだけある、その配列が大腸がん患者で多い、あるいは同一患者のがん組織に集積していることを調べることで大腸がんを発見、病態や予後を予測することができる。治療については、大腸がん特異的配列をもつＴ細胞を高頻度に誘導した細胞集団、大腸がん特異的配列をもつＴ細胞株、大腸がん特異的配列を人為的に発現させたＴ細胞(リンパ球)を大腸がんの治療に利用することができる（参考文献として、1:　Uttenthal　BJ,　Chua　I,　Morris　EC,Stauss　HJ.　Challenges　in　T　cell　receptor　gene　therapy.　J　Gene　Med.　2012Jun;14(6):386-99.　doi:　10.1002/jgm.2637.　Review.　PubMed　PMID:　22610778.；2:Linnemann　C,　Schumacher　TN,　Bendle　GM.　T-cell　receptor　gene　therapy:　criticalparameters　for　clinical　success.　J　Invest　Dermatol.　2011　Sep;131(9):1806-16.doi:　10.1038/jid.2011.160.　Epub　2011　Jun　16.　Review.　PubMed　PMID:　21677669.；3:Lagisetty　KH,　Morgan　RA.　Cancer　therapy　with　genetically-modified　T　cells　forthe　treatment　of　melanoma.　J　Gene　Med.　2012　Jun;14(6):400-4.　doi:10.1002/jgm.2636.　Review.　PubMed　PMID:　22610729を参照）。したがって、本発明は、上記細胞集団、Ｔ細胞株またはＴ細胞を含む大腸がんの治療剤または予防剤を提供する。
　（応用）本発明を用いて、大規模シーケンスにより同定されたTCRまたはBCR遺伝子の塩基配列（リード）とその出現頻度をソフトウェア上で算出し、リストや分布あるいはグラフを描出できる。それら情報に基づいて、次のような様々な指標を使うことによりレパトアの変化を検出する。その変化に基づいて、疾患や障害との関連を明らかにすることができる。
　１つの局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、V遺伝子の使用頻度を検出する方法を提供する。各リードのV遺伝子を同定し、全体のTCRあるいはBCR遺伝子に占める各V遺伝子の割合を算出することができる。疾患や病態に関連したVの使用頻度の増加や減少を明らかにすることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、J遺伝子の使用頻度を検出する方法を提供する。各リードのJ遺伝子を同定し、全体のTCRあるいはBCR遺伝子に占める各J遺伝子の割合を算出することができる。疾患や病態に関連したJの使用頻度の増加や減少を明らかにすることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、サブタイプの頻度解析（BCR）の使用頻度を検出する方法を提供する。Ｃ領域の配列決定に基づいて、ＩｇＡ１，ＩｇＡ２、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４サブタイプの存在頻度を算出することができる。疾患や病態に関連した特定のサブタイプの増加や減少を明らかにすることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、CDR3配列長のパターンを分析する方法を提供する。各リードのもつＣＤＲ３塩基配列長を算出して、その分布を明らかにすることができる。正常なＴＣＲあるいはＢＣＲからは正規分布様のピークパターンを示すが、正常な分布より逸脱したピークを検出して、疾患や病態との関連を明らかにすることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、ＴＣＲあるいはＢＣＲのクローナリティを分析する方法を提供する。各リードのＶ配列、Ｊ配列およびＣＤＲ３配列に基づいて、同一配列を有するリードを分類し、そのコピー数を算出す。全体のリード数に占める各リードのコピー数の割合を算出し、高頻度に存在するリードの存在を明らかにすることができる。出現頻度により降順にソートして、高頻度に存在するリードの数や割合について正常試料と比較することでクローナリティの度合いを評価する。そのことから疾患や病態に関連するＴＣＲあるいはＢＣＲクローナリティの変化を調べる。特に、白血病細胞などの検出に用いることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、重複リードを抽出する方法を提供する。特定の疾患、病型、病態、組織、遺伝子型（ＨＬＡなど）に分類される試料のリードを検索し、試料間に重複するＴＣＲまたはＢＣＲリードを抽出する。そのことから疾患や障害の状態に関連するＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子を明らかにすることができる。自己免疫疾患の発症に関与する疾患特異的Ｔ細胞、疾患関連抗体を産生するＢ細胞、がん細胞を攻撃するがん特異的Ｔ細胞などの同定を行うことができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、疾患特異的TCRあるいはBCRクローンを検索する方法を提供する。特定の疾患や障害の状態に関連づけられたTCRあるいはBCRリードを、試験試料において検索し、その出現や消失、あるいは増加や減少を明らかにすることで、疾患の発症や病態の進行あるいは改善を予測することができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、多様性指数を使って対象を分析する方法を提供する。あるいは、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、多様性指数を使って対象を分析を支援する方法を提供する。ＣＤＲ３配列に基づいて同定されたリード配列をカウントし、リードの種数、個体数を算出し、ＴＣＲあるいはＢＣＲレパトアの多様性について指数化する。Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒの多様性指数（Ｈ’）、Ｓｉｍｐｓｏｎの多様性指数（λ、１－λあるいは１／λ）、Ｐｉｅｌｏｕ均等度指数（Ｊ’）あるいはＣｈａｏ１指数などを用いて、正常試料と対比することで多様度を評価する。骨髄移植後の免疫系の回復度を測る指標として利用することができる。また、造血器腫瘍に伴う免疫系細胞の異常を検出する指標として利用できる。
　１つの実施形態では、多様性指数を使った対象の分析方法では、骨髄移植後の免疫系の回復度を測る指標、または、造血器腫瘍に伴う免疫系細胞の異常を検出する指標として前記多様性指数を使用する。このような多様性指標を用いた分析は、従来のシステムでは困難であった。
　本明細書において、種々の多様性指標は、サンプル数、リードの種類、リード数のデータから、ＥＸＣＥＬスプレッドシート、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳ（Colwell, R. K.　et al. Journal of Plant Ecology 5:3-21.）あるいはＲパッケージ（ｖｅｇａｎ）等のソフトウェアを用いて算出することができる。Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒの多様性指数（Ｈ’）、Ｓｉｍｐｓｏｎの多様性指数（λ、１－λあるいは１／λ）、Ｐｉｅｌｏｕ均等度指数（Ｊ’）あるいはＣｈａｏ１指数は次に示す数式により求める。Ｎ：　全リード数、ｎｉ：リードｉにおけるリード数Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｅａｖｅｒ　ｉｎｄｅｘ　Ｈ’
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ　ｉｎｄｅｘ　λ
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Ｉｎｖｅｒｓｅ　Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ　ｉｎｄｅｘ
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
Ｐｉｅｌｏｕ’ｓ　Ｊ
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
ＳＣｈａｏ１Ｓｏｂｓ：全リード種数、Ｆ１：シングルトンリード、Ｆ２：ダブルトンリード
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、類似性指数を使って対象を分析する方法。あるいは、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、類似性指数を使って対象を分析を支援する方法を提供する。ＣＤＲ３配列に基づいて同定されたリード配列の種数、個体数を算出し、比較する試料間のＴＣＲあるいはＢＣＲレパトアの類似度を明らかにする。Ｍｏｒｉｓｉｔａ―Ｈｏｒｎ指数、木元のＣπ指数あるいはＰｉａｎｋａのα指数を用いて、試料間の類似度を明らかにします。ＨＬＡ型一致あるいは不一致間のレパトアの類似度の評価、骨髄移植後のレシピエントとドナー間のレパトアの類似度の評価などに利用することができる。
　１つの実施形態では、ＨＬＡ型一致あるいは不一致間のレパトアの類似度の評価、骨髄移植後のレシピエントとドナー間のレパトアの類似度の評価として前記類似性指数を使用する。このような類似性指数を用いた分析は、従来のシステムでは困難であった。種々の類似性指数は以下の数式を用いて、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳ（Colwell, R. K.　et al. Journal of Plant Ecology 5:3-21.）あるいはＲパッケージ（ｖｅｇａｎ）を用いて算出することができる。Ｍｏｒｉｓｉｔａ―Ｈｏｒｎ指数、木元のＣπ指数あるいはＰｉａｎｋａのα指数は次に示す数式により求める。Ｍｏｒｏｓｉｔａ－Ｈｏｒｎ指数Ｘｉ：片方のサンプルに由来する全Ｘリードに出現するリードｉの回数ｙｉ：もう一方のサンプルに由来する全Ｙリードに出現するリードｉの回数Ｓ：ユニークリード数
木元のπ指数
　
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
Ｐｉａｎｋａのα指数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うための試料の調整を行うことができる。これらのシークエンシング技術は、妥当なコストで、試料から100万またはそれ以上のリードを得ることができる。1/1,000,000またはそれよりも低い頻度で存在する遺伝子型でさえ、これらの技術を用いて特異的様式で、しかもバイアスのかかっていない様式で検出することができる。血液または骨髄等のDNA由来の試料から、遺伝子または転写物の特定部分の配列の異なる型をすべて増幅するための非バイアス増幅方法が達成される。
　＜がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法＞
　１つの局面では、本発明は、被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法を提供する。この方法は、（１）本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；および（４）決定されたペプチドを合成する工程を包含する。ここで合成されたペプチドは、がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用することができる。この方法は、本明細書において「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」と呼ばれることがある。
　がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法では、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。例えば、手短には、（１）血液腫瘍を罹患したがん患者末梢血細胞を採取し、リンパ球細胞を分離し、その後、本発明のレパトア解析法を実施することができ、そして、これを用いてがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法を行うことができる。　別の実施形態では、Ｔ細胞系腫瘍の場合はＴＣＲ、Ｂ細胞系腫瘍の場合はＢＣＲについて本発明のレパトア解析法を実施することができる。そして、その後、ＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列を該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択し、該ＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域を含む配列から別途決定した該がん患者のヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）に結合するペプチドを、ＨＬＡ結合ペプチド予測プログラム（本明細書においてほかにも説明されているように任意の公知のプログラムを用いることができる）を用いて予測する。そして、ＨＬＡ結合ペプチドをペプチド合成装置により合成し、その後、以下を行う。オーダーメイドペプチド感作ＣＴＬ療法の場合は、患者末梢血単核球細胞を採取し、単核球細胞あるいは患者由来抗原提示細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を混合したものに該ペプチドを添加して培養し、抗原ペプチドによる刺激を行なうことができる。
　オーダーメイドペプチド感作ＣＴＬ療法の場合は、該ペプチド刺激リンパ球細胞を患者に移入し、ＣＴＬ療法を行うことができる。
　あるいは、オーダーメイドペプチド感作ＤＣワクチン療法の別法として、患者末梢血単核球細胞を採取した後、単球細胞を分離し、分化誘導因子の存在下で樹状細胞（ＤＣ）に分化誘導した後に、該ペプチドを添加して培養し、該ペプチド感作樹状細胞を患者に移入し、樹状細胞療法を行っても実現することができる。
　がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法は例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。特に、腫瘍細胞を標的とした抗体療法などを行なう場合、腫瘍細胞に標的抗原が発現していない、あるいは標的抗原が正常細胞にも発現することで問題となる。それと比し、腫瘍細胞に特異的な配列を選択して利用するため、より特異性の高い、副作用の少ない治療が期待される。
　１つの実施形態では、本発明における（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＰまたはＮｅｔＭＨＣを用いて決定される。
　別の実施形態では、本発明は、本発明における（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程を包含する。これは、改良型ＣＴＬ法とも呼ばれる。
　改良型ＣＴＬ法では、例えば、既存の抗ＣＤ３抗体やＩＬ－２による広範なＴ細胞の活性化とは異なり、抗原ペプチドを利用したＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原特異性の付与により、より特異性が高く副作用の少ない治療が期待できる。また、該患者の腫瘍細胞から得られた情報をもとに作成した個別化ペプチドを利用するため、高い治療効果が期待できるのが特徴である。
　改良型ＣＴＬ法では例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。
　別の実施形態では、本発明は、本発明の（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程を包含する。これは、ＤＣワクチン療法とも呼ばれる。
　ＤＣワクチン療法では、例えば、該患者由来の腫瘍細胞から得られた配列情報をもとに個別化ペプチドを作出するため、正常細胞には作用せず、腫瘍細胞により特異的に作用して、高い治療効果が見込める。抗原としてペプチドを用いるため、蛋白とは異なり容易に化学合成することができる利点がある。
　ＤＣワクチン療法では例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる）。
　別の実施形態では、本発明は、本発明の（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞－ペプチド混合物を生産する工程を包含する。これは、患者自己免疫細胞療法とも呼ばれる。
　患者自己免疫細胞療法では、例えば、ＣＴＬ療法同様に該患者由来のペプチドによるＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激活性化とともに、樹状細胞のペプチド感作も行なうことになる。該患者由来のＣＤ８＋細胞と樹状細胞を共に患者に移入することにより、特異性を付与したＣＴＬによる急性効果と抗原提示細胞として利用した樹状細胞による持続的効果の相乗効果が期待できるのが特徴である。
　患者自己免疫細胞療法では例えば、血液がん（白血病等）、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。
　別の局面において、本発明は、被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法を付与する方法を提供する。この方法は、（１）本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；（４）決定されたペプチドを合成する工程；必要に応じて（５）合成したペプチドを用いて治療を行う工程を包含する。この方法は、治療剤を製造する方法および治療自体を行う方法の両方を包含する。医療行為を除く場合は、（５）の前までの工程で完了させることができる。
　好ましい実施形態では、本発明では、前記（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＰまたはＮｅｔＭＨＣを用いて決定される。
　ＢＩＭＡＳとは、www-bimas.cit.nih.gov/で提供されるＨＬＡペプチド結合の推定プログラムである。
　ＳＹＦＰＥＩＴＨＩとは、www.syfpeithi.de/で提供される、ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのデータベースおよび検索エンジンである。
　ＲＡＮＫＰＥＰとは、http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.htmlで提供される、クラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣ分子に対するペプチド結合の予測プログラムである。
　ＮｅｔＭＨＣとはwww.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/で提供される、多数のＨＬＡ対立遺伝子に対するペプチドの結合を予測するプログラムサーバーである。
　好ましい実施形態では、改良型ＣＴＬ法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程、および該培養後の混合物を患者に投与する工程を包含する。
　好ましい実施形態では、ＤＣワクチン療法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程、および該培養された混合物を患者に投与する工程を包含する。
　好ましい実施形態では、患者自己免疫細胞療法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞－ペプチド混合物を生産する工程を行い、該ＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物、および該樹状細胞－ペプチド混合物を患者に投与する工程を包含する。
　＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞
　別の局面において、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離技術を提供する。したがって、本発明は、（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または本発明の「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程を包含する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法を提供する。このようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
　このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。
　１つの実施形態では、以下のように実施することができ、例えば、（１）がん患者から腫瘍細胞を摘出する。（２）該患者由来腫瘍細胞を破砕後、単一細胞に分離し、マイトマイシンＣなどの化学処理や放射線照射により不活化処理をする。（３）該がん患者の全血より末梢血細胞を分離する。（４）末梢血細胞の一部を未処理コントロール試料として、細胞よりＲＮＡを抽出する（５）不活化腫瘍細胞と末梢血細胞を混合し、培養することにより腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化し、増殖させる。（６）活性化後、末梢血細胞を回収し、刺激後試料として、細胞よりＲＮＡを抽出する。（７）（４）及び（６）で抽出したＲＮＡ試料から本発明のレパトア解析法を実施する。（８）コントロール試料に比し刺激試料で大きく増加したＴＣＲ遺伝子を抽出し、それらをランキングした後に、上位のＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子を選択する。（９）これらの全長ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクターに導入する。（１０）これらＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子発現レトロウイルスベクターから遺伝子導入用ウイルスを作成する。（１１）該患者より採取したリンパ球にＴＣＲα、ＴＣＲβを単独で、続けて感染させることにより形質転換する、あるいはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両遺伝子を含む遺伝子発現レトロウイルスベクターを作成することにより、一度に両遺伝子を形質転換する。（１２）細胞表面におけるＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの発現を確認する。（１３）目的のＴＣＲα／ＴＣＲβを発現する腫瘍特異的患者リンパ球を患者に細胞移入することによって、単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いた治療を実現することができる。
　具体的には、本発明の実施形態において、例えば、血液腫瘍の場合は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」に記載の方法で決定したＴＣＲまたはＢＣＲを抗原もしくはペプチドとして使用することができる。ここでは任意のがん抗原や患者由来の不活化がん組織が想定されるが、代表的に以下の方法が利用され得る：任意の抗原タンパク質または任意の抗原ペプチド、Ｔリンパ球と抗原提示細胞を混合する方法；被験者由来リンパ球と被験者由来不活化がん細胞を混合する方法；「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において提供されるレパトア解析より決定されたＴＣＲまたはＢＣＲ由来のペプチド、Ｔリンパ球と抗原提示細胞を混合する方法が提供される。
　したがって、１つの実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程を含む。
　さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
　さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
　このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いた治療は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
　さらなる局面では、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離を提供する。したがって、本発明は、（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体から単離されたリンパ球またはがん組織を提供する工程；（Ｂ）該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程を包含する、共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法を提供する。このような共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子は、種々のがんの治療および予防に用いることができる。この方法は、「本発明のオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法」とも呼ばれる。
　このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。１つの実施形態では、まず、（１）ＨＬＡが同一のがん患者から腫瘍細胞を摘出または末梢血を分離する。（２）腫瘍細胞浸潤Ｔ細胞を含む腫瘍組織、あるいはリンパ球細胞を用いてレパトア解析を行なう。（３）各試料においてその存在頻度に基づいてランキングし、末梢血細胞に比し腫瘍細胞で高い存在頻度を示した腫瘍特異的Ｔ細胞を選択する。（４）それら腫瘍特異的Ｔ細胞について、複数のＨＬＡ一致がん患者で共通する配列を検索する。（５）最も多くの癌患者で共通する腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を治療用腫瘍特異的ＴＣＲとして選択する。（６）これらの全長ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクターに導入する。（７）これらＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子発現レトロウイルスベクターから遺伝子導入用ウイルスを作成する。（８）該患者より採取したリンパ球にＴＣＲα、ＴＣＲβを単独で、続けて感染させることにより形質転換する、あるいはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両遺伝子を含む遺伝子発現レトロウイルスベクターを作成することにより、一度に両遺伝子を形質転換する。（９）細胞表面におけるＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの発現を確認する。（１０）目的のＴＣＲα／ＴＣＲβを発現する腫瘍特異的患者リンパ球を患者に細胞移入することによって、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子を用いた治療を実現することができる。
　このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子を用いた治療は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
　したがって、別の局面では、本発明は、（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球またはがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程を包含する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法を提供する。このようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
　したがって、このｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法の１つの実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程を含む。
　さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
　さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
　さらに別の局面では、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離技術を提供し、（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体からリンパ球またはがん組織を単離する工程；（Ｂ）該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法によって解析する工程；および（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程を包含する、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離する方法を提供する。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
　＜細胞加工療法＞
　さらなる局面において、本発明は、細胞加工療法を提供する。詳細には、本発明は、A)患者から採取されたＴリンパ球を提供する工程；B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程； およびＤ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を調製する方法を提供する。この腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
　このような腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。例えば、＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞あるいは＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞で記載された方法により腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を用いることができる。
　したがって、本発明の細胞加工療法において、抗原として任意のがん抗原またはがんペプチドを製造もしくは合成によって生産し、採取された不活性化患者がん細胞を利用することができ、あるいは腫瘍由来イディオタイプペプチドを利用することができる。選択方法としては、がん組織で高発現する抗原を選択する、あるいは患者ＨＬＡ型に結合するペプチドを抗原として選択することができる。
　好ましい実施形態では、本発明の細胞加工療法では、最適抗原として、例えば、（１）患者がん組織に高発現する抗原、（２）抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原、（３）抗原刺激前後のレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる、抗原を選択することが想定され得るがこれらに限定されない。また、（３）抗原刺激前後のレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる例において最も増加したＴＣＲを最適ＴＣＲとして選択する方法なども想定することができる。また、代表的な例としては、最適ＴＣＲ候補を患者リンパ球に人為的に遺伝子導入し、実際の患者がん組織に最も高い反応性を示したものを最適ＴＣＲとして選択することができる。
　このような腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
　したがって、１つの実施形態では、本発明の方法の抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる。
　別の実施形態では、本発明のの抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる。
　別の実施形態では、本発明の方法の抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる。
　別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む。
　別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む。
　別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、抗原刺激前後において本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む。
　１つの特定の実施形態では、本発明は、「本発明のオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法」で単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および／または安全性評価を行う方法を提供する。
　有効性は、例えば、がん特異的ＴＣＲ遺伝子を導入したＴ細胞と被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる抗原刺激がなされた該被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされ抗原刺激がなされたような該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによって抗原刺激がなされた腫瘍由来イディオタイプペプチドと培養した後に、Ｔ細胞の活性化に応じて細胞外に分泌されるサイトカイン（インターフェロンγ等）量を測定する、Ｔ細胞の活性化に応じて上昇する特定の遺伝子の発現量を測定する、あるいはＴ細胞の活性化に応じて発現または発現増加する細胞表面分子を測定することで、有効性を評価することができる。
　＜安全性＞例えば、がん特異的ＴＣＲ遺伝子を導入した前記被験者に由来するＴ細胞と該被験者に由来する正常細胞を混合した場合に、上記Ｔ細胞の活性化に応じて分泌されるサイトカイン、遺伝子発現、あるいは細胞表面分子の発現を測定し、該ＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞が正常細胞により活性化されないことを確認することにより安全性を評価することができる。
　１つの実施形態では、有効性および／または安全性評価の具体的なステップは以下のように実現することができる。すなわち、例えば、（１）レトロウイルス遺伝子発現系を用いて腫瘍特異的ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子導入Ｔリンパ球細胞を作出する。（２）有効性を評価する場合、患者由来の癌細胞を摘出・分離し、不死化処理を行なった後、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球と混合培養する。（３）上記培養細胞を用い、細胞増殖試験（チミジン取込試験、ＭＴＴ試験あるいはＩＬ－２産生試験など）を行うことにより、腫瘍細胞に対する反応性を定量的に評価し、より強く腫瘍細胞に反応するＴＣＲ遺伝子を選択することができる。（４）安全性を評価する場合、対照となる既存の細胞株、患者癌細胞を含んでいない正常組織（腫瘍摘出の過程で採取される正常組織の一部）、あるいは固形腫瘍の場合は患者末梢血細胞を用いて不死化処理を行なった後、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球と混合培養する。（５）上記培養細胞を用い、細胞増殖試験（チミジン取込試験、ＭＴＴ試験あるいはＩＬ－２産生試験など）を行うことにより、腫瘍細胞に対する反応性を定量的に評価し、正常細胞に対し反応性を示さないＴＣＲ遺伝子を選択することができる。
　したがって、別の局面では、本発明は、A)患者からＴリンパ球を採取する工程；B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程； Ｄ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程；E)該腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を該患者に導入する工程；を包含する細胞加工療法を提供する。
　得られた腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を該患者に導入する工程を実施する方法は以下：Ａ）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を製造する工程；Ｂ）腫瘍特異的ＴＣＲαおよびＴＣＲβの発現を確認する工程；Ｃ）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を静脈から点滴移入する工程を包含する。
　したがって、１つの実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、抗原刺激前後において本発明のレパトア解析法に基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む。
　＜ＢＣＲレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離＞
　一つの実施形態として、本発明のレパトア解析法を用いてＢＣＲ遺伝子レパトア解析を行い、以下に記載の方法で標的抗原に特異的なヒト型抗体を迅速に取得することができる
（Ａ）標的となる抗原タンパクまたは抗原ペプチドをマウスに免疫し、該マウスより抗体産生Ｂ細胞を含む細胞集団（例えば脾臓、リンパ節、末梢血細胞）を分離し、本発明のレパトア解析法によるＢＣＲレパトア解析により免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を解析する方法
（Ａ１）免疫するマウスが抗体多様性を維持したまま完全ヒト抗体を産生することができるＫＭマウスであるＡの方法
（Ａ２）免疫するマウスがNOD/scidマウスにIL-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを交配して作製された重度な複合型免疫不全を呈するNOG(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull)マウスにヒト幹細胞を移植して作製されたヒト化マウスであるＡの方法
（Ｂ）対照マウスと免疫マウス、あるいは抗原免疫前と後のマウス由来の試料から得られた免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子配列とその頻度を比較する
（Ｃ）免疫マウスで強く発現する、あるいは免疫後に増加する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を同定する
（Ｄ）Ｃの工程から選択した免疫グロブリン重鎖と軽鎖遺伝子を選択し、１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法
（Ｅ）Ｄの工程で作製した免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子発現ベクターをＣＨＯ（Chinese HamsterOvary）などの真核細胞に導入し、細胞培養を行う
（Ｆ）遺伝子組換え細胞により産生、分泌された抗体分子を分離・精製し、標的抗体タンパクあるいはペプチドに対する特異性を検証する
上記Ａ－Ｆの工程により、動物由来の抗体遺伝子を取得した後にヒト抗体とのキメラ型抗体あるいはヒト化抗体に改変することなく、直接的かつ迅速に抗原特異的ヒト型抗体を取得する方法であり、ヒト型抗体から成る抗体医薬品の開発と製造に用いることができる。
　この実施形態で用いられるKMマウスについては、Ishida　I,　Tomizuka　K,　Yoshida　H,　Tahara　T,　Takahashi　N,　Ohguma　A,　Tanaka　S,　Umehashi　M,　Maeda　H,　Nozaki　C,　Halk　E,　Lonberg　N.　Production　of　human　monoclonal　and　polyclonal　antibodies　in　TransChromo　animals.　Cloning　Stem　Cells.　2002;4(1):91-102.　Review.を参照することができ、NOGマウスについては、Ito　M,　Hiramatsu　H,　Kobayashi　K,　Suzue　K,　Kawahata　M,　Hioki　K,　Ueyama　Y,　Koyanagi　Y,　Sugamura　K,　Tsuji　K,　Heike　T,　Nakahata　T.　NOD/SCID/gamma(c)(null)　mouse:　an　excellent　recipient　mouse　model　for　engraftment　of　human　cells.　Blood.　2002　Nov　1;100(9):3175-82.を参照することができ、CHO細胞/抗体産生については、Jayapal　KP,　Wlaschin　KF,　Hu　W-S,　Yap　MGS.　Recombinant　protein　therapeutics　from　CHO　cells-20　years　and　counting.　Chem　Eng　Prog.　2007;103:40?47.；Chusainow　J,　Yang　YS,　Yeo　JH,　Toh　PC,　Asvadi　P,　Wong　NS,　Yap　MG.　A　study　of　monoclonal　antibody-producing　CHO　cell　lines:　what　makes　a　stable　high　producer?　Biotechnol　Bioeng.　2009　Mar　1;102(4):1182-96を参照することができる。
　＜ＢＣＲレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離＞
一つの実施形態として、当該ＢＣＲ遺伝子レパトア解析法を利用して、以下に記載の方法で標的抗原に特異的なヒト型抗体を迅速に取得することができる
（Ａ）標的となる抗原タンパクまたは抗原ペプチドをマウスに免疫し、該マウスより抗体産生Ｂ細胞を含む細胞集団（例えば脾臓、リンパ節、末梢血細胞）を分離し、ＢＣＲレパトア解析法により免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を解析する方法
（Ａ１）免疫するマウスが抗体多様性を維持したまま完全ヒト抗体を産生することができるＫＭマウスであるＡの方法
（Ａ２）免疫するマウスがNOD/scidマウスにIL-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを交配して作製された重度な複合型免疫不全を呈するNOG(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull)マウスにヒト幹細胞を移植して作製されたヒト化マウスであるＡの方法
（Ｂ）対照マウスと免疫マウス、あるいは抗原免疫前と後のマウス由来の試料から得られた免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子配列とその頻度を比較する
（Ｃ）免疫マウスで強く発現する、あるいは免疫後に増加する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を同定する
（Ｄ）Ｃの工程から選択した免疫グロブリン重鎖と軽鎖遺伝子を選択し、１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法
（Ｅ）Ｄの工程で作製した免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子発現ベクターをＣＨＯ（Chinese HamsterOvary）などの真核細胞に導入し、細胞培養を行う
（Ｆ）遺伝子組換え細胞により産生、分泌された抗体分子を分離・精製し、標的抗体タンパクあるいはペプチドに対する特異性を検証する
上記Ａ－Ｆの工程により、動物由来の抗体遺伝子を取得した後にヒト抗体とのキメラ型抗体あるいはヒト化抗体に改変することなく、直接的かつ迅速に抗原特異的ヒト型抗体を取得する方法であり、ヒト型抗体から成る抗体医薬品の開発と製造に用いることができる。
　これらの方法の実施形態としては以下を挙げることができる。その一例として、
１．ＫＭマウスに実験的自己免疫性脳脊髄炎の抗原ペプチドであるMyelinOligodendrocyte Glycoprotein(MOG35-55, MOG)を免疫する。等量の2mg/mL MOGペプチドと完全フロイントアジュバントを混合し、エマルジョンを作成し、200μgのMOGを皮下に免疫し、同時に400ngの百日咳毒素を腹腔に免疫する。対PBSと完全フロイントアジュバントによる免疫を行い、対照マウスとする。
２．初回免疫後2日目に400ngの百日咳毒素を免疫し、免疫後10日目に発症を確認した後、脳脊髄炎発症マウスより脾臓を摘出する。
３．発症マウスと対照マウスの脾臓を用いて、次世代BCRレパトア解析を実施する。IgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖について、個々のBCR配列の出現頻度の集計とランキングを行う。
４．対照ウスに比し、発症マウスにおいて出現頻度が大きく増加したBCR配列を抽出し、ランキングする。これら抗体投与によって誘導されたBCR配列のランキング上位のものの組み合わせについて、MOG特異的抗体遺伝子として同定する。
５．発症マウスから増幅したBCR遺伝子増幅産物からPCR-cloning法により全長ヒト免疫フロブリン配列をクローニングする。抗体発現用ベクターにIgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のそれぞれをクローニングする。１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法がある。
６．これら構築した発現ベクターでリポフェクタミン３０００（Life Science）を用いてＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞を形質転換し、IgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を導入する。
７．CHO細胞培養液を回収し、ProteinAアフィニティーカラムによる精製、ゲル濾過による濃縮により、分泌された抗体蛋白を回収する。
８．回収した抗体を用いたELISAアッセイにより、MOG35-55またはMOG蛋白に対する結合活性を測定し、抗体の特異性を検証する。
９．十分な特異性が得られたら、抗体発現安定発現細胞株を取得し、大量培養系によりヒト型抗MOG抗体を製造する。
　（本発明のペプチド、治療）
　本発明のペプチドまたはそれをコードする核酸は、免疫療法に用いることができる。以下に説明する。
　本発明が提供するペプチドは、腫瘍形成に関連する抗原に由来するものであり、かつMHC (HLA)クラスII分子に十分に結合してヒトの白血球の免疫応答、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD4陽性Tリンパ球、特にCD4陽性Tリンパ球がもたらすTH1-型の免疫応答を起動する能力を有するものでありうる。
　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、
本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、2’－O－メチル－リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’－P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC－5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC－5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC－5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine－modified　cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’－O－プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’－メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzeret al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossoliniet al., Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)）。本明細書に
おいて「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
　本発明は、同定されたペプチドのほか、その改変体を用いてもよい。そのような改変体としては、同定されたペプチドに相同性を有するものが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でDNA配列が、代表的には少なくとも50％同一である場合、好ましくは少なくとも70％同一である場合、より好ましくは少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本発明の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。
　アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC－IUB BiochemicalNomenclature Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST2.2.28（2013.4.2発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
　本発明の一実施形態において「数個」は、例えば、10、8、6、5、4、3、または2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。1または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Market al., ProcNatl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al.,Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun29;224(4656):1431-1433.）。欠失等がなされた抗体は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、または抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばKOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.)を使用できる。欠失等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、FACS解析やELISA等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
　本発明の一実施形態において「90％以上」は、例えば、90、95、96、97、98、99、または100％以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、2つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えば、BLAST、GENETYX等)。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りNCBIのBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Blastpをデフォルト設定で使用できる。測定結果はPositivesまたはIdentitiesとして数値化される。
　本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0．7～1．0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1～2倍濃度のSSC（saline-sodiumcitrate）溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウムである）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v/v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、または(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,(1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５～６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、MolecularCloning2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNACloning1:Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, OxfordUniversityPress(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌ．１、７．４２－７．４５　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０－５０°Cでの、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ－６×ＳＳＣ（または約４２°Cでの約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０°C、０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本発明において使用されるポリペプチドには、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
　本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。
　本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがn）に対して、1～n－1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20
、25、30、40、50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、11など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、11など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーまたは標的分子として機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーまたは標的分子としての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
　本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson& Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA85:2444-2448(1988)）、Smith and Waterman法（Smithand Waterman,J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman and Wunsch法（Needlemanand Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムDNAをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、PCRおよびinsituハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
　本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば1～30個、好ましくは1～20個、より好ましくは1～9個、さらに好ましくは1～5個、特に好ましくは1～2個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のアミノ酸配列において1または複数個（好ましくは1もしくは数個または1、2、3、もしくは4個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、1または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象をいう。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、70％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、脳マラリア）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。
　本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、脳マラリア等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいい、本発明が提供するような阻害剤（例えば、抗体）をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。
　本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、脳マラリア）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、脳マラリア等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
　本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、脳マラリア等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
　本発明は、腫瘍形成に関連する抗原に由来し、かつMHC(HLA)クラスI分子に十分に結合してヒトの白血球、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD8 陽性細胞傷害性Tリンパ球の免疫応答を起動する能力を有するペプチドも提供し、かつまた、がん患者のワクチン接種として特に有用な2つのペプチドの組み合わ せも提供する。
　本発明のペプチドは、腫瘍関連抗原、特に例えばタンパク質分解、血管形成、細胞成長、細胞周期制御、細胞分裂、転写調節、組織浸潤などにおける機能を持つ腫瘍関連抗原に由来しうる。
　ペプチドは化学合成が可能であり、製薬の有効医薬成分として使用可能であるので、本発明が提供する該ペプチドは免疫療法、好ましくはがんの免疫療法に使用可能である。
　本発明の医薬組成物は、効果を増すための追加的ペプチドおよび／または賦形剤をさらに含むが、これについて以下にさらに説明する。
　本発明の医薬組成物は本発明において同定されたペプチドを含みうるものであり、そのペプチドは8から100個のアミノ酸、好ましくは8から30個のアミノ酸、最も好ましくは8から16個のアミノ酸を全長として有する。
　加えて、より強力な免疫応答を引き出すために、安定性および／またはMHC分子への結合を改善するよう、該ペプチドまたは改変体をさらに修飾することがで きる。 そのようなペプチド配列の最適化の方法は当業者に周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入を含む。したがって、本発明の別の実施形態では、医薬組成物を提供し、この医薬組成物において、その少なくとも1つのペプチドまたは改変体は非ペプチド結合を含む。
　逆ペプチド結合におけるアミノ酸残基は、ペプチド(-CO-NH-)により結合されておらず、そのペプチド結合は逆になっている。 そのようなレトロ-インバースペプチド模倣薬は、当業者に周知の方法を用いて作ることができ、例えば、ここに参照として組み込むMeziere et al(1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記述されている方法がある。このアプローチには、バックボーンが関与する変更を含むが側鎖の配向は関与しない擬ペプチドの作成が関与する。 Meziereら(1997) は、MHCおよびＴヘルパー細胞応答にこれら擬ペプチドが有用であることを示している。 CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含むレトロ-インバースペプチドは、タンパク質分解に対する抵抗力がはるかに強い。
　非ペプチド結合とは、例えば、-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、 -CH(OH)CH2-、-CH2SO-である。 米国特許第4,897,445号は、ポリペプチド鎖にある非ペプチド結合 (-CH2-NH)の固相合成の方法を提供しており、これには標準的手順により合成するポリペプチドと、アミノアルデヒドとアミノ酸をNaCNBH3存在下で反応させて合成する非ペプチド結合が関与する。
　本発明の配列を有するペプチドは、例えばそれらペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、および／またはアフィニティを強めるために、それらのアミノ末端および／またはカルボキシ末端にある追加的な化学基と合成できる。 例えば、該ペプチドのアミノ末端に、カルボベンゾキシル基、ダンジル基、またはｔ-ブチルオキシカルボニル基のような疎水性の基を加えることができる。 同様に、該ペプチドのアミノ末端に、アセチル基または9－フルオレニルメトキシーカルボニル基を置くことができる。 加えて、例えば前記の疎水性の基であるｔ-ブチルオキシカルボニル基またはアミド基を該ペプチドのカルボキシ末端に加えることができる。
　さらに、本発明で用いられるペプチドは、それらの立体配置を変えるように合成することができる。例えば、該ペプチドの１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基のD-異性体を、通常のL-異性体の代わりに使用することができる。 またさらに、本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を、周知の非天然アミノ酸残基の１つと置換することができる。これらのような改変は、本発明のペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、および／または結合作用を増す働きをすることができる。
　同様に、本発明で用いられるペプチドの合成の前または後に特定のアミノ酸を反応することにより、本発明のペプチドまたは改変体を化学修飾することができる。そのような修飾の例は当該技術分野で周知であり、例えば、この参照によりここに組み込まれるR. Lundblad, ChemicalReagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005に要約されている。 アミノ酸の化学修飾として、アシル化、アミジン化、リシンのピリドキシル化、還元的アルキル化、2, 4, 6-トリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンゼン化、カルボキシル基のアミド修飾および過ギ酸によるスルフィドリル修飾、システインからシステイン酸への酸化、水銀誘導体の生成、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの生成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドとのカルボキシメチル 化、およびアルカリｐＨでのシアン酸塩とのカルバモイル化による修飾を含むが、これらに限定されない。これに関し、当業者は、Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley& Sons NY 1995-2000) により、 タンパク質の化学修飾に関するより広範な方法論を参照できる。例えばタンパク質のアルギニン残基の修飾は、フェニルグリオキサル、2,3-ブタンジオン、および1,2-シクロヘキサンジオンのような隣接ジカルボニル化合物の反応に基づく付加物の形成であることが多い。別の例は、メチルグリコサルとアルギニン残基の反応である。システインは、リシンおよびヒスチジンのような他の求核的部位の同時修飾なしに修飾することができる。そのため、システインの修飾には多数の試薬を利用可能である。具体的な試薬の情報は、Pierce ChemicalCompany、Sigma-Aldrich、および他のウェブサイトに提供されている。
　本発明で用いられるタンパク質におけるジスルフィド結合の選択的還元もよく行われる。ジスルフィド結合は、バイオ医薬の熱処理の間に形成および酸化することができる。WoodwardのReagentKを用いて、特定のグルタミン酸残基を修飾することができる。N-(3-(ジメチルアミノ)プロピル)-N'-エチルカルボジイミドを用いて、リシン残基とグルタミン酸残基の間に分子内クロスリンクを形成することができる。例えば、ジエチルピロカルボナートは、タンパク質内のヒスチジル残基を修飾する試薬である。ヒスチジンも、4-ヒドロキシ-2-ノネナールを用いて修飾することができる。リシン残基と他のαアミノ基の反応は、例えば、ペプチドと表面の結合またはタンパク質/ペプチドのクロスリンクに有用である。リシンはポリ(エチレン)グリコールが付着する部位であり、タンパク質の糖化における修飾の主要部位である。タンパク質のメチオニン残基は、例えばヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、クロルアミンTで修飾することができる。テトラニトロメタンおよびN-アセチルイミダゾルは、チロシル残基の修飾に用いることができる。ジチロシンの形成によるクロスリンクは、過酸化水素/銅イオンによって達成できる。トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、N-ブロモサクシンイミド、2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロマイドまたは3-ブロモ-3-メチル-2-(2-ニトロフェニルメルカプト)-3H-インドル(BPNS-スカトール)が使用された。PEGで治療用タンパク質およびペプチドを適切に修飾するには、しばしば、循環半減期の延長が伴い、ヒドロゲルの調製には、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレートおよびホルムアルデヒドによるタンパク質のクロスリンクが用いられる。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、しばしば、シアン酸カリウムによるカルバミル化によって達成される。
　一般に、本発明で用いられるペプチドおよび改変体 (少なくともアミノ酸残基間にペプチドリンクを含むもの)は、Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433およびその参照が開示するように、例えば固相ペプチド合成のFmoc-ポリアミド形態を使って合成できる。精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および(通常は)例えばアセトニトリル/水傾斜分離を使う逆相高速液体クロマトグラフィーのような手法の1つもしくは組み合わせによって行うことができる。ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出(CSPE)、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析、高速原子衝撃(FAB)質量分析、MALDIおよびESI-Q-TOF質量分析を用いて行うことができる。
　本発明のさらに別の局面は、本発明のペプチドまたはその改変体をコードする核酸(例えばポリヌクレオチド)を提供する。該ポリヌクレオチドとしては、例えば、DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA、単鎖および／または二本鎖、または天然または安定形のポリヌクレオチド、例えばホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせが可能であり、該ペプチドをコーディングするポリヌクレオチドである限り、イントロンの含有は不可欠ではない。当然、天然に生じるペプチド結合によって結合された天然に生じるアミノ酸残基を含むペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってコードされる。本発明のまたさらに別の態様は、本発明によるポリペプチドを発現する能力のある発現ベクターを提供する。異なる細胞型の発現ベクターは当該技術分野で周知であり、特別な実験をせずに選択することができる。
　一般に、DNAはプラスミドのような発現ベクターに、正しい配向で、発現のために正しいリーディングフレームで挿入される。必要であれば、望ましい宿主によって認識される適切な転写・翻訳調節管理ヌクレオチド配列にDNAをリンクすることができるが、そのような管理機能は一般に発現ベクターに入っている。次に、標準的手法によって該ベクターを宿主に導入する。これについては、Sambrook et al(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NYを参照することができる。
　ワクチンに含まれる核ペプチドの最適な量および最適な用量のレジメンは、特別な実験をしなくとも当業者であれば決定することができる。例えば、該ペプチドまたはその変異形は、静脈（ｉ．ｖ．）注射、皮下　（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹膜内（ｉ．ｐ．）注射、筋内（ｉ．ｍ．）注射として調製することができる。ペプチド注射の好ましい投与経路はｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、ｉ．ｖ．である。ＤＮＡ注射の好ましい投与経路は、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．である。例えば、１～５００ｍｇ、５０μｇ～１．５ｍｇ、好ましくは１２５　μｇ～５００　μｇのペプチドまたはＤＮＡを投与することができ、用量は各ペプチドまたはＤＮＡに依存する。　この範囲の用量はこれまでの治験で用いられ、成功している (Brunsvig PF,Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M,Trachsel S, Muller M, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase peptide vaccination:a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer ImmunolImmunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T.Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G.Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of thepeptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017)。
　本発明の医薬組成物を調製することにより、該組成物に存在するペプチドの選択、数、および／または量を、組織、がん、および／または患者に特異のものにすることができる。例えば、与えられた患者の組織のタンパク質の発現パターンによってペプチドの正しい選択を導くことにより、副作用を避けることができる。この選択は、治療を受ける患者に特定のがんのタイプおよび該疾病の状態、それまでの治療レジメン、患者の免疫ステータス、および当然、患者のHLAハプロ型に依存する場合がある。さらに、本発明によるワクチンは、特定の患者の個人的な必要に応じて個別の構成要素を含むことができる。例としては、特定の患者の、関係TAAの発現、個人のアレルギーまたはその他の治療による副作用、一連の初期治療計画後の2次的治療の調整に応じた異なるペプチドの量である。
　正常組織に親タンパク質が高い量で発現されるペプチドは回避されるか、もしくは本発明の組成物に低量で存在する。一方、患者の腫瘍が特定のタンパク質を高い量で発現することがわかっている場合、このがんの治療のための各医薬組成物は高い量で存在できる、および／またはこの特定のタンパク質または経路に特異な複数のペプチドを含むことができる。当業者であれば、invitroでのT細胞形成、それらの効能、および全体的な提示、特定のペプチドに対する特定のT細胞の増殖、アフィニティ、拡大、およびT細胞の機能性を、例えばIFN-γ生成の分析によって試験することによって、免疫原性ペプチドの好ましい組み合わせを選択することができる(下記の例も参照のこと)。通常、次に、最も効率的なペプチドを、上述の目的のためにワクチンとして組み合わせる。
　適切なワクチンは、好ましくは1～20個のペプチド、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の異なるペプチド、さらに好ましくは6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の異なるペプチド、最も好ましくは14個の異なるペプチドを含有する。がんのワクチンとして用いられる該ペプチドの長さは、任意の適切なペプチドでよい。具体的には、適切な9-merのペプチドまたは適切な7-merまたは8-merまたは10-merまたは11-merのペプチドまたは12-mer、13-mer、14-merまたは15-merのペプチドとすることができる。より長いペプチドも適切である場合があり、添付の表１および２に記述されているように、MHCクラスIペプチドには9-merまたは10-merのペプチドが好ましく、MHCクラスIIペプチドには12-から15-merが好ましい。
　本発明のペプチドは腫瘍またはがんワクチンを構成する。該腫瘍またはがんワクチンは、患者に直接にその疾病器官または全身に投与すること、または患者からの細胞またはヒト細胞株に生体外適用したものを該患者に投与すること、またはinvitroで用いて患者の免疫細胞からのサブ集団を選択して再び該患者に投与することができる。
　該ペプチドは実質的に純粋であること、または免疫刺激性アジュバント(下記参照)と組み合わせること、または免疫刺激性サイトカインと組み合わせて使うこと、または適切な送達系(例えばリポソーム)と共に投与することができる。該ペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)またはマンナンのような適切な担体と接合することもできる(WO95/18145号およびLongenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci.690,276-291を参照)。該ペプチドをタグ付けすること、または融合タンパク質にすること、またはハイブリッド分子にすることもできる。本発明においてその配列が与えられているペプチドは、CD4またはCD8CTLを刺激することが期待される。しかし、反対のCDに対して陽性のT細胞が助けを提供する方が刺激の効率は高まる。したがって、CD4CTLを刺激するMHCクラスIIエピトープの場合、その融合パートナーまたはハイブリッド分子のセクションが、CD8陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。一方、CD8CTLを刺激するMHCクラスIエピトープの場合は、その融合パートナーまたはハイブリッド分子のセクションが、CD4陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。CD4およびCD8刺激性エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で特定するものを含む。
　免疫応答を引き出すために、通常は、該組成物の免疫原性を高める賦形剤を含める必要がある。したがって、本発明の好ましい実施形態の医薬組成物は、少なくとも1つの適切なアジュバントをさらに有する。本発明で用いられるアジュバントは、抗原に対する免疫応答 (例えばCTLおよびヘルパーT (TH)細胞が媒介する免疫応答)を非特異的に強化または促進する物質であるので、本発明の薬剤にとって有用と考えられる。 限定はしないが、適切なアジュバントは、1018 ISS、アルミニウム塩、アンプリヴァックス、AS15、BCG、CP-870、893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、 IC30、IC31、イミキモド、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、モノホスホリル脂質A、モンタナイドIMS 1312、モンタナイドISA 206、モンタナイドISA 50V、モンタナイドISA-51、OK-432、 OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel(R)ベクターシステム、PLG微粒子、レジキモド、SRL172、ウィロソームおよ び他のウイルス様粒子、YF-17D、VEGFトラップ、R848、βグルカン、Pam3Cys、Aquila のQS21スティミュロン (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA) (サポニン由来物質)、 マイコバクテリア抽出物、および合成細菌細胞壁模倣物、および他の専有アジュバント (RibiのDetox、Quil、またはSuperfosなど) である。フロイント不完全またはGM-CSFのようなアジュバントが好ましい。 樹状細胞に特異ないくつかの免疫学的アジュバント (例えばMF59)およびそれらの製剤についてはすでに記述がある (Dupuis M,Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendriticcells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol.1998; 186(1):18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants;Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11)。 また、サイトカインを使うこともできる。いくつかのサイトカインは、樹状細胞がTリンパ球に対し効果的な抗原提示細胞に成熟する過程を加速するとして (例えばGM-CSF、IL-1、IL-4) (米国特許第5,849,589号 (この参照によりその全文が組み込まれる))、また、免疫アジュバントとして作用するとして (例えばIL-12) (Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP;IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specificimmunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)、リンパ球組織(例えばTNF-α)への樹状細胞の移動に与える影響と直接リンクされているものがある。
　CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドもワクチン設定におけるアジュバントの効果を高めるという報告がある。理論に束縛されず、CpGオリゴヌクレオチドはトール様受容体(TLR)(主にTLR9)を介して生来の(非適応の)免疫系を活性化する作用を持つ。CpGが起動するTLR9活性は、予防ワクチンおよび治療ワクチンの両方で、ペプチドまたはタンパク質抗原、生のウイルスおよび殺傷されたィルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、および多糖共役体を含む様々な抗原に対する体液性および細胞性の抗原特異的応答を高める。より重要なのは、たとえCD4T細胞の助けがなくても、それが樹状細胞の成熟と分化を増進し、TH1細胞の活性および細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の生成を増進することである。TLR9の刺激によって誘導されるTH1バイアスは、TH2バイアスを通常促進するミョウバンまたはフロイント不完全アジュバント(IFA)のようなワクチンアジュバントが存在していても維持される。CpGオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと共処方または併投与するか、もしくは微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションまたは類似の処方にすることによって、さらに高いアジュバント活性を示すものであり、比較的弱い抗原の場合に強い応答を誘発するには特に必要である。それらは、免疫応答も加速するものであり、いくつかの実験では、CpGのない全用量ワクチンに匹敵する抗体応答が、約二桁低減した抗原用量で得られた (Arthur M.Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, NatureReviews, Drug Discovery, 2006, 5, 471-484)。米国特許第6,406,705号B1は、CpGオリゴヌクレオチドと非核酸アジュバントと抗原との組み合わせによって抗原特異的免疫応答を誘発することに ついて記述している。 RNA結合TLR7、TLR8、および／またはTLR9のようなその他のTLR結合分子を使用することもできる。
　限定するものでないが、本発明において有用なアジュバントのその他の例としては、化学修飾CpGs(例えばCpR、Idera)、ポリ(I:C)(例えばポリI：C12U)、非CpG細菌DNAまたはRNA、およびイミダゾキノリン、シクロホスファミド、スニチニブ、ビバシズマブ、セレブレックス、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、ZD2171、AZD2171、イピリムマブ、トレメリムマブ、SC58175を含み、これらは治療薬および／またはアジュバントとして作用することができる。本発明のコンテクストにおいて有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者であれば特別な実験をせずに容易に決定できる。好ましいアジュバントはdSLIM、BCG、OK432、イミキモド、PeviTer、およびJuvImmuneである。本発明の医薬組成物の好ましい実施形態において、該アジュバントは、グラニュロサイトマクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF、サルグラモスティム)のようなコロニー刺激因子を含む群から選択される。本発明の医薬組成物の好ましい実施形態において、該アジュバントはイミキモドである。
　本発明の組成物は、皮下、皮内、筋内のような非経口投与または経口投与に用いられる。このための該ペプチドおよび選択的他の分子は、薬学的に許容される好ましくは水性の担体に溶解または懸濁される。加えて、該組成物は、緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香味料、潤滑剤のような賦形剤などを含むことができる。該ペプチドは、また、サイトカインのような免疫刺激性物質と共に投与することもできる。そのような組成物に使用可能な賦形剤の広範なリストは、例えば、A. Kibbe,Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed. 2000, American PharmaceuticalAssociation and pharmaceutical pressから得られる。該組成物は、腫瘍またはがん、好ましくはCRCの予防および／または療法として用いることができる。
　細胞傷害性T細胞(CTL)は、MHC分子と結合したペプチド形状抗原を認識し、そのままの外来抗原自体は認識しない。該MHC分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面にある。したがって、CTLの活性化は、ペプチド抗原の三量体複合体とMHC分子とAPCの存在下でのみ可能である。したがって、ペプチドだけを用いてCTLを活性化するのではなく、各MHC分子と共にAPCも追加的に加えることによって免疫応答は増進される。したがって、好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は少なくとも１つの抗原提示細胞を追加的に含む。
　抗原提示細胞(または刺激細胞)は、通常、MHCクラスIまたはII分子をその表面に有し、１実施形態においては、その選択された抗原を有する該MHCクラスIまたはII分子をそれ自体に負荷することは実質的に不可能である。下記に詳細に述べるように、該MHCクラスIまたはII分子に、その選択された抗原をin　vitroで容易に負荷することができる。
　一般に、本発明の核酸を含む本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドを含む医薬組成物と同様の方法で投与すること、すなわち静脈内、動脈内、腹膜内、筋内、皮内、腫瘍内、経口、経皮、経鼻腔、経口腔、経直腸、経膣投与、または吸入または局所投与することができる。
　回避のメカニズムにより、腫瘍はしばしば治療薬に対する耐性を得る。この薬品耐性は治療中に生じ、転移および再発腫瘍として現れる場合がある。そのような薬品耐性を避けるために、一般に腫瘍の治療は薬品の組み合わせによって行われ、多くの場合、無病期間後の転移および腫瘍再発には異なる組み合わせが要求される。したがって、本発明の１つの態様において、該医薬組成物は第２の抗がん剤と併せて投与される。本発明において使用される第２の薬剤は、本発明の医薬組成物の前または後、またはそれと同時に投与することができる。同時投与は、例えば、化学特性に適合性があるならば本発明の医薬組成物を該第２の抗がん剤と混合して行うことができる。同時投与の別の方法は、例えば本発明の医薬組成物を注射し、第２の抗がん剤を例えば経口投与することにより、同日に該組成物と抗がん剤を独立の投与経路で投与することである。該医薬組成物と第２の抗がん剤を、異なる日に同じ治療コース内で投与、および／または別々の治療コース内で投与してもよい。
　本発明の別の局面では、患者のがんを治療または予防する方法を提供するものであり、この方法は、任意の１つの本発明の医薬組成物を治療効果のある量で該患者に投与する工程を有する。治療効果のある量とは、免疫応答の誘発、特に、CTLのサブ集団の活性化に十分な量である。当業者であれば、本明細書の実施例に提供されているような標準的な免疫学的方法を用いて、効果のある量を容易に決定することができる。本発明の医薬組成物の特定量の効果を監視する別の方法は、治療した腫瘍の成長および／または再発を観察することである。
　本発明の特に好ましい実施形態において、該医薬組成物は抗癌ワクチンとして用いられる。
　本発明のペプチドまたはペプチドコード核酸を含む組成物は、腫瘍または癌ワクチンを構成することもできる。該腫瘍または癌ワクチンは、該患者に直接にその疾病器官または全身的に投与すること、または患者からの細胞またはヒト細胞株に生体外適用したものを該患者に投与すること、またはinvitroで用いて患者の免疫細胞からのサブ集団を選択して再び該患者に投与することができる。
　本発明の組成物は、癌を治療する方法として、またはワクチンとして使用することができる。該癌は、口腔、咽頭の癌、消化管癌、結腸、直腸、肛門の癌、気道癌、乳癌、子宮、膣、外陰の癌、子宮体、卵巣の癌、男性生殖管癌、尿道癌、骨および軟組織の癌、カポジ肉腫、皮膚メラノーマ、眼メラノーマ、非メラノーマ眼癌、脳、中枢神経系の癌、甲状腺および他の内分泌腺の癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫であり、好ましくは腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、脳癌、GISTまたはグリア芽腫である。本発明によると、ペプチドの好ましい量は500μl溶液中に約0．1～100ｍｇ、好ましくは約0．1～1ｍｇ、最も好ましくは約300μg～800μgの間で変動することができる。ここで、「約」という言葉は、特に述べない限り、与えられた値の+/-10パーセントを意味する。当業者であれば、例えば患者個人の免疫ステータスおよび／または特定のタイプの癌で提示されるTUMAPの量のようないくつかの因子に基づき、使用するペプチドの実際量を調整することができるであろう。本発明のペプチドは、凍結溶解物以外の他の適切な形状(滅菌液等)として提供してもよい。
　本発明によるペプチドおよび／または核酸を有する本発明の医薬組成物は、各対応するペプチドまたは抗原に関連する腺腫または癌疾病の患者に投与される。これにより、T細胞を媒介とする免疫応答が起動される 好ましくは本発明の医薬組成物であって、この本発明の医薬組成物のペプチド (特に腫瘍関連のペプチド)または核酸、または本発明の組成物に存在する本発明の発現ベクターの量は、組織、癌、および／または患者に特異的である。
　本発明の別の実施形態において、本発明のワクチンは核酸ワクチンである。ポリペプチドをコードするDNAワクチンのような核酸ワクチンの接種がT細胞応答を引き出すことは周知である。該腫瘍または癌ワクチンは、該患者に直接にその疾病器官または全身的に投与すること、または患者からの細胞またはヒト細胞株に生体外適用したものを該患者に投与すること、またはin　vitroで用いて患者の免疫細胞からのサブ集団を選択して再び該患者に投与することができる。該核酸をin　vitroで細胞に投与する場合、インターロイキン－2またはGM-CSFのような免疫刺激性サイトカインを共発現するよう、該細胞の移入が有用である場合がある。該核酸は実質的に純粋であること、または免疫刺激性アジュバントと組み合わせること、または免疫刺激性サイトカインと組み合わせて使うこと、または適切な送達系(例えばリポソーム)と共に投与することができる。該核酸ワクチンは、上記ペプチドワクチンに関して記述したようなアジュバントと共に投与してもよい。好ましくは、該核酸ワクチンをアジュバントなしに投与する。
　本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋である、または適切なベクターまたは送達系に含まれている場合がある。適切なベクターおよび送達系として含まれるのは、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、または複数のウイルスの要素を含むハイブリッドに基づく系のような、ウイルス性のものである。非ウイルス送達系として含まれるのは、DNA送達技術分野で周知のカチオン性脂質およびカチオン性ポリマーである。「遺伝子銃」のような物理的送達も使用することができる。該ペプチド、または該核酸によってコードされるペプチドは、融合タンパク質の場合があり、例えばCD4陽性T細胞を刺激する破傷風トキソイドからのエピトープとの融合タンパク質である。
　適切には、該患者に投与される全てのペプチドは滅菌されていて発熱物質がない。裸のDNAは筋内、皮内、皮下注射により投与することができる。 便利なことに、該核酸ワクチンは任意の核酸送達手段を有することができる。好ましくはDNAである該核酸は、リポソームにて送達することも、ウイルスベクター送達系の一部として送達することもできる。　　　
 DNAワクチンのような核酸ワクチンは筋肉に投与するのが好ましく、ペプチドワクチンはs.c.または i.d.にて投与するのが好ましい。該ワクチンを皮内に投与するのも好ましい。
　樹状細胞のようなプロフェッショナル抗原提示細胞による核酸の摂取、およびコードされたポリペプチドの発現は、免疫応答のプライミングのメカニズムである可能性がある。しかし、樹状細胞は移入されない可能性があるとはいえ、組織内の移入された細胞から発現ペプチドを取り込むことができるので、なお重要である(「クロスプライミング」。例：Thomas AM, Santarsiero LM,Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH,Jaffee EM. Mesothelin-specific CD8(+) T cell responses provide evidence of invivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancerpatients. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):297-306)。
　ポリヌクレオチドを媒介とする癌免疫療法についてはConry et al (1996)Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al (1996) J.Immunol. 156, 700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65, 664-670; andBurchell et al (1996) 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology andtherapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotextに記述されており、 これら全ては参照によりその全文がここに組み込まれる。
　本発明において、注射部位、標的化ベクターおよび送達系の使用、または患者からの特異的細胞集団の選択的精製によって、本発明のワクチンの標的を、例えば抗原提示細胞のような特異的細胞集団とすること、および該ペプチドまたは核酸を生体外投与することも有用である可能性がある(例えば、Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth etal (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651に記述されているように、樹状細胞をソートすることができる)。例えば、標的化ベクターは、適切な場所での抗原の発現を方向づける組織または腫瘍特異的プロモーターを有することができる。
　本発明のワクチンは、治療を受ける患者に特定の癌のタイプおよび該疾病の状態、それまでの治療レジメン、患者の免疫ステータス、および当然、患者のHLAハプロ型に依存する場合がある。さらに、本発明によるワクチンは、特定の患者の個人的な必要に応じて個別の構成要素を含むことができる。例としては、特定の患者の、関係TAAの発現、個人のアレルギーまたはその他の治療による副作用、一連の初期治療計画後の2次的治療の調整に応じた異なるペプチドの量である。
　本発明のペプチドは癌治療に有用なだけでなく、診断にも有用である。該ペプチドはグリア芽腫から生成されるものであり、これらのペプチドは正常組織には存在しないことが特定されているので、これらのペプチドを用いて癌の存在を診断することができる。
　病理学者は、組織生検での本発明のペプチドの存在を癌の診断の助けとすることができる。病理学者は、抗体を使って行う本発明の特定のペプチドの検出、質量分析、または当該技術分野で周知の他の方法によって、該組織が悪性か、炎症または総じて罹患しているかを知ることができる。本発明のペプチドのグループの存在によって、罹患組織の分類または下位分類が可能になる。
　罹患組織標本にある本発明のペプチドの検出は、作用のメカニズムにTリンパ球が関わることがわかっている場合または予期される場合は特に、その免疫系が関わる療法の恩恵についての決断を可能にする。MHC発現の喪失はよく理解されているメカニズムであり、これによって悪性細胞は免疫監視を逃れる。したがって、本発明のペプチドの存在は、被分析細胞によってこのメカニズムが利用されていないことを示す。
　本発明のペプチドは、本発明のペプチドに対するリンパ球応答の分析に用いることができ、例えば、本発明のペプチド、またはMHC分子との複合体である本発明のペプチドに対するT細胞応答または抗体応答を分析することができる。これらのリンパ球応答を、さらなる治療工程を決定するための予後マーカーとして用いることができる。これらの応答は、例えばタンパク質、核酸、自己物質、リンパ球免疫伝達のワクチン接種など異なる手段によってリンパ球応答を誘発しようとする免疫療法アプローチで、代理マーカーとして用いることもできる。遺伝子療法という設定では、副作用の評価において本発明のペプチドに対するリンパ球応答を考慮することができる。リンパ球応答の監視は、移植療法後のフォローアップ検査でも、例えば移植片対宿主および宿主対移植片の病気の検出などに有用である可能性がある。
　本発明のペプチドは、MHC/ペプチド複合体に対し特異的な抗体の生成および発育に用いることができる。これらを療法に用いて、罹患組織を標的として毒素または放射性物質を当てることができる。これらの抗体の別の使い方として、PETのような画像法のために、罹患組織に対する放射性核種を標的としてこれらの抗体を当てることができる。この使用方法は、小さな転移の検出または罹患組織のサイズおよび正確な位置を決定するための助けとなり得る。加えて、該ペプチドは、病理学者が行う生検標本に基づく癌の診断の検証に用いることができる。
　本発明はキットとして提供されることができる。本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
　このように、本発明のさらなる局面では、本発明はキットに関するものであり、このキットは、(a)本発明の医薬組成物を溶液形状または凍結乾燥形状で包含する容器と、(b)選択的に、該凍結乾燥製剤用の希釈剤または再構成液を包含する第２の容器と、(c)選択的に、(i)該溶液の使用または(ii)該凍結乾燥製剤の再構成および／または使用に関する説明書とを有する。該キットは、1もしくはそれ以上の(iii)緩衝剤、(iv)希釈剤、(v)フィルター、(vi)針、または(v)シリンジをさらに有する。該容器は、好ましくは瓶、バイアル瓶、シリンジ、または試験管であり、多用途容器でよい。該医薬組成物は、好ましくは乾燥凍結される。
　本発明のキットは、好ましくは、本発明の乾燥凍結製剤およびその再構成および／または使用に関する説明書を、適切な容器内に有する。適切な容器として含まれるのは、例えば、瓶、バイアル瓶(例えばデュアルチャンババイアル)、シリンジ(デュアルチャンパシリンジなど)、および試験管である。該容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成することができる。好ましくは、該キットおよび／または容器は、該容器上にある、あるいは該容器に伴う、再構成および／または使用の方法を示す説明書を包含する。例えば、そのラベルは、該乾燥凍結製剤を再構成して上記のペプチド濃度にするという説明を示すことができる。該ラベルは、さらに、該製剤が皮下注射に有用であるもしくは皮下注射のためのものであるという説明を示すことができる。.　
