KR102543325B1 - 쌍을 이룬 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 고처리량 클로닝 및 이의 적용 - Google Patents

쌍을 이룬 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 고처리량 클로닝 및 이의 적용 Download PDF

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Abstract

이분 면역수용체의 동족 쌍을 코딩하는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 고처리량 클로닝을 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 또한, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터, 또는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 함유하는 세포의 다양한 적용이 본원에 제공된다.

Description

쌍을 이룬 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 고처리량 클로닝 및 이의 적용
상호 참조
본원은 2018년 8월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/718,227, 2018년 8월 31일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/725,842, 2018년 9월 18일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/732,898, 2019년 3월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/818,355, 2019년 3월 26일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/823,831에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 참조로 본원에 전체가 포함된다.
발명의 배경
T 세포 수용체(TCR)는 항원 주요 조직적합성 복합체의 인식을 담당하여 염증 반응을 개시한다. 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포를 포함하여 많은 T 세포 서브세트가 존재한다. 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포로도 공지됨)는 바이러스에 감염된 세포 또는 종양 세포와 같은 비정상 세포를 사멸시킨다. 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포로도 공지됨)는 다른 면역 세포의 활성화 및 성숙을 돕는다. 세포독성 및 헬퍼 T 세포 둘 다는 각각의 반응을 촉발하는 특정 표적 항원을 인식한 후 그들의 기능을 수행한다. T 세포의 항원 특이성은 T 세포 표면 상에서 발현되는 TCR에 의해 정의될 수 있다. T 세포 수용체는 2개의 폴리펩티드 쇄, 가장 일반적으로 알파 및 베타 쇄로 구성된 이종이량체 단백질이지만, 소수의 T 세포는 감마 및 델타 쇄를 발현할 수 있다. TCR의 특정 아미노산 서열 및 그에 따른 3차원 구조는 TCR 항원 특이성 및 친화성을 정의한다. 임의의 개별 T 세포에 대한 TCR 쇄의 아미노산 및 코딩 DNA 서열은 가능한 TCR 서열이 매우 많기 때문에 유기체의 전체 TCR 레퍼토리에서 거의 항상 유일하거나 매우 낮은 풍부도를 갖는다. 이 큰 서열 다양성은 다수의 세포 메카니즘을 통해 T 세포 발달 동안 달성되며, 매우 다양한 잠재적 항원에 반응하는 면역계 능력의 중요한 측면일 수 있다.
TCR 레퍼토리를 분석하는 것은 면역계 특색 및 질환, 특히 미지의 항원 촉발을 갖는 질환의 병인 및 진행에 대한 더 나은 이해를 얻는 데 도움이 될 수 있다. TCR 레퍼토리의 극도의 다양성 및 TCR의 이분(bipartite) 특성은 주요 분석 과제를 나타낸다. 고처리량 시퀀싱은 스펙트라타이핑(spectratyping)보다 더 많은 비용이 들지만 더 큰 시퀀싱 깊이 및 TCR 클론타입 풍부도의 훨씬 더 정확한 정량화를 허용할 수 있다. 그러나, 고처리량 시퀀싱은 여전히 PCR 편향 및 시퀀싱 오류의 영향을 받으며, 그 결과 클론타입 풍부도가 심하게 왜곡될 수 있고 존재하지 않는 클론타입이 기록되어 관찰된 다양성이 잘못 증가할 수 있다. 또한, 클로닝, 기능 연구 및 치료적 사용과 같은 다운스트림 적용을 위한 시퀀싱 데이터로부터 TCR 쇄의 동족(cognate) 쌍의 선별 및/또는 합성은 시간이 많이 걸릴 수 있다. 또한, TCR 쇄의 선별되고 합성된 동족 쌍의 라이브러리는 작거나 다양성이 낮다.
다양한 적용에 사용될 수 있는 자연적으로 쌍을 이룬 TCR의 고처리량 클로닝을 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 시퀀싱 및 합성을 능가할 수 있고, 숙주 세포에서 직접 발현을 위한 TCR의 동족 쌍을 코딩하는 융합된 핵산 분자를 제공할 수 있다. 조성물 및 방법은 또한 B 세포 수용체(BCR)와 같은 다른 이분 면역수용체에 적용될 수 있다.
한 측면에 따라, 복수의 융합된 T 세포 수용체(TCR) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하고, (1) 제1 핵산 서열은 제1 TCR 펩티드 쇄의 제1 가변 도메인을 코딩하고, 여기서 제1 가변 도메인은 CDR2 및 CDR3을 포함하고, (2) 제2 핵산 서열은 제2 TCR 펩티드 쇄의 제2 가변 도메인을 포함하고, 제2 가변 도메인 서열은 CDR2 및 CDR3을 포함하고; 각각의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드의 제1 및 제2 핵산 서열은 면역 세포로부터의 제1 및 제2 TCR 펩티드 쇄의 동종 쌍을 코딩하고; 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 50개의 상이한 동족 쌍을 코딩하고; 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 5, 10, 또는 20개의 상이한 V 유전자의 V 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 TCR 펩티드 쇄는 T 세포 수용체(TCR) 알파 펩티드 쇄이고, 제2 TCR 펩티드 쇄는 TCR 베타 펩티드 쇄이다. 일부 실시양태에서, 제1 TCR 펩티드 쇄는 TCR 감마 펩티드 쇄이고, 제2 TCR 펩티드 쇄는 TCR 델타 펩티드 쇄이다. 일부 실시양태에서, 제1 가변 도메인은 CDR1을 추가로 포함하고/하거나, 제2 가변 도메인은 CDR1을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 TCR 펩티드 쇄의 제1 가변 도메인은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, 및 CDR3을 포함하는 제1 전장 가변 도메인이고/이거나, 제2 TCR 펩티드 쇄의 제2 가변 도메인은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, 및 CDR3을 포함하는 제2 전장 가변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 제1 TCR 펩티드 쇄의 제1 불변 도메인 또는 이의 일부를 추가로 코딩하고/하거나 제2 핵산 서열은 제2 TCR 펩티드 쇄의 제2 불변 도메인 또는 이의 일부를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 불변 도메인은 제1 세포외 도메인이고/이거나, 제2 불변 도메인은 제2 세포외 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제1 불변 도메인은 제1 TCR 쇄의 제1 세포외 도메인, 제1 힌지 영역, 제1 막횡단 영역 및 제1 세포질 테일을 포함하고/하거나, 제2 불변 도메인은 제2 TCR 펩티드 쇄의 제2 세포외 도메인, 제2 힌지 영역, 제2 막횡단 영역 및 제2 세포질 테일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 길이가 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 또는 적어도 1500개 염기쌍이다. 일부 실시양태에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 길이가 적어도 1000, 적어도 1500, 또는 적어도 2000개 염기쌍이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 면역 세포로부터 수득되거나 방출된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 샘플로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 대상체로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에서, 림프구는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 염증 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 시험관내에서 확장된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 세포 샘플, 골수 샘플, 제대 혈액 샘플, 복수 샘플, 흉막 삼출 샘플, 뇌척수 샘플, 정액 샘플, 가래 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절, 편도, 갑상선, 췌장, 심장, 골격근, 장, 후두, 식도, 흉선, 위, 종양, 감염 부위, 또는 이들의 조합으로부터 수득되는 조직 샘플이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간, 개, 고양이, 마우스, 또는 래트이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강한 대상체 또는 병든 대상체이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 마커에 의해 샘플로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 마커는 세포 표면 마커이다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, 및 CD45RO, GITR, FoxP3, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 마커는 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 퍼포린, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시양태에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적이거나 유도성이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 테트라사이클린 반응성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 시토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 프렌드(Friend) 비장 포커스-형성 바이러스 프로모터, 헤르페스 바이러스 TK 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터; 마우스 유선 종양 바이러스 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 7.5K 프로모터, 또는 에놀라제 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 제1 가변 도메인 및 제2 가변 도메인의 발현이 하나의 프로모터의 제어 하에 있도록 인-프레임으로 융합된다. 일부 실시양태에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 부위는 세포성 프로테아제 절단 부위 또는 바이러스성 프로테아제 절단 부위이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 부위는 엔테로키나제 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, 레닌 절단 부위, 콜라게나제 절단 부위, 트립신 절단 부위, 카스파제 프로테아제 절단 부위, 푸린 절단 부위, PC5/6 프로테아제 절단 부위; PACE 프로테아제 절단 부위, LPC/PC7 프로테아제 절단 부위, 인자 Xa 프로테아제 절단 부위, 게네나제 I 절단 부위, MMP 프로테아제 절단 부위, 또는 KEX2 프로테아제 절단 부위이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 부위는 바이러스 2A 프로테아제 절단 부위, 바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 감염성 췌장 괴사증 바이러스(IPNV) VP4 프로테아제 절단 부위, 토바코 에치 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, 터닙 모자이크 포티바이러스의 핵 봉입체 단백질 a(N1a) 절단 부위이다. 일부 실시양태에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 자가 절단 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 절단 펩티드는 인테인 펩티드, 헤지혹(hedgehog) 펩티드, 또는 2A 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 20개의 상이한 V 유전자는 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 및/또는 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, TRAV 유전자 및 TRBV 유전자는 인간 또는 마우스 TRAV 유전자 및 TRBV 유전자이다.
일부 실시양태에서, 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자는 인간 TRAV1-1, TRAV1-2, TRAV2, TRAV3, TRAV4, TRAV5, TRAV6, TRAV7, TRAV8-1, TRAV8-2, TRAV8-3, TRAV8-4, TRAV8-6, TRAV9-1, TRAV9-2, TRAV10, TRAV12-1, TRAV12-2, TRAV12-3, TRAV13-1, TRAV13-2, TRAV14, TRAV16, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, TRAV21, TRAV22, TRAV23, TRAV24, TRAV25, TRAV26-1, TRAV26-2, TRAV27, TRAV29, TRAV30, TRAV34, TRAV35, TRAV36, TRAV38-1, TRAV38-2, TRAV39, TRAV40, TRAV41로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자는 인간 TRBV2, TRBV3-1, TRBV4-1, TRBV4-2, TRBV4-3, TRBV5-1, TRBV5-4, TRBV5-5, TRBV5-6, TRBV5-8, TRBV6-1, TRBV6-2, TRBV6-3, TRBV6-4, TRBV6-5, TRBV6-6, TRBV6-8, TRBV6-9, TRBV7-2, TRBV7-3, TRBV7-4, TRBV7-6, TRBV7-7, TRBV7-8, TRBV7-9, TRBV9, TRBV10-1, TRBV10-2, TRBV10-3, TRBV11-1, TRBV11-2, TRBV11-3, TRBV12-3, TRBV12-4, TRBV12-5, TRBV13, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV18, TRBV19, TRBV20-1, TRBV24-1, TRBV25-1, TRBV27, TRBV28, TRBV29-1, 및 TRBV30으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 적어도 20개의 상이한 V 유전자는 적어도 20개의 상이한 V 유전자 서브그룹을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 20개의 상이한 V 유전자 서브그룹은 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 서브그룹 및/또는 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자 서브그룹을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 서브그룹은 인간 TRAV1, TRAV2, TRAV3, TRAV4, TRAV5, TRAV6, TRAV7, TRAV8, TRAV9, TRAV10, TRAV12, TRAV13, TRAV14, TRAV16, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, TRAV21, TRAV22, TRAV23, TRAV24, TRAV25, TRAV26, TRAV27, TRAV29, TRAV30, TRAV34, TRAV35, TRAV36, TRAV38, TRAV39, TRAV40, 및 TRAV41 서브그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자 서브그룹은 인간 TRBV2, TRBV3, TRBV4, TRBV5, TRBV6, TRBV7, TRBV9, TRBV10, TRBV11, TRBV12, TRBV13, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV18, TRBV19, TRBV20, TRBV24, TRBV25, TRBV27, TRBV28, TRBV29, 및 TRBV30 서브그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자는 마우스 TRAV1, TRAV2, TRAV3-1, TRAV3-3, TRAV3-4, TRAV3D-3, TRAV3N-3, TRAV4-2, TRAV4-3, TRAV4-4, TRAV4D-2, TRAV4D-3, TRAV4D-4, TRAV4N-3, TRAV4N-4, TRAV5-1, TRAV5-2, TRAV5-4, TRAV5D-2, TRAV5D-4, TRAV5N-2, TRAV5N-4, TRAV6-1, TRAV6-2, TRAV6-3, TRAV6-4, TRAV6-5, TRAV6-6, TRAV6-7, TRAV6D-3, TRAV6D-4, TRAV6D-5, TRAV6D-6, TRAV6D-7, TRAV6N-5, TRAV6N-6, TRAV6N-7, TRAV7-1, TRAV7-2, TRAV7-3, TRAV7-4, TRAV7-5, TRAV7-6, TRAV7D-2, TRAV7D-3, TRAV7D-4, TRAV7D-5, TRAV7D-6, TRAV7N-4, TRAV7N-5, TRAV7N-6, TRAV8-1, TRAV8-2, TRAV8D-1, TRAV8D-2, TRAV8N-2, TRAV9-1, TRAV9-2, TRAV9-3, TRAV9-4, TRAV9D-1, TRAV9D-2, TRAV9D-3, TRAV9D-4, TRAV9N-2, TRAV9N-3, TRAV9N-4, TRAV10, TRAV10D, TRAV10N, TRAV11, TRAV11D, TRAV11N, TRAV12-1, TRAV12-2, TRAV12-3, TRAV12D-1, TRAV12D-2, TRAV12D-3, TRAV12N-1, TRAV12N-2, TRAV12N-3, TRAV13-1, TRAV13-2, TRAV13-3, TRAV13-4, TRAV13-5, TRAV13D-1, TRAV13D-2, TRAV13D-3, TRAV13D-4, TRAV13N-1, TRAV13N-2, TRAV13N-3, TRAV13N-4, TRAV14-1, TRAV14-2, TRAV14-3, TRAV14D-1, TRAV14D-2, TRAV14D-3, TRAV14N-1, TRAV14N-2, TRAV14N-3, TRAV15-1, TRAV15-2, TRAV15D-1, TRAV15D-2, TRAV15N-1, TRAV15N-2, TRAV16, TRAV16D, TRAV16N, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, 및 TRAV21로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자는 마우스 TRBV1, TRBV2, TRBV3, TRBV4, TRBV5, TRBV8, TRBV9, TRBV10, TRBV12-1, TRBV12-2, TRBV13-1, TRBV13-2, TRBV13-3, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV17, TRBV19, TRBV20, TRBV21, TRBV23, TRBV24, TRBV26, TRBV29, TRBV30, 및 TRBV31로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 서브그룹은 TRAV1, TRAV2, TRAV3, TRAV4, TRAV5, TRAV6, TRAV7, TRAV8, TRAV9, TRAV10, TRAV11, TRAV12, TRAV13, TRAV14, TRAV15, TRAV16, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, 및 TRAV21 서브그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자 서브그룹은 마우스 TRBV1, TRBV2, TRBV3, TRBV4, TRBV5, TRBV8, TRBV9, TRBV10, TRBV12, TRBV13, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV17, TRBV19, TRBV20, TRBV21, TRBV23, TRBV24, TRBV26, TRBV29, TRBV30, 및 TRBV31 서브그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 원형화된다. 일부 실시양태에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 상이한 서열을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 각각 면역 세포로부터의 상이한 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 복수의 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 복수의 벡터는 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 벡터는 자가 증폭 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온이다. 일부 실시양태에서, 복수의 벡터는 숙주 세포 타입 I 인터페론 생성 감소, 발현 지속시간의 연장, 단백질 생성 수준 증가, 및/또는 이분 면역수용체 외에 치료적 이익의 추가의 작용제(들) 발현을 위해 선택되거나 조작된 TC-83 알파바이러스 레플리콘의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 복수의 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 알파 바이러스, 백시나 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스 또는 이들의 슈도타입으로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 복수의 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노중합체, 나노로드, 리포좀, 미셀, 마이크로버블, 세포 투과성 펩티드, 또는 지질구이다.
또한, 각각 본원에 기재된 조성물로부터의 상이한 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 기재된 복수의 벡터로부터의 상이한 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, 복수의 TCR이 본원에 제공되며, 여기서 복수의 TCR은 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 TCR을 포함한다.
또한, 각각 본원에 기재된 조성물로부터의 상이한 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드, 본원에 기재된 복수의 벡터의 상이한 벡터, 또는 본원에 기재된 복수의 TCR의 상이한 TCR을 포함하는, 복수의 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 복수의 숙주 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 염증 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 복수의 숙주 세포는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 복수의 숙주 세포는 동종이계 세포이다. 일부 실시양태에서, 복수의 숙주 세포는 공여자 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 공여자는 인간이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 건강한 공여자 또는 병든 공여자이다. 일부 실시양태에서, 복수의 숙주 세포는 샘플로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플, 골수 샘플, 제대 혈액 샘플, 복수 샘플, 흉막 삼출 샘플, 뇌척수 샘플, 정액 샘플, 가래 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절, 편도, 갑상선, 췌장, 심장, 골격근, 장, 후두, 식도, 흉선, 위, 종양, 감염 부위, 또는 이들의 조합으로부터 수득되는 조직 샘플이다. 일부 실시양태에서, 복수의 숙주 세포는 세포주 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포주 세포는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; 저캇(Jurkat) 세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; 또는 Molt 4 세포이다. 일부 실시양태에서, 복수의 숙주 세포는 유전자 변형된 세포이다.
일부 실시양태에서, TCR 알파 펩티드 쇄, TCR 베타 펩티드 쇄, TCR 감마 펩티드 쇄, TCR 델타 펩티드 쇄, BCR 중쇄 펩티드, 또는 BCR 경쇄 펩티드를 코딩하는 내인성 유전자는 하향조절되거나 비활성화된다. 일부 실시양태에서, 추가의 내인성 유전자는 하향조절되거나 비활성화되고, 여기서 추가의 내인성 유전자는 PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 복수의 숙주 세포 각각은 숙주 세포의 기능을 향상시키기 위한 추가의 작용제를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 기능은 세포독성 기능, 전염증 기능, 또는 항염증 기능이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 전염증 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 항염증 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 종양 괴사 인자 알파(TNFα); 인터류킨(IL)-1α; IL-1β; IL-2; IL-5; IL-6; IL-8; IL-15; IL-18; 인터페론(IFN-γ); 혈소판 활성화 인자(PAF); 단핵구 화학주성 단백질 1 및 2(MCP-1, MCP-2); 대식세포 이동 억제 인자(MIF); CXCL8; CXCL9; CXCL10; 높은 이동성 그룹 박스 단백질 1(HMGB-1), IL-1ra, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 전환 성장 인자 베타(TGF-β), IL-16, 또는 이들의 임의의 조합이다.
또 다른 측면에 따라, 각각 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 갖는 융합된 T 세포 수용체(TCR) 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 복수의 벡터를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 (1) 제1 핵산 서열은 제1 TCR 펩티드 쇄의 제1 가변 도메인을 코딩하고, 여기서 제1 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, (2) 제2 핵산 서열은 제2 TCR 펩티드 쇄의 제2 가변 도메인을 코딩하고, 제2 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고; 각각의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드의 제1 및 제2 핵산 서열은 면역 세포로부터의 제1 및 제2 TCR 펩티드 쇄의 동족 쌍을 코딩하고; 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 20개의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 벡터는 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 또는 적어도 1,000,000개의 상이한 동족 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 벡터는 적어도 약 5, 10, 50 ,100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개, 또는 그 초과의 상이한 동족 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 벡터는 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 상이한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 20개의 상이한 V 유전자는 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 서브그룹 및/또는 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자 서브그룹을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 각각 제1 면역수용체 펩티드 쇄의 제1 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 분자 및 이의 제1 증폭 생성물, 제2 면역수용체 펩티드 쇄의 제2 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산 분자 및 이의 제2 증폭 생성물을 포함하는, 복수의 히드로겔 입자 또는 비드를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 제1 가변 도메인은 CDR3을 포함하고, 여기서 제2 가변 도메인은 CDR3를 포함하고, 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체를 갖는 매트릭스 내에 매립되거나 포착되고, 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물의 확산은 제한된다.
또 다른 측면에 따라, 각각 제1 면역수용체 펩티드 쇄의 제1 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 분자 및 이의 제1 프라이머 연장 생성물, 제2 면역수용체 펩티드 쇄의 제2 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산 분자 및 이의 제2 프라이머 연장 생성물을 포함하는, 복수의 히드로겔 입자 또는 비드를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 제1 가변 도메인은 CDR3을 포함하고, 제2 가변 도메인은 CDR3를 포함하고, 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 프라이머 연장 생성물은 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체를 갖는 매트릭스 내에 매립되거나 포착되고, 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 프라이머 연장 생성물의 확산은 제한된다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 사전 설계된 서열을 갖는 어댑터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 제1 또는 제2 핵산에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드의 서열 또는 역 상보 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 역전사(RT) 생성물이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 제2 가닥 합성(SSS) 생성물이다. 일부 실시양태에서, RT 생성물은 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, SSS 생성물은 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, SSS 생성물은 확산 제한제에 간접적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 제1 및 제2 증폭 생성물이다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 생성물 및/또는 제2 증폭 생성물은 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 생성물 및/또는 제2 증폭 생성물은 포획제를 통해 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 포획제는 제1 증폭 생성물 및/또는 제2 증폭 생성물의 어댑터 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 확산 제한제는 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 다당류이다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 입자이다. 일부 실시양태에서, 입자는 매트릭스의 공극 크기보다 큰 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 매트릭스이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 세포로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 세포는 단일 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD3+ T 세포, CD28+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD45RA+ T 세포, CD45RO+ T 세포, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, B 세포는 형질모세포 세포, 형질 세포, 림프형질세포양 세포, 기억 B 세포, 여포성 B 세포, 변연부 B 세포, B-1 세포, B-2 세포, 또는 조절 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 제1 면역수용체 펩티드 쇄는 TCR 알파 펩티드 쇄이고 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 TCR 베타 펩티드 쇄이다. 일부 실시양태에서, 제1 면역수용체 펩티드 쇄는 TCR 감마 펩티드 쇄이고 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 TCR 델타 펩티드 쇄이다. 일부 실시양태에서, 제1 면역수용체 펩티드 쇄는 면역글로불린 중쇄 펩티드이고 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 면역글로불린 경쇄 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 제1 면역수용체 펩티드 쇄 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 이분 면역수용체의 동족 쌍이다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 연결되어 연속 폴리뉴클레오티드 가닥을 형성한다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 생성물 및/또는 제2 증폭 생성물은 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 10000개, 또는 그 초과의 카피의 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 핵산은 확산 제한된다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자는 단일 가닥 핵산 또는 이중 가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 분자는 제1 불변 도메인을 추가로 코딩하고/하거나 제2 핵산 분자는 제2 불변 도메인을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 불변 도메인은 제1 세포외 불변 도메인이고/이거나 제2 불변 도메인은 제2 세포외 불변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제1 불변 도메인은 제1 세포외 불변 도메인, 제1 힌지 영역, 제1 막횡단 도메인, 및 제1 세포질 테일을 포함하고/하거나, 제2 불변 도메인은 제2 세포외 불변 도메인, 제2 힌지 영역, 제2 막횡단 도메인, 및 제2 세포질 테일을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 히드로겔 입자 또는 비드는 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 히드로겔 입자 또는 비드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 히드로겔 입자 또는 비드는 이분 면역수용체의 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 상이한 동족 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 다당류, 폴리아크릴아미드, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 다당류는 아가로스, 히알루론산, 카르복시메틸셀룰로스, 키토산, 전분, 덱스트란, 또는 알기네이트이다. 일부 실시양태에서, 단량체는 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드 단량체이다. 일부 실시양태에서, 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체는 아가로스와 폴리아크릴아미드의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체는 가교결합된다. 일부 실시양태에서, 제1 가변 도메인 및/또는 제2 가변 도메인은 CDR1, CDR2, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 히드로겔 입자 또는 비드는 아가로스 겔 입자이다.
또 다른 측면에 따라, 복수의 적어도 5개의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 적어도 5개의 히드로겔 입자는 (a) 제1 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (b) 제2 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 고유한 동족 면역수용체의 쌍을 이룬 쇄를 포함하고, 적어도 5개의 히드로겔 입자의 개별 히드로겔 입자의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 단일 세포로부터의 것이고, (ii) 서로 연결되고; 히드로겔 입자로부터의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 확산은 제한된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 실시양태에서, DNA는 증폭 생성물이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 공유적으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 확산 제한제에 연결된다.
또 다른 측면에 따라, 복수의 적어도 5개의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 각각의 적어도 5개의 히드로겔 입자는 (a) 제1 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 RNA 및 (b) 제2 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 RNA를 포함하고, 각각의 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 고유한 동족 면역수용체의 쌍을 이룬 쇄를 포함하고, 적어도 5개의 히드로겔 입자의 개별 히드로겔 입자의 제1 RNA 및 제2 RNA 각각은 단일 세포로부터의 것이고, (1) 각각의 제1 RNA는 제1 RNA의 역 상보 서열을 포함하는 제1 cDNA에 하이브리화되고 (2) 각각의 제2 RNA는 제2 RNA의 역 상보 서열을 포함하는 제2 cDNA에 하이브리화되고; 히드로겔 입자로부터의 제1 cDNA 및 제2 cDNA의 확산은 제한된다. 일부 실시양태에서, 제1 cDNA 또는 제2 cDNA는 제1 RNA 또는 제2 RNA에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않은 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 cDNA 또는 제2 cDNA는 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드의 역 상보 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 cDNA 또는 제2 cDNA는 확산 제한제에 연결된다.
또 다른 측면에 따라, 복수의 적어도 5개의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 적어도 5개의 히드로겔 입자는 (a) 제1 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (b) 제2 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 고유한 동족 면역수용체 쌍을 이룬 쇄를 포함하고, 적어도 5개의 히드로겔 입자의 개별 히드로겔 입자의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 각각은 단일 세포로부터의 것이고, (1) 각각의 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 프라이머에 하이브리드화되고 2) 각각의 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 프라이머에 하이브리드화되고; 히드로겔 입자로부터의 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 확산은 제한된다.
일부 실시양태에서, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 역전사 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 증폭 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 확산 제한제에 연결된다.
또 다른 측면에 따라, 복수의 적어도 5개의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 적어도 5개의 히드로겔 입자는 (a) 제1 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 DNA 및 (b) 제2 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 DNA를 포함하고, 각각의 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 고유한 동족 면역수용체의 쌍을 이룬 쇄를 포함하고, 적어도 5개의 히드로겔 입자의 개별 히드로겔 입자의 제1 DNA 및 제2 DNA 각각은 단일 세포로부터의 것이고, (1) 각각의 제1 DNA는 제1 면역수용체 쇄를 코딩하는 서열의 역 상보 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드에 하이브리화되고 (2) 각각의 제2 DNA는 제2 면역수용체 쇄를 코딩하는 서열의 역 상보 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드에 하이브리화되고; 히드로겔 입자로부터의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 확산은 제한된다.
일부 실시양태에서, 제1 DNA 또는 제2 DNA는 cDNA이다. 일부 실시양태에서, 제1 DNA 또는 제2 DNA는 게놈 DNA이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 메신저 RNA이다. 일부 실시양태에서, 히드로겔로부터의 제1 DNA 또는 제2 DNA의 확산은 제한된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 증폭 생성물이다. 일부 실시양태에서, 증폭 생성물은 제1 또는 제2 DNA에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않는 어댑터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 포획제에 추가로 하이브리드화한다. 일부 실시양태에서, 포획제는 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 중합체 또는 입자이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 TCR 알파 및 TCR 베타 펩티드 쇄, TCR 감마 및 TCR 델타 펩티드 쇄, 또는 BCR 중쇄 및 경쇄 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 단일 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포이다.
또 다른 측면에 따라, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 각각 (1) 세포 및 (2) 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 포함하는, 복수의 용기(vessel)를 생성하는 단계로서, 여기서 세포는 이분 면역수용체의 제1 펩티드 쇄를 코딩하는 제1 핵산 및 이분 면역수용체의 제2 펩티드 쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 단계; 및 (b) 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 중합하거나 겔화하여, 각각 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체로 구성된 매트릭스를 갖는, 복수의 경화된 입자를 형성하는 단계로서, 복수의 경화된 입자 각각은 제1 핵산의 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 핵산의 제2 프라이머 연장 생성물을 포함하고; 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 프라이머 연장 생성물은 매트릭스 내에 매립되거나 포착되고, 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 프라이머 연장 생성물의 확산이 제한되는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 역전사(RT) 생성물, 제2 가닥 합성(SSS) 생성물, 또는 증폭 생성물이다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 프라이머 연장 생성물은 어댑터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 어댑터 서열은 제1 또는 제2 핵산 분자에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 가변 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 가변 도메인은 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 프라이머 연장 생성물은 불변 도메인을 추가로 코딩한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포를 용해시켜 제1 핵산 및 제2 핵산을 방출시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 핵산 및 제2 핵산을 역전사시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 역전사는 RT 프라이머를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, RT 프라이머는 확산 제한제에 연결되고, 여기서 확산 제한제는 매트릭스 내에서 RT 프라이머의 확산을 제한한다. 일부 실시양태에서, 방법은 템플릿 스위치 반응 또는 SSS 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 핵산 및 제2 핵산을 증폭시켜 제1 및 제2 증폭 생성물을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 제1 또는 제2 핵산에 대해, 증폭은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 프라이머는 확산 제한제에 연결되고, 여기서 확산 제한제는 매트릭스 내에서 제1 증폭 프라이머의 확산을 제한한다.
일부 실시양태에서, 방법은 복수의 경화된 입자를 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 경화된 입자를 세척하여 시약이 복수의 경화된 입자로부터 확산되게 하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 RT 프라이머, 증폭 프라이머, 템플릿 스위치 프라이머, SSS 프라이머, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 경화된 입자를 반복적으로 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세척 단계 후 복수의 경화된 입자를 오일에 유화시킴으로써, 각각 복수의 경화된 입자의 단일 경화된 입자를 포함하는, 추가의 복수의 용기를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 다당류이다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 입자이다. 일부 실시양태에서, 입자는 매트릭스의 공극 크기보다 큰 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 매트릭스이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 포획제를 통해 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 포획제는 고정화 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고정화 모이어티는 포획제를 확산 제한제에 연결한다.
일부 실시양태에서, 고정화 모이어티는 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포획제는 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 포획 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 프라이머는 포획 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 증폭 생성물은 포획 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함함으로써 제1 및 제2 증폭 생성물을 포획제에 연결하고 이로써 확산 제한제에 연결한다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 숙신이미딜 에스테르, 아미드, 아크릴아미드, 아크릴 아지드, 아실 할라이드, 아실 니트릴, 알데히드, 케톤, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 무수물, 아릴 할라이드, 아지리딘, 보로네이트, 카르보디이미드, 디아조알칸, 에폭사이드, 할로아세트아미드, 할로플라티네이트, 할로트리아진, 이미도 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 포스포르아미다이트, 실릴 할라이드, 술포네이트 에스테르, 술포닐 할라이드, 아민, 아닐린, 티올, 알콜, 페놀, 히드라진, 히드록실아민, 카르복실산, 글리콜, 또는 헤테로사이클이다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물을 연결하여 추가의 복수의 용기의 각각의 용기 내에 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 형성함으로써 복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 갖는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 리게이션 또는 PCR에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 연속 폴리뉴클레오티드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 인-프레임으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 방법은 추가의 복수의 용기로부터 복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 방출시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 각각을 원형화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 각각을 벡터에 삽입시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 자가 증폭 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 알파 바이러스, 백시나 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스 또는 이들의 슈도타입으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노중합체, 나노로드, 리포좀, 미셀, 마이크로버블, 세포 투과성 펩티드, 또는 지질구이다. 일부 실시양태에서, 이분 면역수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 B 세포 수용체(BCR)이다. 일부 실시양태에서, TCR은 TCR 알파 펩티드 쇄 및 TCR 베타 펩티드 쇄, 또는 TCR 감마 펩티드 쇄 및 TCR 델타 펩티드 쇄를 포함하고; BCR은 중쇄 펩티드 및 경쇄 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에서, 림프구는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 염증 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, B 세포는 형질모세포 세포, 형질 세포, 림프형질세포양 세포, 기억 B 세포, 여포성 B 세포, 변연부 B 세포, B-1 세포, B-2 세포, 또는 조절 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 종양 조직 또는 혈액 샘플로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 방법은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 상이한 융합된 이분 면역수용체 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드 쇄 및 제2 펩티드 쇄는 이분 면역수용체의 동족 쌍이다. 일부 실시양태에서, 용기는 액적(droplet)이다. 일부 실시양태에서, 액적은 유중수 액적이다. 일부 실시양태에서, 경화된 입자는 히드로겔 입자이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 다당류, 폴리아크릴아미드, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 다당류는 아가로스, 히알루론산, 카르복시메틸셀룰로스, 키토산, 또는 알기네이트이다. 일부 실시양태에서, 단량체는 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드 단량체이다. 일부 실시양태에서, 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체는 아가로스와 폴리아크릴아미드의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체는 가교결합된다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체의 중합 또는 겔화는 개시제를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시제는 UV 광 또는 화학물질이다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체의 중합 또는 겔화는 용기의 온도를 낮추는 것을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, (a) 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장하여 제1 연장 생성물을 형성하는 단계; (b) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 증폭시켜 제1 증폭 생성물을 형성하는 단계; (c) 중합체 매트릭스를 액체에서 생성하여 히드로겔 입자를 형성함으로써 제1 증폭 생성물의 확산을 제한하는 단계; 및 (d) 히드로겔 입자를 세척하여 히드로겔 입자로부터 제2 프라이머를 고갈시키는 단계를 포함하는, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머 또는 제1 증폭 생성물은 확산 제한제에 연결된다.
또 다른 측면에 따라, (a) 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하는 단계; (b) 중합체 매트릭스를 액체에서 생성하여 히드로겔 입자를 생성함으로써 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥의 확산을 제한하는 단계; (c) 히드로겔 입자를 세척하는 단계; 및 (d) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 증폭시켜 제1 증폭 생성물을 형성하는 단계를 포함하는, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제1 연장 생성물은 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 방법은 추가의 핵산 분자에 하이브리드화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자 및 추가의 핵산 분자는 면역수용체의 제1 펩티드 쇄 및 제2 펩티드 쇄를 코딩하고, 여기서 제1 펩티드 쇄 및 제2 펩티드 쇄는 면역수용체의 동족 쌍이다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 중합체 또는 입자이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 다당류이다. 일부 실시양태에서, 입자는 중합체 매트릭스의 공극 크기보다 큰 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 중합체 매트릭스이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 게놈 DNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 메신저 RNA이다. 일부 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 역전사(RT) 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 방법은 RT 프라이머를 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드로 연장시켜 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드의 역 상보 서열을 갖는 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 어댑터 서열을 갖는 제2 가닥 합성(SSS) 프라이머를 사용하여 제1 연장 생성물의 역 상보 가닥을 합성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 어댑터 서열은 핵산 분자 또는 제1 연장 생성물에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않다. 일부 실시양태에서, 제1 연장 생성물은 어댑터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 면역수용체의 펩티드 쇄를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 방법은 히드로겔 입자를 세척하는 단계 이후 또는 동안에 시약이 히드로겔 입자로 확산되도록 시약을 히드로겔 입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 올리고뉴클레오티드 또는 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소는 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 방법은 세척 후 히드로겔 입자를 오일 중에 유화시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에 따라, (a) 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 액적의 적어도 2개의 액적은 단일 세포를 포함하는 단계; (b) 단일 세포로부터 제1 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하고; 단일 세포로부터 제2 핵산 분자에 하이브리드화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제2 연장 생성물을 형성하는 단계; (c) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트로 증폭시켜 제1 증폭 생성물 세트를 형성하고; 제2 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트로 증폭시켜 제2 증폭 생성물 세트를 형성하는 단계; 및 (d) 제1 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물을 제2 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물에 연결하는 단계로서, 여기서 연결은 제2 및 제4 프라이머의 부재 하에 액체에서 연결하는 것을 포함하는 단계를 포함하는, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에 따라, (a) 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 액적의 적어도 2개의 액적은 단일 세포를 포함하는 단계; (b) 단일 세포로부터 제1 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하고; 단일 세포로부터 제2 핵산 분자에 하이브리드화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제2 연장 생성물을 형성하는 단계; (c) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트로 증폭시켜 제1 증폭 생성물 세트를 형성하고; 제2 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트로 증폭시켜 제2 증폭 생성물 세트를 형성하는 단계; (d) 제2 및 제4 프라이머를 제거하고; 제1 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물을 제2 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물에 연결하는 단계를 포함하는, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 각각의 액적은 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 중합체 매트릭스를 액체에서 생성하여 히드로겔을 형성하여 제1 증폭 생성물 세트 및 제2 증폭 생성물 세트의 확산을 제한하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 히드로겔 입자를 세척하여 히드로겔 입자로부터 제2 프라이머 및 제4 프라이머를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물 상에 점착 말단을 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 생성물 상에서 점착 말단의 생성은 USER 효소를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물을 하이브리드화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물을 리게이션하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머 및 제3 프라이머는 동일한 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머, 제3 프라이머, 제1 증폭 생성물 세트, 또는 제2 증폭 생성물 세트는 확산 제한제에 연결된다.
또 다른 측면에 따라, (a) 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 액적의 적어도 2개의 액적은 단일 세포를 포함하는 단계; (b) 단일 세포로부터 제1 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하고; 단일 세포로부터 제2 핵산 분자에 하이브리드화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제2 연장 생성물을 형성하는 단계; (c) 중합체 매트릭스를 액체에서 생성하여 히드로겔 입자를 형성함으로써 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물의 확산이 제한되는 단계; (d) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트로 증폭시켜 제1 증폭 생성물 세트를 형성하고; 제2 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트로 증폭시켜 제2 증폭 생성물 세트를 형성하는 단계; 및 (e) 제1 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물을 제2 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물에 연결하는 단계를 포함하는, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 방법은 (c) 후에 히드로겔 입자를 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 시약이 히드로겔 입자로 확산하도록 시약을 히드로겔 입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 효소 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 프라이머 세트 및/또는 제2 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소는 폴리머라제, 리가제, USER 효소, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 방법은 세척 후 히드로겔 입자를 오일에 유화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 확산 제한제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 RT 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 방법은 제2 가닥 합성(SSS) 프라이머를 사용하여 제1 및/또는 제2 연장 생성물의 역 상보 가닥을 합성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, SSS 프라이머는 어댑터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 어댑터 서열은 제1 및/또는 제2 연장 생성물에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않다. 일부 실시양태에서, 방법은 RT 프라이머를 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드로 연장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 일부 실시양태에서, DNA는 게놈 DNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 메신저 RNA이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 분자는 면역수용체의 제1 펩티드를 코딩하고 제2 핵산 분자는 면역수용체의 제2 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드 쇄 및 제2 펩티드 쇄는 면역수용체의 동족 쌍이다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드 쇄 또는 제2 펩티드 쇄는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가변 도메인은 CDR1, CDR2, CDR3, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드 쇄 또는 제2 펩티드 쇄는 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드 쇄 또는 제2 펩티드 쇄는 막횡단 영역 및/또는 세포질 테일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역수용체는 B 세포 수용체이다. 일부 실시양태에서, 면역수용체는 T 세포 수용체이다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 중합체 또는 입자이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리아크릴아미드, 다당류, 또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 입자는 히드로겔 입자의 공극 크기보다 큰 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 확산 제한제는 중합체 매트릭스이다. 일부 실시양태에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물 상에 점착 말단을 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 생성물 상의 점착 말단의 생성은 USER 효소를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물을 하이브리드화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물을 리게이션하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, (a) 집단 내의 각각의 숙주 세포가 자연적으로 쌍을 이룬 TCR 알파 및 베타 펩티드 쇄를 갖는 TCR 또는 자연적으로 쌍을 이룬 BCR 중쇄 및 경쇄 펩티드를 갖는 BCR을 발현하는, 숙주 세포 집단을 수득하고; (i) 집단으로부터 숙주 세포의 서브집단, 또는 (ii) 집단으로부터 숙주 세포의 서브집단의 발현된 TCR 또는 BCR을 농축시키는 단계로서, 여기서 숙주 세포의 서브집단 또는 숙주 세포의 서브집단의 발현된 TCR 또는 BCR은 표적 항원 또는 표적 MHC-항원 복합체에 결합하는 단계; 및 (b) 단계 (b)로부터 농축된 숙주 세포의 서브집단 또는 서브집단의 발현된 TCR 또는 BCR을 표적 항원 또는 표적 MHC-항원 복합체를 발현하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 수득은 본원에 기재된 임의의 방법을 이용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, (b)는 숙주 세포 집단 또는 발현된 TCR 또는 BCR을 표적 항원 또는 표적 MHC-항원 복합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC는 MHC 사량체이다. 일부 실시양태에서, (c)는 주사에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 주사는 정맥내, 피하, 피내, 또는 근육내 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 신생항원 또는 종양 관련된 항원이다.
또 다른 측면에 따라, (1) 복수의 적어도 1,000개 세포를 제공하는 단계로서, 적어도 1,000개 세포의 각각의 세포는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 단계; (2) 복수의 적어도 1,000개의 구획을 제공하는 단계로서, 적어도 1,000개의 구획의 각각의 구획은 고체 지지체를 포함하고, 여기서 고체 지지체는 (a) 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제1 공통 서열과 제2 공통 서열 사이의 TCR 알파 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, (b) 제3 공통 서열, 제4 공통 서열, 및 제3 공통 서열과 제4 공통 서열 사이의 TCR 베타 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 구획의 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 적어도 하나의 복수의 세포에 존재하는 동족 쌍이어서 각각 TCR 알파 쇄를 코딩하는 제1의 복수의 단백질 코딩 서열 및 각각 TCR 베타 쇄를 코딩하는 제2의 복수의 단백질 코딩 서열을 제공하는 단계; 및 (3) 각각의 구획의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 물리적으로 연결하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1의 복수의 단백질 코딩 서열은 적어도 10개의 TRAV 서브그룹을 포함하고 제2의 복수의 단백질 코딩 서열은 적어도 10개의 TRBV 서브그룹을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1,000개의 구획의 각각의 구획은 복수의 적어도 1,000개의 세포로부터의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구획은 웰, 마이크로웰, 또는 액적이다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 비드, 히드로겔 입자, 또는 웰 또는 마이크로웰의 표면이다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 제3 공통 서열, 또는 제4 공통 서열은 복수의 적어도 1,000개의 구획에서 동일하다.
또 다른 측면에 따라, 적어도 1,000개의 구획의 각각의 구획이 고체 지지체를 포함하는, 복수의 적어도 1,000개의 구획을 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 고체 지지체는 (a) 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제1 공통 서열과 제2 공통 서열 사이의 TCR 알파 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 제3 공통 서열, 4 공통 서열, 및 제3 공통 서열과 제4 공통 서열 사이의 TCR 베타 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (i) 각각의 구획의 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 동족 쌍이고, (ii) 복수의 구획의 복수의 제1 공통 서열은 동일한 서열을 갖고 제1 프라이머에 하이브리드화 가능하거나 상보적이고, (iii) 복수의 구획의 복수의 제2 공통 서열은 동일한 서열을 갖고 제2 프라이머에 하이브리드화 가능하거나 상보적이고, (iv) 복수의 구획의 복수의 제3공통 서열은 동일한 서열을 갖고 제3 프라이머에 하이브리드화 가능하거나 상보적이고, (v) 복수의 구획의 복수의 제4 공통 서열은 동일한 서열을 갖고 제4 프라이머에 하이브리드화 가능하거나 상보적이다.
일부 실시양태에서, 각각의 구획은 제1 프라이머, 제2 프라이머, 제3 프라이머, 및 제4 프라이머를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머의 농도는 적어도 1 nM이고, 제2 프라이머의 농도는 적어도 1 nM이고, 제3 프라이머의 농도는 적어도 1 nM이고, 제4 프라이머의 농도는 적어도 1 nM이다. 일부 실시양태에서, 제2 공통 서열은 각각의 구획에서 제4 공통 서열 또는 이의 역 상보 서열에 하이브리드화 가능하거나 상보적이다.
또 다른 측면에 따라, 복수의 적어도 1,000개의 구획을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고, 적어도 1,000개의 구획의 각각의 구획은 (a) 5' 말단에 제1 공통 서열, 3' 말단에 제2 공통 서열, 및 제1 공통 서열과 제2 공통 서열 사이의 TCR 알파 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는, 제1의 완전 또는 부분 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 5' 말단에 제3 공통 서열, 3' 말단에 제4 공통 서열, 및 제3 공통 서열과 제4 공통 서열 사이의 TCR 베타 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는, 제2의 완전 또는 부분 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 i) TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 동족 쌍이고, (ii) 제2 공통 서열은 제4 공통 서열에 하이브리드화된다. 일부 실시양태에서, 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 제3 공통 서열, 또는 제4 공통 서열은 복수의 적어도 1,000개의 구획에서 동일하다. 일부 실시양태에서, 각각의 구획은 고체 지지체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 비드 또는 히드로겔 입자이다.
또 다른 측면에 따라, 표적 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 방법이 본원에 제공되고, 방법은 (a) 복수의 TCR을 발현하는 복수의 T 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 복수의 T 세포의 각각의 T 세포는 복수의 TCR의 TCR의 동족 쌍을 발현하는 단계; (b) 복수의 T 세포를 복수의 구획으로 분할하는 단계로서, 여기서 각각의 구획은 복수의 T 세포의 개별 T 세포를 포함하는 단계; (c) 각각의 구획 내에서, 개별 T 세포의 TCR의 동족 쌍의 제1 TCR 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 TCR 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 연결하여 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계로서, 여기서 (i) 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 개별 T 세포의 내인성 핵산의 전사되거나 증폭된 생성물이거나 (ii) 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 포스포르아미다이트를 사용하여 화학적으로 합성되지 않는 단계; (d) 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 벡터를 생성하는 단계로서, 복수의 벡터의 각각의 벡터는 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; (e) 복수의 벡터를 복수의 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 세포의 각각의 세포는 복수의 벡터 중 적어도 하나의 벡터를 포함하는 단계; (f) 복수의 세포에서 복수의 벡터로부터 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단계로서, 여기서 복수의 세포의 서브세트는 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 단계; (g) 복수의 세포를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 복수의 세포의 서브세트는 하나 이상의 항원에 결합하는 단계; 및 (h) 복수의 세포의 서브세트의 복수의 표적 반응성 TCR의 표적 반응성 TCR을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 표적 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 복수의 TCR을 발현하는 복수의 T 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 복수의 T 세포의 각각의 T 세포는 복수의 TCR의 TCR의 동족 쌍을 발현하는 단계; (b) 복수의 T 세포를 복수의 구획으로 분할하는 단계로서, 여기서 각각의 구획은 복수의 T 세포의 개별 T 세포를 포함하는 단계; (c) 각각의 구획 내에서, 개별 T 세포의 TCR의 동족 쌍의 제1 TCR 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 TCR 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 연결하여 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계로서, 여기서 (i) 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 개별 T 세포의 내인성 핵산의 전사되거나 증폭된 생성물이거나 ii) 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 포스포르아미다이트를 사용하여 화학적으로 합성되지 않는 단계; (d) 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 복수의 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 세포의 각각의 세포는 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; e) 복수의 세포에서 복수의 벡터로부터 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단계로서, 여기서 복수의 세포의 서브세트는 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 단계; (f) 복수의 세포를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 복수의 세포의 서브세트는 하나 이상의 항원에 결합하는 단계; 및 (g) 복수의 세포의 서브세트의 복수의 표적 반응성 TCR의 표적 반응성 TCR을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, 방법은, 전달 전에, 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 벡터를 생성하는 단계로서, 복수의 벡터의 각각의 벡터는 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 복수의 수용자 세포이다. 일부 경우에서, 내인성 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)이다. 일부 경우에서, DNA는 게놈 DNA이다. 일부 경우에서, RNA는 메신저 RNA이다. 일부 경우에서, 접촉은 세포 집단을 하나 이상의 표적 항원을 제시하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 세포는 하나 이상의 종양 세포, 종양구, 종양 용해물 펄싱된 항원 제시 세포(APC) 또는 하나 이상의 표적 항원을 제시하도록 조작된 APC이다. 일부 경우에서, 하나 이상의 표적 항원을 제시하도록 조작된 하나 이상의 APC는 표적 항원 코딩 DNA 또는 RNA와 함께 전달(예컨대, 형질감염 또는 전기천공)된다. 일부 경우에서, 접촉은 세포 집단을 종양 조직과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 표적 항원은 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체를 형성한다. 일부 경우에서, MHC는 MHC 사량체이다. 일부 경우에서, 제1 TCR 쇄는 TCR 알파 쇄이고 제2 TCR 쇄는 TCR 베타 쇄이다. 일부 경우에서, 제1 TCR 쇄는 TCR 감마 쇄이고 제2 TCR 쇄는 TCR 델타 쇄이다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 세포주 세포이다. 일부 경우에서, 세포주 세포는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; 저캇 세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; 또는 Molt 4 세포이다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 단리된다. 일부 경우에서, 복수의 T 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 단리된다. 일부 경우에서, 샘플은 종양 조직, 혈액 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에서, 종양 조직은 최대 약 2000 mm3이다. 일부 경우에서, 혈액 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 T 세포는 종양 침윤 T 세포 또는 말초 T 세포이다. 일부 경우에서, 복수의 T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 탈진된(exhausted) T 세포, 조절 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 복수의 세포의 서브세트의 적어도 하나의 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 세포의 서브세트의 적어도 하나의 세포는 FACS에 의해 단리된다. 일부 경우에서, 복수의 세포의 서브세트의 적어도 하나의 세포는 마커를 기반으로 하여 단리한다. 일부 경우에서, 마커는 세포 표면 마커 또는 시토카인이다. 일부 경우에서, 세포 표면 마커는 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, FoxP3, 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에서, 시토카인은 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 퍼포린, 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에서, 방법은 (i) 복수의 세포의 서브세트의 적어도 하나의 세포를 대상체에게 투여하거나 (ii) 확인된 표적 반응성 TCR을 포함하는 자가 또는 동종이계 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 자가 또는 동종이계 세포는 확인된 표적 반응성 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, 확인된 표적 반응성 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 융합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 증폭 생성물이거나, 융합된 폴리뉴클레오티드의 제1 TCR 쇄 및 제2 TCR 쇄를 코딩하는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 복수의 표적 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 복수의 TCR을 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계로서, 복수의 세포의 각각의 세포는 복수의 TCR의 TCR을 발현하고, 여기서 복수의 TCR은 적어도 50개의 상이한 동족 쌍을 포함하고 복수의 V 유전자로부터의 V 영역을 포함하고, 복수의 TCR은 복수의 세포에 대해 외인성인 단계; (b) 복수의 세포를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 복수의 세포의 서브세트는 하나 이상의 표적 항원에 결합하는 단계; 및 (c) 복수의 세포의 서브세트의 적어도 2개의 세포를 확인하는 단계로서, 여기서 적어도 2개의 세포는 복수의 표적 반응성 TCR 중 적어도 2개의 표적 반응성 TCR을 발현하여 복수의 표적 반응성 TCR 중 적어도 2개의 표적 반응성 TCR을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, 복수의 V 유전자는 적어도 10개의 상이한 V 유전자를 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 복수의 유전자 조작된 세포이다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 환자로부터 단리되지 않는다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 단리된다. 일부 경우에서, 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, PBMC 샘플, 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 탈진된 T 세포를 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 복수의 TCR은 적어도 100개의 상이한 동족 쌍을 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 복수의 세포의 세브세트의 적어도 2개의 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, (b)는 복수의 세포를 하나 이상의 표적 항원을 제시하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 세포는 하나 이상의 종양 세포, 종양구, 종양 용해물 펄싱된 항원 제시 세포(APC) 또는 하나 이상의 표적 항원을 제시하도록 조작된 APC이다. 일부 경우에서, 하나 이상의 표적 항원을 제시하도록 조작된 하나 이상의 APC는 표적 항원 코딩 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 경우에서, (b)는 복수의 세포를 종양 조직과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (b)는 복수의 세포를 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체를 형성한 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, MHC는 MHC 사량체이다. 일부 경우에서, 하나 이상의 표적 항원의 서열 또는 아이덴티티(identity)는 알려져 있지 않다. 일부 경우에서, 방법은 복수의 세포의 세브세트의 적어도 2개의 세포 중 적어도 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 세포의 각각의 세포는 세포의 TCR이 하나 이상의 표적 항원의 표적 항원에 결합할 때 신호를 보내도록 조절되는 리포터 유전자를 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 세포주 세포이다. 일부 경우에서, 복수의 TCR은 적어도 100개의 상이한 VJ 조합을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 복수의 TCR을 발현하는 복수의 T 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 복수의 T 세포의 각각의 T 세포는 복수의 TCR의 TCR의 동족 쌍을 발현하는 단계; (b) 복수의 T 세포를 복수의 구획으로 분할하는 단계로서, 여기서 각각의 구획은 복수의 T 세포의 개별 T 세포를 포함하는 단계; (c) 각각의 구획 내에서, 개별 T 세포의 TCR의 동족 쌍의 제1 TCR 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 TCR 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 연결하여 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계로서, 여기서 (i) 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 개별 T 세포의 내인성 핵산의 전사되거나 증폭된 생성물이거나 (ii) 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 포스포르아미다이트를 사용하여 화학적으로 합성되지 않는 단계; (d) 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 복수의 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 세포의 각각의 세포는 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; (e) 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 복수의 세포에서 발현하는 단계로서, 여기서 복수의 세포의 서브세트는 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드의 서브세트로부터 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 단계; (f) 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드의 서브세트로부터 복수의 표적 반응성 TCR을 확인하는 단계; (g) 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드의 서브세트의 하나 이상의 융합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 복수의 수용자 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 수용자 세포의 각각의 세포는 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드의 서브세트의 하나 이상의 융합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 유도체 중 적어도 하나를 포함하는 단계; 및 (h) (i) 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나의 수용자 세포를 대상체에게 투여하거나 (ii) 복수의 수용자 세포 중 적어도 2개의 수용자 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 적어도 2개의 수용자 세포는 상이한 TCR을 발현하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, 복수의 T 세포는 종양 침윤 T 세포 또는 말초 T 세포이다. 일부 경우에서, 복수의 T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 탈진된 T 세포, 조절 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 T 세포는 시험관내에서 활성화되고/되거나 확장된다. 일부 경우에서, 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드는 복수의 벡터에 전달되고, 여기서 복수의 벡터의 각각의 벡터는 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, 방법은, (d)에서 전달 전에, 복수의 벡터를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, (f)에서 확인은 복수의 세포를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 복수의 세포의 서브세트는 하나 이상의 항원에 결합한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 표적 항원은 하나 이상의 종양 세포 또는 항원 제시 세포(APC)에 의해 제시된다. 일부 경우에서, 하나 이상의 APC는 (i) 하나 이상의 표적 항원에 의해 펄싱되거나 (ii) 표적 항원 코딩 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 항원의 각각의 항원은 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체를 형성한다. 일부 경우에서, MHC는 MHC 사량체이다. 일부 경우에서, 방법은, (g)에서 전달 전에, 복수의 세포의 서브세트의 하나 이상의 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 대상체로부터 복수의 TCR을 발현하는 복수의 T 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 투여는 복수의 T 세포를 단리한 후 최대 약 60일, 50일, 40일, 30일, 20일 또는 그 미만에 수행된다. 일부 경우에서, 복수의 수용자 세포는 동종이계 세포, 자가 세포, 또는 세포주 세포이다. 일부 경우에서, 복수의 세포는 유전자 조작된 세포 또는 세포주 세포이다. 일부 경우에서, 방법은, (h) 전에, 복수의 수용자 세포를 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 유도체는 하나 이상의 융합된 폴리뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 유도체는 하나 이상의 융합된 폴리뉴클레오티드의 증폭된 생성물 또는 합성된 생성물이다.
또 다른 측면에 따라, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 복수의 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 대상체로부터 복수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 여기서 복수의 T 세포의 각각의 T 세포는 복수의 TCR의 TCR의 동족 쌍을 발현하고, 여기서 복수의 TCR은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함하는 단계; (b) 복수의 TCR로부터 복수의 종양 반응성 TCR을 확인하는 단계; (c) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 복수의 수용자 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 수용자 세포의 각각의 수용자 세포는 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; (d) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 복수의 수용자 세포에서 발현하는 단계; 및 (e) (i) 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나의 수용자 세포를 대상체에게 투여하거나 (ii) 복수의 수용자 세포 중 적어도 2개의 수용자 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 적어도 2개의 수용자 세포는 상이한 TCR을 발현하고, 여기서 투여는 (a)에서 복수의 T 세포 단리 후 최대 약 60일, 50일, 40일, 30일, 20일 또는 그 미만에 수행되는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, a) 복수의 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 대상체로부터 복수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 여기서 복수의 T 세포의 각각의 T 세포는 복수의 TCR의 TCR의 동족 쌍을 발현하고, 여기서 복수의 TCR은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함하는 단계; b) 복수의 TCR로부터 복수의 종양 반응성 TCR을 확인하는 단계; (c) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 복수의 수용자 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 수용자 세포의 각각의 수용자 세포는 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; (d) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 복수의 수용자 세포에서 발현하는 단계; 및 (e) (i) 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나의 수용자 세포를 대상체에게 투여하거나 (ii) 복수의 수용자 세포 중 적어도 2개의 수용자 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 적어도 2개의 수용자 세포는 상이한 TCR을 발현하고, 여기서 대상체의 종양은 대상체로부터 복수의 T 세포를 단리하는 것으로부터 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나 또는 적어도 2개의 수용자 세포를 대상체에게 투여하는 것까지 약 60일, 50일, 40일, 30일, 20일 또는 그 미만의 초과 동안 진행되지 않는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 복수의 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 대상체로부터 복수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 여기서 복수의 T 세포의 각각의 T 세포는 복수의 TCR의 TCR의 동족 쌍을 발현하고, 복수의 TCR은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함하는 단계; (b) 복수의 TCR로부터 복수의 종양 반응성 TCR을 확인하는 단계; (c) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 복수의 수용자 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 수용자 세포의 각각의 수용자 세포는 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; (d) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 복수의 수용자 세포에서 발현하는 단계; 및 (e) (i) 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나의 수용자 세포를 대상체에게 투여하거나 (ii) 복수의 수용자 세포 중 적어도 2개의 수용자 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 적어도 2개의 수용자 세포는 상이한 TCR을 발현하고, 복수의 T 세포를 단리하는 것으로부터 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나 또는 적어도 2개의 수용자 세포를 투여하는 것까지 (i) 종양의 크기는 약 50%, 30%, 40%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 2% 미만 증가하거나, (ii) 대상체에서 종양 세포의 수는 약 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 초과 증가하지 않는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 복수의 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 대상체로부터 복수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 여기서 복수의 T 세포의 각각의 T 세포는 복수의 TCR의 TCR의 동족 쌍을 발현하고, 복수의 TCR은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함하는 단계; (b) 복수의 TCR로부터 복수의 종양 반응성 TCR을 확인하는 단계; (c) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 복수의 수용자 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 수용자 세포의 각각의 수용자 세포는 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계; (d) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 복수의 수용자 세포에서 발현하는 단계; 및 (e) (i) 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나의 수용자 세포를 대상체에게 투여하거나 (ii) 복수의 수용자 세포 중 적어도 2개의 수용자 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 적어도 2개의 수용자 세포는 상이한 TCR을 발현하고, 종양은 복수의 T 세포를 단리하는 것으로부터 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나 또는 적어도 2개의 수용자 세포를 투여하는 것까지 새로운 단계로 진행되지 않는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 복수의 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 대상체로부터 복수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 여기서 복수의 T 세포의 각각의 T 세포는 내인성 핵산으로부터의 복수의 TCR의 TCR의 동족 쌍을 발현하고, 복수의 TCR은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함하는 단계; (b) 복수의 TCR로부터 복수의 종양 반응성 TCR을 확인하는 단계; (c) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 복수의 수용자 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 복수의 수용자 세포의 각각의 수용자 세포는 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (i) 폴리뉴클레오티드는 내인성 핵산의 전사되거나 증폭된 생성물이거나 (ii) 폴리뉴클레오티드는 포스포르아미다이트를 사용하여 화학적으로 합성되지 않는 단계; (d) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 복수의 수용자 세포에서 발현하는 단계; 및 e) (i) 복수의 수용자 세포 중 적어도 하나의 수용자 세포를 대상체에게 투여하거나 (ii) 복수의 수용자 세포 중 적어도 2개의 수용자 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 적어도 2개의 수용자 세포는 상이한 TCR을 발현하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, 방법은 포스포르아미다이트를 사용한 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 복수의 T 세포는 종양 침윤 T 세포 또는 말초 T 세포이다. 일부 경우에서, 복수의 T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 탈진된 T 세포, 조절 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 수용자 세포는 동종이계 T 세포, 자가 T 세포, 또는 세포주 세포이다. 일부 경우에서, 방법은, b) 전에, 복수의 TCR을 복수의 리포터 세포에서 발현하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 발현은 복수의 TCR을 코딩하는 핵산 서열을 바이러스 벡터에 의해 전달하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 경우에서, 복수의 리포터 세포의 각각의 리포터 세포는 리포터 유전자를 포함한다. 일부 경우에서, (b)에서, 확인은 복수의 TCR을 하나 이상의 표적 항원, 또는 하나 이상의 표적 항원을 제시하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 표적 항원은 하나 이상의 종양 세포 또는 항원 제시 세포(APC)에 의해 제시된다. 일부 경우에서, 하나 이상의 APC는 표적 항원 코딩 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 표적 항원은 MHC와 복합체를 형성한다. 일부 경우에서, MHC는 MHC 사량체이다. 일부 경우에서, 복수의 TCR의 복수의 종양 반응성 TCR은 TCR의 적어도 2, 5, 10, 15, 또는 20개의 상이한 동족 쌍을 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 종양 반응성 TCR의 각각의 TCR은 상이한 에피토프 또는 상이한 단백질에 대해 특이적이다. 일부 경우에서, 복수의 종양 반응성 TCR의 각각의 TCR은 상이한 (i) TCR 알파 CDR3 서열, (ii) TCR 베타 CDR3 가변 도메인 서열, (iii) TCR 알파 가변 도메인 서열, (iv) TCR 베타 가변 도메인 서열, 또는 v) TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인 서열의 조합을 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 종양 반응성 TCR은 대상체로부터의 종양 세포에는 결합하지만 대상체로부터의 건강한 세포에는 결합하지 않거나 종양 세포보다 적어도 10배 낮은 친화도로 대상체로부터의 건강한 세포에 결합한다. 일부 경우에서, (e)에서 투여되는 복수의 수용자 세포는 (a)에서 단리된 복수의 T 세포보다 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 또는 적어도 1,000,000배 많은 세포를 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) T 세포 수용체(TCR) 집단을 발현하는 대상체로부터 T 세포 집단을 단리하는 단계로서, 여기서 T 세포 집단은 최대 약 10,000개 세포를 포함하는 단계; b) TCR 집단으로부터 복수의 종양 반응성 TCR을 확인하는 단계; 및 (c) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 발현하는 복수의 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트는 적어도 2개의 상이한 동족 쌍을 포함하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) TCR 집단으로부터 복수의 종양 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 단계로서, 여기서 TCR 집단은 TCR의 적어도 50개의 상이한 동족 쌍을 포함하는 단계; 및 (b) 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 발현하는 복수의 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트는 적어도 50개의 상이한 동족 쌍 중 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 또는 적어도 20개의 상이한 동족 쌍을 포함하고, 복수의 종양 반응성 TCR은 복수의 세포에 대해 외인성인 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트는 적어도 5개의 TCR을 포함하고, 여기서 적어도 5 TCR의 각각의 TCR은 (1) 상이한 에피토프 또는 상이한 단백질에 대해 특이적이거나 (2) 상이한 (i) TCR 알파 CDR3 서열, (ii) TCR 베타 CDR3 가변 도메인 서열, (iii) TCR 알파 가변 도메인 서열, (iv) TCR 베타 가변 도메인 서열, 또는 (v) TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인 서열의 조합을 포함한다.
일부 경우에서, 방법은. (a) 전에, 대상체로부터 TCR 집단을 발현하는 T 세포 집단을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 적어도 50개의 상이한 동족 쌍은 적어도 5, 10, 15, 또는 20개의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 확인은 마커에 의해 복수의 종양 반응성 TCR을 단리하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 발현하는 복수의 세포는 복수의 동종이계 세포, 자가 세포 또는 세포주 세포이다. 일부 경우에서, 복수의 동종이계 세포는 억제성 자연 살해(NK) 세포 수용체에 결합하는 단백질을 발현한다. 일부 경우에서, 단백질은 B2M-HLA-E 또는 B2M-HLA-G 융합 단백질이다.
또 다른 측면에 따라, 표적 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 제1 샘플로부터의 복수의 T 세포를 대상체로부터의 종양 세포를 포함하는 제2 샘플 또는 제3 샘플과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제3 샘플은 제2 샘플로부터 유래되고, 제3 샘플은 (i) 제2 샘플의 종양 세포로부터의 표적 항원 또는 표적 항원을 코딩하는 핵산, 및 MHC, (ii) MHC에서 표적 항원을 제시하는 세포, 또는 (iii) MHC 및 핵산에 의해 코딩되는 단백질 생성물을 포함하는 세포를 포함하고, 복수의 T 세포의 서브세트는 MHC와 복합체를 형성한 표적 항원에 결합하는 단계; (b) 제1 샘플의 복수의 T 세포의 서브세트 또는 이의 일부를 단리하는 단계; (c) 복수의 T 세포의 서브세트 또는 이의 일부를 복수의 구획으로 분할하는 단계로서, 여기서 각각의 구획은 복수의 T 세포의 서브세트 또는 이의 일부의 개별 T 세포를 포함하는 단계; 및 (d) 각각의 구획 내에서, 개별 T 세포의 TCR의 동족 쌍의 제1 TCR 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 TCR 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 확인하여 하나 이상의 쌍을 이룬 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, 확인은 개별 T 세포의 동족 쌍의 제1 TCR 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 TCR 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 물리적으로 연결하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 쌍을 이룬 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 융합된 폴리뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, 확인은 개별 T 세포의 TCR의 동족 쌍의 제1 TCR 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 TCR 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 것을 포함한다.
일부 경우에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 포스포르아미다이트를 사용하여 화학적으로 합성되지 않는다. 일부 경우에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 개별 T 세포의 내인성 핵산의 전사되거나 증폭된 생성물이다. 일부 경우에서, 제1 샘플 또는 제2 샘플은 대상체로부터 단리된다. 일부 경우에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 동일한 대상체로부터 단리된다. 일부 경우에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 상이한 대상체로부터 단리된다. 일부 경우에서, 제1 샘플 또는 제2 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, PBMC 샘플, 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에서, 조직 샘플은 종양 조직 또는 건강한 조직이다. 일부 경우에서, 제1 샘플 또는 제2 샘플은 코어 생검, 미세 바늘 생검, 또는 성분채집술에 의해 대상체로부터 단리된다. 일부 경우에서, 단리는 마커에 의해 복수의 T 세포의 서브세트 또는 이의 일부를 단리하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 마커는 세포 표면 마커 또는 시토카인이다. 일부 경우에서, 세포 표면 마커는 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, FoxP3, 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에서, 표적 항원을 제시하는 세포는 종양 세포, 항원 제시 세포(APC), 인공 APC, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 경우에서, APC 또는 aAPC는 표적 항원에 의해 펄싱된다. 일부 경우에서, 핵산에 의해 코딩되는 단백질 생성물을 포함하는 세포는 APC 또는 핵산 또는 이의 유도체와 함께 전달(예컨대, 형질감염 또는 전기천공)되는 aAPC이다. 일부 경우에서, APC 또는 aAPC는 MHC를 코딩하는 추가의 핵산과 함께 전달된다. 일부 경우에서, 핵산 또는 이의 유도체는 DNA 또는 RNA이다. 일부 경우에서, 표적 항원을 제시하는 세포 또는 핵산에 의해 코딩되는 단백질 생성물을 포함하는 세포는 대상체로부터 단리되거나 세포주 세포이다. 일부 경우에서, 표적 항원을 제시하는 세포 또는 핵산에 의해 코딩되는 단백질 생성물을 포함하는 세포는 제1 샘플 및 제2 샘플이 단리되는 동일한 대상체로부터 단리된다. 일부 경우에서, 방법은 하나 이상의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 생성하는 단계로서, 하나 이상의 벡터의 각각의 벡터는 하나 이상의 융합된 폴리뉴클레오티드의 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 하나 이상의 벡터를 복수의 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 복수의 세포의 각각의 세포는 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나의 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 복수의 세포에서 하나 이상의 융합된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 복수의 세포의 서브세트는 복수의 표적 반응성 TCR을 발현한다. 일부 경우에서, 방법은 복수의 세포를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 복수의 세포의 서브세트는 하나 이상의 항원에 결합한다. 일부 경우에서, 방법은 복수의 표적 반응성 TCR의 하나 이상의 표적 반응성 TCR을 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 하나 이상의 표적 반응성 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 복수의 수용자 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 복수의 수용자 세포 중 하나 이상의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 본원에 기재된 방법에 의해 확인되는 표적 반응성 또는 종양 반응성 TCR을 코딩하는 서열을 포함하는 수용자 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에 따라, 본원에 기재된 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에서, 수용자 세포는 약 1 x 109개 세포 내지 약 1 x 1011개 세포의 용량으로 투여된다.
본 개시내용의 추가의 측면 및 이점은 본 개시내용의 단지 예시적인 실시양태가 제시되고 설명되는 하기의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용은 다른 및 상이한 실시양태가 가능하고, 그의 몇몇 세부 사항은 모두 본 개시내용으로부터 벗어나지 않고 다양한 명백한 측면에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 설명은 제한적인 것이 아니라 본질적으로 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
참조에 의한 삽입
본 명세서에 언급된 모든 공개문, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개문, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함된 공개문 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 함유된 개시내용과 모순되는 한, 명세서는 임의의 이러한 모순되는 자료를 대체 및/또는 우선하도록 의도된다.
본 발명의 새로운 특색은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 하기의 상세한 설명 및 첨부 도면 (또한 본원에서 "도")을 참조하면 본 발명의 특색 및 이점에 대한 더 나은 이해가 얻어질 것이다.
도 1은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 및 면역수용체 발현 벡터를 생성하는 일반적인 개념의 예시적인 도식을 도시한다. 다중 소스(source) 면역수용체 발현 세포(예컨대, 3개의 T 세포가 표시됨)는 동시에 처리될 수 있다. 각각의 세포에 대해, 이분 면역수용체의 2개의 유전자(예컨대, T 세포 수용체 알파 유전자좌 유전자 TRA 및 T 세포 수용체 베타 유전자좌 유전자 TRB, 각각 TRA 1 및 TRB 1로 칭함)에 대한 서열이 융합되어 융합된 이분 면역수용체 유전자로 지칭될 수 있는 두 쇄를 코딩하는 융합된 DNA 분자를 생성한다(단계 1). 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 시험관과 같은 하나의 용기에 혼합될 수 있다(단계 2). 융합된 DNA 분자는 면역수용체 발현 벡터로 제조될 수 있다(단계 3).
도 2는 3개의 T 세포(도면에 도시된 T 세포 1, T 세포 2 및 T 세포 3)를 예로 사용하여 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위한 단일 세포 반응기의 개념의 예시적인 도식을 도시한다. (a) 각각의 세포는 단일 세포 반응기에 배치될 수 있다. (b) 세포는 각각의 단일 세포 반응기에서 용해되어 2개의 쇄(예컨대, T 세포 1로부터의 TRA 및 TRB, 각각 TRA 1 및 TRB 1로 칭함)를 코딩하는 mRNA 분자를 방출할 수 있다. (c) 이어서, 각각의 mRNA 분자는 DNA 분자로 전환되고 증폭될 수 있다. (d) 융합된 DNA 분자(예컨대, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드)는 각각의 쇄의 증폭 생성물을 리게이션하여 생성될 수 있다. 단일 세포 반응기 사이의 장벽으로 인해, 상이한 세포로부터의 TRA 및 TRB의 쌍형성오류(mispairing)(예컨대, TRB 2와 융합된 TRA 1)가 최소화될 수 있다.
도 3은 예로서 TCR을 사용하여 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 상이한 가능한 배향을 도시한다. 점선 화살표는 단백질 코딩 서열의 센스 가닥의 방향을 나타낸다. 이 예에서 센스 가닥의 5' 말단은 "헤드"를 지칭하고 센스 가닥의 3' 말단은 "테일"을 지칭한다.
도 4a는 테일-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 4b는 테일-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 5a는 TRA에 이어 TRB의 순서로 헤드-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 5b는 TRA에 이어 TRB의 순서로 헤드-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 5c는 TRA에 이어 TRB의 순서로 헤드-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 6a는 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 양방향 프로모터로 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 6b는 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 양방향 프로모터로 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 7a는 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉(bicistronic) 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 7b는 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 7c는 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 7d는 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 8a는 헤드-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 8b는 헤드-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 8c는 헤드-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉 면역수용체 발현 벡터로 전환하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 9a는 테일-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 9b는 테일-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 10a는 헤드-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 10b는 헤드-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 예시적인 전략을 도시한다.
도 11a는 수상이 세포 및 프라이머 변형된 아가로스를 포함하는 액적 형성의 예를 도시한다.
도 11b는 형성된 액적의 예를 도시한다. 밝은 스팟은 염료로 염색된 세포 핵을 나타내고 큰 구체는 아가로스 비드를 나타낸다.
도 12는 실시예 8에 기재된 바와 같은 OE-PCR을 위한 에멀젼의 예시적인 이미지를 도시한다. 확대 보기는 어댑터 함유 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄 폴리뉴클레오티드를 포착하는 아가로스 비드를 함유하는 일부 액적을 도시한다.
도 13은 시퀀싱 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 위한 예시적인 도식을 도시한다. 이 도에서 사용되는 바와 같이, (p)는 부분을 의미하고, (f)는 전장을 의미한다.
도 14는 쌍을 이룬 판독 카운트 매트릭스(M0)를 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 15a는 TRA 및 TRB 클론의 도미넌트(dominant) 쌍형성을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 15b는 TRA 및 TRB 클론의 도미넌트 쌍형성을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 15c는 TRA 및 TRB 클론의 도미넌트 쌍형성을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 15d는 TRA 및 TRB 클론의 도미넌트 쌍형성을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 15e는 TRA 및 TRB 클론의 도미넌트 쌍형성을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 15f는 TRA 및 TRB 클론의 도미넌트 쌍형성을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 16a는 A1, A2 또는 A3에 의해 표시되는 바와 같이 상위 1, 2, 또는 3의 TRB 짝형성 파트너(들)에 매핑된 TRA 클론의 판독의 클론별 분율을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 16b는 B1, B2 또는 B3에 의해 표시되는 바와 같이 상위 1, 2, 또는 3의 TRA 짝형성 파트너(들)에 매핑된 TRB 클론의 판독의 클론별 분율을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 17a는 검출된 도미넌트 쌍의 수를 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 17b는 도미넌트 쌍에 의해 기여된 판독의 분율을 보여주는 예시적인 시퀀싱 데이터를 도시한다.
도 18은 항원에 대한 사전 지식 없이 종양 반응성 (또는 종양 특이적) TCR을 선별하는 예시적인 도식을 도시한다.
도 19는 종양 반응성 (또는 종양 특이적) TCR을 선별하고 TCR을 발현하는 수용자 세포를 사용하여 대상체에서 종양을 치료하는 예시적인 도식을 도시한다.
본 발명의 다양한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명에서 벗어나지 않고 당업자에게 다양한 변형, 변경 및 대체가 발생할 수 있다. 본원에 기재된된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 개시에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 또한, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 마찬가지로, "포함한다" 및 "포함하는"은 제한하려는 의도가 아니다.
정의
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는가, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예컨대, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 더욱 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 명세서 및 청구범위에 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미한다고 가정해야 한다.
용어 "면역수용체"는 면역 세포가 그의 표적을 인식하기 위해 생성하는 수용체 단백질 또는 수용체 단백질 복합체를 지칭한다. 표적은 항원 또는 이의 일부(예컨대, 에피토프)일 수 있다. 항원은 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 표적은 MHC 결합된 펩티드일 수 있다. 면역수용체의 예는 B 세포 수용체(BCR), 항체("면역글로불린"과 상호 교환적으로 사용됨) 및 T 세포 수용체(TCR)를 포함한다.
용어 "면역수용체 쇄"는 면역수용체의 서브유닛으로서 기능하는 폴리펩티드를 지칭한다. 면역수용체 쇄의 예는 면역글로불린(Ig)의 중쇄, 면역글로불린의 경쇄, TCR의 알파 쇄, TCR의 베타 쇄, TCR의 감마 쇄, TCR의 델타 쇄를 포함한다.
용어 "이분 면역수용체"는 2개의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 의해 형성된 면역수용체를 지칭한다. 세포에서 2개의 유전자는 염색체의 상이한 유전자좌 또는 상이한 염색체에 위치될 수 있다. 2개의 유전자는 V(D)J-재배열된 유전자와 같이 재배열된 유전자일 수 있다. V(D)J-재배열된 유전자는 V(D)J 재조합이라는 메카니즘을 통해 생성될 수 있으며, 이는 1차 림프 기관에서 발생하고 거의 무작위 방식으로 가변(V), 연결(J) 및 일부 경우에 다양성(D) 유전자 분절을 재배열한다. 이분 면역수용체의 예는 BCR(재배열된 중쇄 유전자 및 재배열된 경쇄 유전자에 의해 코딩됨), 항체(재배열된 중쇄 유전자 및 재배열된 경쇄 유전자에 의해 코딩됨) 및 TCR(재배열된 TRA 유전자 및 재배열된 TRB 유전자에 의해 코딩되거나 재배열된 TRG 유전자 및 재배열된 TRD 유전자에 의해 코딩됨)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "유전자"는 잠재적으로 전사 및/또는 해독될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다(이 정의는 5' 및 3'의 조절 요소 및 존재하는 경우 인트론을 포함함). 오르 폰(orphon) 및 유사 유전자도 "유전자" 개념의 사례이다. 일반적으로, V, D 및 J 유전자는 배선의 유전자 분절을 나타내며, 이들 배선 유전자 서열은 IMGT 데이터베이스에서 찾아질 수 있다. V(D)J 재조합 후, 재배열된 유전자의 V, D 및 J 유전자 분절을 각각 V 영역, D 영역 및 J 영역으로 지칭한다. 재배열된 유전자의 V 영역, D 영역 및 J 영역은 각각 배선의 V 유전자, D 유전자 또는 J 유전자로부터 유래된다.
용어 "소스 면역수용체 발현 세포"는 면역수용체가 면역수용체 발현 벡터로 클로닝될 수 있는 면역수용체 발현 세포를 지칭한다. 면역수용체가 이분 면역수용쇄 경우, 이들 세포는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 본원에 기재된 방법에서 인풋(input) 세포로 사용될 수 있으며, 이는 차례로 면역수용체 발현 벡터로 전환될 수 있다. 예컨대, 소스 면역수용체 발현 세포는 소스 BCR 발현 세포, 소스 항체 발현 세포 또는 소스 TCR 발현 세포일 수 있다.
용어 "융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드"는 이분 면역수용체의 두 유전자(재배열된 유전자를 포함)에 대한 코딩 서열을 포함하는 연속 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하며, 여기서 코딩 서열은 면역수용체 쇄를 코딩하는 전체 또는 부분 서열일 수 있다. 예컨대, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 융합된 BCR 폴리뉴클레오티드, 융합된 항체 폴리뉴클레오티드 또는 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
용어 "면역수용체 발현 벡터"는 (1) 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 포함하고 (2) 숙주 세포(예컨대, 본원에 기재된 수용자 세포)에서 면역수용체를 발현하는 데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 벡터(예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터)를 지칭한다. 예컨대, 면역수용체 발현 벡터는 BCR 발현 벡터, 항체 발현 벡터 또는 TCR 발현 벡터일 수 있다.
용어 "수용자 세포"는 면역수용체 발현 벡터가 기능적으로 도입될 수 있는 세포를 의미한다. 어구 "기능적으로 도입된"은 면역수용체 발현 벡터에 코딩된 면역수용체가 수용자 세포에서 발현될 수 있음을 의미한다. 수용자 세포의 예는 CD45+ 세포, T 세포, B 세포, 대식세포, 자연 살해(NK) 세포, 줄기 세포, 박테리아 세포, 효모 세포 및 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포"는 면역수용체를 발현하기 위해 면역수용체 발현 벡터를 보유하도록 조작된 수용자 세포를 지칭한다. 적절한 경우, 어구 "면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포"에서 단어 "면역수용체"는 "BCR", "항체" 또는 "TCR"로 대체될 수 있다. 적절한 경우, 어구 "면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포"에서 어구 "수용자 세포"는 수용자 세포로 사용되는 세포 타입, 예컨대 "CD45+ 세포", "T 세포', "B 세포", "대식세포", "NK 세포", "줄기 세포", "HeLa 세포", "CHO 세포", "박테리아 세포" 및 "효모 세포"로 대체될 수 있다. 예컨대, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 TCR 프로그래밍된 T 세포, BCR 프로그래밍된 B 세포 또는 항체 프로그래밍된 CHO 세포일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조작된" 및 그의 문법적 등가물은 핵산(예컨대, 유기체의 게놈 내의 핵산) 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 변경을 지칭할 수 있다. 하나 이상의 변경은 유전자의 변형, 추가 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 조작된 세포는 유전자가 추가, 삭제 및/또는 변경된 세포를 지칭할 수 있다.
용어 "폴리클로날 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포"는 하나 초과의 상이한 면역수용체가 발현되는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 집단을 지칭한다. 발현되는 하나 초과의 상이한 면역수용체 각각은 상이한 MHC에 의해 제시되는 상이한 에피토프, 상이한 항원 또는 에피토프에 대해 반응할 수 있다. 폴리클로날 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포 집단에서 발현되는 상이한 면역수용체의 총수는 100, 1,000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000개를 초과할 수 있다. 일부 경우에서, 폴리클로날 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포 집단에서 발현되는 상이한 면역수용체의 총수는 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000개 또는 그 초과일 수 있다.
서열의 도메인 수준 설명: 본 개시에서 폴리뉴클레오티드 서열은 도메인 수준에서 설명될 수 있다. 각각의 도메인 이름은 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 상응할 수 있다. 예컨대, 도메인 'A'는 5'-TATTCCC-3'의 서열을 가질 수 있고, 도메인'B'는 5'-AGGGAC-3'의 서열을 가질 수 있으며, 도메인 'C'는 5'-GGGAAGA-3'의 서열을 가질 수 있다. 이 경우에서, 도메인 A, B 및 C의 연쇄인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 [A|B|C}로 표기될 수 있다. 기호 '['는 5' 말단을 나타내고, 기호 '}'는 3' 말단을 나타내며, '|' 기호는 도메인 이름을 구분한다. 서열 'X'를 갖는 ssDNA 또는 ssDNA의 섹션은 [X}로 지칭될 수 있다. 별표 기호는 서열 상보성을 나타낸다. 예컨대 도메인 [X*}는 도메인 [X}의 역 상보물이다. 표기법 ds[X}는 [X} 및 [X*}에 의해 형성되는 이중 가닥 DNA를 기재하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 특히 dsDNA와 ssDNA를 구별할 필요가 없는 상황에서, 한 가닥의 서열이 [X} 인 dsDNA는 느슨하게 [X}로도 지칭될 수 있다. [X}와 동일한 서열을 갖는 단일 가닥 RNA 분자 또는 분절(T를 U로 대체하는 경우 제외)도 [X}로 지칭될 수 있다. 문맥에 따라, 도메인 이름은 정확한 서열을 지칭하거나 DNA 또는 도메인의 일반적인 기능을 설명할 수 있다. 예컨대, [RBS}는 이에 대한 정확한 서열은 다를 수 있지만 리보솜 결합 부위를 설명하는 데 사용될 수 있다. 괄호를 사용하여 도메인의 연쇄를 그룹화할 수 있으며, 닫는 괄호 뒤에 '*'를 추가함으로써 역 상보 조작('*'로 표시됨)이 연쇄에 적용될 수 있다. 예컨대 [(X|Y)*}는 [Y*|X*}와 동일하다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체와 같은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 아데노신(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U) 또는 이들의 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 일반적으로 뉴클레오사이드 및 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 포스페이트(PO3) 기를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵염기, 5탄당(리보스 또는 데옥시리보스) 및 하나 이상의 포스페이트기를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 다양한 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 원형 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 비표준 뉴클레오티드(들), 비-천연 뉴클레오티드(들), 뉴클레오티드 유사체(들) 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드 변이체를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 디아미노퓨린, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실큐오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-D46-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신, 슈도우라실, 큐오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노퓨린 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 뉴클레오티드는 트리포스페이트 모이어티에 대한 변형을 포함하여 포스페이트 모이어티에 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예는 더 긴 길이의 포스페이트 쇄(예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 포스페이트 모이어티를 갖는 포스페이트 쇄) 및 티올 모이어티를 갖는 변형(예컨대, 알파-티오트리포스페이트 및 베타-티오트리포스페이트))을 포함한다. 핵산 분자는 또한 염기 모이어티에서(예컨대, 전형적으로 상보적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성하는 데 사용 가능한 하나 이상의 원자 및/또는 전형적으로 상보적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 없는 하나 이상의 원자에서), 슈가 모이어티에서 또는 포스페이트 골격에서 변형될 수 있다. 핵산 분자는 또한 N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHS)와 같은 아민 반응성 모이어티의 공유적 부착을 허용하기 위해 아미노 알릴 1-dUTP(aa-dUTP) 및 아미노헥실아크릴아미드-dCTP(aha-dCTP)와 같은 아민 변형된 기를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드에서 표준 DNA 염기 쌍 또는 RNA 염기 쌍에 대한 대체물은 입방 mm당 비트에서 더 높은 밀도, 더 높은 안전성(천연 독소의 우발적 또는 의도적 합성에 대한 내성), 광 프로그래밍된 폴리머라제에서 더 쉬운 구별, 또는 더 낮은 이차 구조를 제공할 수 있다. 이러한 대체 염기 쌍은 드 노보 및/또는 증폭 합성을 위한 천연 및 돌연변이 폴리머라제와 맞는다.
용어 "펩티드"는 아미노산의 중합체이고 아미드 결합을 통해 함께 결합되고 대안적으로 "폴리펩티드"로 지칭된다. 본 명세서의 맥락에서, 아미노산은 L-광학 이성질체 또는 D-광학 이성질체일 수 있음을 인식해야 한다. 펩티드는 2개 이상의 아미노산 단량체 길이이며 종종 20개 초과의 아미노산 단량체 길이일 수 있다. 폴리펩티드는 선형으로 구조화되지 않거나 3차원 구조로 접힐 수 있다. 구조화된 폴리펩티드는 단백질일 수 있다. 일부 경우에서, 펩티드는 신생항원 펩티드이다. 일부 경우에서, 펩티드는 종양 관련된 항원 펩티드이다.
용어 "신생항원"은 게놈 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하는 종양 특이적 돌연변이(들)로부터 발생하는 종양 항원의 부류를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "서열" 및 그의 문법적 등가물은 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있고; 선형, 원형 또는 분지형일 수 있으며; 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 서열은 돌연변이될 수 있다. 서열은 임의의 길이, 예컨대 2 내지 1,000,000개 또는 그 초과의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이 (또는 그 사이 또는 그 초과의 임의의 정수 값), 예컨대 약 100 내지 약 10,000개 뉴클레오티드 또는 약 200 내지 약 약 500개의 아미노산 또는 뉴클레오티드일 수 있다. 핵산의 서열은 실제 서열 및 그 서열의 역 상보 서열을 포괄할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "용기"는 생화학적 반응(예컨대, 표적 단백질 및 항체 결합, 핵산 하이브리드화 및 프라이머 연장)이 일어날 수 있는 구획(예컨대, 미세유체 채널, 웰, 튜브 또는 액적)을 지칭한다. 용어 "용기" 및 "구획"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 용기 또는 구획은 고체 벽(용기 또는 구획의 경계가 유리, 플라스틱 또는 폴리디메틸실록산(PDMS)과 같은 고체인 경우) 또는 액체 벽(용기 또는 구획의 경계가 오일과 같은 액체인 경우)으로 될 수 있다. 고체 벽으로된 용기는 모든 용기를 연결하는 연속적인 고체인 고체 스캐폴드를 함유할 수 있다. 구획의 부피는 1 mL와 같이 많거나 1 피코리터와 같이 적을 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 구획의 구획의 중앙값 크기는 1 내지 10 피코리터, 10 내지 100 피코리터, 100 피코리터 내지 1 나노리터, 1 내지 10 나노리터, 10 내지 100 나노리터, 100 나노리터 내지 1 마이크로리터, 1 내지 10 마이크로리터, 10 내지 100 마이크로리터, 또는 100 내지 1000 마이크로리터이다. 구획 내의 수성 내용물의 부피는 구획의 부피보다 적거나 거의 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 구획 내 수성 내용물의 중앙값 부피는 1 마이크로리터 이하이다. 용기는 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 포함할 수 있다. 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체는 중합 또는 겔화 시에 히드로겔 또는 경화된 매트릭스를 형성하여 경화된 입자를 형성할 수 있다. 경화된 입자는 비드일 수 있다. 경화된 입자는 다공성 입자일 수 있다. 경화된 입자는 히드로겔 입자일 수 있다. 히드로겔 입자는 가교결합된 폴리아크릴아미드, 가교결합된 PEG, 아가로스 또는 알기네이트와 같은 겔화된 중합체로 제조될 수 있다. 경화된 입자는 처리 또는 자극 시 용융될 수 있다. 예컨대, 아가로스 입자는 고온에 의해 용융될 수 있다. 가교제에 디술파이드 결합을 갖는 폴리아크릴아미드 입자는 베타 메르캅토에탄올 또는 DTT와 같은 환원제로 처리하여 용융될 수 있다.
용어 "액적"은 소정 부피의 액체를 지칭한다. "에멀젼"은 제1 액체가 제2 액체에 용해되거나 혼화되지 않는 제2 액체에 있는 제1 액체의 미세한 액적의 분산물을 지칭한다. 에멀젼의 예는 유중수 에멀젼, 수중유중수 에멀젼, 또는 지질층 중 물(리포좀) 에멀젼을 포함한다. 본원에 사용된 "유중수 에멀젼"은 오일이 연속상을 형성하고 물이 불연속적인 액적으로 존재하는 유중수 혼합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 액적은 균일 크기 또는 비균질 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 액적에서 액적의 중앙값 직경은 약 0.001 μm 내지 약 1 mm 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 액적에서 액적의 중앙값 부피는 0.01 나노리터 내지 1 마이크로리터 범위일 수 있다.
용어 "입자"는 구형, 실형, 브러시형 및 많은 불규칙한 모양을 포함하는 임의의 형상의 불용성 물질을 지칭한다. 입자는 내부에 규칙적 또는 무작위 채널이 있는 다공성일 수 있다. 예는 실리카, 셀룰로스, 세파로스 비드, 폴리스티렌(고체, 다공성 및 유도체화됨) 비드, 제어된 공극 유리, 겔 비드, 졸, 생물학적 세포, 준세포(subcellular) 입자, 미생물(원생동물, 박테리아, 효모, 바이러스 등), 미셀, 리포좀, 사이클로덱스트린, 2상 시스템(예컨대, 왁스 중 아가로스 비드) 등 및 물질을 포착하거나 캡슐화할 수 있는 다른 구조물을 포함한다.
본원 사용된 용어 "파티션(partition)"은 동사 또는 명사일 수 있다. 동사로 사용되는 경우(예컨대, "분할하기 위해" 또는 "분할하는"), 이 용어는 일반적으로 하나의 분획 (또는 세분획)을 또 다른 분획으로부터 격리하는 데 사용될 수 있는 용기 사이의 종 또는 샘플의 분획화(예컨대, 세분)를 지칭한다. 이러한 용기는 명사 "파티션"을 사용하여 참조된다. 예컨대, 미세유체공학, 분배, 볼텍싱 등을 이용하여 분할이 수행될 수 있다. 파티션은, 예컨대 웰, 마이크로웰, 구멍, 액적(예컨대, 에멀젼 중의 액적), 에멀젼의 연속상, 시험관, 스팟, 캡슐, 비드, 희석 용액 중의 비드의 표면, 또는 샘플의 하나의 분획을 다른 분획으로부터 격리하는 데 적합한 임의의 다른 컨테이너일 수 있다. 파티션은 또한 또 다른 파티션이 포함할 수 있다. 유중수 에멀젼은 미세유체공학을 이용하거나 선택적으로 계면활성제의 존재 하에 수상과 유상의 혼합물의 물리적 교반에 의해 생성될 수 있다.
용어 "중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체"는 중합 또는 비-중합 메카니즘을 통해 매트릭스를 형성할 수 있는 임의의 중합체 또는 단량체를 지칭한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체는 수성 액체에 가용성인 또는 분산성인 중합체이다. 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체는 가교결합 가능한 기를 통해 적합한 가교제와 가교결합할 수 있는 중합체를 포함한다. "중합 가능한"은 "가교결합 가능한"의 의미를 포괄할 수 있다. 중합은 단량체로부터 중합체를 형성하는 과정일 수 있으며, 선형 중합체로부터 가교결합된 중합체를 형성하는 과정일 수도 있다. 중합 가능한 중합체는 마크로머일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "마크로머"는 추가 중합에 참여할 수 있는 작용기를 갖는 임의의 중합체 또는 올리고머를 지칭한다.
용어 "매트릭스", "프레임워크" 및 "중합체 프레임워크"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 용기 내에 형성된 중합체 네트워크를 지칭한다.
용어 "고체 지지체", "지지체", "고체상 지지체", "기재(substrate)" 및 다른 문법적 등가물은 분자의 부착 또는 회합에 적합한 개별 부위를 함유하도록 변형될 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 강성 또는 반-강성 표면 또는 표면들을 갖는 물질 또는 물질의 군일 수 있다. 가능한 기재는 유리 및 변형된 또는 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 테플론 등 포함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 실리카 또는 실리콘 및 변형된 실리콘을 포함하는 실리카 기반 물질, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 광섬유 번들 및 다른 다양한 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 고체 지지체 또는 기재는 다중 웰 플레이트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체의 적어도 하나의 표면은 실질적으로 편평할 수 있으며, 일부 실시양태에서, 이는, 예컨대 웰, 융기된 영역, 핀, 에칭된 트렌치 등으로 상이한 분자 또는 반응에 대한 영역을 물리적으로 분리하는 것이 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체(들)는 비드, 수지, 입자, 겔, 마이크로구 또는 다른 기하학적 형상의 형태를 취할 수 있다.
용어 "농축", "단리", "분리", "분류", "정제", "선택" 또는 이들의 등가물은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 샘플에서 주어진 특성을 갖는 서브샘플을 수득하는 것을 지칭한다. 예컨대, 이들은 원하는 세포 계통 또는 특정 세포 표현형을 갖는, 예컨대 특정 세포 마커를 발현하는 또는 그 세포 표현형의 특징적인 특정 세포 마커 유전자를 발현하지 않는 원하는 세포를 적어도 약 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 함유하는 세포 집단 또는 세포 샘플을 수득하는 것을 지칭할 수 있다.
개요
면역수용체, 예컨대 B 세포 수용체(BCR) 및 T 세포 수용체(TCR)는 다중 서브유닛 또는 쇄에 의해 형성될 수 있다. BCR (및 BCR의 가용성 형태, 즉 항체) 분자는 중쇄(H 쇄)의 2개의 동일한 카피 및 경쇄(L 쇄)의 2개의 동일한 카피에 의해 형성될 수 있다. TCR 분자는 알파 쇄(TRA 유전자/서열에 의해 코딩되는, α 쇄 또는 TCRα 쇄) 및 베타 쇄(TRB 유전자/서열에 의해 코딩되는, β 쇄 또는 TCRβ 쇄) 또는 감마 쇄(TRG 유전자/서열에 의해 코딩되는, γ 쇄 또는 TCRγ 쇄) 및 델타 쇄(TRD 유전자/서열에 의해 코딩되는, δ 쇄 또는 TCRδ 쇄)에 의해 형성될 수 있다. 이들 면역수용체 쇄는 가변 도메인(예컨대, 재배열된 VDJ 또는 VJ 영역에 의해 코딩됨)을 가질 수 있다. 가변 도메인의 일부는 초가변일 수 있다. 초가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR), 예컨대 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 하나의 B 세포 내에서, 단지 하나의 기능적 H 쇄 서열 및 하나의 기능적 L 쇄 서열이 발현될 수 있다. 일부 경우에서, 하나의 T 세포 내에서 단지 하나의 기능적 α 쇄 서열 및 하나의 기능적 β 쇄 서열이 발현될 수 있다. 일부 경우에서, 하나의 T 세포 내에서, 단지 하나의 기능적 γ 쇄 서열 및 하나의 기능적 δ 쇄 서열이 발현될 수 있다.
이러한 면역수용체의 클로닝은 추가 기능 연구 및 적용에 유용할 수 있다. 그러나, 이들 면역수용체의 이분 특성으로 인해 통상적인 기술을 이용하여 조작하기가 어려울 수 있다. 예컨대 100개의 T 세포가 용해되면 100개의 TCRα 쇄와 100개의 TCRβ 쇄를 시퀀싱 및/또는 클로닝할 수 있지만, 소스 TCR 발현 세포에서 어떤 TCRα 쇄가 어떤 TCRβ 쇄와 쌍을 이루고 있는지 파악하기 어려울 수 있다. 이들 100개의 T 세포로부터, 각각 TCRα 쇄를 코딩하는 제1 서열 및 TCRβ 쇄를 코딩하는 제2 서열을 포함하는 100개의 물리적으로 융합된 DNA 분자를 수득할 수 있다면 더 가치가 있을 수 있다(도 1, 단계 1). 이어서, TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄는 하나의 소스 TCR 발현 세포에서 공동 발현될 수 있다. 이러한 융합된 분자는 쌍을 이룬 TRA 및 TRB 서열을 수득하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 또한, 이들 융합된 분자는 벡터 골격(예컨대, 플라스미드 골격)에 추가로 조작되고 삽입되어 발현 벡터를 생성하여(도 1, 단계 3), 쌍을 이룬 TRA 및 TRB 서열이 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포를 생성하기 위해 본원에 기재된 수용자 세포로 불리는 새로운 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이 경우에서, 제1 서열은 TCRα 쇄의 3개의 CDR 서열 모두를 포함할 수 있고, 제2 서열은 TCRβ 쇄의 3개의 CDR 서열 모두를 포함할 수 있다. 유사한 작업이 B 세포 집단에 대해 수행될 수 있다. 이들 면역수용체 발현 벡터는 TCR-T 요법, 항체 요법, 항체 조작, 및 특정 항원 또는 항원 세트를 인식하는 TCR 또는 항체의 확인과 같은 다수의 적용에 사용될 수 있다.
융합된 면역수용체 쇄의 생성은 단일 세포 반응기에서 수행될 수 있다. 단일 세포 반응기는 액적 또는 히드로겔 입자일 수 있다. 본원에서 기재되는 바와 같은 단일 세포 반응기를 사용하는 조성물 및 방법은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 집단의 고처리량 클로닝을 가능하게 할 수 있고, 이분 면역수용체의 적어도 약 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 또는 10,000,000개의 고유한 동족 쌍을 함유하는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드, 면역수용체 발현 벡터, 또는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 라이브러리를 생성할 수 있다.
T 세포 수용체(TCR)
본원에 기재된 면역수용체는 T 세포 수용체(TCR)일 수 있다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 TCRα 쇄를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 TCRβ 쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 또는 TCRγ 쇄를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 TCRδ 쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 프로모터를 추가로 포함할 수 있고/있거나 벡터에 삽입되어 수용자 세포에서 발현될 수 있다.
TCR은 다양한 암 또는 감염성 유기체와 관련된 항원을 인식하는 T 세포의 능력을 부여하는 데 사용될 수 있다. TCR은 알파(α) 쇄와 베타(β) 쇄 또는 감마(γ) 및 델타(δ) 쇄로 구성된다. 이들 쇄를 구성하는 단백질은 TCR의 거대한 다양성을 생성하는 고유한 메카니즘을 사용하는 DNA에 의해 코딩된다. 이 다중 서브유닛 면역 인식 수용체는 CD3 복합체와 회합하고, 항원 제시 세포(APC) 표면 상의 MHC 클래스 I 및 II 단백질에 의해 제시된 펩티드에 결합한다. APC 상의 항원성 펩티드에 대한 TCR의 결합은 T 세포 활성화의 중심 사건일 수 있으며, 이는 T 세포와 APC 사이의 접촉 지점에서 면역학적 시냅스에서 발생한다.
TCR은 MHC 클래스 I 분자의 맥락에서 T 세포 에피토프를 인식할 수 있다. MHC 클래스 I 단백질은 고등 척추동물의 모든 유핵 세포에서 발현될 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 12-kDa 경쇄 β-2 마이크로글로불린과 비공유적으로 회합된 46-kDa 중쇄로 구성된 이종이량체이다. 인간에는, 예컨대 HLA-A2, HLA-Al, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 및 HLA-Cw8과 같은 여러 MHC 대립유전자가 있다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 대립유전자는 HLA-A2 대립유전자이며, 일부 집단에서 집단의 약 50%에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, HLA-A2 대립유전자는 HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206, 또는 *0207 유전자 생성물일 수 있다. 일부 경우에서, 상이한 집단 간에 서브타입의 빈도에 차이가 있을 수 있다. 예컨대, 일부 실시양태에서, HLA-A2 양성 백인 인구의 95% 초과가 HLA-A*0201인 반면, 중국 인구에서는 빈도가 약 23% HLA-A*0201, 45% HLA-A*0207, 8% HLA-A*0206 및 23% HLA-A*0203인 것으로 보고되었다.
일부 실시양태에서, TCR은 MHC 클래스 II 분자의 맥락에서 T 세포 에피토프를 인식할 수 있다. MHC 클래스 II 단백질은 APC의 서브세트에서 발현될 수 있다. 인간에는, 예컨대 DR1, DR3, DR4, DR7, DR52, DQ1, DQ2, DQ4, DQ8 및 DPI와 같은 여러 MHC 클래스 II 대립유전자가 있다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1*0101, HLA-DRB*0301, HLA-DRB*0701, HLA-DRB*0401 또는 HLA-DQB1*0201 유전자 생성물이다.
B 세포에 의해 발현되는 면역글로불린과 유사한 - 막 결합된 면역글로불린은 종종 B 세포 수용체(BCR)로 지칭됨 - TCR 쇄는 가변 도메인 (또는 가변 영역) 및 불변 도메인 (또는 불변 영역)으로 이루어진다. 전장 불변 도메인/영역은 세포외 부분(본원에서 "세포외 불변 도메인"으로 지칭됨), 힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포질 테일을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 불변 도메인은 전장 불변 도메인 또는 이의 일부, 예컨대 세포외 불변 도메인일 수 있다. TCRα 및 δ 쇄의 가변 도메인은 다수의 가변(V) 및 연결(J) 유전자에 의해 코딩되는 반면, TCRβ 및 γ 쇄는 추가로 다양성(D) 유전자에 의해 코딩된다. VDJ 재조합 동안, 각각의 유전자 분절의 하나의 무작위 대립유전자가 기능적 가변 도메인을 형성하기 위해 다른 것과 재조합된다. 가변 도메인과 불변 유전자 분절의 재조합은 기능적 TCR 쇄 전사체를 생성할 수 있다. 또한, 무작위 뉴클레오티드는 유전자 분절 사이의 접합 부위에서 추가 및/또는 결실될 수 있다. 이 과정은 강력한 조합(어떤 유전자 영역이 재결합할 것인지에 따라 다름) 및 접합 다양성(뉴클레오티드가 추가/삭제되는 대상 및 수에 따라 다름)으로 이어질 수 있으며, 결과적으로 크고 매우 가변적인 TCR 레퍼토리가 생성되어 과다한 항원의 확인을 보장할 수 있다. 기능적 TCR을 형성하기 위해 α와 β 또는 γ와 δ 쇄의 쌍형성("조립"으로도 지칭됨)에 의해 추가적인 다양성을 달성할 수 있다. 재조합, 무작위 삽입, 결실 및 치환에 의해, T 세포 수용체를 코딩하는 유전자의 작은 세트는 1015 내지 1020개의 TCR 클론타입을 생성할 가능성이 있다. 본원에 사용된 "클론타입"은 동일한 면역수용체를 보유하는 면역 세포 집단을 지칭한다. 예컨대, 클론타입은 동일한 TCR을 보유하는 T 세포 집단 또는 동일한 BCR (또는 항체)을 보유하는 B 세포 집단을 지칭한다. 면역수용체 다양성의 맥락에서 "다양성"은 집단에서 면역수용체(예컨대, TCR, BCR 및 항체) 클론타입의 수를 지칭한다. 본원에 사용된 "동족 쌍 조합"은 면역 세포내의 이분 면역수용체의 2개의 쇄(예컨대, TCRα 및 TCRβ, TCRγ 및 TCRδ, 또는 중쇄 및 경쇄)의 천연 조합을 지칭한다. 2개의 쇄의 동일한 동족 쌍 조합은 동일한 TCR을 생성할 수 있다. 예컨대, 동일한 클론타입을 갖는 T 세포는 TCRα 및 TCRβ 쇄의 동일한 동족 쌍 조합을 갖는다. 클론타입의 더 높은 다양성은 동족 쌍 조합에서 더 높은 다양성을 나타낼 수 있다.
각각의 TCR 쇄는 구조에 상보성 결정 영역(CDR1-3)이라고 하는 3개의 초가변 루프를 함유한다. CDR1 및 2는 V 유전자에 의해 코딩되며, TCR과 MHC 복합체의 상호 작용에 필요할 수 있다. 그러나, CDR3은 V와 J 또는 D와 J 유전자 사이의 접합 영역에 의해 코딩되므로 매우 가변적일 수 있다. CDR3은 펩티드 항원과 직접 접촉하는 TCR 영역일 수 있다. CDR3은 T 세포 클론타입을 결정하기 위한 관심 영역으로 사용될 수 있다. 하나의 개체의 T 세포에 의한 모든 TCR의 합계를 TCR 레퍼토리 또는 TCR 프로파일이라고 한다. TCR 레퍼토리는 질환의 발병 및 진행에 따라 변할 수 있다. 따라서, 암, 자가면역, 염증 및 감염성 질환과 같은 상이한 질환 조건에서 면역 레퍼토리 상태를 결정하는 것은 질환 진단 및 예후에 유용할 수 있다.
TCR은 전장 TCR 뿐만 아니라 이의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 단편(MHC-펩티드 결합 단편이라고도 함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 실시양태에서, TCR은 전장 TCR보다 작지만 MHC 분자, 즉 MHC-펩티드 복합체에 결합된 특정 항원성 펩티드에 결합하는 항원 결합 부분이다. TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 전장 또는 무손상 TCR의 구조 도메인의 일부만 함유할 수 있지만 전체 TCR이 결합하는 에피토프(예컨대, MHC-펩티드 복합체)에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은, 일반적으로 각각의 쇄가 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경우와 같이, 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 쇄 및 가변 β 쇄와 같은 TCR의 가변 도메인을 함유한. 항원 결합 도메인이거나 항원 결합 도메인과 상동인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질이 포함된다.
B 세포 수용체(BCR) 및 항체
본원에 기재된 면역수용체는 B 세포 수용체(BCR)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 면역수용체는 항체 (또는 면역글로불린)이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 중쇄를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 경쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 융합된 BCR 또는 항체 폴리뉴클레오티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 융합된 이분 BCR 또는 항체 폴리뉴클레오티드는 프로모터를 추가로 포함할 수 있고/있거나 벡터에 삽입되어 수용자 세포에서 발현될 수 있다.
BCR은 한 쌍의 신호전달 단백질과 회합된 형질막 결합된 항체로 이루어진다. BCR에 대한 항원 결합은 B 세포를 자극하여 항체 분비 세포로 분화할 수 있다. BCR은 B 세포의 클론 선택 및 항체 분비 형질 세포로의 분화에 중요한 역할을 할 수 있다. 성숙한 B 세포는 BCR의 면역글로불린 M(IgM) 및 BCR의 IgD 이소형을 모두 가질 수 있으며, 이는 둘 다 신호전달 서브유닛 Igα 및 Igβ와 관련될 수 있지만 막 결합된 중쇄 이소형이 다르다.
전체 면역글로불린 또는 항체는 일반적으로 4개의 폴리펩티드로 이루어질 수 있다: 중쇄(H) 폴리펩티드의 2개의 동일한 카피 및 경쇄(L) 폴리펩티드의 2개의 동일한 카피. 포유동물에서, 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5가지 이소형으로 나뉜다. 이소형은 생물학적 특성, 기능적 위치 및 상이한 항원을 다루는 능력이 다르다. 존재하는 중쇄의 타입은 항체의 부류를 정의한다. 그리스 문자로 표시되는 포유동물 Ig 중쇄에는 α, δ, ε, γ 및 μ의 5가지 타입이 있다. 이들 쇄는 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체에서 발견된다. 중쇄는 크기 및 조성이 상이하며; α 및 γ는 약 450개의 아미노산을 함유하고, μ와 ε은 약 550개의 아미노산을 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 N-말단 가변(VH) 영역 및 3개의 C-말단 불변(CH1, CH2, 및 CH3) 영역을 포함할 수 있으며, 각각의 경쇄는 하나의 N-말단 가변(VL) 영역 및 하나의 C-말단 불변(CL) 영역을 함유할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파(κ) 또는 람다(λ)의 2개의 다른 타입 중 하나에 할당될 수 있다. 전형적인 면역글로불린에서, 각각의 경쇄는 디술파이드 결합에 의해 중쇄에 연결될 수 있고, 2개의 중쇄는 디술파이드 결합에 의해 서로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공된 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 작용제는 하나 이상의 디술파이드 결합을 포함하는 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 디술파이드 결합은 IgG4 면역글로불린에 대한 예상 위치에서 디술파이드 결합이거나 이를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬될 수 있고, 경쇄 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬될 수 있다. 중쇄의 나머지 불변 도메인은 서로 정렬될 수 있다.
경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍의 가변 도메인은 항체의 항원 결합 부위를 형성할 수 있다.
항체는 항원 결합 단편(Fab) 및 단편 결정화 가능한 영역(Fc)을 포함할 수 있다. Fc 영역은 항체가 면역계를 활성화시킬 수 있는 세포 표면 수용체와 상호 작용할 수 있다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인에서 유도된 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성되며; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에 3개의 중쇄 불변 도메인(CH 도메인 2-4)을 함유한다. IgG의 Fc 영역은 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 보유한다. Fc 단편의 글리코실화는 Fc 수용체 매개된 활성에 필수적일 수 있다. 이 부위에 부착된 N-글리칸은 주로 복합체 타입의 코어-푸코실화된 디안테나 구조일 수 있다. 항체 단편의 예는 (1) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편, 2) 힌지 영역에서 디술파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (3) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (4) 온화한 환원 조건을 이용하여 F(ab')2 단편의 디술파이드 브릿지를 파괴하여 발생하는 Fab' 단편, (5) 디술파이드 안정화된 Fv 단편(dsFv), 및 (6) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변 도메인(VH 또는 VL) 폴리펩티드인 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않을 수 있지만, 불변 도메인은 가변 도메인의 배향에 영향을 미칠 수 있다. 불변 도메인은 또한 이펙터 분자 및 세포와의 상호 작용을 통해 항체 의존적 보체 매개된 용해 또는 항체 의존적 세포독성에 참여하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있다.
항체는 또한 키메라 항체, 인간화 항체 및 재조합 항체, 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 생성된 인간 항체 뿐만 아니라 농축 기술을 이용하여 라이브러리로부터 선택되는 항체를 포함할 수 있다.
항체는 척추동물의 혈액 또는 다른 체액에서 발견되는 단백질일 수 있으며, 이는 박테리아 및 바이러스와 같은 이물체를 식별하고 중화하기 위해 면역계에 의해 사용된다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다특이적 항체(예컨대, 이특이적 항체 및 다반응성 항체) 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 따라서, 항체는 임의의 특이적 결합 구성원, 면역글로불린 부류 및/또는 이소형(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE 및 IgM); 및 Fab, F(ab')2, Fv, 및 scFv(단일 쇄 또는 관련된 실체)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 생물학적으로 관련된 단편 또는 이의 특이적 결합 구성원을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성된다. "이특이적" 또는 "이기능적" 항체 이외의 항체는 각각의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. 모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득될 수 있으며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 폴리클로날 항체는 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 제제일 수 있다.
많은 면역수용체의 가변 도메인(예컨대, TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 항체 중쇄, 항체 경쇄)은 동일한 일반 구조를 가질 수 있으며, 각각의 도메인은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크(FW 또는 FR) 영역을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "프레임워크 영역"은 초가변 또는 상보적 결정 영역(CDR) 사이에 위치되는 가변 도메인 내의 비교적 보존된 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 전형적인 면역글로불린 또는 TCR 쇄에서, 각각의 가변 도메인에는 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된 4개의 프레임워크 영역이 있을 수 있다. 프레임워크 영역은 가변 도메인의 구조적 프레임워크를 제공하는 β 시트를 형성한다. 전형적인 면역글로불린 또는 TCR 쇄에서, 각각의 가변 도메인에 3개의 상보적 결정 영역(CDR)이 있을 수 있으며, 이는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. CDR은 항원 결합을 담당할 수 있는 항체의 "초가변 영역"을 형성한다.
단일 세포 반응기
융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 단일 세포로부터의 이분 면역수용체를 코딩하는 2개의 V(D)J-재배열된 유전자의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 단일 세포 반응기는 단일 세포로부터 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법의 예시적인 도식이 도 2에 도시되어 있다. 단일 세포 반응기(개념적으로 도 2에 음영 구조로 표시됨)를 사용함으로써, 쌍형성오류를 유발할 수 있는 상이한 세포로부터의 상이한 면역수용체 쇄를 코딩하는 핵산 분자 간의 접촉(즉, 세포간 서열 접촉)을 최소화할 수 있다. 예컨대, 도 2에서 도시되는 바와 같이, TCRα 쇄 1을 코딩하는 핵산 분자(TRA 1)는 TCRβ 쇄 2를 코딩하는 핵산 분자(TRB 2)와 접촉하지 않을 수 있다.
이 예시적인 도식에 의해 예시되는 바와 같이, 단일 세포 반응기는 단일 생물학적 입자(예컨대, 단일 세포)로부터의 관심 분자가 시약과 반응할 수 있거나 서로 반응할 수 있는 컨테이너일 수 있다. 단일 세포 반응기는 (1) 단일 세포로부터의 관심 분자가 회합될 수 있는 고체 지지체 및 (2) 생화학적 반응이 발생하기 위한 수성 내용물의 2개의 성분을 포함할 수 있다. 단일 세포 반응기 내의 관심 분자는 상이한 세포로부터의 관심 분자가 서로 접촉하거나 혼합하지 않는 반응을 겪을 수 있다. 관심 분자는 세포에 존재하는 핵산, 단백질 또는 다른 분자일 수 있다. 핵산은 DNA, RNA, mRNA, miRNA, tRNA 등일 수 있다. 핵산은 면역수용체 또는 면역수용체 쇄를 코딩할 수 있다.
일부 경우에서, 고체 지지체는 일괄 처리될 수 있다. 예컨대, 고체 지지체는 비드일 수 있으며, 이 경우 모든 비드 상의 모든 분자가 수용액 중의 반응물에 접근할 수 있도록 많은 비드를 수용액의 연속 부피에 침지시킬 수 있다. 예컨대, 고체 지지체는 더 큰 고체 표면에 패턴화된 고체 마이크로웰의 표면일 수 있다. 이 경우 모든 마이크로웰 상의 모든 분자가 수용액의 반응물에 접근할 수 있도록 전체 고체 표면을 수용액의 연속 부피에 침지시킬 수 있다.
단일 세포 반응기: 모양 및 형태
단일 세포 반응기는 장벽이 상이한 단일 세포 반응기의 내용물이 서로 접촉하는 것을 제한하는 장벽을 가질 수 있다.
단일 세포 반응기가 장벽을 갖는 경우, 단일 세포 반응기는 용기일 수 있다. 이 경우 단일 세포 반응기는 고체-벽 또는 액체-벽일 수 있다. 장벽은 오일 장벽, 고체 장벽 또는 다른 장벽일 수 있다. 예컨대, 단일 세포 반응기의 장벽은 튜브, 웰, 마이크로웰 또는 유중수 액적일 수 있다. 일부 경우에서, 단일 세포 반응기는 에멀젼 중의 유중수 액적이다. 유중수 액적을 단일 세포 반응기로 사용하면 수백만개 이상의 이러한 액적이 몇분에서 몇시간 내에 생성될 수 있으므로 매우 높은 처리량을 제공할 수 있다. 유중수 액적의 생성은 볼텍싱하거나 유동-포커싱 미세유체 칩과 같은 미세유체 칩을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 에멀젼은 미세유체 디바이스를 사용하여 수동적으로 형성된다. 이들 방법은 스퀴징, 드립핑, 분사, 팁-스트리밍, 팁-멀티-브레이킹 등을 포함할 수 있다. 수동적 미세유체 액적 생성은 2개의 상이한 유체의 경쟁력을 변경함으로써 입자 수, 크기 및 직경을 제어하도록 조정될 수 있다. 이들 힘은 두 용액의 혼합에 대한 모세관, 점도 및/또는 관성력일 수 있다.
일부 실시양태에서, 에멀젼은 미세유체 칩의 능동적 제어에 의해 형성된다. 능동 제어에서, 액적 생성은 전기, 자기 또는 구심력과 같은 외력 적용을 통해 조작될 수 있다. 미세유체 칩에서 액적의 능동적 조작을 제어하는 인기있는 방법은 오일과 물과 같은 2개의 혼합 용액의 유체 속도를 변화하여 내재력을 변형하는 것이다.
역전사 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 표준 분자 생물학 반응은 유중수 에멀젼에서 수행될 수 있다. 계면활성제는 에멀젼을 안정화시키기 위해 수성 또는 오일 상에 첨가될 수 있다.