　該製剤の容器は、繰り返し投与(例えば2～6回の投与)に使うことができる多用途バイアル瓶でもよい。該キットは、さらに、適切な希釈剤(例えば重曹溶液)を有する第２の容器を有することができる。
　該希釈剤と該凍結乾燥製剤を混合して作られる再構成された製剤の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも0.15mg/mL/ペプチド(=75μg)であり、好ましくは3mg/mL/ペプチド(=1500μg)以下である。該キットは、さらに、商業的観点およびユーザーの観点から見て望ましいその他の材料(その他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、およびパッケージに挿入される使用説明書を含む)を含むことができる。
　本発明のキットは、他の構成要素(例えば他の化合物またはこれら他の化合物の医薬組成物)と共に、もしくはそれらなしに、本発明の医薬組成物の製剤を包含する単一の容器を有すること、または各構成要素によって別の容器を有することができる。
　好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物(アジュバント(例えばGM-CSF)、化学療法薬剤、天然生成物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管形成剤または血管形成阻害剤、アポトーシス誘発剤またはキレート剤など)またはその医薬組成物の併投与との組み合わせとして使用するためにパッケージされた本発明の処方を含む。該キットの構成要素は、予め複合体として作られたもの、もしくは、患者に投与するまで各構成要素が異なる別々の容器に入ったものが可能である。該キットの構成要素は、１もしくはそれ以上の液体溶液として提供することができ、好ましくは水溶液であり、より好ましくは滅菌水溶液である。該キットの構成要素は、固体として提供することも可能であり、好ましくは別の異なる容器にて提供される適切な溶剤をそれに加えて液体に変換することができる。
　療法キットの容器としては、バイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、もしくは固体または液体を密封する他の任意の手段が可能である。通常、複数の構成要素がある場合、別々に投薬できるように、該キットは第２のバイアルまたはその他の容器を包含する。該キットは、薬学的に許容される液体用の別の容器も包含することができる。好ましくは、治療キットは、該キットの構成要素である本発明の薬剤を投与することを可能にする器具(例えば１もしくはそれ以上の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど)を包含する。
　本発明の医薬組成物は、経口(経腸)、経鼻腔、経眼、皮下、皮内、筋内、静脈内、または経皮のような任意の許容される経路によって該ペプチドを投与するのに適したものである。好ましくは該投与は皮下投与であり、最も好ましくは皮内投与である。投与は注入ポンプによって行うことができる。
　本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package　insert）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook　J.　et　al.(1989).Molecular　Cloning:　A　Laboratory　Manual,　Cold　Spring　Harborおよびその3rd　Ed.(2001);　Ausubel,　F.　M.(1987).Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Greene　Pub.　Associates　and　Wiley-Interscience;　Ausubel,F.M.(1989).Short　Protocols　in　Molecular　Biology:　A　Compendium　of　Methods　from　Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Greene　Pub.　Associates　and　Wiley-Interscience;　Innis,　M.　A.　(1990).　PCR　Protocols:　A　Guide　to　Methods　and　Applications,　Academic　Press;　Ausubel,　F.　M.　(1992).Short　Protocols　in　Molecular　Biology:　A　Compendium　of　Methods　from　Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Greene　Pub.　Associates;　Ausubel,　F.　M.(1995).Short　Protocols　in　Molecular　Biology:　A　Compendium　of　Methods　from　Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Greene　Pub.　Associates;　Innis,　M.　A.　et　al.(1995).　PCR　Strategies,　Academic　Press;　Ausubel,　F.　M.　(1999).　Short　Protocols　in　Molecular　Biology:　A　Compendium　of　Methods　from　Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Wiley,　and　annual　updates;　Sninsky,　J.　J.　et　al.(1999).PCR　Applications:　Protocols　for　Functional　Genomics,　Academic　Press,　Gait,　M.　J.　(1985).　Oligonucleotide　Synthesis:　A　Practical　Approach,　IRL　Press;　Gait,　M.　J.　(1990).　Oligonucleotide　Synthesis:　A　Practical　Approach,　IRL　Press;　Eckstein,　F.(1991).　Oligonucleotides　and　Analogues:　A　Practical　Approach,　IRL　Press;　Adams,　R.　L.　et　al.(1992).The　Biochemistry　of　the　Nucleic　Acids,　Chapman　&　Hall;　Shabarova,　Z.　et　al.(1994).　Advanced　Organic　Chemistry　of　Nucleic　Acids,　Weinheim;　Blackburn,　G.　M.　et　al.(1996).　Nucleic　Acids　in　Chemistry　and　Biology,　Oxford　University　Press;　Hermanson,　G.　T.　(I996).　Bioconjugate　Techniques,　Academic　Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　（非バイアス増幅試料の調製実施例）
　（調製実施例１：健常人末梢血におけるＢＣＲレパトアの解析）　本実施例では、健常人末梢血におけるＢＣＲレパトアの解析を行った。
　（材料および方法）
　試料：健常人末梢血単核球細胞
　方法：
　（１．ＲＮＡ抽出）
　例の健常人から全血５ｍＬをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ，　ＰＢＭＣ）を分離した。単離した５×１０６細胞のＰＢＭＣからＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。取得されたＲＮＡは、吸光度計を用いてＡ２６０の吸光度により定量された。溶出液量３０μＬにおいて濃度２３２ｎｇ／μＬであった。
　（２．相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成）
　抽出されたＲＮＡ試料を用いて、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲを実施した。最初に、相補的ＤＮＡを合成するため、ＢＳＬ－１８Ｅプライマー（表１－１）と　３．５　μＬ（８１２ｎｇ）のＲＮＡを混和して、７０℃で８分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）の存在下で逆転写反応を行い、相補的ＤＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　続いて、下記の二本鎖ＤＮＡ合成緩衝液中、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｈの存在下、１６℃で２時間保温し、二本鎖相補的ＤＮＡを合成した。さらに、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１６℃で５分間反応させ、５’末端平滑化反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　二本鎖ＤＮＡは、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりカラム精製された後、下記のＴ４リガーゼ緩衝液中、Ｐ２０ＥＡ／１０ＥＡアダプター（表１－１）およびＴ４リガーゼの存在下、１６℃で終夜保温して、ライゲーション反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前述同様カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖ＤＮＡは、３’末端に付加したアダプターを除去するため、ＮｏｔＩ制限酵素（５０　Ｕ／μＬ、Ｔａｋａｒａ）に下記の組成で消化された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（３．ＰＣＲ）
　二本鎖相補的ＤＮＡからの一次ＰＣＲ増幅（１ｓｔ　ＰＣＲ）は、共通アダプタープライマーのＰ２０ＥＡと各々の免疫グロブリンアイソタイプＣ領域特異的プライマー（ＣＭ１、ＣＡ１、ＣＧ１、ＣＤ１、ＣＥ１）を用いて、次に示す反応組成で、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分のサイクルを２０サイクル行った。用いたプライマー配列は表１－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　次に、第１のＰＣＲ増幅反応の産物である１ｓｔ　ＰＣＲ増幅産物を用いて、Ｐ２０ＥＡプライマーと各免疫グロブリンアイソタイプＣ領域特異的プライマーの間で次に示す反応組成でｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分のサイクルを２０サイクル行った。用いたプライマー配列は表１－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　得られた第２のＰＣＲ増幅反応の産物である２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物からプライマーを除去するため、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりカラム精製を行った。続いて、２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を鋳型として、Ｐ２０ＥＡプライマーにアダプターＢ配列を付加したＢ－Ｐ２０ＥＡプライマーと各免疫グロブリンＣ領域特異的プライマーにアダプターＡ配列と同定配列であるＭＩＤ　Ｔａｇ配列を付加したＧＳ－ＰＣＲプライマーを用い、次の反応組成でＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分を１０サイクル行った。用いたプライマー配列は表１－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（４．次世代シーケンス）
　至適条件下におけるＧＳ－ＰＣＲ増幅の後、２％アガロースゲル電気泳動を実施し、目視化において目的のサイズ（５００ｂｐ～７００ｂｐ）のバンドを切り出し、ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。回収されたＤＮＡをＱｕａｎｔ－ｉＴTM　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）　ｄｓＤＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ量を測定した。回収された各アイソタイプ由来の増幅産物のＤＮＡ量は、それぞれＩｇＭ（１６１１ｎｇ／ｍＬ）、ＩｇＧ（９５５ｎｇ／ｍＬ）、ＩｇＡ（７９６ｎｇ／ｍＬ）、ＩｇＤ（２５８ｎｇ／ｍＬ）、ＩｇＥ（８７１ｎｇ／ｍＬ）であった。これらアイソタイプ増幅産物のＤＮＡ量が均等になるよう混和し、１０００万ＤＮＡをエマルジョンＰＣＲに用い、ロシュ社製次世代シーケンス解析装置（ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒベンチトップシステム）によるシーケンス解析を行った。
　（５．データ解析）
　シーケンスリードの解析は、ＩＭＧＴ　（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベースから入手されるＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ配列をリファレンス配列として各リード配列のＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ配列をアサインした。アサインメントにはＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔおよび新規に開発したレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ、同日付で出願される特許出願を参照。この内容は本明細書において参考として援用される）を用いた。
　アイソタイプ特異的プライマーの交差性は図１に示す。使用した免疫グロブリンアイソタイプ特異的プライマーの特異性を評価するため、目的の免疫グロブリンアイソタイプ特異的プライマーとともに他のアイソタイプ特異的プライマーによる増幅を行い、交差反応性の有無を確認した。１０μＬのＧＳ－ＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲルにてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動後、エチジウムブロマイド染色により評価した。各アイソタイプ特異的プライマーで増幅された２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物は、他のアイソタイプ特異的ＧＳ－ＰＣＲプライマーで増幅されることなく、プライマーの特異性が高いことが確認された。
　至適希釈濃度の検討は図２に示す。各アイソタイプにおけるＧＳ－ＰＣＲ至適条件を検討した。２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物の２倍階段希釈系列を作成し、２０サイクルのＧＳ－ＰＣＲを行った。１６倍希釈において良好な結果が得られた。
　至適サイクル数の検討は図３に示す。１６倍希釈２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を用いて、１０、１５、２０サイクルのＰＣＲを行った。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤにおいては、１０サイクルで良好な増幅が確認された。また、ＩｇＥにおいては、２０サイクルが適当であることが確認された。
　次世代シーケンスのリード長は図４に示す。図４はＢＣＲ遺伝子の次世代シーケンスのリード長を示している。Ｒａｗ　ｄａｔａのリード数は１３万、Ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｓｓを経たものは９万以上のリード数が得られた。Ｔａｇ標識した各アイソタイプ由来のリード数は表１－２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ＭＩＤ別リード長は図５に示す。ＭＩＤ別に分割したリード数、リード長の分布も均等であった。Ｖ領域の解析に十分な長さを持つリード長を４００ｂｐ以上としてカウントすると、約半数の１万リードがＢＣＲレパトア解析に有効なリードであると考えられた。
　アイソタイプ別Ｃ領域配列の使用頻度は図６に示す。得られた各アイソタイプ別のリードに対して、サブクラスも含めた免疫グロブリンアイソタイプのＣ領域配列との相同性検索を行った。サブクラス別のリード数の頻度は、ＩｇＡサブクラスでは、ＩｇＡ１が７３％、ＩｇＡ２が２７％であり、ＩｇＧサブクラスはＩｇＧ１が６２％、ＩｇＧ２が３６％で、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のリードはほとんど得られなかった。また、得られた各サブクラス別のリードは、他のクラスに分類されることがほとんどなかったため、プライマーの特異性がシークエンスレベルで再確認できた。
　ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔを用いてＶ、Ｄ，Ｊ領域のアサインメントを行った（図６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ）。また、次に新規に開発したレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ、特許出願中）を用いて行ったＶ、Ｄ，Ｊ領域のアサインメントの結果を表１－１Ｈに示す。これらのリード数データを用いて、Ｖ領域、Ｊ領域の頻度を求めた（図６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ）。以下にそのデータを示す（表１－１Ｈ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
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Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
　アイソタイプ別Ｖ領域レパトアは図７（Ａ～Ｄ）に示す。ここではアイソタイプ別のＶ領域配列のレパトア（ＢＣＲ　Ｖレパトア）を示した。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤの間でＢＣＲ　Ｖレパトアは非常に類似したが、ＩｇＥはＩＧＨＶ３－３０を有するリードのみ得られた。この理由として、末梢血中のＩｇＥ陽性細胞数は他のクラスと比較して非常に少なく、偏ったレパトアが検出された可能性が示唆される。
　サブタイプ別Ｖ領域レパトアは図８（Ａ～Ｄ）に示す。ここでは、ＩｇＡとＩｇＧサブクラス別のＢＣＲ　Ｖレパトアを示した。ＩｇＡのサブクラスはＩｇＡ１とＩｇＡ２で数種のＶ鎖における頻度が異なった。ＩＧＨＶ１－１８とＩＧＨＶ４－３９の存在頻度はＩｇＡ２に比較してＩｇＡ１で高く、一方、ＩＧＨＶ３－２３とＩＧＨＶ３－７４の存在頻度はＩｇＡ１よりＩｇＡ２で高かった。ＩｇＧサブクラスに関し、ＩｇＡ２で増加が認められたＩＧＨＶ３－２３とＩＧＨＶ３－７４の頻度は、ＩｇＧ１と比較してＩｇＧ２で高かった。ＩｇＧ３とＩｇＧ４のリード数は少なく（１０リード）、ＩｇＧ３ではＩＧＨＶ４－５９－ＩＧＨＪ４－ＩＧＨＤ１－７をもつクローンの頻度が３／１０とクローナリティーが高く、ＩｇＧ４についてもＩＧＨＶ３－２３－ＩＧＨＪ４－ＩＧＨＤ３－１０をもつリードが５／１０を占めた（表１－３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　サブクラス別のＢＣＲＪレパトアは図９に示す。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤにおいて、約半数のリードにおいてＩＧＨＪ４が使用されており、一方ＩＧＨＪ２はほとんど使用されていなかった。ＩｇＥではＩＧＨＪ１のみが使用されていた。ＩｇＭおよびＩｇＡのサブクラスにおけるＩＧＨＪレパトアについても検討した。ＩＧＨＶレパトアとは異なり、サブクラス間での顕著な差は認められなかった。
　以上から、本発明の試料提供方法により、非バイアスによる定量的な解析が可能であっ
たことが示された。
　（調製実施例２：健常人末梢血におけるＴＣＲレパトアの解析）
　本実施例では、健常人末梢血におけるＴＣＲレパトアの解析を行った。
　（材料および方法）
　（試料）
　１０例の健常人末梢血単核球細胞
　（方法）　
　（１．ＲＮＡ抽出）
　１０例の健常人から全血５ｍＬをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ，　ＰＢＭＣ）を分離した。単離したＰＢＭＣからＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。取得されたＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて定量された。獲得されたＲＮＡ量を次の表１－４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　（２．相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成）
　抽出されたＲＮＡ試料を用いて、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲを実施した。方法は調製実施例１に示した方法に従って実施した。すなわち、ＢＳＬ－１８Ｅプライマー（表１－５）とＲＮＡを混和してアニーリング後、逆転写酵素を使って相補鎖ＤＮＡを合成した。続いて、二本鎖相補的ＤＮＡを合成し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる５’末端平滑化反応を行った。Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりカラム精製した後、Ｐ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡアダプターをＬｉｇａｔｉｏｎ反応にて付加した。カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡは、ＮｏｔＩ制限酵素により消化された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　（３．ＰＣＲ）
　二本鎖相補的ＤＮＡから、表１－１に示す共通アダプタープライマーＰ２０ＥＡとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的プライマー（ＣＡ１またはＣＢ１）を用いて、第１のＰＣＲ増幅反応の産物である１ｓｔ　ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲは次に示す組成で、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを２０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　次に、１ｓｔ　ＰＣＲ増幅産物を用いて、Ｐ２０ＥＡプライマーとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的プライマー（ＣＡ２またはＣＢ２）を用いて、次に示す反応組成で２ｎｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを２０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
得られた第２のＰＣＲ増幅反応の産物である２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物からＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりプライマーを除去し、さらに１０倍希釈した２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を鋳型として、ロシュ社製次世代シーケンス解析装置（ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒベンチトップシステム）による解析を実施した。増幅には、図１０に示したＰ２０ＥＡアダプタープライマーにアダプターＢ配列を付加したＢ－Ｐ２０ＥＡプライマーとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的配列にアダプターＡ配列および各ＭＩＤ　Ｔａｇ配列（ＭＩＤ－１～２６）を付加したＨｕＶａＦ－０１～ＨｕＶａＦ１０（α鎖）およびＨｕＶｂＦ－０１～ＨｕＶｂＦ－１０（β鎖）を利用した。使用したプライマー配列は、表１－６に示した。ＰＣＲサイクルは、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分を１０サイクル行った。ＰＣＲ増幅を確認するため、１０μＬの増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で増幅した（図１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　図１１に示すアガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅産物の後に、６００ｂｐ程度の増幅産物を含むバンドを目視化において切り出し、ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。回収されたＰＣＲ増幅産物はＱｕａｎｔ－ＴTM　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）　ｄｓＤＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＤＮＡ量を測定した。各健常人１０例の回収されたＤＮＡ量を表１－７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　（４．次世代シーケンス）
　ロシュ社製ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒシーケンス解析装置による次世代シーケンスを実施した。具体的には、ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　ｅｍＰＣＲ　Ｋｉｔ　（Ｌｉｂ－Ｌ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってｅｍＰＣＲを実施した。ビーズとＤＮＡの割合（ｃｏｐｙ　ｐｅｒ　ｂｅａｄｓ：ｃｐｂ）０．５で実施した。ｅｍＰＣＲ後、ビーズエンリッチメントにて回収されたビーズは、シーケンスラン試薬であるＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＫｉｔおよびＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ　Ｋｉｔを用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスランを実施した。
　（５．データ解析）
　得られたシーケンスデータ（ＳＦＦファイル）をＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ付属ソフトウェア（ｓｆｆｆｉｌｅもしくはｓｆｆｉｎｆｏ）により、ＭＩＤ　Ｔａｇ別のリード配列に分類し、Ｆａｓｔａ形式のシーケンスファイルを生成した。得られた平均リード数はＴＲＡ：１７８４０リード、ＴＲＢ：５１２２リードで、２００ｂｐ以上のＲａｗ　ｄａｔａの割合はＴＲＡ：３４．９－６３．７％（平均４２．２％）、ＴＲＢ：６８．８－７８．７％（平均７３．１％）であった（表１－８）。次に、新規に開発したレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ、特許出願中）を用いて、ＩＭＧＴ（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，　ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベースのリファレンス配列との照合を行い、各リードのＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域のアサインメントとＣＤＲ３配列の決定を行った。アサインされたリード数は表１－８に示した。また、同一リードの頻度解析、Ｖ、Ｄ、Ｊ鎖の使用頻度を調べた。Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓにより得られたリードを用いて生成したＴＲＶおよびＴＲＪレパトアについて図１３（Ａ～Ｄ）、１４（Ａ～Ｄ）、１５（Ａ～Ｄ）、図１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　ＴＣＲ遺伝子の増幅方法を図１０に示す。Ｐ２０ＥＡアダプタープライマーにＢ－ａｄａｐｔｏｒを付加したＢ－Ｐ２０ＥＡプライマーと３ｒｄ　ｎｅｓｔｅｄプライマーにＡ－ａｄａｐｔｏｒおよびＭＩＤ　Ｔａｇ配列（ＭＩＤ－１～２６）を付加したプライマーを用いて増幅した。
　ＧＳ－ＰＣＲ増幅産物の確認を図１１に示す。１０例の健常人由来ＧＳ－ＰＣＲ増幅産物の１０μＬを２％アガロースゲルにて電気泳動を行った。上段はＧＳ－ＰＣＲ（ＴＲＡ）（ＴＣＲα鎖増幅産物）を示し、下段はＧＳ－ＰＣＲ（ＴＲＢ）（ＴＣＲβ鎖増幅産物）を示す。
　ＴＣＲ／ＢＣＲレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ）のパラメータ設定は図１２に示す。
　健常人におけるＴＲＡＶレパトアは、図１３に示す。健常人１０例のＴＲＡＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＡＶ９－２、１２および１３の存在頻度が高く、＃１においてＴＲＡＶ２０、＃５においてＴＲＡＶ２１が他の健常人よりも高く、個人差も認められた。
　健常人におけるＴＲＢＶレパトアは図１４に示す。健常人１０例のＴＲＢＶレパトアとその平均値を示した。ＴＲＢＶ２０－１、２８および２９－１の存在頻度が高く、＃８においてＴＲＢＶ３－１が他の健常人より高く、個人差が認められた。　
健常人におけるＴＲＡＪレパトアは図１５に示す。健常人１０例のＴＲＡＪレパトアとその平均値を示した。健常人のＴＲＡＪレパトアは、どのＡＪファミリーも概ね５％以内を示し、＃１においてＴＲＡＪ１２、＃４においてＴＲＡＪ２７、＃５においてＴＲＡＪ３７、＃８においてＴＲＡＪ４５が他の健常人よりも高く、個人差が認められた。
　健常人におけるＴＲＢＪレパトアは図１６に示す。健常人１０例のＴＲＢＪレパトアとその平均値を示した。健常人のＴＲＢＪレパトアは、ＴＲＢＪ２－１、２－３および２－７の存在頻度が高く、＃８においてはＴＲＢＪ２－２が高く、個人差が認められた。
　したがって、本発明の調製法で調製した試料を用いることで、ＴＣＲにおいても非バイアスの定量分析が可能であることが証明された。
　（調製実施例３：非バイアスＡｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲ法によるＴＣＲおよびＢＣＲ遺伝子の増幅）
　本実施例では、非バイアスＡｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲ法によるＴＣＲおよびＢＣＲ遺伝子の増幅を行う。
　（材料および方法）
　（試料）
　健常人末梢血単核球細胞
　（方法）
　（１．ＲＮＡ抽出）
　１例の健常人から全血５ｍＬをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ，　ＰＢＭＣ）を分離した。単離した５×１０６細胞のＰＢＭＣからＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。
　（２．相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成）
　抽出されたＲＮＡ試料を用いて、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲを実施した。最初に、相補的ＤＮＡを合成するため、ＢＳＬ－１８Ｅプライマー（表１－１）と　３．５　μＬ（８１２ｎｇ）のＲＮＡを混和して、７０℃で８分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）の存在下で逆転写反応を行い、相補的ＤＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　続いて、下記の二本鎖ＤＮＡ合成緩衝液中、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｈの存在下、１６℃で２時間保温し、二本鎖相補的ＤＮＡを合成した。さらに、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１６℃で５分間反応させ、５’末端平滑化反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　二本鎖ＤＮＡは、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりカラム精製された後、下記のＴ４　リガーゼ緩衝液中、Ｐ２０ＥＡ／１０ＥＡアダプター（表１－１）およびＴ４　ｌｉｇａｓｅの存在下、１６℃で終夜保温して、ライゲーション反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　前述同様カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖ＤＮＡは、３’末端に付加したアダプターを除去するため、ＮｏｔＩ制限酵素（５０　Ｕ／μＬ、Ｔａｋａｒａ）に下記の組成で消化された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　（３．ＰＣＲ）
　二本鎖相補的ＤＮＡからの１ｓｔ　ＰＣＲは、共通アダプタープライマーのＰ２０ＥＡとＴＣＲ　Ｃ領域特異的プライマー（ＣＡ１、ＣＢ１、ＣＧ１、ＣＤ１）または免疫グロブリンアイソタイプＣ領域特異的プライマー（ＣＭ１、ＣＡ１、ＣＧ１、ＣＤ１、ＣＥ１、ＣＫ１、ＣＬ１）を用いて行った。Ｃ領域の全長を含む配列を増幅できるようＣ領域の３′末端側、中央部あるいは５′側にプライマーを設定した。示す反応組成で、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分のサイクルを２０サイクル行った。用いたプライマー配列は表１－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　次に、第１のＰＣＲ増幅反応の産物である１ｓｔ　ＰＣＲ増幅産物を用いて、Ｐ２０ＥＡプライマーと各免疫グロブリンアイソタイプＣ領域特異的プライマーの間で次に示す反応組成でｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分のサイクルを２０サイクル行った。用いたプライマー配列は表１－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　第２のＰＣＲ増幅反応により合成した各２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲルで電気泳動した結果、目視化において目的のサイズの増幅産物を確認した（図１７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　プライマーの位置を鋳型に対して示したものを図１８～２５に示す。これにより、相当範囲の領域が、本発明の目的のＰＣＲプライマーとして適切であることが示され、本発明の原理に基づいて、適宜具体的な配列を決定することができることが理解される。
　（調製実施例４：ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株を用いた腫瘍細胞の検出）　本実施例では、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株を用いた腫瘍細胞の検出を行った。
　（材料および方法）
　（試料）
　健常人末梢血単核球細胞、ＭＯＬＴ－４ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株
　（方法）
　（１．Ｔ細胞系白血病細胞株の培養）
　Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞系細胞株として、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株Ｍｏｌｔ－４を用いた。１０％ウシ胎児血清、１００　ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００　μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ－グルタミンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ２下において培養し、全細胞数として１　ｘ　１０７細胞を回収した。ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄し、１　ｘ　１０６細胞／ｍＬになるように細胞を懸濁した。