일부 경우에서, 단일 세포 반응기는 장벽을 갖지 않는다. 예컨대, 히드로겔 입자(예컨대, ~100 마이크론 직경의 아가로스 입자)는 단일 세포로부터의 관심 분자가 안정적으로 부착되는 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 히드로겔의 수성 내용물은 관심 분자와 반응할 수 있는 반응물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 분자가 히드로겔 입자의 중합체 매트릭스에 안정적으로 부착되기 때문에, 상이한 세포의 관심 분자는 서로 접촉하거나 혼합하지 않는다.
다른 예로서, 비-다공성 입자(예컨대, ~10 마이크론 직경의 폴리스티렌 입자)는 단일 세포로부터의 관심 분자가 안정적으로 부착되는 표면을 포함할 수 있다. 고체 입자는 입자의 표면 상에서 관심 분자와 반응하는 반응물을 포함하는 용액에 침지될 수 있다. 이 경우에서, 입자는 이를 둘러싼 용액과 함께 단일 세포 반응기를 구성한다. 일부 경우에서, 이러한 비-다공성 입자가 용기에 추가로 포함될 수 있다. 예컨대, 단일 세포 반응기는 에멀젼 액적의 액체로 둘러싸인 비드이거나 웰의 액체로 둘러싸인 비드일 수 있다.
단일 세포 반응기: 고체 지지체 - 일반
다양한 타입의 고체 지지체 및 다양한 부착 화학을 이용하여 단일 세포로부터의 관심 분자가 안정적으로 회합될 수 있는 고체 지지체를 제공할 수 있다. 본 개시내용은 임의의 특정 타입의 고체 지지체 물질 또는 구성으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
고체 지지체는 편평하거나 평면일 수 있거나, 실질적으로 상이한 입체구조를 가질 수 있다. 예컨대, 고체 지지체는 입자, 비드, 가닥, 침전물, 겔, 졸-겔, 시트, 튜브, 구체, 컨테이너, 모세관, 패드, 슬라이스, 필름, 플레이트, 딥스틱, 슬라이드 등으로 존재할 수 있다. 자기 라텍스 비드 및 산화철 입자와 같은 자기 비드 또는 입자는 고체 기재의 예이다.
고체 지지체를 형성할 수 있는 물질의 예는 유리 또는 다른 세라믹, 플라스틱, 중합체, 금속, 준금속, 합금, 복합재, 유기물 등을 포함한다. 예컨대, 고체 지지체는 규소, 실리카, 석영, 유리, 제어된 다공성 유리, 탄소, 알루미나, 티타니아, 산화탄탈, 게르마늄, 질화규소, 제올라이트 및 갈륨 비소로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함할 수 있다. 금, 백금, 알루미늄, 구리, 티타늄 및 그들의 합금과 같은 많은 금속도 고체 지지체로 사용할 수 있는 옵션이다. 또한, 많은 세라믹 및 중합체를 고체 지지체로 사용할 수도 있다. 또한, 고체 지지체로서 사용될 수 있는 중합체는 폴리스티렌; 폴리(테트라)-플루오로에틸렌(PTFE); 폴리비닐리덴플루오라이드; 폴리카르보네이트; 폴리메틸메타크릴레이트; 폴리비닐에틸렌; 폴리에틸렌이민; 폴리(에테르에테르)케톤; 폴리옥시메틸렌(POM); 폴리비닐페놀; 폴리락타이드; 폴리메타크릴이미드(PMI); 폴리아트켄술폰(PAS); 폴리프로필렌; 폴리에틸렌; 폴리히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA); 폴리디메틸-실록산; 폴리아크릴아미드; 폴리이미드; 및 블럭-공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 어레이를 위한 기재는 규소, 실리카, 유리, 및 중합체를 포함한다. 고체 지지체는 단일 물질(예컨대, 유리), 물질의 혼합물(예컨대, 공중합체) 또는 상이한 물질의 다층(예컨대, 소분자의 단층으로 코팅된 금속, BSA로 코팅된 유리 등)으로 구성될 수 있다.
고체 지지체의 구성은 임의의 적절한 형태일 수 있으며, 예컨대 비드, 구체, 입자, 과립, 겔, 졸-겔, 자가 조립된 단층(SAM) 또는 표면(편평할 수 있거나 성형된 피처를 가질 수 있음)을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 반고체 지지체를 포함할 수 있다. 고체 지지체의 표면은 평면, 실질적으로 평면 또는 비-평면일 수 있다. 고체 지지체는 다공성이거나 비-다공성일 수 있으며, 팽윤 또는 비-팽윤 특징을 가질 수 있다. 고체 지지체는 웰, 함몰지(depression) 또는 다른 컨테이너, 용기, 피처 또는 위치(location)의 형태로 구성될 수 있다. 복수의 고체 지지체는 시약의 로봇 전달을 위해 또는 레이저 또는 다른 조명 및 CCD, 공초점 또는 편향 광 수집을 포함하는 검출 수단에 의해 어드레스할 수 있는 다양한 위치에서 어레이에 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 고체 지지체는 비드(입자와 동의어) 형태이다. 비드는 생물학적, 비-생물학적, 유기, 무기, 중합체, 금속 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 기재 물질로 제조될 수 있다. 비드의 표면 또는 내부는 화학적으로 변형될 수 있으며, 임의의 타입의 처리 또는 코팅, 예컨대 도구 분자와의 결합 상호 작용을 허용하는 반응성 기를 함유하는 코팅이 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 고체 지지체는 세포일 수 있다. 세포는 고체 지지체일 수 있는 소스 면역수용체 발현 세포일 수 있다(예컨대, TRA 유전자/mRNA 및 TRB 유전자/mRNA를 갖는 소스 T 세포). 세포는 포름알데히드, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 또는 유사한 고정제, 또는 이들의 조합을 사용하여 고정될 수 있다. 고정 후 트리톤-X100과 같은 세제를 사용하여 세포를 투과가능하게 할 수 있다. 고정되고 투과 가능하게 된 세포는 다공성 입자, 입자 및 고체 지지체로 간주될 수 있다. 세포가 고정되어 있기 때문에, TRA 및 TRB 함유 DNA(게놈 DNA의 일부) 및 mRNA는 세포에서 확산이 제한되거나 세포에 안정적으로 부착될 수 있다. 세포가 투과 가능하게 되고 다공성이기 때문에, 역전사효소, DNA 폴리머라제, 프라이머, 탬플릿 스위칭 올리고(TSO)와 같은 시약을 세포로 확산시켜 DNA 또는 RNA(예컨대, TRA 및 TRB mRNA)와 접촉하여 역전사, 프라이머 확장 및 템플릿 스위칭과 같은 반응을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비드는 신속한 단리 및/또는 정제를 용이하게 하는 방식으로 생성될 수 있다. 예컨대, 자기 비드는 플레이트 웰 내의 액상으로부터 비드를 신속하게 단리하기 위해 자기장을 적용함으로써 조작될 수 있다.
단일 세포 반응기: 고체 지지체 - 히드로겔
고체 지지체는 히드로겔을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 히드로겔 입자일 수 있다. 히드로겔은 기존의 방법을 이용하여 히드로겔 입자로 제조될 수 있다. 예컨대, 히드로겔의 졸 상태 또는 전구체는 유중수 에멀젼으로 제조될 수 있다. 수성 액적은 (예컨대, 전구체의 중합에 의해 또는 아가로스와 같은 열 가역성 히드로겔에 대한 온도를 낮춤으로써) 겔 상태로 변화되어 '유중히드로겔' 에멀젼을 생성할 수 있다. 전구체의 중합은 빛에 의해 또는 유상에 개시제 또는 촉진제(예컨대, TEMED)를 첨가하여 촉발될 수 있다. 이 에멀젼은 해유화되어 수용액에 현탁된 히드로겔 입자를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 히드로겔은 겔 상과 용액(졸) 상 사이에서 가역적일 수 있는 가역적 히드로겔이다. 일부 실시양태에서, 가역성 히드로겔의 겔 상과 졸 상 사이의 전환은 온도에 의해 제어된다(즉, 열 제어되거나 열 가역성). 예컨대, 열 제어된 가역성 (또는 열 가역성) 히드로겔은 아가로스 히드로겔일 수 있다. 가역성 히드로겔의 유용한 특성은 졸 상에서 포획제, 포획제에 부착된 분자, 및 다른 관심 분자가 자유롭게 확산되어 특정 반응을 보다 효율적으로 만들 수 있다는 것이다.
예컨대, 열 반응성 중합체를 사용함으로써 열 민감성 또는 열 가역성 히드로겔을 제공하는 다른 방법이 있다. 온도 민감성 중합체는 양친매성 이블록(AB), 삼블록(ABA 또는 BAB 타입) 또는 다중 블록 공중합체를 생성하기 위해 소수성 블록을 친수성 블록으로 중합 후 그래프팅하거나 공중합함으로써 합성될 수 있다. A는 PEG(폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)로도 공지됨)와 같은 친수성 블록이고 B는 폴리에스테르, 폴리(프로필렌 옥사이드)(PPO)(폴리(프로필렌 글리콜)(PPG)로도 불림), 또는 또는 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)(PNIPAm)와 같은 소수성 블록이다. 양친매성 블록 공중합체는 물에서 자가 조립되어 저온에서 친수성 블록의 외층과 소수성 블록의 코어를 갖는 미셀을 형성하며, 고온에서 미셀의 회합은 겔화를 촉발한다. 열 반응성 중합체 용액이 겔로 변하는 온도를 겔화 온도라고 한다. Pluronic®(BSAF) 또는 Synperonic® PE(ICI)로 상업적으로 공지된 폴록사머(ABA 타입 PEO-PPO-PEO 중합체)를 사용하여 열 민감성 히드로겔을 형성할 수 있다. Pluronic®의 수용액은 자가 조립되어 주위 온도에서 미셀을 형성하며, 체온에서 미셀의 회합에 의해 겔화가 발생한다. Pluronic®의 다중블록 공중합체는 각각 포스겐 또는 헥사 메틸렌 디이소시아네이트(HDI)를 결합제로 사용하여 PEO 및 PPO 분절 또는 Pluronics®를 결합함으로써 제조될 수 있다. 폴리(ε-카프롤락톤)(PCL) 및 폴리(락트산)(PLA)와 같은 지방족 에스테르는 촉매로서 주석 옥토에이트(Sn(oct)2)를 사용하여 상응하는 ε-카프롤락톤(CL) 및 락트산(LA) 단량체의 개환 중합(ROP)을 통해 Pluronic®의 말단에 커플링되어 가수분해로 분해 가능한 Pluronic® 히드로겔을 제조할 수 있다. 산 불안정한 아세탈 결합을 기반으로 하는 Pluronic®의 다중 블록 공중합체는 p-톨루엔술폰산 무수물(p-TSA) 촉매의 존재 하에 Pluronic® 및 디-(에틸렌 글리콜)디비닐 에테르(DEGDVE)의 반응에 의해 생성될 수 있다.
PLA, PCL, 폴리(글리콜산)(PGA) 및 폴리[(R)-3-히드록시부티레이트](PHB)와 같은 지방족 에스테르를 갖는 PEG를 기반으로 하는 열 가역성 히드로겔을 사용할 수 있다. 예컨대, ABA 타입 PEG-폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)-PEG(PEG-PLGA-PEG) 삼블록 공중합체는 가수분해로 분해 가능한 히드로겔을 형성하였다. 공중합체는 2단계로 합성될 수 있다. 첫째, 모노메톡시 PEG-PLGA(MPEG-PLGA)의 이블록 공중합체는 촉매로서 Sn(oct)2의 존재 하에 MPEG 상의 D,L-락타이드(DLLA) 및 글리콜라이드(GA)의 ROP를 통해 합성될 수 있으며, 이어서, HDI 커플링제를 사용하여 이블록 MPEG-PLGA 공중합체를 서로 커플링시킴으로써 삼블록 PEG-PLGA-PEG 공중합체가 제조될 수 있다. 공중합체 용액은 저온에서 존재할 수 있지만, 37℃에서는 겔이 된다(졸에서 겔로의 전환). 중앙 PEG 블록이 측면에 있는 PLGA 블록을 갖는 BAB 타입 삼블록 공중합체(PLGA-PEG-PLGA)는 커플링제 없이도 PEG 상에 DLLA 및 GA의 ROP를 통해 합성될 수 있다. PLGA-PEG-PLGA는 PEG-PCLA-PEG와 유사한 졸에서 겔로의 전환 경향을 나타낸다. 이들 히드로겔의 겔화 및 분해는 소수성 및 친수성 블록의 분자량, 소수성 블록의 조성, 중합체 농도 및 첨가제를 다양하게 하여 조정될 수 있다. PLGA-PEG-PLGA의 겔화 거동은 다양한 말단기(즉, 히드록실, 아세틸, 프로피오닐 및 부타노일기)의 통합에 의해 조정될 수 있다.
PNIPAm은 실온에서 수용액에 용해되지만 코일에서 소구체로의 전환으로 인해 32℃(상 전환 온도) 초과에서 침전된다. PNIPAm을 다른 중합체와 통합하면 온도 상승에 반응하여 수용액에서 졸에서 겔로의 상 전환을 나타내는 공중합체가 생성될 수 있다. 라디칼 중합은 NIPAm을 다른 메타크릴레이트 또는 아크릴레이트 단량체/중합체와 통합하는 데 사용하여 PNIPAm 기반 중합체를 생성할 수 있다. 예컨대, PNIPAm-폴리(2-메타-크릴로일옥시에틸 포스포릴 콜린)-PNIPAm(PNIPAm-MPC-PNIPAm) 공중합체는 원자 이동 라디칼 중합(ATRP)을 통해 합성될 수 있다. NIPAm의 ATRP는 (1) 마크로-개시제의 제조 및 (2) 마크로-개시제에 NIPAm을 첨가하여 블록 공중합체를 생성하는 2단계로 발생할 수 있다. 중합체 용액은 네트워크 형성 동안 중합체 쇄 간의 소수상호 작용으로 인해 온도가 32℃ 초과로 상승함에 따라 겔을 형성할 수 있다.
열 반응성 폴리포스파젠은 또한 온도가 상승함에 따라 수용액에서 졸에서 겔로의 상 전환을 나타낼 수 있다. 이들 중합체는 다단계 합성을 통해 제조될 수 있다. 먼저, 염화알루미늄(AlCl3)을 촉매로 사용하는 헥사클로로사이클로트리포스파젠의 용융 중합 반응을 통해 디클로로포스파젠 중합체를 합성할 수 있다. 이어서, 친수성 PEG 블록 및 소수성 블록을 디클로로포스-파젠 중합체 골격에 접합하여 히드로겔 마크로머를 수득할 수 있다. 소수성 블록은 디-, 트리- 및 올리고-펩티드 또는 단일 변형된 아미노산(예컨대, L-이소류신 에틸 에스테르(IleOEt), D,L-류신 에틸 에스테르(LeuOEt), L-발린 에틸 에스테르(ValOEt))일 수 있다.
MPEG 및 폴리(프로필렌 푸마레이트)(PPF)로 이루어진 ABA-타입 삼블록 공중합체는 PPF 상의 불포화된 이중 결합의 가교결합을 통해 더욱 안정화될 수 있는 열 민감성 겔을 생성할 수 있다.
거울상이성질체 PEG-P(L-락타이드)-PEG(PEG-PLLA-PEG) 및 PEG-P(D-락타이드)-PEG(PEG-PDLA-PEG) 삼블록 공중합체의 혼합은 졸에서 겔로의 전환을 유도할 수 있다. 히드로겔은 온도가 37℃로 증가될 때 형성될 수 있으며 70℃ 초과의 용액이 될 수 있다. 마찬가지로, 히드로겔은 거울상이성질체 PEG-(PLLA)8 및 PEG-(PDLA)8 스타 블록, 및 PEG-(PLLA)2 및 PEG-(PDLA)2 삼블록 공중합체의 입체복합체화에 의해 형성될 수 있다.
합성 중합체의 자가 조립에 추가하여, 합성 분자로 화학적으로 변형된 천연 물질도 수성 매질에서 자가 조립하여 히드로겔을 형성할 수 있다. 예컨대, 자연적으로 풍부한 키틴의 부분적 탈아세틸화로부터 유도된 다당류인 키토산이 히드로겔 형성에 사용될 수 있다. 키토산은 여러 중합체와 접합될 때 물리적 히드로겔을 형성할 수 있다. 예컨대, PEG-알데히드는 쉬프의 염기 반응을 통해 키토산에 커플링된 후 나트륨 시아노보로히드라이드(NaBH3CN)로 환원되어 PEG-g-키토산을 생성할 수 있다. 생성된 그래프트 중합체는 저온에서 용액이며 약 37℃ 온도에서 겔로 전환될 수 있다. 겔화는 중합체 쇄 사이의 소수상호 작용에 기인할 수 있으며, 이는 키토산 분절의 회합 및 PEG 이동성의 감소로 이어진다. 마찬가지로, Pluronic®-g-키토산은 가열 시 열 가역성 졸에서 겔로의 전환을 나타낸다.
폴리아크릴아미드는 히드로겔을 위한 중합체 프레임워크일 수 있다. 폴리아크릴아미드 겔은 액적에서 단량체(예컨대, 아크릴아미드) 및 가교제(예컨대, 비스-아크릴아미드)로부터 중합될 수 있으며, 이는 낮은 점도 및 높은 고정화 효율로 포획제를 쉽게 고정하는 것과 같은 몇몇 이점을 제공한다.
중합체의 자가 조립은 물리적으로 가교결합된 히드로겔을 제조하는 간단한 방법을 제공할 수 있다. 자가 조립은 수소 결합 및 소수 상호 작용과 같은 분자내 및 분자간 힘의 결과로 일부 중합체에서 발생한다. 이들 중합체의 수용액은 pH 및 온도와 같은 외부 자극에 반응하여 자가 조립 시 졸에서 겔로의 전환을 겪는다. 열 반응성 중합체의 자가 조립은 간단한 온도 변화로 히드로겔을 제조하는 방법이다.
또한, 알기네이트 및 아가로스와 같은 여러 다당류 기반 중합체를 고려할 수 있다. 알기네이트는 쉽게 유도체화될 수 있으며 포획제를 고정하는 데 많은 옵션을 제공한다(예컨대, 문헌(Pawer and Edgar, Biomaterials 33(2012), 3279) 참조). 중합체가 유도체화되지 않은 경우에도 여전히 포획제와 중합체 프레임워크 사이에 안정적인 물리적 회합을 달성할 수 있다. 예컨대, 큰 입자(예컨대, 마이크론-크기의 스트렙트아비딘-코팅된 비드)는 비유도체화된 중합체 프레임워크에 포착될 수 있으며 포획제는 큰 입자의 표면 또는 내부와 안정적인 물리적 회합을 형성할 수 있다.
일부 중합체의 경우, 겔화가 역전될 수 있다. 즉, 히드로겔 입자는 겔 상태에서 유체 상태로 전환될 수 있다. 즉, 겔이 용융될 수 있다. 이는 히드로겔 입자에서 표적 분자 또는 DNA를 회수하는 것과 같은 일부 상황에서 유용할 수 있다. 예컨대, 폴리아크릴아미드 겔에서 비스-아크릴아미드는 DATD(디알릴-타르타르디아미드), DHEBA(디히드록시에틸렌-비스-아크릴아미드) 및 BAC(비스-아크릴릴시스타민)와 같은 가교제로 대체될 수 있다. 이들 가교제는 여러 환원제 또는 산화제에 의해 절단될 수 있다. 알기네이트 겔은 EDTA에 의해 쉽게 용융될 수 있고, 아가로스 겔은 고온에서 용융될 수 있다.
단일 세포 반응기: 고체 지지체 - 히드로겔: 촉발된 겔화 및 경화된 입자
일부 경우에서, 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 포함하는 수용액은 중합 또는 비-중합 메카니즘을 통해 매트릭스를 형성함으로써 히드로겔로 전환될 수 있다. 이 과정을 겔화라고 한다. 이러한 수용액이 구획의 내용물일 때, 겔화 과정에 의해 형성된 히드로겔은 히드로겔 입자일 것이다. 구획(예컨대, 마이크로웰 또는 유중수 액적)의 수상의 내용물로부터 형성된 히드로겔 입자를 경화된 입자로 지칭한다.
중합 메카니즘에 의해 형성된 매트릭스의 예는 폴리아크릴아미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리아크릴아미드는 아크릴아미드와 비스-아크릴아미드의 단량체로 형성된 매트릭스일 수 있다. 중합 반응은 유리 라디칼에 의해 촉매되는 비닐 첨가일 수 있다. 반응은 과황산암모늄(APS)으로부터 유리 라디칼 형성을 유도하는 TEMED에 의해 개시될 수 있다. 유리 라디칼은 전자를 아크릴아미드/비스 아크릴아미드 단량체에 전달하여 이를 라디칼화하고 서로 반응시켜 폴리아크릴아미드 쇄를 형성한다. 비스-아크릴아미드의 부재 하에서 아크릴아미드는 다공성 겔이 아닌 긴 가닥으로 중합될 수 있다. 비스-아크릴아미드는 아크릴아미드 쇄를 가교결합하여 다공성 겔 매트릭스를 형성할 수 있다. 가교결합의 양 및 따라서 겔의 공극 크기 및 결과적인 분리 특성은 아크릴아미드 대 비스-아크릴아미드의 비율을 변경하여 제어될 수 있다. 비-중합 메카니즘에 의해 형성된 매트릭스의 예는 아가로스 겔을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아가로스는 다당류일 수 있다. 아가로스의 단량체 단위는 D-갈락토스 및 3,6-안히드로-L-갈락토피라노스의 이당류일 수 있다. 특정 온도(겔화 온도), 예컨대 35℃ 미만의 수용액에서 이들 중합체 가닥은 수소 결합 및 정전기 상호 작용과 같은 비공유적 상호 작용에 의해 다공성 겔 구조로 함께 유지될 수 있다. 겔화 온도 초과로 온도를 높이기 위해 용액을 가열하면 이들 비공유적 상호 작용을 파괴하고 가닥을 분리할 수 있다. 이어서, 용액이 냉각되면 이들 비공유적 상호 작용이 다시 설정되고 겔이 형성될 수 있다. 따라서, 아가로스 겔은 수소 결합 및 정전기적 상호 작용을 통한 겔화에 의해 형성될 수 있다. 겔화 및 용융 온도는 아가로스의 타입에 따라 다를 수 있다. 겔리듐(Gelidium)으로부터 유도된 표준 아가로스는 겔화 온도가 34-38℃(93-100°F)이고 용융 온도가 90-95℃(194-203°F)인 반면, 그라실라리아(Gracilaria)로부터 유도된 것은 그의 더 높은 메톡시 치환에 기인하여 겔화 온도가 40-52℃(104-126°F)이고 용융 온도가 85-90℃(185-194°F)일 수 있다. 용융 및 겔화 온도는 겔 농도, 특히 1% 미만의 낮은 겔 농도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 겔화 및 용융 온도는 일반적으로 지정된 아가로스 농도에서 제공된다. 천연 아가로스는 하전되지 않은 메틸기를 함유할 수 있으며 메틸화 정도는 겔화 온도에 직접적으로 비례할 수 있다. 그러나, 합성 메틸화는 역효과를 가질 수 있으며, 이로써 증가된 메틸화는 겔화 온도를 낮출 수 있다. 화학적 변형을 통해 용융 및 겔화 온도가 상이한 다양한 화학적으로 변형된 아가로스를 사용할 수 있다.
액적에서 폴리아크릴아미드 히드로겔 입자를 제조할 때 중합 개시제는 과황산암모늄(APS) 또는 수용성 광개시제일 수 있다. APS가 개시제로 사용되는 상황에서, 촉진제 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 캐리어 오일에 첨가할 수 있다. 예컨대, 2.5 mL의 캐리어 오일 및 10 μL의 TEMED를 조합하여 TEMED 함유 캐리어 오일을 형성할 수 있다. APS 및 TEMED 함유 캐리어 오일이 사용되는 경우, 생성된 에멀젼을 65℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 폴리아크릴아미드 히드로겔의 중합을 유도할 수 있다. 다른 수용성 광개시제가 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 광개시제는 365 nm UV(핵산에 안전한 것으로 간주될 수 있음)로 여기될 수 있다. (a) 예컨대 문헌(Kojima et al., Chem Mater 10(1998):3429)의 방법에 의해 합성될 수 있는 나트륨 4-[2-(4-모르폴리노)벤조일-2-디메틸아미노]-부틸벤젠술포네이트(MBS) 및 b) 예컨대, 문헌(Ayub et al., Advanced Materials Research 1125(2015):84)에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있는 2,2-디메톡시-2-페닐 아세토페논 및 메틸화된-β-사이클로덱스트린에 의해 형성된 분자 복합체(DMPA:MβCD 복합체)와 같은 LAP 이외의 여러 옵션이 존재한다.
알기네이트가 중합체 프레임워크로 사용되는 상황에서, 겔화는 칼슘 이온을 미세유체 디바이스에서 액적에 직접적으로 전달하거나 광케이지된 칼슘을 방출함으로써 촉발될 수 있다. 아가로스가 중합체 프레임워크로 사용되는 상황에서, 겔화는 온도를 낮춤으로써 촉발될 수 있다.
생물학적 입자가 다중 파티션에 분포되고 표적 핵산이 방출된 후, 파티션 내의 단량체 및 가교제가 중합되어 히드로겔을 지지하는 가교결합된 중합체 네트워크를 형성할 수 있다. 이러한 중합을 촉발하기 위해 여러 방법이 이용될 수 있다. 예시적인 방법은 과황산암모늄(APS) 및 N,N,N',N'-테트라메틸에탄-1,2-디아민(TEMED)을 사용하는 것일 수 있다. APS는 (예컨대, 액적에서) 수상에 포함될 수 있으며 TEMED는 분할 오일에 추가될 수 있다. 액적 생성 후, 에멀젼은 장기간(예컨대, 하룻밤) 동안 (예컨대, 65℃에서) 가열되어 중합을 촉발할 수 있다. 그러나, 일부 적용에서 이러한 과정은 표적 핵산의 품질 유지와 같은 다른 측면에서 어려움을 야기할 수 있다. 따라서, 일부 경우에서, 중합을 더 빠르게 온화한 처리로 촉발하는 것이 바람직할 수 있다. 장파장 UV(예컨대, > 360 nm) 광-개시는 옵션일 수 있다. 장파장 UV는 일반적으로 대부분의 생물학적 분자(단백질 및 핵산 포함)에 대해 안전한 것으로 간주된다. 편리한 LED 기반 광원은 적어도 360 nm, 361nm, 362nm, 363nm, 364nm, 365 nm 또는 그 초과의 조명에 사용될 수 있다.
많은 분자 또는 분자 복합체는 장파장 UV와 적합한 수용성 광 개시제, 예컨대 리튬- 및 마그네슘 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(TMPPL 및 TMPPM)일 수 있다. 이들은 수용액에서 아크릴아미드 및 메타크릴아미드와 같은 적절한 단량체의 유리 라디칼 중합을 위한 효과적인 수용성 광 개시제이다. TMPPL(LAP로도 불림)을 사용하여 생체적합성 히드로겔 형성을 촉발할 수 있다. 마찬가지로, 2-벤질-2-(디메틸아미노)-1-(4-모르폴리노페닐)-1-부탄온(BDMB)을 통해 나트륨 4-[2-(4-모르폴리노)벤조일-2-디메틸아미노]-부틸벤젠술포네이트(MBS)를 수용성 장파장 UV 광개시제로 사용할 수 있다. 수-불용성 광 개시제는 또한, 예컨대 메틸화된-β-사이클로덱스트린(MβCD)과의 복합체 형성에 의해 수용성 형태로 제형화될 수 있다. 예컨대, 수용성 광개시제로 MβCD와 복합체 형성된 2,2-디메톡시-2-페닐 아세토페논(DMPA)을 사용할 수 있다.
단일 세포 반응기: 고체 지지체에 대한 부착 화학 - 일반
관심 분자는 정전기 상호 작용 또는 물리적 포착과 같은 비-특이적 방식으로 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예컨대, 카르복실 분자로 추가로 코팅된 마그네타이트 층으로 둘러싸인 폴리스티렌으로 제조된 고체상의 가역적 고정화(SPRI) 비드는 "밀집제(crowding agent)" 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 염(예컨대, 20% PEG, 2.5 M)의 존재 하에서 폴리뉴클레오티드에 안정하게 결합할 수 있다. 마찬가지로, 실리카 비드는 구아니듐의 존재 하에 폴리뉴클레오티드에 안정적으로 결합할 수 있다. 다양하게 양으로 하전된 비드가 폴리뉴클레오티드에 결합하는 것으로 기재되었다. 포착의 예로서, 고체 지지체가 히드로겔이고 히드로겔의 공극 크기보다 큰 유체역학적 반경을 갖는 관심 분자인 경우, 관심 분자는 물리적 포착에 의해 히드로겔 기반 고체 지지체에 부착될 수 있다.
보다 특정한 부착을 위해 포획제를 사용할 수 있다. 포획제는 고체 지지체에 관심 분자(예컨대, 관심 폴리뉴클레오티드)의 안정한 부착을 매개하는 화학적 조성물일 수 있다. 포획제는 표적 분자에 대한 결합과 같은 다중 기능을 통해 안정된 부착을 매개할 수 있으며, 표적 분자와 반응하여 표적 핵산 분자 상에서 연장하는 프라이머 역할을 할 수 있다.
단일 세포 반응기: 고체 지지체에 대한 부착 화학 - 일반: 포획제
본원에 제공된 조성물 또는 방법은 포획제를 포함할 수 있다. 포획제는 단일 세포 반응기 내에서 관심 분자(표적 분자와 동의어)를 고정하거나 포착하는 앵커로서 역할을 할 수 있다. 한편으로, 포획제는 표적 분자에 결합할 수 있다. 다른 한편으로, 포획제는 고체 지지체와 회합하여 자신의 확산을 제한할 수 있으며, 결과적으로 표적 분자의 확산이 제한된다. 일부 실시양태에서, 포획제는 히드로겔의 프레임워크 내에서 확산 제한제에 연결된다. 표적 분자는 핵산 템플릿 또는 이의 카피, 예컨대 면역수용체 쇄를 코딩하는 핵산 또는 이의 카피일 수 있다.
포획제는 2개의 모이어티: 표적화 모이어티 및 고정화 모이어티를 포함할 수 있다. 고정화 모이어티는 비-다공성 고체 지지체 및 히드로겔과 같은 다공성 고체 지지체를 포함하는 고체 지지체에 포획제를 부착시키는 역할을 할 수 있다. 히드로겔의 경우, 고정화 모이어티는 히드로겔 또는 확산 제한제를 지지하는 중합체 프레임워크(예컨대, 매트릭스)에 부착될 수 있다. 표적화 모이어티는 핵산 템플릿 또는 이의 카피와 안정적인 상호 작용을 하는 데 책임이 있을 수 있다. 포획제는 표적화 모이어티 및 고정화 모이어티가 동일한 분자의 2개 부분이고 공유적으로 결합된 하나의 분자일 수 있다. 포획제는 하나 초과의 분자일 수 있으며, 여기서 표적화 모이어티 및 고정화 모이어티는 링커를 통해 공유적으로 연결되거나 비공유적으로 연결될 수 있다. 예컨대, 고정화 모이어티는 중합체 프레임워크에 연결된 제1 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 표적화 모이어티는 제1 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 포획제의 표적화 모이어티와 고정화 모이어티 사이의 상호 작용 타입에는 제한이 없음을 이해해야 한다.
일부 실시양태에서, 포획제는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 화학적 기이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드 압타머이다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 역전사 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 역전사 프라이머는 폴리-데옥시-티미딘 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편, 또는 펩티드 압타머이다. 일부 실시양태에서, 화학적 기는 반응성 기이다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 핵산 템플릿의 핵염기와 공유 결합을 형성한다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 NHS 에스테르, 말레이미드 기, 또는 표지-IT 링커 및 반응성 기이다. 일부 실시양태에서, 핵염기는 구아닌이다.
예컨대, 폴리뉴클레오티드가 관심 분자인 경우, 표적화 모이어티는 표적 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 표적화 모이어티는 세포의 모든 mRNA 종과 하이브리드화하는 역전사 프라이머일 수 있다. 표적화 모이어티는 특정한 관심 DNA 또는 RNA와 하이브리드화하는 특정한 또는 설계된 서열을 갖는 프라이머일 수 있다.
적용 및 표적 분자에 따라, 표적화 모이어티는 프라이머(폴리머라제 또는 역전사효소에 의해 확장될 수 있음), 표적 분자에 비공유적으로 안정적으로 결합하는 친화성 작용제, 또는 표적 분자와 공유 결합을 형성하는 결합제일 수 있다. 일부 경우에서, 표적화 모이어티는 염기-쌍형성에 의해 그의 표적 폴리뉴클레오티드 분자(예컨대, 면역수용체 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 카피)에 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 프라이머 상의 어댑터 서열(예컨대, ARS)과 하이브리드화하여 프라이머를 고체 지지체에 연결할 수 있는 ACO이다. 일부 경우에서, 표적화 모이어티는 프라이머로 작용하는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 RT 프라이머 또는 PCR 프라이머이다. 프라이머로부터의 연장 생성물은 또한 포획제를 통해 고체 지지체에 연결될 수 있다.
포획제는 고정화 모이어티를 포함할 수 있다. 고정화 모이어티는 포획제를 고체 지지체에 연결할 수 있다. 포획제는 링커를 포함하거나 링커를 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 링커는 미리 형성되거나(예컨대, PEG 링커) 포획제 상의 제1 반응성 기 및 고체 지지체 상에 고정된 제2 반응성 기에 의해 형성될 수 있다.
고정화 모이어티는 NHS 에스테르, 비오틴, 말레이미드기, 티올기, 아지드기, 아비딘 또는 스트렙트아비딘, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드, 비오틴기, 메타크릴 기 또는 이들의 반응 생성물일 수 있다. 고정화 모이어티는 반응성 기를 포함할 수 있다.
반응성 기의 예는 숙신이미딜 에스테르, 아미드, 아크릴아미드, 아실 아지드, 아실 할라이드, 아실 니트릴, 알데히드, 케톤, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 무수물, 아릴 할라이드, 및 아지리딘, 보로네이트, 카르보디이미드, 디아조알칸, 에폭사이드, 할로아세트아미드, 할로플라티네이트, 할로트리아진, 이미도 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 포스포르아미다이트, 실릴 할라이드, 술포네이트 에스테르, 술포닐 할라이드, 아민, 아닐린, 티올, 알콜, 페놀, 히라진, 히드록실아민, 카르복실산, 글리콜 및 헤테로사이클을 포함한다.
일부 실시양태에서, 고정화 모이어티 상의 반응성 기는 고체 지지체 상의 친핵성 모이어티에 반응할 수 있는 친전자성 모이어티이거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 친핵성 모이어티 또는 친전자성 모이어티는 고정화 모이어티 또는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 친전자성 모이어티는, 예컨대 카르보닐기, 술포닐기, 알데히드기, 케톤기, 힌더드 에스테르기, 티오에스테르기, 안정한 이민기, 에폭사이드기, 아지리딘기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용에서 사용될 수 있는 반응성 기 화학은 상기 항목에 한정되지 않는다. 예컨대, 다른 실시양태에서, 제1 반응성 기와 제2 반응성 기 사이의 반응은 친쌍극자체 반응을 통해 진행될 수 있다. 예컨대, 제1 반응성 기는 아지드일 수 있고 제2 반응성 기는 알킨일 수 있다. 대안적으로, 제1 반응성 기는 알킨일 수 있고 제2 반응성 기는 아지드일 수 있다. 아지드 또는 알킨 함유 폴리뉴클레오티드를 수반하는 고리화첨가 반응은 제자리에서 촉매량으로 Cu(II)를 Cu(I)로 환원하기 위한 환원제의 존재 하에 Cu(II)(예컨대, 촉매량의 CuSO4의 형태)를 첨가하여 수성 조건 하에서 실온에서 수행될 수 있다. 환원제는 아스코르베이트, 금속 구리, 퀴닌, 히드로 퀴논, 비타민 K, 글루타티온, 시스테인, Fe2+, Co2+, 및 인가된 전위를 포함한다. 본 개시내용에 이용될 수 있는 또 다른 반응성 화학은 스타우딩거(Staudinger) 리게이션 및 올레핀 복분해 화학(예컨대, 문헌(Mahal et al., (1997) Science 276:1125-1128) 참조)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 포획제 (또는 관심 분자)와 고체 지지체 사이의 부착은 비공유적 부착이다. 예컨대, 적합한 산성 기를 갖는 포획제 (또는 관심 분자)는 히드록실 또는 다른 음으로 하전된 기를 보유하는 고체 지지체와 강한 회합을 형성할 수 있다. 이 시스템의 다른 변형에서, 서로에 대해 강한 친화성을 갖는 다른 타입의 모이어티는 포획제 (또는 관심 분자) 및 고체 지지체 상의 반응성 기에 포함될 수 있다. 예컨대, 포획제 (또는 관심 분자)는 적합한 반응성 기를 통해 비오틴과 커플링될 수 있고, 고체 지지체는 아비딘으로 코팅될 수 있으며, 그 결과 포획제 (또는 분자의 관심)와 고체 지지체 사이에 매우 강한 비공유적 결합이 초래된다,
단일 세포 반응기: 고체 지지체 - 히드로겔에 대한 부착 화학
고체 지지체가 히드로겔을 포함하는 경우, 포획제의 고정화 모이어티는 히드로겔 또는 확산 제한제를 지지하는 중합체 프레임워크(예컨대, 매트릭스)에 부착될 수 있다.
고정화 모이어티는 중합체 프레임워크(예컨대, 히드로겔 프레임워크) 또는 확산 제한제 상의 반응성 기와 일반적인 고체 지지체를 위해 본원에 기재된 화학을 이용하여 반응될 수 있다. 특정한 경우에서, 포획제와 중합체 프레임워크 사이의 상호 작용은 가역적일 수 있으므로 필요한 경우 포획제가 프레임워크에서 방출될 수 있다. 예컨대, 고정화 모이어티가 스트렙트아비딘을 포함하고 중합체 프레임워크가 비오틴을 포함하는 경우, 스트렙트아비딘과 비오틴 사이의 상호 작용은 변성제(예컨대, 포름아미드)의 존재 하에 과량의 유리 비오틴을 첨가하고 가열함으로써 역전될 수 있다. 또 다른 예로서, 고정화 모이어티와 중합체 프레임워크 사이의 상호 작용이 핵산 하이브리드화를 통해 이루어지는 경우, 핵산 듀플렉스를 용융시키기 위해 온도를 증가시킴으로써 상호 작용이 역전될 수 있다.
일부 실시양태에서, 고정화 모이어티는 공유 결합 또는 비공유적 상호 작용을 통해 매트릭스 또는 중합체 프레임워크를 회합시킬 수 있다. 고정화 모이어티는 a) 중합체 프레임워크에 포함되는 화학물질, (b) 중합체 프레임워크와 직접적으로 안정하게 상호 작용하는 화학물질 또는 단백질, 또는 (c) 중합체 프레임워크와 간접적으로 안정하게 상호 작용하는 화학물질 또는 단백질을 포함할 수 있다. (a)의 예는 폴리아크릴아미드 겔로 공중합될 수 있는 메타크릴기일 수 있다. (b)의 예는 안정한 공유적 상호 작용을 형성하기 위해 1차 아민기와 반응할 수 있는 NHS 에스테르일 수 있다. 이 예는 중합체 프레임워크가 1차 아민기를 함유하는 경우 적용할 수 있다. b)의 또 다른 예는 안정한 공유적 상호 작용을 형성하기 위해 티올기와 반응할 수 있는 말레이미드일 수 있다. 이 예는 중합체 프레임워크가 티올기를 포함하는 경우 적용할 수 있다. (b)의 또 다른 예는 안정한 공유적 상호 작용을 형성하기 위해 C-C 이중 결합 함유기(예컨대, 말레이미드 및 아크릴레이트)와 반응할 수 있는 티올기이다. 이 예는 중합체 프레임워크가 C-C 이중 결합 함유기를 포함하는 경우 적용 가능할 수 있다. (b)의 또 다른 예는 안정한 공유적 상호 작용을 위해 알킨기와 반응할 수 있는 아지드기일 수 있다. 이 예는 중합체 프레임워크가 알킨기를 함유하는 경우 적용할 수 있다. (b)의 또 다른 예는 안정한 비공유적 상호 작용을 위해 비오틴과 상호 작용할 수 있는 아비딘 또는 스트렙트아비딘일 수 있다. 이 예는 중합체 프레임워크가 비오틴기를 함유하는 경우 적용할 수 있다. (b)의 또 다른 예는 안정한 비공유적 상호 작용을 형성하기 위해 역 상보적 서열의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드와 상호 작용할 수 있는 단일 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이 예는 중합체 프레임워크가 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 힘유하는 경우 적용할 수 있다. c)의 예는 비오틴일 수 있다. 이 예는 중합체가 비오틴을 함유하고 히드로겔이 스트렙트아비딘 사량체를 추가로 함유하는 경우 적용할 수 있다. 이 경우에서, 스트렙트아비딘의 하나의 단량체는 고정화 모이어티로서 비오틴과 안정하게 상호 작용할 수 있으며, 동일한 스트렙트아비딘의 또 다른 단량체는 중합체 상의 비오틴과 안정하게 상호 작용할 수 있다. 이러한 방식으로 고정화 모이어티는 중합체와 간접적으로 안정하게 상호 작용할 수 있다.
히드로겔 내에 핵산 분자를 포착하기 위해 핵산 분자가 히드로겔의 매트릭스 내에 고정되어 핵산 분자가 히드로겔 외부로 확산되는 것을 방지할 수 있다. 고정화는 핵산 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하고 또한 히드로겔의 매트릭스와 상호 작용하는 포획제를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획제는 핵산 템플릿에 연결된다. 일부 실시양태에서, 포획제는 핵산 템플릿의 카피에 연결된다. 포획제는 공유 결합 또는 비공유적 상호 작용을 통해 매트릭스에 결합할 수 있다.
고체 지지체가 히드로겔을 포함하는 경우, 히드로겔은 히드로겔 프레임워크에 포획 프로브 (또는 표적화 모이어티)를 부착하도록 기능화될 수 있다. 고정화 또는 확산 제한된 포획제(예컨대, ACO)로 변형된 히드로겔을 생성하는 것은 기능화된 히드로겔을 생성하는 예일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획제는 중합체 프레임워크에 연결된다. 일부 실시양태에서, 포획제는 확산 제한제에 연결된다(하기 참조). 기능화된 히드로겔을 생성하는 것은 관심 핵산 뿐만 아니라 관심 핵산에 의해 결합된 다른 분자가 (1) 히드로겔 내부 또는 외부로 확산되지 않거나 (2) 제어된 방식으로 히드로겔 내부 또는 외부로 확산될 수 있도록 히드로겔 내에서 관심 핵산을 제한하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 히드로겔은 히드로겔 입자의 형태이다.
고체 지지체가 중합 가능한 단량체 또는 겔화 가능한 중합체로 제조된 히드로겔인 경우, 고정화 모이어티는 중합체 및/또는 단량체와 공중합되는 화학물질, 중합체 및/또는 단량체 또는 확산 제한제와 직접적으로 안정하게 상호 작용하는 화학물질 또는 단백질, 또는 중합체 및/또는 단량체 또는 확산 제한제와 간접적으로 안정하게 상호 작용하는 화학물질 또는 단백질일 수 있다.
히드로겔 입자는 히드로겔 입자의 빌딩 블록을 직접 변형함으로써 기능화될 수 있다. 빌딩 블록은 중합 또는 비중합 메카니즘을 통해 히드로겔 또는 경화된 매트릭스를 형성할 수 있는 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체이다. 예컨대, 히드로겔 입자가 빌딩 블록의 중합에 의해 형성될 때, 포획제는 빌딩 블록에 부착될 수 있다. 따라서, 중합 동안 포획제는 중합체 프레임워크로 공중합될 수 있다. 대안적으로, 중간 분자(예컨대, 링커)는 도구 분자를 고정하는 데 사용될 수 있는 빌딩 블록에 부착될 수 있다. 히드로겔 입자의 빌딩 블록은 단량체일 수 있다. 단량체는 아크릴아미드, 비닐 아세테이트, 비닐 알콜, 메틸아크릴아미드 또는 아크릴산일 수 있다. 이 전략의 예는 AcryditeTM 변형된 올리고뉴클레오티드를 폴리아크릴아미드 히드로겔로 공중합하는 것이다. 이 예에서, 올리고뉴클레오티드는 포획 프로브의 예이다. 이 전략의 또 다른 예는 '기능화된 아크릴레이트/아크릴아미드'를 폴리아크릴아미드 히드로겔로 공중합하는 것이다. 기능화된 아크릴레이트/아크릴아미드는 접합 핸들을 함유할 수 있으며, 도구 분자는 아민-NHS 에스테르 반응, 클릭 화학 등과 같은 접합 화학을 통해 부착될 수 있다. 이 예에서, 접합 핸들은 중간 분자 역할을 할 수 있다. 기능화된 아크릴레이트/아크릴아미드의 예는 3-아지도프로필 메타크릴레이트(AzPMA)일 수 있으며, 여기서 아지도기는 클릭 화학을 통해 포획제가 부착될 수 있는 접합 핸들이다. 기능화된 아크릴레이트/아크릴아미드의 또 다른 예는 N-(3-아미노프로필)-메타크릴아미드이며, 여기서 (3-아미노프로필 측쇄 상의) 1차 아민기는 포획제가 NHS 에스테르를 통해 부착될 수 있는 접합 핸들이다.
히드로겔 입자는 빌딩 블록 대신 프레임워크를 변형함으로써 기능화될 수 있다. 히드로겔 입자를 형성한 후, 히드로겔 입자의 프레임워크는 포획제가 부착될 수 있도록 변형될 수 있다. 예컨대, 아가로스 히드로겔 입자의 다가 특징은 그의 반응성을 설명할 수 있으므로 히드록실 기능은 부분적으로 또는 전체적으로 유도체화될 수 있다. 이러한 방식으로, 아민, 카르복실, 술포네이트, 시아노 및 디클로로 트리아지닐과 같은 아가로스 겔의 중합체 쇄를 따라 여러 새로운 화학적 기능이 접목될 수 있다. 예컨대, 글리옥실 아가로스는 나중에 과요오드산나트륨으로 산화되어 글리옥실기를 생성할 수 있는 디올을 도입하기 위해 히드로겔 프레임워크의 1차 히드록실기를 글리시돌로 에테르화함으로써 제조될 수 있다. 아크릴산을 함유하는 히드로겔 상의 카르복실기의 변형은 또한, 예컨대 EDC 화학을 이용하여 쉽게 수행될 수 있다.
소분자, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 단백질을 히드로겔 프레임워크에 코플링하기 위한 대부분의 표준 기술이 여기에 적용될 수 있다. 일반적으로 사용되는 유도체화의 예는 카르복실 또는 아민기를 포함하지만 다른 기능기도 사용될 수 있다. 에폭시 링커는 적합한 단량체를 사용하여 중합 중에 도입될 수 있고, 알데히드 또는 티올기는 수성 조건에서 중합 후 절차 후에 도입될 수 있다. 클릭 화학은 기능화를 위해 활용될 수 있다. 클릭 화학 반응 및 클릭 화학 반응에 적합한 반응성 기는 말단 알킨, 아지드, 변형된(strained) 알킨, 디엔, 친디엔체(dieneophile), 알콕시아민, 카르보닐, 포스핀, 히드라지드, 티올 및 알켄을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 일부 실시양태에서, 아지드 및 알킨이 클릭 화학 반응에 사용된다.
중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 또는 단량체의 기능화를 이용하여 주어진 표적의 특정 포획을 허용할 수 있다. 특정한 경우에서, 원하는 작용기가 예비중합체 혼합물에 직접적으로 첨가되고 공중합될 수 있다. 이러한 접근법의 실행 가능성은 선택된 생체분자의 안정성 또는 중합 조건에 존재하는 특정 화학기의 교차 반응성에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 카르복실 또는 아민 작용기를 갖는 소량의 공단량체는 중합 단계 동안 사용되어 합성 후 단계에서 히드로겔의 추가 기능화를 허용할 수 있다. 이 접근법은 중합 반응 조건을 견딜 수 없는 분자의 접합을 위해 따를 수 있다.
단일 세포 반응기: 고체 지지체 - 히드로겔에 대한 부착 화학: 확산 제한제
일부 경우에서, 포획제는 히드로겔 내에 포획제를 포착하기 위해 확산 제한제에 고정될 수 있다.
확산 제한제는 히드로겔 내부 또는 외부로의 확산이 제한되는 작용제(예컨대, 화학 조성물)일 수 있다. 확산 제한제는 히드로겔 입자의 공극 크기보다 큰 유체역학적 반경을 가질 수 있다. 확산 제한제는 입자 또는 중합체일 수 있다. 입자는 자기 비드일 수 있다. 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴산 또는 PEG일 수 있다.
확산 제한제는 확산 제한 중합체일 수 있다. 확산 제한제는 포획제에 직접 접합된 긴 중합체 쇄일 수 있으므로 접합된 포획제는 중합체 프레임워크에 의해 얽힐만큼 충분히 클 수 있다. 예컨대, 포획제는 다수의 긴 PEG 쇄와 접합되어 표적 분자와 함께 포획제의 확산이 프레임워크 내에서 제한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 긴 중합체 쇄는 폴리아크릴아미드 쇄일 수 있다. 일부 다른 경우에서, 확산 제한제는 큰 입자(예컨대, 마이크론 크기의 스트렙트아비딘 코팅된 비드)일 수 있다. 큰 입자는 히드로겔의 공극 크기보다 클 수 있으므로 포획제가 큰 입자와 회합될 때 포획제는 히드로겔의 프레임워크 내에 포착된다.
확산 제한 중합체는 PEG 분자 또는 폴리아크릴아미드 분자일 수 있다. 확산 제한 중합체는 히드로겔의 기계적 무결성을 지지하는 프레임워크 형성에 참여하거나 참여하지 않을 수 있다.
확산 제한제는 하나 이상의 고분자량 중합체(예컨대, 분자량 3350, 8000 및 20,000의 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있으며, 이는 히드로겔의 공극 크기보다 더 큰 유체역학적 반경을 초래할 수 있거나 그렇지 않으면, 예컨대 히드로겔의 중합체 프레임워크와 얽힘으로써 히드로겔에 포착될 수 있다. 중합체 (또는 쇄)의 총 분자량은 5 kDa 내지 1000 kDa일 수 있다. 일부 경우에서, 중합체의 총 분자량은 5 kDa 내지 10 kDa, 10 kDa 내지 15 kDa, 15 kDa 내지 20 kDa, 20 kDa 내지 25 kDa, 25 kDa 내지 30 kDa, 30 kDa 내지 35 kDa, 35 kDa 내지 40 kDa, 40 kDa 내지 45 kDa, 또는 45 kDa 내지 50 kDa일 수 있다. 일부 경우에서, 중합체의 총 분자량은 50 kDa 내지 100 kDa, 100 kDa 내지 150 kDa, 150 kDa 내지 200 kDa, 200 kDa 내지 250 kDa, 250 kDa 내지 300 kDa, 300 kDa 내지 350 kDa, 350 kDa 내지 400 kDa, 400 kDa 내지 450 kDa, 또는 450 kDa 내지 500 kDa일 수 있다. 일부 경우에서, 중합체의 총 분자량은 500 kDa 내지 600 kDa, 600 kDa 내지 700 kDa, 700 kDa 내지 800 kDa, 800 kDa 내지 900 kDa, 900 kDa 내지 1000 kDa, 1000 kDa 내지 1500 kDa, 1500 kDa 내지 2000 kDa, 2000 kDa 내지 3000 kDa, 또는 3000 kDa 내지 5000 kDa일 수 있다. 중합체는 선형 폴리아크릴아미드 중합체일 수 있다. 일부 경우에서, 중합체의 총 분자량은 적어도 약 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 또는 그 초과일 수 있다. 선형 폴리아크릴아미드 중합체는 히드로겔의 프레임워크를 형성하는 데 사용되지 않을 수 있다. 예컨대, 선형 폴리아크릴아미드 중합체는 아가로스 겔의 겔화 온도 초과에서 수성 형태의 아가로스와 혼합될 수 있으며, 온도를 겔화 온도 미만으로 낮추면 아가로스는 겔화를 거쳐 선형 폴리아크릴아미드 중합체를 프레임워크 내부로 가둘 수 있는 중합체 프레임워크를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아크릴아미드 단량체는 중합 동안 수성 형태의 아가로스와 혼합될 수 있다. 가교결합된 폴리아크릴아미드 히드로겔에 포획제를 부착하기 위해 사용된 본원에 기재된 화학은 또한 도구 분자를 선형 폴리아크릴아미드 중합체에 부착시키는 데 사용될 수 있다.
확산 제한제는 큰 입자일 수 있다. 큰 입자는 히드로겔의 공극 크기보다 큰 크기를 가질 수 있다. 큰 입자를 선택하고 그에 따라 히드로겔의 공극 크기를 조정할 수 있다. 큰 입자의 크기(직경으로 표시됨)는 0.5 μm 내지 5 μm일 수 있다. 일부 경우에서, 큰 입자의 크기는 0.5 μm 내지 1 μm, 1 μm 내지 1.5 μm, 1.5 μm 내지 2 μm, 2 μm 내지 2.5 μm, 2.5 μm 내지 3 μm, 3 μm 내지 3.5 μm, 3.5 μm 내지 4 μm, 4 μm 내지 4.5 μm, 또는 4.5 μm 내지 5 μm일 수 있다. 일부 다른 경우에서, 큰 입자의 크기는 5 μm 내지 10 μm, 10 μm 내지 20 μm, 20 μm 내지 30 μm, 30 μm 내지 40 μm, 또는 40 μm 내지 50 μm일 수 있다. 일부 경우에서, 큰 입자의 크기는 적어도 약 1 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 또는 그 초과일 수 있다.
단일 세포 반응기: 관심 분자
일부 실시양태에서, 단일 세포 반응기는 관심 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 분자는 관심 핵산이다. 일부 실시양태에서, 관심 분자는 고체 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 관심 핵산은 고체 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 단일 세포 반응기는 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 세포 반응기는 제1 핵산 및 제2 핵산이 부착되는 고체 지지체를 포함할 수 있다. 부착은 안정한 부착일 수 있다. 부착은 가역성 부착일 수 있다.
제1 및/또는 제2 핵산은 면역수용체 또는 면역수용체 쇄를 코딩하는 mRNA일 수 있다. 제1 및/또는 제2 핵산은 면역수용체 또는 면역수용체 쇄를 코딩하는 mRNA의 역전사 생성물(즉, cDNA 생성물)일 수 있다. 역전사 생성물은 템플릿-스위칭된 역전사 생성물일 수 있다. 제1 및/또는 제2 핵산은 어댑터 서열을 추가로 포함할 수 있다. 단일 세포 반응기는 제1 핵산 및 제2 핵산의 카피를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 및 제2 핵산 분자의 카피이 고체 지지체에 부착된다.
다양한 실시양태에서, 단일 세포 반응기는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 포획제 또는 고체 지지체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 이들의 조합이다. 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 변형된 DNA, 예컨대 메틸화된 DNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 세포 반응기는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 핵산은 TCRα 쇄, TCRβ 쇄, TCRγ 쇄, TCRδ 쇄, 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 관심 핵산은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 이의 카피이다.
일부 실시양태에서, 핵산 템플릿의 카피는 확장된 프라이머 (또는 프라이머 확장 생성물)이다. 핵산 템플릿의 카피는 핵산 템플릿의 동일한 서열 또는 핵산 템플릿의 역 상보적 서열을 갖는 합성된 생성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 템플릿의 카피는 확장된 정방향 또는 역방향 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 핵산 템플릿의 카피는 연장된 역전사(RT) 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 핵산 템플릿의 카피는 확장된 증폭 프라이머이다. 본원에서 사용된 "확장된 프라이머" 또는 "프라이머 연장 생성물"은 핵산 증폭, 제2 가닥 합성 및 역전사를 포함하지만 이에 제한되지 않는 템플릿 의존적 핵산 합성 동안 프라이머 연장을 겪은 프라이머를 지칭한다. 핵산 템플릿 또는 이의 카피를 고정하거나 포착하기 위해, 프라이머는 핵산 템플릿에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않은 어댑터 서열을 가질 수 있다. 어댑터 서열은 포획제에 연결될 수 있으며, 여기서 포획제는 프레임워크 내의 확산 제한제에 추가로 연결된다. 일부 실시양태에서, 어댑터 서열은 포획제의 서열에 하이브리드한다. 일부 실시양태에서, 프라이머의 어댑터 서열은 템플릿에 하이브리드화 가능하거나 상보적인 부분으로부터 연속적인 핵산 서열일 수 있다. 어댑터 서열 자체는 템플릿에 대해 하이브리드 가능하거나 상보적이지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머의 어댑터 서열은 화학적 링커를 통해 템플릿에 하이브리드화 가능하거나 상보적인 부분에 연결될 수 있다. 헥사에틸렌글리콜과 같은 다양한 화학적 링커가 사용될 수 있다.
단일 세포 반응기: 수상에서의 반응물
단일 세포 반응기의 수상는 핵산을 기질로 사용하는 효소를 포함할 수 있다. 이러한 효소의 예는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사효소, 제한 효소, 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, USER 믹스의 효소(New England Biolabs), 리가제를 포함한다.
단일 세포 반응기의 수상은 프라이머를 포함할 수 있다. 따라서, 단일 세포 반응기는 프라이머 및 핵산 템플릿(예컨대, 면역수용체의 쇄를 코딩하는 핵산 서열) 모두를 포함할 수 있으며, 여기서 프라이머는 수상에 있을 수 있고 핵산 템플릿은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 프라이머는 역전사(RT) 프라이머 및 증폭 프라이머를 포함하지만 이에 제한되지 않는 템플릿 의존적 핵산 합성을 수행하는 데 사용되는 임의의 프라이머일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머는 용기에서 핵산 템플릿으로 구획화된다. 일부 실시양태에서, 정방향 프라이머 및/또는 역방향 프라이머는 용기에서 핵산 템플릿으로 구획화된다.
단일 세포 반응기의 수상은 역전사 생성물의 3' 말단에 공통 서열(어댑터 서열로도 불림)을 부착하는 데 유용한 템플릿 스위칭 올리고(TSO)를 포함할 수 있다.
단일 세포 반응기: 순차적 시약 첨가
일부 실시양태에서, 동일한 세포로부터 유래된 표적 분자와 동시에 접촉하는 것이 아니라 정의된 순서로 접촉하도록 상이한 시약이 제조될 수 있다. 마찬가지로, 일부 실시양태에서, 일부 시약 또는 반응 부산물은 다음 반응이 발생하기 전에 제거될 수 있다. 예컨대, 세포를 용해시키기 위해 용해 버퍼를 첨가할 수 있고(도 2, 패널 (b)), mRNA를 역전사(RT) 및 PCR-증폭시키기 위해 역전사효소 및 열안정성 DNA 폴리머라제를 첨가할 수 있다(도 2, 패널 (c)). 이 상황에서, 용해 버퍼는 RT 및/또는 PCR을 억제할 수 있으며, RT-PCR 단계 전에 제거되어야 할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면은 이들 목표를 달성하기 위한 방법을 제공한다.
본 개시내용에서, 새로운 시약의 첨가 및/또는 오래된 시약, 부산물 및 폐기물의 제거를 총칭하여 "시약 교환"이라고 한다. 시약 교환이 필요한 상황에서, 교차 오염을 일으킬 수 있는 세포간 서열 접촉(예컨대, 제1 세포로부터의 서열과 제2 세포로부터의 또 다른 서열과 접촉)은 시약 교환 중에 최소화되어야 할 수 있다. 고체 지지체를 사용하면 세포간 서열 접촉을 최소화하는 데 도움이 될 수 있다. 예컨대, 웰 또는 마이크로웰을 단일 세포 반응기로 사용할 수 있으며, 이 상황에서 면역수용체를 코딩하는 mRNA, cDNA 또는 증폭된 DNA 분자는 서열 특이적 또는 비-서열 특이적 상호 작용으로 웰 또는 마이크로웰의 표면에 부착될 수 있다. 예컨대, 포획제 역할을 하는 올리고뉴클레오티드(예컨대, "친화성 포획 올리고(ACO)")는 본원에 제공된 다양한 화학에 의해 표면 상에 변형될 수 있다. 동시에, RT 및 PCR 프라이머의 일부 또는 전부에, 임의적으로 유연한 링커(예컨대, PEG6를 위한 PEG4와 같은 에틸렌 글리콜 스페이서)를 통해, 포획 올리고에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 부가할 수 있다. 본원에 기재된 일부 예에서, 부가된 올리고뉴클레오티드는 "친화성 보유 서열(ARS)"로 지칭된다. ACO 또는 ARS의 길이는 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 또는 약 30 내지 약 50개 뉴클레오티드일 수 있다. ACO 또는 ARS의 길이는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 그 초과일 수 있다. 포획 ACO:ARS 상호 작용은 비오틴-스트렙트아비딘 상호 작용과 같은 다른 공유적 또는 비공유적 상호 작용으로 대체될 수 있다. 대안적으로, RT 또는 PCR 프라이머의 일부 또는 전부는, 예컨대 프라이머 및 표면 상의 반응성 기 사이에 형성된 화학적 결합을 통해 표면에 직접적으로 부착될 수 있다.
예컨대, 유중수 액적의 수상은 촉발 시 히드로겔 입자(즉, 경화된 입자)를 형성할 수 있는 단량체 또는 중합체를 함유할 수 있다. ACO는 히드로겔 입자 내부 또는 외부로의 ACO 확산이 제한될 수 있도록 히드로겔 입자에 결합되거나 포착될 수 있다. ACO는 확산 제한제에 연결될 수 있다. 예컨대, ACO는 히드로겔 입자의 프레임워크로서 역할을 하는 중합체에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있다. ACO는 또한 히드로겔 프레임워크에 포착되는 입자 또는 중합체에 부착될 수 있다. 이러한 방식으로 RT 및 PCR 프라이머에 (임의적으로 유연한 링커를 통해) ARS를 부가하여 세포간 서열 접촉을 최소화하고, 다른 시약, 부산물 및 폐기물을 히드로겔 입자 내부 또는 외부로 확산시킬 수 있다. 대안적으로, RT 또는 PCR 프라이머의 일부 또는 전부는 중합체 프레임워크 또는 확산 제한제에 직접적으로 부착될 수 있다. 히드로겔 프레임워크가 충분히 조밀하면, mRNA, mRNA:cDNA 하이브리드 및 PCR 생성물과 같은 큰 분자는 너무 커서 히드로겔 입자 외부로 확산되지 않을 수 있고(예컨대, 1 kb dsDNA는 4% 아가로스 겔에서 자유롭게 확산되지 않을 수 있음), 이들 분자는 중합체 프레임워크 또는 확산 제한제와의 어떠한 특정한 반응도 없이 중합체 프레임워크에 포착될 수 있다. 어떤 의미에서, 이들 상황에서, 이들 큰 분자는 자체적으로 확산이 제한된다. 핵산 템플릿 또는 이의 카피 및 생물학적 입자를 포착하는 방법은 미국 특허 출원 62/609,756 및 62/674,214에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
확산 제한제는 자유 확산을 방지하는 작용제일 수 있고/있거나 표적 분자가 작용제에 부착될 때 자유 확산으로부터 표적 분자를 제한하는 기능을 할 수 있다. 표적 분자는 분자가, 예컨대 (i) 고체 지지체를 갖는 단일 세포 반응기의 표면에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되거나, (ii) 중합체 프레임워크 또는 히드로겔 내의 확산 제한제에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되거나, (iii) 히드로겔에 포착되는 경우 단일 세포 반응기 내에서 확산이 제한될 수 있다.
일부 경우에서, 시약, 부산물 및 폐기물은 확산이 제한되지 않을 수 있으며 수소 입자의 내부 및 외부로 확산될 수 있다. 일부 경우에서, 확산 효율을 증가시키기 위해 히드로겔 입자는 졸 상으로 전환될 수 있다.
일부 다른 경우에서, 히드로겔 입자에서의 반응은 온도가 열 가역성 겔의 융점 초과로 상승될 것을 요구할 수 있다(예컨대, PCR 동안). 히드로겔 입자는 재유화될 수 있으며, 이는 단순히 히드로겔 입자 및 캐리어 오일을 혼합하고 혼합물을 (예컨대, 볼텍싱에 의해 및 플릭킹에 의해) 교반하거나 미세유체 칩을 사용하여 수행될 수 있다. 새로 형성된 '유중겔' 액적은 단일 세포 반응기로도 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 일시적으로 기계적 무결성을 잃을 수 있거나(예컨대, 아가로스 입자와 같은 열 가역성 히드로겔 입자는 프라이머가 표적에 결합하는 데 필요할 수 있는 고온에서 용융될 수 있음) 표적 분자(예컨대, 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드)는 고체 지지체로부터 일시적으로 해리될 수 있지만(예컨대, DNA 하이브리드화가 표적 분자의 고체 지지체에 대한 부착을 매개하는 경우), 일단 온도가 낮아지면, 고체 지지체가 다시 형성될 수 있고(예컨대, 아가로스가 겔이 될 수 있음) 표적 분자가 고체 지지체에 재부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구획 내 부피의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과는 열 가역성 입자가 차지한다. 이러한 경우, 용융된 입자가 구획 내의 다른 수성 내용물과 혼합된 후, 겔화 가능한 중합체의 희석은 약 2배, 1.7배, 1.5배, 1.3배, 1.2배 미만 또는 그 이하로 제한될 수 있다. 따라서, 희석된 겔화 가능한 중합체는 적절한 실험 온도(예컨대, 실온 또는 4℃)에서 여전히 겔을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, (1) 에멀젼에서 반응 수행, (2) 겔 형성(예컨대, 냉각에 의함), (3) 해유화, (4) 확산 기반 시약 교환, 및 (5) 재유화의 사이클을 다수회 반복할 수 있다. 일부 경우에서, 히드로겔 입자의 세척은 해유화 후 수행될 수 있다.
절차의 예로서, 히드로겔 입자(냉각 시 아가로스를 함유하는 유중수 액적에 의해 형성됨)에서 동일한 세포로부터의 면역수용체를 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포획하고, '유중겔' 에멀젼을 해유화하고, 히드로겔 입자를 버퍼에서 세척하여 확산 기반 시약 교환을 수행할 수 있다. 시약 교환은 면역수용체를 코딩하는 핵산을 포획한 후, 역전사 후, 사전 증폭 단계 후, 또는 시약 교환을 수행하는 것이 필요한 다른 단계와 같이 본원에 기재된 방법 동안 임의의 단계에서 수행될 수 있다. 예컨대, 면역수용체를 코딩하는 RNA를 포획하고, 역전사 및/또는 제2 가닥 합성(어댑터 서열을 추가하기 위함)을 수행한 다음, 시약 교환을 수행하여 증폭 프라이머 및 시약을 확산시킬 수 있다. 또 다른 예로서, 면역수용체를 코딩하는 RNA를 포획하고, 역전사 및/또는 제2 가닥 합성(어댑터 서열을 추가하기 위함)을 수행하고, 사전 증폭 단계를 수행한 다음, 시약 교환을 수행하여 추가의 증폭 프라이머 및 시약을 확산시킬 수 있다. 일부 경우에서, 히드로겔 입자는 추가의 반응을 수행하기 위해 재유화될 수 있다. 재유화 후, 재유화된 히드로겔 입자 각각은 캡슐화되거나 오일로 둘러싸일 수 있다. 일부 경우에서, 재유화된 히드로겔 입자는 캡슐화되거나 오일로 둘러싸일 때 용융될 수 있다. 예컨대, 재유화된 히드로겔 입자는 히드로겔 입자의 겔화 온도보다 높은 온도에서 수행되는 반응 동안 용융될 수 있다.
면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드로 변형된 고체 지지체
본 개시내용은 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드로 변형된 복수의 고체 지지체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체(예컨대, 비드 또는 마이크로웰의 벽)는 하나의 세포로부터의 표적 폴리뉴클레오티드('단일 세포성'으로 불리는 특색)를 함유한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 면역수용체는 TCR 또는 BCR일 수 있다.
이러한 복수의 고체 지지체를 제공하는 것은 면역수용체 발현 세포 또는 그들의 핵 (또는 소스 면역수용체 발현 생물학적 입자, 또는 생물학적 입자로 지칭됨)을 복수의 구획으로 분할하는 것을 수반할 수 있다.
각각 단일 생물학적 입자로부터 유래된 제1 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드로 변형된 복수의 고체 지지체는 (1) 복수의 생물학적 입자를 복수의 구획으로 분할함으로써 제공될 수 있고(여기서 각각의 구획은 (a) 또한 하나 이상의 미리 형성된 고체 지지체를 함유하거나, (b) 고체 지지체 역할을 할 수 있는 경화된 입자로 전환될 수 있음), (2) 각각의 구획에서 생물학적 입자를 용해하거나 그렇지 않으면 면역수용체 쇄를 코딩하는 표적 DNA 또는 mRNA 분자를 방출하고, (3) 각각의 구획에서 표적 DNA 또는 mRNA 분자를 고체 지지체(들)에 부착한다.
일부 실시양태에서, 포획제는 프라이머일 수 있다. 프라이머는 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드를 템플릿으로 사용하여 확장될 수 있다. 따라서, 고체 지지체에 부착된 제1 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드는 프라이머 연장 생성물일 수 있다. 프라이머는 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드의 C 영역(불변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 상의 영역), J 영역 또는 V 영역을 인식할 수 있다. 프라이머는 정방향 프라이머(면역수용체의 센스 서열의 일부를 가짐) 또는 역방향 프라이머(면역수용체의 안티센스 서열의 일부를 가짐)일 수 있다. 포획제는 미리 형성된 고체 지지체 또는 경화된 입자에 부착될 수 있다. 세포는 구획에 용해 버퍼를 첨가하거나 온도를 상승시킴으로서 구획에서 용해될 수 있다. 용해는 포획제에 결합할 수 있는 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드의 방출을 유발할 수 있다. 구획은 또한 DNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 함유할 수 있다. 이 경우에서, 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드에 결합된 프라이머는 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드를 템플릿으로 하여 연장되어 프라이머 연장 생성물을 형성할 수 있다. 구획은 또한 템플릿 스위칭 올리고(TSO)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획제는 TSO를 포함할 수 있다. TSO의 존재 하에, 역전사 생성물은 TSO에 상보적인 서열로 3' 말단에서 연장될 수 있다. 각각의 구획의 내용물은 본원에 기재된 2개의 프라이머를 포함할 수 있으며, 각각은 이분 면역수용체 쇄 코딩 폴리뉴클레오티드 중 하나에 결합하도록 설계된다. 예컨대, 각각의 구획의 내용물은 2개의 프라이머를 포함할 수 있으며, 하나는 TCR 알파 쇄 코딩 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 설계되고 다른 하나는 TCR 베타 쇄 코딩 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 설계된다.
프라이머 연장 생성물은 한쪽 또는 양쪽 말단에 공통 서열을 가질 수 있다. 프라이머는 면역수용체를 코딩하는 서열의 C 영역에 결합하도록 설계될 수 있다. C 영역의 서열이 일정하기 때문에, 하나의 타입의 면역수용체 쇄(예컨대, IgG, IgA, IgM, IgK, IgL, TCR 알파, TCR 베타)에 대해 하나의 프라이머만 필요할 수 있다. 예컨대, 하나의 프라이머를 사용하여 하나의 실험에 사용된 모든 세포로부터 TCR 알파 쇄 코딩 폴리뉴클레오티드를 포획할 수 있다. 따라서, 프라이머의 서열은 공통 서열로 간주될 수 있다. C 영역은 센스 가닥에서 재배열된 V(D)J 영역의 하류이므로, 이 공통 서열을 하류 공통 서열이라고 한다. mRNA가 표적 폴리뉴클레오티드인 경우, C 영역 표적화 프라이머가 사용될 수 있다. TSO 및 템플릿 스위칭 가능한 역전사효소가 구획에 존재하는 경우, RT 생성물의 3' 말단은 [TSO*}로 확장될 수 있다. TSO 서열은 모든 구획, 따라서 모든 세포에서 일정할 수 있으므로, TSO 서열도 공통 서열이다. 이는 센스 가닥 상의 V(D)J 영역의 상류이므로, 상류 공통 서열이라고 한다. TSO 서열은 임의로 설계될 수 있고 표적 서열의 어떠한 부분에도 결합할 필요가 없으므로, TSO 서열은 또한 어댑터 서열이라고 한다. 이 예에서, 프라이머 확장 생성물은 V(D)J 영역의 상류 및 하류 모두에서 공통 서열을 가지며, 이들 공통 서열은 추가의 증폭 및 융합 반응에 사용될 수 있다.
DNA가 템플릿으로 사용되는 경우, J 영역 또는 V 영역 각각에 대해 프라이머 패널이 설계될 수 있다. J 영역 및 V 영역이 일정하지 않으므로, 추가의 어댑터 서열이 패널의 각각의 프라이머의 5' 말단에 부가될 수 있다. 어댑터 서열은 하류 공통 서열(예컨대, 프라이머가 J 영역에 결합하도록 설계된 경우) 또는 상류 공통 서열(예컨대, 프라이머가 V 영역에 결합하도록 설계된 경우)일 수 있다.
생물학적 입자(예컨대, 세포, 핵, 엑소솜 등)를 분할하는 방법은, 예컨대 미세유체 기반 방법 및 비-미세유체 기반 방법(예컨대, 볼텍싱)을 포함한다. 본 개시내용은 일부 구획에서 구획 내에 단 하나의 생물학적 입자가 있도록 소스 생물학적 입자를 구획으로 분할하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 구획의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%는 0 또는 단 하나의 생물학적 입자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 구획의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%는 0개 또는 1개의 프라이머 전달 입자를 함유한다.
사용된 파티션 또는 구획의 수는 적용에 따라 다를 수 있다. 예컨대, 파티션 또는 구획의 수는 약 5, 10, 50 ,100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개, 또는 그 초과일 수 있다. 파티션 또는 구획의 수는 적어도 약 1, 5, 10, 50 ,100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개, 또는 그 초과일 수 있다. 파티션 또는 구획의 수는 5, 10, 50 ,100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개, 또는 그 초과의 미만일 수 있다. 파티션 또는 구획의 수는 약 5-10000000, 5-5000000, 5-1000000, 10-10000, 10-5000, 10-1000, 1000-6000, 1000-5000, 1000-4000, 1000-3000, 또는 1000-2000개일 수 있다.
구획으로 분할될 수 있는 생물학적 입자의 수는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개, 또는 그 초과일 수 있다. 구획으로 분할될 수 있는 생물학적 입자의 수는 적어도 약 1, 5, 10, 50 ,100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개, 또는 그 초과일 수 있다. 구획으로 분할될 수 있는 생물학적 입자의 수는 2, 5, 10, 50 ,100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개, 또는 그 초과의 미만일 수 있다. 구획으로 분할될 수 있는 생물학적 입자의 수는 약 5-10000000, 5-5000000, 5-1000000, 10-10000, 10-5000, 10-1000, 1000-6000, 1000-5000, 1000-4000, 1000-3000, 또는 1000-2000개일 수 있다.
일부 실시양태에서, 구획은 분류에 의해 분리가 지원되는 표준 마이크로웰 플레이트의 웰이다. 일부 실시양태에서, 분류기는 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)이다. 또한, 플루이딤 C1(Fluidigm C1)의 경우와 같이, 분할은 분리된 미세유체 챔버에서 자동 라이브러리 생성과 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구획은 서브나노리터의 웰이고 입자는 반투과성 막에 의해 밀봉된다.
단일 생물학적 입자를 개별 구획으로 분할한 후, 생물학적 입자를 조작하여 구성요소를 방출할 수 있다. 예컨대, 단일 세포 또는 핵을 용해하여 DNA, RNA, 단백질 및/또는 펩티드를 추가 분석을 위해 구획으로 방출할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 또는 RNA는 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
특정 측면에 따라, 세포와 같은 생물학적 입자는 파티션 내의 세포의 내용물을 방출하기 위해 용해제(예컨대, 세포 용해 시약)와 함께 분할될 수 있다. 이러한 경우, 용해제는, 예컨대 채널 접합의 상류에 있는 추가의 채널 또는 채널들을 통해 분할 접합/액적 생성 구역으로 세포를 도입하는 것과 동시에 또는 직전에 세포 현탁액과 접촉될 수 있다. 용해제의 예는 상이한 세포 타입, 예컨대 그람 양성 또는 음성 박테리아, 식물, 효모, 포유동물 등의 용해에 사용되는 용해 효소와 같은 생체활성 시약, 예컨대 리소자임, 아크로모펩티다제, 리소스타핀, 라비아제, 키탈라제, 리티카제, 및 예컨대 시그마-알드리치, 인크.(Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, Mo.)로부터 입수 가능한 다양한 다른 용해 효소 뿐만 아니라 다른 상업적으로 입수 가능한 용해 효소를 포함한다. 다른 용해제는 추가적으로 또는 대안적으로 세포와 공동 분할되어 세포의 내용물이 파티션으로 방출되도록 할 수 있다. 예컨대, 일부 경우에서, 계면활성제 기반 용해 용액은, 계면활성제가 안정한 에멀젼을 방해할 수 있는 에멀젼 기반 시스템에는 덜 바람직할 수 있지만, 세포를 용해시키는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 용해 용액은, 예컨대 트리톤X-100 및 트윈 20과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 용해 용액은, 예컨대 사르코실 및 나트륨 도데실 술페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 전기천공, 열, 음향 또는 기계적 세포 파괴와 같은 다른 방법을 이용하는 용해 방법이 또한 특정한 경우에, 예컨대 액적 분할에 추가하여 또는 대신에 있을 수 있는 세포의 캡슐화와 같은 비-에멀젼 기반 분할에 이용될 수 있으며, 여기서 캡슐화물의 임의의 공극 크기는 충분히 작아 세포 파괴 후 원하는 크기의 핵산 단편을 보유한다.
상술된 세포와 함께 공동 분할된 용해제에 추가하여, 예컨대 DNase 및 RNase 비활성화제 또는 억제제, 예컨대 프로테이나제 K, 킬레이트제, 예컨대 EDTA, 및 핵산의 후속 처리에서 상이한 세포 용해 성분의 부정적인 활성 또는 영향을 제거하거나 달리 감소시키는 데 사용되는 다른 시약을 포함하는 다른 시약도 세포와 함께 분할될 수 있다. 또한, 캡슐화된 세포의 경우, 세포는 적절한 자극에 노출되어 공동 분할된 마이크로캡슐로부터 세포 또는 그들의 내용물을 방출할 수 있다. 예컨대, 일부 경우에서, 화학적 자극은 캡슐화된 세포와 함께 공동 분할되어 마이크로캡슐을 분해하고 세포 또는 그의 내용물을 더 큰 파티션으로 방출할 수 있다.
세포의 DNA를 단편화하기 위한 엔도뉴클레아제, DNA 폴리머라제 효소 및 세포의 핵산 단편을 증폭시키는 데 사용되는 dNTP와 같은 추가의 시약도 세포와 공동 분할될 수 있다. 추가의 시약은 또한 말단 트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소를 포함하는 역전사효소, 프라이머 및 올리고뉴클레오티드, 및 템플릿 스위칭에 사용될 수 있는 스위치 올리고뉴클레오티드(본원에서 "스위치 올리고" 또는 "템플릿 스위치 올리고" 또는 "TSO"로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 템플릿 스위칭은 cDNA의 길이를 증가시키는 데 이용될 수 있다. 템플릿 스위칭의 한 예에서, cDNA는 템플릿, 예컨대 세포 mRNA의 역전사로부터 생성될 수 있으며, 여기서 말단 트랜스퍼라제 활성을 갖는 역전사효소는, 예컨대 cDNA의 말단에서, 템플릿에 의해 코딩되지 않은 cDNA에 추가의 뉴클레오티드, 예컨대 polyC를 추가할 수 있다. 스위치 올리고는 추가의 뉴클레오티드, 예컨대 polyG에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있다. cDNA 상의 추가의 뉴클레오티드(예컨대, polyC)는 스위치 올리고 상의 추가 뉴클레오티드(예컨대, polyG)에 대해 상보적 서열에 하이브리드화할 수 있으며, 이에 의해 스위치 올리고는 역전사효소에 의해 템플릿으로서 사용되어 cDNA를 추가로 연장할 수 있다. 스위치 올리고는 데옥시리보핵산, 리보핵산, 잠금 핵산(LNA)을 포함하는 변형된 핵산, 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다.
상술된 작용제는 세포 또는 다른 생물학적 입자와 함께 공동 분할될 수 있지만, 이러한 작용제를 공동 분할할 필요는 없다. 본원에 기재된 방법은 경화된 입자의 형성 및 경화된 입자 내에 표적 분자의 포획을 허용하므로, 시험관에서 작용제를 풀링된 경화된 입자와 직접적으로 혼합함으로써 경화된 입자의 형성 후 다양한 단계를 수행할 수 있다. 단일 세포로부터 유래된 표적 분자는 상이한 단일 세포로부터의 표적 분자와 혼합하지 않고도 여전히 그들의 정체성을 유지할 것이다. 예컨대, 경화된 입자를 풀링한 후에 용해제를 첨가할 수 있다. 또 다른 예에서, 역전사를 위한 작용제는 경화된 입자를 풀링한 후에 첨가될 수 있다. 포착된 표적 모이어티를 갖는 경화된 입자는 대량으로 다양한 조작을 허용한다는 것을 이해해야 한다.
다양한 실시양태에서, 생물학적 입자는 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 포함하는 용액과 공동 분할될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 입자는 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체와 공동 분할된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 입자는 중합 가능하거나 겔화 가능한 단량체와 공동 분할된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 입자는 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및 단량체의 혼합물과 공동 분할된다. 중합체는 동일한 화학물질 또는 상이한 화학물질일 수 있다. 단량체는 동일한 화학물질 또는 상이한 화학물질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용액은 겔화 과정을 개시하는 데 필요한 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 용액은 경화된 입자(예컨대, 히드로겔 입자)를 형성하는 중합 과정을 개시하는 데 필요한 작용제를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 반응 후, 미리 형성된 고체 지지체 및 경화된 입자를 회수하여 추가 작업을 위해 수용액에 침지시킬 수 있다.
고체 벽 구획의 수성 내용물이 경화된 입자로 전환되는 경우, 고체 스캐폴드를 변형시키거나, 고체 스캐폴드를 용해시키거나, 원심력을 이용하여 경화된 입자를 용기의 개구부를 통해 구동시키거나 이들의 조합에 의해 경화된 입자를 구획으로부터 제거할 수 있다.
일부 실시양태에서, 구획은 액체 벽(예컨대, 유중수 액적)으로 된다. 이 경우에서, 경화된 입자는, 예컨대 유중수 에멀젼을 해유화함으로써 구획을 합쳐 구획으로부터 제거될 수 있다. 퍼플루오로옥탄올 및 클로로포름과 같은 해유화제로 해유화를 달성할 수 있다. 해유화 방법은 사용되는 캐리어 오일에 따라 달라질 수 있다. 플루오로카본 오일의 경우, 에멀젼은 HFE-7500 오일에 20%-100% (vol/vol) 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥탄올(20%-100% PFO)을 첨가함으로써 해유화될 수 있다. 미네랄 오일의 경우 에멀젼은 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25:24:1; vol/vol/vol; Fisher, cat. No. BP17521)에 의해 해유화될 수 있다. 소형 정전기방지 건을 사용하고 세포 스트레이너의 상단에서 수용액으로 세척하는 것과 같은 비화학적인 방법으로도 해유화를 수행할 수 있다.
어댑터 추가
본 개시내용은 각각 단일 생물학적 입자로부터 유래된 제1 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드로 변형된 복수의 고체 지지체를 수득하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상류 공통 서열(예컨대, TSO 서열) 및 하류 공통 서열(예컨대, C 영역에 결합하는 프라이머의 서열) 모두를 갖는다. 이 경우에서, 이들 고체 지지체는 사전 증폭 또는 융합에 직접적으로 사용될 수 있다.
다른 경우에서, 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 재배열된 V(D)J 서열의 상류 또는 하류에서 0개 또는 단 하나의 공통 서열을 가질 수 있다. 이 경우에서, 추가의 공통 서열을 추가할 수 있다. 추가의 공통 서열은 어댑터 서열일 수 있다. 어댑터 서열은 프라이머 연장에 의해 추가될 수 있으며, 여기서 프라이머는 5' 말단에 어댑터 서열을 함유한다. 일부 실시양태에서, 모든 프라이머가 동일한 어댑터 서열을 공유하는 프라이머 패널이 사용될 수 있다. 패널의 각각의 프라이머는 소스 면역수용체 발현 세포의 면역수용체 레퍼토리에 존재할 수 있는 상이한 V 영역을 인식할 수 있다. 패널의 각각의 프라이머는 소스 면역수용체 발현 세포의 면역수용체 레퍼토리에 존재할 수 있는 상이한 J 영역을 인식할 수 있다. V 영역을 표적으로 하는 프라이머 패널을 사용하여 상류 어댑터 서열을 추가하는 예는 실시예 섹션에 제공된다.
단일 세포성을 유지하면서(즉, 고체 지지체에 부착된 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드가 하나의 세포로부터 유래함을 확인) 이들 프라이머 연장 반응을 수행하기 위해 단일 세포 반응기를 사용할 수 있다.
기계적 강도 및 고체 지지체에 대한 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드의 부착이 프라이머-연장 반응의 온도를 견딜 수 있는 경우, 고체 지지체를 프라이머 및 효소를 포함하는 수용액의 연속 부피에 침지시킬 수 있다. 그렇지 않으면, 고체 지지체는 대부분의 구획의 각각의 구획이 하나 이하의 고체 지지체를 함유하는 구획으로 재분할될 수 있다. 이 경우에서, 구획은 또한 프라이머 연장 반응을 위한 프라이머 및 효소를 포함할 수 있다.
고체 지지체가 입자인 경우, 고체 지지체의 재분할은 생물학적 입자가 고체 지지체(예컨대, 입자)로 대체되는 것을 제외하고는 생물학적 입자를 분할하는 데 사용되는 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 고체 지지체가 히드로겔 입자인 경우, 효소 및 프라이머는 히드로겔 입자로 확산될 수 있으며, 히드로겔 입자는 본원에 기재된 다른 방법을 이용하여 재유화될 수 있다.
본원에 기재된 방법을 이용하여, 각각 단일 생물학적 입자로부터 유래된 제1 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드로 변형된 복수의 고체 지지체를 제공할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드는 모두 상류 공통 서열 및 하류 공통 서열을 갖는다.
쌍을 이룬 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 융합
제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 제1 핵산 서열은 제1 면역수용체 쇄를 코딩할 수 있고 제2 핵산 서열은 제2 면역수용체 쇄를 코딩할 수 있다. 제1 면역수용체 쇄 및 제2 면역수용체 쇄는 기능적 면역수용체 수용체를 형성할 수 있다. 제1 면역수용체 쇄 및 제2 면역수용체 쇄를 코딩하는 핵산 서열은 단일 세포로부터 유래될 수 있다. 제1 면역수용체 쇄 및 제2 면역수용체 쇄는 세포(예컨대, 면역 세포)로부터 수득된 면역수용체의 동족 쌍 조합 (또는 자연적으로 쌍을 이룬 조합)으로부터 유래될 수 있다. 제1 및/또는 제2 핵산 서열은 면역수용체의 전장 가변 도메인(예컨대, 모든 3개의 CDR: CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함)을 코딩할 수 있다. 제1 및/또는 제2 핵산 서열은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 부분 가변 도메인을 코딩할 수 있다. 제1 및/또는 제2 핵산 서열은 면역수용체의 불변 도메인을 추가로 코딩할 수 있다. 불변 도메인은 전장 불변 도메인, 세포외 불변 도메인, 또는 전장 불변 도메인의 임의의 부분일 수 있다. 일부 경우에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 길이가 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1200, 적어도 1500개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 염기쌍)이다. 일부 경우에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 길이가 적어도 1000, 적어도 1500, 적어도 2000, 적어도 2500개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 염기쌍)이다. 일부 경우에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 길이가 600 내지 1000 또는 1500 내지 3000개 뉴클레오티드 (또는 염기쌍)이다.
단일 세포 반응기 내에서, 리게이션 및 PCR 기반 방법과 같은 이분 면역수용체의 2개의 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 융합하기 위해 다양한 방법이 이용될 수 있다. 본원에 사용된 "융합된"은 연결 또는 물리적 연결을 지칭한다. 이분 면역수용체의 2개의 펩티드 쇄를 코딩하는 서열은 단일 세포 (또는 본원에서 기재되는 바와 같은 단일 소스 면역수용체 발현 세포)로부터 유래될 수 있다. RT-PCR을 수행하여 게놈 DNA로부터 또는 mRNA로부터 표적 핵산을 카피 또는 증폭시키는 것 사이의 선택은 발현된 mRNA의 특성을 기반으로 하여 이루어질 수 있다. 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하면 역전사 단계가 필요하지 않을 수 있지만 비기능적 수용체를 증폭시킬 위험이 있는 반면, mRNA를 템플릿으로 사용하면 더 높은 카피 수의 이익이 있을 수 있고 기능적인 발현된 수용체를 포획할 수 있다. 이분 면역수용체의 2개의 펩티드 쇄를 코딩하는 2개의 핵산의 물리적 융합은 다수의 메카니즘을 통해 발생할 수 있다. 예컨대, 중첩 연장에 의한 표준 스플라이싱 PCR(Standard splicing-by-overlap-extension PCR: SOE-PCR)(융합 PCR, 교차 PCR 또는 중첩 연장 PCR로도 공지됨, OE-PCR로 약칭됨)을 통해 물리적 융합을 달성할 수 있으며, 따라서 2개의 앰플리콘이 프라이머 역할을 하고 서로 융합되도록 2개의 PCR 프라이머는 상보적인 서열을 갖는다. 이 방법의 하나의 장점은 융합된 구축물이 즉시 사용 가능한 scFv 형식이 되도록 중첩 서열을 설계할 수 있다는 것일 수 있다. 또 다른 예로서, 태그가 PCR 프라이머에 통합된다는 점에서 SOE-PCR과 유사한 메카니즘을 통해 융합이 달성될 수 있다. 이 경우에서, 태그는 loxP 부위를 함유할 수 있으므로 Cre 매개된 재조합 시 융합이 발생할 수 있다. 물리적 융합은 또한 평활 말단 리게이션 및 점착 말단 리게이션을 포함한 리게이션에 의해 달성될 수 있다.
사전 증폭
융합 반응 전에, 각각의 이분 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 표적 핵산이 증폭될 수 있으며, 이를 "사전 증폭"으로 지칭한다. 사전 증폭은 준비 절차 및 증폭 절차를 포함하는 2개의 절차를 포함할 수 있다. 준비 절차 동안, 증폭 전에 표적 핵산에 대해 공통 서열(예컨대, 어댑터 서열)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가하기 위해 하나 이상의 반응이 수행될 수 있다. 예컨대, 준비 절차는 어댑터로 새로 합성된 생성물을 생성하기 위해 어댑터 서열을 갖는 프라이머를 사용한 표적 핵산의 핵산 합성을 포함할 수 있다. 어댑터는 표적 핵산에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않을 수 있다. 본원에 사용된 "하이브리드화 가능한"은 주어진 조건 하에서 2개의 핵산 가닥 사이에 안정한 염기 쌍을 형성하는 것을 지칭한다. 어댑터는 사전 결정된 서열을 포함할 수 있으며 증폭 절차를 위해 프라이머를 결합하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 준비 절차 후, 새로 합성된 생성물은 각각의 말단에 하나의 어댑터 서열을 갖는 2개의 어댑터 서열을 포함한다.
상기 섹션은 각각 단일 생물학적 입자로부터 유래된 제1 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드로 변형된 복수의 고체 지지체를 제공하는 일반적인 방법을 기재하며, 여기서 제1 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드는 모두 상류 공통 서열 및 하류 공통 서열을 갖는다. 이러한 복수의 지지체의 제공은 준비 절차를 수행한 결과일 수 있다.
일부 경우에서, 표적 핵산은 DNA(예컨대, 게놈 DNA)이고, 준비 절차는 제1 어댑터 서열을 갖는 제1 프라이머 및 제2 어댑터 서열을 갖는 제2 프라이머를 사용하여 DNA 카피를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 제1 어댑터 서열 및 제2 어댑터 서열은 사전 설계된 또는 인공 서열일 수 있다. 제1 프라이머 및 제2 프라이머 중 하나를 사용하여 DNA 카피를 히드로겔 입자의 중합체 프레임워크에 연결할 수 있다. 두 어댑터 서열 모두 추가의 증폭을 위해 프라이머에 결합하는 데 사용될 수 있다. 이분 면역수용체의 표적 핵산은 인트론을 함유할 수 있는 게놈 DNA일 수 있다. 프라이머는 인트론이 없는 영역을 합성 (또는 카피)하도록 설계될 수 있다. 예컨대, 인트론은 일반적으로 J 영역과 C 영역 사이에 위치되므로, TCR 쇄에 대한 가변 도메인만 합성 (또는 복사)하도록 프라이머를 설계할 수 있다.
일부 경우에서, 이분 면역수용체의 표적 핵산은 mRNA이다. 또한, 이러한 경우에서, PCR에 의한 증폭 전에 RT 단계를 수행할 수 있다. RT 프라이머는 확산이 제한될 수 있다. 일부 경우에서, RT 프라이머는 확산이 제한되지 않을 수 있다. RT 프라이머는 포획제의 표적화 모이어티일 수 있다. 예컨대, 단일 세포 반응기가 히드로겔 입자인 경우, RT 프라이머는 중합체 프레임워크에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 표면 또는 고체 지지체 또는 프레임워크 상에 포획제를 고정시키기 위해 본원에 기재된 다양한 방법을 이용하여 RT 프라이머를 중합체 프레임워크에 연결할 수 있다. RT 프라이머는 확산 제한제에 연결될 수 있다. RT 단계의 결과로 RT 생성물(cDNA 또는 연장된 RT 프라이머)은 중합체 프레임워크에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다 (또는 확산이 제한될 수 있다). RT 단계 동안, 템플릿 스위칭 올리고(TSO)를 사용하는 템플릿 스위치가 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 템플릿 스위치 단계가 RT 단계 동안 수행되고, 템플릿 스위칭된 RT 생성물이 중합체 프레임워크에 연결되거나 확산이 제한된다. TSO는 증폭 절차 동안 프라이머에 결합하는 데 사용할 수 있는 어댑터 서열로 기능할 수 있다. RT 프라이머는 폴리-T 또는 불변 도메인의 서열에 하이브리드화 가능하거나 상보적인 서열일 수 있다. 일부 다른 경우에서, 템플릿 스위치는 수행되지 않을 수 있으며, RT 단계 후에 제2 가닥 합성(SSS) 단계가 수행된다. SSS 단계 동안, 공통 어댑터 서열을 갖는 프라이머 패널이 사용될 수 있다.
사전 증폭에서, 증폭 생성물 (또는 앰플리콘)은 면역수용체 펩티드 쇄의 모든 CDR 서열을 코딩할 수 있다. 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 핵산(예컨대, DNA 및 mRNA)의 모든 CDR 서열을 함유하는 서열을 증폭시키는 다양한 방법이 있다. 비제한적인 예가 본원에 기재된다. 예컨대, 템플릿 스위칭 반응은 RT 동안 수행될 수 있다. TSO를 사용한 템플릿 스위칭이 RT 동안 수행되고 cDNA가 본질적으로 동일한 TSO 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 C 영역을 인식하는 역방향 프라이머에 의해 증폭되는 경우, 면역수용체 쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포괄하는 전체 V 영역 및 V(D)J 접합물이 증폭될 수 있다(예컨대, 도 4a, 화살표 (1)-(2)). 대안적으로, RT 동안 템플릿 스위칭이 수행되지 않는 경우, 면역수용체 쇄의 FR1(즉, CDR1의 상류인 프레임워크 1) 분절 상의 또는 상류의 서열을 인식하도록 정방향 프라이머를 설계할 수 있다. 이 정방향 프라이머는 SSS 또는 PCR에서 사용될 수 있다(예컨대, 도 5a 및 5b, 화살표 (1)-(3)).
면역수용체의 V 유전자는 매우 다양할 수 있다. 따라서, 주어진 유기체(예컨대, 인간)에서 주어진 면역 세포 타입(예컨대, T 세포 또는 B 세포)의 면역수용체 쇄를 증폭시키기 위해, 10 내지 100개의 프라이머 패널("V 유전자 프라이머"로 지칭됨)을 설계할 수 있다. 일부 경우에서, 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95개 또는 그 초과의 프라이머 패널이 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95개 또는 그 초과의 상이한 V 유전자를 표적으로 (또는 증폭) 하도록 설계될 수 있다. 일부 경우에서, 주어진 유기체에서 주어진 면역 세포 타입의 가능한 모든 면역수용체 쇄가 증폭된다.
인간에서, TRAV1-1, TRAV1-2, TRAV2, TRAV3, TRAV4, TRAV5, TRAV6, TRAV7, TRAV8-1, TRAV8-2, TRAV8-3, TRAV8-4, TRAV8-6, TRAV9-1, TRAV9-2, TRAV10, TRAV12-1, TRAV12-2, TRAV12-3, TRAV13-1, TRAV13-2, TRAV14, TRAV16, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, TRAV21, TRAV22, TRAV23, TRAV24, TRAV25, TRAV26-1, TRAV26-2, TRAV27, TRAV29, TRAV30, TRAV34, TRAV35, TRAV36, TRAV38-1, TRAV38-2, TRAV39, TRAV40, 및 TRAV41을 포함하는, TRA에 대한 40개 초과의 기능적 V 유전자가 있을 수 있다. 이들 V 유전자 중 일부는 동일한 서브그룹으로 분류될 수 있으며 "TRAV" 바로 다음에 동일한 서브그룹 번호로 표시되지만 "-" 기호 다음에 상이한 번호로 표시된다. 예컨대 TRAV1-1과 TRAV1-2는 동일한 서브그룹에 속한다. 본원에 사용된 "그룹"은 동일한 "유전자 타입"(예컨대, V, D, J 또는 C 타입)을 공유하고 동일한 "쇄 타입"의 폴리펩티드 합성에 잠재적으로 참여하는 유전자 세트이다. 확장하면, 그룹은 관련된 위유전자 및 오르폰을 포함한다. "서부그룹"은 주어진 종에서 동일한 그룹에 속하고 뉴클레오티드 수준에서 (V, D 및 J에 대한 배선 구성에서) 적어도 75% 동일성을 공유하는 유전자 세트를 의미한다.
인간에서, TRBV2, TRBV3-1, TRBV4-1, TRBV4-2, TRBV4-3, TRBV5-1, TRBV5-4, TRBV5-5, TRBV5-6, TRBV5-8, TRBV6-1, TRBV6-2, TRBV6-3, TRBV6-4, TRBV6-5, TRBV6-6, TRBV6-8, TRBV6-9, TRBV7-2, TRBV7-3, TRBV7-4, TRBV7-6, TRBV7-7, TRBV7-8, TRBV7-9, TRBV9, TRBV10-1, TRBV10-2, TRBV10-3, TRBV11-1, TRBV11-2, TRBV11-3, TRBV12-3, TRBV12-4, TRBV12-5, TRBV13, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV18, TRBV19, TRBV20-1, TRBV24-1, TRBV25-1, TRBV27, TRBV28, TRBV29-1, 및 TRBV30를 포함하는, TRB에 대한 40개 초과의 기능적 V 유전자가 있을 수 있다. 다른 종, 예컨대 마우스에 대한 V 유전자는 IMGT 데이터베이스에서 찾아질 수 있다.
일부 경우에서, 사전 증폭에 사용되는 V 유전자 프라이머의 수는 적다(예컨대, BCR 또는 항체 유전자를 증폭할 때 약 5, 6, 8 또는 10개의 V 유전자 프라이머가 필요할 수 있음). 이러한 경우에서, 이들 프라이머는 다중화 PCR에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 사전 증폭에 사용되는 V 유전자 프라이머의 수는 많다(예컨대, TCR 유전자를 증폭 할 때 약 50, 80, 100개 또는 그 초과의 V 유전자 프라이머가 필요할 수 있음). 이러한 경우에서, 각각의 V 유전자 프라이머의 5' 말단에 부착할 공통 어댑터 서열을 설계할 수 있으며, 이들 프라이머("어댑터 함유 V 유전자 프라이머"로 지칭됨)를 사용하여 cDNA에 하이브리드화하고 단일-사이클 프라이머 연장을 수행할 수 있다. 이 단계는 예컨대 도 5a에서 도시되는 바와 같이 SSS 단계를 지칭한다. SSS 단계 후, 하나의 공통 프라이머 쌍 - 어댑터를 표적으로 하는 정방향 프라이머 및 C 영역을 표적으로 하는 역방향 프라이머 - 을 사용하여 가능한 면역수용체 쇄를 증폭할 수 있다. 융합 및 후속 조작을 위해, 각각의 쇄에 상이한 어댑터가 사용될 수 있다. 예컨대, 제1 어댑터 서열은 TRA 쇄에 사용될 수 있고 제2 어댑터 서열은 TRB 쇄에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, V 유전자 프라이머는 단백질 코딩 서열의 처음 15개 내지 40개 염기의 서열을 가질 수 있다(ATG로 시작). 이 경우에서, PCR 생성물은 V 유전자 및 VDJ 접합물의 전체 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이러한 어댑터 함유 V 유전자 프라이머의 일부 예는 도 5a 및 실시예 섹션에 기재되는 바와 같이 [AdptA|CDSTRA} 및 [AdptB|CDSTRB}이다. 어댑터 함유 V 유전자 프라이머의 프라이머는 3' 말단을 보호하기 위해 차단제 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화될 수 있다. 차단제 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 별개의 올리고뉴클레오티드 가닥일 수 있다.
SSS 또는 PCR에서 10 내지 100개의 프라이머를 적용 할 때 서열 특이성을 유지하는 것은 어려울 수 있다. 그러나, SSS 또는 PCR에 대한 하이브리드화의 특이성을 증가시키기 위해 DMSO 및 베타인과 같은 첨가제를 사용, LNA 또는 리보뉴클레오티드(후자는 RNase H 의존적 PCR과 함께 사용될 수 있음)와 같은 화학적 변형을 사용, 인-양(Yin-Yang) 프로브 또는 토홀드(toehold) 프로브에서와 같은 경쟁 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 방법을 이용할 수 있다.
준비 절차를 수행한 후, 각각 고체 지지체를 포함하는 복수의 단일 세포 반응기를 생성할 수 있으며, OE-PCR(실시예 6 참조)과 같은 1단계 융합 반응을 수행할 수 있다. OE-PCR 동안, 외부 프라이머(들)(예컨대, 도 9b의 pTSO)는 내부 프라이머(들)(예컨대, 도 9b의 프라이머 1R 및 2R)보다 더 높은 농도로 사용될 수 있다. 지수 증폭 단계 후, 외부 프라이머(들)는 선형 증폭을 유도하여 외부 프라이머(들)로부터 연장된 단일 가닥 연장 생성물의 축적을 초래할 수 있다. 이들 단일 가닥 연장 생성물의 3' 말단은 내부 프라이머(들)에 의해 서열이 결정되는 중첩을 가지며, 따라서 서로 하이브리드화할 수 있다. 하이브리드화 생성물은 이중 가닥 융합 생성물을 생성하기 위해 더욱 연장될 수 있다.
일부 실시양태에서, 융합 생성물을 생성하지 않고 단일 세포 반응기에서 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위해 증폭 절차를 수행할 수 있다. 이를 위해, 각각 단일 고체 지지체를 포함하는 복수의 단일 세포 반응기가 준비 절차에서 제조될 수 있으며, 제1 프라이머 쌍은 그의 상류 및 하류 공통 서열에 결합함으로써 (예컨대, TCR 알파 쇄를 위한) 제1 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드를 증폭시키고, 제2 프라이머 쌍은 그의 상류 및 하류 공통 서열에 결합함으로써 (예컨대, TCR 베타 쇄를 위한) 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드를 증폭시킨다.
사전 증폭 생성물은 확산 제한될 수 있다. 예컨대, 이 PCR 기반 사전 증폭을 위한 프라이머는 포획제일 수 있다. 예컨대, 프라이머에 [ARS}가 부가될 수 있다. [ARS}는 PEG 링커 또는 Spacer18과 같은 유연한 링커를 통해 프라이머 서열에 연결될 수 있다. 이들 프라이머의 비제한적인 예는 도 4a 및 4b의 ARS-pTSO 및 도 5b의 ht1F, ht2R를 포함한다.
증폭 절차 후, 각각 제1 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드(예컨대, TCR 알파 쇄를 코딩)의 제1의 복수의 증폭 생성물 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드(예컨대, TCR 베타 쇄를 코딩)의 제2의 복수의 증폭 생성물로 변형된 복수의 고체 지지체를 제공할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 면역수용체 코딩 폴리뉴클레오티드는 기본 쌍(native pair)을 형성한다.
중첩 설계
이분 면역수용체의 2개의 펩티드 쇄를 코딩하는 2개의 핵산은 여러 배향, 예컨대 예컨대, 헤드-대-헤드, 헤드-대-테일, 및 테일-대-테일로 융합될 수 있다(도 3). 본원에 기재된 "헤드"는 센스 핵산 가닥의 "5' 말단"을 지칭하고 "테일"은 센스 핵산 가닥의 "3' 말단"을 지칭미한다. 일부 경우에서, 배향은 헤드-대-테일이고, 융합 순서(예컨대, TRA 다음에 TRB 또는 TRB 다음에 TRA)가 제어될 수 있다. 이러한 제어 가능성을 달성하기 위해 서열 의존적 융합이 수행될 수 있다. 이를 위해, 중첩 서열은 2개의 쇄의 증폭 생성물로 조작될 수 있다. 본원에서 기재되는 바와 같이, TCR의 TRA 및 TRB 폴리뉴클레오티드를 융합하는 것은 상이한 전략을 기재하기 위한 예로서 사용된다. 전략은 BCR 쇄 융합, 항체 쇄 융합 및 TCRγδ 쇄 융합에 적용될 수 있다.
테일-대-테일 설계
도 4a 및 4b는 TCR 면역수용체의 TRA 및 TRB의 테일-대-테일 융합의 예를 도시한다. TRA 분절의 증폭을 위해, TRA의 C 영역을 인식하는 프라이머(즉, TRAC)를 역방향 프라이머로 사용할 수 있다. TRAC를 인식하는 이 프라이머의 서열은 [TRAC-5A*}로 표시될 수 있다. [OL-2*}로 표시되는 ~10-nt 서열은 [TRAC-5A*}의 5' 말단에 부가되어 서열 [OL-2*|TRAC-5A*}를 갖는 '1R'로 표시되는 프라이머를 형성할 수 있다. 마찬가지로, TRB 분절의 증폭을 위해, TRB의 C 영역을 인식하는 프라이머(즉, TRBC)를 역방향 프라이머로 사용할 수 있다. TRBC를 인식하는 이 프라이머의 서열은 [TRBC-5A*}로 표시된다. [OL-1}로 표시되는 ~10-nt 서열은 [TRBC-5A*}의 5' 말단에 부가되어 서열 [OL-1|TRBC-5A*}를 갖는 '2R'로 부르는 프라이머를 형성할 수 있다. 이 설계에서, [OL-1*}은 [TRAC-5A*}의 처음 1~10개 염기이고, [OL-2}는 [TRBC-5A*}의 처음 1~10개 염기이다. 따라서, TRA 증폭 생성물의 센스 가닥의 마지막 ~20개 염기는 [OL-1|OL-2}의 서열을 가질 수 있고, TRB 증폭 생성물의 센스 가닥의 마지막 ~20개 염기는 [OL-2*|OL-1*}의 서열을 가질 수 있다. 2개의 말단은 5'에서 3'로의 엑소뉴클레아제(예컨대, 깁슨(Gibson) 조립), 3'에서 5'로의 엑소뉴클레아제(예컨대, 서열 및 리가제 독립적 클로닝 또는 SLIC), 또는 USER 효소 혼합물(예컨대, USER 친화적 DNA 재조합 또는 USERec)을 사용하여 긴 점착 말단을 생성한 후 리게이션에 의해 융합될 수 있다. 조립 방법의 추가의 예는 순환 폴리머라제 연장 클로닝(circular polymerase extension cloning: CPEC) 및 심리스 리게이션 클로닝 익스트랙트(seamless ligation cloning extract: SLiCE) 조립을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 이들 2개의 말단은 중첩 PCR에 의해 융합될 수 있다. 테일-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 전략에 대한 상세한 설명은 실시예 1에 추가로 제공된다.
헤드-대-테일 설계
도 5a-5c는 TCR 면역수용체의 TRA 및 TRB 폴리뉴클레오티드의 헤드-대-테일 융합의 예를 도시한다. 본원에서 기재되는 바와 같이, 어댑터 함유 V 유전자 프라이머는 SSS 동안 V 유전자 서열에 어댑터 서열을 추가하는 데 사용될 수 있다. 헤드-대-테일 융합을 수행하기 위해, [AdptA} 및 [AdptB}로 표시되는 2개의 상이한 어댑터 서열을 각각 TRA 및 TRB에 대한 어댑터 서열로 사용할 수 있다. TRA 다음에 TRB 순으로 헤드-대-테일 융합을 생성하기 위해, 서열 [TRAC-5A*}을 갖는 TRA를 증폭시키기 위한 역방향 프라이머에 [htOL-2*}로 불리는 서열을 부가하여 서열 [htOL-2*|TRAC-5A*}을 갖는 'ht1R'로 표시되는 프라이머를 형성할 수 있다. 동시에, [htOL-1}로 불리는 서열을 서열 [AdptB}를 갖는 프라이머에 추가하여 서열 [htOL-1|AdptB}을 갖는 'ht2F'로 표시되는 새로운 프라이머를 형성할 수 있다. 이 프라이머 'ht2F'는 TRB를 증폭시키기 위한 정방향 프라이머일 수 있다. 이 설계에서, [htOL-1*}은 [TRAC-5A*}의 처음 1~10개 염기일 수 있으며, [htOL-2}는 [AdptB}의 처음 1~10개 염기일 수 있다. TRA 및 TRB의 증폭 생성물은 단일 세포 반응기에서 리게이션 및 중첩 PCR과 같은 다양한 전략에 의해 융합될 수 있고, 여기서 단일 세포로부터 유래하는 면역수용체 코딩 서열을 갖는 증폭 생성물은 고체 지지체에 부착되며, 각각의 단일 세포 반응기에 단 하나의 고체 지지체만 존재한다. 이들 단일 세포 반응기에서 증폭 생성물은 본원에 제공된 방법을 이용하여 자유롭게 확산 가능하게 만들 수 있다(예컨대, 고체 지지체 용융). 예컨대, 2개의 말단은 5'에서 3'로의 엑소뉴클레아제(예컨대, 깁슨 조립), 3'에서 5'로의 엑소뉴클레아제(예컨대, 서열 및 리가제 독립적 클로닝 또는 SLIC), 또는 USER 효소 혼합물(예컨대, USER 친화적 DNA 재조합 또는 USERec)을 사용하여 긴 점착 말단을 생성한 후 리게이션에 의해 융합될 수 있다. 조립 방법의 추가의 예는 순환 폴리머라제 연장 클로닝(CPEC) 및 심리스 리게이션 클로닝 익스트랙트(SLiCE) 조립을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 헤드-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 전략에 대한 상세한 설명은 실시예 2에 추가로 제공된다.
면역수용체 발현 벡터
융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용에서 "수용자 세포"로 지칭되는 숙주 세포에서 발현되기 위해 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 원형 핵산 가닥으로서 수용자 세포에 전달될 수 있다. 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터로서 수용자 세포에 전달될 수 있다. 일부 경우에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 전기천공에 의해 수용자 세포에 전달될 수 있다. 일부 경우에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 양이온성 중합체와 같은 담체에 의해 전달될 수 있다.
이분 면역수용체의 2개의 쇄는 플라스미드, 트랜스포존(예컨대, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 피기 백(Piggy Bac)) 및 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터)와 같은 벡터로부터 발현될 수 있다. 벡터의 추가의 예는 셔틀 벡터, 파지미드, 코스미드 및 발현 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터의 비제한적인 예는 pUC, pBR322, pET, pBluescript 및 이들의 변이체를 포함한다. 추가로, 벡터는 추가적인 발현 제어 서열(예컨대, 인핸서 서열, 코자크(Kozak) 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선택 가능한 마커 서열(예컨대, 항생제 내성 유전자), 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 벡터는 수용자 세포에 도입되는 핵산 분자이므로, 형질 전환된 수용자 세포를 생성한다. 벡터는 복제 기점과 같은 수용자 세포에서 복제되도록 하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 융합된 유전자의 발현을 허용하는 서열에 작동적으로 연결된 본 개시내용에 따른 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 벡터는 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터를 포함), 복제 적격, 복제 결핍 및 이의 거틀리스(gutless) 형태를 포함한 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련된 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40(SV-40) 벡터, 소 유두종 벡터, 엡스타인-바르 벡터, 헤르페스 벡터, 백시니아 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 벡터, 하베이 뮤린 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유선 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터 및 비바이러스 플라스미드와 같은 바이러스 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 배큘로바이러스 벡터는 곤충 세포에서의 발현에 적합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 자가 복제(self-replicating) (m)RNA, 자가 복제(self-replication) (m)RNA, 자가 증폭 (m)RNA 또는 RNA 레플리콘으로도 지칭되는 자가 증폭 RNA 레플리콘이다. 자가 증폭 RNA 레플리콘은 스스로 복제할 수 있는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 자가 증폭 RNA 레플리콘은 세포내부에서 스스로 복제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자가 증폭 RNA 레플리콘은 RNA 폴리머라제 및 관심 분자를 코딩한다. RNA 폴리머라제는 RNA 의존적 RNA 폴리머라제(RDRP 또는 RdRp)일 수 있다. 자가 증폭 RNA 레플리콘은 또한 프로테아제 또는 RNA 캡핑 효소를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자가 증폭 RNA 레플리콘 벡터는 동부 말 뇌염 바이러스(EEE), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 에베르글라데스 바이러스, 무캄보 바이러스, 픽수나 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스(WEE), 신드비스 바이러스, 사우쓰 아프리칸 아르보바이러스 번호 86, 셈리키 포레스트 바이러스, 미들버그 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 오뇽-뇽(Onyong-nyong) 바이러스, 로스 리버 바이러스, 바마 포레스트 바이러스, 게타 바이러스, 사기야마 바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 우나 바이러스, 아우라 바이러스, 와타로아 바이러스, 바반키 바이러스, 키질라가크 바이러스, 히글란즈 J 바이러스, 포르트 모르간 바이러스, 누무(Ndumu) 바이러스, 부기 크리크(Buggy Creek) 바이러스, 및 바이러스 분류 국제 위원회(ICTV)에 의해 알파바이러스로 분류된 임의의 다른 바이러스를 포함할 수 있는 알파바이러스로 공지된 바이러스의 토가비리대(Togaviridae) 과의 것이거나 이로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 자가 증폭 RNA 레플리콘은 VEE TC-83 백신 스트레인과 같은 알파바이러스의 약독화된 형태이거나 이의 일부를 함유한다. 일부 실시양태에서, 자가 증폭 RNA 레플리콘 벡터는 세포에 대한 세포변성 또는 아폽토시스 효과 없이 관심 분자("수용자 세포의 추가의 게놈 조작" 및 "수용 세포에 의해 발현되는 추가의 작용제"라는 표제의 섹션에서 기재되는 바와 같은 이분 면역수용체 및 추가의 작용제를 포함)의 발현을 허용하는 바이러스의 약독화된 형태이다. 일부 실시양태에서, 자가 증폭 RNA 레플리콘 벡터는 숙주 세포, 표적 세포, 또는 유기체에서 특정 기능(예컨대, 연장되거나 증가된 이분 면역수용체 발현)을 위해 시험관내, 생체내, 생체외 또는 인 실리카(in silica)에서 조작되거나 선택되었다. 예컨대, 자가 증폭 RNA 레플리콘의 상이한 변이체를 보유하는 숙주 세포 집단은 상이한 시점에서 하나 이상의 관심 분자(자가 증폭 RNA 레플리콘 또는 숙주 게놈에서 코딩됨)의 발현 수준을 기반으로 하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택되거나 조작된 자가 증폭 RNA 레플리콘은 타입 I 인터페론 반응, 선천적 항바이러스 반응, 또는 숙주 세포, 표적 세포, 또는 유기체에서 RNA 레플리콘의 단백질 발현이 더 오래 지속되거나 더 많이 발현되도록 하는 숙주 세포 또는 유기체로부터의 적응 면역 반응을 감소시키도록 변형되었다. 일부 실시양태에서, 이 최적화된 자가 증폭 RNA 레플리콘 서열은 원하는 표현형 특성(예컨대, 야생형 스트레인 또는 백신 스트레인과 비교하여 관심 분자의 더 높거나 더 지속적인 발현, 또는 벡터에 대한 감소된 선천적 항바이러스 면역 반응)을 갖는 개별 세포 또는 세포 집단으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 원하는 또는 선택된 자가 증폭 RNA 레플리콘 서열을 보유하는 세포는 자가 증폭 RNA 레플리콘을 포함하는 치료제로 치료된 후 유익한 반응 특징을 갖는 대상체(예컨대, 인간 또는 동물)(예컨대, 엘리트 반응자 또는 완전 관해의 대상체)로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 자가 증폭 RNA 레플리콘 벡터는 "수용자 세포의 추가의 게놈 조작" 및 "수용자 세포에 의해 발현되는 추가의 작용제"라는 표제의 섹션에서 기재되는 바와 같은 추가의 작용제를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-10, GM-CSF, TNF 알파, 그랜자임 B, 또는 이들의 조합과 같은 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 면역수용체의 발현에 직접적으로 영향을 미치거나 숙주 세포 표현형을 조절함으로써(예컨대, 아폽토시스아폽토시스 또는 확장을 유도) 이분 면역수용체의 발현을 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자가 증폭 RNA 레플리콘은 하나 이상의 서브-게놈 서열(들)을 함유하여 하나 이상의 서브-게놈 폴리뉴클레오티드(들)를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서브-게놈 폴리뉴클레오티드는 세포 번역 기구에 의한 번역을 위한 기능적 mRNA 분자로 작용한다. 서브-게놈 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제가 서브-게놈 서열로부터 서브-게놈 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 지시하는 자가 증폭 RNA 레플리콘 상의 정의된 서열 요소(예컨대, 서브-게놈 프로모터 또는 SGP)의 기능을 통해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, SGP는 RNA 의존적 RNA 폴리머라제(RDRP 또는 RdRp)에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 다중 SGP 서열은 단일 자가 증폭 RNA 레플리콘 상에 존재하고, 이분 면역수용체, 이분 면역수용체의 구성요소 또는 추가의 작용제를 코딩하는 서브-게놈 서열의 상류에 위치될 수 있다. 일부 실시양태에서, SGP 서열의 뉴클레오티드 길이 또는 조성은 서브-게놈 폴리뉴클레오티드의 발현 특징을 변경하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일하지 않은 SGP 서열은 상응하는 서브-게놈 폴리뉴클레오티드의 비율이 SGP 서열이 동일한 경우와 상이하도록 자가 증폭 RNA 레플리콘 상에 위치된다. 일부 실시양태에서, 동일하지 않은 SGP 서열은 이분 면역수용체 및 추가의 작용제(예컨대, 시토카인)의 생성을 지시하여 그들이 서로 상대적인 비율로 생성되어 이분 면역수용체의 발현을 증가시키거나, 표적 세포 또는 숙주에 대해 세포독성 효과 없이 표적 세포의 확장을 증가시키거나 빠르게 하거나, RNA 레플리콘에 대한 선천적 또는 적응 면역 반응을 약화시킨다. 일부 실시양태에서, 서로에 대한 서브-게놈 서열 및 SGP 서열의 위치 및 게놈 서열 자체는 서로에 대한 서브-게놈 폴리뉴클레오티드의 비율을 변경하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이분 면역수용체를 코딩하는 SGP 및 서브-게놈 서열은 이분 면역수용체의 발현이 추가의 작용제에 비해 실질적으로 증가되도록 추가의 작용제를 코딩하는 SGP 및 서브-게놈 영역의 하류에 위치될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 레플리콘 또는 SGP는 시토카인이 T 세포의 확장을 촉진하거나 이분 면역수용체의 치료 효과를 증가시키지만 시토카인 방출 증후군, 시토카인 폭풍 또는 신경 독성과 같은 심각한 부작용을 유발하지 않도록 최적량의 시토카인을 발현하도록 선택되거나 조작되었다.