　（２．健常人末梢血単核球細胞の分離）
　１例の健常人から全血５ｍＬをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ，　ＰＢＭＣ）を分離した。ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、細胞数をカウントして１　ｘ　１０６細胞／ｍＬになるように懸濁した。
　（３．細胞段階希釈液の調製）
　得られた１ｘ１０６　細胞／ｍＬのＰＢＭＣと１　ｘ　１０６　細胞／ｍＬのＭｏｌｔ－４細胞を下記の細胞数となるように混合し、Ｍｏｌｔ－４段階希釈細胞懸濁液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　（４．ＲＮＡ抽出とＲＮＡ量の測定）
　段階希釈細胞懸濁液からＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。２０　μＬの溶出液で溶出し、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＡ２６０の吸光度によりＲＮＡ量を定量した。ＲＮＡ電気泳動像を図２６に示し、各試料から得られたＲＮＡ量を表１－４Ｂに示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　（５．相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成）
　抽出されたＲＮＡ試料を用いて、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲを実施した。最初に、相補的ＤＮＡを合成するため、ＢＳＬ－１８Ｅプライマーと３．５　μＬのＲＮＡを混和して、７０℃で８分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）の存在下で逆転写反応を行い、相補的ＤＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　続いて、下記の二本鎖ＤＮＡ合成緩衝液中、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｈの存在下、１６℃で２時間保温し、二本鎖相補的ＤＮＡを合成した。さらに、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１６℃で５分間反応させ、５’末端平滑化反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　二本鎖ＤＮＡは、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりカラム精製された後、下記のＴ４　リガーゼ緩衝液中、Ｐ２０ＥＡ／１０ＥＡアダプター（表１－４Ｅ）およびＴ４　ｌｉｇａｓｅの存在下、１６℃で終夜保温して、ライゲーション反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　前述同様カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖ＤＮＡは、３’末端に付加したアダプターを除去するため、ＮｏｔＩ制限酵素（５０　Ｕ／μＬ、Ｔａｋａｒａ）に下記の組成で消化された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
　（６．ＰＣＲ）
　二本鎖相補的ＤＮＡから、表１－１に示す共通アダプタープライマーＰ２０ＥＡとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的プライマー（ＣＢ１）を用いて、１ｓｔ　ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲは次に示す組成で、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを２０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　次に、１ｓｔ　ＰＣＲ増幅産物を用いて、Ｐ２０ＥＡプライマーと各免疫グロブリンアイソタイプＣ領域特異的プライマーの間で次に示す反応組成でｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分のサイクルを２０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　得られた２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物からＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりプライマーを除去し、さらに１０倍希釈した２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を鋳型として、ロシュ社製次世代シーケンス解析装置（ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒベンチトップシステム）による解析を実施した。増幅には、Ｐ２０ＥＡアダプタープライマーにアダプターＢ配列を付加したＢ－Ｐ２０ＥＡプライマーとＴＣＲβ鎖Ｃ領域特異的配列にアダプターＡ配列および各ＭＩＤ　Ｔａｇ配列を付加したＨｕＶｂＦ　Ｐｒｉｍｅｒを利用した。ＰＣＲサイクルは、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分を１０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　（７．次世代シーケンス）
　ロシュ社製ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒシーケンス解析装置による次世代シーケンスを実施した。具体的には、ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　ｅｍＰＣＲ　Ｋｉｔ　（Ｌｉｂ－Ｌ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってｅｍＰＣＲを実施した。ビーズとＤＮＡの割合（ｃｏｐｙ　ｐｅｒ　ｂｅａｄｓ：ｃｐｂ）２で実施した。ｅｍＰＣＲ後、ビーズエンリッチメントにて回収されたビーズは、シーケンスラン試薬であるＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＫｉｔおよびＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ　Ｋｉｔを用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスランを実施した。　　　
　（８．データ解析）　得られたシーケンスデータ（ＳＦＦファイル）をＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ付属ソフトウェア（ｓｆｆｆｉｌｅもしくはｓｆｆｉｎｆｏ）により、ＭＩＤ　Ｔａｇ別のリード配列に分類し、Ｆａｓｔａ形式のシーケンスファイルを生成した。得られた有効リード数は１１６５１リードであった。レパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて、ＩＭＧＴデータベースのリファレンス配列との照合を行い、各リードのＢＶ領域、ＢＪ領域のアサインメントとＣＤＲ３配列の決定を行った。Ｍｏｌｔ－４細胞からは機能的配列を有するｉｎ－ｆｒａｍｅのＴＣＲリード（Ｒｅａｄ　１）とフレームシフトを起こしたＴＣＲリード（Ｒｅａｄ　２）が観察された（表１－４Ｊ）。いずれも同程度の頻度で検出され、Ｍｏｌｔ－４細胞由来のＴＣＲ遺伝子であると推測された。Ｍｏｌｔ－４細胞では２つのＴＣＲ遺伝子座における遺伝子再構成が既に報告され（文献１：Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ　Ａ，　Ｋｅｆｆｏｒｄ　Ｒ，　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，　Ｆｏｒｓｔｅｒ　Ａ，　Ｒａｂｂｉｔｔｓ　ＴＨ．　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｅｔａ－ｃｈａｉｎ　ｇｅｎｅｓ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９８５　Ａｕｇ；８２（１５）：５０６８－７２．）、機能的なＴＣＲ遺伝子の配列（Ｒｅａｄ　１）は既報と一致した（文献２：Ａｓｓａｆ　Ｃ，　Ｈｕｍｍｅｌ　Ｍ，　Ｄｉｐｐｅｌ　Ｅ，　Ｇｏｅｒｄｔ　Ｓ，　Ｍuｌｌｅｒ　ＨＨ，　Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ　Ｉ，　Ｏｒｆａｎｏｓ　ＣＥ，　Ｓｔｅｉｎ　Ｈ．　Ｈｉｇｈ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｅｔａ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｆａｍｉｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＧｅｎｅＳｃａｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．　Ｂｌｏｏｄ．　２０００　Ｊｕｌ　１５；９６（２）：６４０－６．，　ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　Ｍ１２８８６．１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
　本次世代ＴＣＲレパトア解析法によるＭｏｌｔ－４細胞の検出限界を調べるため、段階希釈試料から獲得されたＴＣＲリード中にＭｏｌｔ－４細胞由来の２つのＴＣＲリードを検索、照合した（図２７（Ａ～Ｄ）、）。その結果、Ｒｅａｄ　１およびＲｅａｄ　２は段階希釈試料中に細胞数に応じてリードが検出され、Ｒｅａｄ　１は０．１％試料に６１　Ｒｅａｄｓ（３．１％）、Ｒｅａｄ　２は０．０１％の試料中に１　Ｒｅａｄ（０．０１％）存在することが確認された（表１－４Ｋ）。０．０１％試料では、機能的ＴＣＲであるＲｅａｄ　１が検出されなかったが、一方で機能的欠損が推測されるＲｅａｄ　２が検出された。このことは、１つのＴ細胞から由来する複数のＴＣＲ遺伝子を検索することで腫瘍細胞検出の確実性が高まると示唆される。これらの結果は、本法は腫瘍細胞を高感度で検出できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　（結果）
　Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　バイオアナライザによるＲＮＡ電気泳動像を図２６に示す。細胞段階希釈液より全ＲＮＡを抽出して、Ａｇｉｌｅｎｔ社製バイオアナライザを用いてＲＮＡ量を測定した。マイクロチップ型電気泳動装置でＲＮＡを分離し、ＲＮＡの品質チェックを行った。いずれの試料においても、２８Ｓ（上バンド）および１８Ｓ　ｒＲＮＡ（下バンド）が検出され、分解を受けていないＲＮＡが得られたことを示している。
　Ｍｏｌｔ－４細胞段階希釈試料におけるＴＣＲリードを図２７（Ａ～Ｄ）、に示す（配列番号１１６５～１３２４）。１０％、１％、０．１％、０．０１％の各Ｍｏｌｔ－４段階希釈試料から獲得されたＴＣＲリードを表１－記する。リード数の多い順にランキングし、上位４０位までを示した。０．０１％試料についてはランキング３６５～４０４を示した。各リードのＴＲＢＶ、ＴＲＢＪおよびＣＤＲ３アミノ酸配列、リード数を示す。Ｍｏｌｔ－４由来の機能的ＴＣＲリード（ＴＲＢＶ２０－１／ＴＲＢＪ２－１／ＣＳＡＲＥＳＴＳＤＰＫＮＥＱＦＦＧ（配列番号１１６６））は太字および背景灰色で示し、もう一方の機能欠損が推測されるＴＣＲリード（ＴＲＢＶ１０－３／ＴＲＢＪ２－５／ＣＡＩＳＥＰＴＧＩＲＲＤＰＶＬＲ（配列番号１１６５））は太字で示した。
　Ｍｏｌｔ－４細胞段階希釈試料におけるＴＣＲリード数と検出感度は図２８に示す。Ｍｏｌｔ－４細胞から２つのＴＣＲリードが検出された（▲：ＴＲＢＶ２０－１／ＴＲＢＪ２－１／ＣＳＡＲＥＳＴＳＤＰＫＮＥＱＦＦＧ（配列番号１１６６）、○：ＴＲＢＶ１０－３／ＴＲＢＪ２－５／ＣＡＩＳＥＰＴＧＩＲＲＤＰＶＬＲ（配列番号１１６５））。１０％、１％、０．１％、０．０１％の各Ｍｏｌｔ－４段階希釈試料から獲得されたＴＣＲリード中に検出されたＭｏｌｔ－４由来のＴＣＲリードの割合を示す。それぞれＲｅａｄの検出限界（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ）は、０．１％（▲）と０．０１％（○）であった。
　（解析試験例）
　（解析試験例１　健常者のＢＣＲレパトア解析）
　本実施例では、健常者のＢＣＲレパトアの比較を行った。
　（材料および方法）
　（材料）
　健常者１検体の末梢血単核球細胞より得られるＲＮＡより、非バイアス的に得られたＢＣＲのｃＤＮＡをＲｏｃｈｅ　ＧＳ－Ｊｕｎｉｏｒで配列決定したリードセットを使用した。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのクラスごとのリードセットとなっている。
　（方法）
　方法の全体像を図３０（図２９にはＴＣＲの解析スキームを示す）に示す。
　参照データベースにはＩＭＧＴより既報のアリルの核酸配列を取得して使用した。相同性検索にはＢＬＡＳＴＮを使用したが、領域ごとに以下のパラメータを設定した。
　　Ｖ ミスマッチペナルティ＝－１、最短アラインメント長＝３０、最短カーネル長＝１５
　　Ｄ ワード長＝７、ミスマッチペナルティ＝－１、ギャップペナルティ＝０、       最短アラインメント長＝１１、最短カーネル長＝８
　　Ｊ ミスマッチペナルティ＝－１、最短ヒット長＝１８、最短カーネル長＝１０
　　Ｃ 最短ヒット長＝３０、最短カーネル長＝１５
最も近しい参照アリルを選択する際の指標は以下の優先順位で適用した。
　　１．　一致塩基数、２．　カーネル長、３．　スコア、４．　アラインメント長その後、クラスごとに、各領域の遺伝子名の出現頻度を算出し、相互に比較した。また、ＩｇＧ、ＩｇＡにはサブクラスが存在するが、サブクラス間の比較も行った。
　（結果）
ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのリードセットごとにＣ遺伝子名の出現頻度を導出した結果を図３１に示す。各クラスに対応する遺伝子名が専ら出現しており、また、ｎｏ－ｈｉｔがほとんど見られないことから、解析対象であるリードセットのクオリティは十分であることが示唆される。
　各クラスについてＤレパトアを算出した結果を表２－３および表２－４に示す。表２－３および表２－４はクラス間のＤレパトアの比較を示す。遺伝子名とＣＤＲ３アミノ酸配列ごとに、出現リード数を記述し、リード数１の遺伝子名およびアミノ酸配列は省略した。また、このほか、Ｖレパトアを図３２（ＡおよびＢ）に、Ｊレパトアを図３３に示す。図３４（ＡおよびＢ）はサブクラス間のＶレパトアの比較を示す。図３５はサブクラス間のＪレパトアの比較を示す。Ｄについては、Ｄ遺伝子名とＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せについて頻度を導出してある。
（表２－３）クラス間のＤレパトアの比較　　縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
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Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
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Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
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Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
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Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
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Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
（表２－４）サブクラス間のＤレパトアの比較　　縦軸：頻度（％）、横軸：遺伝子名
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
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Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
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Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　以上の結果から、本発明の解析技術で数分で算出することができ、迅速な分析が実現されることが示された。
　（解析試験例２　検体間のＢＣＲレパトア比較）
　本実施例では、検体間のＢＣＲレパトアの比較を行った。
　（材料および方法）
　（材料）
　解析実施例１と同様の手法で得られた５検体のリードセットで、４検体（Ｎｏ．１－４）が健常人、１検体（Ｎｏ．５）が白血病患者である。
　（方法）
　解析実施例１と同様の方法で各検体について、クラスごと、領域ごとのレパトアを導出し、検体間で比較を行った。
　（結果）
　結果の一例としてＩｇＭにおけるＶレパトアの比較結果を図３６（ＡおよびＢ）に、Ｊレパトアの比較結果を図３７に示す。Ｎｏ．５の検体のみ大きく異なることが示されている。
　（解析試験例３：健常人のＴＣＲレパトアの比較）
　本実施例では、健常人のＴＣＲレパトアの比較を行った。
　（材料および方法）
　（材料）
　実施例１と同様の手法で得られた１０検体のリードセットで、１０検体（Ｎｏ．１－１０）とも健常人である。
　（方法）
　実施例１と同様の方法で各検体について、クラスごと、領域ごとのレパトアを導出し、検体間で比較を行った。
　（結果）
　結果を図３８～４１に示す。図３８（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＶのレパトア比較の結果を示し、図３９（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＢＶのレパトア比較の結果を示し、図４０（Ａ～Ｄ）は、検体間のＴＲＡＪレパトア比較の結果を示し、図４１は、検体間のＴＲＢＪレパトア比較の結果を示す。
　いずれの結果も数分程度で結果を得ることができた。
　本解析方法では、従来汎用されるＨｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴでは提供されなかったＣ領域の解析も実現することができる。本システムでは領域ごとに「遺伝子名単位」「アリル単位」を選択可能である点も利点として挙げることができる。理論に束縛されることを望まないが、従来汎用されるＨｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴではこの選択が実現していないからである。Ｈｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴ方式の（現在における）問題点は、Ｄ領域の分類が十分になされないことにあるが、本システムではこれを解決したといえる。すなわち、Ｈｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴではＤ領域のデータベースのコンテンツが十分でなく、ＤＢレコードに類似しないＤ領域配列は十把一絡げで”ｎｏ　ｈｉｔ”となってしまう。それに対して本発明のシステムでは、Ｄ遺伝子名／アリルの代わりにＣＤＲ３配列を分類項目として利用できるため、現状で可能な限りの分類を行うことができる。本システムでは、本発明のシステムでは配列数に制限なく利用することができる。理論に束縛されることを望まないが、レアなクローンを探索することを目的に更なるディープシーケンシングを行った場合でも変更なしに解析可能なよう、配慮したことによる。代わりに、同時に処理される解析ジョブ数を制限する（満席の場合は自動的に後回しになる）機能、すなわちジョブキュー方式の管理機能を導入して、計算資源の枯渇を防いでいる。このことにより、最大配列数が制限されているＨｉｇｈ－Ｖ－ＱＵＥＳＴの欠点を解消する。
　（解析システムの実施例）
　（解析システムの実施例１：T細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）の診断応用）
　本実施例では、本発明のシステムのT細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ－ＬＧＬ）の診断への応用を確認する実験を行った。
試料：T細胞大顆粒リンパ球性白血病由来末梢血単核球細胞
方法
　（RNA抽出）
　１例のＴ細胞大顆粒リンパ球性白血病を罹患した患者から全血７ｍＬをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ，　ＰＢＭＣ）を分離した。単離した１．６６ｘ１０７細胞のＰＢＭＣからＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。取得されたＲＮＡは、吸光度計を用いてＡ２６０の吸光度により定量され、全ＲＮＡ量は１５μｇであった。
　（相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成）
　抽出されたＲＮＡ試料を用いて、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲを実施した。最初に、相補的ＤＮＡを合成するため、ＢＳＬ－１８Ｅプライマー（表３－１Ａ）と　３．５　μＬのＲＮＡを混和して、７０℃で８分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）の存在下で逆転写反応を行い、相補的ＤＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
続いて、下記の二本鎖DNA合成緩衝液中、E. coli DNA polymerase I、E.coli DNA Ligase、RNase Hの存在下、16℃で2時間保温し、二本鎖相補的DNAを合成した。さらに、T4DNA polymeraseを16℃で5分間反応させ、5’末端平滑化反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
二本鎖DNAは、HighPure PCR Cleanup Micro Kit（Roche）によりカラム精製された後、下記のT4 リガーゼ緩衝液中、P20EA/10EAアダプター（表３－１Ａ）およびT4ligaseの存在下、16℃で終夜保温して、ライゲーション反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
前述同様カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖DNAは、3’末端に付加したアダプターを除去するため、NotI制限酵素（50 U/μL、Takara）に下記の組成で消化された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
３．PCR
二本鎖相補的DNAから、共通アダプタープライマーP20EAとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー（CA1またはCB1）を用いて、1stPCR増幅を行った。PCRは次に示す組成で、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
次に、1stPCR増幅産物を用いて、P20EAプライマーとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー（CA2またはCB2）を用いて、次に示す反応組成で2nd PCRを行った。PCRサイクルは、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
得られた2ndPCR増幅産物からHigh PurePCR Cleanup Micro Kit（Roche）によりプライマーを除去し、さらに10倍希釈した2nd PCR増幅産物を鋳型として、Ｒｏｃｈｅ社製次世代シーケンス解析装置（GSJuniorベンチトップシステム）による解析を実施した。増幅には、P20EAアダプタープライマーにアダプターB配列を付加したB-P20EAプライマーとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的配列にアダプターA配列および各MIDTag配列（MID-1~26）を付加したHuVaF-01～HuVaF10（α鎖）およびHuVbF-01～HuVbF-10（β鎖）を利用した。PCRサイクルは、95℃　30秒、55℃　30秒、72℃　１分を10サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
アガロースゲル電気泳動において600bp程度の増幅産物を含むバンドを目視化において切り出し、DNA精製キット（QIAEX II Gel Extraction Kit、Qiagen）を用いて精製した。回収されたPCR増幅産物はQuant-TTMPicoGreen（登録商標） dsDNA AssayKit （Invitrogen）によりDNA量を測定した。
 ４．次世代シーケンス
Ｒｏｃｈｅ社製GSJuniorシーケンス解析装置による次世代シーケンスを実施した。具体的には、GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib-L)を用いて、メーカーのプロトコールに従ってemPCRを実施した。ビーズとDNAの割合（copyper beads：cpb）0.5で実施した。emPCR後、ビーズエンリッチメントにて回収されたビーズは、シーケンスラン試薬であるGS JuniorTitanium Sequencing KitおよびPicoTiterPlateKitを用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスランを実施した。
 ５．データ解析
得られたシーケンスデータ（SFFファイル）をGS Junior付属ソフトウェア（sfffileもしくはsffinfo）により、MID Tag別のリード配列に分類し、Fasta形式のシーケンスファイルを生成した。シーケンスリードの解析は、IMGT(the international ImMuno　Gene　Ticsinformation system, http://www.imgt.org)データベースから入手されるV、D、J、C配列をリファレンス配列として各リード配列のV、D、J、C配列をアサインした。アサインメントには新規開発ソフトウェア（RepertoireGenesis）を用いた。ＴＣＲαにおいては、２２８３３のリードが得られ、１６４０７リード（７１．９％）がアサインされた。ユニークリード数は１７０５リードであった。ＴＣＲβにおいては、１２１０８０のリードが得られ、８１５４２リード（６７．３％）がアサインされた。ユニークリード数は９２２４リードであった。得られたリードについて、同一のＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＡＪ遺伝子およびＣＤＲ３配列をもつリードをユニークリードとして、その頻度を調べた（表３－１）。また、同様に、同一のＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＢＪ遺伝子およびＣＤＲ３配列をもつリードについて頻度を調べた（表３－２）。その結果、ＴＲＡレパトアでは、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＪ１５およびＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）をもつリードが１９７１リード（１２．５３％）を占め、特定のＴＣＲを発現する細胞がクローナルに増加している可能性を示唆した。また、ＴＲＢレパトアでは、ＴＲＢＶ２９－１、ＴＲＢＪ２－７およびＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）をもつリードが２２５６８リード（２８．５７％）を占めた。これらの結果から、ＴＲＡＶ１０およびＴＲＡＪ１５を有するＴＣＲαとＴＲＢＶ２９－１およびＴＲＢＪ２－７を有するＴＣＲβからなるＴＣＲ分子を発現するＴ細胞がモノクローナルに増殖している可能性が示唆された。健常人１０例とＬＧＬ患者の間で種々の多様度指数について比較した（表３－３）。多様度を示すシャノン・ウェーバー指数（H'）、シンプソン指数（λ）、逆シンプソン指数（1/λ）およびPielouの指数（Ｊ）は健常人と比べ低い値を示し、多様性が減少していることが示された。
 ６．診断としての利用
本ＬＧＬ患者においては、薬物療法などの治療を施行した後、ＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１５／ＣＶＶＲＡＴＧＴＡＬＩＦＧ（配列番号１４５０）あるいはＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ２－７／ＣＳＶＥＲＧＧＳＬＧＥＱＹＦＧ（配列番号１５００）を持つシーケンスリードを指標として、微少残存病変の検出ができると期待される。また、リード頻度を用いた定量的解析から白血病細胞に対する治療効果を測ることができると考えられる。また、種々の多様度指数を用いて、クローナリティの増加疾患の有無を推測できる可能性が示唆された。
（表３－１）　ＴＲＡリード（上位５０位）（配列番号１４５０－１４９９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
表３－２　ＴＲＢリード（上位５０位）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
表３－３　多様性指数
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
図４４にＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖レパトア解析におけるユニークリード数の分布を示す。全シーケンスリードのユニークリード（他のリードと共通性のない塩基配列）について、コピー数を横軸に分布を調べた。ＴＣＲαにおいては、１リードしか検出されなかったリード（シングル）は全体の７３．３％（１２５０リード）、ＴＣＲβ鎖においては７０．５％（６５０２リード）であった。
　図４５ではＴＲＡＶおよびＴＲＡＪレパトアを示す。全リードにおける各ＴＲＡＶとＴＲＡＪの使用頻度を示した。横軸は、ＴＲＡＶ遺伝子(上グラフ)およびＴＲＡＪ遺伝子（下グラフ）を示す。縦軸は、全リードに占める割合（％Ｕｓａｇｅ）を示す。
　図４６ではＴＲＡレパトアの３Ｄプロットを示す。全リードにおける各ＴＲＡＶとＴＲＡＪの組み合わせの使用頻度を３次元プロットで示す。横軸はＴＲＡＪ遺伝子、奥行き軸はＴＲＡＶ遺伝子、縦軸は使用頻度（％Ｕｓａｇｅ）を示す。最も高い使用頻度を示したのはＴＲＡＶ１０とＴＲＡＪ１５の組み合わせである（１２．５３％）。図４７ではＴＲＢＶおよびＴＲＢＪレパトアを示す。全リードにおける各ＴＲＢＶとＴＲＢＪの使用頻度を示した。横軸は、ＴＲＢＶ遺伝子(上グラフ)およびＴＲＢＪ遺伝子（下グラフ）を示す。縦軸は、全リードに占める割合（％Ｕｓａｇｅ）を示す。
　図４８ではＴＲＢレパトアの３Ｄプロットを示す。全リードにおける各ＴＲＢＶとＴＲＢＪの組み合わせの使用頻度を３次元プロットで示す。横軸はＴＲＢＶ遺伝子、奥行き軸はＴＲＢＪ遺伝子、縦軸は使用頻度（％Ｕｓａｇｅ）を示す。最も高い使用頻度を示したのはＴＲＢＶ２９－１とＴＲＢＪ２－７の組み合わせである（２８．５７％）。
　（解析システムの実施例２： HLA-A2402大腸がん患者の大腸がん組織に浸潤するT細胞の解析）　本実施例では、本発明の解析システムを用いてHLA-A2402大腸がん患者の大腸がん組織に浸潤するT細胞の解析を行った。
　（材料および方法）
試料：外科手術にて摘出された大腸がん患者の腫瘍組織、健常人末梢血
方法
　（大腸がん組織の採取と保存）
　６０例の大腸がん患者における腫瘍摘出手術において腫瘍組織を採取した。摘出臓器のがん病変部から大豆大の大きさに相当する１００ｍｇの組織を採材し、５ｍｍ四方に切断したものをただちにRNA安定化試薬（RNAlater（登録商標）、Ambion）に浸漬した。一晩、4℃で保管した後、RNAlater（登録商標）を除去した後－８０℃で保管した。
　（健常人末梢血の単離）
　コントロールとして、健常人末梢血細胞を用いた。１０例の健常人から全血5ｍＬをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（peripheral bloodmononuclear cells, PBMC）を分離した。単離した5×106細胞のPBMCからRNeasyLipid TissueMini Kit (QIAGEN, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。取得されたRNAは、吸光度計を用いてA260の吸光度により定量された（表３－３Ａ）。表３－３Ａ　健常人末梢血細胞の全ＲＮＡ量
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000065
　（HLAハプロタイプの検討）
　がん組織におけるHLAの発現およびHLAハプロタイプを同定するため、HLA-Aタイピングを実施した。RNAlater（登録商標）に浸漬したがん組織を一部取り出し、QIAampDNA Mini Kit（Qiagen, Germany）を用いてゲノムDNAを抽出した。次にWAKFlow HLAタイピング試薬 HLA-A（Wakunaga）を用いて増幅および標識を行い、Luminex（LuminexCorp.）で解析した。その結果、HLA-A2402遺伝子は６０検体中２５検体でホモもしくはヘテロで発現し
ていた（表３－４）。
表３－４　ＨＬＡ－Ａ２４０２を発現した大腸がん組織の一覧
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
　（RNA抽出とRNA量の測定）
　HLA-A2402遺伝子を発現する25検体においてＴＣＲレパトアを解析するため、RNAlater（登録商標）に浸漬した組織を一部取り出し、RNeasyLipidTissue Mini Kit (QIAGEN, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。カラムからの溶出はRNAaseフリーの滅菌水50 μLで実施した。各試料から得られたRNA量を表３－５に示した。
表３－５　大腸がん試料の全ＲＮＡ量
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000068
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000069
　（相補的DNAおよび二本鎖相補的DNAの合成）
　抽出されたRNA試料を用いて、adaptor-ligationPCRを実施した。最初に、相補的DNAを合成するため、BSL-18Eプライマーと3.5 μLのRNAを混和して、70℃で8分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてRNase阻害剤（RNAsin）の存在下で逆転写反応を行い、相補的DNAを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000070
続いて、下記の二本鎖DNA合成緩衝液中、E. coli DNA polymerase I、E.coli DNA Ligase、RNase Hの存在下、16℃で2時間保温し、二本鎖相補的DNAを合成した。さらに、T4DNA polymeraseを16℃で5分間反応させ、5’末端平滑化反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000072
二本鎖DNAは、HighPure PCR Cleanup Micro Kit（Roche）によりカラム精製された後、下記のT4 リガーゼ緩衝液中、P20EA/10EAアダプターおよびT4ligaseの存在下、16℃で終夜保温して、ライゲーション反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000073
前述同様カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖DNAは、3’末端に付加したアダプターを除去するため、NotI制限酵素（50 U/μL、Takara）に下記の組成で消化された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000074
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000075
５．PCR
二本鎖相補的DNAから、共通アダプタープライマーP20EAとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー（CB1）を用いて、1stPCR増幅を行った。PCRは次に示す組成で、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000076