일부 실시양태에서, TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄를 코딩하는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, TCRγ 쇄 및 TCRδ 쇄를 코딩하는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, BCR 또는 항체 중쇄 및 BCR 또는 항체 경쇄를 코딩하는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 자가 증폭 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 알파 바이러스, 백시나 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스 또는 이들의 슈도타입으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노중합체, 나노로드, 리포좀, 미셀, 마이크로버블, 세포 투과성 펩티드 또는 지질구로 제형화될 수 있다.
2개의 쇄의 발현은 2개의 프로모터 또는 1개의 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 경우에서, 2개의 프로모터가 사용된다. 일부 경우에서, 2개의 프로모터는 2개의 쇄에 대한 각각의 단백질 코딩 서열과 함께 헤드-대-헤드, 헤드-대-테일, 또는 테일-대-테일 배향으로 배열될 수 있다. 일부 경우에서, 하나의 프로모터가 사용된다. 2개의 단백질 코딩 서열은 하나의 프로모터가 두 쇄를 모두 발현하는 데 사용될 수 있도록 인-프레임으로 연결될 수 있다. 또한, 이러한 경우에서, 2개의 단백질 코딩 서열은 헤드-대-테일 배향으로 배열될 수 있고, 리보솜 결합 부위(예컨대, 내부 리보솜 결합 부위 또는 IRES), 프로테아제 절단 부위, 또는 바이시스트로닉 발현을 촉진하기 위한 자가 처리 절단 부위(예컨대, 2A 펩티드를 코딩하는 서열)와 연결될 수 있다. 일부 경우에서, 2개의 쇄는 단일 쇄 폴리펩티드로 발현될 수 있도록 펩티드 링커와 연결될 수 있다. 각각의 발현된 쇄는 재배열된 V(D)J 유전자를 포함하는 완전한 가변 도메인 서열을 함유할 수 있다. 각각의 발현된 쇄는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 전체 가변 도메인 서열을 함유할 수 있다. 각각의 발현된 쇄는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3을 포함하는 완전한 가변 도메인 서열을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 각각의 발현된 쇄는 불변 도메인 서열을 추가로 함유할 수 있다.
발현 벡터를 생성하기 위해, 추가의 서열이 융합된 면역수용체 유전자에 추가될 필요가 있을 수 있다. 이러한 추가의 서열은 벡터 골격(예컨대, 표적 세포 또는 이. 콜리(E. coli)와 같은 임시 숙주에서 벡터의 복제에 필요한 요소), 프로모터, IRES, 자가 절단 펩티드를 코딩하는 서열, 종결자, 보조 유전자(예컨대, 페이로드) 뿐만 아니라 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 부분 서열(예컨대, 불변 도메인을 코딩하는 서열의 일부)을 포함한다.
프로테아제 절단 부위는 엔테로키나제 절단 부위: (Asp)4Lys; 인자 Xa 절단 부위: Ile-Glu-Gly-Arg; 트롬빈 절단 부위, 예컨대 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser; 레닌 절단 부위, 예컨대 His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His; 콜라게나제 절단 부위, 예컨대 X-Gly-Pro(여기서, X는 임의의 아미노산임); 트립신 절단 부위, 예컨대 Arg-Lys; 바이러스성 프로테아제 절단 부위, 예컨대 피코르나바이러스로부터의 프로테아제 2A 절단 부위, A형 간염 바이러스 3C 절단 부위, 인간 리노바이러스 2A 프로테아제 절단 부위, 피코르나바이러스 3 프로테아제 절단 부위를 포함하지만 이에 제한되지 않는 바이러스 2A 또는 3C 프로테아제 절단 부위; 및 카스파제 프로테아제 절단 부위, 예컨대 카스파제-3에 의해 인식되고 절단되는 DEVD(여기서 절단은 제2 아스파르트산 잔기 이후에 발생함)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 프로테아제 절단 부위를 포함하는 발현 벡터를 제공하고, 여기서 프로테아제 절단 부위는 세포성 프로테아제 절단 부위 또는 바이러스성 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질 절단 부위는 푸린에 의해 인식되는 부위; IPNV의 VP4; 토바코 에치 바이러스(TEV) 프로테아제; 리노바이러스의 3C 프로테아제; PC5/6 프로테아제; PACE 프로테아제, LPC/PC7 프로테아제; 엔테로키나제; 인자 Xa 프로테아제; 트롬빈; 게네나제 I; MMP 프로테아제; 터닙 모자이크 포티바이러스의 핵 봉입체 단백질 a(N1a); 댕기 타입 4 플라비바이러스의 NS2B/NS3, 황열 바이러스의 NS3 프로테아제; 콜리플라워 모자이크 바이러스의 또는F V; KEX2 프로테아제; CB2; 또는 2A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 절단 부위는 바이러스 내부 절단 가능한 신호 펩티드 절단 부위이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 내부 절단 가능한 신호 펩티드 절단 부위는 인플루엔자 C 바이러스, C형 간염 바이러스, 한타바이러스, 플라비바이러스 또는 루벨라 바이러스의 부위를 포함한다.
본 개시내용의 벡터에 포함하기에 적합한 IRES 요소는 진핵 리보솜을 관여시킬 수 있는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRES 요소는 적어도 약 250개 염기쌍, 적어도 약 350개 염기쌍, 또는 적어도 약 500개 염기쌍이다. 본 개시내용의 IRES 요소는 바이러스, 포유동물 및 드로소필라(Drosophila)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유기체의 DNA로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에서, IRES 요소가 유래되는 바이러스 DNA는 피코르나바이러스 상보성 DNA(cDNA), 뇌심근염 바이러스(EMCV) cDNA 및 폴리오바이러스 cDNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. IRES 요소가 유래되는 포유동물 DNA의 예는 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP)을 코딩하는 DNA 및 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)를 코딩하는 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. IRES 요소가 유래되는 드로소필라 DNA의 예는 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster)로부터의 안테나페디아(Antennapedia) 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리오바이러스 IRES 요소의 추가의 예는, 예컨대 폴리오바이러스 IRES, 뇌심근염 바이러스 IRES 또는 A형 간염 바이러스 IRES를 포함한다. 플라비바이러스 IRES 요소의 예는 소 바이러스성 설사 바이러스 IRES 또는 고전적인 돼지 열 바이러스 IRES를 포함하지만 이에 제한되지 않는 C형 간염 바이러스 IRES, GB 바이러스 B IRES 또는 페스티바이러스 IRES를 포함한다.
자가 처리 절단 부위의 예는 인테인 서열; 변형된 인테인; 헤지혹 서열; 다른 혹(hog)-패밀리 서열; 2A 서열, 예컨대 구제역 바이러스(FMDV)로부터 유래된 2A 서열; 및 각각에 대한 이의 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
재조합 면역글로불린 또는 다른 단백질 발현을 위한 벡터는 임의의 수의 프로모터를 포함할 수 있으며, 여기서 프로모터는 구성적, 조절 가능 또는 유도성, 세포 타입 특이적, 조직 특이적 또는 종 특이적이다. 추가의 예는 테트라사이클린 반응성 프로모터를 포함한다. 벡터는 재조합적으로 융합된 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적응된 레플리콘일 수 있으며, 박테리아 세포, 예컨대 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)에서도 기능하는 레플리콘을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있으며, 여기서 유도는, 예컨대 특정 세포 타입 또는 특정 수준의 성숙과 관련된다. 대안적으로, 다수의 바이러스 프로모터가 적합할 수 있다. 프로모터의 예는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 시토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 연장 인자 1A(EF-1A) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 및 프렌드 비장 포커스-형성 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 인핸서와 관련되거나 관련되지 않을 수 있으며, 여기서 인핸서는 자연적으로 특정 프로모터와 관련되거나 상이한 프로모터와 관련될 수 있다.
유전자 발현을 위한 숙주 세포인 수용자 세포는 제한 없이 동물 세포, 특히 포유동물 세포이거나, 미생물 세포(박테리아, 효모 또는 진균) 또는 식물 세포일 수 있다. 숙주 세포의 예는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포와 같은 곤충 배양 세포, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모 세포, 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei), 아스페르길루스(Aspergillus), 아우레오바시둠(Aureobasidum) 및 페니실리움(Penicillium)과 같은 진균 뿐만 아니라 CHO(중국 햄스터 난소), BHK(베이비 햄스터 신장), COS, 293, 3T3(마우스), Vero(아프리카 녹색 원숭이) 세포와 같은 포유동물 세포를 포함하고, 제한 없이 돼지, 마우스, 래트, 양, 염소, 소를 포함한 다양한 트랜스제닉 동물 시스템도 사용될 수 있다. 배큘로바이러스, 특히 AcNPV 벡터는 본 개시내용의 단일 ORF 면역수용체 발현 및 절단을 위해, 예컨대 곤충 세포주에서 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강력한 프로모터의 조절 제어 하에 단일 ORF의 발현에 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서 사용되는 프로모터는 구성적이거나(헤르페스 바이러스 TK 프로모터; SV40 초기 프로모터; 라우스 육종 바이러스 프로모터; 시토메갈로바이러스 프로모터; 마우스 유선 종양 바이러스 프로모터) 또는 조절될 수 있다(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터. 벡터는 특정 포유동물 세포를 감염시키는 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 및 아데노바이러스 및 이들의 유도체를 기반으로 할 수 있다. 프로모터는 제한 없이 시토메갈로바이러스, 아데노바이러스 후기 및 백시니아 7.5K 프로모터를 포함한다. 에놀라제는 구성적 효모 프로모터의 예이며, 알콜 데히드로게나제는 조절된 프로모터의 예이다.
특정 프로모터, 전사 종결 서열 및 조직 특이적 서열을 코딩하는 서열과 같은 다른 임의적 서열의 선택은 발현이 수행되는 세포의 타입에 의해 결정될 수 있다. 이는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물, 곤충, 닭 또는 다른 동물 세포일 수 있다.
면역수용체 발현 벡터로부터 발현되는 면역수용체는 천연 형태일 수 있거나 조작된 형태일 수 있다. 일부 경우에서, 조작된 형태는 단일 쇄 항체 단편 또는 단일 쇄 TCR 단편이다. 예컨대, 유연한 링커는 항체의 중쇄의 가변 도메인과 경쇄의 가변 도메인을 연결하여 단일 쇄 항체 단편(즉, scFv)을 형성할 수 있다. 일부 경우에서, 조작된 형태는 TCR-CAR이다. 실시예 3, 4 및 5는 면역수용체 발현 벡터를 생성하기 위해 기능적 서열(예컨대, 불변 도메인 코딩 서열, P2A 링커 및 프로모터)을 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드에 추가로 융합하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 또한 이들 조작된 형태의 면역수용체를 발현하는 면역수용체 발현 벡터를 생성하기 위해 기능적 서열(예컨대, 링커CD28 TM 도메인)을 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드에 도입하는 데 사용될 수 있다.
소스 면역수용체 발현 세포
본원에 기재된 방법을 이용하여 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드가 생성될 수 있는 소스 면역수용체 발현 세포는 다양한 유기체로부터의 다양한 세포 타입일 수 있고 다양한 조직 또는 기관으로부터 단리될 수 있다. 소스 면역수용체 발현 세포는 다양한 샘플로부터 수득될 수 있다. 소스 면역수용체 발현 세포는 BCR, TCR 및 항체와 같은 면역수용체를 생성할 수 있다. 소스 면역수용체 발현 세포는 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 선천성 및/또는 적응 면역 반응의 개시 및/또는 실행에 기능적으로 관여된 조혈 기원의 세포를 지칭한다. 소스 면역수용체 발현 세포는 림프구, 예컨대 종양 침윤 림프구(TIL)일 수 있다.
소스 면역수용체 발현 세포를 호스팅하는 원래 부위는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리의 특징에 영향을 미칠 수 있으며, 결과적으로 생성된 면역수용체 발현 벡터 및 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 레퍼토리에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 레퍼토리의 특징의 측면은 유전자 사용 다양성일 수 있다.
일부 경우에서, 레퍼토리는 2개 초과, 5개 초과, 10개 초과, 50개 초과, 100개 초과, 500개 초과, 1,000개 초과, 5,000개 초과, 10,000개 초과, 50,000개 초과, 또는 100,000개 초과의 V(D)J 조합을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 레퍼토리가 2개 초과, 5개 초과, 10개 초과, 50개 초과, 100개 초과, 500개 초과, 1,000개 초과, 5,000개 초과, 10,000개 초과, 50,000개 초과, 또는 100,000개 초과의 상이한 V(D)J 조합을 함유할 수 있다. 이는 소스 면역수용체 발현 세포의 폴리클로날 집단이 V, D 및 J 유전자를 매우 다양한 양상으로 사용하여 매우 다양한 V(D)J 조합을 생성할 수 있기 때문이다.
융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 면역수용체 발현 벡터의 VJ 조합은 두 면역수용체 쇄에 의해 사용되는 V 유전자 및 J 유전자에 의해 정의될 수 있다. 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 면역수용체 발현 벡터의 V(D)J 조합은 두 면역수용체 쇄에 의해 사용되는 V 유전자, D 유전자 및 J 유전자에 의해 정의될 수 있다. 예컨대, TRAV8-4/TRAJ45/TRBV29-1/TRBJ1-5는 쌍을 이룬 TCR의 특정 VJ 재조합을 정의할 수 있다. 면역수용체 쇄에 대한 코딩 서열이 주어지면 V-Quest 및 MiXCR과 같은 계산 도구를 사용하여 V(D)J 조합을 추론할 수 있다.
2개의 상이한 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 (또는 2개의 상이한 면역수용체 발현 벡터)는 동일한 V(D)J 재조합을 공유할 수 있지만 상이한 서열을 가질 수 있다는 점에 유의해야 하며, 이는 (1) V(D)J 재조합 동안 무작위 삽입 및 결실이 VD, DJ 및 VJ 접합부에서 발생할 수 있으며 (2) 서열 변이가 돌연변이유발 및 유전자 합성에 의해 인공적으로 생성될 수 있으며, 가변 서열이 유전자 합성 동안 도입될 수 있기 때문일 수 있다. 예컨대, 2개의 융합된 TCR 유전자는 동일한 VJ 재조합을 가질 수 있지만 다른 CDR3 서열을 가질 수 있다. 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터는 소스 면역수용체 발현 세포로부터의 제1 면역수용체 쇄 및 제2 면역수용체 쇄의 동족 쌍 조합 (또는 세포에서 기본 쌍 조합)을 포함할 수 있다. 복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터는 복수의 면역수용체 발현 세포로부터의 제1 면역수용체 쇄 및 제2 면역수용체 쇄의 다중 동족 쌍 조합을 포함할 수 있다. 소스 면역수용체 발현 세포는 상이한 클론타입을 가질 수 있으며, 따라서 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터의 폴리클로날 집단을 생성할 수 있다. 폴리클로날 면역수용체 발현 벡터를 복수의 수용자 세포에 전달하는 것은 적어도 100, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 적어도 10,000,000, 또는 적어도 100,000,000개, 또는 그 초과의 상이한 면역수용체 (또는 면역수용체의 상이한 동족 쌍 조합)를 발현하는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 폴리클로날 집단을 생성할 수 있다. 상이한 면역수용체 각각은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드에서 고유한 서열을 가질 수 있다.
이 폴리클로날 특색은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 라이브러리, 발현 벡터의 라이브러리 및 이전에 보고된 대응물로부터 본 개시내용에 기재된 방법을 이용하여 수득되는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 폴리클로날 집단을 구별할 수 있다. 예컨대, 하나 또는 소수의 면역수용체 쇄 코딩 서열, 면역수용체 도메인 코딩 서열, 또는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드로 시작하고, 돌연변이유발 또는 에러 유발 PCR(error prone PCR)을 이용하여 이들 시작 서열의 많은 변이를 생성함으로써 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 대규모 라이브러리를 생성할 수 있다. 따라서, 이들 라이브러리는 하나 또는 소수의 V(D)J 유전자 조합을 함유할 수 있다. 대조적으로, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 라이브러리, 발현 벡터의 라이브러리 및 본 개시내용에 기재된 방법을 이용하여 수득되는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 폴리클로날 집단은 약 1,000개 초과, 약 5,000개 초과, 약 10,000개 초과, 약 50,000개 초과, 약 100,000개 초과, 약 500,000개 초과, 약 1,000,000개 초과, 약 5,000,000개 초과, 또는 약 10,000,000개 초과의 서열을 포함할 수 있으며, 약 1,000개 초과, 약 5,000개 초과, 약 10,000개 초과, 약 50,000개 초과, 약 100,000개 초과, 약 500,000개 초과, 약 1,000,000개 초과, 약 5,000,000개 초과, 또는 약 10,000,000개 초과의 VJ 또는 VDJ 조합을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 라이브러리, 발현 벡터의 라이브러리 및 본 개시내용에 기재된 방법을 이용하여 수득되는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 폴리클로날 집단은 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 VJ 또는 VDJ 조합을 함유할 수 있다. 또한, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 라이브러리, 발현 벡터의 라이브러리 및 본 개시내용에 기재된 방법을 이용하여 수득되는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 폴리클로날 집단은 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20개, 또는 그 초과의 상이한 TRAV(TCRα 쇄에 대한 V 유전자) 서브그룹, 및/또는 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20개, 또는 그 초과의 상이한 TRBV(TCRβ 쇄에 대한 V 유전자) 서브그룹을 함유할 수 있다.
샘플
소스 면역수용체 발현 세포는 다양한 샘플로부터 수득되거나 단리될 수 있다. 소스 면역수용체 발현 세포는 다양한 샘플로부터 수득되거나 단리된 면역 세포일 수 있다. 샘플은 본원에 기재된 다양한 소스 또는 대상체로부터 수득될 수 있다. 수용자 세포는 또한 본원에 기재된 샘플로부터 수득될 수 있다.
특정 실시양태에서, 소스 면역수용체 발현 세포는 잠재적인 임상적 중요성을 갖는 병원체-, 종양-, 및/또는 질환 특이적 항체 또는 TCR을 확인하기 위해 감염, 암, 자가면역 병태, 또는 임의의 다른 질환을 앓거나 면역화된 인간 또는 다른 동물과 같은 인간 또는 다른 동물과 같은 대상체 또는 숙주의 혈액 샘플 또는 다른 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 예컨대, 인간은 질환 진단을 받았거나, 질환의 증상을 나타내거나, 질환 진단을 받지 않았거나, 질환의 증상을 나타내지 않을 수 있다. 예컨대, 인간은 감염원(예컨대, 바이러스, 박테리아, 기생충, 프리온 등), 항원 또는 질환에 노출되고/되거나 이에 대해 유용한 항체 또는 TCR을 만들 수 있는 인간일 수 있다. 예컨대, 동물은 감염원(예컨대, 바이러스, 박테리아, 기생충, 프리온 등), 항원 또는 질환에 노출되고/되거나 이에 대한 유용한 항체 또는 TCR을 만들 수 있는 동물일 수 있다. 면역화된 숙주로부터의 특정 면역 세포는 문제의 하나 이상의 표적 항원 및/또는 하나 이상의 미지의 항원에 대한 항체 또는 TCR을 만들 수 있다. 본 개시내용에서, 림프구 풀은 샘플로부터 복수의 면역 세포를 생성하기 위해 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 자기 활성화된 세포 분류(MACS), 패닝 또는 다른 스크리닝 방법을 이용하여 세포를 스크리닝 및 분류하는 것과 같은 임의의 적합한 방법에 의해 원하는 면역 세포에 대해 농축될 수 있다.
면역 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포,보다 특히 비-인간 줄기 세포, 제대 혈액 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 대표적인 인간 줄기 세포는 CD34+ 세포일 수 있다. 단리된 면역 세포는 수지상 세포, 살해 수지상 세포, 비만 세포, 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, B 세포, 또는 염증 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 또는 CD4+CD8+ T 림프구일 수 있다.
일부 실시양태에서, 소스 면역수용체 발현 세포는 비-면역화된 인간 또는 비-인간 공여자로부터 단리된 면역 세포일 수 있다. 항체 또는 TCR 결합 부위의 서열 다양성은 배선에서 직접적으로 코딩되지 않을 수 있지만 V 유전자 분절로부터 조합 방식으로 조립될 수 있다. 면역화는 면역원에 결합하여 증식(클론 확장)하거나 상응하는 항체를 분비하는 VH-VL 또는 Va-Vβ 또는 Vγ-Vδ 조합을 만드는 임의의 면역 세포를 촉발할 수 있다. 그러나, 비면역화된 대상체로부터의 비장 세포 및/또는 면역 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구의 사용은 가능한 항체 또는 TCR 레퍼토리의 더 나은 표현을 제공할 수 있으며, 또한 임의의 동물 종을 사용하는 후속 BCR 또는 항체 또는 TCR 라이브러리의 구축을 허용할 수 있다.
일부 경우에서, 소스 면역수용체 발현 세포는 말초 혈액 샘플으로부터 수득될 수 있다. 말초 혈액 세포는 특정 세포 타입(예컨대, 단핵 세포; 적혈구; CD4+ 세포; CD8+ 세포; 면역 세포; T 세포, NK 세포 등)에 대해 농축될 수 있다. 말초 혈액 세포는 또한 특정 세포 타입(예컨대, 단핵 세포; 적혈구; CD4+ 세포; CD8+ 세포; 면역 세포; T 세포, NK 세포 등)이 선택적으로 고갈될 수 있다. 샘플은 상이한 BCR (또는 항체) 또는 TCR을 발현하는 개별 면역 세포의 적어도 약 5, 10, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 10000, 25000, 50000, 75000, 10000, 250000, 500000, 750000, 1000000, 2500000, 5000000, 7500000, 또는 10000000개의 서브세트를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 소스 면역수용체 발현 세포는 고체 조직, 비제한적인 예로서 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절(편도선을 포함), 갑상선, 흉선, 췌장, 심장, 골격근, 장, 후두, 식도 및 위로부터의 조직을 포함하는 조직 샘플로부터 수득될 수 있다. 추가적인 비제한적 소스는 골수, 제대 혈액, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직 및 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 건강한 공여자, 암으로 진단된 환자 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래되거나 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 상이한 표현형 특징을 나타내는 혼합된 세포 집단의 일부이다.
소스 면역수용체 발현 세포는 종양 침윤 림프구(TIL), 예컨대 종양 침윤 T 세포일 수 있다. TIL은 암에 걸린 기관으로부터 단리될 수 있다. 하나 이상의 세포는 뇌, 심장, 폐, 눈, 위, 췌장, 신장, 간, 장, 자궁, 방광, 피부, 모발, 손톱, 귀, 샘, 코, 입, 입술, 비장, 잇몸, 치아, 혀, 타액선, 편도선, 인두, 식도, 대장, 소장, 직장, 항문, 갑상선, 흉선, 골, 연골, 힘줄, 인대, 신상 캡슐, 골격근, 평활근, 혈관, 혈액, 척수, 기관, 요관, 요도, 시상하부, 뇌하수체, 유문, 부신, 난소, 난관, 자궁, 질, 유선, 고환, 정낭, 음경, 림프, 림프절 또는 림프관일 수 있는 암을 갖는 기관으로부터 단리될 수 있다. 하나 이상의 TIL은 뇌, 심장, 간, 피부, 장, 폐, 신장, 눈, 소장 또는 췌장으로터의 단리될 수 있다. TIL은 췌장, 신장, 눈, 간, 소장, 폐 또는 심장으로부터 단리될 수 있다. 하나 이상의 세포는 췌장도 세포, 예컨대 췌장 β 세포일 수 있다. 일부 경우에서, TIL은 위장암으로부터 단리될 수 있다. TIL 배양물은 다수의 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 종양은 비-암성 조직 또는 괴사 부위로부터 절단될 수 있다. 종양은 약 2-3 mm 길이로 단편화될 수 있다. 일부 경우에서, 종양은 약 0.5 mm 내지 약 5 mm, 약 1 mm 내지 약 2 mm, 약 2 mm 내지 약 3 mm, 약 3 mm 내지 약 4 mm, 또는 약 4 mm 내지 약 5 mm 크기로 단편화될 수 있다. 종양 단편은 배지 및 시토카인과 같은 세포 자극제를 사용하여 시험관내에서 배양될 수 있다. 일부 경우에서, IL-2를 사용하여 종양 단편으로부터 TIL을 확장시킬 수 있다. IL-2의 농도는 약 6000 IU/mL일 수 있다. IL-2의 농도는 또한 약 2000 IU/mL, 3000 IU/mL, 4000 IU/mL, 5000 IU/mL, 6000 IU/mL, 7000 IU/mL, 8000 IU/mL, 9000 IU/mL, 또는 최대 약 10000 IU/mL일 수 있다. TIL이 확장되면 종양 반응성을 결정하기 위해 시험관내 검정을 받을 수 있다. 예컨대, TIL은 CD3, CD4, CD8 및 CD58 발현에 대해 FACs에 의해 평가될 수 있다. TIL은 또한 공동배양, 세포독성, ELISA 또는 ELISPOT 검정을 받을 수 있다. 일부 경우에서, TIL 배양물은 저온보존되거나 신속 확장을 거칠 수 있다. TIL과 같은 세포는 태아, 신생아, 청년 및 성인을 포함하지만 이에 제한되지 않는 발달 단계의 공여자로부터 단리될 수 있다.
하나 이상의 샘플은 하나 이상의 소스로부터의 것일 수 있다. 하나 이상의 샘플은 2개 이상의 소스로부터의 것일 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 대상체로부터의 것일 수 있다. 하나 이상의 샘플은 2개 이상의 대상체로부터 것일 수 있다. 하나 이상의 샘플은 동일한 대상체로부터 것일 수 있다. 하나 이상의 대상체는 동일 종으로부터의 것일 수 있다. 하나 이상의 대상체는 상이한 종으로부터의 것일 수 있다. 하나 이상의 대상체는 건강할 수 있다. 하나 이상의 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 걸릴 수 있다.
샘플은 병태를 갖는 대상체로부터 채취될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플을 채취한 대상체는 환자, 예컨대 암 환자 또는 암을 갖는 것으로 의심되는 환자일 수 있다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간일 수 있고 남성 또는 여성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 여성은 임신 중이다. 샘플은 종양 생검일 수 있다. 생검은, 예컨대 의사, 의사 보조자, 간호사, 수의사, 치과 의사, 척추 지압사, 구급대원, 피부과 전문의, 종양 전문의, 위장병 전문의 또는 외과의를 포함한 의료 서비스 제공자에 의해 수행될 수 있다.
대상체는 표적 항원이 발현되는 질환을 가질 수 있다. 예컨대, 질환은 B 세포 림프종, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 부신피질암, AIDS 관련된 암, 항문암, 충수암, 별아교세포종, 비전형성 기형/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 간외암, 방광암, 골암(유잉 육종 및 골육종 및 악성 섬유성 조직구종 포함), 뇌종양, 유방암, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양(위장), 원발 불명 암종, 중추 신경계, 림프종, 원발성, 자궁경부암, 담관 암종, 만성 림프구성 백혈병(cll), 만성 골수형성 백혈병(cml), 만성 골수증식성 신생물, 결장직장암, 피부 T 세포 림프종, 제자리 관 암종(dcis), 자궁내막암, 식도, 유잉 육종, 성선외 생식 세포 종양, 안암, 안내 흑색종, 망막모세포종, 나팔관암, 골 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종, 담낭암, 위(gastric, stomach)암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양(gist), 생식 세포 종양, 성선외, 난소, 고환, 임신성 영양막 질환, 신경아교종, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간)암, 조직구증, 랑게르한스 세포, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 섬세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 카포시 육종, 신장, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 입술 및 구강(oral cavity)암, 간암(원발성), 폐암, 림프종, 거대글로불린혈증, 발덴스트롬, 남성 유방암, 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종, 흑색종, 흑색종, 안내(눈), 머켈 세포 암종, 중피종, 잠복 원발성을 갖는 악성, 전이성 편평 경부암, 구강암(mouth cancer), 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물 및 만성 골수증식성 신생물, 골수형성 백혈병, 만성(cml), 골수성 백혈병, 급성(AML), 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종. 비-소세포 폐암, 구강암(oral cancer), 입술 및 구강(oral cavity)암 및 구인두암, 골육종 및 골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 췌장암 및 췌장 신경내분비 종양(섬세포 종양), 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 임신 및 유방암, 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종, 원발성 복막암, 전립선암, 직장암, 신세포(신장)암, 망막 모세포종, 침샘암, 육종, 유잉 육종, 카포시 육종, 골육종, 횡문근육종, 자궁 육종, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 잠복 원발성을 갖는 편평 경부암, 전이성 위(stomach, gastric)암, T 세포 림프종, 피부암, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선암, 갑상선암, 신장 골반 및 요관의 이행 세포암, 요관 및 신장 골반, 이행 세포암, 요도암, 자궁암, 자궁내막 및 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 거대 글로불린혈증 또는 빌름스 종양을 포함하는 암일 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플은 혈액, 타액, 림프, 소변, 뇌척수액, 정액, 가래, 대변 또는 조직 균질물과 같은 유체이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 타액이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 전혈이다. 일부 실시양태에서, 시험을 위한 충분한 양의 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 적어도 약 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mL의 혈액 부피를 채취한다. 일부 경우에서, 혈액은 EDTA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 마그네슘 킬레이터를 함유하는 장치에 수집될 수 있으며 4℃에서 저장된다. 임의적으로, EGTA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 칼슘 킬레이터가 첨가될 수 있다. 일부 경우에서, 포름알데히드, 포름알데히드 유도체, 포르말린, 글루타르알데히드, 글루타르알데히드 유도체, 단백질 가교제, 핵산 가교제, 단백질 및 핵산 가교제, 1차 아민 반응성 가교제, 술프히드릴 반응성 가교제, 술프히드릴 첨가 또는 디술파이드 환원, 탄수화물 반응성 가교제, 카르복실 반응성 가교제, 광반응성 가교제 또는 절단 가능한 가교제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 용해 억제제가 혈액에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 비-핵산 물질은 효소 처리(예컨대, 프로테아제 분해)를 이용하여 출발 물질로부터 제거될 수 있다.
복수의 샘플은 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 또는 그 초과의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 또는 그 초과의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000개 샘플, 9000개 또는 10,000개 샘플, 또는 100,000개 샘플, 또는 1,000,000개 또는 그초과의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 10,000개의 샘플을 포함할 수 있다.
제1 샘플은 하나 이상의 세포를 포함할 수 있고 제2 샘플은 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 제1 샘플의 하나 이상의 세포는 제2 샘플의 하나 이상의 세포와 동일한 세포 타입일 수 있다. 제1 샘플의 하나 이상의 세포는 복수의 샘플의 하나 이상의 상이한 세포와 상이한 세포 타입일 수 있다.
복수의 샘플은 함께 수득될 수 있다. 복수의 샘플은 동시에 수득될 수 있다. 복수의 샘플은 순차적으로 수득될 수 있다. 복수의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 수득한 후 수년간, 예컨대 100년, 10년, 5년, 4년, 3년, 2년 또는 1년에 걸쳐 수득될 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 수득한 후 약 1년 이내에 수득될 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 수득한 후 12개월, 11개월, 10개월, 9개월, 8개월, 7개월, 6개월, 4개월, 3개월, 2개월 또는 1개월 이내에 수득될 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 수득한 후 30일, 28일, 26일, 24일, 21일, 20일, 18일, 17일, 16일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 이내에 수득될 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 수득한 후 약 24시간, 22시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 2시간 또는 1시간 이내에 수득될 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 수득한 후 약 60초, 45초, 30초, 20초, 10초, 5초, 2초 또는 1초 이내에 수득될 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 수득한 후 1초 미만 이내에 수득될 수 있다.
T 세포의 소스
T 세포는 대상체(예컨대, 1차 T 세포)로부터 수득될 수 있다. 일부 경우에서, 소스 TCR 발현 세포는 대상체로부터 수득된다. T 세포는 본원에 기재된 임의의 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 경우에서, 수용자 T 세포는 대상체로부터 수득된다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예컨대, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대 혈액, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직 및 종양을 포함한 다수의 소스로부터 수득될 수 있다. 특정 측면에서, T 세포주가 사용될 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 알파 베타 T 세포 또는 감마 델타 T 세포일 수 있다. 본 개시내용의 특정 측면에서, T 세포는 Ficoll™ 분리와 같은 다양한 기술을 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 수득될 수 있다. 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득될 수 있다. 성분채집 산물은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유할 수 있다. 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 버퍼 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척될 수 있다. 일부 경우에서, 세포를 포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 세척할 수 있다. 세척 용액은 칼슘, 마그네슘 또는 다른 2가 양이온이 결여될 수 있다. 칼슘 부재 하에서 초기 활성화 단계는 활성화를 확대할 수 있다. 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 "플로우-스루(flow-through)" 원심분리기(예컨대, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같은 방법으로 수행될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 버퍼, 예컨대 Ca-비함유, Mg-비함유 PBS, 플라스말리트 A(PlasmaLyte A), 또는 버퍼가 있거나 없는 다른 식염수 용액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
한 측면에서, T 세포는 예컨대 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 용출에 의해 적혈구를 용해하고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구 또는 조직으로부터 단리된다. 조직에서 T 세포를 단리하는 경우(예컨대, 종양 조직에서 종양 침윤 T 세포를 단리), 조직은 적혈구를 용해시키거나 단핵구를 고갈시키기 전에 세포를 분해하기 위해 다져지거나 단편화된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포와 같은 T 세포의 특정 서브집단은 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예컨대, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선별에 충분한 기간 동안 DYNABEADS™ M-450 CD3/CD28 T와 같은 항-CD3/항-CD28(예컨대, 3x28)-접합된 비드와의 인큐베이션에 의해 단리될 수 있다. 한 측면에서, 기간은 약 30분이다. 추가의 측면에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 초과 및 그 사이의 모든 정수의 범위이다. 추가의 측면에서, 기간은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 또 다른 측면에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 한 측면에서, 인큐베이션 시간은 약 24시간이다. 더 긴 인큐베이션 시간은, 예컨대, 종양 조직으로부터 또는 면역 손상 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL) 분리 시, 다른 세포 타입에 비해 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서 T 세포를 분리하는 데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하면 CD8+ T 세포 포획의 효율성을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 항-CD3/항-CD28 비드에 결합하는 시간을 단순히 단축 또는 연장하고/하거나 비드 대 T 세포의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 서브집단은 배양 개시 시 또는 과정 동안의 다른 시점에 선별될 수 있다. 또한, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 서브집단은 배양 개시 시 또는 다른 원하는 시점에 선별될 수 있다. 일부 경우에서, 다중 라운드의 선별을 사용할 수 있다. 특정 측면에서, 선별 절차가 수행될 수 있고, "선별되지 않은" 세포(항-CD3/항-CD28 비드에 결합하지 않을 수 있는 세포)가 활성화 및 확장 과정에서 사용될 수 있다. "선별되지 않은" 세포도 추가의 라운드의 선별에 적용될 수 있다.
음성 선별에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선별되는 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 하나의 예시적인 방법은 음성으로 선별되는 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지시되는 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역 부착 또는 유동 세포측정을 통한 세포 분류 및/또는 선별이다. 예컨대, 음성 선별에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 농축하거나 양성적으로 선별하는 것이 유용할 수 있다. 대안적으로, 특정 측면에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선별 방법에 의해 고갈된다.
한 실시양태에서, IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 및 퍼포린, 또는 다른 적합한 분자, 예컨대 다른 시토카인 및 전사 인자, 예컨대 T-bet, Eomes, Tcf1(인간에서 TCF7) 중 하나 이상을 발현하는 T 세포 집단이 선별될 수 있다. 세포 발현을 위한 스크리닝 방법은, 예컨대 PCT 공개 번호: WO 2013/126712에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선별에 의한 원하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면(예컨대, 비드와 같은 입자)의 농도는 변할 수 있다. 특정 측면에서, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피는 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 감소될 수 있다(예컨대, 세포 농도의 증가). 예컨대, 한 측면에서 2,000,000,000개 세포/mL의 농도가 사용된다. 또 다른 측면에서, 1,000,000,000개 세포/mL의 농도가 사용된다. 추가의 측면에서, 100,000,000개 세포/mL 초과가 사용된다. 추가의 측면에서, 적어도 약 10,000,000, 15,000,000, 20,000,000, 25,000,000, 30,000,000, 35,000,000, 40,000,000, 45,000,000, 또는 50,000,000개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 일부 측면에서, 적어도 약 75,000,000, 80,000,000, 85,000,000, 90,000,000, 95,000,000 또는 100,000,000개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 일부 측면에서, 적어도 약 125,000,000 또는 150,000,000개 세포/mL의 세포 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28 음성 T 세포와 같은 표적 관심 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(예컨대, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있다. 예컨대, 고농도의 세포를 사용하면 CD28 발현이 보다 약할 수 있는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선별할 수 있다.
일부 경우에서, 더 낮은 농도의 세포가 사용될 수 있다. T 세포와 표면의 혼합물을 크게 희석함으로써 입자와 세포 간의 상호 작용을 최소화할 수 있다. 이는 입자에 결합할 원하는 항원을 다량으로 발현하는 세포를 선별할 수 있다. 예컨대, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현할 수 있으며, 희석된 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획될 수 있다. 일부 측면에서, 사용되는 세포의 농도는 적어도 약 5x105/mL, 5x106/mL, 또는 그 초과이다. 다른 측면에서, 사용되는 농도는 약 1x105/mL 내지 1x106/mL, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다. 다른 측면에서, 세포는 2-10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 길이 동안 회전자에서 인큐베이션될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수도 있다. 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단 내의 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공할 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 이러한 맥락에서 많은 동결 용액 및 파라미터가 유용할 수 있지만, 사용될 수 있는 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스말라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 헤스판 및 플라스말라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 수반한다. 이어서, 세포를 -80℃로 동결하고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상태에 저장할 수 있다. 세포는 -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결에 의해 동결될 수 있다. 특정 측면에서, 저온보존된 세포는 본원에서 기재되는 바와 같이 해동 및 세척되고, 활성화 전에 1시간 동안 실온에서 둔다.
또한, 확장된 세포(예컨대, T 세포 요법을 위해 TCR을 발현하는 조작된 세포)가 필요할 수 있기 전의 기간에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집 산물의 수집이 본 개시내용의 맥락에서 고려된다. 따라서, 확장될 세포의 소스는 필요한 어떠한 시점에서든 수집될 수 있으며, T 세포와 같은 원하는 세포는 본원에 기재된 것과 같이 T 세포 요법로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 수의 질환 또는 병태에 대한 T 세포 요법에 나중에 사용하기 위해 단리되고 동결된다. 일부 경우에서, 혈액 샘플 또는 성분채집물은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채집된다. 특정 측면에서, 혈액 샘플 또는 성분채집물은 질환이 발병할 위험이 있지만 아직 질환이 발병되하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되며, 관심 세포는 나중에 사용하기 위해 단리 및 동결된다. 특정 측면에서, T 세포는 확장되고, 동결되고, 나중에 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 샘플은 본원에 기재된 특정 질환의 진단 직후 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가의 측면에서, 세포는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대 캄프쓰(CAMPATH), 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 방사선조사와 같은 작용제를 사용한 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 방식 이전에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집물로부터 단리된다.
본 개시내용의 추가의 측면에서, T 세포는 대상체에게 기능적 T 세포를 남기는 치료 직후 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 정상적으로 치료로부터 회복되는 기간 동안 치료 직후, 수득되는 T 세포의 품질이 최적이거나 생체외에서 확장할 능력이 개선된다는 것이 관찰되었다. 따라서, 이 회복 단계 동안에 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 개시내용의 맥락 내에서 고려된다. 또한, 특정 측면에서, 특히 요법 후 정의된 시간의 창 동안 특정 세포 타입의 재집단화, 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호되는 대상체에서의 상태를 생성하기 위해 동원(예컨대, GM-CSF를 사용한 동원) 및 컨디셔닝 요법이 이용될 수 있다. 예시적인 세포 타입은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 다른 면역계 세포를 포함한다.
대상체로부터 수득된 1차 T 세포 외에, 소스 세포 또는 수용자 세포로 사용되는 T 세포는 세포주 T 세포와 같은 세포주 세포일 수 있다. 세포주 T 세포의 예는 저캇, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-T1, TALL-1, MOLT 16/17 및 HUT 78/H9를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
T 세포는 시험관내 배양으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 조직 또는 세포와 접촉함으로써 시험관내에서 활성화 또는 확장될 수 있다. "활성화 및 확장" 섹션을 참조한다. 예컨대, 환자의 말초 혈액에서 단리된 T 세포는 종양 세포, 종양 조직, 종양구, 종양 용해물 펄싱된 APC 또는 종양 mRNA 로딩된 APC와 같은 종양 항원을 제시하는 세포와 공동 배양될 수 있다. 종양 항원을 제시하는 세포는 정의된 항원, 정의된 항원 세트 또는 정의되지 않은 항원 세트(예컨대, 종양 용해물 또는 전체 종양 mRNA)로 펄싱되거나 이를 발현하도록 조작될 수 있다. 예컨대, 정의된 항원을 제시하는 경우, APC는 공지된 서열을 갖는 하나 이상의 짧은 에피토프(예컨대, 7 내지 13개 아미노산 길이)를 코딩하는 하나 이상의 미니겐을 발현할 수 있다. APC는 또한 2개 이상의 에피토프를 코딩하는 서열을 함유하는 벡터로부터 2개 이상의 미니겐을 발현할 수 있다. 정의되지 않은 항원을 제시하는 경우, APC는 종양 용해물 또는 전체 종양 mRNA로 펄싱될 수 있다. 종양 항원을 제시하는 세포는 공동 배양 전에 조사될 수 있다. 공동 배양은 공동 자극 신호 또는 시토카인을 제공할 수 있는 시약(예컨대, 항-CD28 항체)을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다. 이러한 공동 배양은 종양 항원 반응성 T 세포를 자극 및/또는 확장시킬 수 있다. 이들 세포는 본원에 기재된 세포 표면 마커(예컨대, CD25, CD69, CD137)를 사용하여 선별되거나 농축될 수 있다. 이 방법을 이용하면 환자의 말초 혈액으로부터 종양 항원 반응성 T 세포를 사전 농축시킬 수 있다. 이들 사전 농축된 T 세포는 본원에 기재된 방법을 이용하여 융합된 (또는 물리적으로 연결된) TCR을 수득하기 위한 인풋으로 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 사전 농축된 T 세포는, 예컨대 단일 세포 바코드를 사용하는 시퀀싱에 의해 TCR의 동족 쌍을 확인하기 위한 임의의 다른 방법에 따라 인풋으로 사용될 수 있다. 사전 농축된 T 세포(예컨대, CD137+)는 공동 배양 동안 마커(예컨대, CD137) 발현을 획득한 T 세포를 함유할 수 있으며, 또한 채혈 시 이미 마커를 발현하는 T 세포를 함유할 수 있다. 그럼에도 불구하고 후자의 집단은 종양에 반응할 수 있다. 이 방법은 기재된 TIL을 단리하는 것보다 더 쉬운 대안을 제공할 수 있다.
면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포
본원에서 기재되는 바와 같은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포를 생성하기 위해 새로운 숙주 세포(본 개시내용에서 "수용자 세포"로 지칭됨)에 도입될 수 있다. 상이한 목적을 위해, 상이한 타입의 면역수용체가 상이한 타입의 수용자 세포에 도입될 수 있다. 예컨대, 항체는 발현을 위해 다양한 1차 세포(예컨대, B 세포) 또는 세포주(예컨대, HeLa 세포, CHO 세포)에 도입될 수 있다. 예컨대, TCR은 T 세포에 새로운 특이성을 부여하기 위해 T 세포에 도입될 수 있다. 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 표적 분자 또는 세포를 감지(예컨대, 인식 또는 결합)하기 위해 새로 도입된 면역수용체를 사용할 수 있다. 예컨대, 표적 분자는 항원 또는 이의 단편일 수 있다. 표적 분자는 펩티드일 수 있다. 표적 분자는 에피토프일 수 있다.
수용자 세포의 소스
수용자 세포는 "샘플" 섹션에서 기재되는 바와 같은 샘플로부터 수득될 수 있다. 수용자 세포로서의 T 세포는 "T 세포의 소스" 섹션에서 기재되는 바와 같은 소스로부터 유래될 수 있다. 수용자 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 과립구, 호산구, 적혈구, 혈소판, 줄기 세포, iPSC, 또는 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 또한, 수용자 세포는 세포주 세포일 수 있다. 세포주는 종양형성 또는 인공적으로 불멸화된 세포주일 수 있다. 세포주의 예는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; 저캇 세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; 및 Molt 4 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 수용자 세포는 자가 T 세포 또는 동종이계 T 세포일 수 있다. 수용자 세포는 유전자 변형되거나 조작된 세포일 수 있다.
활성화 및 확장
면역수용체 발현 벡터를 T 세포에 전달하기 전 또는 후에 T 세포는 일반적으로, 예컨대 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화되고 확장될 수 있다. T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 확장될 수 있다.
T 세포는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하기 위해 T 세포 표면 상의 CD3 TCR 복합체 및 공동 자극 분자를 자극하는 작용제와 접촉함으로써 확장될 수 있다. 예컨대, 칼슘 이오노포어 A23187, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 또는 식물적혈구응집소(PHA)과 같은 유사분열 렉틴과 같은 화학물질을 사용하여 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성할 수 있다. 비제한적인 예로서, T 세포 집단은 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성인자(예컨대, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해서와 같이 시험관내에서 자극될 수 있다. T 세포 표면 상의 보조 분자의 공동 자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예컨대, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체의 증식을 자극하기 위해서. 예컨대, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 상태이거나 표면에 커플링될 수 있다. 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 추가의 실시양태에서, T 세포와 같은 세포는 작용제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포는 후속적으로 분리된 다음, 세포는 배양된다. 대안적인 실시양태에서, 배양 전에, 작용제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청(예컨대, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-g, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 세포 성장을 위한 다른 첨가제를 포함하여 증식 및 생존력에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예컨대, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 5, (Lonza))를 포함한다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트 및 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 및 X-Vivo 20, 옵티마이저를 포함할 수 있으며, 아미노산, 나트륨 피루베이트 및 비타민이 추가되고, 무혈청이거나 적절량의 혈청 (또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 시토카인(들)로 보충된다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예컨대 적절한 온도(예컨대, 37℃) 및 대기(예컨대, 공기 + 5% CO2)에서 유지될 수 있다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포는 조직 또는 세포와 공동 배양함으로써 활성화되거나 확장될 수 있다. T 세포를 활성화시키는 데 사용되는 세포는 APC 또는 인공 APC(aAPC)일 수 있다. APC는 수지상 세포, 대식세포 또는 B 세포와 같은 전문적 APC일 수 있다. APC는 단핵구 또는 단핵구 유래된 수지상 세포일 수 있다. aAPC는 T 세포 수용체 및 공동 자극 분자에 대한 리간드를 발현할 수 있으며, 일부 경우에서, 그들의 효능과 기능을 향상시키면서 전달을 위해 T 세포를 활성화 및 확장시킬 수 있다. aAPC는 T 세포 활성화를 위한 임의의 유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. aAPC는 T 세포 확장을 위한 임의의 유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. aAPC는 비드, 세포, 단백질, 항체, 시토카인, 또는 임의의 조합일 수 있다. aAPC는 게놈 이식을 받을 수 있는 세포 집단에 신호를 전달할 수 있다. 예컨대, aAPC는 신호 1, 신호, 2, 신호 3 또는 임의의 조합을 전달할 수 있다. 신호 1은 항원 인식 신호일 수 있다. 예컨대, 신호 1은 펩티드-MHC 복합체에 의한 TCR의 리게이션이거나 CD3 신호-전달 복합체의 활성화로 이어질 수 있는 CD3를 향한 효능작용적 항체의 결합일 수 있다. 신호 2는 공동 자극 신호일 수 있다. 예컨대, 공동 자극 신호는 각각 ICOS-L, CD70 및 4-1BBL에 결합하는 항-CD28, 유도성 공동 자극자(ICOS), CD27 및 4-1BB(CD137)일 수 있다. 신호 3은 임의의 시토카인 신호일 수 있다. 시토카인은 임의의 시토카인일 수 있다. 시토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 경우에서, aAPC를 사용하여 세포 집단을 활성화 및/또는 확장시킬 수 있다. 일부 경우에서, 인위물은 동종특이성을 유도할 수 없다. 일부 경우에서, aAPC는 HLA를 발현할 수 없다. aAPC는 활성화 및/또는 자극에 사용될 수 있는 유전자를 안정적으로 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 일부 경우에서, K562 세포가 활성화에 사용될 수 있다. K562 세포가 또한 확장에 사용될 수 있다. K562 세포는 인간 적백혈병 세포주일 수 있다. K562 세포는 관심 유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. K562 세포는 HLA 클래스 I, II 또는 CD1d 분자를 내인적으로 발현할 수 없지만 ICAM-1(CD54) 및 LFA-3(CD58)을 발현할 수 있다. K562는 신호 1을 T 세포에 전달하도록 조작될 수 있다. 예컨대, K562 세포는 HLA 클래스 I을 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에서, K562 세포는 B7, CD80, CD83, CD86, CD32, CD64, 4-1BBL, 항-CD3, 항-CD3 mAb, 항-CD28, 항-CD28mAb, CD1d, 항-CD2, 막 결합된 IL-15, 막 결합된 IL-17, 막 결합된 IL-21, 막 결합된 IL-2, 말단절단된 CD19, 또는 임의의 조합과 같은 추가의 분자를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에서, 조작된 K562 세포는 CD80 및 CD83에 더하여 막 형태의 항-CD3 mAb, 클론 OKT3을 발현할 수 있다. 일부 경우에서, 조작된 K562 세포는 CD80 및 CD83에 더하여 막 형태의 항-CD3 mAb, 클론 OKT3, 막 형태의 항-CD28 mAb를 발현할 수 있다.
일부 경우에서, 세포의 재자극은 항원 및 피더 PBMC와 같은 조사된 조직적합성 APC로 수행될 수 있다. 일부 경우에서, PHA 및 동종 피더 세포와 같은 비특이적 유사분열물질을 사용하여 세포를 성장시킬 수 있다. 피더 PBMC는 40 Gy에서 조사될 수 있다. 피더 PBMC는 약 10 Gy 내지 약 15 Gy, 약 15 Gy 내지 약 20 Gy, 약 20Gy 내지 약 25 Gy, 약 25 Gy 내지 약 30 Gy, 약 30 Gy 내지 약 35 Gy, 약 35 Gy 내지 약 40 Gy, 약 40 Gy 내지 약 45 Gy, 약 45 Gy 내지 약 50 Gy에서 조사될 수 있다. 일부 경우에서, 조사된 피더 세포의 대조군 플라스크는 항-CD3 및 IL-2로만 자극될 수 있다.
aAPC는 비드일 수 있다. 구형 폴리스티렌 비드는 CD3 및 CD28에 대한 항체로 코팅되어 T 세포 활성화에 사용될 수 있다. 비드는 임의의 크기일 수 있다. 일부 경우에서, 비드는 약 3 및 6 마이크로미터일 수 있다. 비드는 크기가 약 4.5 마이크로미터일 수 있다. 비드는 임의의 세포 대 비드 비율로 활용될 수 있다. 예컨대, 밀리리터당 1,000,000개의 세포에서 3:1 비드 대 세포 비율이 사용될 수 있다. aAPC는 또한 강성 구형 입자, 폴리스티렌 라텍스 마이크로비드, 자기 나노- 또는 마이크로-입자, 나노크기 양자점, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 마이크로구, 비구형 입자, 탄소 나노튜브 번들, 타원 PLGA 마이크로 입자, 나노웜, 유체 지질 이중층 함유 시스템, 2D-지지된 지질 이중층(2D-SLB), 리포좀, RAFTsome/마이크로도메인 리포좀, SLB 입자 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 경우에서, aAPC는 CD4 T 세포를 확장시킬 수 있다. 예컨대, aAPC는 HLA 클래스 II 제한된 CD4 T 세포의 항원 처리 및 제시 경로를 모방하도록 조작될 수 있다. K562는 HLA-D, DPα, DPβ 쇄, Ii, DMα, DMβ, CD80, CD83 또는 이들의 조합을 발현하도록 조작될 수 있다. 예컨대, 조작된 K562 세포는 HLA 제한된 항원 특이적 CD4 T 세포를 확장시키기 위해 HLA 제한된 펩티드로 펄싱될 수 있다.
일부 경우에서, aAPC의 사용은 T 세포 활성화, 확장 또는 임의의 조합을 위해 외인적으로 도입된 시토카인과 조합될 수 있다. 세포는 또한 생체내, 예컨대 게놈 이식된 세포를 대상체에게 투여한 후 대상체의 혈액에서 확장될 수 있다.
세포(예컨대, 수용자 세포)는 또한 생체내, 예컨대 세포를 대상체에게 투여한 후 대상체의 혈액에서 확장될 수 있다.
오조립의 방지
일부 경우에서, 면역수용체 발현 벡터는 내인성 이분 면역수용체를 발현하는 수용자 세포에 도입될 수 있다. 이러한 경우에서, 내인성 면역수용체와 외인성 면역수용체 간의 오조립이 방지될 수 있다. 예컨대, TCR 발현 벡터가 T 세포에 도입되는 경우, (게놈으로부터의) 내인성 TCR 쇄와 (벡터로부터의) 외인성 TCR 쇄가 모두 발현될 수 있다. 따라서, 내인성 알파 쇄가 외인성 베타 쇄와 함께 이량체를 형성하여 원치 않는 TCR(즉, 오조립된 TCR)을 초래할 가능성이 있다. 유사한 상황이 BCR 프로그래밍된 B 세포에서 발생할 수 있다. 면역수용체 쇄의 불변 도메인을 조작하거나 면역수용체를 코딩하는 내인성 유전자를 녹아웃/다운하여, 예컨대 디술파이드 결합을 조작(Kuball 2007), 도메인 스와핑(Bethune 2016), RNA 간섭에 의한 녹다운(Bunse 2014), 유전자 녹아웃(Provasi 2012), TCR의 일부를 뮤린화, TCR을 단일 쇄로 발현(Uckert and Schumacher, 2009), TCR-CAR 구축물에서 TCR을 발현(Walseng et al., 2017)하여 이러한 오조립을 최소화하기 위한 다양한 방법이 이용될 수 있다.
일부 경우에서, 면역수용체 쇄의 불변 도메인을 코딩하는 서열은 돌연변이유발에 의해 조작된다. 일부 경우에서, 2개의 면역수용체 쇄의 두 불변 도메인을 코딩하는 서열은 하나 이상의 시스테인이 각각의 쇄의 접촉 영역에 도입될 수 있도록 조작된다. 일부 경우에서, 2개의 면역수용체 쇄의 두 불변 도메인을 코딩하는 서열은 발현된 면역수용체의 2개의 쇄 사이에 하나 이상의 디술파이드 결합이 형성될 수 있도록 조작된다. 예컨대, 하나 이상의 시스테인이 면역수용체의 두 쇄(예컨대, TCRα 및 TCRβ 쇄 또는 BCR 중쇄 및 경쇄)의 각각의 불변 도메인에 도입될 수 있으며, 디술파이드 결합(들)이 시스테인 사이에 형성될 수 있다.
일부 경우에서, 면역수용체의 2개의 쇄의 불변 도메인을 코딩하는 서열은 서열이 수용자 세포가 수득되는 종과 상이한 종에서 발견되는 불변 도메인을 코딩하도록 조작된다. 예컨대, 수용자 세포가 인간으로부터 수득되는 경우, 면역수용체의 2개의 쇄의 불변 도메인을 코딩하는 서열은 마우스에서 발견되는 면역수용체의 불변 도메인을 코딩하는 서열로 변경될 수 있다(즉, 뮤린화).
일부 경우에서, 제1 쇄(예컨대, TCRα 쇄)의 제1 불변 도메인을 코딩하는 제1 서열의 제1 분절 및 제2 쇄(예컨대, TCRβ 쇄)의 제2 불변 도메인을 코딩하는 제2 서열의 제2 분절은 스와핑된다. 예컨대, 스와핑 후에 오조립된 TCR 분자는 CD3 또는 신호와 제대로 조립되지 않을 수 있다.
일부 경우에서, 제1 쇄(예컨대, TCRα 쇄)의 제1 불변 도메인을 코딩하는 제1 서열의 제1 분절 및 제2 쇄(예컨대, TCRβ 쇄)의 제2 불변 도메인을 코딩하는 제2 서열의 제2 분절은 또 다른 단백질, 예컨대 CD3-제타의 세포내 도메인으로 변경된다. 예컨대, (쇄간 디술파이드 브릿지를 매개하는) 세포외 시스테인 하류의 원래의 불변 도메인이 완전한 인간 CD3-제타로 대체될 수 있는 변형된 TCRα 및 TCRβ 쇄는 내인성 TCR 쇄와 오조립될 수 없고 1차 인간 T 세포에서 이들 TCR 쇄의 올바른 쌍형성이 형성된다.
일부 경우에서, P2A 링커를 통해 변형된 TCRβ에 연결된 변형된 TCRα 쇄를 코딩하는 구축물이 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 변형된 TCRβ 쇄는 키메라 항원 수용체(CAR)에 사용되는 것과 유사한 인공 신호전달 도메인, 즉 CD28 막횡단(TM) 코딩 서열에 이어 2개의 신호전달 모듈(CD28 및 CD3ζ)에 융합될 수 있다. 동시에, 변형된 TCRα 쇄는 TCRα의 세포외 도메인만을 함유할 수 있다. 또한, TCR 이량체 안정성을 증가시키기 위해 TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄의 불변 도메인(C-도메인)에서 시스테인 치환이 수행될 수 있다. 이 구축물은 "TCR-CAR"로 지칭된다. 이러한 TCR-CAR은 NK 세포와 같은 비 -T 세포에서 신호를 보낼 수 있다.
수용자 세포는 내인성 면역수용체가 녹아웃되거나 녹다운된 유전자 변형된 세포일 수 있다. 본원에 기재된 예는 T 세포를 수용자 세포로 사용하지만 유사한 전략이 다른 세포 타입에 적용될 수 있다.
유전자 편집 뉴클레아제는 내인성 TCR의 성분을 파괴하기 위해 사용될 수 있다. TCR α/β 이량체는 완전히 기능하는 TCR 복합체를 생성할 수 있으므로, TCRα 및/또는 TCRβ 기능을 파괴하면 내인성 TCR 발현이 감소 (또는 제거)될 수 있다. 내인성 TCRα 또는 TCRβ 유전자를 파괴하기 위해 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예컨대, 사용자 정의된 DNA 서열에 결합하고 이중 가닥 DNA 파손(DSB)을 매개하는 공통 작용 모드를 공유하는 4가지 부류의 유전자 편집 단백질이 존재한다. 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 표적 DNA 부위에 공동 국소화하는 이종이량체 어레이이다. ZFN은 DNA에 결합하고 DNA를 절단하는 Fokl 뉴클레아제 도메인에 테더링된 개별 핑거 서브유닛을 포함한다. 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 DNA 염기 인식을 제어하는 초가변 2개 아미노산 서열(반복 가변 잔기; RVD)에 의해 DNA에 결합하는 반복 유닛을 포함한다. ZFNS와 마찬가지로, TALEN은 DSB 생성을 위해 Fokl 엔도뉴클레아제 도메인에 융합된 이량체 단백질로 기능한다. 메가뉴클레아제(MN)는 박테리아 호밍 엔도뉴클레아제로부터 유래되고 고유한 표적 부위를 위해 조작된 선천적 뉴클레아제 활성을 갖는 단량체 단백질이다. 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR) 및 관련된 Cas9 뉴클레아제 플랫폼은 왓슨-크리크(Watson-Crick) 염기 쌍형성을 통해 표적 DNA 서열과 접촉하는 작은 가이드 RNA(gRNA) 전사체 및 DNA를 절단하는 Cas9 뉴클레아제를 수반한다.
일부 경우에서, 게놈 편집 뉴클레아제를 T 세포에 도입하는 것은 게놈 편집 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 게놈 편집 뉴클레아제를 T 세포에 도입하는 것은 Cas9 폴리펩티드를 T 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집 뉴클레아제는 TALEN 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 뉴클레아제 또는 megaTAL 뉴클레아제를 포함한다. 일부 경우에서, CRISPR/Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유도된다. 이들 실시양태 중 일부에서, CRISPR/Cas9 뉴클레아제는 예컨대 적어도 하나의 2'-OMe-포스포로티오에이트 변형된 염기, 적어도 하나의 2'-O-메틸 변형된 염기, 또는 적어도 하나의 2'-O-메틸 3'티오PACE 변형된 염기와 같은 뉴클레아제 내성 gRNA를 포함한다. 일부 경우에서, TALEN 뉴클레아제 또는 megaTAL 뉴클레아제는 외인성 폴리아데닐화 신호를 갖는 RNA에 의해 코딩된다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 방법은 게놈 변형된 T 세포의 집단을 확장시키는 데 효과적인 조건 하에서 T 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
수용자 세포의 추가의 게놈 조작
일부 경우에서, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 PD1 및 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트 단백질을 코딩하는 비활성화된 유전자를 포함한다. 이는 PD1 및 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트 단백질을 코딩하는 유전자의 비활성화에 의해 가능해질 수 있다. 일부 경우에서, 유전적 변형은 PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 2개의 유전자의 비활성화에 의존한다. 일부 경우에서, 유전자 변형은 B2M과 같은 MHC 성분의 녹아웃을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 유전자는 또한, 예컨대 마이크로RNA에 의해 하향조절될 수 있다.
수용자 세포에 의해 발현되는 추가의 작용제
면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 이들 세포의 기능을 향상시키기 위해 추가의 작용제(예컨대, 단백질 또는 RNA)를 발현하도록 조작될 수 있다. 예컨대, 기능은 세포독성 기능, 전염증 기능 또는 항염증 기능일 수 있다. 일부 경우에서, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 항종양 효능을 향상시키기 위해 추가의 작용제를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에서, 추가의 작용제는 분비되는 단백질이다. 분비되는 단백질은 시토카인, 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 경우에서, 분비되는 단백질은 시토카인이다. 일부 경우에서, 분비되는 단백질은 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 분비되는 단백질은 억제 분자를 억제할 수 있으며, 여기서 억제 분자는 면역 이펙터 반응을 일으키는 면역 세포의 능력을 감소시킨다. 분비되는 단백질은 전염증 시토카인 또는 항염증 시토카인일 수 있다. 전염증 시토카인의 예는 종양 괴사 인자 알파(TNFα); 인터류킨(IL)-1α; IL-1β; IL-2; IL-5; IL-6; IL-8; IL-15; IL-18; 인터페론(IFN-γ); 혈소판 활성화 인자(PAF); 단핵구 화학주성 단백질 1 및 2(MCP-1, MCP-2); 대식세포 이동 억제 인자(MIF); CXCL8; CXCL9; CXCL10; 및 높은 이동성 그룹 박스 단백질 1(HMGB-1)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항염증 시토카인의 예는 IL-1ra, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 전환 성장 인자 베타(TGF-β) 및 IL-16을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 추가의 작용제는 RNA이다. 일부 경우에서, 추가의 작용제는 RNA를 코딩하는 DNA일 수 있다. RNA는 가이드 RNA, 마이크로RNA 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)일 수 있다. RNA는 억제 분자의 전사 또는 번역을 억제할 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 일부 경우에서, RNA는 TCRα 쇄, TCRβ 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1 및 FAS를 포함하는 내인성 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 이들 억제 분자를 코딩하는 내인성 유전자는 또한 본원에 기재된 유전자 편집 방법에 의해 녹아웃될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 또 다른 작용제, 예컨대 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 활성을 향상시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. 예컨대, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자는 면역 이펙터 반응을 일으키는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다.
추가의 작용제는 스위치 수용체일 수 있다. 예컨대, 억제 분자를 억제하는 작용제는 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예컨대 세포내 신호전달 도메인과 관련된 제1 폴리펩티드, 예컨대 억제 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 PD1, LAG3, CTLA4, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4 및 TIGIT와 같은 억제 분자의 제1 폴리펩티드, 또는 이들 중 임의의 것의 단편(예컨대, 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부) 및 세포내 신호전달 도메인(예컨대, 공동 자극 도메인 4-1BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인(예컨대, CD3 제타 신호전달 도메인)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 PD1의 제1 폴리펩티드 또는 이의 단편(예컨대, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부) 및 CD28 신호전달 도메인 또는 CD3 제타 신호전달 도메인와 같은 세포내 신호 전달 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 작용제는 림프 고갈 내성을 부여하거나 이식편 대 숙주 질환 가능성을 감소시키는 단백질일 수 있다. 예컨대, 단백질은 억제성 자연 살해(NK) 세포 수용체에 결합하여 NK 세포가 수용자 세포를 사멸시키는 것을 억제할 수 있다. 단백질은 HLA-E 또는 HLA-G일 수 있다.
일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 면역수용체 발현 벡터에 의해 코딩되거나 이로부터 발현된다.
적용
본원에서 기재되는 바와 같이, 소스 면역수용체 발현 세포의 폴리클로날 집단은 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 폴리클로날 집단으로 전환될 수 있으며, 여기서 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 조작된 면역수용체 레퍼토리는 소스 면역수용체 발현 세포의 천연 면역수용체 레퍼토리(예컨대, 면역수용체 쇄의 동족 쌍 조합)를 포함할 수 있다. 많은 면역수용체의 이분 특성은 이 작업을 통상적인 기술로는 어렵게 하였다. 본원에 제공된 방법은 이들 어려움을 극복하는 데 이용될 수 있다. 소스 면역수용체 발현 세포를 사용하는 것보다 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포를 사용하는 것의 여러 이점이 있을 수 있다. 예컨대, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 더 많은 수로 제조될 수 있거나, 더 이상적인 기능적 특징을 가질 수 있거나, 더 이상적인 후성적 상태에 있을 수 있거나, 더 균일한 유전적 또는 표현형 배경을 가질 수 있거나, 항종양 효능을 향상시킬 추가의 작용제를 발현하도록 조작될 수 있거나, 선별을 돕도록 리포터 유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 많은 분야에서 많은 적용에서 사용될 수 있다.
항체 발견
소스 면역수용체 발현 세포가 B 세포인 경우, 생성된 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 다양한 항체를 코딩하는 라이브러리일 수 있다. 이 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 특색을 갖는 항체를 찾을 수 있다. 원하는 특색은 특정 표적 단백질에 대한 결합 또는 표적 세포에서 특정 세포 반응을 촉발하는 것을 포함할 수 있다. 항체 발견을 위해, 융합된 BCR 유전자는 실시예에 기재된 유사한 전략을 이용하여 단일 쇄 Fv 구축물(scFv) 및 scFv 발현 벡터로 전환될 수 있으며, 단 프라이머 및 링커 서열은 scFv 구축의 필요성에 맞게 재설계될 수 있으며, 이는 숙련된 기술자에 의해 수행될 수 있다. 소스 면역수용체 발현 세포는 형질모세포, 형질 세포, 림프형질세포양 세포, 기억 B 세포, 여포성 B 세포, 변연부 B 세포, B-1 세포, B-2 세포, 또는 조절 B 세포일 수 있다.
결합을 위한 선택
항체 발현 벡터 또는 scFv 발현 벡터는 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 포유동물 세포 디스플레이 및 mRNA 디스플레이와 같은 통상적인 스크리닝 기술과 함께 사용될 수 있다. 또한, 항체 발현 벡터 라이브러리를 B 세포주(예컨대, Raji 세포)에 도입하여 조작된 항체 발현 수용자 세포의 라이브러리를 생성할 수 있다. 이들 세포는 문헌(Eyer et al., 2017 and Mazutiz et al., 2013)에 기재된 표현형 스크리닝에 사용될 수 있으며, 여기서 항체 발현 수용자 세포는 동물로부터 직접적으로 단리된 B 세포를 대체할 수 있다.
기능을 위한 선택
항체 발현 벡터 라이브러리는 또한 표면 수용체의 기능을 위해 리포터 서킷으로 조작된 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 수용체 효능제인 항체를 직접 선택할 수 있다. 예컨대, 렌티바이러스 형태의 항체 발현 벡터 라이브러리를 사용하여 수용체 효능제 또는 길항제 항체가 찾는 수용체에 커플링된 형광 리포터 시스템을 함유하는 진핵 세포를 감염시킬 수 있다. 방법의 이 실시양태에서, 매우 많은 수의 후보 항체 발현 렌티바이러스 및 진핵 리포터 세포는 각각이 복제할 수 있는 형식으로 함께 패키징되어 유전자형과 표현형 사이에 직접적인 연결을 형성할 수 있다. 확산 제한 구성(예컨대, 반고형 한천 또는 액적)에서 감염 및 인큐베이션 후, (아마도 항체 발현 벡터에 의해 코딩되는 분비되는 항체의 작용으로 인해) 변경된 형광을 나타내는 세포를 분류하고, 효능제 또는 길항제 항체를 코딩하는 통합된 유전자를 회수할 수 있다. 인큐베이션은 적절한 배경 신호전달을 제공하기 위해 동족 리간드 또는 수용체의 공지된 효능제 또는 길항제 항체의 존재 하에 있을 수 있다. 이 시스템은 완전한 트롬보포이에틴 표현형모사인 강력한 항체 효능제를 신속하게 생성하는 능력을 예증함으로써 검증되었다(Hongkai Zhang et al., Chemistry & biology 20(5):734-741, May 2013). 시스템은 활성화가 선택 가능한 표현형의 생성과 연결될 수 있는 임의의 경로로 일반화될 수 있다.
폴리클로날 항체의 치료적 사용
본원에 기재된 방법은 인간 공여자로부터 B 세포 및 형질 세포 레퍼토리로부터 수득된 DNA 라이브러리로부터 재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 재조합 폴리클로날 항체는 특정 질환을 치료하는 데 사용할 수 있다. 예컨대, 면역 결핍을 갖는 환자는 수천 명의 인간 공여자로부터 풀링된 혈장 샘플로부터 유래된 혈장 기반 약품으로 치료될 수 있다. 이러한 제품의 예는 정맥내 면역글로불린(IVIG) 및 특정 병원체에 대해 항체 역가가 높은 공여자의 혈장으로부터 제조된 IVIG의 변형인 하이퍼이뮨(hyperimmune)을 포함한다. 하이퍼이뮨은 급성 감염을 치료하거나 장기 이식 후와 같이 면역 손상된 환자에서 감염을 예방하는 데 사용될 수 있다. 재조합 폴리클로날 항체는 현재의 혈장 기반 제품을 대체하는 데 사용될 수 있다. 재조합 폴리클로날 항체는 혈장 유래된 등가물보다 더 높은 효능을 갖도록 조작될 수 있다.
폴리클로날 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 치료적 사용
면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 다양한 질환을 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 폴리클로날 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포이다.
암 치료를 위한 TCR-T 세포
많은 종양은 종양 미세환경에 침투된 다량의 T 세포를 가질 수 있고, 이들 종양 침윤 T 세포(TIT) 중 다수는 종양 발현된 항원을 인식하는 TCR을 가질 수 있다. 이들 TIT는 종양 반응성 T 세포일 수 있다. TIT에 의해 인식되는 항원은 신생항원, 종양 특이적 항원 또는 종양 관련된 항원일 수 있다. 이들 항원은 야생형 서열 또는 돌연변이 서열일 수 있다. 암 치료를 위한 일반적인 전략은 이들 TIT의 수 및/또는 활성을 향상시키는 것일 수 있다. 이 전략을 구현하는 하나의 특정한 접근법은 TIT의 생체외 확장일 수 있다. 그러나, 이 접근법은 많은 제한을 가질 수 있다. 예컨대, 일부 TIT는 부분적으로 만성 항원 노출로 인해 매우 탈진된 표현형을 나타낼 수 있다. 이들 T 세포는 저조하게 확장될 수 있다. 또한, 외과적으로 제거된 종양에서 단리된 적은 수의 T 세포를 환자 신체를 재감염시키기에 충분히 큰 수(수억 또는 수십억개의 세포가 필요할 수 있음)로 확장시키는 데 매우 오랜시간이 걸릴 수 있다. 최근 단일 세포 시퀀싱의 발전에 의해 가능해진 대안적 방법은 심하게 탈진된 세포를 포함하여 이들 종양 침투된 T 세포로부터 쌍을 이룬 TCR 서열을 수득하는 것이다. 이어서, 이들 TCR 서열은 TCR 발현 벡터를 수득하기 위해 합성될 수 있다. 또한, 이들 벡터는 TCR-T 세포를 생성하기 위해 많은 수의 신선한 숙주 T 세포(예컨대, 환자의 말초 혈액으로부터 단리된 후 생체외 확장됨, CAR-T를 위한 숙주 세포를 제조하는 과정과 유사)에 도입될 수 있다. 그러나, DNA 합성의 한계로 인해 한 번에 소수(예컨대, 100개 미만 또는 50개 미만)의 고유한 TCR 발현 벡터만 제조될 수 있다. 즉, TCR-T 세포는 제한된 외인성 TCR 레퍼토리를 가질 수 있다.
상술된 바와 같이 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 신속하게 수득하는 기술로, 많은 수의 TCR을 코딩하는 많은 수(예컨대, 약 100개 초과, 약 1,000개 초과, 약 10,000개 초과, 약 100,000개 초과, 또는 약 1,000,000개 초과)의 고유한 TCR 발현 벡터를 생성할 수 있다. 이들 벡터는 매우 다양한 외인성 TCR 레퍼토리(약 100개 초과, 약 1,000개 초과, 약 10,000개 초과, 약 100,000개 초과, 또는 약 1,000,000개 초과의 클론타입)를 갖는 폴리클로날 TCR-T 세포를 생성하기 위해 (수용자 세포로서) 새로운 숙주 T 세포에 도입될 수 있다. 이어서, 이들 폴리클로날 TCR-T 세포는 환자에게 투여될 수 있다.
이 적용에서 사용되는 소스 TCR 발현 세포는 외과적으로 제거된 종양에서 단리된 TIT일 수 있다. 예컨대, 종양 조직을 지방 및 결합 조직을 트리밍한 후 3-5 mm2 단편으로 절단하고 슈어드 스토마커(Seward Stomacher) 디바이스(Fisher, Pittsburgh, PA)를 사용하여 부드러운 기계적 분쇄를 사용하여 차가운 RPMI 1640에서 해체할 수 있다. 이 과정은 효소적 분해 없이 단일 세포 현탁액을 빠르게 생성할 수 있다. 세포 현탁액을 75 μm 공극 크기 스크린(BD Biosciences, San Jose CA)을 통해 여과하고, 배양 배지에서 세척할 수 있다. 즉각적인 염색 및 유동 세포측정에 의한 분석에 사용되는 세포의 일부를 배양 배지에서 세척할 수 있으며, 세포 현탁액을 불연속의 70%에 이은 100% 피콜 이소파크(Ficoll Isopaque) 구배 위에 층지게 하고, 원심분리하여 농축된 TIT(100% 인터페이스)로부터 종양 세포를 분리할 수 있다. 이어서, 농축된 TIT를 D-PBS, 1% BSA에서 세척한 다음 처리할 수 있다. 일부 경우에서, 종양 샘플로부터의 TIT는 3,000 IU/ml 재조합 IL-2 사용하여 글루타막스(Glutamax)(Invitrogen), 10% 인간 AB 혈청(Sigma, St. Louis, MI), 50 mM 2-메르캅토에탄올, 1 mM 피루베이트, 1X 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)과 함께 RPMI 1640을 함유하는 TIT 배양 배지(TIL-CM)에서 확장될 수 있다.
일부 경우에서, 새로운 종양이 이용 가능하지 않을 수 있으며, 이러한 경우 핵은 동결되거나 고정된 조직에서 분리될 수 있다. 이들 핵은 또한 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하기 위해 쌍을 이룬 이분 면역수용체 클로닝 과정(이 경우 쌍을 이룬 TCR 클로닝)에 대한 인풋으로 작용할 수 있다. 이들 세포 및 핵은 추가의 선별 없이 사용될 수 있다. 대안적으로, 특정 세포 또는 핵 집단을 단리하여 종양 특이적 TCR을 농축시킬 수 있다. 예컨대, 세포 표면 마커 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB의 발현은 종양 반응성과 상관 관계가 있을 수 있다. 세포 표면 마커는 FACS에 의해 종양 반응성 TCR을 단리/농축시키는 데 사용될 수 있다. 즉, 이들 마커 중 하나 또는 조합의 높은 발현을 갖는 세포는 쌍을 이룬 TCR 클로닝을 위한 인풋으로 사용될 수 있다.
T 세포는 폴리클로날 TCR-T 세포를 생성하기 위해 수용자 세포로 사용될 수 있다. 수용자 세포로서의 T 세포는 "T 세포의 소스" 섹션에서 기재되는 바와 같은 소스로부터 수득될 수 있으며, "샘플" 섹션에서 기재되는 바와 같이 다양한 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 경우에서, 수용자 세포로서 T 세포는 환자의 말초 혈액으로부터 수득될 수 있고 본원에서 기재되는 바와 같이 생체외에서 확장될 수 있다.
대안적으로, 수용자 세포로서의 T 세포는 공여자로부터 수득될 수 있다. 공여자는 건강한 공여자일 수 있다. 공여자로부터 수득되는 T 세포는, 예컨대 냉동기에 적절하게 저장한 다음 필요 시 동종이계 개체에게 주입될 수 있다. 수용자 세포 또는 폴리클로날 TCR-T 세포는 "수용자 세포의 소스", "활성화 및 확장", "오조립의 방지", "수용자 세포의 추가의 게놈 조작" 및 "수용자 세포에 의해 발현되는 추가의 작용제" 섹션에 기재된 방법을 이용하여 배양 또는 변형될 수 있다. 수용자 세포가 T 세포인 경우, T 세포의 내인성 TCR은 본원에서 기재되는 바와 같이 녹아웃되거나 녹다운될 수 있다. 수용자 세포가 T 세포인 경우, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+CD4+ 이중 양성 T 세포일 수 있다. 이는 감마-델타 T 세포일 수 있다. 이들 TCR-T 세포는 본원에서 기재되는 바와 같이 그들의 항종양 활성을 향상시키기 위해 다른 조절 분자의 시토카인을 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 공여자(예컨대, 치료될 대상체와 상이한 대상체)로부터 수득되는 수용자 세포는 억제성 자연 살해(NK) 세포 수용체에 결합하는 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 억제 성 NK 세포 수용체는 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 또는 C-타입 렉틴 패밀리 수용체일 수 있다. 억제 NK 세포 수용체는 NKG/CD94 또는 KIR2DL4일 수 있다. 억제 NK 세포 수용체에 결합하는 단백질은 막횡단 단백질, 세포 표면 단백질 또는 분비되는 단백질일 수 있다. 억제 NK 세포 수용체에 결합하는 단백질은 HLA-E 또는 HLA-G를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제 NK 세포 수용체에 결합하는 단백질은 B2M 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제 NK 세포 수용체에 결합하는 단백질은 B2M-HLA-E 융합 또는 B2M-HLA-G 융합 단백질이다.
본원에 기재된 방법은 올리고클로날 또는 폴리클로날 TCR-T 세포를 사용한 개인화된 암 치료를 가능하게 할 수 있다. 이들 TCR-T 세포는 종양 반응성일 수 있는 대상체 특이적 TCR을 포함할 수 있다. 합성 TIL 또는 SynTIL로 불리는 예시적인 치료 방법이 도 19에 요약되어 있다. 첫째, 절제된 종양 또는 종양 생검은 환자로부터 수득될 수 있다. 종양 침윤 T 세포는 기존의 방법을 이용하여 종양 조직으로부터 수득될 수 있다(도 19, 단계 (1)). 그러나, 통상적인 TIL 방법에서와 같이 이들 세포를 배양하는 대신, 이들 세포로부터의 TCR은 본원에 제공된 방법을 이용하여 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드로 전환될 수 있다(도 19, 단계 (2)). 이어서, 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 본원에서 기재되는 바와 같이 리포터 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있는 TCR 발현 렌티바이러스 벡터(도 19, 단계 (3))로 전환될 수 있다(도 19, 단계 (4)). 형질도입된 리포터 세포는 종양 세포 또는 종양 mRNA 로딩된 APC와 함께 인큐베이션될 수 있으며, 그 후 리포터-양성 세포(예컨대, 종양 반응성 세포)가 본원에서 기재되는 바와 같이 (예컨대, FACS를 사용하여) 확인되거나 단리될 수 있다(도 19, 단계 (5), 또한 도 18 참조). 임의적으로, 확인된 리포터-양성 세포의 TCR은 시퀀싱될 수 있다. 이어서, 분류된 세포로부터의 융합된 TCR을 재증폭시켜 TCR 발현 벡터의 풀을 생성할 수 있으며, 여기서 대부분의 TCR은 종양 반응성일 것으로 예상될 수 있다(도 19, 단계 (6)). 일부 경우에서, 공여자로부터의 동종이계 T 세포를 사용하여 자가 T 세포 대신 확인된 종양 반응성 세포를 발현할 수 있다. 또한, 이러한 경우에서, 동종이계 T 세포는 본원에서 기재되는 바와 같이 조작될 수 있다. 상이한 TCR 발현 벡터를 개별적으로 또는 풀로 제조한 다음, 기존 TCR-T 제조 방법을 이용하여 환자의 말초 혈액으로부터의 많은 수(예컨대, 수억 또는 수십억)의 자가 T 세포를 형질도입하는 데 사용할 수 있다(도 19, 단계 (7)). TCR 발현 벡터를 개별적으로 제조하는 경우, 정의된 서브세트(예컨대, 5 내지 20개 TCR)을 사용하여 TCR-T 세포를 생성하기 위해 말초 T 세포를 조작할 수 있다. 이들 TCR-T 세포는 올리고클로날로 간주될 수 있다. TCR 발현 벡터가 풀로 제조되는 경우, 생성된 TCR-T 세포를 폴리클로날로 지칭할 수 있다. 예컨대, 풀의 총 TCR 클론 수는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50, 또는 그 초과의 이상일 수 있다. 풀의 총 TCR 클론 수는 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 또는 500, 또는 그 초과일 수 있다. TCR-T 세포는 일련의 방출 시험(도 19, 단계 (8))을 받을 수 있고, 환자에게 투여(예컨대, 주입에 의해)될 수 있다. 각각의 단계에 필요할 수 있는 예시적인 타이밍이 도 19에 표시되어 있다. 특정 상황에서, 종양 침윤 T 세포는 환자로부터의 말초 T 세포로 대체되어 소스 면역수용체 발현 세포로 사용될 수 있다. 이들 소스 T 세포(예컨대, 말초 T 세포)는 조직 또는 세포와 공동 배양하여 활성화 또는 확장될 수 있다. 말초 혈액으로부터의 표적 반응성 T 세포(예컨대, 종양 반응성 T 세포)는 (1) 표면 마커 발현(예컨대, CD25, CD69, CD137, PD-1 및 본원에 기재된 다른 마커)에 기초하여, 2) 본원에 기재된 공동 배양 방법을 이용하여 종양 항원을 발현하도록 펄싱되거나 조작된 APC로 시험관내 자극에 의해, 또는 이 둘의 조합으로 농축될 수 있다. APC는 전문적 APC 또는 비-전문적 APC일 수 있다. APC는 대상체, 예컨대 환자 또는 건강한 공여자로부터 단리될 수 있다. APC는 본원에서 기재되는 바와 같은 aAPC(예컨대, K562 세포)일 수 있다.
본원에 제공된 방법은 통상적인 방법보다 T 세포의 단리로부터 치료 세포를 대상체에게 투여하기까지 더 빠른 반전(turnaround) 시간을 제공할 수 있다. 본원에 제공된 대상체에서 종양을 치료하는 방법은 대상체로부터 T 세포 집단을 단리하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 T 세포 집단은 T 세포 수용체(TCR) 집단을 발현한다. TCR 집단의 서브집단을 농축시킬 수 있으며, 여기서 서브집단은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함할 수 있다. 이어서, 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 발현하는 복수의 수용자 세포는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 투여는 T 세포 집단을 단리한 후 최대 약 60일, 50일, 40일, 30일, 20일 또는 그 미만에 수행된다. 일부 경우에서, 대상체의 종양은 대상체로부터 T 세포 집단을 단리하는 것으로부터 복수의 수용자 세포를 투여하기까지 약 60일, 50일, 40일, 30일, 20일 또는 그 미만의 초과 동안 진행되지 않았다. 일부 경우에서, 종양의 크기는 집단 T 세포를 단리하는 것으로부터 복수의 수용자 세포를 투여하기까지 약 50%, 30%, 40%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 2% 미만 증가되었다. 일부 경우에서, 대상체에서 복수의 종양 세포는 집단 T 세포를 단리하는 것으로부터 복수의 수용자 세포를 투여하기까지 약 2배, 3배, 4배 또는 5배 증가하지 않았다. 일부 경우에서, 종양은 T 세포 집단을 단리하는 것으로부터 복수의 수용자 세포를 투여하기까지 새로운 단계로 진행되지 않았다. 예컨대, 종양은 I 기에서 II 기, II 기에서 III 기, 또는 III 기에서 IV기로 진행되지 않았다.
본원에 제공된 대상체에서 종양을 치료하는 방법은 대상체로부터 T 세포 집단을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. T 세포 집단은 내인성 핵산으로부터 T 세포 수용체(TCR) 집단을 발현할 수 있다. 이어서, TCR 집단의 서브집단이 농축될 수 있으며, 여기서 서브집단은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함할 수 있다. 이어서, 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 발현하는 복수의 수용자 세포가 대상체에게 투여될 수 있다. 복수의 종양 반응성 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 내인성 핵산의 카피 생성물(예컨대, 전사되거나 증폭된 생성물)일 수 있다. 이들 카피 생성물은 템플릿 의존적 핵산 합성에 의해 생성될 수 있으며, 여기서 상보적 가닥은 프라이머 연장, 핵산 증폭, 제2 가닥 합성, 전사, 역전사 등과 같이 기존 가닥을 템플릿으로 사용하여 합성된다.
일부 경우에서, 방법은, 예컨대 포스포아미다이트를 사용하여 복수의 종양 반응성 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성을 포함하지 않는다. T 세포의 집단은 종양 침윤 T 세포일 수 있다. T 세포의 집단은 탈진된 T 세포 또는 조절 T 세포를 포함할 수 있다. 복수의 수용자 세포는 동종이계 T 세포, 자가 T 세포 또는 세포주 세포일 수 있다. 방법은 농축 전에 리포터 세포 집단에서 TCR 집단을 발현하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 발현 시, TCR 집단을 코딩하는 핵산 서열은 바이러스 벡터에 의해 리포터 세포 집단에 전달될 수 있다. 바이러스 벡터는 본원에 기재된 임의의 타입의 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 예컨대, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 알파 바이러스, 백시나 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스 벡터 또는 이들의 슈도타입일 수 있다. 리포터 세포 집단의 각각의 리포터 세포는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 농축 시, TCR 집단은 종양 세포 또는 종양 RNA 로딩된(예컨대, mRNA 로딩된) 항원 제시 세포 또는 하나 이상의 항원/MHC 복합체와 접촉될 수 있다. 항원의 아이덴티티 또는 서열은 알려지지 않을 수 있다. 농축 후, TCR 집단의 서브집단은 TCR의 적어도 약 2, 5, 10, 15 또는 20개의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 서브집단은 약 20, 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 또는 4,000개 또는 그 초과의 이상의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다. TCR 집단의 서브집단의 각각의 TCR은 상이한 에피토프 또는 상이한 단백질에 특이적일 수 있다. TCR 집단의 서브집단의 각각의 TCR은 상이한 (i) TCR 알파 CDR3 서열, (ii) TCR 베타 CDR3 가변 도메인 서열, (iii) TCR 알파 가변 도메인 서열, (iv) TCR 베타 가변 도메인 서열, 또는 (v) TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인 서열의 조합을 포함할 수 있다. 복수의 종양 반응성 TCR은 대상체의 종양 세포에 결합할 수 있지만 대상체로부터의 건강한 세포에는 결합하지 않거나 대상체로부터의 건강한 세포에는 종양 세포에 비해 적어도 약 10배, 20배, 50배, 100배, 500배, 또는 1000배 낮은 친화도로 결합한다.
본원에 제공된 방법은 화학적 합성에 의해 확인된 동족 쌍의 합성을 필요로하지 않을 수 있다. 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체로부터 제1 T 세포 집단을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 T 세포 집단은 내인성 핵산으로부터 T 세포 수용체(TCR) 집단을 발현할 수 있다. 이어서, 내인성 핵산에 의해 코딩된 TCR 집단을 코딩하는 핵산 서열은 제2 세포 집단에서 발현될 수 있으며, 여기서 핵산 서열은, 예컨대 포스포르아미다이트를 사용하여 화학적으로 합성되지 않는다. 이어서, TCR 집단의 서브집단은 제2 세포 집단으로부터 농축될 수 있으며, 여기서 서브집단은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함한다. 이어서, 복수의 종양 반응성 TCR을 발현하는 복수의 수용자 세포는 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 제공된 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체로부터 제1 T 세포 집단을 단리하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 T 세포 집단은 내인성 핵산으로부터 T 세포 수용체(TCR) 집단을 발현한다. 이어서, 제1 T 세포 집단으로부터의 내인성 핵산의 전사되거나 증폭된 생성물은 제2 세포 집단에서 발현될 수 있으며, 여기서 전사되거나 증폭된 생성물은 TCR 집단을 코딩한다. 전사되거나 증폭된 생성물은 모 가닥을 카피하여 합성된 핵산 가닥일 수 있다. 이어서, 제2 세포 집단으로부터의 TCR 집단의 서브집단이 농축될 수 있으며, 여기서 서브집단은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함한다. 이어서, 복수의 종양 반응성 TCR을 발현하는 복수의 수용자 세포는 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 제공된 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체로부터 제1 T 세포 집단을 단리하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 T 세포 집단은 내인성 핵산으로부터 T 세포 수용체(TCR) 집단을 발현한다. 이어서, TCR의 집단은 제2 세포 집단에서 발현될 수 있다. 제2 세포 집단은 제1 T 세포 집단의 표현형 배경/특성을 갖지 않을 수 있다. 예컨대, 제2 세포 집단은 제1 T 세포 집단과 동일한 비-TCR 유전자 발현 프로파일을 갖지 않을 수 있다. 제2 세포 집단은 제1 T 세포 집단과 동일한 세포 타입(예컨대, 탈진된 T 세포, 활성화된 T 세포, 기억 T 세포 또는 이펙터 T 세포)이 아닐 수 있다. 이어서, TCR 집단의 서브집단은 제2 세포 집단으로부터 농축될 수 있으며, 여기서 서브집단은 복수의 종양 반응성 TCR을 포함한다. 이어서, 복수의 종양 반응성 TCR을 발현하는 복수의 수용자 세포가 대상체에게 투여될 수 있다. 제1 T 세포 집단은 종양 침윤 T 세포 또는 말초 T 세포일 수 있다. 제1 T 세포 집단은 탈진된 T 세포 또는 조절 T 세포를 포함할 수 있다. 투여는 제1 T 세포 집단을 단리한 후 최대 약 60일, 50일, 40일, 30일, 20일 또는 그 미만에 수행될 수 있다. 농축 시, 제2 세포 집단은 하나 이상의 항원/MHC 복합체와 접촉될 수 있다. 항원/MHC 복합체는 MHC 사량체와 복합체 형성된 항원일 수 있다. 일부 경우에서, 제2 세포 집단은 각각 하나 이상의 표적 항원(예컨대, 종양 항원)을 제시하는 하나 이상의 세포와 접촉될 수 있다. 예컨대, 제2 세포 집단은 종양 세포 또는 종양 RNA 로딩된 APC와 접촉될 수 있다. 복수의 수용자 세포는 동종이계 세포, 자가 세포 또는 세포주 세포일 수 있다.
본원에 제공된 방법은 TCR 집단으로부터 복수의 종양 반응성 TCR을 확인하는 데 이용될 수 있다. 본원에 제공된 대상체에서 종양을 치료하는 방법은 TCR 집단으로부터 복수의 종양 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 TCR 집단은 적어도 약 20, 30, 50, 100, 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000개, 또는 그 초과의 상이한 동족 쌍을 포함한다. 이어서, 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트를 발현하는 복수의 세포는 대상체에게 투여될 수 있다. 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트는 복수의 세포에 대해 외인성일 수 있다. 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 또는 적어도 20개의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트는 약 20, 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 또는 4,000개, 또는 그 초과의 이상의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다. 복수의 종양 반응성 TCR의 각각의 TCR은 상이한 에피토프 또는 상이한 단백질에 특이적일 수 있거나 상이한 (i) TCR 알파 CDR3 서열, (ii) TCR 베타 CDR3 가변 도메인 서열, (iii) TCR 알파 가변 도메인 서열, (iv) TCR 베타 가변 도메인 서열, 또는 (v) TCR 알파 및 TCR 베타 가변 도메인 서열의 조합을 포함할 수 있다. 방법은 대상체로부터 TCR 집단을 발현하는 T 세포 집단을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. TCR의 상이한 동족 쌍은 적어도 5, 10, 15, 20개, 또는 그 초과의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 최대 약 100,000, 10,000, 1,000, 100개, 또는 그 미만의 세포를 갖는 것과 같은 작은 샘플 크기를 갖는 샘플로부터 표적 반응성 TCR을 확인할 수 있다. 본원에 제공된 대상체에서 종양을 치료하는 방법은 T 세포 수용체(TCR) 집단을 발현하는 대상체로부터 T 세포 집단을 분리하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 T 세포 집단은 최대 약 10,000개 세포를 포함한다. 이어서, 복수의 종양 반응성 TCR은 TCR 집단으로부터 확인될 수 있다. 이어서, 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트는 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 복수의 종양 반응성 TCR 또는 이의 서브세트는 적어도 약 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50개, 또는 그 초과의 상이한 동족 쌍을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 복수의 수용자 세포는 대상체에게 투여하기 전에 확장될 수 있다.
자가면역 질환 치료를 위한 TCR-Treg 세포
암을 치료하기 위해 '살해' 세포를 생성하는 것 외에, 자가면역 질환을 치료하기 위한 '치유' 세포를 생성할 수도 있다. Treg 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 도입하여 항원 특이적 조절 T 세포를 생성할 수 있다(Jelena Skuljec et al., Chimeric Antigen Receptor-Redirected Regulatory T Cells Suppress Experimental Allergic Airway Inflammation, a Model of Asthma, Front Immunol. 2017; 8:1125). 조직에 특이적인 TCR은 본원에 기재된 방법(배양 및 조작 방법을 포함)을 이용하여 Treg 세포에 도입될 수 있으며, 이들 세포를 홈으로 안내하고 특정 조직 또는 기관을 보호할 수 있다. 소스 면역수용체 발현 세포는 조직 상주 T 세포로부터 수득될 수 있거나 공지된 조직 특이적 항원에 대해 선별될 수 있다. 여기서, 조직 특이적 항원은 세포내에 있거나 세포 표면에 결합될 수 있다. 이들 TCR-Treg 세포는 본원에서 기재되는 바와 같이 면역 조절 활성을 향상시키기 위해 추가의 작용제(예컨대, 시토카인 또는 다른 조절 분자)를 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 이러한 추가의 작용제의 예는 IL-1ra, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 전환 성장 인자 베타(TGF-β) 및 IL-16과 같은 항염증 시토카인을 포함한다.
표적 반응성 TCR의 확인
T 세포는 특정 MHC 결합된 항원을 인식하는 TCR을 확인하기 위해 말초 혈액, 비장, 림프절 및 종양과 같은 다수의 기관(본원에서는 총칭하여 '소스 TCR 발현 세포'라고 함, 본 개시내용의 다른 곳의 설명과 일치하기 위함)으로부터 스크리닝될 수 있다. 본원에 기재된 방법을 이용하여 수득되는 폴리클로날 TCR 프로그래밍된 수용자 세포는 이들 적용에서 소스 TCR 발현 세포를 대체할 수 있다. 이러한 적용에서, 수용자 세포는 세포주 T 세포와 같은 세포주 세포일 수 있다. 세포주 T 세포의 예는 저캇, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-T1, TALL-1, MOLT 16/17 및 HUT 78/H9를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포주 T 세포의 내인성 TCR은 본원에서 기재되는 바와 같이 녹아웃되거나 녹다운될 수 있다.
일부 실시양태에서, MHC 결합된 항원은 펩티드 MHC 복합체(pMHC), pMHC 사량체, pMHC 올리고머이다. 예컨대, pMHC는 스트렙트아비딘 스캐폴드 상에서 사량체화되거나 다양한 화학적 스캐폴드 상에서 올리고머화될 수 있다(Cochran & Stern, 2000). 일부 실시양태에서, pMHC, pMHC 사량체, pMHC 올리고머는 pMHC를 인식하는 폴리클로날 TCR 프로그래밍된 수용자 세포의 FACS 분류를 용이하게 하기 위해 형광 표지된다.
일부 실시양태에서, MHC 결합된 항원은 세포 표면에 제시된다. 일부 경우에서, 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. APC는 수지상 세포, 대식세포 또는 B 세포와 같은 전문적 APC일 수 있다. APC는 또한 MHC 또는 HLA를 발현하는 다른 세포(예컨대, 인공 APC)일 수 있다. 예컨대, 암 세포주로부터의 세포는 APC일 수 있다. 일부 실시양태에서, APC는 단지 하나의 클래스 I MHC 대립유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, APC는 임의의 수의 클래스 I MHC 대립유전자 및 클래스 II MHC 대립유전자, 예컨대 한 대상체로부터 단리되는 모든 클래스 I 또는 클래스 II MHC 대립유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. 대상체는 인간일 수 있다. 인간은 환자일 수 있다. 환자는 암 환자일 수 있다.
일부 실시양태에서, MHC 결합된 항원의 에피토프는 잘 정의되어 있다. 예컨대, pMHC 사량체에서 에피토프 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, MHC 결합된 항원에 대한 에피토프는 알려지지 않았거나 잘 정의되지 않았다. 예컨대, 항원 단백질은 APC에서 과발현될 수 있고, 다수의 에피토프가 APC에 의해 제시될 수 있다. 또 다른 예에서, 소그룹의 단백질(예컨대, 적어도 2개의 단백질, 적어도 3개의 단백질, 적어도 4개의 단백질, 적어도 5개의 단백질, 적어도 10개의 단백질, 적어도 20개의 단백질, 적어도 30개의 단백질, 적어도 40개의 단백질, 또는 적어도 50개의 단백질)이 APC에서 과발현될 수 있다. 또 다른 예에서, 미지의 수의 단백질이 APC에서 과발현될 수 있고, 이러한 경우에서, cDNA 풀은 APC에 전달될 수 있다(예컨대, 형질감염, 전기천공 또는 본원에 기재된 벡터를 사용하는 다른 전달 방법).
일부 실시양태에서, 항원은 항원 코딩 DNA 또는 mRNA를 APC로 형질감염시킴으로써 APC에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질로서의 항원은 APC의 배양 배지에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드로서의 항원은 APC의 배양 배지에 첨가될 수 있다.
MHC 결합된 항원을 인식하는 TCR 발현 수용자 세포는 그렇지 않은 세포로부터 선별될 수 있다. 선별은 가용성의 형광 표지된 pMHC, pMHC 사량체 또는 pMHC 올리고머에 대한 결합을 기반으로 할 수 있다. 선별은 세포가 MHC 결합된 항원과 접촉한 후 TCR 발현 수용자 세포에 대한 세포 표면 마커 발현을 기반으로 할 수 있다. 세포 표면 마커는 CD25, CD69, CD39, CD103, CD137 뿐만 아니라 다른 T 세포 활성화 마커 또는 이들의 조합일 수 있다. 선별은 칼슘 유입을 기반으로 할 수 있다. 선별은 또한 리포터 유전자 발현을 기반으로 할 수 있다. 리포터 유전자는 형광 단백질(예컨대, GFP 및 mCherry)일 수 있다. 리포터 유전자는 TCR 신호전달에 의해 조절되는 전사 인자의 제어 하에 있을 수 있다. 이들 전사 인자의 예는 AP-1, NFAT, NF-카파-B, Runx1, Runx3 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, MHC 결합된 항원을 인식하는 TCR을 추가로 농축시키기 하기 위해 상술된 기준에 기초하여 선별된 TCR 프로그래밍된 수용자 세포를 증식시키고 다시 선별할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 TCR 발현 수용자 세포로부터 단리된 TCR 발현 벡터에서 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 증폭되고 TCR 발현 벡터로 전환될 수 있다. 또한, 이들 TCR 발현 벡터는 TCR 프로그래밍된 수용자 세포의 새로운 집단을 수득하는 데 사용될 수 있다. 이들 세포는 MHC 결합된 항원을 인식하는 TCR을 더욱 농축시키기 위해 다시 선별을 거칠 수 있다.
종양 반응성 TCR의 신속한 확인은 항원, 에피토프 또는 제시 MHC의 아이덴티티를 반드시 알 필요 없이 암 면역요법에서 광범위한 적용을 가질 수 있으며, 리포터- 기반 선별 방법과 조합된 본원에 기재된 대규모 병렬 TCR 클로닝 기술로 달성될 수 있다.
리포터 기반 선별 방법의 예시적인 도식이 도 18에 요약되어 있다. 리포터 세포주는 T 세포주(예컨대, 저캇)일 수 있다. 리포터 세포주는 TCR 신호전달(예컨대, NFAT, NF-카파-B, Nur77)에 의해 제어되는 프로모터에 의해 구동되는 리포터 유전자(예컨대, 형광 단백질 또는 염색 가능한 세포 표면 단백질)를 보유할 수 있다. 임의적으로, 리포터 세포주의 내인성 TCR은 녹아웃될 수 있다. 리포터 세포는 일부가 종양 반응성 (또는 종양 특이적)인 T 세포(예컨대, 종양 침윤 T 세포) 집단으로부터 수득되는 폴리클로날 TCR 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다(도 18, 단계 (1)). 형질도입된 리포터 세포는 종양 유전자를 발현하도록 조작된 종양 세포, 종양 조직, 종양 구체 또는 APC(자가 APC 또는 자가 MHC를 발현하도록 조작된 동종이계 APC)(즉, 암 백신으로 연구된 종양 mRNA 로딩된 APC)와 함께 인큐베이션될 수 있다(도 18, 단계 (2)). 리포터 세포주로 형질도입된 TCR이 종양 반응성인 경우, 리포터 세포에서 리포터 유전자가 발현될 수 있고 세포가 확인될 수 있다(예컨대, FACS 또는 MACS를 사용하여 선별/단리/농축됨)(도 18, 단계 (3)). 임의적으로, 종양 반응성인 확인된 TCR은 시퀀싱될 수 있다. 분류된 세포로부터의 이미 융합된 TCR을 간단하게 PCR 증폭시켜 TCR 발현 벡터로 일괄 클로닝할 수 있다. 임의적으로, 개별 TCR은, 예컨대 TCR 발현 벡터를 호스팅하는 이. 콜리를 선별하여 수득될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 면역 모니터링 시험으로 환자의 종양 조직 또는 말초 혈액에서 종양 반응성 T 세포를 정량화하는 것을 가능하게 할 수 있다. 예컨대, 종양 생검은 암 환자로부터 수득될 수 있다. 말초 T 세포도 동일한 환자로부터 수득될 수 있다. 말초 T 세포로부터의 TCR은 TCR 발현 벡터로 클로닝될 수 있으며, 이는 다시 본원에서 기재되는 바와 같이 리포터 세포주를 조작하는 데 사용될 수 있다. 한편, HLA 유전자는 말초 혈액에서 증폭될 수 있다. 인간 HLA 발현이 없는 APC 세포주(예컨대, K562 및 721.221과 같은 MHC를 발현하지 않거나 매우 낮은 수준으로 발현하는 인간 세포주, COS-7과 같은 비-인간 영장류 세포주 또는 내인성 HLA 녹아웃된 인간 세포주 녹아웃)은 환자의 HLA 유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. 환자로부터의 자가 APC(예컨대, 단핵구 유래된 수지상 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포)도 APC로 사용될 수 있다. 종양 샘플(수술 샘플 또는 생검)로부터의 전장 mRNA는 단리되고, 증폭되고, 상술된 자가 또는 HLA 조작된 동종이계 APC로 형질감염되어 종양 mRNA 로딩된 APC를 생성할 수 있다. 종양 샘플은 코어 생검 또는 미세 바늘 생검 샘플과 같은 생검 샘플일 수 있다. 이들 샘플은 적은 부피의 종양 샘플도 증폭시키기에 충분한 mRNA를 함유할 수 있기 때문에 적은 부피(예컨대, <1000 mm3, <500 mm3, <100 mm3, <50 mm3)을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 종양 샘플의 부피는 약 2000 mm3, 1000 mm3, 800 mm3, 500 mm3, 100 mm3, 50 mm3, 또는 20 mm3 이하일 수 있다. 따라서, 이 방법은 큰 수술 종양 샘플을 수득하기 어려운 상황에 적용할 수 있다. TCR-조작된 리포터 세포 및 종양 mRNA 로딩된 APC는 공동 인큐베이션될 수 있고, 종양 반응성인 리포터 발현 세포는 상술된 바와 같이 단리될 수 있다. 단리된 세포로부터의 TCR은 시퀀싱되어 종양 반응성 TCR의 서열 및 풍부도를 제공할 수 있다. 이러한 정보가 함유된 보고서가 발행될 수 있다. 이 방법은 통상적인 TCR 레퍼토리 분석과 조합하여 풍부한 종양 반응성 TCR의 정확성을 개선할 수 있다. 이 단락에 기재된 APC 및 종양 mRNA 로딩된 APC를 수득하고 조작하는 방법은 본원의 다른 곳에 기재된 방법에서도 이용될 수 있다.
예컨대, 복수의 표적 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 방법은 TCR 집단을 발현하는 세포 집단을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. TCR 집단은 세포 집단에 대해 외인성일 수 있다. TCR 집단은 상이한 동족 쌍, 예컨대 적어도 50개의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다. TCR 집단은 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40개, 또는 그 초과의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함할 수 있다. TCR 집단은 적어도 100개의 상이한 VJ 조합을 포함할 수 있다. 방법은 세포 집단을 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 표적 반응성 TCR은 하나 이상의 표적 항원에 결합한다. 이어서, 복수의 표적 반응성 TCR은 단리되거나 농축될 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 적어도 약 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600개, 또는 그 초과의 표적 반응성 TCR이 단리되거나 농축될 수 있다. 세포 집단은 조작된 세포, 비-탈진된 세포 또는 환자로부터 단리되지 않은 세포일 수 있다. 방법은 세포 집단을 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 표적 반응성 TCR은 하나 이상의 표적 항원에 결합할 수 있다. 이어서, 복수의 적어도 5개의 표적 반응성 TCR은 단리되거나 농축될 수 있다. TCR의 집단은 적어도 약 100, 200, 500, 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 또는 10,000,000개의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다. 복수의 표적 반응성 TCR은 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20개 또는 그 초과의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 세포 집단은 종양 세포 또는 하나 이상의 표적 항원을 제시하는 항원 제시 세포와 접촉된다. 표적 항원은 종양 항원 또는 조직 특이적 항원일 수 있다. 하나 이상의 표적 항원은 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체를 이룰 수 있다. MHC는 MHC 사량체일 수 있다. 방법은 복수의 표적 반응성 TCR 중 적어도 하나의 표적 반응성 TCR을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 세포 집단의 세포 또는 조작된 세포는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 리포터 유전자는 세포의 TCR이 하나 이상의 표적 항원의 표적 항원에 결합 할 때 신호를 보내도록 조절될 수 있다. 세포 집단 또는 조작된 세포는 세포주 세포(예컨대, 저캇 세포)일 수 있다.
예컨대, 복수의 표적 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 방법은 복수의 TCR을 발현하는 복수의 T 세포를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 TCR은 적어도 20개의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함하는 적어도 50개의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다. 방법은 복수의 TCR의 각각의 TCR의 TCR 알파 (또는 감마) 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드와 TCR 베타 (또는 델타) 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 물리적으로 연결하여 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드는 복수의 세포에서 발현될 수 있으며, 여기서 복수의 세포의 서브세트는 복수의 표적 반응성 TCR을 발현한다. 복수의 세포는 하나 이상의 표적 항원과 접촉하여 복수의 표적 반응성 TCR을 확인할 수 있다. 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 복수의 세포의 서브세트는 하나 이상의 표적 항원에 결합할 수 있다. 복수의 세포의 서브세트는 단리되거나 농축될 수 있으며, 이로써 복수의 표적 반응성 TCR을 단리하거나 농축시킬 수 있다.
예컨대, 복수의 표적 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 방법은 복수의 TCR을 발현하는 복수의 T 세포를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 TCR은 적어도 20개의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함하는 적어도 50개의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다. 방법은 임의의 바코딩, 예컨대 단일 세포 바코딩을 사용하지 않고 복수의 TCR의 하나 이상의 동족 쌍을 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 시퀀싱은 복수의 TCR 중 하나 이상의 동족 쌍의 TCR 쇄를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 TCR 쇄는 동일한 바코드를 포함하지 않는다. 복수의 TCR 또는 이의 서브세트를 코딩하는 하나 이상의 동족 쌍은, 예컨대 가용성 형태로 또는 복수의 세포에서 발현될 수 있다. 하나 이상의 동족 쌍을 발현하는 데 사용되는 복수의 세포는 세포주 세포일 수 있다. 복수의 TCR 또는 이의 서브세트는 복수의 표적 반응성 TCR을 포함할 수 있다. 이어서, 복수의 TCR은 하나 이상의 표적 항원과 접촉되어 표적 반응성 TCR을 확인할 수 있다. 복수의 표적 반응성 TCR은 하나 이상의 표적 항원에 결합할 수 있고, 이어서 단리되거나 농축될 수 있다. 일부 경우에서, TCR의 동족 쌍을 확인하는 경우, 복수의 TCR의 각각의 TCR의 TCR 알파 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCR 베타 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 물리적으로 연결되어 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 방법은 복수의 TCR의 하나 이상의 동족 쌍을 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 복수의 T 세포는 대상체로부터 단리될 수 있다. 복수의 T 세포는 종양 침윤 T 세포일 수 있다. 복수의 T 세포는 탈진된 T 세포를 포함할 수 있다. 복수의 표적 반응성 TCR은 FACS에 의해 단리되거나 농축될 수 있다. 복수의 표적 반응성 TCR은 세포 표면 마커 또는 시토카인 마커에 의해 단리될 수 있다. 예컨대, 표적 반응성 TCR은 FACS로 분류하기 위해 CD69, CD25 또는 41BB와 같은 표면 마커에 특이적인 항체를 사용하여 단리되거나 농축될 수 있다.
일부 경우에서, 샘플로부터 단리된 복수의 T 세포는, 예컨대 항원을 제시하는 APC와 함께 시험관내에서 배양 및 자극될 수 있으며, 복수의 T 세포의 서브세트는 농축될 수 있다. 이들 사전 농축된 T 세포는 표적 반응성 TCR을 확인하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, 혈액 샘플 또는 PBMC 샘플로부터 복수의 T 세포를 단리하는 경우, 복수의 T 세포의 소분획이 표적 반응성 T 세포일 수 있다. 이러한 경우에서, 복수의 T 세포는 T 세포를 활성화시키기 위해 먼저 (예컨대, MHC 사량체 형태로 또는 세포 표면 상에 제시된) 하나 이상의 표적 항원과 접촉될 수 있다. 복수의 T 세포의 서브세트는 마커(예컨대, 표면 마커)를 기반으로 하여 농축되거나 단리될 수 있으며, 이어서 동족 TCR 쇄를 융합하는 것을 포함하여 본원에 기재된 후속 확인 방법에 사용될 수 있다. 사전 농축된 T 세포는 또한 예컨대 시퀀싱을 이용하여 동족 쌍을 확인하기 위한 공지된 방법에 적용될 수 있다. 시퀀싱은 단일 세포 바코딩(예컨대, T 세포를 개별 구획으로 분할, 단일 세포로부터 방출된 핵산 바코딩, 핵산 시퀀싱 및 동일한 바코드를 기반으로 하여 단일 세포로부터 TCR 쇄 쌍형성)을 이용할 수 있다.
조성물
본 개시내용은 융합된 면역수용체 폴리뉴클레오티드, 융합된 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터, 또는 융합된 면역수용체 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 융합된 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 핵산을 함유하는 복수의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 복수의 융합된 T 세포 수용체(TCR) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함할 수 있다. 제1 핵산 서열은 제1 TCR 펩티드 서열의 제1 가변 도메인을 코딩할 수 있으며, 여기서 제1 가변 도메인은 CDR2 및 CDR3을 포함하고, 제2 핵산 서열은 제2 TCR 펩티드 서열의 제2 가변 도메인을 코딩할 수 있으며, 여기서 제2 가변 도메인은 CDR2 및 CDR3을 포함한다. 각각의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드의 제1 및 제2 핵산 서열은 면역 세포로부터의 제1 및 제2 TCR 펩티드 서열의 동족 쌍을 코딩할 수 있다. 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 50, 100, 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 또는 10,000,000개의 상이한 동족 쌍을 코딩한다. 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40개, 또는 그 초과의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함할 수 있다.
제1 TCR 펩티드 쇄는 T 세포 수용체(TCR) 알파 펩티드 쇄일 수 있고, 제2 TCR 펩티드 쇄는 TCR 베타 펩티드 쇄일 수 있다. 제1 TCR 펩티드 쇄는 TCR 감마 펩티드 쇄일 수 있고, 제2 TCR 펩티드 쇄는 TCR 델타 펩티드 쇄일 수 있다. 제1 가변 도메인은 CDR1을 추가로 포함할 수 있다. 제2 가변 도메인은 CDR1에 추가로 포함될 수 있다. 제1 TCR 펩티드 쇄의 제1 가변 도메인은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3을 포함하는 제1 전장 가변 도메인일 수 있다. 제2 TCR 펩티드 쇄의 제2 가변 도메인은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3을 포함하는 제2 전장 가변 도메인일 수 있다. 제1 핵산 서열은 제1 TCR 펩티드 쇄의 제1 불변 도메인 또는 이의 일부를 추가로 코딩할 수 있다. 제2 핵산 서열은 제2 TCR 펩티드 쇄의 제2 불변 도메인 또는 이의 일부를 추가로 코딩할 수 있다. 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 길이가 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 또는 적어도 1500개 염기쌍일 수 있다. 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드 각각은 길이가 적어도 1000, 적어도 1500, 또는 적어도 2000개 염기쌍일 수 있다.
제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 면역 세포로부터 수득되거나 방출될 수 있다. 면역 세포는 샘플로부터 단리될 수 있다. 예컨대, 샘플은 혈액 샘플, 골수 샘플, 제대 혈액 샘플, 복수 샘플, 흉막 삼출 샘플, 뇌척수 샘플, 정액 샘플, 가래 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 예로서, 샘플은 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절, 편도, 갑상선, 췌장, 심장, 골격근, 장, 후두, 식도, 흉선, 위, 종양, 또는 감염 부위를 포함한 다양한 소스로부터 수득된 조직 샘플일 수 있다. 샘플은 대상체로부터 수득될 수 있다. 대상체는 건강한 대상체 또는 병든 대상체일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 포유동물이다. 포유동물는 인간, 개, 고양이, 마우스 또는 래트일 수 있다. 면역 세포는 이분 면역수용체를 갖거나 발현하는 다양한 면역 세포일 수 있다. 예컨대, 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 림프구일 수 있다. T 세포는 염증 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포일 수 있다.
일부 경우에서, 면역 세포가 시험관내 또는 생체외에서 확장된다. 면역 세포는 마커에 의해 샘플로부터 단리될 수 있다. 마커는 세포 표면 마커일 수 있다. 예컨대, 적합한 세포 표면 마커는 CD39, CD69, CD103, CD25, PD-1, TIM-3, OX-40, 4-1BB, CD137, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, GITR, 및 FoxP3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 마커는 시토카인일 수 있다. 예컨대, 시토카인은 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 퍼포린, 또는 이들의 조합일 수 있다.