次に、1stPCR増幅産物を用いて、P20EAプライマーと各免疫グロブリンアイソタイプC領域特異的プライマーの間で次に示す反応組成でnested PCRを行った。PCRサイクルは、95℃30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを20サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
 
得られた2ndPCR増幅産物からHigh PurePCR Cleanup Micro Kit（Roche）によりプライマーを除去し、さらに10倍希釈した2nd PCR増幅産物を鋳型として、Ｒｏｃｈｅ社製次世代シーケンス解析装置（GSJuniorベンチトップシステム）による解析を実施した。増幅には、P20EAアダプタープライマーにアダプターB配列を付加したB-P20EAプライマーとTCRα鎖およびβ鎖C領域特異的配列にアダプターA配列および各MIDTag配列を付加したHuVaFおよびHuVbFPrimerを利用した。PCRサイクルは、95℃　30秒、55℃　30秒、72℃　１分を10サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000079
　６．次世代シーケンス
Ｒｏｃｈｅ社製GSJuniorシーケンス解析装置による次世代シーケンスを実施した。具体的には、GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib-L)を用いて、メーカーのプロトコールに従ってemPCRを実施した。ビーズとDNAの割合（copyper beads：cpb）2で実施した。emPCR後、ビーズエンリッチメントにて回収されたビーズは、シーケンスラン試薬であるGS JuniorTitanium Sequencing KitおよびPicoTiterPlateKitを用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスランを実施した。
 ７．データ解析
得られたシーケンスデータ（SFFファイル）をGS Junior付属ソフトウェア（sfffileもしくはsffinfo）により、MID Tag別のリード配列に分類し、Fasta形式のシーケンスファイルを生成した。レパトア解析ソフトウェア（RepertoireGenesis）を用いて、IMGTデータベースのリファレンス配列との照合を行い、各リードのAV、BV領域およびAJ、BJ、領域のアサインメントとCDR3配列の決定を行った。
 ８．健常人１０例の解析における重複ユニークリードの抽出
正常コントロールとして、１０例の健常人末梢血単核球のＴＣＲシーケンスを調べた。各健常人から得られたＴＣＲαおよびＴＣＲβシーケンスリードについて、Ｖ、ＪおよびＣＤＲ３配列を指標にして個体間で重複するリードを検索し、抽出した。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の間で、重複するユニークリード数ならびにその重複ユニーリードをもつ個体数を調べた（表３－６）。ＴＣＲβ鎖に比べ、ＴＣＲα鎖において著しく重複ユニークリードの数が多く（８０９対３９）、その割合も高かった（２．３７％対０．１９％）。また、ＴＣＲα鎖は最大１０個体中８個体に重複するリードが存在し、一方でＴＣＲβ鎖のすべての重複リードは２個体だけに重複していた。これらの結果は、ＴＣＲαレパトアは個体間でより類似していることを示唆している。表３－６　健常人における重複ユニークリード数
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000080
　９．ＴＣＲα鎖における重複リードの解析
ＴＣＲβ鎖に対比し高い個体間での重複度を示すＴＣＲα鎖について、重複リードの塩基配列を詳細に調べた。その結果、高い重複度を示すＴＣＲリードの多くは、インバリアント鎖を発現するとして知られるナテュラルキラーＴ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ　Ｔ，ＮＫＴ）あるいは粘膜関連インバリアントＴ細胞（Ｍｕｃｏｓａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｖａｒｉａｎｔ　Ｔ、ＭＡＩＴ）由来のＴＣＲα遺伝子であることが分かった（表３－７）。ＮＫＴ細胞はＴＲＡＶ１０（Ｖα２４）－ＴＲＡＪ１８を、ＭＡＩＴはＴＲＡＶ１－２（Ｖα７．２）－ＴＲＡＪ３３からなるＴＣＲを主に発現する。最近、ＭＡＩＴのＴＣＲは、ＭＲ１分子によって提示された細菌のビタミンＢ代謝物を認識することが報告され、免疫監視機能における役割が注目されている（Nature. 2012 Nov 29;491(7426):717-23；JExp Med. 2013 Oct21;210(11):2305-20）。重複個体数が４以上の重複リードについて、既報のインバリアントＴＣＲと照合した結果、その４５％がインバリアントＴＣＲで占められることが分かった（表３－７）。ＴＣＲα鎖において高頻度重複リードが存在するのとは対称的に、ＴＣＲβ鎖の重複個体数は最大２であった（表３－８）。従って、ＴＣＲαでの高い重複度はインバリアントＴＣＲの存在によると推測される。４個体以上に重複する３８種の高頻度重複リードのうち既報のインバリアントＴＣＲと照合できなかったＴＣＲαリードを２１種類特定できた（表３－９）。これらは、新規インバリアントＴＣＲである可能性が示唆される。
表３－７　健常人における重複ＴＣＲα鎖リード配列
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
表３－８　健常人における重複ＴＣＲβ鎖リード配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
表３－９　インバリアントＴＣＲ候補遺伝子
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
１０．大腸がん患者組織における重複リードの解析
がん患者のがん組織にはがん抗原特異的Ｔ細胞が存在し、抗腫瘍効果に重要な働きをすることが知られている。がん抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を同定するため、特定のＨＬＡを有する患者を対象にＴＣＲレパトアを解析して、特定の抗原に反応して増殖するＴＣＲ遺伝子を同定する。本実験では、２５例の共通のＨＬＡ－Ａ２４０２を有する大腸がん患者のがん組織を用いてＴＣＲレパトア解析を実施し、がん患者サンプル間で重複して存在するユニークリードを検索した（表３－１０）。その結果、ＴＣＲα鎖においては２１３リード（１．６５％）、ＴＣＲβ鎖では４９リード（０．１１％）が複数の患者に重複して存在することが分かった。健常人と同様に、ＴＣＲα鎖においては最大２５例中１２例に存在する高頻度重複リードが存在する一方で、ＴＣＲβ鎖は最大２個体で重複するのみであった。ＴＣＲα鎖では、最大１２検体の間で共通するリードが存在し、４検体以上のがん組織で重複する７リードの配列は１例を除きＭＡＩＴに由来するＴＲＡＶ１－２／ＴＲＡＪ３３を有するＴＣＲα鎖であった（表３－１１）。（表３－１０　がん組織における重複ユニークリード数とがん特異的リード数）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000085
表３－１１　がん患者における重複ＴＣＲαリード配列とがん特異的ＴＣＲαリード
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000087
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000088
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000089
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000090
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
１１．がん特異的ＴＣＲ配列の抽出
高頻度に重複するＴＣＲαリードはインバリアントＴＣＲを多く含んでいる。これらの配列は正常コントロールである健常人にも存在し、腫瘍抗原に反応するＴＣＲではない。がん特異的ＴＣＲを抽出する目的で、がん組織で重複するリードのうち健常人試料で検出されないものをがん特異的ＴＣＲとして分類した（表３－１２）。健常人にも存在する重複リードはＴＣＲα鎖では５６リード、一方ＴＣＲβ鎖ではわずか１リードであった。重複個体数が４個体以上のリードはインバリアントＴＣＲまたは健常人にも存在するリードであった。がん特異的リードは３個体間以内で重複し、ＴＣＲα鎖では１５７リード（１．２２％）、ＴＣＲβ鎖では４８リード（０．１１％）検出された。（ＴＣＲαβペアリードの推定方法については図４９も参照）。
表３－１２　がん患者における重複ＴＣＲβリード配列とがん特異的ＴＣＲβ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
表３－１３　重複個体の組み合わせによるペアＴＣＲαβの推測
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000097
　（解析システムの実施例３：Ion PGMシステム（Ion Torrent社）を用いたシーケンス）　（１．ＲＮＡ抽出）　健常人から全血５ｍＬをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ，　ＰＢＭＣ）を分離した。単離したＰＢＭＣからＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。取得されたＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて定量された。
　（２．相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成）
　抽出されたＲＮＡ試料を用いて、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲを実施した。方法は実施例１に示した方法に従って実施した。すなわち、ＢＳＬ－１８Ｅプライマー（表３－１４）とＲＮＡを混和してアニーリング後、逆転写酵素を使って相補鎖ＤＮＡを合成した。続いて、二本鎖相補的ＤＮＡを合成し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる５’末端平滑化反応を行った。Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりカラム精製した後、Ｐ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡアダプターをＬｉｇａｔｉｏｎ反応にて付加した。カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡは、ＮｏｔＩ制限酵素により消化された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
　（３．ＰＣＲ）
　二本鎖相補的ＤＮＡから、表３－１４に示す共通アダプタープライマーＰ２０ＥＡとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的プライマー（ＣＡ１またはＣＢ１）を用いて、第１のＰＣＲ増幅反応の産物である１ｓｔ　ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲは次に示す組成で、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを２０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000099
　次に、１ｓｔ　ＰＣＲ増幅産物を用いて、Ｐ２０ＥＡプライマーとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的プライマー（ＣＡ２またはＣＢ２）を用いて、次に示す反応組成で２ｎｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを２０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
　１０倍希釈した２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を鋳型として、図１０に示したＰ２０ＥＡアダプタープライマーにアダプターＢ配列を付加したＢ－Ｐ２０ＥＡプライマーとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的配列にアダプターＡ配列および各ＭＩＤ　Ｔａｇ配列（ＭＩＤ－１～２６）を付加したＨｕＶａＦ－０１～ＨｕＶａＦ１０（α鎖）およびＨｕＶｂＦ－０１～ＨｕＶｂＦ－１０（β鎖）を利用して、ＰＣＲを行った。使用したプライマー配列は、表６に示した。ＰＣＲサイクルは、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分を１０サイクル行った。ＰＣＲ増幅を確認するため、１０μＬの増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000103
　次に、IonOneTouch2システム（Ion Torrent社）を用いて、エマルジョンＰＣＲを行いテンプレートの調整を行う。Ion OneTouch2（IonTorrent社）キットを用いて下記の溶液を混合する
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000104
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000105
IonSphereParticle（ＩＳＰ）ビーズを攪拌し、下記のように１００μＬのＩＳＰを加え混合する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000106
上記１０００μＬを十分に混合後、５分間攪拌する。Ion OneTouch Plus Reaction FilterAssemblyをセットアップした後、上記全量をローディングする。さらに、５００μＬのIonOneTouch Reaction Oilを追加した後、ラン開始する。約５．５時間の反応を経た後、サンプルを回収する。遠心を行い、過剰な溶液を除去した後、ＩＳＰを回収する。
 エンリッチメント
Ion OneTouch ES（IonTorrent社）を用いてサンプルのエンリッチメントを行う。新しいチューブをチップローダーにセットし、チップアームを取り付ける。次に、下記のMelt-Off溶液を調整する。
 Melt-Off溶液
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
８連チューブの各ウェルに下記の溶液を分注する
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000108
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109
　試薬をセットアップした後に、Ｉｏｎ　ＯｎｅＴｏｕｃｈ　ＥＳの装置を開始してエンリッチメントを行う。終了後、ＩＳＰの入ったチューブを回収し、穏やかに５回転倒混和する。その後、Ion PGM Sequencing 200 Kit v2（IonTorrent社）を用いてシーケンスを行う。
　このようにして、本発明のシステムは、ロシュの装置以外の装置を用いてもできることがわかる。
 （解析システムの実施例4：Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＭｉＳｅｑシステムを用いたＴＣＲシーケンス）
　本実施例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＭｉＳｅｑシステムを用いたＴＣＲシーケンスでも本発明のシステムが実施可能かを実証する。
　（１．ＲＮＡ抽出）
　健常人から全血５ｍＬをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ，　ＰＢＭＣ）を分離した。単離したＰＢＭＣからＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。取得されたＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて定量された。
 （２．相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成）
　抽出されたＲＮＡ試料を用いて、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲを実施した。方法は実施例１に示した方法に従って実施した。すなわち、ＢＳＬ－１８Ｅプライマー（表３－２１）とＲＮＡを混和してアニーリング後、逆転写酵素を使って相補鎖ＤＮＡを合成した。続いて、二本鎖相補的ＤＮＡを合成し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる５’末端平滑化反応を行った。Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりカラム精製した後、Ｐ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡアダプターをＬｉｇａｔｉｏｎ反応にて付加した。カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡは、ＮｏｔＩ制限酵素により消化された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000110
　（３．ＰＣＲ）
　二本鎖相補的ＤＮＡから、表１に示す共通アダプタープライマーＰ２０ＥＡとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的プライマー（ＣＡ１またはＣＢ１）を用いて、第１のＰＣＲ増幅反応の産物である１ｓｔ　ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲは次表３－２２に示す組成で、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを２０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000111
　次に、１ｓｔ　ＰＣＲ増幅産物を用いて、Ｐ２０ＥＡプライマーとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的プライマー（ＣＡ２またはＣＢ２）を用いて、次表３－２３に示す反応組成で２ｎｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを２０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000112
　（４．ＭｉＳｅｑ　Ｄｕａｌ－ｉｎｄｅｘｅｄ　Ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
　１０倍希釈した２ｎｄ　ＰＣＲ増幅産物を鋳型として、図５０のようにＰ２０ＥＡアダプタープライマーにＰ５配列、Ｒ１　Ｓｅｑ　Ｐｒｉｍｅｒ配列、Ｉｎｄｅｘ２配列を付加したＰ５－Ｐ２０ＥＡプライマーとＴＣＲα鎖またはβ鎖Ｃ領域特異的配列にＰ７配列、Ｒ２　Ｓｅｑ　Ｐｒｉｍｅｒ配列、Ｉｎｄｅｘ１配列を付加したＰ７－ＣＡ３またはＰ７－ＣＢ３を用いて、ＰＣＲ増幅反応を行う。異なるＩｎｄｅｘ１配列とＩｎｄｅｘ２配列を使って増幅プライマーに標識し、複数の試料から増幅したＴＣＲ遺伝子増幅産物を識別する。使用するプライマー配列は、表３－２４に示した。ＰＣＲサイクルは、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分を１０サイクル行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000113
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000114
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000115
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000116
　（５．電気泳動によるＰＣＲ産物の精製）
E-Gelアガロースゲル電気泳動システムを用いて、増幅したＰＣＲ産物を電気泳動する。高感度蛍光染色剤入りプレキャストゲルを電気泳動装置に設置し、２％アガロースゲルにウェル当たり２０μＬの試料を入れ、電気泳動を行う。５００－６００ｂｐに相当する目的バンドが溶出された時点で、増幅産物を回収する。回収されたPCR増幅産物はQuant-TTMPicoGreen（登録商標） dsDNA AssayKit （Invitrogen）によりＤＮＡ量を測定する。得られたＤＮＡ量をもとに、複数の試料を等モル量ずつ混合し、シーケンス反応を行う。
 （６．ＭｉＳｅｑ　シーケンス）
ＭｉＳｅｑ　サンプルシートを作成する。ＰｈｉＸコントロールを５－５０％の範囲で加え、ＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｖ．３　（６００ｃｃｙｌｅ、イルミナ社）をインストールしたＭｉＳＥＱシーケンス装置でシーケンスを開始する。約６５時間後に、シーケンスデータを得ることができる。
　（解析システムの実施例５：ＴＣＲαおよびＴＣＲβのレパトアの多様性および類似性を決定し、潜在的な新規インバリアントＴＣＲα鎖を同定するためのハイスループット配列解析法～ＮＫＴ細胞およびＭＡＩＴ細胞によって発現されたインバリアントＴＣＲを例として）
　解析システムの実施例１～４に記載の手法をまとめる実施例として以下に総合した実施例を記載する。
　（はじめに）
　これまでに述べてきたように、近年では、次世代配列決定（ＮＧＳ）として公知のハイスループット配列決定技術における進歩が急激に進み、ラージスケールのシーケンスデータの分析が可能となった（Shendure J etal. (2008) Nat Biotechnol 26: 1135-1145; Metzker ML et al. (2010) Nat Rev Genet11: 31-46）。いくつかのＮＧＳに基づくＴＣＲレパトア解析システムが、他の研究者らによって開発されてきたが、多くの増幅技術が、各可変領域に特異的な異なるプライマーを含むＭｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲに基づいている。そのため、異なる標的遺伝子に対する可変領域特異的プライマー間の示差的なハイブリダイゼーション動態に起因して、バイアスは最も一般的であるため、ＰＣＲ増幅中のバイアスが回避できない。それゆえ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲアッセイを用いる場合、補正およびさらなる計算的な標準化法が、ＰＣＲバイアスを最小化するために必要とされる（Carlson CS etal. (2013) Nat Commun 4: 2680）。プライマーの単一セットの使用は、配列の５’末端が高度に多様である未知の変異体を含むすべてのＴＣＲ遺伝子の非バイアスで定量的な増幅を達成する好ましい方法である。Ｔ４　ＲＮＡリガーゼを含むｃＤＮＡの３’末端に対する一本鎖オリゴヌクレオチドアンカーライゲーション（Troutt AB et al.(1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89: 9823-9825）、ｃＤＮＡのホモポリマーテーリング、ｃＤＮＡ末端の５’急速増幅（ＲＡＣＥ）（Frohman MA et al. (1988)Proc Natl Acad Sci U S A 85: 8998-9002）およびテンプレートスイッチングＰＣＲ（ＴＳ－ＰＣＲまたはＳＭＡＲＴ　ＰＣＲ）（Zhu YY et al.(2001) Biotechniques 30: 892-897）は、ＴＣＲレパトアを分析するために使用されてきた（Freeman JD etal. (2009) Genome Res 19: 1817-1824; Warren RL et al. (2011) Genome Res 21:790-797）。ＴＳ－ＰＣＲは、単純で便利だが、ＴＳプライマーは、非特異的にＲＮＡのランダムな領域にアニーリングするか、ＴＳプライマーを繰り返し付加させるため、高いレベルのバックグラウンド増幅が生じる（Alon S et al.(2011) Genome Res 21: 1506-1511; Kapteyn J (2010) BMC Genomics 11: 413）。そこで、本明細書は、ＴＣＲ転写物ならびにアダプタープライマーおよび定常領域特異的プライマーによるその後のＰＣＲ増幅物に由来する二本鎖相補的ＤＮＡの５’末端に対するアダプターの付加によって開発されたａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ媒介ＰＣＲ（Ｔｓｕｒｕｔａら（Tsuruta Y et al.(1993) J Immunol Methods 161: 7-21; Tsuruta Y et al. (1994) J Immunol Methods169: 17-23）によって初めて報告された）を記載している。平滑末端化された二本鎖相補的ＤＮＡへのａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎは、特定のｃＤＮＡの配列にほとんど影響されず、他方で、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼを用いた５’ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎの効率は、配列依存的である（Jayaprakash AD et al. (2011) Nucleic Acids Res 39:e141）。さらに、Ｔ４リガーゼを用いた二本鎖ＤＮＡのライゲーションは、ライゲーションアンカー（ｌｉｇａｔｉｏｎ　ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＰＣＲ（ＬＡ－ＰＣＲ）におけるＴ４　ＲＮＡリガーゼを用いたｓｓＤＮＡライゲーションよりも効率的である。したがって、この非バイアスＡＬ－ＰＣＲ法は、補正または標準化を必要としないＴＣＲレパトアの正確な分析を可能とする。
　Ｒｏｃｈｅ　４５４（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｉｏｎ－Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、ＳＯＬｉＤ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｈｅｌｉｃｏｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびＰａｃＢｉｏ（Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、ＣＡ）などの様々な配列決定技術が開発されてきた。これらのＮＧＳプラットフォーム中で、４５４　ＤＮＡ配列決定は、５０～６００ベースペア（ｂｐ）の長さの範囲またはそれより多くのシーケンスリードおよび十分なリード出力を生成するが、Ｉｌｌｕｍｉｎａよりも一回あたりのリード数が少ない。ロングリード配列決定は、Ｖ、Ｄ、ＪおよびＣ領域を含むＴＣＲ遺伝子の完全またはほぼ完全な長さの決定を可能とする。さらに、組換えＴＣＲタンパク質は、ＴＣＲ遺伝子のその後のＰＣＲクローニングによって、容易に生成され得る。したがって、本発明者らは、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ媒介ＰＣＲ法を４５４　ＤＮＡ配列決定を用いたＮＧＳに適用した。
　ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、自然免疫および獲得免疫における重要な役割を有する別個のＴ細胞集団である。ＮＫＴ細胞は、自己免疫疾患、腫瘍監視、および病原体感染に対する宿主防御などの広範囲の免疫応答を制御する。ＮＫＴ細胞は、非古典的主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連タンパク質、ＣＤ１ｄにより提示される糖脂質を認識するＶα２４およびＪα１８からなるインバリアントＴＣＲαを発現する（Godfrey DI etal. (2004) J Clin Invest 114: 1379-1388）。最近、粘膜組織に優先的に存在する粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞は、Ｖα７．２およびＪα３３からなるセミインバリアントＴＣＲαを発現する唯一のＴ細胞集団であることが示された。ＭＡＩＴ細胞は、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣ関連タンパク質１（ＭＲ１）によって提示される微生物ビタミンＢ代謝物を認識する（Kjer-Nielsen Let al. (2012) Nature 491: 717-723）。インバリアントＴＣＲαを有するこれらのＴ細胞集団は、免疫調節における中心的な役割を果たすが、すべてのインバリアントＴＣＲαがこれらの唯一のＴ細胞集団によって発現されるかどうかは特定されないままである。
　本研究では、本発明者らは、新しく開発したＮＧＳに基づくＴＣＲレパトア解析を用いて、２０例の健常人由来のＴＣＲ転写物のＮＧＳ配列決定を行った。最初に、シーケンスリード数に基づいて、可変領域および連結領域の使用について試験し、さらに、ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子におけるクローナリティおよび多様性を分析した。独自に開発された遺伝子分析プログラムを使用して同定されたユニークリード配列を、健常人の間のクローンレベルで比較した。これらの結果は、個人間で、ＴＲＶおよびＴＲＪの類似した使用および類似した程度のＴ細胞の多様性を示した。興味深いことに、ＴＣＲβのリードは、個人間で共有されておらず、他方で、ＴＣＲαのリードは、高い頻度で２以上の個人間で重複したパブリック配列を含有していた。パブリックＴＣＲαのリードは、高い割合のインバリアントＴＣＲαを含有しており、ｉＮＫＴ細胞またはＭＡＩＴ細胞の存在を示した。
　本実施例では、本発明者らは、ＮＧＳデータから、複数の個人間で共有されたＴＣＲ遺伝子の分析が、ＮＫＴ細胞およびＭＡＩＴ細胞によって発現されたインバリアントＴＣＲにおける有意な情報を提供しするものである
　（本実施例における実証）
　Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）遺伝子のハイスループット配列決定は、抗原特異性、Ｔリンパ球のクローナリティおよび多様性の分析に強力なツールとなる。ここで、発明者らは、ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせた４５４ＤＮＡ配列決定技術を用いた新規ＴＣＲレパトア解析法を開発した。この方法は、ＰＣＲに通常生じるバイアスをかけることなく、SMART　PCR法で達成し得る擬似バイアス程度のレベルではなく、真の意味での非バイアスの様式ですべてのＴＣＲ遺伝子の増幅が可能となった。
　本実施例では、遺伝子の使用、発現されたＴＣＲレパトアの多様性および類似性を個人間で比較するために、本発明者らは、２０例の健常人からの末梢血単核球細胞におけるＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子の次世代配列決定（ＮＧＳ）を行った。２０例の健常人から全部で２６７，０３７のシーケンスリードから、１４９，２１６のユニークリードが同定された。いくつかのＶ遺伝子およびＪ遺伝子の優先的な使用が観察され、他方で、ＴＲＡＶのＴＲＡＪでのいくつかの組換えが制限されているようにみえた。観察されたＴＣＲ多様性の程度は、ＴＣＲαとＴＣＲβとの間で顕著に異なり、他方で、ＴＣＲαレパトアは、ＴＣＲβレパトアよりも個人間でより類似していた。ＴＣＲαの個人間での類似性は、２以上の個人間で共有されるパブリックＴＣＲの高い頻度の存在に大きく依存していた。パブリックに利用可能なＴＣＲαは、より短いＣＤＲ３を有する生殖系列近傍のＴＣＲを有していた。パブリックＴＣＲα配列、特に多数の個人の間で共有される配列は、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞および粘膜関連インバリアントＴ細胞由来のインバリアントＴＣＲαを含有することが多かった。これらの結果は、ＮＧＳによるパブリックＴＣＲの検索が、潜在的な新規インバリアントＴＣＲα鎖の同定に有用であることを示唆している。このＮＧＳ法は、クローンレベルでのＴＣＲレパトアの精度の高い包括的な分析が可能であることが判明した。
　（材料および方法）
　　末梢血単核球細胞およびＲＮＡ抽出物の単離   
　インフォームドコンセントを得た後、全血を２０例の健常人から回収した。本研究は、独立行政法人国立病院機構相模原病院臨床研究センターの倫理委員会によって承認された。全血１０ｍＬをヘパリン処置したチューブに回収した。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳＴＭ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の密度勾配遠心により単離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞数をカウントして１　×　１０６細胞をＲＮＡ抽出に使用した。全ＲＮＡを単離して、ＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりメーカーの説明書に従って精製した。ＲＮＡ量および純度を、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて測定した。
　ＴＣＲ遺伝子の非バイアス増幅
　全ＲＮＡ１μｇを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。ｐｏｌｙ１８およびＮｏｔＩ部位を含むＢＳＬ－１８ＥプライマーをｃＤＮＡ合成に使用した。ｃＤＮＡ合成後、二本鎖（ｄｓ）－ｃＤＮＡを、Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＲＮａｓｅ　Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。ｄｓ－ｃＤＮＡをＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて平滑末端化した。Ｐ１０ＥＡ／Ｐ２０ＥＡアダプターをｄｓ－ｃＤＮＡの５’末端に連結させ、その後ＮｏｔＩ制限酵素で切断した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアダプターおよびプライマーを除いた後、ＴＣＲα鎖定常領域特異的プライマー（ＣＡ１）またはＴＣＲβ鎖定常領域特異的プライマー（ＣＢ１）のいずれかとＰ２０ＥＡ（表４－１）とを使用して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下のとおりである：９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、および７２℃（１分）を２０サイクル。２ｎｄ　ＰＣＲを、同じＰＣＲ条件を使用して、ＣＡ２またはＣＢ２のいずれかとＰ２０ＥＡプライマーとにより行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000117
　Ｒｏｃｈｅ　４５４配列決定システムによる増幅産物の配列決定
　ＮＧＳ用の増幅産物を、Ｐ２０ＥＡプライマーと融合タグプライマー（表４－１）とを使用した２ｎｄ　ＰＣＲ産物の増幅により調製した。アダプターＡ配列（ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣ）を含む融合タグプライマー、４塩基配列のｋｅｙ（ＴＣＡＧ）、分子同定（ＭＩＤ）タグ配列（１０ヌクレオチド）、およびＴＣＲ定常領域特異的配列を、メーカーの説明書に従って設計した。ＰＣＲ増幅後、増幅産物を分離して、アガロースゲル電気泳動により評価した。得られた断片（約６００ｂｐ）をゲルから取り除き、ＱＩＡＥＸ　ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製された増幅産物の量をＱｕａｎｔ－ｉＴＴＭ　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。１０例の健常人から異なる融合タグプライマーを用いて得られた各増幅産物を、等モル濃度で混合した。エマルションＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）を、ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　ｅｍＰＣＲ　Ｌｉｂ－Ｌ　ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　４５４　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）により、増幅産物混合物を使用して、メーカーの説明書に従って行った。
　ＴＲＶおよびＴＲＪセグメントのアサインメント