융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있다. 예컨대, 프로모터는 테트라사이클린 반응성 프로모터일 수 있다. 프로모터는 바이러스 프로모터일 수 있다. 프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 시토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 프렌드 비장 포커스-형성 바이러스 프로모터, 헤르페스 바이러스 TK 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 7.5K 프로모터, 또는 에놀라제 프로모터일 수 있다.
제1 핵산 및 제2 핵산은 제1 핵산 및 제2 핵산의 발현이 하나의 프로모터의 제어 하에 있을 수 있도록 인-프레임으로 융합될 수 있다. 일부 다른 경우에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 인-프레임으로 융합되지 않을 수 있다. 제1 핵산 및 제2 핵산의 발현은 2개의 프로모터 하에서 제어될 수 있다. 2개의 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 세포성 프로테아제 절단 부위 또는 바이러스성 프로테아제 절단 부위일 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 엔테로키나제 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, 레닌 절단 부위, 콜라게나제 절단 부위, 트립신 절단 부위, 카스파제 프로테아제 절단 부위, 푸린 절단 부위, PC5/6 프로테아제 절단 부위, PACE 프로테아제 절단 부위, LPC/PC7 프로테아제 절단 부위, 인자 Xa 프로테아제 절단 부위, 게네나제 I 절단 부위, MMP 프로테아제 절단 부위, 또는 KEX2 프로테아제 절단 부위일 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 바이러스 2A 프로테아제 절단 부위, 바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 감염성 췌장 괴사증 바이러스(IPNV) VP4 프로테아제 절단 부위, 토바코 에치 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, 또는 터닙 모자이크 포티바이러스의 핵 봉입체 단백질 a(N1a) 절단 부위일 수 있다. 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 자가 절단 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 자가 절단 펩티드는 인테인 펩티드, 헤지혹 펩티드 또는 2A 펩티드일 수 있다.
복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40개, 또는 그 초과의 상이한 V 유전자로부터의 V 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 20개의 상이한 V 유전자를 포함할 수 있다. 적어도 20개의 상이한 V 유전자는 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 및/또는 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자를 포함할 수 있다. TRAV 유전자 또는 TRBV 유전자는 인간 TRAV 유전자 또는 TRBV 유전자일 수 있다. TRAV 유전자 또는 TRBV 유전자는 마우스 TRAV 유전자 또는 TRBV 유전자일 수 있다. 인간 TRAV 유전자의 예는 인간 TRAV1-1, TRAV1-2, TRAV2, TRAV3, TRAV4, TRAV5, TRAV6, TRAV7, TRAV8-1, TRAV8-2, TRAV8-3, TRAV8-4, TRAV8-6, TRAV9-1, TRAV9-2, TRAV10, TRAV12-1, TRAV12-2, TRAV12-3, TRAV13-1, TRAV13-2, TRAV14, TRAV16, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, TRAV21, TRAV22, TRAV23, TRAV24, TRAV25, TRAV26-1, TRAV26-2, TRAV27, TRAV29, TRAV30, TRAV34, TRAV35, TRAV36, TRAV38-1, TRAV38-2, TRAV39, TRAV40, 및 TRAV41을 포함한다. 인간 TRBV 유전자의 예는 인간 TRBV2, TRBV3-1, TRBV4-1, TRBV4-2, TRBV4-3, TRBV5-1, TRBV5-4, TRBV5-5, TRBV5-6, TRBV5-8, TRBV6-1, TRBV6-2, TRBV6-3, TRBV6-4, TRBV6-5, TRBV6-6, TRBV6-8, TRBV6-9, TRBV7-2, TRBV7-3, TRBV7-4, TRBV7-6, TRBV7-7, TRBV7-8, TRBV7-9, TRBV9, TRBV10-1, TRBV10-2, TRBV10-3, TRBV11-1, TRBV11-2, TRBV11-3, TRBV12-3, TRBV12-4, TRBV12-5, TRBV13, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV18, TRBV19, TRBV20-1, TRBV24-1, TRBV25-1, TRBV27, TRBV28, TRBV29-1, 및 TRBV30을 포함한다.
복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40개, 또는 그 초과의 상이한 V 유전자 서브그룹으로부터의 V 영역을 포함할 수 있다. 적어도 20개의 상이한 V 유전자는 적어도 20개의 상이한 V 유전자 서브그룹으로부터의 유전자를 포함할 수 있다. 적어도 20개의 상이한 V 유전자 서브그룹은 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 서브그룹 및/또는 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자 서브그룹을 포함할 수 있다. 인간 TRAV 유전자 서브그룹의 예는 인간 TRAV1, TRAV2, TRAV3, TRAV4, TRAV5, TRAV6, TRAV7, TRAV8, TRAV9, TRAV10, TRAV12, TRAV13, TRAV14, TRAV16, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, TRAV21, TRAV22, TRAV23, TRAV24, TRAV25, TRAV26, TRAV27, TRAV29, TRAV30, TRAV34, TRAV35, TRAV36, TRAV38, TRAV39, TRAV40, 및 TRAV41 서브그룹을 포함한다. 인간 TRBV 유전자 서브그룹의 예는 인간 TRBV2, TRBV3, TRBV4, TRBV5, TRBV6, TRBV7, TRBV9, TRBV10, TRBV11, TRBV12, TRBV13, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV18, TRBV19, TRBV20, TRBV24, TRBV25, TRBV27, TRBV28, TRBV29, 및 TRBV30 서브그룹을 포함한다.
마우스 TRAV 유전자의 예는 마우스 TRAV1, TRAV2, TRAV3-1, TRAV3-3, TRAV3-4, TRAV3D-3, TRAV3N-3, TRAV4-2, TRAV4-3, TRAV4-4, TRAV4D-2, TRAV4D-3, TRAV4D-4, TRAV4N-3, TRAV4N-4, TRAV5-1, TRAV5-2, TRAV5-4, TRAV5D-2, TRAV5D-4, TRAV5N-2, TRAV5N-4, TRAV6-1, TRAV6-2, TRAV6-3, TRAV6-4, TRAV6-5, TRAV6-6, TRAV6-7, TRAV6D-3, TRAV6D-4, TRAV6D-5, TRAV6D-6, TRAV6D-7, TRAV6N-5, TRAV6N-6, TRAV6N-7, TRAV7-1, TRAV7-2, TRAV7-3, TRAV7-4, TRAV7-5, TRAV7-6, TRAV7D-2, TRAV7D-3, TRAV7D-4, TRAV7D-5, TRAV7D-6, TRAV7N-4, TRAV7N-5, TRAV7N-6, TRAV8-1, TRAV8-2, TRAV8D-1, TRAV8D-2, TRAV8N-2, TRAV9-1, TRAV9-2, TRAV9-3, TRAV9-4, TRAV9D-1, TRAV9D-2, TRAV9D-3, TRAV9D-4, TRAV9N-2, TRAV9N-3, TRAV9N-4, TRAV10, TRAV10D, TRAV10N, TRAV11, TRAV11D, TRAV11N, TRAV12-1, TRAV12-2, TRAV12-3, TRAV12D-1, TRAV12D-2, TRAV12D-3, TRAV12N-1, TRAV12N-2, TRAV12N-3, TRAV13-1, TRAV13-2, TRAV13-3, TRAV13-4, TRAV13-5, TRAV13D-1, TRAV13D-2, TRAV13D-3, TRAV13D-4, TRAV13N-1, TRAV13N-2, TRAV13N-3, TRAV13N-4, TRAV14-1, TRAV14-2, TRAV14-3, TRAV14D-1, TRAV14D-2, TRAV14D-3, TRAV14N-1, TRAV14N-2, TRAV14N-3, TRAV15-1, TRAV15-2, TRAV15D-1, TRAV15D-2, TRAV15N-1, TRAV15N-2, TRAV16, TRAV16D, TRAV16N, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, 및 TRAV21을 포함한다. 마우스 TRBV 유전자의 예는 마우스 TRBV1, TRBV2, TRBV3, TRBV4, TRBV5, TRBV8, TRBV9, TRBV10, TRBV12-1, TRBV12-2, TRBV13-1, TRBV13-2, TRBV13-3, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV17, TRBV19, TRBV20, TRBV21, TRBV23, TRBV24, TRBV26, TRBV29, TRBV30, 및 TRBV31을 포함한다. 마우스 TRAV 유전자 서브그룹의 예는 마우스 TRAV1, TRAV2, TRAV3, TRAV4, TRAV5, TRAV6, TRAV7, TRAV8, TRAV9, TRAV10, TRAV11, TRAV12, TRAV13, TRAV14, TRAV15, TRAV16, TRAV17, TRAV18, TRAV19, TRAV20, 및 TRAV21 서브그룹을 포함한다. 마우스 TRBV 유전자 서브그룹의 예는 마우스 TRBV1, TRBV2, TRBV3, TRBV4, TRBV5, TRBV8, TRBV9, TRBV10, TRBV12, TRBV13, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV17, TRBV19, TRBV20, TRBV21, TRBV23, TRBV24, TRBV26, TRBV29, TRBV30, 및 TRBV31 서브그룹을 포함한다.
융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 원형화될 수 있다. 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 상이한 또는 고유한) 서열을 포함할 수 있다.
융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 발현을 위해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 다양한 유전자 전달 방법을 이용할 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 일부 경우에서, 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 전기천공에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있고, 일부 다른 경우에서, 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 벡터에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각 본원에 기재된 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드와 상이한 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 벡터가 본원에 제공된다. 복수의 벡터는 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 적어도 10,000,000개의 벡터를 포함할 수 있다. 복수의 벡터는 자가 증폭 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온일 수 있다. 복수의 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 복수의 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 알파 바이러스, 백시나 바이러스, B형 간염 바이러스, 또는 인간 유두종 바이러스 또는 이들의 슈도타입로부터 유래될 수 있다. 복수의 벡터는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 비-바이러스 벡터는 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노중합체, 나노로드, 리포좀, 미셀, 마이크로버블, 세포 투과성 펩티드 또는 지질구일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에는 복수의 벡터를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 복수의 벡터의 각각은 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 갖는 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 (1) 제1 핵산 서열은 제1 TCR 펩티드 쇄의 제1 가변 도메인을 코딩하고, 여기서 제1 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, (2) 제2 핵산 서열은 제2 TCR 펩티드 쇄의 제2 가변 도메인을 코딩하고, 여기서 제2 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하고; 여기서 각각의 융합된 TCR 서열의 제1 및 제2 핵산 서열은 면역 세포로부터의 제1 및 제2 TCR 펩티드 쇄의 동족 쌍을 코딩한다. 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40개, 또는 그 초과의 상이한 V 유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드는 적어도 20개의 상이한 V 유전자를 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 벡터는 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 상이한 동족 쌍을 포함한다. 적어도 20개의 상이한 V 유전자는 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 서브그룹 및/또는 적어도 10개의 상이한 TRBV 유전자 서브그룹을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 복수의 TCR이 본원에 제공된다. 복수의 TCR 각각은 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드로부터 상이한 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 복수의 TCR 각각은 본원에서 기재되는 바와 같은 복수의 벡터로부터 상이한 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 복수의 TCR은 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 TCR을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 복수의 숙주 세포가 본원에 제공된다. 본원에서 기재되는 바와 같이, 이러한 숙주 세포는 "수용자 세포"로 지칭된다. 복수의 숙주 세포 각각은 본원에 기재된 복수의 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드로부터 상이한 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 복수의 숙주 세포 각각은 본원에서 기재되는 바와 같은 복수의 벡터의 상이한 벡터를 포함할 수 있다. 복수의 벡터 각각은 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있다. 복수의 벡터 각각은 복수의 TCR의 상이한 TCR을 포함할 수 있다. 복수의 숙주 세포는 T 세포 또는 B 세포일 수 있다. T 세포는 염증 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포일 수 있다. 복수의 숙주 세포는 자가 세포일 수 있다. 복수의 숙주 세포는 동종이계 세포일 수 있다. 복수의 숙주 세포는 공여자로부터 수득될 수 있다. 공여자는 인간일 수 있다. 공여자는 건강한 공여자 또는 병든 공여자일 수 있다. 복수의 숙주 세포는 샘플으로부터 수득될 수 있다. 예컨대, 샘플은 혈액 샘플, 골수 샘플, 제대 혈액 샘플, 복수 샘플, 흉막 삼출 샘플, 뇌척수 샘플, 정액 샘플, 가래 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 예로서, 샘플은 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절, 편도, 갑상선, 췌장, 심장, 골격근, 장, 후두, 식도, 흉선, 위, 종양, 감염 부위, 또는 이들의 조합으로부터 수득된 조직 샘플일 수 있다. 복수의 숙주 세포는 세포주 세포일 수 있다. 세포주 세포의 예는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; 저캇 세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; 또는 Molt 4 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 복수의 숙주 세포는 유전자 변형된 세포일 수 있다. 일부 경우에서, TCR 알파 펩티드 서열, TCR 베타 펩티드 서열, TCR 감마 펩티드 서열, TCR 델타 펩티드 서열, BCR 중 펩티드 서열, 또는 BCR 경쇄 펩티드 서열을 코딩하는 내인성 유전자는 하향조절되거나 비활성화될 수 있다. 일부 경우에서, TCR 알파 및 베타 펩타이드 서열을 코딩하는 내인성 유전자는 하향조절되거나 비활성화된다. 일부 경우에서, 추가의 내인성 유전자는 하향조절되거나 비활성화된다. 추가의 내인성 유전자의 예는 PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 및 2B4를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 2개 이상의 추가의 내인성 유전자는 하향조절되거나 비활성화된다. 숙주 세포는 숙주 세포의 기능을 향상시키기 위해 추가의 작용제를 발현하도록 조작될 수 있다. 기능은 세포독성 기능, 전염증 기능 또는 항염증 기능일 수 있다. 추가의 작용제는 시토카인일 수 있다. 시토카인은 전염증 시토카인 또는 항염증 시토카인일 수 있다. 시토카인은 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 인터류킨(IL)-1α, IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-15, IL-18, 인터페론(IFN-γ), 혈소판 활성화 인자(PAF), 단핵구 화학주성 단백질 1 및 2(MCP-1, MCP-2), 대식세포 이동 억제 인자(MIF), CXCL8, CXCL9, CXCL10, 높은 이동성 그룹 박스 단백질 1(HMGB-1), IL-1ra, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 전환 성장 인자 베타(TGF-β), IL-16, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
또한, 복수의 히드로겔 입자 또는 비드를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 복수의 히드로겔 입자 또는 비드 각각은 (a) 제1 면역수용체 펩티드 서열의 제1 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 분자 및 이의 제1 증폭 생성물(여기서, 제1 가변 도메인은 CDR3을 포함), 및 (b) 제2 면역수용체 펩티드 서열의 제2 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산 분자 및 이의 제2 증폭 생성물(여기서, 제2 가변 도메인은 CDR3을 포함)을 포함할 수 있다(예컨대, 도 4a, 4b, 5a-5c, 9a, 9b, 10a, 및 10b의 TRA 및 TRB). 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체를 갖는 매트릭스 내에 매립되거나 포착될 수 있다. 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물의 확산은 제한될 수 있다. 일부 다른 측면에서, 복수의 히드로겔 입자 또는 비드 각각은 (a) 제1 면역수용체 펩티드 서열의 제1 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 분자 및 이의 제1 프라이머 연장 생성물(여기서 제1 가변 도메인은 CDR3을 포함) 및 (b) 제2 면역수용체 펩티드 서열의 제2 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산 분자 및 이의 제2 프라이머 연장 생성물(여기서, 제2 가변 도메인은 CDR3을 포함)을 포함한다. 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 프라이머 연장 생성물은 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체를 갖는 매트릭스 내에 매립되거나 포착될 수 있다. 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 프라이머 연장 생성물의 확산이 제한될 수 있다. 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 사전 설계된 서열을 갖는 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 어댑터 서열은 제1 또는 제2 핵산에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않을 수 있다. 어댑터 서열은 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드의 서열 또는 역 상보 서열일 수 있다. 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 역전사(RT) 생성물일 수 있다. 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 제2 가닥 합성(SSS) 생성물일 수 있다. RT 생성물은 확산 제한제에 연결될 수 있다. SSS 생성물은 확산 제한제에 연결될 수 있다. SSS 생성물은 확산 제한제에 간접적으로 연결될 수 있다. 예컨대, SSS 생성물은 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되고 결국 확산 제한제에 연결될 수 있다(예컨대, 도 5a 및 5b 및 도 10a 및 10b).
제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 제1 및 제2 증폭 생성물일 수 있다. 제1 증폭 생성물 및/또는 제2 증폭 생성물은 확산 제한제에 연결될 수 있다. 제1 증폭 생성물 및/또는 제2 증폭 생성물은 포획제를 통해 확산 제한제에 연결될 수 있다. 포획제는 제1 증폭 생성물 및/또는 제2 증폭 생성물의 어댑터 서열에 대한 상보적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 확산 제한제는 중합체일 수 있다. 중합체는 선형 중합체일 수 있다. 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다당류일 수 있다. 확산 제한제는 입자일 수 있다. 입자가 히드로겔 입자 또는 비드의 매트릭스 외부로 확산되지 않도록 입자는 매트릭스의 공극 크기보다 큰 직경을 가질 수 있다. 확산 제한제는 매트릭스 자체일 수 있다. 예컨대, 폴리뉴클레오티드는 매트릭스에 직접적으로 연결되어 폴리뉴클레오티드의 확산을 제한할 수 있다. 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 세포로부터 방출될 수 있다. 세포은 단일 세포일 수 있다. 세포는 림프구일 수 있다. 세포는 T 세포 또는 B 세포일 수 있다. T 세포는 CD3+ T 세포, CD28+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD45RA+ T 세포, CD45RO+ T 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. B 세포는 CD3+ T 세포, CD28+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD45RA+ T 세포, CD45RO+ T 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. B 세포는 형질모세포 세포, 형질 세포, 림프형질세포양 세포, 기억 B 세포, 여포성 B 세포, 변연부 B 세포, B-1 세포, B-2 세포, 또는 조절 B 세포일 수 있다. 제1 면역수용체 펩티드 서열은 TCR 알파 펩티드 서열일 수 있고 제2 면역수용체 펩티드 서열은 TCR 베타 펩티드 서열일 수 있다.
제1 면역수용체 펩티드 쇄는 TCR 감마 펩티드 쇄일 수 있고 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 TCR 델타 펩티드 쇄일 수 있다. 제1 면역수용체 펩티드 쇄는 면역글로불린 중쇄 펩티드 쇄일 수 있고 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 면역글로불린 경쇄 펩티드 쇄일 수 있다. 제1 면역수용체 펩티드 쇄 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 이분 면역수용체의 동족 쌍일 수 있다.
제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 연결되어 연속적인 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 제1 증폭 생성물 및/또는 제2 증폭 생성물은 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자의 적어도 약 100, 적어도 약 500, 적어도 약 1000, 적어도 약 10000개, 또는 그 초과의 카피를 포함할 수 있다 . 제1 또는 제2 핵산은 확산 제한될 수 있다. 예컨대, 제1 또는 제2 핵산은 확산 제한제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산일 수 있다. 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자는 단일 가닥 핵산 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 제1 핵산 분자는 제1 불변 도메인을 추가로 코딩할 수 있고/있거나 제2 핵산 분자는 제2 불변 도메인을 추가로 코딩할 수 있다.
복수의 히드로겔 입자 또는 비드는 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 히드로겔 입자 또는 비드를 포함할 수 있다. 복수의 히드로겔 입자 또는 비드는 이분 면역수용체의 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 상이한 동족 쌍을 포함할 수 있다.
히드로겔 입자 또는 비드를 제조하는 데 사용되는 중합체는 다당류, 폴리아크릴아미드 또는 이들의 조합일 수 있다. 다당류는 아가로스, 히알루론산, 카르복시메틸셀룰로스, 키토산, 덱스트란, 전분, 또는 알기네이트일 수 있다. 히드로겔 입자 또는 비드를 제조하는 데 사용되는 단량체는 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드 단량체일 수 있다. 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체는 아가로스와 폴리아크릴아미드의 혼합물을 포함할 수 있다. 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체는 가교결합될 수 있다. 제1 가변 도메인 및/또는 제2 가변 도메인은 CDR1, CDR2 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 각각의 히드로겔 입자 또는 비드는 아가로스 겔 입자이다.
또 다른 측면에서, 복수의 적어도 5개의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 적어도 5개의 히드로겔 입자 각각은 (a) 제1 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (b) 제2 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 고유한 동족 면역수용체의 쌍을 이룬 쇄를 포함하고, 여기서 적어도 5개의 히드로겔 입자의 개별 히드로겔 입자의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 (i) 단일 세포로부터의 것이고, (ii) 서로 연결되어 있으며; 여기서 히드로겔 입자로부터의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 확산은 제한된다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. DNA는 증폭 생성물일 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 공유적으로 연결될 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결될 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 확산 제한제에 연결될 수 있다.
또 다른 측면에서, 복수의 적어도 5개의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 적어도 5개의 히드로겔 입자 각각은 (a) 제1 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 RNA 및 (b) 제2 제2 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 RNA를 포함하고, 여기서 각각의 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 고유한 동족 면역수용체의 쌍을 이룬 쇄를 포함하고, 여기서 적어도 5개의 히드로겔 입자의 개별 히드로겔 입자의 각각의 제1 RNA 및 제2 RNA는 단일 세포로부터의 것이고, (1) 각각의 제1 RNA는 제1 RNA의 역 상보 서열을 포함하는 제1 cDNA에 하이브리드화되고 (2) 각각의 제2 RNA는 제2 RNA의 역 상보 서열을 포함하는 제2 cDNA에 하이브리드화되고; 여기서 히드로겔 입자로부터의 제1 cDNA 및 제2 cDNA의 확산은 제한된다. 제1 cDNA 또는 제2 cDNA는 제1 RNA 또는 제2 RNA에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않은 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제1 cDNA 또는 제2 cDNA는 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드의 역 상보 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제1 cDNA 또는 제2 cDNA는 확산 제한제에 연결될 수 있다.
또 다른 측면에서, 복수의 적어도 5개의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 적어도 5개의 히드로겔 입자 각각은 (a) 제1 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (b)) 제2 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 고유한 동족 면역수용체의 쌍을 이룬 쇄를 포함하고, 여기서 적어도 5개의 히드로겔 입자의 개별 히드로겔 입자의 각각의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 단일 세포로부터의 것이고, 여기서 (1) 각각의 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 프라이머에 하이브리드화되고 (2) 각각의 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 프라이머에 하이브리드화되고; 여기서 히드로겔 입자로부터의 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 확산은 제한된다. 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 역전사 프라이머일 수 있다. 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 증폭 프라이머일 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 확산 제한제에 연결될 수 있다.
또 다른 측면에서, 적어도 5개의 히드로겔 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 적어도 5개의 히드로겔 입자 각각은 (a) 제1 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 DNA 및 (b)) 제2 면역수용체 펩티드 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 DNA를 포함하고, 여기서 각각의 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 고유한 동족 면역수용체의 쌍을 이룬 쇄를 포함하고, 여기서 적어도 5개의 히드로겔 입자의 개별 히드로겔 입자의 각각의 제1 DNA 및 제2 DNA는 단일 세포로부터의 것이고, 여기서 (1) 각각의 제1 DNA는 제1 면역수용체 쇄를 코딩하는 서열의 역 상보 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되고 (2) 각각의 제2 DNA는 제2 면역수용체 쇄를 코딩하는 서열의 역 보체 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되고; 여기서 히드로겔 입자로부터의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 확산은 제한된다. 제1 DNA 또는 제2 DNA는 cDNA일 수 있다. 제1 DNA 또는 제2 DNA는 게놈 DNA일 수 있고, 이러한 경우에서, 어댑터 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 제1 DNA 또는 제2 DNA를 하이브리드화하여 제1 또는 제2 DNA의 연장 생성물을 생성할 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. RNA는 메신저 RNA일 수 있다. 예컨대, 도 4a 또는 도 5a는 cDNA가 mRNA에 하이브리드화 한다는 것을 보여준다. 히드로겔 입자로부터의 제1 DNA 또는 제2 DNA의 확산은 제한될 수 있다. 일부 경우에서, 제1 DNA 또는 제2 DNA는 cDNA이고, 이러한 경우에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 가닥 합성(SSS) 생성물일 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 증폭 생성물일 수 있다. 증폭 생성물은 제1 또는 제2 DNA에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않은 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 어댑터 서열은 포획제에 추가로 하이브리드화할 수 있다. 포획제는 확산 제한제에 연결될 수 있다.
확산 제한제는 중합체 또는 입자일 수 있다. 제1 및 제2 면역수용체 펩티드 쇄는 TCR 알파 및 TCR 베타 펩티드 쇄, TCR 감마 및 TCR 델타 펩티드 쇄, 또는 BCR 중쇄 및 경쇄 펩티드 쇄일 수 있다. 단일 세포는 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포일 수 있다.
또 다른 측면에서, 복수의 적어도 1,000개의 구획을 포함하는 조성물로서, 적어도 1,000개의 구획의 각각의 구획이 고체 지지체를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 고체 지지체는 (a) 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제1 공통 서열과 제2 공통 서열 사이의 TCR 알파 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 제3 공통 서열, 제4 공통 서열, 및 제3 공통 서열과 제4 공통 서열 사이의 TCR 베타 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 (i) 각각의 구획의 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 동족 쌍이고, (ii) 복수의 구획의 복수의 제1 공통 서열은 동일한 서열을 갖고 제1 프라이머에 하이브리드화 가능하거나 상보적이며, (iii) 복수의 구획의 복수의 제2 공통 서열은 동일한 서열을 갖고 제2 프라이머에 하이브리드화 가능하거나 상보적이고, (iv) 복수의 구획의 복수의 제3 공통 서열은 동일한 서열을 갖고 제3 프라이머에 하이브리드화 가능하거나 상보적이며, (v) 복수의 구획의 복수의 제4 공통 서열 동일한 서열을 갖고 제4 프라이머와 하이브리드화 가능하거나 상보적이다. 각각의 구획은 제1 프라이머, 제2 프라이머, 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 제1 프라이머의 농도는 적어도 1 nM일 수 있고, 제2 프라이머의 농도는 적어도 1 nM일 수 있고, 제3 프라이머의 농도는 적어도 1 nM일 수 있고, 제4 프라이머의 농도는 적어도 1 nM일 수 있다. 각각의 프라이머의 농도는 적어도 약 0.5 nM, 적어도 약 1 nM, 적어도 약 1.5 nM, 적어도 약 2 nM, 적어도 약 2.5 nM, 적어도 약 3 nM, 적어도 약 3.5 nM, 또는 적어도 약 4 nM일 수 있다. 제2 공통 서열은 각각의 구획에서 제4 공통 서열 또는 이의 역 상보 서열에 하이브리드화 가능하거나 상보적일 수 있다.
또 다른 측면에서, 적어도 1,000개의 구획을 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 적어도 1,000개의 구획의 각각의 구획은 (a) 5' 말단에 제1 공통 서열, 3' 말단에 제2 공통 서열, 및 제1 공통 서열과 제2 공통 서열 사이의 TCR 알파 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는 제1의 완전 또는 부분 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 (i) TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 동족 쌍이고, (ii) 제2 공통 서열은 제4 공통 서열에 하이브리드화된다. 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 제3 공통 서열 또는 제4 공통 서열은 복수의 적어도 1,000개의 구획에서 동일할 수 있다. 각각의 구획은 고체 지지체를 추가로 포함할 수 있다. 고체 지지체는 비드 또는 히드로겔 입자일 수 있다.
방법
본 개시내용은 본원에서 기재되는 바와 같은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 제조하거나 사용하는 방법을 제공한다. 다양한 방법 및 적용이 제공된다.
한 측면에서, 융합된 이분 면역수용체 서열 라이브러리를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 각각 (1) 세포 및 (2) 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 포함하는, 복수의 용기를 생성하는 단계로서, 여기서 세포는 이분 면역수용체의 제1 펩티드 서열을 코딩하는 제1 핵산 및 이분 면역수용체의 제2 펩티드 서열을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 단계; 및 (b) 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 중합하거나 겔화하여, 각각 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체로 구성된 매트릭스를 갖는, 복수의 경화된 입자를 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 경화된 입자 각각은 제1 핵산의 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 핵산의 제2 프라이머 연장 생성물을 포함하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 프라이머 연장 생성물은 매트릭스 내에 매립되거나 포착된다. 일부 경우에서, 제1 프라이머 연장 생성물 및 제2 프라이머 연장 생성물의 확산은 제한된다. 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 역전사(RT) 생성물, 제2 가닥 합성(SSS) 생성물, 또는 증폭 생성물일 수 있다. 제1 및/또는 제2 프라이머 연장 생성물은 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 어댑터 서열은 제1 또는 제2 핵산 분자에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않을 수 있다. 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 가변 도메인을 코딩할 수 있다. 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함할 수 있다. 제1 및/또는 제2 프라이머 연장 생성물은 불변 도메인을 추가로 코딩할 수 있다.
각각의 용기의 세포는 용해되어 제1 핵산과 제2 핵산을 방출할 수 있다. 제1 핵산 및 제2 핵산은 역전사될 수 있다. 역전사는 RT 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. RT 프라이머는 확산 제한제에 연결될 수 있으며, 여기서 확산 제한제는 매트릭스 내에서 RT 프라이머의 확산을 제한한다. 일부 경우에서, 템플릿 스위치 반응 또는 SSS 반응이 수행된다. 제1 핵산 및 제2 핵산은 증폭되어 제1 및 제2 증폭 생성물을 생성할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 또는 제2 핵산 각각에 대해, 증폭은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 사용하여 수행된다. 제1 증폭 프라이머는 확산 제한제에 연결될 수 있으며, 여기서 확산 제한제는 매트릭스 내에서 제1 증폭 프라이머의 확산을 제한한다.
일부 경우에, 경화된 입자는 세척될 수 있다. 경화된 입자를 세척하여 시약이 경화된 입자에서 확산되도록 할 수 있다. 시약은 RT 프라이머, 증폭 프라이머, 템플릿 스위치 프라이머, SSS 프라이머, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 경화된 입자를 세척하여 또 다른 시약이 경화된 입자로 확산되도록 할 수 있다. 일부 경우에서, 방법은 경화된 입자를 반복적으로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 경화된 입자는 세척 단계 후에 오일에 재유화될 수 있다. 재유화 경화된 입자는 반응을 수행하기 위한 단일 세포 반응으로 다시 사용될 수 있다. 온도가 상승하는 특정 반응 동안 경화된 입자는 완전히 또는 부분적으로 용해될 수 있다.
제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 확산 제한제에 연결될 수 있다. 확산 제한제는 중합체일 수 있다. 확산 제한제로 사용되는 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다당류일 수 있다. 확산 제한제는 입자일 수 있다. 입자는 매트릭스의 공극 크기보다 큰 직경을 가질 수 있다. 확산 제한제는 매트릭스 자체일 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 제한될 수 있도록 폴리뉴클레오티드를 매트릭스 또는 확산 제한제에 연결하는 다양한 방법이 있다. 예컨대, 제1 및 제2 프라이머 연장 생성물은 포획제를 통해 확산 제한제에 연결될 수 있다. 포획제는 고정화 모이어티를 포함할 수 있다. 고정화 모이어티는 포획제를 확산 제한제에 연결할 수 있다. 고정화 모이어티는 반응기를 포함할 수 있다. 포획제는 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 포획 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 제1 증폭 프라이머는 포획 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 증폭 생성물은 포획 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화하여 제1 및 제2 증폭 생성물을 포획제에 연결함으로써 확산 제한제에 연결하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 반응기는 숙신이미딜 에스테르, 아미드, 아크릴아미드, 아실 아지드, 아실 할라이드, 아실 니트릴, 알데히드, 케톤, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 무수물, 아릴 할라이드, 아지리딘, 보로네이트, 카르보이미드, 디아조알칸, 에폭사이드, 할로아세트아미드, 할로플라티네이트, 할로트리아진, 이미도 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 포스포르아미다이트, 실릴 할라이드, 술포네이트 에스테르, 술포닐 할라이드, 아민, 아닐린, 티올, 알콜, 페놀, 히라진, 히드록실아민, 카르복실산, 글리콜, 또는 헤테로사이클일 수 있다.
제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 추가로 연결되어 각각의 용기 또는 경화된 입자 내에 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 형성함으로써 복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 갖는 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생성할 수 있다. 융합된 폴리뉴클레오티드 각각은 고유한 서열을 가질 수 있다. 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 리게이션 또는 PCR에 의해 연결될 수 있다. 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 연속 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 제1 증폭 생성물 및 제2 증폭 생성물은 인-프레임으로 연결될 수 있다.
복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 또는 경화된 입자로부터 방출될 수 있다. 복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 각각은 원형화될 수 있다.
복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 각각은 (예컨대, 융합된 선형 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 벡터 골격에 리게이션하여) 벡터로 전환될 수 있다. 일부 경우에서, 벡터는 폴리뉴클레오티드가 아니고, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 비-폴리뉴클레오티드 벡터에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다.
벡터는 자가 증폭 RNA 레플리콘, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온일 수 있다. 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 알파 바이러스, 백시나 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 유두종 바이러스 또는 이들의 슈도타입으로부터 유도될 수 있다. 벡터는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 비-바이러스 벡터는 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 금속성 나노중합체, 나노로드, 리포좀, 미셀, 마이크로버블, 세포 투과성 펩티드, 또는 지질구일 수 있다.
이분 면역수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 B 세포 수용체(BCR)일 수 있다. TCR은 TCR 알파 펩티드 서열 및 TCR 베타 펩티드 서열, 또는 TCR 감마 펩티드 서열 및 TCR 델타 펩티드 서열을 포함할 수 있으며; BCR은 중쇄 펩티드 서열 및 경쇄 펩티드 서열을 포함할 수 있다.
소스 세포로 사용되는 세포는 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 림프구일 수 있다. 림프구는 T 세포 또는 B 세포일 수 있다. T 세포는 염증 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포일 수 있다. B 세포는 형질모세포, 형질 세포, 림프형질세포양 세포, 림프형질세포양 세포, 기억 B 세포, 여포성 B 세포, 변연부 B 세포, B-1 세포, B-2 세포 또는 조절 B 세포일 수 있다. 면역 세포는 종양 조직이나 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다.
융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 전달될 수 있다. 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 10,000,000개의 상이한 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 각각 상이한 서열을 갖는다. 제1 핵산 및 제2 핵산에 의해 코딩되는 제1 펩티드 쇄 및 제2 펩티드 쇄는 이분 면역수용체의 동족 쌍일 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용되는 용기는 액적일 수 있다. 액적은 유중수 액적일 수 있다. 경화된 입자는 중합체 및/또는 단량체를 중합 또는 겔화함으로써 액적 내에 형성될 수 있다. 경화된 입자는 히드로겔 입자일 수 있다. 히드로겔 입자를 형성하는 데 사용되는 중합체는 다당류, 폴리아크릴아미드 또는 이들의 조합일 수 있다. 다당류는 아가로스, 히알루론산, 카르복시메틸셀룰로스, 키토산, 전분, 덱스트란 또는 알기네이트일 수 있다. 히드로겔 입자를 형성하는 데 사용되는 단량체는 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드 단량체일 수 있다. 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체는 아가로스와 폴리아크릴아미드의 혼합물을 포함할 수 있다. 중합되거나 겔화된 복수의 중합체 및/또는 단량체는 가교결합될 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체는 개시제를 사용하여 중합되거나 겔화될 수 있다. 개시제는 UV 광 또는 화학물질일 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체는 용기의 온도를 낮춤으로써 중합되거나 겔화될 수 있다. 예컨대, 아가로스 입자는 아가로스의 온도를 낮춤으로써 형성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공된다. 방법의 예시적인 절차는 (a) 각각 단일 세포(예컨대, 면역 세포) 및 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 포함하는 복수의 용기(예컨대, 액적)를 생성하는 단계; (b) 각각의 용기에서 단일 세포를 용해하여 제1 핵산 및 제2 핵산을 갖는 핵산을 방출하는 단계로서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 면역수용체의 제1 펩티드 쇄 및 제2 펩티드 쇄를 코딩하는 단계; (c) 제1 및 제2 핵산이 RNA인 경우, 제1 및 제2 핵산을 역전사하는 단계; (d) 제1 및 제2 핵산 또는 이의 유도체(예컨대, cDNA)가 히드로겔 입자 내에 포착되도록 중합체 및/또는 단량체를 중합하거나 겔화하여 히드로겔 입자를 생성하는 단계; (e) 히드로겔 입자를 세척하여 시약 교환을 수행하는 단계; f) 히드로겔 입자를 재유화시키는 단계; (g) 제1 및 제2 핵산 또는 이의 유도체를 증폭시켜 제1 및 제2 핵산에 대한 증폭 생성물을 생성하는 단계; 및 (h) 제1 및 제2 핵산의 증폭 생성물을 연결 또는 융합하여 복수의 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 템플릿 스위치 반응은 역전사 동안 수행된다. 일부 다른 경우에서, 제2 가닥 합성 반응은 역전사 후에 수행된다. 일부 경우에서, 히드로겔 입자 생성은 제1 및 제2 핵산을 증폭한 후 수행될 수 있으며, 이어서 히드로겔 입자를 세척하면 제1 및 제2 핵산을 증폭시키는 데 사용된 내부 프라이머를 제거할 수 있다. 일부 다른 경우에서, 역전사 후 및 증폭 전에 히드로겔 입자 생성이 수행되지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하는 단계; (b) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 증폭시켜 증폭 생성물을 형성하는 단계; (c) 액체에서 중합체 매트릭스를 생성하여 히드로겔 입자를 형성함으로써 증폭 생성물의 확산을 제한하는 단계; 및 (d) 히드로겔 입자를 세척하여 히드로겔 입자로부터 제2 프라이머를 고갈시키는 단계를 포함한다. 제1 프라이머 또는 증폭 생성물은 확산 제한제에 연결될 수 있다. 방법은 추가의 핵산 분자에 하이브리드화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 핵산 분자 및 추가 핵산 분자는 면역수용체의 동족 쌍일 수 있다.
일부 실시양태에서, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하는 단계; (b) 액체에서 중합체 매트릭스를 생성하여 히드로겔 입자를 형성함으로써 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥의 확산을 제한하는 단계; (c) 히드로겔 입자를 세척하는 단계; 및 (d) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 증폭시켜 증폭 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제1 연장 생성물은 확산 제한제에 연결될 수 있다.
확산 제한제는 중합체 또는 입자일 수 있다. 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다당류일 수 있다. 입자는 중합체 매트릭스의 공극 크기보다 큰 직경을 가질 수 있다. 확산 제한제는 중합체 매트릭스일 수 있다. 핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 핵산 분자는 게놈 DNA일 수 있다. 핵산 분자는 메신저 RNA일 수 있다. 제1 올리고뉴클레오티드는 역전사(RT) 프라이머일 수 있다. RT 프라이머는 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드로 추가로 연장되어 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드의 역 상보 서열을 갖는 제1 연장 생성물을 생성할 수 있다. 일부 경우에서, 어댑터 서열을 갖는 제2 가닥 합성(SSS) 프라이머를 사용하여 제1 연장 생성물의 역 상보 가닥을 합성할 수 있다. 어댑터 서열은 핵산 분자 또는 제1 연장 생성물에 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않을 수 있다. 제1 연장 생성물는 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자는 면역수용체의 펩티드 서열을 코딩할 수 있다. 일부 경우에서, 방법은 히드로겔 입자를 세척한 후 또는 세척하는 동안 시약이 히드로겔 입자로 확산되도록 시약을 히드로겔 입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시약은 올리고뉴클레오티드 또는 효소일 수 있다. 효소는 폴리머라제일 수 있다. 폴리머라제는 교정 활성을 가질 수 있다. 폴리머라제의 예는 DNA 폴리머라제, 열안정성 폴리머라제, 야생형 폴리머라제, 변형된 폴리머라제, 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I, T7 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Tth 폴리머라제, Tli 폴리머라제, Pfu 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, VENT 폴리머라제, DEEPVENT 폴리머라제, EX-Taq 폴리머라제, LA-Taq 폴리머라제, Sso 폴리머라제, Poc 폴리머라제, Pab 폴리머라제, Mth 폴리머라제, ES4 폴리머라제, Tru 폴리머라제, Tac 폴리머라제, Tne 폴리머라제, Tma 폴리머라제, Tea 폴리머라제, Tih 폴리머라제, Tfi 폴리머라제, 백금 Taq 폴리머라제s, Tbr 폴리머라제, Tfl 폴리머라제, Pfu-turbo 폴리머라제, 피로베스트(Pyrobest) 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, KOD 폴리머라제, Bst 폴리머라제, Sac 폴리머라제, 클레노우 단편, 및 변이체, 이의 변형된 생성물 및 유도체를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 히드로겔 입자는 세척 후 오일에 재유화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 a) 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 액적의 적어도 2개의 액적은 단일 세포를 포함하는 단계; (b) 단일 세포로부터 제1 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하고; 단일 세포로부터 제2 핵산 분자에 하이브리드화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제2 연장 생성물을 형성하는 단계; (c) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트로 증폭시켜 제1 증폭 생성물 세트를 형성하고; 제2 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트로 증폭시켜 제2 증폭 생성물 세트를 형성하는 단계; 및 (d) 제1 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물을 제2 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물에 연결하는 단계로서, 여기서 연결은 제2 및 제4 프라이머의 부재 하에 액체에서 연결하는 것을 포함하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 액적의 적어도 2개의 액적은 단일 세포를 포함하는 단계; (b) 단일 세포로부터 제1 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하고; 단일 세포로부터 제2 핵산 분자에 하이브리드화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제2 연장 생성물을 형성하는 단계; (c) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트로 증폭시켜 제1 증폭 생성물 세트를 형성하고; 제2 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트로 증폭시켜 제2 증폭 생성물 세트를 형성하는 단계; d) 제2 및 제4 프라이머를 제거하는 단계; 및 (e) 제1 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물을 제2 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물에 연결하는 단계를 포함한다. 복수의 액적 각각은 복수의 중합 가능하거나 겔화 가능한 중합체 및/또는 단량체를 포함할 수 있다. 액체에서 중합체 매트릭스가 생성되어 히드로겔 입자를 형성함으로써 제1 증폭 생성물 세트 및 제2 증폭 생성물 세트의 확산을 제한할 수 있다. 히드로겔 입자는 버퍼에서 세척되어 히드로겔 입자로부터 제2 프라이머와 제4 프라이머를 고갈시킬 수 있다.
다양한 실시양태에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물에 점착 말단을 생성하는 것을 포함한다. USER 효소를 사용하여 증폭 생성물 상에 점착 말단을 생성할 수 있다. 일부 경우에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물을 하이브리드화하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 연결은 제1 및 제2 세트의 증폭 생성물을 연결하는 것을 포함한다. 제1 프라이머와 제3 프라이머는 동일한 프라이머일 수 있다(즉, 동일한 서열을 가짐). 제1 프라이머, 제3 프라이머, 제1 증폭 생성물 세트, 또는 제2 증폭 생성물 세트는 확산 제한제에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 액체에서 수행되는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 a) 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 액적의 적어도 2개의 액적은 단일 세포를 포함하는 단계; (b) 단일 세포로부터 제1 핵산 분자에 하이브리드화되는 제1 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제1 연장 생성물을 형성하고; 단일 세포로부터 제2 핵산 분자에 하이브리드화되는 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 제2 연장 생성물을 형성하는 단계; (c) 중합체 매트릭스를 액체에서 생성하여 히드로겔 입자를 형성함으로써 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물의 확산을 제한하는 단계; (d) 제1 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트로 증폭시켜 제1 증폭 생성물 세트를 형성하고; 제2 연장 생성물 또는 이의 역 상보 가닥을 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트로 증폭시켜 제2 증폭 생성물 세트를 형성하는 단계; 및 (e) 제1 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물을 제2 증폭 생성물 세트의 증폭 생성물에 연결하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 (c) 후에 히드로겔 입자를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 시약이 히드로겔 입자로 확산되도록 시약을 히드로겔 입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시약은 효소 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 시약은 제1 프라이머 세트 및/또는 제2 프라이머 세트일 수 있다. 효소는 폴리머라제, 리가제, USER 효소 또는 이들의 조합일 수 있다. 방법은 세척 후 히드로겔 입자를 오일에 유화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 확산 제한제에 연결될 수 있다. 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 핵산 분자가 mRNA인 경우 RT 프라이머일 수 있다. RT 프라이머는 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드로 추가로 연장될 수 있다. 일부 경우에서, 제2 가닥 합성(SSS) 프라이머를 사용하여 제1 및/또는 제2 연장 생성물의 역 상보 가닥을 합성할 수 있다. SSS 프라이머는 어댑터 서열을 포함할 수 있다. 어댑터 서열은 제1 및/또는 제2 연장 생성물과 하이브리드화 가능하거나 상보적이지 않을 수 있다. SSS 프라이머는 RT 프라이머와 함께 첨가될 수 있거나 중합체 매트릭스로의 확산에 의해 별도로 첨가될 수 있다. 단일 세포는 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포일 수 있다. 제1 핵산 분자와 제2 핵산 분자는 DNA(예컨대, 게놈 DNA) 또는 RNA(예컨대, mRNA)이다.
다양한 실시양태에서, 제1 핵산 분자는 면역수용체의 제1 펩티드 쇄를 코딩할 수 있고, 제2 핵산 분자는 면역수용체의 제2 펩티드 서열을 코딩할 수 있다. 제1 펩티드 쇄와 제2 펩티드 쇄는 면역수용체의 동족 쌍이다. 제1 펩티드 쇄 또는 제2 펩티드 쇄는 부분 또는 전장 가변 도메인을 포함할 수 있다. 가변 도메인은 CDR1, CDR2, CDR3 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 제1 펩티드 쇄 또는 제2 펩티드 쇄는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 펩타이드 쇄 및 제2 펩타이드 쇄는 TCR 쇄이며, 힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포질 테일을 추가로 포함할 수 있다. 제1 펩티드 쇄 및 제2 펩티드 쇄는 기능적 TCR을 형성할 수 있다. 면역수용체는 TCR 또는 BCR일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서 기재되는 바와 같이 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드, 면역수용체 발현 벡터, 또는 숙주 세포(예컨대, 수용자 세포)를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 다양한 적용이 본 개시내용에 제공된다. 예컨대, 방법은 (a) 숙주 세포의 집단을 수득하는 단계로서, 집단의 각각의 숙주 세포는 자연적으로 쌍을 이룬 TCR 알파 및 베타 펩티드 서열을 갖는 TCR 또는 자연적으로 쌍을 이룬 BCR 중쇄 및 경쇄 펩티드 서열을 갖는 BCR을 발현하는 단계; (b) (i) 집단으로부터 숙주 세포의 서브집단, 또는 (ii) 집단으로부터 숙주 세포의 서브집단의 발현된 TCR 또는 BCR을 농축시키는 단계로서, 여기서 숙주 세포의 서브집단 또는 서브집단의 숙주 세포의 발현된 TCR 또는 BCR은 표적 항원 또는 표적 MHC-항원 복합체에 결합하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 농축된 숙주 세포의 서브집단 또는 서브집단의 발현된 TCR 또는 BCR을 표적 항원 또는 표적 MHC-항원 복합체를 발현하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
숙주 세포 집단은 본원에 기재된 방법을 이용하여 수득될 수 있다. T 세포의 서브집단은 숙주 세포 집단 또는 발현된 TCR 또는 BCR을 표적 항원 또는 표적 MHC-항원 복합체와 접촉시킴으로써 농축될 수 있다. MHC는 MHC 사량체일 수 있다. 숙주 세포의 농축된 서브집단 또는 발현된 TCR 또는 BCR은 주사에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 주사는 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내 주사를 포함할 수 있다. 표적 항원은 신생항원 또는 종양 관련된 항원이다. 대상체는 암 또는 자가면역 질환을 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, (1) 복수의 적어도 1,000개의 세포를 제공하는 단계로서, 적어도 1,000개의 세포의 각각의 세포는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 단계; (2) 복수의 적어도 1,000개의 구획을 제공하는 단계로서, 적어도 1,000개의 구획의 각각의 구획은 고체 지지체를 포함하고, 여기서 고체 지지체는 (a) 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 및 제1 공통 서열과 제2 공통 서열 사이의 TCR 알파 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, (b) 제3 공통 서열, 제4 공통 서열, 및 제3 공통 서열과 제4 공통 서열 사이의 TCR 베타 쇄를 코딩하는 단백질 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각각의 구획의 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 복수의 세포 중 적어도 하나에 존재하는 동족 쌍이며, 이에 의해 각각 TCR 알파 쇄를 코딩하는 제1의 복수의 단백질 코딩 서열 및 각각 TCR 베타 쇄를 코딩하는 제2의 복수의 단백질 코딩 서열을 제공하는 단계; 및 (3) 각각의 구획에서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 물리적으로 연결하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 제1의 복수의 단백질 코딩 서열은 적어도 10개의 TRAV 서브그룹을 포함할 수 있고, 제2의 복수의 단백질 코딩 서열은 적어도 10개의 TRBV 서브그룹을 포함할 수 있다. 적어도 1,000개의 구획의 각각의 구획은 복수의 적어도 1,000개의 세포로부터의 세포를 포함할 수 있다. 구획은 웰, 마이크로웰 또는 액적일 수 있다. 고체 지지체는 비드, 히드로겔 입자 또는 웰 또는 마이크로웰의 표면일 수 있다. 제1 공통 서열, 제2 공통 서열, 제3 공통 서열 또는 제4 공통 서열은 복수의 적어도 1,000개의 구획에서 동일한 서열일 수 있다.
치료 요법
본원에는 치료 요법에 사용되는 세포(예컨대, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포)가 개시될 수 있다. 예컨대, 대상체는 암 또는 질환 치료를 위한 치료 요법의 일부로서 세포를 받을 수 있다. 치료 요법은 예컨대 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 면역자극제, 항진균제, 항바이러스제, 항생제 또는 구토제를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 세포 조성물은 골수 이식, 화학요법제, 예컨대 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 캄프쓰를 사용하는 T 세포 절제 요법과 함께(예컨대, 전, 동시 또는 이후) 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 확장된 세포된 수술 전 또는 후에 투여될 수 있다. 수술은 일부 경우에서 종양 적출일 수 있다. TIL 또는 TIT를 단리하기 위해 수술이 수행될 수 있다.
치료학적 유효량의 세포가 투여를 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 약 5x1010개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 경우에서, 약 5x1010개 세포는 대상체에게 투여되는 세포의 중앙값을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 약 5x1010개 세포가 대상체에서 치료 반응을 수행하는 데 필요하다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 1x106개 세포, 적어도 약 2x106개 세포, 적어도 약 3x106개 세포, 적어도 약 4x106개 세포, 적어도 약 5x106개 세포, 적어도 약 6x106개 세포, 적어도 약 6x106개 세포, 적어도 약 8x106개 세포, 적어도 약 9x106개 세포, 1x107개 세포, 적어도 약 2x107개 세포, 적어도 약 3x107개 세포, 적어도 약 4x107개 세포, 적어도 약 5x107개 세포, 적어도 약 6x107개 세포, 적어도 약 6x107개 세포, 적어도 약 8x107개 세포, 적어도 약 9x107개 세포, 적어도 약 1x108개 세포, 적어도 약 2x108개 세포, 적어도 약 3x108개 세포, 적어도 약 4x108개 세포, 적어도 약 5x108개 세포, 적어도 약 6x108개 세포, 적어도 약 6x108개 세포, 적어도 약 8x108개 세포, 적어도 약 9x108개 세포, 적어도 약 1x109개 세포, 적어도 약 2x109개 세포, 적어도 약 3x109개 세포, 적어도 약 4x109개 세포, 적어도 약 5x109개 세포, 적어도 약 6x109개 세포, 적어도 약 6x109개 세포, 적어도 약 8x109개 세포, 적어도 약 9x109개 세포, 적어도 약 1x1010개 세포, 적어도 약 2x1010개 세포, 적어도 약 3x1010개 세포, 적어도 약 4x1010개 세포, 적어도 약 5x1010개 세포, 적어도 약 6x1010개 세포, 적어도 약 6x1010개 세포, 적어도 약 8x1010개 세포, 적어도 약 9x1010개 세포, 적어도 약 1x1011개 세포, 적어도 약 2x1011개 세포, 적어도 약 3x1011개 세포, 적어도 약 4x1011개 세포, 적어도 약 5x1011개 세포, 적어도 약 6x1011개 세포, 적어도 약 6x1011개 세포, 적어도 약 8x1011개 세포, 적어도 약 9x1011개 세포, 또는 적어도 약 1x1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 예컨대, 약 5x1010개 세포가 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 3x106개 세포로 시작하여, 세포는 약 5x1010개 세포로 확장되어 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 세포는 요법에 충분한 수로 확장된다. 예컨대, 5 x107개 세포는 치료 용도로 충분한 수를 생성하기 위해 신속 확장을 겪을 수 있다. 일부 경우에서, 치료 용도로 충분한 수는 5x1010개일 수 있다. 치료 용도로 임의의 수의 세포를 주입할 수 있다. 예컨대, 환자는 1x106 내지 5x1012개의 세포 수로 주입될 수 있다. 세포에 대해 생성될 수 있는 많은 세포가 환자에게 주입될 수 있다. 일부 경우에서, 환자에게 주입되는 세포가 모두 조작되지는 않는다. 예컨대, 환자에게 주입되는 세포의 적어도 90%가 조작될 수 있다. 다른 경우에서, 환자에게 주입되는 세포의 적어도 40%가 조작될 수 있다. 환자에게 치료적으로 효과적이기에 필요한 세포의 양은 세포의 생존력 및 세포가 유전자 변형된 효율에 따라 달라질 수 있다. 일부 경우에서, 유전적 변형 후 세포 생존력의 산물(예컨대, 증식)은 대상체에게 투여하기 위해 사용 가능한 세포의 치료적 분취물에 상응할 수 있다. 일부 경우에서, 유전적 변형 후 세포 생존력의 증가는 투여가 환자에게 치료적으로 효과적이기 위해 필요한 세포의 양의 감소에 상응할 수 있다.
일부 경우에서, 방법은 대상체에서 치료 반응을 수행하는 데 필요한 조작된 세포의 양을 계산 및/또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 반응을 수행하는 데 필요한 조작된 세포의 양을 계산하는 것은 조작된 세포의 생존력을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 치료 반응을 수행하기 위해, 대상체에게 투여되는 세포는 생존 가능한 세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 치료 반응을 수행하기 위해, 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%의 세포가 생존 가능한 세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 치료 반응을 수행하기 위해, 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%의 세포가 면역수용체의 동족 쌍을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 도입되었다.
일부 경우에서, 입양 이식된 세포는 정량적 PCR(qPCR)에 의해 모니터링될 수 있다. 입양 이식된 세포의 qPCR 검정은 도입 후 대상체에 존재하는 변형된 세포의 수준을 나타낼 수 있다. 일부 경우에서, 입양 전달된 세포는 유동 세포측정을 이용하여 모니터링될 수 있다. 예컨대, 유동 세포측정 검정은 4-1BB 대 TCR의 수준을 결정할 수 있다. 일부 경우에서, 단일 세포 TCR PCR이 수행될 수 있다. 입양 전달된 세포의 수준은 주입 후 40일에 확인될 수 있다. 입양 전달된 세포, 예컨대 변형된 세포의 수준은 주입 후 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175,180, 185, 190, 195일, 또는 최대 200일에 확인될 수 있다.
면역자극제
일부 경우에서, 면역자극제는 세포 또는 대상체에 도입될 수 있다. 면역자극제는 특이적이거나 비특이적일 수 있다. 특정 면역자극제는 백신 또는 항원과 같은 항원 특이성을 제공할 수 있다. 비특이적 면역자극제는 면역 반응을 증가시키거나 면역 반응을 자극할 수 있다. 비특이적 면역자극제는 애주번트일 수 있다. 면역자극제는 백신, 콜로니 자극제, 인터페론, 인터류킨, 바이러스, 항원, 보조 자극제, 면역원성 작용제, 면역조정제 또는 면역치료제일 수 있다. 면역자극제는 인터류킨과 같은 시토카인일 수 있다. 하나 이상의 시토카인이 본 개시내용의 세포와 함께 도입될 수 있다. 시토카인은 종양 미세환경 내에서 확장하기 위해 세포독성 T 림프구(입양 전달된 종양 특이적 세포독성 T 림프구를 포함)를 부스팅하는 데 사용할 수 있다. 일부 경우에서, IL-2는 본원에 기재된 세포의 확장을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. IL-15와 같은 시토카인도 사용될 수 있다. IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 면역요법 분야의 다른 관련된 시토카인도 사용될 수 있다. 일부 경우에서, IL-2, IL-7 및 IL-15가 본 개시내용의 세포를 배양하는 데 사용된다. 인터류킨은 IL-2 또는 알데스류킨일 수 있다. 알데스류킨은 저용량 또는 고용량으로 투여될 수 있다. 고용량 알데스류킨 요법은 약 0.037 mg/kg(600,000 IU/kg)에서 최대 약 14회 복용 동안 허용되는 대로 8시간마다 알데스류킨을 정맥내로 투여하는 것을 수반할 수 있다. 면역자극제(예컨대, 알데스류킨)는 세포 투여 후 24시간 이내에 투여될 수 있다. 면역자극제(예컨대, 알데스류킨)는 세포주입 후 최대 약 4일 동안 약 8시간마다 약 15분에 걸쳐 주입으로 투여될 수 있다. 면역자극제(예컨대, 알데스류킨)는 약 100,000 IU/kg부터, 200,000 IU/kg, 300,000 IU/kg, 400,000 IU/kg, 500,000 IU/kg, 600,000 IU/kg, 700,000 IU/kg, 800,000 IU/kg, 900,000 IU/kg, 또는 최대 약 1,000,000 IU/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 알데스류킨은 약 100,000 IU/kg 내지 300,000 IU/kg, 300,000 IU/kg 내지 500,000 IU/kg, 500,000 IU/kg 내지 700,000 IU/kg, 700,000 IU/kg 내지 약 1,000,000 IU/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 면역자극제(예컨대, 알데스류킨)는 1회 내지 약 14회 용량으로 투여될 수 있다. 면역자극제(예컨대, 알데스류킨)는 적어도 약 1회 용량부터, 2회 용량, 3회 용량, 4회 용량, 5회 용량, 6회 용량, 7회 용량, 8회 용량, 9회 용량, 10회 용량, 11회 용량, 12회 용량, 13회 용량, 14회 용량, 15회 용량, 16회 용량, 17회 용량, 18회 용량, 19회 용량, 또는 최대 약 20회 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 알데스류킨과 같은 면역자극제는 약 1회 용량 내지 3회 용량, 3회 용량 내지 5회 용량, 5회 용량 내지 8회 용량, 8회 용량 내지 10회 용량, 10회 용량 내지 14회 용량, 14회 용량 내지 20회 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 알데스류킨은 20회 용량 초과로 투여된다. 일부 경우에서, 알데스류킨과 같은 면역자극제는 순차적으로 또는 세포 투여와 동시에 투여될 수 있다. 예컨대, 면역자극제는 약 -14일부터, -13, -12, -11, -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2 ,-1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13일, 또는 최대 약 14일에 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 알데스류킨과 같은 면역자극제는 세포 집단의 투여 후 0일에서 4일까지 투여된다. 일부 경우에서, 면역자극제(예컨대, 알데스류킨)는 약 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간 또는 최대 약 3시간의 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 경우에서, 면역자극제(예컨대, 알데스류킨)는 조작된 세포의 투여 전 약 24시간부터 조작된 세포의 투여 후 약 4일까지 투여될 수 있다. 면역자극제(예컨대, 알데스류킨)는 조작된 세포의 투여 후 -7일부터, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19일, 또는 최대 약 20일에 투여될 수 있다.