　すべてのリード配列をＭＩＤ　Ｔａｇ配列によって分類した。人工的に付加された配列（タグ、アダプター、およびｋｅｙ）および低い品質スコアを有する配列を、４５４配列決定システム上にインストールされたソフトウェアを使用してリード配列の両末端から取り除いた。残りの配列を、ＴＲＡＶおよびＴＲＡＪのＴＣＲα配列に対するアサインメントならびにＴＲＢＶおよびＴＲＢＪのＴＣＲβ配列に対するアサインメントに使用した。配列のアサインメントを、偽遺伝子を含む５４個のＴＲＡＶ、６１個のＴＲＡＪ、６５個のＴＲＢＶおよび１４個のＴＲＢＪ遺伝子についてのリファレンス配列のデータセット、ならびにＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）から利用可能なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）リファレンス配列のデータセットにおける最も高い同一性を用いた配列決定により行った。データ処理、アサインメント、データ集積を、本発明者らによって独自に開発されたレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ、ＲＧ）を使用して自動的に行った。ＲＧは、ＢＬＡＴＮ、自動集積プログラム、ＴＲＶおよびＴＲＪの使用についてのグラフィックプログラム、ならびにＣＤＲ３の鎖長分布を用いた配列相同性検索についてのプログラムを実行した。クエリー配列とエントリー配列との間のヌクレオチドレベルでの配列相同性を自動的に計算した。感受性および精度を増加させたパラメータ（Ｅ値閾値、最小カーネル、ハイスコアセグメントペア（ＨＳＰ）スコア）を、それぞれのレパトア解析に対して慎重に最適化した。
　データ解析
　１０４位の保存されたシステイン（Ｃｙｓ１０４）（ＩＭＧＴの命名）から１１８位の保存されたフェニルアラニン（Ｐｈｅ１１８）までの範囲のＣＤＲ３のヌクレオチド配列およびその次のグリシン（Ｇｌｙ１１９）を、推定アミノ酸配列に翻訳した。ユニークシーケンスリード（ＵＳＲ）を、ＴＲＶ、ＴＲＪおよび他のシーケンスリードを含むＣＤＲ３の推定アミノ酸配列において、同一性を有さないシーケンスリードとして定義した。同一のＵＳＲのコピー数を、各試料においてＲＧソフトウェアによって自動的にカウントし、その後、コピー数の順位でランク付けした。全シーケンスリードにおけるＴＲＡＶ、ＴＲＡＪ、ＴＲＢＶおよびＴＲＢＪ遺伝子を含むシーケンスリードの発生頻度の割合を計算した。
　試料間で共有されたＵＳＲの検索
　試料間で共有された配列を検索するために、個人のＵＳＲの「ＴＲＶ遺伝子名」＿「ＣＤＲ３領域の推定アミノ酸配列」＿「ＴＲＪ遺伝子名」の文字列（例えば、ＴＲＢＶ１＿ＣＡＳＴＲＶＶＪＦＧ＿ＴＲＢＪ２－５）を、ＴＣＲ識別子として使用した。試料中のＴＣＲ識別子を、すべての他の試料からのリードデータセットにおいて検索した。
　多様性指数および類似性指数
　ディープシーケンスデータにおいてＴＣＲ多様性を推定するために、いくつかの多様性指数、シンプソン指数およびシャノン・ウェーバー指数を、Ｒプログラムにおけるｖｅｇａｎパッケージの関数「多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」を使用して計算した。これらの指数を、生態学における生物学的多様性についての尺度として、試料当たりの種の数および試料当たりの個人の数に基づいて計算した。ディープシーケンスデータにおいて、ＵＳＲおよびコピー数を、種および個人にそれぞれ使用した。シンプソン指数（１－λ）を以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
（式中、Ｎは、全シーケンスリード数であり、ｎｉは、ｉ番目のＵＳＲのコピー数であり、Ｓは、ＵＳＲの種の数である）として定義した。この値は０～１の範囲に及び、最大数１は高いレベルの多様性を意味し、０は低い多様性を示す。逆数のシンプソン指数（１／λ）もまた、λの逆数として計算した。シャノン・ウェーバー指数（Ｈ’）を多様性指数に使用し、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
（式中、Ｎは、全シーケンスリード数であり、ｎｉは、ｉ番目のＵＳＲの数であり、Ｓは、ＵＳＲの種の数である）として定義した。これらの多様性指数は、試料間のリード数の違いによってバイアスされるはずである。それゆえ、シーケンスリードの最小数までシーケンスリード数を各試料に対して標準化した（Venturi V et al.(2007) J Immunol Methods 321: 182-195）。試料サイズを標準化するために、交換せずに１０００回繰り返しランダムにサンプリングして、多様性指数の計算を、Ｒプログラムを使用して行った。これらの指数の中央値を使用して、試料についての多様性指数を決定した。
　健常人の間のＴＣＲレパトアの類似性を推定するために、Ｍｏｒｉｓｉｔａ－Ｈｏｒｎ指数（ＣＨ）を以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
（式中、ｘｉは、単一試料の全Ｘリードにおけるｉ番目のＵＳＲの数であり、ｙｉは、別の試料の全Ｙリードにおけるｉ番目のＵＳＲの数であり、Ｓは、ＵＳＲの数である）として定義した。試料サイズを標準化するために、交換せずに１０００回繰り返しランダムにサンプリングして、類似性指数の計算を、Ｒプログラムを使用して行った（Venturi V et al.(2008) J Immunol Methods 329: 67-80）。中央値を、試料のペア間の類似性指数に使用した。
　統計
　統計学的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ４．０、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ノンパラメトリックなＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定によって試験した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなす。
　（結果）
　レパトア解析ソフトウェア
　本研究において開発されたクラウドベースのソフトウェアプラットフォームであるＲＧは、ＴＣＲレパトア解析のための高速で、正確で、便利な計算システムである。ＲＧは、（１）Ｖ、ＤおよびＪセグメントのアサインメント、（２）配列同一性の計算、（３）ＣＤＲ３配列の抽出、（４）同一リードのカウント、（５）アミノ酸翻訳、（６）フレーム解析（ストップおよびフレームシフト）、ならびに（７）ＣＤＲ３の長さの分析についての統合されたソフトウェアパッケージを提供する。ＮＧＳシーケンサから配列決定データをアップロードした後、Ｖ、ＤおよびＪセグメントを、最適化されたパラメータを用いてそれらの配列類似性に基づいて同定することができる。リード数を自動的に集約し、その後、加工されたデータ、集計表、およびグラフを容易にダウンロードすることができる。
　リード数、エラー率、および非生産的リード
　本発明者らは、２０例の健常人由来のＰＢＭＣにおけるＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子のハイスループット配列決定を行った。全部で１７２，１０９個および９１，２３４個のシーケンスリードを、ＲＧプログラムを使用して、それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβのレパトア解析に対してアサインした（表４－２および４－３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000118
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000119
全部で９４，９２８個および５７，９８２個のユニークシーケンスリード（ＵＤＲ）を、それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβにおいて同定した。Ｒｏｃｈｅ　４５４配列決定により得られたリード当たりのヌクレオチド配列の数は、約４００ｂｐの長さ（平均ｂｐ長±ＳＤ、ＴＣＲα：４０７．４±３５．４、ＴＣＲβ：４０９．４±３７．８）であり、これらの配列は、Ｖ領域からＪ領域までの範囲のＴＣＲ遺伝子を同定するのに十分な長さであることを示している。ＮＧＳ配列決定の精度および質を評価するために、本発明者らは、クエリー配列とリファレンス配列との間のミスマッチヌクレオチドの頻度をエラー率として計算した。エラー率は、ＴＲＡＶについては０．７２±０．１８％、ＴＲＡＪについては０．５４±０．０８％、ＴＲＢＶについては０．７０±０．１５％、およびＴＲＢＪについては０．５０±０．１２％であった（表４－４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000120
これらのエラー率は、４５４－配列について１．０７％の平均エラー率を報告した以前の研究（Gilles A et al.(2011) BMC Genomics 12: 245）よりもわずかに低かった。このエラー率は、Ｊ領域よりもＶ領域において有意に高く（ＡＶ対ＡＪ：ｐ＜０．０５、ＢＶ対ＢＪ：ｐ＜０．０００１）、配列決定プライマーに対して閉じた領域におけるより高い配列信頼性を示した。ストップコドンを有する非生産的リードまたはＣＤＲ３領域におけるリードフレームのシフト（アウトオブフレーム）の発生頻度を計算した（表４－５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000121
ＴＣＲαとＴＣＲβとの間の非生産的ユニークシーケンスリードの発生頻度の割合における有意な差はなかった（３１．２±７．０％対２９．３±７．９％、Ｐ＝０．３１）。
　偽遺伝子およびＯＲＦを含むＴＣＲ遺伝子の発現
　ＴＣＲシーケンスリードにおけるＴＲＶおよびＴＲＪ遺伝子の使用を決定するために、ＴＲＶまたはＴＲＪそれぞれを有するＵＳＲのコピー数（リード数）をカウントした。個々のＵＳＲをコピー数の順番でランク付けし、ＴＲＶおよびＴＲＪそれぞれの頻度パーセンテージを計算した（図５１および図５２）。ＴＣＲαレパトアに関して、８つの偽遺伝子（ＡＶ８－５、ＡＶ１１、ＡＶ１５、ＡＶ２８、ＡＶ３１、ＡＶ３２、ＡＶ３３およびＡＶ３７）は、健常人において発現されなかった。ＯＲＦとして分類されるＡＶ８－７（ＩＭＧＴによるスプライシング部位、組換えシグナルおよび／または制御エレメントにおける変更に基づいて定義される）は、わずかに発現した（２０個体のうち１１個体において４３リード）。ＡＶ１８およびＡＶ３６の発現（機能遺伝子として分類される）は、健常人において観察されなかった。さらに、機能遺伝子であるＡＶ７およびＡＶ９－１は、１個体（９リード）および２個体（３リード）において、それぞれ十分に発現されなかった。ＯＲＦ遺伝子として分類される８つのＡＪ遺伝子（ＡＪ１、ＡＪ２、ＡＪ１９、ＡＪ２５、ＡＪ３５、ＡＪ５８およびＡＪ６１）のうち、ＡＪ３５およびＡＪ５８の発現は、２０個体すべてにおいて観察された。これらのうち、ＡＪ２５およびＡＪ６１は、３個体（２１リード）および７個体（３５リード）において、それぞれわずかに発現した。ＡＪ１、ＡＪ２、ＡＪ１９およびＡＪ５９は、いずれの個体にも存在しなかった。いずれの個体においても３つの偽遺伝子、ＡＪ５１、ＡＪ５５およびＡＪ６０の発現は存在しなかった。機能遺伝子ＡＪ１４を、３個体から３リードだけ検出した。
　ＴＣＲβ遺伝子について、１１の偽遺伝子（ＢＶ１、ＢＶ３－２、ＢＶ５－２、ＢＶ７－５、ＢＶ８－１、ＢＶ８－２、ＢＶ１２－１、ＢＶ１２－２、ＢＶ２１－１、ＢＶ２２－１およびＢＶ２６）の発現が健常人において存在しなかった。５つのＯＲＦ遺伝子のうちＢＶ５－７（１３個体において３２リード）、ＢＶ６－７（８個体において１３リード）、およびＢＶ１７（１個体において３リード）が十分に発現されなかった。ＢＶ７－１　ＯＲＦ遺伝子は、いずれの個体においても観察されず、他方で、ＢＶ２３－１は、２０個体すべてにおいて発現した。ＢＪ遺伝子に関して、ＢＪ２－２Ｐ偽遺伝子の発現は存在しなかった。
　ＴＲＡＶおよびＴＲＡＪの低い頻度の組換え
　４１個のＴＲＡＶの５０個のＴＲＡＪでの遺伝子組換え（偽遺伝子、ＯＲＦ、および十分に発現されない遺伝子を除く）は、総数２，０５０個のＡＶ－ＡＪ組換えを生成することが可能であり（図５３）、そのうち１，９６９個のＡＶ－ＡＪ組換え（９６．０％）を２０個体において検出した。これは、ほとんどすべてのＡＶ－ＡＪ組換えが、制限されずにＴＣＲ転写物において使用されたことを示した。特に、ＡＶ１－１～ＡＶ６遺伝子を、ＡＪ５０～ＡＪ５８で優先的には組換えられず、同様に、ＡＶ３５～ＡＶ４１遺伝子のＡＪ３～ＡＪ１６での組換えは、ほとんど観察されなかった。これらの遺伝子セグメントの染色体上の位置を考慮すると、これらの結果は、ＡＶ－ＡＪ組換えは、近位ＡＶ遺伝子と遠位ＡＪ遺伝子との間および遠位ＡＶ遺伝子および近位ＡＪ遺伝子との間で、ほとんど起こらないことを示した。
　ＴＣＲβについて、６５０個の遺伝子組換えは、５０個のＢＶ（１１の偽遺伝子および５つのＯＲＦを除いて）および１３個のＢＪ遺伝子（偽遺伝子を除いて）によって生成され、そのうち６０５個のＢＶ－ＢＪ（９３．１％）が３０個体において使用された。ＴＲＢＶのＴＲＢＪでの組み合わせについては制限が存在しなかった。
　健常人におけるＴＲＶおよびＴＲＪレパトアの優先的使用
　全ＴＣＲ転写物におけるＴＲＶおよびＴＲＪの使用を明らかにするため、ＴＲＶまたはＴＲＪそれぞれを有するＵＳＲの発生頻度を計算した（図５１および図５２）。いくつかのＴＲＡＶ遺伝子における優先的使用は、ハイブリダイゼーションに基づく定量アッセイを使用して得られた以前の結果（６）と類似していた。いくつかのＴＲＢＶ遺伝子をＴＲＢＶレパトアにおいて多く使用した。上位３位のＴＲＡＶ９－２（ＡｒｄｅｎによるＢＶ４Ｓ１）、ＴＲＢＶ２０－１（ＢＶ２Ｓ１）およびＴＲＢＶ２８（ＢＶ３Ｓ１）は、全シーケンスリードの３分の１を占めた。これは、マイクロプレートハイブリダイゼーションアッセイを使用した本発明者らの以前の研究で得られた結果（６）と似ていた。遺伝子の使用は、ＴＲＢＪ遺伝子の間でかなり変動した。ＴＲＢＪ２－１およびＴＲＢＪ２－７は非常に発現され、他方で、ＴＲＢＪ１－３、ＴＲＢＪ１－４、ＴＲＢＪ１－６、ＴＲＢＪ２－４およびＴＲＢＪ２－６の発現は低かった。
　ＴＣＲレパトアの使用の３次元（３Ｄ）ビュー
　ＴＲＶ遺伝子とＴＲＪ遺伝子との組み合わせを有するＴＣＲの使用を可視化するために、本発明者らは、ＴＣＲレパトアの３Ｄ描写を作製した（図５４および図５５）。３Ｄイメージの利点は、ＴＲＶ遺伝子とＴＲＪ遺伝子との特定の組み合わせの優位およびＴＣＲの多様性の程度を容易に観察し得ることである。ＴＣＲβについては、ＴＲＢＶ遺伝子とＴＲＢＪ遺伝子との間の組換えの優先的な使用はほとんど存在しなかった。各組換えの頻度は、ＴＲＢＶまたはＴＲＢＪの使用に依存した。ＢＶ２９－１／ＢＪ２－７、ＢＶ２９－１／ＢＪ２－１、ＢＶ２９－１／ＢＪ２－３およびＢＶ２０－１／ＢＪ２－７は、すべての組み合わせにおいて高い頻度で使用され、他方で、その他は低い頻度で発現した。対照的に、ＴＣＲαレパトアの３Ｄイメージングは、ＴＲＡＶおよびＴＲＡＪの広範な分布で、低いレベルでの発現を示した。占有率は、すべての組み合わせについて１％未満だった。注目すべきことに、ＡＶ１－２およびＡＪ３３を有するＴＣＲリードは、すべての健常人において高度に発現した（平均±ＳＤ：０．９９±０．８５）。
　デジタルＣＤＲ３鎖長分布
　ＣＤＲ３サイズスペクトラタイピング（Yassai M et al.(2000) J Immunol 165: 3706-3712; Yassai M et al. (2002) J Immunol 168:3801-3807）またはイムノスコープ解析（Pannetier C etal. (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90: 4319-4323; Pannetier C et al. (1995)Immunol Today 16: 176-181）と呼ばれるＣＤＲ３の鎖長分布の分析を効率的に使用し、ＴＣＲレパトアの多様性を推定した。この技術は、ゲル電気泳動による、ＣＤＲ３配列を含むＰＣＲ増幅産物の実際のピーク分布に基づいている。本研究において、保存されたＣｙｓ１０４（ＩＭＧＴの命名）から１１８位の保存されたフェニルアラニン（Ｐｈｅ１１８）の範囲のＴＣＲの決定されたヌクレオチド配列の長さを自動的に計算した。これは、ＮＧＳデータを使用することによってＴＣＲの多様性およびクローナリティを推定するための可視的に容易な方法を提供する。ＲＧは、各Ｖ領域についてのデジタルＣＤＲ３鎖長分布を表す図を生成することができる。ＴＣＲαおよびＴＣＲβ両方のＣＤＲ３鎖長分布は、通常の分布と似ていたが、完全に対称的というわけではなかった（図５６）。ＣＤＲ３の鎖長は、ＴＣＲαにおいてＴＣＲβよりも短く（平均±ＳＤ：４１．２±８．３対４２．８±６．１）、ＴＣＲαは、ＴＣＲβよりも正の歪度を有しており（歪度指数：１１．１対５．４１）、ＴＣＲαにおける分布が左側に集中したことを示した。さらに、ＴＣＲαは、ＴＣＲβよりも正の尖度を有しており、ＴＣＲαにおいて高い尖度を示した（尖度指数：２８２．４対１７６．７）。
　ＴＣＲαおよびＴＣＲβレパトアの多様性
　ＴＣＲレパトアの多様性を示すために、本発明者らは、ＵＳＲの平均コピー数および多様性指数（シンプソン指数およびシャノン・ウェーバー指数など）を計算した（図５７）。ＵＳＲの平均コピー数は、ＴＣＲαとＴＣＲβとの間で顕著に異なった（２．０±０．７２対１．７０±０．５７）。さらに、ＴＣＲαとＴＣＲβとの間のシンプソン指数の逆数（Ｄ）およびシャノン・ウェーバー指数（Ｈ）において顕著な違いはなかった（Ｄ：７１０．３±４３３．０対７２９．７±４９３．９、Ｈ：７．０２±０．３３対６．９７±０．４３）。これらの結果は、健常人におけるＴＣＲαおよびＴＣＲβについての免疫多様性に違いがないことを示した。
　健常人の間のＴＣＲαおよびＴＣＲβレパトアの類似性
　個人間の遺伝子の使用の相関を明らかにするために、ＴＲＶおよびＴＲＪの各々の頻度パーセンテージを、散布図によってすべての個体のペアの間でプロットした（図６０）。各ペア間のスピアマンの相関係数を計算した。一致相関係数は、ＴＲＡＶにおいてＴＲＢＶよりも低く（平均±ＳＤ、ＴＲＡＶにおいて０．８６±０．０５９、ＴＲＢＶにおいて０．８９±０．０３８、ｐ＜０．００１）、ＴＲＡＪにおいてＴＲＢＪよりも低かった（ＴＲＡＪにおいて０．７４±０．０９５、ＴＲＢＪにおいて０．９１±０．０６３、ｐ＜０．００１）。これらの結果は、健常人の間のＴＲＶおよびＴＲＪの発現レベルが、ＴＣＲαと比較して、ＴＣＲβにおいて個人間でより類似していたことを示した。
　健常人の間のクローンレベルでのＴＣＲレパトアの潜在的な類似性を評価するために、本発明者らは、個体間で共有されたＴＣＲシーケンスリードを検索した。個体のすべてのペア間で共有されたＴＣＲリード数をカウントし、それらの発生頻度を計算した（表４－６および表４－７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000122
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000123
平均頻度は、ＴＣＲβと比較して、ＴＣＲαにおいて顕著により高く（０．７６±０．５２対０．０４０±０．０５７、ｎ＝３８０、Ｐ＜０．００１）（図５８）、ＴＣＲαレパトアは、ＴＣＲβよりもより共通のＴＣＲリードを個体間で含んでいることを示している。同様の指数であるＭｏｒｉｓｉｔａ－Ｈｏｒｎ指数は、ＴＣＲβよりもＴＣＲαについて顕著に大きかった（０．００５８±０．００６９対０．００００９６±０．０００２９、ｎ＝１９０、Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＴＣＲαレパトアが、ＴＣＲβレパトアと比較して、健常人の間でより類似していたことを明らかに示した。
　健常人の間で共有されたＴＣＲ配列
　少数のＴＣＲ配列は、異なる健常人の間で共有され、それらの共有されたＴＣＲはパブリックＴＣＲと呼ばれる。対照的に、ほとんどのＴＣＲは各健常人に対して特異的であった（プライベートＴＣＲ）。２０例の健常人におけるパブリックＴＣＲ配列を同定するために、本発明者らは、２以上の健常人の間で共有されたＴＣＲαリードおよびＴＣＲβリードを検索した。２０例の健常人において、３０４１個のパブリックＴＣＲαおよび２０６個のパブリックＴＣＲβ配列が、それぞれ９０，６４３個および５７，９８２個のＵＳＲから得られた（表４－８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000124
パブリックＴＣＲαは、健常人由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において、ＴＣＲβよりもより高い頻度であった。パブリックＴＣＲβ配列は、２～４個体から得られ、他方で、パブリックＴＣＲα配列は、１６個体において観察された。これらの結果は、ＴＣＲαパブリック配列は、より一般的に個体によって使用されるが、ＴＣＲβレパトアは、各個体に対してより特異的であったことを示した。さらに、個体のペア間で共有されるＴＣＲ配列の個体当たりの発生頻度は、ＴＣＲβ（０．７％）よりもＴＣＲα（７．９％）に対して顕著に高かった。パブリックＴＣＲα配列を特徴づけるために、本発明者らは、パブリックとプライベートＴＣＲα配列との間のＣＤＲ３の長さを比較し、パブリックＴＣＲαが、プライベートＴＣＲαよりも短い鎖長のＣＤＲ３を有していたことを観察した（中央値：３９対４２）（図５９）。
　複数の個体で共有されるＴＣＲは、インバリアントＴＣＲα鎖を高頻度で含む
　パブリックＴＣＲαは、健常人由来のＰＢＬにおいて高頻度で観察された。パブリックＴＣＲαの起源を決定するために、本発明者らは、以前に報告されたパブリックＴＣＲαのＣＤＲ３配列を調べた。興味深いことに、複数の個体に対して共通であったパブリックＴＣＲα配列は、ｉＮＫＴ細胞またはＭＡＩＴ細胞を示す高い割合のインバリアントＴＣＲαを含んでいた（表４－９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000125
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000126
  

ＭＡＩＴ細胞は、ＴＲＡＶ１－２およびＴＲＡＪ３３を発現し、他方で、ｉＮＫＴは、ＴＲＡＶ１０およびＴＲＡＪ１８を発現することが報告された。多くのパブリックＴＣＲαは、異なるＣＤＲ３配列を含むＴＲＡＶ１－２およびＴＲＡＪ３３を使用した。ＴＲＡＶ１－２およびＴＲＡＪ３３を有するＭＡＩＴ　ＴＣＲαならびにＴＲＡＶ１０およびＴＲＡＪ１８を有するｉＮＫＴ　ＴＣＲαの頻度パーセンテージの合計は、個体当たりそれぞれ０．８２±０．７２％および０．１５±０．４１％であった。５５個のパブリックＴＣＲα配列のうち、１７個（３１％）のＭＡＩＴおよび１個（１．８％）のｉＮＫＴ配列が、６以上の個体において観察された（図５３）。この割合は、重複する個体の数と共に上昇した。生殖系列の配列から改変されたアミノ酸配列を有していない生殖系列様ＣＤＲ３配列は、ＭＡＩＴ（ＴＲＡＶ１－２－ＴＲＡＪ３３）およびＮＫＴ（ＴＲＡＶ１０－ＴＲＡＪ１８）を除いて、３８個のパブリックＴＣＲαのうち２７個（７１％）において観察された。
　（考察）
　　ハイスループット配列決定技術は、幅広い種類のＮＧＳプラットフォームの開発により大きな飛躍をしてきた。ＮＧＳは、莫大な量のシーケンスデータの取得を促進するが、未だに、全ゲノムまたは遺伝子ライブラリの代わりに、目的の配列遺伝子のＰＣＲ増幅または遺伝子エンリッチメントを必要とする。多くの遺伝子セグメントの再構成によって生成された不均一なＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子については、多くの遺伝子特異的プライマーによるマルチプレックスＰＣＲが広く使用されていた。しかし、複数のプライマーの使用により、それぞれの遺伝子の間で増幅バイアスが生じ、遺伝子頻度の正確な推定を妨害する。ここで、本発明者らは、ＮＧＳに基づくＴＣＲレパトア解析のために、非バイアスＰＣＲ技術であるａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ媒介ＰＣＲを使用した。この方法は、単一セットのプライマーを使用し、ＰＣＲバイアスをかけることなく、理論上すべてのＴＣＲ遺伝子の増幅を可能とする。したがって、この方法は、幅広い試料からのＴＣＲ遺伝子のそれぞれの存在量を正確に推定するのに最も適している。
　本発明者らは、多くの個体（ｎ＝２０）由来のクローンレベルでのＴＣＲαおよびＴＣＲβレパトアを包括的に調査し、多量のシーケンスデータを評価した（２６７，０３７個のシーケンスリードから全部で１４９，２１６個のユニークシーケンスリード）。したがって、本研究は、通常の範囲の遺伝子使用および健常人におけるＴＣＲレパトアの多様性および類似性の程度を明らかにした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＮＧＳプラットフォーム（Freeman JD etal. (2009) Genome Res 19: 1817-1824; Warren RL et al. (2011) Genome Res 21:790-797; Robins HS et al. (2009) Blood 114: 4099-4107）と比較して、サンプルシーケンスリードは多くはないが、より長く、より高い品質である。Ｉｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して、多くのショットガンリードから生成されるＣＤＲ３コンティグの中の異なる配列の深度が、ＴＣＲクローンタイプの頻度を決定するのを難しくし得る。しかし、すべてのＴＣＲ配列を単一リードから決定し、ＣＤＲ３、ＶおよびＪの全領域をカバーする長い配列（平均約４００ｂｐ、表４－２および表４－３）を有していた。会合を用いないリード配列からの直接分析は、ＴＣＲクローンタイプの実際の頻度を正確に反映する可能性が高い。ＴＣＲ配列におけるエラー率は、４５４－配列について１．０７％の平均エラー率を示した以前の報告よりもわずかに低く、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲとは無関係に、高いレベルの精度および質を示した。さらに、アサインメントおよび集約ソフトウェア、ＲＧは、ＴＲＶおよびＴＲＪの使用および組換えの使用を迅速に集約することができる。この統合された分析は、所定のＴＲＶおよび／またはＴＲＪの優先的な使用を検出することを容易に可能とし、それゆえ、それは、抗原特異的Ｔ細胞による免疫応答を研究するのに有用である。
　典型的にＰＣＲバイアスの補填を必要とする広く使用されているマルチプレックスＰＣＲとは異なり（Carlson CS etal. (2013) Nat Commun 4: 2680）、ＡＬ－ＰＣＲ法は、バイアスをかけることなくＴＣＲレパトアを正確に推定する。高い発現レベルのＴＲＢＶ１８（ＢＶ１８Ｓ１、Ａｒｄｅｎの命名）、ＴＲＢＶ１９（ＢＶ１７Ｓ１）およびＴＲＢＶ７－９（ＢＶ６Ｓ５）ならびに低い発現レベルのＴＲＢＶ２０－１（ＢＶ２Ｓ１）、ＴＲＢＶ２８（ＢＶ３Ｓ１）およびＴＲＢＶ２９－１（ＢＶ４Ｓ１）が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞において、マルチプレックスＰＣＲによって報告されている（Emerson R et al.(2013) J Immunol Methods 391: 14-21）。しかし、フローサイトメトリー解析は、ＴＲＢＶ２０およびＴＲＢＶ２９が、ＰＢＬにおいて大量に発現したことを示した（van den Beemd Ret al. (2000) Cytometry 40: 336-345; Pilch H et al. (2002) Clin Diagn LabImmunol 9: 257-266; Tzifi F (2013) BMC Immunol 14: 33）。ＴＣＲレパトアの本研究者らによる結果は、以前の報告と似ている（Li S et al.(2013) Nat Commun 4: 2333）。したがって、この方法は、直接的で、正確で、信頼できるＴＣＲレパトアの結果を提供する。
　組換えの使用は、ＡＪ－近位３’ＡＶセグメントのＡＶ－遠位３’ＡＪセグメントでの低い頻度の組換えおよびＡＪ－近位５’ＡＶセグメントのＡＶ－遠位５’ＡＪセグメントでの低い頻度の組換えを示した。ＴＣＲαδ遺伝子座の遺伝子再構成において、ＴＣＲαエンハンサー（Ｅα）およびＴ初期活性化（ＴＥＡ）プロモーターの活性化は、近位のＴＲＡＶおよびＴＲＡＪセグメントの第一の再構成を開始する。その後の第２の再構成が、５’近位ＴＲＡＶおよび遠位３’ＴＲＡＪ遺伝子を使用して起こり（Huang C et al.(2001) J Immunol 166: 2597-2601; Krangel MS et al. (2004) Immunol Rev 200:224-232; Pasqual N et al. (2002) J Exp Med 196: 1163-1173; Aude-Garcia C et al.(2001) Immunogenetics 52: 224-230）、その結果、ＴＣＲαレパトアの制限された使用が生じた（連続的な双方向性の組換えのモデル）（Chaumeil J etal. (2012) Embo J 31: 1627-1629）。しかし、すべてのＴＲＡＶ遺伝子は、遺伝子座の収縮およびＤＮＡループ形成のモデルによる第２の再構成において、ＴＲＡＪ遺伝子と組換えることができる（Genolet R et al.(2012) Embo J 31: 4247-4248）。遠位－近位および近位－遠位のＴＲＡＶ－ＴＲＡＪ遺伝子の非効率な組換えが存在したが、ＴＲＡＪの使用は、すべてのＴＲＡＶにわたり制限されず、むしろ均等に分布した。これは、組換えの頻度はＴＲＡＶの位置に依存して変動し、おそらく、ＴＲＡＶ遺伝子座とＴＲＡＪ遺伝子座との間のループ形成の能力に依存することを示す。
　組換えおよびヌクレオチドの付加／欠失により生成される潜在的なＴＣＲの多様性を、最大で１０１５であると推定した（Davis MM et al.(1988) Nature 334: 395-402）。ＮＧＳに基づく推定によって、ＴＣＲβの多様性を、３～４×１０６（Robins HS et al.(2009) Blood 114: 4099-4107）またはヒトにおいて約１×１０６（Warren RL et al.(2011) Genome Res 21: 790-797）であると推定した。さらに、ＴＣＲαの多様性は、ヒトにおいてＴＣＲβの５０％である（Arstila TP etal. (1999) Science 286: 958-961）。マウスにおいて、ＴＣＲα多様性は、０．７９×１０４（Pasqual N et al.(2002) J Exp Med 196: 1163-1173）または１．１８×１０４（Cabaniols JP etal. (2001) J Exp Med 194: 1385-1390）であり、ＴＣＲベターの多様性の１０倍低いことが示された。このＴＣＲαの低い多様性は、ＴＣＲαとＴＣＲβとの間の組換えプロセスの違いによって引き起こされ得る。しかし、本発明者らの結果は、シンプソン指数およびシャノン・ウェーバー指数によって評価されたように、ＴＣＲαとＴＣＲβとの間の多様性の程度が似ていることを示した。同様に、Ｗａｎｇらは、ＴＣＲ多様性をＴＣＲαとＴＣＲβとの間で等しいと推定したことを報告した（０．４７×１０６対０．３５×１０６）（Wang C et al.(2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107: 1518-1523; Dash P et al. (2011) J ClinInvest 121: 288-295）。限定された数の配列を使用して得られた以前の報告とは反対に、ラージスケールの配列決定は、Ｖ－Ｊ組換えにより生成されるＴＣＲαについてのレパトアサイズが、Ｖ－Ｄ－Ｊ組換えによるＴＣＲβについてのレパトアサイズに匹敵することを示す。
　驚くべきことに、本発明者らは、ＴＣＲαレパトアが、個体間で類似していることを見出した。これは、主に、２以上の個体の間で共有されたＴＣＲ配列（パブリックＴＣＲ）の存在に起因する。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより媒介されるランダムなヌクレオチドの付加および欠失が、ＴＣＲ再構成中に起こり、結果として、ＣＤＲ３領域の多様性の顕著な増加を生じさせる。しかし、パブリックＴＣＲは、そのような改変を受けない生殖系列様ＣＤＲ３配列を有しているようにみえる（表４－９）。さらに、パブリックＴＣＲは、より短い鎖長のＣＤＲ３を有する多くのＴＣＲクローンタイプを含んだ。これらの結果は、パブリックＴＣＲαの高い頻度の発生は、ＴＣＲβ（Ｖ－Ｊ対Ｖ－Ｄ－Ｊ）からの固有の組換えメカニズムにおける違いによって引き起こされる可能性がある。
　パブリックＴＣＲαが多数の個体で存在することは注目すべきことである。本発明者らは、パブリックＴＣＲαは、ＭＡＩＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞由来の高い割合のインバリアントＴＣＲαを含むことを予想外にも見出した。これらの機能的に重要なＴ細胞は、均一なＴＣＲαおよび多様なＴＣＲβを有している。ＭＡＩＴ細胞は、ＴＲＡＶ１－２（Ｖα７．２）－ＴＲＡＪ３３（Ｊα３３）を含む古典的ＴＣＲαを発現し、優先的に腸粘膜固有層に位置する（Tilloy F et al.(1999) J Exp Med 189: 1907-1921; Treiner E et al. (2003) Nature 422: 164-169）。ＭＡＩＴ細胞は、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子であるＭＲ１によって提示されるビタミンＢ２代謝物を認識する。さらに、ＣＤ１ｄ－制限ｉＫＮＴ細胞は、インバリアントＴＲＡＶ１０（Ｖα２４）－ＴＲＡＪ１８（Ｊα１８）鎖およびセミインバリアントＴＲＢＶ２５－１（Ｖβ１１）（Godfrey DI etal. (2004) Nat Rev Immunol 4: 231-237）を発現し、α－ガラクトシルセラミド、自己糖脂質、またはイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質を認識する（Tupin E et al.(2007) Nat Rev Microbiol 5: 405-417）。両方の細胞型は、感染、腫瘍、自己免疫疾患、および耐性誘導に対する免疫応答の制御において重要な役割を担っている（Godfrey DI etal. (2004) J Clin Invest 114: 1379-1388）。本研究で得られたＭＡＩＴ細胞およびｉＮＫＴ細胞の頻度は、以前の報告（ＭＡＩＴ細胞が末梢血Ｔ細胞の１～４％まで拡大し（Martin E et al.(2009) PLoS Biol 7: e54）、ｉＮＫＴ細胞が全ＰＢＭＣの０．２％を占めたことを示した（Lee PT et al.(2002) J Clin Invest 110: 793-800））と一貫している。興味深いことに、ＴＲＡＶ１－２を有するパブリック配列の異なるタイプ（例えば、ＴＲＡＶ１－２－ＴＲＡＪ１２、ＴＲＡＶ１－２－ＴＲＡＪ２０）ならびに周知のＭＡＩＴおよびｉＮＫＴ配列以外のいくつかのパブリックＴＣＲα配列が存在する。したがって、ＮＧＳに基づくレパトア解析は、ＭＡＩＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の頻度の推定すること、および潜在的な新しいインバリアントＴＣＲα鎖を同定することの両方に有用である。さらなる同定および立証が、潜在的な新しいインバリアントＴＣＲαを同定するのに必要である。
　以上のように、本実施例から、本発明者らは、新規のＮＧＳに基づくＴＣＲレパトア解析法を開発し、それによって、比較可能な多様性およびＴＣＲαとＴＣＲβとの間の異なる個体間での類似性を明らかにした。パブリックＴＣＲα配列は、高頻度で機能的な有意なＴ細胞亜集団、ＭＡＩＴおよびｉＮＫＴ細胞を含み、ＮＧＳによってパブリックＴＣＲを探すアプローチは、潜在的な新しいインバリアントＴＣＲα鎖の同定に有用である。ＴＣＲレパトア解析のためのこの非常に精度の高い技術は、ヒト疾患の発症に関連する抗原特異的Ｔ細胞を明らかにすること、ならびに自然免疫および獲得免疫の研究、診断および治療に寄与することが実証された。
　（応用実施例１：抗体単離の実施例：ＢＣＲレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離例）
　本実施例では、実際に応用した具体的な態様としては、ＢＣＲレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離例を行う。
　（試薬等の入手先）
　ヒト化ＮＯＧマウスを用いたヒト型抗イディオタイプ抗体の取得
１．Ｂ細胞系白血病あるいは悪性リンパ腫患者においては腫瘍細胞に由来するモノクローナルＢＣＲの高度な発現が観察される。
２．Ｂ細胞系白血病あるいは悪性リンパ腫患者の末梢血単核球細胞を採取し、本編記載のＢＣＲレパトア解析を実施する。決定された数万リードの遺伝子配列からランキング最上位に位置し、優位に存在する腫瘍細胞由来の免疫グロブリンＨ鎖遺伝子を同定する。
３．決定された免疫グロブリンＨ鎖遺伝子配列を使って、多様性の高いＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を推定し、その配列と同一のペプチドを合成する。
４．２００μｇの合成ペプチドを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ，シグマ・アルドリッチ社）とよく混和し、シリンジを用いてヒト化ＮＯＧマウスの皮下に投与する（初回免疫）。同様に、対照マウスに対しＰＢＳを投与する。さらに、初回投与後２週後に再度同量の抗原ペプチドを投与する。
５．初回免役から４週後に、マウスよりリンパ節または脾臓を摘出する。リン酸緩衝液（ＰＢＳ、Invitrogen社）中で組織を細断し、セルストレイナー(０．７５μｍ、ＢＤ社)でフィルターろ過し、シングルセルを調整する。
６．得られた細胞をＴｒｉｚｏｌ溶液（Invitrogen社）に溶解し、本特許記載のＢＣＲレパトア解析法により遺伝子配列を決定する。
７．得られた数万リードのＢＣＲ遺伝子配列について、その存在頻度（リード数）順にソートし、ランキング上位に位置する免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖遺伝子配列を決定する。対照としてＰＢＳを投与したマウスのリードランキングと比較して、存在頻度が有意に高い免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖遺伝子配列を選択する。
８．得られた免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖遺伝子配列について、P20EAアダプタープライマーとC末端primerを用いて全長免疫グロブリンＨ鎖および全長Ｌ鎖遺伝子をPCR増幅する。抗体発現ベクターであるpEHX1.1（抗体H鎖用、TOYOBO社）およびpELX2.2（抗体L鎖用、TOYOBO社）にLigation　Kit（TAKARA社）を用いてLigation反応により、それぞれ全長遺伝子をベクター内のマルチクローニング部位に挿入する。大腸菌TOP10細胞株（One　Shot（登録商標）　TOP10　Chemically　Competent　E.　coli、Invitrogen社）を形質転換し、Ｈ鎖発現プラスミドおよびＬ鎖発現プラスミドを得る。
９．両プラスミドについてBglＩＩおよびEcoRI制限酵素で二重消化し、次いでＨ鎖プラスミドのBglＩＩ－EcoRI切断部位に、Ｌ鎖プラスミドのBglＩＩ－EcoRI断片を挿入し、Ｈ鎖およびＬ鎖を共発現する抗体発現プラスミドを得る。
１０．抗体発現プラスミドをQIAGEN　Plasmid　Mini　kitを用いて大腸菌より抽出・精製し、TransIT（登録商標）-CHO　Transfection　Kit（TAKARA社）を用いてCHO細胞に導入する。
１１．形質転換した抗体発現CHO細胞株を拡大培養し、培養上清を回収して、ProteinAアガロースアフィニティーカラム（HiTrap　Protein　A　HP　Columns、GEヘルスケア社）を用いて、使用方法に従い精製する。
１２．得られた抗体蛋白量を吸光度計を用いて測定した後、抗原ペプチドとの結合反応性をＥＬＩＳＡ法で検証する。
　この実施例で用いられるKMマウスについては、Ishida　I,　Tomizuka　K,　Yoshida　H,　Tahara　T,　Takahashi　N,　Ohguma　A,　Tanaka　S,　Umehashi　M,　Maeda　H,　Nozaki　C,　Halk　E,　Lonberg　N.　Production　of　human　monoclonal　and　polyclonal　antibodies　in　TransChromo　animals.　Cloning　Stem　Cells.　2002;4(1):91-102.　Review.を参照することができ、NOGマウスについては、Ito　M,　Hiramatsu　H,　Kobayashi　K,　Suzue　K,　Kawahata　M,　Hioki　K,　Ueyama　Y,　Koyanagi　Y,　Sugamura　K,　Tsuji　K,　Heike　T,　Nakahata　T.　NOD/SCID/gamma(c)(null)　mouse:　an　excellent　recipient　mouse　model　for　engraftment　of　human　cells.　Blood.　2002　Nov　1;100(9):3175-82.を参照することができ、CHO細胞/抗体産生については、Jayapal　KP,　Wlaschin　KF,　Hu　W-S,　Yap　MGS.　Recombinant　protein　therapeutics　from　CHO　cells-20　years　and　counting.　Chem　Eng　Prog.　2007;103:40?47.；Chusainow　J,　Yang　YS,　Yeo　JH,　Toh　PC,　Asvadi　P,　Wong　NS,　Yap　MG.　A　study　of　monoclonal　antibody-producing　CHO　cell　lines:　what　makes　a　stable　high　producer?　Biotechnol　Bioeng.　2009　Mar　1;102(4):1182-96を参照することができる。
　（応用実施例２：がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法）
　本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法での実証例を行う。以下にその手順を説明する（図６２参照）。
（１）悪性リンパ腫患者の全血１０ｍＬを採血し、Ficoll-Paque比重遠心分離（GEヘルスケアバイオサイエンス、17-1440-02）により末梢血単核球（PBMC）を分離する。
（２）患者PBMCよりTrizol　Reagent（Invitrogen社）を用いて全RNAを抽出する。
（３）RNAから逆転写酵素（Superscript　II,　Invitrogen,　18064-014）によりcDNA合成し、その後、DNA　Polymerase（Invitrogen,　18010-017）、E.coli　Ligase（Invitrogen,　18052-019）、RNase　H（Invitrogen,　18021071）によりdsDNA合成し、さらにT4　DNA　Polymerase（Invitrogen,　18005-025）により末端の平滑化を行う。T4　ligase（Invitrogen,　15224-025）によりP20EA/P10EA　adaptorのライゲーション反応（調製実施例２等を参照）を行なった後、NotI（TaKaRa,　1166A）で消化を行なう。
（４）ＢＣＲ遺伝子のＩｇＭのＣ領域特異的プライマー（ＣＭ１（配列番号５））とＰ２０ＥＡアダプター（配列番号２）により１ｓｔ　ＰＣＲを、ＣＭ２（配列番号６）とＰ２０ＥＡプライマー（配列番号２）により２ｎｄ　ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ反応は、９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　１分のサイクルをそれぞれ２０サイクル行う。
（５）２ｎｄ　ＰＣＲ産物からプライマーを除去するため、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によりカラム精製を行った後、Ｐ２０ＥＡプライマー（配列番号２）にアダプターＢ配列（配列番号１３７５）を付加したＢ－Ｐ２０ＥＡプライマー（配列番号４）とＩｇＭ　Ｃ領域特異的プライマー（ＣＭ３にアダプターＡ配列（配列番号３９）および同定配列であるＭＩＤ　Ｔａｇ配列（表１－６を参照）を付加したＧＳ－ＰＣＲプライマー（配列情報は表１－１を参照）を用いてＰＣＲを行う。
（６）ＧＳ－ＰＣＲ増幅の後、２％アガロースゲル電気泳動を実施し、目視化において目的のサイズ（５００ｂｐ～７００ｂｐ）のバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。回収されたＤＮＡをＱｕａｎｔ－ｉＴTM　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ量を測定した。１０００万ＤＮＡをエマルジョンＰＣＲに用い、Ｒｏｃｈｅ社製次世代シーケンス解析装置（ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒベンチトップシステム）によるシーケンス解析を行う。
（７）得られた配列データについて本発明において新規に開発したＴＣＲ／ＢＣＲレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ、本明細書解析試験例、解析実施例１～５等参照）を用いて、Ｖ及びＪ配列のアサイメント並びにＣＤＲ３領域の推定アミノ酸配列を決定する。同時に、同一の塩基配列についてそのコピー数を集計し、出現頻度によるランキングを行なう。
（８）ランキング最上位のＢＣＲ遺伝子を決定し、そのBCRのリード数が全体の１０％以上を占めることを著明に高いとして確認し、該ＢＣＲ遺伝子を腫瘍由来ＢＣＲ遺伝子として同定する。
（９）該腫瘍由来ＢＣＲ遺伝子の推定アミノ酸配列について、ＨＬＡ結合ペプチド予測プログラムであるＢＩＭＡＳ（www-bimas.cit.nih.gov/）を用いて、ＨＬＡ結合ぺプチドを予測する。特に条件指定がなければデフォルトの条件を用いる。該ＢＣＲアミノ酸配列と患者ＨＬＡ型をBIMASに入力し、ＣＤＲ３アミノ酸配列内のペプチド、もしくはＣＤＲ３アミノ酸配列の一部を含むペプチドの中で、最も高いスコアを示した推定ＨＬＡ結合ペプチドを決定する。
（１０）ハイスコアＨＬＡ結合ペプチドを個別化がんペプチドとして用いて、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法または樹状細胞（ＤＣ）ワクチン療法を実施する。ここでは、ＤＣワクチン療法を実施する。
（１１）個別化がんペプチド配列を、全自動ペプチド合成装置（Protein　Technologies,　Inc.社）を用いて化学合成する。ペプチドは収量１ｍｇ以上、純度９５％以上のものを獲得する。ペプチドは５０％ＤＭＳＯに溶解し、－20℃で保存する。
（１２）成分採血装置（テルモアフェレーシス装置AC-555）を実施し、がん患者より単球細胞を分離する。単球を含む細胞をAIM-V培地（Invitrogen, 12055091）で洗浄した後、細胞数を計測する。
（１３）プラスティックプレート上で付着しなかった細胞を除去した後、2000U/mLの顆粒球単球コロニー刺激因子（GM－CSF、和光純薬）及び400U/mLのインターロイキン－４（IL-4、ペトロテック）を含むAIM-V培地で約1週間培養し、樹状細胞（ＤＣ）に分化誘導させる。
（１４）MHCクラスI&II分子、CD40，CD80またはCD86の発現をFACS解析を用いて調べることでＤＣに分化したことを確認した後、2×106　細胞に対して20μg/mLの個別化がんペプチドを添加し、刺激因子（ピシバニール（OK-432）, ピシバニール注射用0.5KE, 中外製薬）とともにAIM-V培地（上記同様）でさらに1日培養する。
（１５）ペプチド刺激したＤＣ細胞を回収し、生理食塩水で洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入を行なう。
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）悪性リンパ腫患者の末梢血においる次世代ＢＣＲレパトア解析によって、全体のＢＣＲリードのうち５０％以上を占める１種のＩｇＭ免疫グロブリン重鎖及び１種のＩｇＭ免疫グロブリン軽鎖が同定される。
（２）これら免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ３領域をＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓプログラムで特定される。
（３）ＢＩＭＡＳプログラムに患者ＨＬＡ型（例：ＨＬＡ－Ａ＊０２）及びＩｇＭ免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を入力し、結合スコアが最もハイスコアを示すペプチド配列が選択される。
（４）このペプチドを個別化がんペプチドとして、全自動ペプチド合成装置にて化学合成し、患者由来のＤＣをペプチドがin vitroで刺激活性化される。
（５）個別化ペプチド刺激ＤＣ細胞を患者に静脈移入し、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）患者癌細胞由来のＢＣＲ配列を使って、治療用個別化がんぺプチドを作製することができ、ＨＬＡ型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にＤＣ療法やＣＴＬ療法を行なうことができる。
（２）患者のＨＬＡに適合したペプチドを用いるため、より患者に適合し、癌細胞に特異性の高い、効果的なＤＣ療法やＣＴＬ療法が実現できる。
（３）ＢＣＲ解析から得られた遺伝子配列から直接抗原ペプチドを化学合成できるため、
安全性が高く、抗原同定などの必要がない。
　（応用実施例３：改良型ＣＴＬ法）
　本実施例では、本発明のレパトア解析を用いた改良型ＣＴＬ法での実証例を行う。以下にその手順を説明する（図６３参照）。
（１）応用実施例２（１）～（９）に記載の方法でがんイディオタイプペプチドを同定する。
（２）既存のがんペプチド（NY-ESO-1ペプチド）またはがんイディオタイプペプチド（１）により同定されたペプチド）について、全自動ペプチド合成装置（Protein　Technologies,Inc.社）を用いて化学合成する。ペプチドは収量１ｍｇ以上、純度９５％以上のものを獲得する。ペプチドは５０％ＤＭＳＯに溶解し、－20℃で保存する。
（３）該がん患者より２０ｍＬの末梢血を採血し、Ficoll-Paque比重遠心分離（応用実施例２を参照）により末梢血単核球（PBMC）を分離する。
（４）ＣＤ８＋Ｔ細胞分離用磁気ビーズ（Miltenyi　Biotech）もしくはフローサイトメトリー装置（FACS　Aria　II,　Beckton　Dickinson）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する。
（５）成分採血装置（テルモアフェレーシス装置AC-555）またはPBMCより分離した単球細胞を培養プレート（100mm ディッシュ、コーニング、353003）で培養し、非付着系の細胞を除去する。
（６）付着した単球細胞を、2000U/mLの顆粒球単球コロニー刺激因子（GM－CSF、和光純薬）及び400U/mLのインターロイキン－４（IL-4、ペトロテック）を含むAIM-V培地（応用実施例２と同じ）で約1週間培養し、樹状細胞（ＤＣ）に分化誘導させる。
（７）ＤＣに分化したことを確認した後、2×106細胞に対して20μg/mLのペプチド（応用実施例２の「最も高いスコアを示した推定ＨＬＡ結合ペプチド」）を添加し、刺激因子（ピシバニール（OK-432）, ピシバニール注射用0.5KE, 中外製薬）とともにAIM-V培地でさらに1日培養する。
（８）さらに、ＤＣ培養液に対し、20μg/mLの合成ペプチド（応用実施例２の「最も高いスコアを示した推定ＨＬＡ結合ペプチド」）、及び上記（３）で分離した2×106/mLのＣＤ８＋Ｔ細胞とAIM-V培地（応用実施例２等を参照）にて刺激培養する。
（９）抗原刺激により増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞をプラスティック培養プレート（100mm ディッシュ、コーニング、353003）（（５）のプレートと同様）に付着したＤＣと分離した後に、さらに5μg/mLの抗ＣＤ３抗体（OKT3、オルソクローンＯＫＴ３、ヤンセンファーマ）及び200U/mLのインターロイキン－２（ＩＬ－２）（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、10799068001）の存在下で拡大培養する。
（９）活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＴＬ細胞として回収した後、生理食塩水にて洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入を行なう。
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）悪性リンパ腫患者の腫瘍細胞由来ＢＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域からＨＬＡ結合ペプチドが同定される。
（２）患者末梢血からＣＤ８＋Ｔ細胞分離用磁気ビーズにより2x106細胞のCD8陽性細胞を回収した。純度は９８％である。
（３）患者単球由来ＤＣ細胞、ＣＤ８＋細胞、ペプチドとの混合培養で抗原刺激を行い、さらに、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ－２の存在下での拡大培養で、ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞を５０倍まで増殖することができる。
（４）培養ＣＴＬ細胞を患者に静脈移入し、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
　（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）患者癌細胞由来のＢＣＲ配列を使って、治療用個別化がんぺプチドを作製することができ、ＨＬＡ型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にＣＴＬ療法を行なうことができる。
（２）患者のＨＬＡに適合したペプチドを用いるため、より患者に適合し、癌細胞に特異性の高い、効果的なＣＴＬ療法が実現できる。
（３）ＢＣＲ解析から得られた遺伝子配列から直接抗原ペプチドを化学合成できるため、
安全性が高く、抗原同定などの必要がない。
　（応用実施例４：ＤＣワクチン療法）
　本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたＤＣワクチン療法の実証例を行う。以下にその手順を説明する（図６４参照）。
（１）応用実施例２（１）～（９）に記載の方法でがんイディオタイプペプチドを同定する。
（２）既存のがんペプチド（NY-ESO-1ペプチド）またはがんイディオタイプペプチド（１）により同定されたペプチド）について、全自動ペプチド合成装置（Protein　Technologies,Inc.社）を用いて化学合成する。ペプチドは収量１ｍｇ以上、純度９５％以上のものを獲得する。ペプチドは５０％ＤＭＳＯに溶解し、－20℃で保存する。がん患者より成分採血（アフェレーシス）により単球細胞を分離する。
（３）成分採血装置（テルモアフェレーシス装置AC-555）を実施し、該がん患者より単球細胞を分離する。単球を含む細胞をAIM-V培地（応用実施例2等を参照）で洗浄した後、細胞数を計測した。
（４）プラスティックプレート（100mm ディッシュ、コーニング、353003）上で付着しなかった細胞を除去した後、2000U/mLの顆粒球単球コロニー刺激因子（GM－CSF、和光純薬）及び400U/mLのインターロイキン－４（IL-4、ペトロテック）を含むAIM-V培地（応用実施例２参照）で約1週間培養し、樹状細胞（ＤＣ）に分化誘導させる。
（５）MHCクラスI&II分子、CD40，CD80またはCD86の発現をFACSにて調べることでＤＣに分化したことを確認した後、2×106細胞に対して20μg/mLのペプチド（（２）で合成したペプチド）を添加し、刺激因子（ピシバニール（OK-432）, ピシバニール注射用0.5KE, 中外製薬）とともにAIM-V培地（応用実施例2等を参照）でさらに1日培養する。
（６）ペプチド刺激したＤＣ細胞を回収し、生理食塩水で洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入（テルフュージョン輸液システム、テルモ）を行なう。
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）悪性リンパ腫患者の腫瘍細胞由来ＢＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域からＨＬＡ結合ペプチドを同定する。
（２）患者末梢血から単球を分離し、分化培養培地で培養することで、MHC DR+, CD40+,CD80/CD86+細胞を検出し、単球からＤＣへの分化が確認する。
（３）ペプチド刺激ＤＣ細胞を患者に静脈移入し、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
　（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）患者癌細胞由来のＢＣＲ配列を使って、治療用個別化がんぺプチドを作製することができ、ＨＬＡ型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にＤＣ療法を行なうことができる。
（２）患者のＨＬＡに適合したペプチドを用いるため、より患者に適合し、癌細胞に特異性の高い、効果的なＤＣ療法が実現できる。
（３）ＢＣＲ解析から得られた遺伝子配列から直接抗原ペプチドを化学合成できるため、安全性が高く、抗原同定などの必要がない。
　（応用実施例５：患者自己免疫細胞療法）
　　本実施例では、本発明のレパトア解析を用いた患者自己免疫細胞療法の実証例を行う。以下にその手順を説明する（図６５参照）。
（１）応用実施例２（１）～（９）に記載の方法でがんイディオタイプペプチドを同定する。
（２）既存のがんペプチドまたはがんイディオタイプペプチド（１）により同定されたペプチド）（について、全自動ペプチド合成装置（Protein　Technologies,Inc.社）を用いて化学合成する。ペプチドは収量１ｍｇ以上、純度９５％以上のものを獲得する。ペプチドは５０％ＤＭＳＯに溶解し、－20℃で保存する。
（３）該がん患者より２０ｍＬの末梢血を採血し、Ficoll-Paque比重遠心分離により末梢血単核球（PBMC）を分離する。
（４）ＣＤ８＋Ｔ細胞分離用磁気ビーズ（Miltenyi　Biotech）もしくはフローサイトメトリー装置（FACS　Aria　II,　Beckton　Dickinson）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する。
（５）成分採血装置（テルモアフェレーシス装置AC-555）またはPBMCより分離した単球細胞を培養プレート（100mm ディッシュ、コーニング、353003）で培養し、非付着系の細胞を除去する。
（６）付着した単球細胞を、2000U/mLの顆粒球単球コロニー刺激因子（GM－CSF、和光純薬）及び400U/mLのインターロイキン－４（IL-4、ペトロテック）を含むAIM-V培地（応用実施例２等と同じ）で約1週間培養し、樹状細胞（ＤＣ）に分化誘導させる。
（７）ＤＣに分化したことを確認した後、2×106細胞に対して20μg/mLのペプチド（（２）で合成したペプチド）を添加し、刺激因子とともにAIM-V培地でさらに1日培養する。
（８）さらに、ＤＣ培養液に対し、20μg/mLの合成ペプチド（（２）で合成したペプチド）、及び上記（３）で分離した2×106/mLのＣＤ８＋Ｔ細胞とAIM-V培地（応用実施例２等と同じ）にて刺激培養する。
（９）活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞とペプチド刺激ＤＣ細胞を共に回収した後、生理食塩水にて洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入を行なう。
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）悪性リンパ腫患者の腫瘍細胞由来ＢＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域からＨＬＡ結合ペプチドを同定する。
（２）患者末梢血からＣＤ８＋Ｔ細胞分離用磁気ビーズにより2x106細胞のCD8陽性細胞を回収する。純度は９８％以上である。
（３）患者末梢血から単球を分離し、分化培養培地で培養することで、MHC DR+, CD40+,CD80/CD86+であるＤＣへの分化が確認する。
（４）患者単球由来ＤＣ、ＣＤ８＋細胞、ペプチドを混合培養することで、腫瘍特異的ＣＴＬ及びＤＣを増殖することができる。
（５）ペプチド刺激ＣＤ８＋細胞とＤＣ細胞を共に患者に静脈移入し、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
　（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）患者癌細胞由来のＢＣＲ配列を使って、治療用個別化がんぺプチドを作製することができ、ＨＬＡ型や抗原の発現に関係なく幅広い患者に患者自己免疫細胞療法を行なうことができる。
（２）患者のＨＬＡに適合したペプチドを用いるため、より患者に適合し、癌細胞に特異性の高い、効果的な患者自己免疫細胞療法が実現できる。
（３）ＢＣＲ解析から得られた遺伝子配列から直接抗原ペプチドを化学合成できるため、安全性が高く、抗原同定などの必要がない。
（４）ＤＣ細胞とＣＴＬ細胞の相乗効果が期待でき、高い治療効果が見込める。
　（応用実施例６：オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離）
　本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離の実証例を行う。以下にその手順を説明する（図６６参照）。
（１）がん患者から常法により腫瘍細胞を摘出する。
（２）該患者由来腫瘍細胞を培養培地（RPMI1640,11875-093, Invitrogen、以下「培養液」と称することもある）中で細断した後、0.70μmのフィルター（Falconセルストレイナー、コーニング）でろ過することにより、単一細胞に分離する。培養液中に10μg/mlのマイトマイシンＣ（注射用マイトマイシンC、協和発酵キリン）により37℃で2時間不活化処理をする。
（３）該がん患者の全血１０ｍＬからFicoll-Paque比重遠心分離により末梢血単核球細胞（PBMC）を分離する。PBMCは培養培地（RPMI1640）で洗浄後2×106/mLの濃度で懸濁する。
（４）PBMCの一部（1×106）を未処理コントロール試料として、細胞よりＲＮＡをTrizol　RNA抽出キット（Invitrogen）により抽出する。
（５）不活化腫瘍細胞と末梢血細胞を低濃度ＩＬ－２の存在下10%ＦＣＳ（16000-044, Invitrogen）を含むRPMI1640培地（RPMI1640,11875-093, Invitrogen）で１週間培養することにより腫瘍特異的Ｔ細胞を抗原刺激し、細胞増殖させる。
（６）Ｔ細胞活性化の後、培養培地から生細胞を回収し、ＰＢＳ（045-29795, 和光純薬）にて洗浄後、細胞よりＲＮＡを抽出する。
（７）（４）および（６）で抽出したＲＮＡ試料を用いて、本発明の次世代レパトア解析を実施する（その条件は、本明細書解析試験例、解析実施例１～５に記載のものを使用することができる。）
（８）本発明の次世代レパトア解析により得られたＴＣＲ遺伝子配列データについて、コントロール試料に比し刺激試料で大きく増加したＴＣＲ遺伝子を抽出し、それらをランキング処理した後に、上位のＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子を選択する。
（９）これらの全長ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクター（Retro-X　Vectors　and　Systems,　Clonetech）にそれぞれ導入する。
（１０）（９）で調製したこれらＴＣＲα及びＴＣＲβ組換えプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞GP2-293細胞株（631458, 　Clonetech）を形質転換し、遺伝子導入用レトロウイルスを作製する。
（１１）成分採血装置（テルモアフェレーシス装置AC-555）により分離したリンパ球細胞を用いて、遺伝子組換えＴＣＲαレトロウイルス及び遺伝子組換えＴＣＲβレトロウイルスを単独で、連続して感染させることにより、機能的αβＴＣＲを発現するリンパ球集団を得る。
（１２）細胞表面におけるＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの発現とその陽性細胞の割合をＦＡＣＳ（応用実施例５を参照、同じ条件を使用することができる）により確認する。
（１３）目的のＴＣＲα／ＴＣＲβを発現する腫瘍特異的患者リンパ球を患者に細胞移入する
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）患者腫瘍組織で刺激した試料とコントロール試料との対比から、腫瘍組織で増加するＴＣＲ遺伝子を選択し、ランキングした結果、末梢血細胞に多く存在するＴＣＲが除かれ、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子が多数抽出される。
（２）これら抽出された遺伝子について、同程度のランキングにあるＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子を選択し、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球の作製に利用する。
（３）レトロウイルス発現ベクター内に全長のＴＣＲαおよびβ鎖遺伝子をクローニングすることができ、パッケージングにより高力価のＴＣＲαレトロウイルス及びＴＣＲβレトロウイルスが作製される。
（４）該患者リンパ球に混合レトロウイルスを感染させ、組換え型ＴＣＲα／ＴＣＲβの発現をＦＡＣＳにて確認する。
（５）一連の工程により製造された腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子組換えリンパ球を患者に移入することで、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
　（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）患者自身の癌細胞及びＴ細胞を使って、治療用の腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を作製することができ、ＨＬＡ型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にＴＣＲ遺伝子治療を行なうことができる。
（２）患者試料に存在するＴＣＲ配列を利用するため、患者のＨＬＡにあったＴＣＲ遺伝子を利用することができ、癌細胞に特異性の高い、効果的な治療が実現できる。
（３）患者試料に存在するＴＣＲ配列を利用するため、患者正常細胞に反応しない、安全性の高いＴＣＲ遺伝子治療が実現できる。
（３）ＴＣＲ解析から得られた遺伝子配列を直接利用するため、抗原の同定が必要なく、特定の抗原を用いたＴＣＲ遺伝子の取得が必要ない。
　（応用実施例7：ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子の調製）
　本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子の調製の実証例を行う。以下にその手順を説明する（図６７参照）。
（１）ＨＬＡが同一のがん患者からそれぞれ腫瘍細胞を摘出し、同時に末梢血を分離する。
（２）腫瘍細胞浸潤Ｔ細胞を含む腫瘍組織、あるいはリンパ球細胞からTrizol　Reagent（invitrogen）を用いてＲＮＡを抽出する。
（３）RNAから本明細書における調製実施例等で説明されているAdaptor-ligation　PCR法でＴＣＲ遺伝子(調製実施例等と同じ）を増幅し、GS Juniorベンチトップシステム（Ｒｏｃｈｅ）等次世代シーケンスによるレパトア解析を行なう。
（４）それぞれの使用から得られたＴＣＲ遺伝子配列について新規に開発したＴＣＲ／ＢＣＲレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ、本明細書の解析実施例１～５を参照）を用いて、Ｖ，ＤおよびＣＤＲ３領域の配列を決定し、同一配列の存在頻度に基づいてランキングする。
（５）個々の患者において末梢血細胞に比べ腫瘍細胞で高い存在頻度（ここでは、具体的な例として、存在頻度＞１０倍、かつ腫瘍組織でのランキング上位のもの）を示したＴＣＲ遺伝子を検索し、腫瘍特異的として同定する。
（６）それら腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子について、複数の同一のＨＬＡを有するがん患者間で共通するＴＣＲ遺伝子配列を検索する。
（７）最も多くの癌患者で共通する腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を治療用腫瘍特異的ＴＣＲとして選択する。
（８）これらの全長ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクターに導入する（応用実施例６と同じものを使用することができる）。
（９）これらＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子発現レトロウイルスベクターから遺伝子導入用ウイルスを上記応用実施例６（１０）の方法に従い作製する。
（１０）該患者から採取したリンパ球に上記（９）により作製したＴＣＲαレトロウイルスを含有する培養液とＴＣＲβレトロウイルスを含有する培養液を等量混合し、３７℃で４時間培養する。その後ＰＢＳにて細胞を洗浄し、さらに、３７℃で２４時間培養する。
（１１）細胞表面における遺伝子組換えＴＣＲαβ分子の発現を確認する。IOTest Beta MarkTCR Vβレパトワ解析キット（Multi-analysisTCR Vβ antibodies, IM3497, Beckman Courter）および抗ヒトCD8抗体（CD8α,6602385, Beckman Courter）を用いたＦＡＣＳ解析によって、ＣＤ８陽性細胞における遺伝子導入するＴＣＲβ鎖陽性細胞の割合を確認する。
（１２）（１１）で目的ＴＣＲαβの発現が確認された細胞を、RPMI1640培地にて0.5 x 106細胞濃度で３７℃の条件下で細胞培養を行なう。腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球ををＰＢＳで洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入（テルフュージョン輸液システム、テルモ）により細胞移入する。
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）患者腫瘍組織間で共通するＴＣＲ遺伝子を選択し、ランキングした結果、末梢血細胞に多く存在するＴＣＲが除かれ、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子が多数抽出される。
（２）これら抽出された遺伝子について、同程度のランキングにあるＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子のペア、かつ同一患者に存在するペアを選択し、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球の作製に利用する。
（３）レトロウイルス発現ベクター内に全長のＴＣＲαおよびβ鎖遺伝子をクローニングすることができ、パッケージングにより高力価のＴＣＲαレトロウイルス及びＴＣＲβレトロウイルスを作製する。
（４）該患者リンパ球に混合レトロウイルスを感染させ、組換え型ＴＣＲα／ＴＣＲβ発現をＦＡＣＳにて確認する。
（５）一連の工程により製造された腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子組換えリンパ球を患者に移入することで、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
　（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）患者自身の癌細胞及びＴ細胞を使って、治療用の腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を作製することができ、ＨＬＡ型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にＴＣＲ遺伝子治療を行なうことができる。
（２）患者試料に存在するＴＣＲ配列を利用するため、患者のＨＬＡにあったＴＣＲ遺伝子を利用することができ、癌細胞に特異性の高い、効果的な治療が実現できる。
（３）患者試料に存在するＴＣＲ配列を利用するため、患者正常細胞に反応しない、安全性の高いＴＣＲ遺伝子治療が実現できる。
（３）ＴＣＲ解析から得られた遺伝子配列を直接利用するため、抗原の同定が必要なく、特定の抗原を用いたＴＣＲ遺伝子の取得が必要ない。
　（応用実施例８：細胞加工療法）
　　本実施例では、本発明のレパトア解析を用いた細胞加工療法の実証例を行う。以下にその手順を説明する（図６８参照）。
（１）　応用実施例６に従い遺伝子導入用レトロウイルスを作製し、機能的αβＴＣＲを発現するリンパ球集団を作出する。
（２）応用実施例６（１）－（２）の手順に従って分離、不活化した患者由来腫瘍細胞をRPMI1640培地（11875-093, Invitrogen）で希釈する。
（３）ＥＬＩＳＰＯＴキット（IFN-γ, Human,ELISpot Kit, EL285, R&D Systems社）を用いて、（１）で作製した腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球と不活化患者腫瘍細胞を、1x106/mLの細胞濃度で、リンパ球と腫瘍細胞の細胞比（Ｅ：Ｔ比）を２：１、１：１、０．５：１の比で混合したものを、３７℃で２４時間培養する。
（４）２４時間後、細胞を除去し、ＰＶＦＤ膜上のＩＮＦγの産生を発色法により検出し、ＩＦＮγ産生細胞数をカウントすることで、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球の腫瘍特異性について評価する。
（５）５％以下の細胞でＩＦＮγの産生が見られない場合は、応用実施例６（８）で採用したＴＣＲ以外のＴＣＲ遺伝子の中で、ランキング上位で、かつＴＣＲαとＴＣＲβが同程度の存在比率を示すペアを選択し、応用実施例６（９）－（１１）の工程を経て、新たな腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を作製する。
（６）このＴＣＲαおよびＴＣＲβについて、上記（１）－（４）の工程を実施し、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球の腫瘍特異性について評価する。
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を作製し、不活化腫瘍細胞に対する反応性を調べる。該ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球が、腫瘍に反応して、ＩＦＮγを産生することがわかる。
（２）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を患者に移入し、抗腫瘍効果並びに臨床症状の改善を見る。
　（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）患者自身の癌細胞及びＴ細胞を使って、治療用の腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を作製することができ、ＨＬＡ型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にＴＣＲ遺伝子治療を行なうことができる。
（２）患者試料に存在するＴＣＲ配列を利用するため、患者のＨＬＡにあったＴＣＲ遺伝子を利用することができ、癌細胞に特異性の高い、効果的な治療が実現できる。
（３）患者試料に存在するＴＣＲ配列を利用するため、患者正常細胞に反応しない、安全性の高いＴＣＲ遺伝子治療が実現できる。
（３）ＴＣＲ解析から得られた遺伝子配列を直接利用するため、抗原の同定が必要なく、特定の抗原を用いたＴＣＲ遺伝子の取得が必要ない
　（応用実施例９：インビトロで刺激試験を行い有効性および／または安全性評価を行う方法）
　本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたインビトロで刺激試験での有効性および／または安全性評価の実証例を提供する。以下にその手順を説明する（図６９参照）。
（１）　応用実施例６に従い遺伝子導入用レトロウイルスを作製し、腫瘍特異的αβＴＣＲを発現するリンパ球集団を作出する。
　＜有効性評価＞
（１）有効性を評価する場合、患者由来の癌細胞を摘出・分離し、培養液（RPMI1640,11875-093, Invitrogen）中で細断した後、0.70μmのフィルター（Falconセルストレイナー、コーニングでろ過することにより、単一細胞に分離する。培養液中に10μg/mlのマイトマイシンＣ（注射用マイトマイシンC、協和発酵キリン）により37℃で2時間不活化処理をする。不活化処理を行なった後、応用実施例６に記載されるように作製した腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球と混合培養する。
（２）応用実施例８に示したＥＬＩＳＰＯＴ法によって、腫瘍細胞に対する反応性を評価する。すなわち、ＥＬＩＳＰＯＴキット（IFN-γ, Human,ELISpot Kit, EL285, R&D Systems社）を用いて、応用実施例６に従い作製した腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球と不活化患者腫瘍細胞を、1x106/mLの細胞濃度で、リンパ球と腫瘍細胞の細胞比（Ｅ：Ｔ比）を２：１、１：１、０．５：１の比で混合したものを、３７℃で２４時間培養する。
（３）２４時間後、細胞を除去し、ＰＶＦＤ膜上のＩＮＦγの産生を発色法により検出し、ＩＦＮγ産生細胞数をカウントすることで、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球の腫瘍特異性について評価する。ＥＬＩＳＰＯＴ法以外に、ＭＴＴ試験（CellProliferation Kit I, MTT assay, 11465007001, Roche Diagnostics）あるいはＩＬ－２産生試験（ヒトIL-2 ELISAシステム, GEヘルスケア, RPN5965）などの細胞増殖試験によっても評価することができる。
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子組換えリンパ球の不活化腫瘍細胞に対する反応性を調べた結果、高頻度なＩＦＮγの産生が認められる。
（２）培養時間に経時的にＩＦＮγ陽性細胞数は増加し、２４時間でプラトーに達する。
（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を使った遺伝子治療を施す前に、患者自身の細胞を使った有効性の評価ができ、治療前に有効性を予測できる。
（２）有効性を評価することで、ＴＣＲ遺伝子を選択して利用することができ、より効果的なＴＣＲ遺伝子治療ができる。
　＜安全性評価＞
（１’）安全性を評価する場合、対照となる既存の細胞株、患者癌細胞を含んでいないと考えられる正常組織（腫瘍摘出の過程で採取される正常組織の一部）、あるいは固形腫瘍の場合は患者末梢血細胞を用いて（１）（２）に同様の試験を実施する。
（２’）正常組織に対する腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球の反応性をＥＬＩＳＰＯＴ法で定量し、評価する。
（３’）正常細胞への反応性が低く、腫瘍細胞への反応性が高い腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を選択し、患者治療に用いる。
　（結果）
　本実施例により、以下が達成される。
（１）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を作製し、不活化正常細胞に対する反応性を調べた結果、ＩＦＮγが産生されず、正常細胞に対してほとんど反応性を示さないことがわかる。
　（考察）
　本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
（１）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を使ったハイリスクの遺伝子治療を施す前に、患者自身の細胞を使った安全性の評価ができ、より安全な治療を実現できる。
（２）安全性を評価することで、リスクの高いＴＣＲ遺伝子を除外でき、より安全なＴＣＲ遺伝子を使った治療ができる。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許出願2013－241403、2013－241404、2013－241405に対して優先権主張をするものであり、これらの出願の内容はその全体が参考として援用される。
　精確度の高い非バイアスでの大規模遺伝子解析のための試料が提供され、定量的な分析が特に必要とされる臨床応用場面において特に有用である。
配列番号１～１９：実施例１で使用されるプライマー配列（表１）
配列番号２０～３１：ＢＣＲリードのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号３２～３８：実施例２で使用されるプライマー配列（表２）
配列番号３９：Ａｄａｐｔｏｒ－Ａの配列
配列番号４０～６０：シーケンス用プライマー（表６）
配列番号６１～１１６４：ＢＣＲリードのＣＤＲ３アミノ酸配列（表１Ｈ）
配列番号１１６５～１３２４：Ｍｏｌｔ－４細胞段階希釈試料におけるＴＣＲリード
配列番号１３２５～１３７４：分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列の例
配列番号１３７５：Ａｄａｐｔｏｒ－Ｂの配列
配列番号１３７６～１３７９：ＴＣＲの各全長配列
配列番号１３８１～１３８６：ＢＣＲの各全長配列
配列番号１３８７：ＣＭ３－ＧＳ（配列番号７）中の特異的配列（ＣＭ３）
配列番号１３８８：ＣＡ３－ＧＳ（配列番号１０）中の特異的配列（ＣＡ３）
配列番号１３８９：ＣＧ３－ＧＳ（配列番号１３）中の特異的配列（ＣＧ３）
配列番号１３９０：ＣＤ３－ＧＳ（配列番号１６）中の特異的配列（ＣＤ３）
配列番号１３９１：ＣＥ３－ＧＳ（配列番号１９）中の特異的配列（ＣＥ３）
配列番号１３９２：標的配列ＴＲＢＣ、名称ＴＲＢＣ２＊０１、膜結合型
配列番号１３９３：標的配列ＴＲＢＣ、名称ＴＲＢＣ２＊０２、膜結合型
配列番号１３９４：標的配列ＴＲＧＣ、名称ＴＲＧＣ１＊０２、膜結合型
配列番号１３９５：標的配列ＴＲＧＣ、名称ＴＲＧＣ２＊０１、膜結合型
配列番号１３９６：標的配列ＴＲＧＣ、名称ＴＲＧＣ２＊０２、膜結合型
配列番号１３９７：標的配列ＴＲＧＣ、名称ＴＲＧＣ２＊０３、膜結合型
配列番号１３９８：標的配列ＴＲＧＣ、名称ＴＲＧＣ２＊０４、膜結合型
配列番号１３９９：標的配列ＴＲＧＣ、名称ＴＲＧＣ２＊０５、膜結合型
配列番号１４００：標的配列ＩＧＨＡ、名称ＩＧＨＡ２＊０１、分泌型
配列番号１４０１：標的配列ＩＧＨＡ、名称ＩＧＨＡ２＊０２ｓ、分泌型
配列番号１４０２：標的配列ＩＧＨＡ、名称ＩＧＨＡ２＊０２、膜結合型
配列番号１４０３：標的配列ＩＧＨＡ、名称ＩＧＨＡ２＊０３、分泌型
配列番号１４０４：標的配列ＩＧＨＤ、名称ＩＧＨＤ＊０１、分泌型
配列番号１４０５：標的配列ＩＧＨＤ、名称ＩＧＨＤ＊０２、分泌型
配列番号１４０６：標的配列ＩＧＨＤ、名称ＩＧＨＤ＊０２、膜結合型
配列番号１４０７：標的配列ＩＧＨＥ、名称ＩＧＨＥ＊０１、膜結合型
配列番号１４０８：標的配列ＩＧＨＥ、名称ＩＧＨＥ＊０２、分泌型
配列番号１４０９：標的配列ＩＧＨＥ、名称ＩＧＨＥ＊０３、膜結合型
配列番号１４１０：標的配列ＩＧＨＥ、名称ＩＧＨＥ＊０４、分泌型
配列番号１４１１：標的配列ＩＧＨＥ、名称ＩＧＨＥ＊０４、膜結合型
配列番号１４１２：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ１＊０２、分泌型
配列番号１４１３：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ１＊０３、分泌型
配列番号１４１４：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ２＊０、分泌型
配列番号１４１５：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ２＊０１、膜結合型
配列番号１４１６：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ２＊０２、分泌型
配列番号１４１７：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ２＊０３、分泌型
配列番号１４１８：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ２＊０４、分泌型
配列番号１４１９：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ２＊０５、分泌型
配列番号１４２０：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ２＊０６、分泌型
配列番号１４２１：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ２＊０６、膜結合型
配列番号１４２２：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０１、分泌型
配列番号１４２３：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０１、膜結合型
配列番号１４２４：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０３、分泌型
配列番号１４２５：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０３、膜結合型
配列番号１４２６：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０４、分泌型
配列番号１４２７：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０５、分泌型
配列番号１４２８：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０６、分泌型
配列番号１４２９：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０７、分泌型
配列番号１４３０：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０８、分泌型
配列番号１４３１：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊０９、分泌型
配列番号１４３２：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１０、分泌型
配列番号１４３３：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１１、分泌型
配列番号１４３４：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１２、分泌型
配列番号１４３５：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１３、分泌型
配列番号１４３６：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１４、分泌型
配列番号１４３７：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１５、分泌型
配列番号１４３８：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１６、分泌型
配列番号１４３９：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１７、分泌型
配列番号１４４０：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１８、分泌型
配列番号１４４１：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ３＊１９、分泌型
配列番号１４４２：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ４＊０１、分泌型
配列番号１４４３：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ４＊０２、分泌型
配列番号１４４４：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ４＊０３、分泌型
配列番号１４４５：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ４＊０４、分泌型
配列番号１４４６：標的配列ＩＧＨＧ、名称ＩＧＨＧ４＊０４、膜結合型
配列番号１４４７：標的配列ＩＧＨＭ、名称ＩＧＨＭ＊０１、膜結合型
配列番号１４４８：標的配列ＩＧＨＭ、名称ＩＧＨＭ＊０３、分泌型
配列番号１４４９：標的配列ＩＧＨＭ、名称ＩＧＨＭ＊０３、膜結合型
配列番号１４５０～１４９９：ＴＲＡリード（上位５０位）（表３－１）
配列番号１５００～１５４９：ＴＲＢリード（上位５０位）（表３－２）
配列番号１５５０～１５８７：健常人における重複ＴＣＲα鎖リード配列（表３－７）
配列番号１５８８～１６２６：健常人における重複ＴＣＲβ鎖リード配列（表３－８）
配列番号１６２７～１６４７：インバリアントＴＣＲ候補遺伝子（表３－９）
配列番号１６４８～１８６０：がん患者における重複ＴＣＲαリード配列とがん特異的ＴＣＲ
αリード（表３－１１）
配列番号１８６１～１９０９：がん患者における重複ＴＣＲβリード配列とがん特異的ＴＣＲ
β（表３－１２）
配列番号１９１０～１９２１：Ｐ５－Ｐ２０ＥＡプライマー
配列番号１９２２～１９２９：Ｐ７－ＣＡ３プライマー
配列番号１９３０～１９３７：Ｐ７－ＣＢ３プライマー
配列番号１９３８～１９９２：解析システムの実施例５で同定されたパブリックＴＣＲα配列において観察されるインバリアントＴＣＲの配列

Claims (46)

  1. データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法であって、該方法は、
    （１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；
    （２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および
    （３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程
    を包含する、方法。
  2. 前記核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）は単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 前記単一の配列決定は、共通アダプタープライマーを用いて行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記非バイアス的な増幅が、Ｖ領域特異的な増幅ではない、請求項１に記載の方法。
  6. 前記レパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である、請求項１に記載の方法。
  7. データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
    （１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット；
    （２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および
    （３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するための装置を備えるシステム。
  8. 請求項７に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するシステム。
  9. 請求項８に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。
  10. 前記（１）は、以下の工程
    （１－１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；
    （１－２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
    （１－３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
    （１－４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
    　該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
    （１－５）（１－４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ
    、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および
    （１－６）（１－５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
    　該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
    　該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
    　該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
    　該分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程；
    を包含する、
    請求項１に記載の方法。
  11. 前記（１）キットは、以下：
    （１－１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する手段；
    （１－２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する手段；
    （１－３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する手段；
    （１－４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、
    　該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段
    （１－５）（１－４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段；および
    （１－６）（１－５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、
    　該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
    　該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
    　該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
    　該分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、手段；
    を包含する、
    請求項７に記載のシステム。
  12. （３）前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの導出は以下の工程
    （３－１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程：
    （３－２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程；
    （３－３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程；
    （３－４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する工程；
    （３－５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する工程；
    （３－６）（３－５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程；
    を包含する方法によって達成される、請求項１または１０に記載の方法。
  13. （３）前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの導出のための装置は以下
    （３－１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：
    （３－２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
    （３－３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
    （３－４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；
    （３－５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；
    （３－６）（３－５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；
    を備える、請求項７または１１に記載のシステム。
  14. ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法であって、以下のステップ：
    （１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：
    （２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；
    （３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；
    （４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；
    （５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；
    （６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；
    を包含する、方法。
  15. 前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し；リード両端からアダプタ配列と１０ｂｐ以上マッチする領域を削除し；および残った長さが２００ｂｐ以上（ＴＣＲ）もしくは３００ｂｐ以上（ＢＣＲ）なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記低クオリティは、ＱＶ値の７ｂｐ移動平均が３０未満のものである、請求項１６に記載の方法。
  18. ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析するシステムであって、該システムは：
    （１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：
    （２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
    （３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
    （４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；
    （５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；
    （６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；
    を包含する、システム。
  19. ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであって、該方法は以下のステップ：
    （１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：
    （２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；
    （３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；
    （４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；
    （５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；
    （６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；
    を包含する、プログラム。
  20. ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は以下のステップ：
    （１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：
    （２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；
    （３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；
    （４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；
    （５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；
    （６）入力配列セットにおいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；
    を包含する、記録媒体。
  21. データベースを用いた遺伝子配列解析により、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うための試料を調製するための方法であって、
    （１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；
    （２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
    （３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
    （４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
    　該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
    （５）（４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および
    （６）（５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
    　該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
    　該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
    　該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、
    　該分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程；
    を包含する、方法。
  22. 　前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＴＣＲまたはＢＣＲのレパトア解析のためのものであり、ＢＣＲである場合、ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，またはＩｇＥの各アイソタイプＣ領域に完全マッチする配列であって、該ＩｇＧおよびＩｇＡの場合は、サブタイプについても完全マッチし、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に
    不一致塩基が含まれるように選択され、
    　該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＢＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される、請求項２１に記載の方法。
  23. 第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ１（配列番号５）、ＣＡ１（配列番号８）、ＣＧ１（配列番号１１）、ＣＤ１（配列番号１４）、ＣＥ１（配列番号１７）、ＣＡ１（配列番号３５）、またはＣＢ１（配列番号３７）を有する、請求項１４に記載の方法。
  24. 第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ２（配列番号６）、ＣＡ２（配列番号９）、ＣＧ２（配列番号１２）、ＣＤ２（配列番号１５）、ＣＥ２（配列番号１８）、ＣＡ２（配列番号３５）、またはＣＢ２（配列番号３７）を有する、請求項１４に記載の方法。
  25. 第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ３－ＧＳ（配列番号７）、ＣＡ３－ＧＳ（配列番号１０）、ＣＧ３－ＧＳ（配列番号１３）、ＣＤ３－ＧＳ（配列番号１６）またはＣＥ３－ＧＳ（配列番号１９）を有する、請求項１４に記載の方法。
  26. 前記ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、いずれも、ＴＣＲまたはＢＣＲのすべてのサブクラスに対応するセットで提供される、請求項１４に記載の方法。
  27. 請求項１４～２６のいずれか1項に記載の方法で製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法。
  28.  前記遺伝子解析は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析である、請求項２７に記載の方法。
  29. 被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法であって、該方法は、
    （１）請求項Ｂ１に記載の方法によって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；
    （２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；
    （３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；および
    （４）決定されたペプチドを合成する工程；
    を包含する、方法。
  30. 前記（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＰまたはＮｅｔＭＨＣを用いて決定される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞－ペプチド混合物を生産する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
  34. （Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または請求項Ｃ１に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；
    （Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを請求項１に記載の方法によって解析する工程；および
    （Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程
    を包含する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法。
  35. （Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、請求項３４に記載の方法。
  36. （Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、請求項３４に記載の方法。
  37. （Ａ）工程は、請求項Ｃ１に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、請求項３４に記載の方法。
  38. （Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体から単離されたリンパ球または癌組織を提供する工程；
    （Ｂ）該リンパ球または癌組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを請求項１に記載の方法によって解析する工程；および
    （Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程
    を包含する、共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法。
  39. 　A)患者から採取されたＴリンパ球を提供する工程；
    　B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、請求項１に記載の方法に基づいてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；
    　Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程； および
    　Ｄ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程 
    を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を調製する方法。
  40. 前記抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、請求項３９に記載の方法。
  43. Ｃ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む、請求項３９に記載の方法。
  44. Ｃ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む、請求項３９に記載の方法。
  45. Ｃ）工程は、抗原刺激前後において請求項１に基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む、請求項３９に記載の方法。
  46. 請求項３８に記載の方法で単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および／または安全性評価を行う方法。
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