알데스류킨과 같은 면역자극제는, 약 0.17 mg 일염기성 및 0.89 mg 이염기성 인산나트륨으로 pH 7.5(7.2 내지 7.8 범위)로 완충된, 멸균된 회색-흰색의 동결건조 케이크로서의 22,000,000 IU(-1.3 mg) IL-2 및 50 mg 만니톨 및 0.18 mg 나트륨 도데실 술페이트를 함유하는 단일-사용 바이알로 제공될 수 있다. 바이알은 1.2 mL의 주사용 멸균수, USP로 재구성될 수 있으며, 생성된 농도는 18,000,000 IU/ml 또는 1.1 mg/mL이다. 과도한 거품이 발생하지 않도록 희석액은 바이알 측면으로 향하게 해야 한다. 바이알은 방부제를 함유하지 않으므로, 재구성된 용액은 24시간에 사용되어야 한다. 재구성된 알데스류킨은 50 mL의 5% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 추가로 희석될 수 있다. HSA는 RIL-2를 첨가하기 전에 희석제에 첨가될 수 있다. 1000배 범위(즉, 1 mg/mL 내지 1 mcg/ml)에 걸쳐 재구성된 용액의 희석액은 유리병 또는 폴리비닐 클로라이드 백에 수용 가능할 수 있다. 알데스류킨은 냉장 및 실온, 2 내지 30℃에서 48시간 동안 화학적으로 안정할 수 있다. 알데스류킨의 투여는 총 체중을 기준으로 하여 계산될 수 있다. 알데스류킨의 최종 희석액은 15분에 걸쳐 주입될 수 있다.
일부 경우에서, 면역자극제는 콜로니 자극 인자이다. 콜로니 자극 인자는 G-CSF(필그라스팀)일 수 있다. 필그라스팀은 300 mcg/ml 및 480 ug/1.6ml 바이알에 저장될 수 있다. 필그라스팀은 매일 피하 주사로 투여될 수 있다. 필그라스팀 투여는 약 5 mcg/kg/일일 수 있다. 필그라스팀틴 투여는 약 1 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀틴 투여는 약 2 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀틴 투여는 약 3 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀틴 투여는 약 4 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀 투여는 약 5 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀 투여는 약 6 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀 투여는 약 7 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀 투여는 약 8 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀틴 투여는 약 9 mcg/kg/일일 수 있고, 필그라스팀틴 투여는 약 10 mcg/kg/일일 수 있다. 일부 경우에서, 필그라스팀은 약 0.5 mcg/kg/일 내지 약 1.0 mcg/kg/일, 약 1.0 mcg/kg/일 내지 1.5 mcg/kg/일, 약 1.5 mcg/kg/일 내지 약 2.0 mcg/kg/일, 약 2.0 mcg/kg/일 내지 약 3.0 mcg/kg/일, 약 2.5 mcg/kg/일 내지 약 3.5 mcg/kg/일, 약 3.5 mcg/kg/일 내지 약 4.0 mcg/kg/일, 약 4.0 mcg/kg/일 내지 약 4.5 mcg/kg/일의 투여 범위로 투여될 수 있다. 필그라스팀 투여는 호중구 수가 적어도 약 1.0 x109/L X 3일 또는 적어도 약 5.0 x109/L일 때까지 매일 계속할 수 있다. 필그라스팀과 같은 면역자극제는 조작된 세포의 투여 후 -7일부터, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19일, 또는 최대 약 20일에 투여될 수 있다.
화학요법제
화학요법제 또는 화합물은 암 치료에 유용한 화합물일 수 있다. 개시된 T 세포와 조합하여 사용될 수 있는 화학요법 항암제는 유사분열 억제제(빈카 알칼로이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들은 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 NavelbineTM(비노렐빈, 5'-노르안드로블라스틴)을 포함한다. 또 다른 경우에서, 화학요법 항암제는 캄프토테신 화합물과 같은 토포이소머라제 I 억제제를 포함한다. 본원에 사용된 "캄토테신 화합물"은 Camptosar™(이리노테칸 HCL), Hycamtin™(토포테칸 HCL) 및 캄프토테신 및 이의 유사체로부터 유도된 다른 화합물을 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 화학요법 항암제의 또 다른 카테고리는 에토포시드, 테니포사이드 및 미토포도지드와 같은 포도필로톡신 유도체이다. 본 개시내용은 종양 세포에서 유전 물질을 알킬화하는 알킬화제로 공지된 다른 화학요법 항암제를 추가로 포함한다. 이들은 제한 없이 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카르무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카르바진을 포함한다. 본 개시내용은 화학요법제로서 항대사물질을 포함한다. 이들 타입의 작용제의 예는 시토신 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 아자티오프라임 및 프로카르바진을 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 화학요법 항암제의 추가의 카테고리는 항생제를 포함한다. 예는 제한 없이 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 마이토마이신 C 및 다우노마이신을 포함한다. 이들 화합물에 대해 상업적으로 입수 가능한 많은 리포좀 제형이 있다. 본 개시내용은 제한 없이 항종양 항체, 다카르바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, 이포스파미드 및 미톡산트론을 포함하는 다른 화학요법 항암제를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포는 세포독성/항신생물제 및 항혈관형성제를 포함하는 다른 항종양제와 조합하여 투여될 수 있다. 세포독성/항신생물제는 암세포를 공격하고 사멸시키는 작용제로 정의될 수 있다. 일부 세포독성/항-신신생물는 종양 세포에서 유전 물질을 알킬화시키는 알킬화제, 예컨대 시스-플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리 메틸렌 티오포스포라미드, 카무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진 및 다카바진일 수 있다. 다른 세포독성/항신생물제는 종양 세포에 대한 항대사물질, 예컨대 시토신 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 아자티오프림 및 프로카르바진일 수 있다. 다른 세포독성/항신생물제는 항생제, 예컨대 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 마이토마이신 C 및 다우노마이신일 수 있다. 이들 화합물에 대해 상업적으로 입수 가능한 많은 리포좀 제형이 있다. 또 다른 세포독성/항신생물제는 유사분열 억제제(빈카 알칼로이드)일 수 있다. 이들은 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 에토포시드를 포함한다. 다른 세포독성/항신생물제는 탁솔 및 이의 유도체, L-아스파라기나제, 항종양 항체, 다카르바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, VM-26, 이포스파미드, 미톡산트론 및 빈데신을 포함한다.
항혈관형성제가 또한 사용될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 항혈관형성제는 인간화 및 키메라 항체, 항-VEGF 압타머 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항-VEGF 항체를 포함한다. 혈관형성의 다른 억제제는 안기오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 인터류킨 1(α 및 β 포함) 인터류킨 12, 레티노산, 및 메탈로프로테이나제-1 및-2의 조직 억제제(TIMP-1 및-2)를 포함한다. 토포이소머라제, 예컨대 라족산, 항혈관형성 활성을 갖는 토포이소머라제 II 억제제를 포함하는 소분자도 사용될 수 있다.
개시된 조작된 세포와 조합하여 사용될 수 있는 다른 항암제는 아시비신, 아클라루비신, 아코다졸 히드로클로라이드, 아크로닌, 아도젤레신; 알데슬류킨, 알트레타민, 앰보마이신, 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페린; 아바스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비산트렌 히드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 술페이트; 브레퀴나 나트륨; 브로피리민; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론, 카라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 히드로클로라이드; 카르젤레신; 세데핀골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 히드로클로라이드; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 히드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 히드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 히드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 히드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 인산나트륨; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 히드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티나 이드; 플록수리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 나트륨; 젬시타빈; 젬시타빈 히드로클로라이드; 히드록시우레아; 이다루비신 히드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 인터류킨 II(재조합 인터류킨 II, 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-1 a; 인터페론 감마-1 b; 이프로플라틴; 이리노테칸 히드로클로라이드; 란레오타이드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 히드로클로라이드; 로메트렉솔 나트륨; 로무스틴; 로속산트론 히드로클로라이드; 마소프로콜; 메이탄신; 메클로레타민 히드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메토프린; 메투레데파; 미틴도마이드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 히드로클로라이드; 미코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 술페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포술판; 피록산트론 히드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니무 스틴; 프로카르바진 히드로클로라이드; 퓨로마이신; 퓨로마이신 히드로클로라이드; 피라조푸린; 리보프린; 로글레티미드; 사핀골; 사핀골 히드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 나트륨; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 히드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트립토조신; 술로페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔록산트론 히드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포사이드; 테록시론; 테스톨락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 히드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오타이드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴 술페이트; 빈데; 빈데신 술페이트; 비네피딘 술페이트; 빈글리시네이트 술페이트; 빈류로신 술페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 술페이트; 빈졸리딘 술페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 히드로클로라이드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 항암 약물은 20-에피-1,25 디히드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데슬류킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미놀레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐라이드; 아나스트로졸; 안드로그라폴라이드; 혈관형성 억제제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항등쪽화 형태형성 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 안티네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전자 조정제; 아폽토시스 조절제; 아퓨린산; ara-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 데아미나제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트 론; 아자톡신; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 억제제; 비칼루타마이드; 비산트렌; 비스아지리디닐스페르민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 술폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복사미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래된 억제제; 카르젤레신; 카제인 키나제 억제제(ICOS); 카스타노스페르민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로린; 클로로퀴녹살린 술폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 사이클로펜탄트라퀴논; 사이클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 세포용해 인자; 시토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 데히드로디데민 B; 데슬로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스페르민; 디히드로-5-아자시티 딘; 디히드로탁솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테라이드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 효능제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티나 이드; 필그라스팀; 피나스테라이드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 히드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 질산갈륨; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나제 억제제; 젬시타빈; 글루타티온 억제제; 헵술팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비사세타미드; 히페리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극 펩티드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 효능제; 인터페론; 인터류킨; 이오벤구안; 요오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키놀라이드; 카할랄라이드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오 타이드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 술페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤라이드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친유성 이당류 펩티드; 친유성 백금 화합물; 리소클린아미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테튬 텍사피린; 리소필린; 용해 펩티드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴리신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메텔린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 불일치 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미톨락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유모세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 모노클로날 항체, 인간 융모막 고나도트로핀; 모노포스포릴 지질 A+미오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다중 약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제인자 1 기반 요법; 머스타드 항암제; 미카페록사이드 B; 미코박테리아 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤자미드; 나파렐린; 나그레스티프; 나록손+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 질소산화물 조정제; 니트록사이드 항산화제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레오타이드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 구강 시토카인 유도제; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 아암라우아민; 아암미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리술페이트 나트륨; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 퍼릴릴 알콜; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 히드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라스틴 A; 플라스틴 B; 플라스미노겐 활성인자 억제제; 백금 착물; 백금 화합물; 백금-트리아민 착물; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아좀 억제제; 단백질 A 기반 면역 조정제; 단백질 키나제 C 억제제; 단백질 키나제 C 억제제, 미세조류; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화된 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 접합체; raf 길항제; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 탈메틸화된 레텔립틴; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 로글티미드; 로히투킨; 로무르타이드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 모방체; 세무스틴; 노화 유도된 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 전달 억제제; 신호 전달 조정제; 단일 쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 나트륨 보로캅테이트; 나트륨 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기 세포 억제제; 줄기-세포 분열 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 술피노신; 초활성 혈관작용성 장 펩티드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스웨인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라아제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포사이드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모방체; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 효능제; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 비클로라이드; 토프센틴; 토레미펜; 전능성 줄기 세포 인자; 해독 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테라이드; 티로신 키나제 억제제; 티르포스틴; UBC 억제제; 우베니멕스; 비뇨생식동-유래된 성장 억제 인자; 우로키나제 수용체 길항제; 바프레오타이드; 바리올린 B; 적혈구 유전자 요법; 벨라레졸; 베라민; 베르딘; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈크살틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 및 지노스타틴 스티말라머를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 임의의 상술된 화학요법제는 임상적 유효량으로 투여될 수 있다. 화학요법제는 또한 세포 집단의 투여 후 약 -14일부터, -13, -12, -11, -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13일, 또는 최대 약 14일에 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 화학요법제에 반응하지 않는 불응성 암을 가질 수 있다.
항진균제
일부 경우에서, 항진균 요법은 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포를 받는 대상체에게 투여된다. 항진균제는 진균을 사멸시키거나 성장을 방지할 수 있는 약물일 수 있다. 항진균제의 표적은 스테롤 생합성, DNA 생합성 및 β-글루칸 생합성을 포함할 수 있다. 항진균제는 또한 폴레이트 합성 억제제 또는 핵산 가교제일 수도 있다. 폴레이트 합성 억제제는 술파 기반 약물일 수 있다. 예컨대, 폴레이트 합성 억제제는 폴레이트의 진균 합성을 억제하는 작용제 또는 경쟁적 억제제일 수 있다. 술파 기반 약물 또는 폴레이트 합성 억제제는 메토트렉세이트 또는 술파메탁사졸일 수 있다. 일부 경우에서, 항진균제는 핵산 가교제일 수 있다. 가교제는 진균에서 DNA 또는 RNA 과정을 억제할 수 있다. 예컨대, 가교제는 5-플루오르시토신일 수 있으며, 이는 시토신의 불소화된 유사체일 수 있다. 5-플루오르시토신은 5-플루오로우라실로의 세포질내 전환을 통해 DNA와 RNA 합성을 모두 억제할 수 있다. 다른 항진균제는 그리세오풀빈일 수 있다. 그리세오풀빈은 페니실리움 그리세오풀붐(Penicillium griseofulvum)에서 생성되는 항진균성 항생제이다. 그리세오풀빈은 진균에서 유사분열을 억제하며 가교제로 간주될 수 있다. 추가의 가교제는 알릴아민(나프티핀 및 테르비나핀)이 스쿠알렌 에폭시다제의 수준에서 에르고스테롤 합성을 억제할 수 있으며; 하나의 모르폴렌 유도체(아모롤핀)는 에르고스테롤 경로의 후속 단계에서 억제한다.
일부 경우에서, 항진균제는 폴리엔, 아졸, 알릴아민, 또는 에키노칸딘 부류로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리엔 항진균제는 암포테리신 B, 칸디시딘, 필리핀, 하미신, 나타마이신, 니스타틴 또는 리모시딘이다. 일부 경우에서, 항진균제가 아졸 계열로부터의 것일 수 있다. 아졸 항진균제는 라노스테롤 14 α-데메틸라제를 억제할 수 있다. 아졸 항진균제는 이미다졸, 예컨대 비포나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 펜티코나졸, 이소코나졸, 케토코나졸, 룰리코나졸, 미코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸, 술코아졸, 또는 티오코나졸일 수 있다. 아졸 항진균제는 트리아졸, 예컨대 알바코나졸, 에피나코나졸, 에폭시코나졸, 플루코나졸, 이사부보나졸, 이트라코나졸, 포사코나졸, 프로피코나졸, 라부코나졸, 테르코나졸, 또는 보리코나졸일 수 있다. 일부 경우에서, 아졸은 티아졸, 예컨대 아바펑진일 수 있다. 항진균제는 알릴아민, 예컨대 아모롤핀, 부테나핀, 나프티핀, 또는 테르비나핀일 수 있다. 항진균제는 또한 에키노칸딘, 예컨대 아니둘라푼긴, 카스포푼긴 또는 미카푼긴일 수 있다. 항진균제일 수 있는 추가의 작용제는 오론, 벤조산, 사이클로피록스, 플루시토신, 그리세오풀빈, 할로프로진, 톨나프테이트, 운데실렌산, 크리스탈 바이올렛 또는 페루시안 발삼일 수 있다.
당업자는 개체를 감염시키는 진균을 기반으로 하여 적용할 공지된 항진균 약물을 적절하게 결정할 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 조작된 세포와 함께 플루코나졸을 투여받을 수 있다. 항진균 요법은 예방적으로 투여될 수 있다.
플루코나졸은 200 mg 정제로 사용 가능할 수 있다. 일부 경우에서, 플루코나졸은 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg 또는 최대 약 400 mg 정제로 투여될 수 있다. 경구 제제를 견딜 수 없는 대상체에게 IV 투여를 위해, 플루코나졸은 주사용 2 MG/ML 용액으로 제공된다. 이는 200 mg/hr의 최대 IV 속로 투여되어야 한다. 일부 경우에서, 주입 속도는 약 50 mg/hr 내지 약 500 mg/hr일 수 있다. 주입 속도는 또한 약 20 mg/hr 내지 약 30 mg/hr, 약 30 mg/hr 내지 약 40 mg/hr, 약 40 mg/hr 내지 약 50 mg/hr, 약 50 mg/hr 내지 약 60 mg/hr, 약 60 mg/hr 내지 약 70 mg/hr, 약 70 mg/hr 내지 약 80 mg/hr, 약 80 mg/hr 내지 약 90 mg/hr, 약 90 mg/hr 내지 약 100 mg/hr, 약 100 mg/hr 내지 약 120 mg/hr, 약 120 mg/hr 내지 약 140 mg/hr, 약 140 mg/hr 내지 약 160 mg/hr, 약 160 mg/hr 내지 약 180 mg/hr, 약 180 mg/hr 내지 약 200 mg/hr, 약 180 mg/hr 내지 약 220 mg/hr, 약 220 mg/hr 내지 약 240 mg/hr, 또는 약 240 mg/hr 내지 약 275 mg/hr일 수 있다.
항진균제는 치료학적 유효 용량으로 투여될 수 있다. 치료학적 유효 용량은 진균 감염을 치료하거나 예방하지만 암 치료에는 효과적이지 않은 용량이다. 예컨대, 플루코나졸과 같은 항진균제는 약 10 mg 내지 약 1000 mg으로 투여될 수 있다. 플루코나졸은 약 10 mg부터, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg, 625 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 725 mg, 750 mg, 775 mg, 800 mg, 825 mg, 850 mg, 875 mg, 900 mg, 925 mg, 950 mg, 975 mg, 또는 최대 약 1000 mg으로 투여될 수 있다. 플루코나졸은 400 mg으로 투여할 수 있다. 일부 경우에서, 항진균제 투여는 세포 요법 전, 세포 요법 동안 또는 세포 요법이 투여된 후일 수 있다. 예컨대, 플루코나졸 투여는 약 0일(대상체에게 세포 요법이 도입된 날)부터 세포 요법의 투여 후 약 4일까지일 수 있다. 항진균제는 세포 요법 투여에 이르기까지 약 14일부터 세포 요법이 완료된 후 약 14일까지 투여될 수 있다. 항진균제는 약 -14일부터, -13, -12, -11, -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13일, 또는 약 14일에 투여될 수 있다.
면역억제제
일부 경우에서, 대상체는 치료 요법의 일부로서 면역억제제를 받을 수 있다. 면역억제제는 방사선요법제, 생물학적 제제, 또는 화학 작용제를 지칭할 수 있다. 일부 경우에서, 면역억제제는 화학 작용제를 포함할 수 있다. 예컨대, 화학 작용제는 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 이포스파미드, 티오테파, 헥사메틸멜라민, 부술판, 플루다라빈, 니트로소우레아, 백금, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 프로카르바진, 다카르바진, 테모졸로미드, 카르무스틴, 로무스틴, 스트립토조신, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 및 미트라마이신을 포함할 수 있다. 화학 작용제는 사이클로포스파미드 또는 플루다라빈으로 이루어진 군으로부터의 적어도 하나의 구성원일 수 있다.
또한, 면역억제제는 글루코코르티코이드, 세포증식억제제, 항체, 항-이뮤노필린 또는 이의 임의의 유도체를 포함할 수 있다. 글루코코르티코이드는 알러지 반응, 염증 및 자가면역 병태를 억제할 수 있다. 글루코코르티코이드는 프레드니손, 덱사메타손 및 히드로코르티손일 수 있다. 면역억제 요법은 면역계를 억제하는 임의의 치료를 포함할 수 있다. 면역억제 요법은 수용자에서 이식 거부를 완화, 최소화 또는 제거하는 데 도움이 될 수 있다. 예컨대, 면역억제 요법은 면역 억제 약물을 포함할 수 있다. 이식 전, 동안 및/또는 후에 사용될 수 있는 면역억제 약물은 MMF(미코페놀레이트 모페틸(셀셉트)), ATG(항-흉선세포 글로불린), 항-CD154(CD4OL), 항-CD40(2C10, ASKP1240, CCFZ533X2201), 알렘투주맙(캄프쓰), 항-CD20(리툭시맙), 항-IL-6R 항체(토실리주맙, 악템라), 항-IL-6 항체(사릴루맙, 올로키주맙), CTLA4-Ig(아바타셉트/오렌시아), 벨라타셉트(LEA29Y), 시롤리무스(라피문), 에베롤리무스, 타크롤리무스(프로그라프), 다클리주맙(제-나팍스), 바실릭시맙(시물렉트), 인플릭시맙(레미케이드), 사이클로스포린, 데옥시스페르구알린, 가용성 보체 수용체 1, 코브라 독 인자, 콤프스타틴, 항 C5 항체(에쿨리주맙/솔리리스), 메틸프레드니솔론, FTY720, 에베롤리무스, 레플루노미드, 항-IL-2R-Ab, 라파마이신, 항-CXCR3 항체, 항-ICOS 항체, 항-OX40 항체, 및 항-CD122 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 하나 이상의 면역억제제/약물은 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 유도 요법 또는 유지 요법을 위해 하나 이상의 면역억제제/약물이 사용될 수 있다. 유도 및 유지 단계 동안 동일하거나 상이한 약물이 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 다클리주맙(제나팍스)은 유도 요법에 사용될 수 있고 타크롤리무스(프로그라프) 및 시롤리무스(라피문)는 유지 요법에 사용될 수 있다. 다클리주맙(제나팍스)은 유도 요법에 사용될 수 있고 저용량 타크롤리무스(프로그라프) 및 저용량 시롤리무스(라피문)는 유지 요법에 사용될 수 있다. 면역억제는 또한 신체 방사선조사, 흉선 방사선조사, 및 전체 및/또는 부분 비장절제술를 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-약물 요법을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 경우에서, 세포증식억제제는 면역억제를 위해 투여될 수 있다. 세포증식억제제는 세포 분열을 억제할 수 있다. 세포증식억제제는 퓨린 유사체일 수 있다. 세포증식억제제는 알킬화제, 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 아자티오프린, 또는 메르캅토퓨린일 수 있다. 세포증식억제제는 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 이포스파미드, 티오테파, 헥사메틸멜라민, 부술판, 플루다라빈, 니트로소우레아, 백금, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 프로카르바진, 다카르바진, 테모졸로미드, 카르무스틴, 로무스틴, 스트립토조신, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 및 미트라마이신 중 적어도 하나일 수 있다.
일부 경우에서, 플루다라빈과 같은 면역억제제는 치료 요법의 일부로 투여될 수 있다. 플루다라빈 포스페이트는 슈가 모이어티가 리보스 또는 데옥시리보스 대신 아라비노스일 수 있다는 점에서 생리학적 뉴클레오사이드와 상이한 합성 퓨린 뉴클레오사이드일 수 있다. 플루다라빈은 퓨린 길항제 항대사물질일 수 있다. 플루다라빈은 흰색의 동결건조된 고체 케이크 형태의 플루다라빈 포스페이트 분말로 50 mg 바이알에 공급될 수 있다. 25 mg/ml의 농도로 주사용 멸균수 2 mL로 재구성한 후, 용액의 pH는 7.7이 될 수 있다. 플루다라빈 분말은 2-8℃에서 적어도 18개월 동안 안정할 수 있으며; 재구성되면 플루다라빈은 실온에서 적어도 16일 동안 안정적이다. 보존제가 없기 때문에, 재구성된 플루다라빈은 8시간 이내에 투여될 수 있다. 구체적인 적합성 정보는 특화된 참조문을 참조해야 한다. 플루다라빈은 혈청에서 탈인산화될 수 있고, 세포내로 운반되어 뉴클레오티드 플루다라빈 트리포스페이트로 전환될 수 있고; 이 2-플루오로-ara-ATP 분자는 약물의 세포독성 효과에 필요한 것으로 생각된다. 플루다라빈은 DNA 폴리머라제, 리보뉴클레오티드 리덕타제, DNA 프리마제를 억제하고, 쇄 연장, RNA 및 단백질 합성을 방해할 수 있다. 플루다라빈은 100 ml 0.9% 염화나트륨, USP를 15 내지 30분에 걸쳐 IV 주입으로 투여될 수 있다. 용량은 신체 표면적(BSA)을 기준으로 할 수 있다. 환자가 비만인 경우(BMI> 35), 약물 용량은 실제 체중을 사용하여 계산될 수 있다. 일부 경우에서, 플루다라빈과 같은 면역억제제는 대상체의 신체 표면적의 약 20 mg/m2 내지 약 30 mg/m2으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 플루다라빈과 같은 면역억제제는 대상체의 신체 표면적의 약 5 mg/m2 내지 약 10 mg/m2, 대상체의 신체 표면적의 약 10 mg/m2 내지 약 15 mg/m2, 대상체의 신체 표면적의 약 15 mg/m2 내지 약 20 mg/m2, 대상체의 신체 표면적의 약 20 mg/m2 내지 약 25 mg/m2, 대상체의 신체 표면적의 약 25 mg/m2 내지 약 30 mg/m2, 대상체의 신체 표면적의 약 30 mg/m2 내지 약 40 mg/m2으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 플루다라빈과 같은 면역억제제는 대상체의 신체 표면적의 약 1 mg/m2부터, 2 mg/m2, 3 mg/m2, 4 mg/m2, 5 mg/m2, 6 mg/m2, 7 mg/m2, 8 mg/m2, 9 mg/m2, 10 mg/m2, 11 mg/m2, 12 mg/m2, 13 mg/m2, 14 mg/m2, 15 mg/m2, 16 mg/m2, 17 mg/m2, 18 mg/m2, 19 mg/m2, 20 mg/m2, 21 mg/m2, 22 mg/m2, 23 mg/m2, 24 mg/m2, 25 mg/m2, 26 mg/m2, 27 mg/m2, 28 mg/m2, 29 mg/m2, 30 mg/m2, 31 mg/m2, 32 mg/m2, 33 mg/m2, 34 mg/m2, 35 mg/m2, 36 mg/m2, 37 mg/m2, 38 mg/m2, 39 mg/m2, 40 mg/m2, 41 mg/m2, 42 mg/m2, 43 mg/m2, 44 mg/m2, 45 mg/m2, 46 mg/m2, 47 mg/m2, 48 mg/m2, 49 mg/m2, 50 mg/m2, 51 mg/m2, 52 mg/m2, 53 mg/m2, 54 mg/m2, 55 mg/m2, 56 mg/m2, 57 mg/m2, 58 mg/m2, 59 mg/m2, 60 mg/m2, 61 mg/m2, 62 mg/m2, 63 mg/m2, 64 mg/m2, 65 mg/m2, 66 mg/m2, 67 mg/m2, 68 mg/m2, 69 mg/m2, 70 mg/m2, 71 mg/m2, 72 mg/m2, 73 mg/m2, 74 mg/m2, 75 mg/m2, 76 mg/m2, 77 mg/m2, 78 mg/m2, 79 mg/m2, 80 mg/m2, 81 mg/m2, 82 mg/m2, 83 mg/m2, 84 mg/m2, 85 mg/m2, 86 mg/m2, 87 mg/m2, 88 mg/m2, 89 mg/m2, 90 mg/m2, 91 mg/m2, 92 mg/m2, 93 mg/m2, 94 mg/m2, 95 mg/m2, 96 mg/m2, 97 mg/m2, 98 mg/m2, 99 mg/m2, 최대 약 100 mg/m2으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 플루다라빈과 같은 면역억제제는 100 ml 0.9% 염화나트륨, USP에서 25 mg/m2의 용량으로 약 15분에서 약 30분에 걸쳐 주입된다.
일부 경우에서, 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제는 치료 요법의 일부로 투여될 수 있다. 사이클로포스파미드는 질소 머스타드 유도체 알킬화제일 수 있다. 사이클로포스파미드는 간에서 활성 대사산물로 전환된 후 알킬화제로 기능하며; 약물은 또한 강력한 면역억제 활성을 갖는다. IV 투여 후 혈청 반감기는 3-12시간의 범위이고; 약물 및/또는 이의 대사산물은 투여 후 최대 72시간 동안 혈청에서 검출될 수 있다. 사이클로포스파미드는 주사용 멸균수로 지시되는 바와 같이 재구성한 후 실온에서 24시간 동안 또는 2-8℃에서 보관할 때 6일 동안 안정할 수 있다. 사이클로포스파미드는 250 ml D5W에 희석되여 1시간에 걸쳐 주입될 수 있다. 용량은 대상체의 체중을 기준으로 할 수 있다. 대상체가 비만인 경우(BMI> 35) 약물 용량은 기재된 바와 같이 실제 체중을 사용하여 계산될 수 있다. 일부 경우에서, 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제는 약 1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 20 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 30 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 40 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 50 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 60 mg/kg 내지 약 70 mg/kg, 약 70 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 80 mg/kg 내지 약 90 mg/kg, 약 90 mg/kg 내지 약 100 mg/kg로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제는 대상체의 50 mg/kg의 과량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제는 대상체의 약 1 mg/kg부터, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg, 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 61 mg/kg, 62 mg/kg, 63 mg/kg, 64 mg/kg, 65 mg/kg, 66 mg/kg, 67 mg/kg, 68 mg/kg, 69 mg/kg, 70 mg/kg, 71 mg/kg, 72 mg/kg, 73 mg/kg, 74 mg/kg, 75 mg/kg, 76 mg/kg, 77 mg/kg, 78 mg/kg, 79 mg/kg, 80 mg/kg, 81 mg/kg, 82 mg/kg, 83 mg/kg, 84 mg/kg, 85 mg/kg, 86 mg/kg, 87 mg/kg, 88 mg/kg, 89 mg/kg, 90 mg/kg, 91 mg/kg, 92 mg/kg, 93 mg/kg, 94 mg/kg, 95 mg/kg, 96 mg/kg, 97 mg/kg, 98 mg/kg, 99 mg/kg, 최대 약 100 mg/kg으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제는 적어도 약 1일 내지 약 3일, 3일 내지 5일, 5일 내지 7일, 7일 내지 약 10일, 10일 내지 14일, 14일 내지 약 20일에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 사이클로포스파미드는 약 60 mg/kg의 용량일 수 있고 물 중의 250 ml 5% 덱스트로스에 희석되고 1시간에 걸쳐 주입된다.
면역억제제는, 예컨대 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 요법일 수 있다. 예컨대, 사이클로포스파미드 플루다라빈 요법은 조작된 세포 요법을 받는 대상체에게 투여될 수 있다. 사이클로포스파미드 플루다라빈 요법은 2일 동안 60 mg/kg qd 및 5일 동안 25 mg/m2 qd의 요법으로 투여될 수 있다. 화학요법 요법, 예컨대 사이클로포스파미드 플루다라빈은 본 개시내용의 조작된 세포의 투여 1시간 내지 14일 전에 투여될 수 있다. 화학요법은 상이한 용량으로 투여될 수 있다. 예컨대, 대상체는 더 높은 초기 용량에 이어 더 낮은 용량을 받을 수 있다. 대상체는 더 낮은 초기 용량에 이어 더 높은 용량을 받을 수 있다.
일부 경우에서, 면역억제제가 항체일 수 있다. 항체는 치료학적 유효 용량으로 투여될 수 있다. 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 투여될 수 있는 폴리클로날 항체는 항림프구 또는 항흉선세포 항원일 수 있다. 모노클로날 항체는 항-IL-2 수용체 항체, 항-CD25 항체 또는 항-CD3 항체일 수 있다. 항-CD20 항체도 사용될 수 있다. CD20과 반응하는 작용제, 예컨대 리툭산과 같은 B 세포 절제 요법도 면역억제제로 사용될 수 있다.
면역억제제는 또한 항-이뮤노필린일 수 있다. 항-이뮤노필린은 시클로스포린, 타크롤리무스, 에베롤리무스, 또는 시롤리무스일 수 있다. 추가의 면역억제제는 인터페론, 예컨대 IFN-베타, 오피오드, 항-TNF 결합제, 미코페놀레이트 또는 핀골리모드일 수 있다.
면역억제제는 또한 방사선치료제를 지칭할 수 있다. 방사선요법은 방사선을 포함할 수 있다. 전신 방사선은 12 Gy로 투여될 수 있다. 방사선량은 건강한 조직을 포함한 전신에 대한 12 Gy의 누적 선량을 포함할 수 있다. 방사선량은 5 Gy 내지 20 Gy를 포함할 수 있다. 방사선량은 5 Gy, 6 Gy, 7 Gy, 8 Gy, 9 Gy, 10 Gy, 11 Gy, 12, Gy, 13 Gy, 14 Gy, 15 Gy, 16 Gy, 17 Gy, 18 Gy, 19 Gy, 또는 최대 20 Gy일 수 있다. 방사선은 전신 방사선 또는 부분 신체 방사선일 수 있다. 방사선이 전신 방사선인 경우, 균일하거나 균일하지 않을 수 있다. 예컨대, 방사선이 균일하지 않을 경우, 목과 같은 신체의 좁은 영역은 엉덩이와 같은 넓은 영역보다 높은 선량을 받을 수 있다. 예컨대, 한 실시양태에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식으로 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 이식 후, 대상체는 본 개시내용의 확장된 세포(예컨대, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포)의 주입을 받는다. 환자에게 투여되는 상기 치료의 용량은 치료되는 병태의 정확한 특성 및 치료의 수용자에 따라 달라질 수 있다. 인간 투여를 위한 용량의 스케일링은 당업계에서 인정하는 관행에 따라 수행될 수 있다. 예컨대, 캄프쓰에 대한 용량은 성인 환자의 경우 1 내지 약 100 mg 범위일 수 있으며, 일반적으로 1일 내지 30일의 기간 동안 매일 투여된다. 1일 용량은 1일 1 내지 10 mg일 수 있지만, 일부 경우에는 1일 최대 40 mg의 더 큰 용량이 사용될 수 있다(미국 특허 번호 6,120,766에 기재됨).
항생제
항생제는 치료 요법의 일부로 대상체에게 투여될 수 있다. 항생제는 치료학적 유효 용량으로 투여될 수 있다. 항생제는 박테리아를 사멸시키거나 성장을 억제할 수 있다. 항생제는 광범위한 박테리아를 표적으로 할 수 있는 광범위한 스펙트럼 항생제일 수 있다. 3세대 또는 4세대의 광범위한 스펙트럼 항생제는 세팔로스포린 또는 퀴놀론일 수 있다.
항생제는 또한 특정 타입의 박테리아를 표적으로 할 수 있는 좁은 스펙트럼의 항생제일 수 있다. 항생제는 페니실린 및 세팔로스포린과 같이 박테리아 세포벽을 표적으로 할 수 있다. 항생제는 폴리믹신과 같이 세포막을 표적으로 할 수 있다. 항생제는 항생제: 리파마이신, 리피아르마이신, 퀴놀론 및 술폰아미드와 같이 필수 박테리아 효소를 방해할 수 있다. 항생제는 또한 마크롤라이드, 린코사미드 및 테트라사이클린와 같은 단백질 합성 억제제일 수 있다. 항생제는 또한 답토마이신과 같은 사이클릭 리포펩티드, 티게사이클린과 같은 글리실사이클린, 리네졸리드와 같은 옥사졸리디온 및 피닥소마이신과 같은 리피아르마이신일 수 있다.
일부 경우에서, 항생제는 1세대, 2세대, 3세대, 4세대 또는 5세대일 수 있다. 1세대 항생제는 좁은 스펙트럼을 가질 수 있다. 1세대 항생제의 예는 페니실린(페니실린 G 또는 페니실린 V), 세팔로스포린(세파졸린, 세팔로틴, 세파피린, 세팔레틴, 세프라딘 또는 세파드록신)일 수 있다. 일부 경우에서, 항생제는 2세대일 수 있다. 2세대 항생제는 페니실린(아목시실린 또는 암피실린), 세팔로스포린(세푸록심, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세프로질, 로라카르베프)일 수 있다. 일부 경우에서, 항생제는 3세대일 수 있다. 3세대 항생제는 페니실린(카르베니실린 및 티카르실린) 또는 세팔로스포린(세픽심, 세프트리악손, 세포탁심, 세프티족심 및 세프타지딤)일 수 있다. 항생제는 또한 4세대 항생제일 수 있다. 4세대 항생제는 세피핌일 수 있다. 항생제는 또한 5세대일 수 있다. 5세대 항생제는 세프타롤린 또는 세프토비프롤일 수 있다.
일부 경우에서, 항생제는 박테리아 벽 표적화제, 세포막 표적화제, 박테리아 효소 간섭제, 살박테리아제, 단백질 합성 억제제 또는 정균제일 수 있다. 박테리아 벽 표적화제는 페니실린 유도체(페남), 세팔로스포린(세펨), 모노박탐 및 카르바페넴일 수 있다. β-락탐 항생제는 살박테리아성 또는 정균성이며 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸 층의 합성을 억제함으로써 작용한다. 일부 경우에서, 항생제는 단백질 합성 억제제일 수 있다. 단백질 합성 억제제는 박테리아가 세포벽을 만드는 데 필요한 효소 트랜스펩티다아제의 비가역성 억제제 역할을 하는 암피실린일 수 있다. 이는 이원 분열에서 박테리아 세포벽 합성의 제3 및 마지막 단계를 억제하여 궁극적으로 세포 용해를 초래하며; 따라서, 암피실린은 일반적으로 박테리아용해성이다. 일부 경우에서, 살박테리아제는 세팔로스포린 또는 퀴놀론일 수 있다. 다른 경우에서, 정균제는 트리메토프림, 술파메톡사졸 또는 펜타미딘이다.
일부 경우에서, PCP 폐렴 예방제가 투여될 수 있다. 예컨대, 트리메토프림과 술파메톡사졸을 투여하여 폐렴을 예방할 수 있다. 트리메토프림 및 술파메톡사졸(TMP/SMX; 예시적 술파 약물)의 용량은 1일 1정 PO, 1주일에 3회, 비-연속일에, 화학요법의 제1 투여일에 또는 이후에 및 적어도 약 6개월 동안 계속 및 적어도 2번의 연속 실험 연구에서 CD4 카운트가 200 초과일 때까지 일 수 있다. 일부 경우에서, 트리메토프림은 160 mg으로 투여될 수 있다. 트리메토프림은 약 100 mg 내지 약 300 mg으로 투여될 수 있다. 트리메토프림은 약 100 mg부터, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg 또는 최대 약 300 mg으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 술파메톡사졸은 800 mg으로 투여된다. 술파메톡사졸은 약 500 mg 내지 약 1000 mg으로 투여될 수 있다. 술파메톡사졸은 약 500 mg부터, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg, 625 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 725 mg, 750 mg, 775 mg, 800 mg, 825 mg, 850 mg, 875 mg, 900 mg, 925 mg, 950 mg, 975 mg, 또는 최대 약 1000 mg으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, TMP/SMX 요법은 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. TMP/SMX는 매일 약 1X 내지 약 10X 투여될 수 있다. TMP/SMX는 매일 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 11X, 12X, 13X, 14X, 15X, 16X, 17X, 18X, 19X, 또는 최대 약 20X 투여될 수 있다. 일부 경우에서, TMP/SMX는 매주 투여될 수 있다. 예컨대, TMP/SMX는 1주일에 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X 또는 최대 약 7X 투여될 수 있다. TMP/SMX 요법은 본원에 기재된 수용자 세포와 같은 세포 요법의 투여 후 약 -14일부터, -13, -12, -11, -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13일, 또는 최대 약 14일에 투여될 수 있다.
일부 경우에서, 술파 알러지를 갖는 대상체는 펜타미딘을 받을 수 있다. 펜타미딘은 에어로졸로 투여될 수 있다. 입원 전 1주일 이내에 분무기당 펜타미딘 300 mg이 투여되고, CD 카운트가 2회의 연속 후속 실험실 연구에서 200을 초과할 때까지 및 화학요법 후 적어도 6개월 동안 매월 계속될 수 있다. 펜타미딘은 PCP 감염의 발생을 예방하는 데 사용될 수 있다. 이는 300 mg의 동결건조 분말 바이알로 공급될 수 있으며 분무기를 통해 투여될 수 있다. 펜타미딘은 약 300 mg 내지 약 500 mg으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 펜타미딘은 약 100 mg부터, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 또는 최대 약 800 mg으로 투여될 수 있다.
일부 경우에서, 항생제와 같은 정균제를 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 투여 전, 이들 세포와 동시에 또는 이들 세포 후에 투여할 수 있다. 일부 경우에서, 정균제는 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포의 투여 전 약 14일부터 이들 세포의 투여 후 약 6개월까지 투여될 수 있다.
항바이러스제
일부 경우에서, 항바이러스제는 치료 요법의 일부로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 헤르페스 바이러스 예방제는 치료 요법의 일부로 대상체에게 투여될 수 있다. 헤르페스 바이러스 예방제는 발라사이클로비르(발트렉스)일 수 있다. 발트렉스는 HSV 혈청 검사가 양성인 대상체에서 헤르페스 바이러스 감염의 발생을 예방하기 위해 경구로 사용될 수 있다. 이는 500 mg 정제로 공급될 수 있다. 발라사이클로비르는 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 예컨대, 발라사이클로비르는 약 50 mg부터, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg, 625 mg, 650 mg, 또는 최대 약 700 mg 정제로 투여될 수 있다. 대상체가 경구 섭취를 견딜 수 있는 경우, 발라사이클로비르는 플루다라빈의 마지막 투여 다음날 500 mg의 용량으로 경구로 매일 시작될 수 있다. 항바이러스 요법은 세포 요법 투여 후 약 -14일부터, -13, -12, -11, -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13일, 또는 최대 약 14일에 투여될 수 있다.
일부 경우에서, 대상체는 헤르페스 예방을 위한 경구 약물을 복용하지 못할 수 있다. 이 경우에 아사이클로비르가 투여될 수 있다. 아사이클로비르는 500 mg/바이알로 주사용 분말로 공급될 수 있다. 일부 경우에서, 아사이클로버는 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 아사이클로비르는 약 50 mg부터, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg, 625 mg, 650 mg, 또는 최대 약 700 mg으로 경구 투여될 수 있다. 아사이클로비르는 1일당 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 또는 최대 약 7X 투여될 수 있다. 아사이클로비르는 세포 요법 투여 후 약 -14일부터, -13, -12, -11, -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13일, 또는 최대 약 14일에 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 아사이클로비르는 정맥내 투여될 수 있다. 예컨대, 아사이클로버는 1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 20 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 30 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 40 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 50 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 60 mg/kg 내지 약 70 mg/kg, 약 70 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 80 mg/kg 내지 약 90 mg/kg, 약 90 mg/kg 내지 약 100 mg/kg으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 아사이클로비르는 50 mg/kg을 초과하여 투여된다. 아사이클로비르는 10 mL의 주사용 멸균수에 50 mg/mL의 농도로 재구성될 수 있다. 재구성된 용액은 12시간 이내에 사용되어야 한다. IV 용액은 7 mg/mL 이하의 농도로 희석되고 신장 손상을 회피하기 위해 1시간에 걸쳐 주입될 수 있다.
투여
암과 같은 병태를 갖는 대상체에게 치료 요법을 투여하는 방법이 본원에 제공될 수 있다. 일부 예에서, 세포 조성물(예컨대, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포를 포함)은 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 세포 조성물은 용액에 재현탁되고 주입으로 투여될 수 있다. 또한, 면역자극제, 면역억제제, 항생제, 항진균제, 항토제, 화학요법제, 방사선요법 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 치료 요법이 본원에 제공될 수 있다. 상기 중 임의의 것을 포함하는 치료 요법은 동결건조되고 수용액(예컨대, 식염수 용액)에서 재구성될 수 있다. 일부 예에서, 치료(예컨대, 세포 치료)는 피하 주사, 근육내 주사, 피내 주사, 경피 투여, 정맥내("iv") 투여, 비강내 투여, 림프내 주사 및 경구 투여로부터 선택되는 경로에 의해 투여된다. 일부 예에서, 대상체는 림프내 마이크로카테터에 의해 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포를 포함하는 세포 조성물로 주입된다.
많은 약물은 액체, 캡슐, 정제 또는 씹을 수 있는 정제로 경구 투여될 수 있다. 구강 경로가 가장 편리하고 일반적으로 가장 안전하고 저렴하기 때문에 가장 자주 사용되는 경로일 수 있다. 그러나, 약물이 전형적으로 소화관을 통해 이동하는 방식 때문에 제한이 있을 수 있다. 경구 투여되는 약물의 경우, 입 및 위에서 흡수가 시작될 수 있다. 그러나, 대부분의 약물은 소장에서 흡수될 수 있다. 약물은 장벽을 통과하여 간으로 이동한 후 혈류를 통해 표적 부위로 이동한다. 장벽 및 간은 많은 약물을 화학적으로 변경(대사)하여 혈류에 도달하는 약물의 양을 감소시킬 수 있다. 결과적으로, 이들 약물은 동일한 효과를 내기 위해 정맥 주사 시 더 적은 용량으로 투여될 수 있다.
피하 경로의 경우, 바늘은 피부 바로 아래 지방 조직에 삽입될 수 있다. 약물이 주사된 후에 작은 혈관(모세 혈관)으로 이동하여 혈류에 의해 운반된다. 대안적으로, 약물은 림프관을 통해 혈류에 도달할 수 있다. 근육내 경로는 더 많은 부피의 약품이 필요할 때 이용될 수 있다. 근육은 피부 및 지방 조직 아래에 있기 때문에 더 긴 바늘이 사용될 수 있다. 약물은 일반적으로 상완, 허벅지 또는 엉덩이 근육에 주사된다. 정맥 경로의 경우, 바늘은 정맥에 직접 삽입될 수 있다. 약물을 함유하는 용액은 단일 용량 또는 연속 주입에 의해 제공될 수 있다. 주입의 경우, 용액은 중력에 의해 (접을 수 있는 플라스틱 백으로부터) 또는 더 일반적으로 주입 펌프에 의해 얇은 유연한 튜브를 통해 정맥, 일반적으로 전완에 삽입된 튜브(카테터)로 이동될 수 있다. 일부 경우에서, 세포 또는 치료 요법은 주입으로 투여된다. 주입은 일정 기간에 걸쳐 발생할 수 있다. 예컨대, 주입은 약 5분 내지 약 5시간의 기간에 걸친 세포 또는 치료 요법의 투여일 수 있다. 주입은 약 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 또는 최대 약 5시간에 걸쳐 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 정맥내 투여는 정확한 용량을 신속하고 잘 조절된 방식으로 전신에 전달하기 위해 사용된다. 이는 또한 피하 또는 근육내 주사로 투여하면 통증을 유발하고 조직에 손상을 줄 수 있는 자극성 용액에도 사용될 수 있다. 정맥 주사는 특히 개체가 비만인 경우 바늘 또는 카테터를 정맥에 삽입하는 것이 어려울 수 있으므로 피하 또는 근육내 주사보다 투여하기가 더 어려울 수 있다. 정맥으로 투여하면 약물이 즉시 혈류에 전달될 수 있으며 임의의 다른 경로로 투여 할 때보다 더 빨리 효과가 나타나는 경향이 있다. 결과적으로, 의료 종사자는 약물이 효과가 있거나 원치 않는 부작용을 유발하고 있다는 징후에 대해 정맥내 주사를 받는 개체를 면밀히 모니터링할 수 있다. 또한, 이 경로로 투여되는 약물의 효과는 더 짧은 시간 동안 지속되는 경향이 있다. 따라서, 일부 약물은 효과를 일정하게 유지하기 위해 지속적인 주입으로 투여될 수 있다. 척수강내 경로의 경우, 바늘은 하부 척추의 2개의 척추골 사이와 척수 주변 공간에 삽입될 수 있다. 이어서, 약물은 척추관에 주사될 수 있다. 주사 부위를 마비시키기 위해 소량의 국소 마취제가 사용될 수 있다. 이 경로는 약물이 뇌, 척수 또는 이를 덮고 있는 조직 층(수막)에 신속하거나 국소적인 효과를 생성하는 것이 필요할 때-예컨대 이들 구조의 감염을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
입을 통해 흡입에 의해 투여되는 약물은 비강 경로에 의해 투여되는 것보다 작은 액적으로 분무될 수 있으므로 약물은 기관(windpipe)(기관(trachea))을 통해 폐로 들어갈 수 있다. 그들이 폐에 얼마나 깊이 들어가는지는 액적의 크기에 따라 달라질 수 있다. 작은 액적은 더 깊숙이 들어가 흡수되는 약물의 양을 증가시킬 수 있다. 폐 내부에서 그들은 혈류로 흡수될 수 있다.
일부 경우에서, 치료 요법은 대상체의 체중에 따라 투여될 수 있다. 비만(BMI > 35)으로 결정된 대상체에서는 실제 체중을 활용해야 할 수 있다. BMI는 하기와 같이 계산된다: BMI = 체중(kg)/[키(m)]2.
이상적인 체중은 남성의 경우 50 kg+2.3×(60 인치 초과의 인치 수) 또는 여성의 경우 45.5kg + 2.3×(60 인치 초과의 인치 수)로 계산될 수 있다. 이상적인 체중의 20% 초과인 대상체에 대해 조정된 체중이 계산될 수 있다. 조정된 체중은 이상적인 체중 + (0.4 x (실제 체중-이상적인 체중))의 합계일 수 있다. 일부 경우에서, 신체 표면적을 활용하여 용량을 계산할 수 있다. 신체 표면적(BSA)은 하기와 같이 계산될 수 있다: BSA (m2) = √높이(cm)*중량(kg)/3600.
일부 경우에서, 세포 요법을 포함하는 약제학적 조성물은 임의의 경로에 의해 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 투여될 수 있으며, 이러한 투여는 단일 및 다중 용량 모두로 수행될 수 있다. 보다 특히, 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 손 사탕, 분말, 스프레이, 수성 현탁액, 주사 용액, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 다양한 약제학적으로 허용되는 불활성 담체와 조합될 수 있다. 이러한 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 다양한 무독성 유기 용매 등을 포함한다. 또한, 이러한 경구 약제학적 제형은 이러한 목적을 위해 일반적으로 사용되는 타입의 다양한 작용제에 의해 적절하게 감미 및/또는 향미될 수 있다.
일부 경우에서, 치료 요법은 담체 또는 부형제와 함께 투여될 수 있다. 담체 및 부형제의 예는 덱스트로스, 염화나트륨, 수크로스, 락토스, 셀룰로스, 자일리톨, 소르비톨, 말리톨, 젤라틴, PEG, PVP 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 덱스트로스 또는 염화나트륨과 같은 부형제는 약 0.5%부터, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13. 5%, 14%, 14. 5%, 또는 최대 약 15%의 퍼센트일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체에서 질환을 치료하는 방법은 조작된 세포(예컨대, 면역수용체 프로그래밍된 수용자 세포)를 포함하는 하나 이상의 세포(기관 및/또는 조직을 포함)를 대상체에게 이식하는 단계를 포함할 수 있다. 세포내 게놈 이식에 의해 제조되는 세포는 암 치료에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 테일-대-테일 배향으로, 액적 기반 단일 세포 반응기를 사용한 쌍을 이룬 TCR 클로닝
단계 1: 올리고뉴클레오티드 적재된, 열 가역성 히드로겔의 제조
올리고뉴클레오티드 적재된, 열 가역성 히드로겔은 초저 겔화 온도(ULGT) 아가로스(열 가역성 히드로겔의 역할을 함) 및 올리고뉴클레오티드로 공유적으로 변형된 선형 폴리아크릴아미드 중합체로 제조될 수 있다. ULGT 아가로스는 타입 IX-A일 수 있으며 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)(Cat. # A2576)에서 구입될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 변형된 선형 폴리아크릴아미드는 올리고뉴클레오티드 및 아크릴아미드 단량체를 공중합시킴으로써 제조될 수 있다. 구체적으로, PBS 버퍼 중에 ~4% 아크릴아미드, 100 μM 아크리다이트-dT30, 100 μM 아크리다이트-T1d를 함유하는 용액을 제조하고, 적절한 양의 과황산암모늄(APS) 및 TEMED를 용액에 첨가하고, 용액을 실온에서 ~6시간 동안 인큐베이션할 것이며, 이 동안 아크릴아미드, 아크리다이트-dT30 아크리다이트-T1d(T1d의 서열은 5'-CGGGAAAGCA GA-3'일 수 있음)는 고분자량 선형 중합체로 공중합될 것이다.
이 용액을 PBS에 대해 투석하여 장쇄 선형 폴리아크릴아미드에 혼입되지 않은 아크릴아미드 단량체, 짧은 폴리아크릴아미드 쇄 및 올리고뉴클레오티드와 같은 폐기물을 제거할 것이다. 이 투석은 또한 APS, TEMED, 그들의 반응/분해 생성물을 제거할 것이다. 이어서, 2% 용융된 ULGT 아가로스 및 올리고뉴클레오티드 변형된 선형 폴리아크릴아미드를 함유하는 용액을 1:1 비율로 혼합하여 올리고뉴클레오티드 적재된 1% ULGT 아가로스를 수득할 수 있다.
이 실시예에서, dT30은 도 4a 및 도 5a에 도시된 확산 제한된 TCR 알파 불변 도메인(TRAC) RT 프라이머 및 확산 제한된 TCR 베타 불변 도메인(TRBC) RT 프라이머의 역할을 한다. 대안적으로, TRAC 및 TRBC를 표적으로 하는 유전자 특이적 프라이머를 RT 프라이머로 사용할 수 있다. TRAC 표적화 유전자 특이적 프라이머 서열의 예는 5'-ttgagaatca aaatcggtga ata-3'이다. TRBC 표적화 유전자 특이적 프라이머 서열의 예는 5'-tgtgcacctc cttccc-3'이다.
이 실시예에서, T1d는 도 4a 및 도 5b에 도시된 친화성 보유 서열(ARS)과 하이브리드화할 수 있는 친화성 포획 올리고(ACO)의 역할을 하여, ARS를 운반하는 분자(예컨대, 프라이머 및 PCR 생성물)는 확산이 제한된다. 중합 조건은 1% ULGT 아가로스 겔에서 dT30 및 T1d의 최종 농도가 100 nM 내지 500 nM 범위가 되도록 최적화될 수 있다.
단계 2: 히드로겔 액적에 T 세포의 캡슐화
약 10,000개의 T 세포를 37℃에서 상술된 용융된 올리고뉴클레오티드 적재된, 열 가역성 히드로겔 ~50 μL에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 유동-포커싱 미세유체 디바이스를 사용하여 캐리어 오일과 유화시켜 중앙값 부피가 ~250 pL인 ~200,000개의 균일한 크기의 유중수 액적을 형성하거나, 티슈라이저(TissueLyser) LT(Qiagen)를 사용하여 볼텍싱하여 불균질한 크기의 유중수 액적을 형성할 것이다. 캐리어 오일은 세제 함유 플루오로카본 오일(예컨대, RAN Biotechnologies, Cat # 008-FluoroSurfactant-2wtH) 또는 세제 함유 미네랄 오일(예컨대, Tegosoft DEC, 미네랄 오일, 73:20:7 비율로 혼합된 Abil WE09, 문헌(Abil et al., 2017) 참조)일 수 있다. 볼텍싱 방법을 위해, T 세포의 합리적인 분획(예컨대, >20%)이 0.1 nL 내지 0.5 nL 부피의 액적에 있도록 볼텍싱의 빈도 및 지속시간을 조정할 수 있다.
단계 3: mRNA 포획 및 역-전사
상기에서 생성된 에멀젼을 65 내지 75℃에서 5분 동안 인큐베이션하여 세포를 파열시키고 mRNA를 방출할 수 있다. 이어서, 에멀젼을 얼음 상에 놓아 dT30이 폴리 A 테일과 하이브리드화되도록 할 것이다(도 4a, 상부). 이 얼음 상에서의 인큐베이션은 또한 아가로스의 겔화를 촉진할 것이다. 이어서, 에멀젼을 해유화시켜 수용액 중의 히드로겔 비드를 수득할 것이다. 해유화 방법은 사용되는 캐리어 오일에 따라 다를 것이다. 플루오로카본 오일의 경우, HFE-7500 오일(20% PFO)에 20% (vol/vol) 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥탄올을 첨가하여 에멀젼을 해유화시킬 수 있다. 미네랄 오일의 경우, 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25:24:1; vol/vol/vol; Fisher, cat. no. BP17521)에 의해 에멀젼을 해유화시킬 수 있다.
시약 교환을 수행하여 버퍼 및 시약을 히드로겔 비드의 수성 내용물에 전달하여 역전사(RT) 및 템플릿 스위칭(TS)을 발생시킬 수 있다(도 4a, 화살표 (1)). 이를 위해, 히드로겔 비드를 4℃에서 충분한 양의 dNTP(예컨대, 스마트스크라이브(SmartScribe) RT 버퍼)를 함유하는 RT 버퍼로 세척한 다음, 충분한 양의 RT 효소(예컨대, 스마트스크립트(SmartScript) 역전사효소) 및 템플릿 스위칭 올리고(TSO)를 비드 현탁액에 첨가하고 히드로겔 비드로 확산시킬 것이다. TSO는 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT/rG//rG//+G/-3'의 서열을 가질 수 있으며, 여기서 /rG/는 리보스 G 뉴클레오티드를 의미하고, /+G/는 LNA G 뉴클레오티드를 의미한다. 히드로겔 비드는 짧은 원심분리(예컨대, 1분 동안 500 g)에 의해 압축될 것이며, 상층액은 제거될 수 있다. 이어서, 히드로겔 비드는 교반 방법을 이용하여 재유화될 것이다. 이를 위해, 소량(예컨대, ~500 uL)의 캐리어 오일을 압축된 히드로겔 비드를 함유하는 튜브에 첨가할 수 있다. 튜브를 (예컨대, 볼텍싱 또는 핸드-플릭킹으로) 교반하여 유중수 에멀젼을 형성할 것이며, 여기서 히드로겔 비드는 중간에 유체 수용액이 소량(예컨대, 50 pL)이거나 전혀 없는 캐리어 오일로 둘러싸일 것이다. 이 에멀젼을 인큐베이션하여 RT 및 템플릿 스위칭(예컨대, 42℃에서 1시간 동안)을 마친 다음, 아가로스 겔이 되도록 4℃에서 5분 동안 인큐베이션할 것이다. 이어서, 에멀젼은 상술된 바와 같이 다시 해유화될 수 있다.
단계 4: TRA 및 TRB를 PCR 증폭
히드로겔에서 제1 가닥 cDNA 확산이 제한되면, 히드로겔 비드는 액적 기반 단일 세포 반응기에서 완충제, DNA 폴리머라제(예컨대, Taq 또는 KOD) 및 TRA 및 TRB의 PCR-증폭을 위한 프라이머를 전달하기 위해 (상술된 바와 같이) 다시 시약 교환될 수 있다. 3개의 프라이머 세트를 사용하여 TRAC 및 TRBC를 증폭할 수 있다: 프라이머 'ARS-pTSO', '1R' 및 '2R'(도 4a, 화살표 (2) 참조). 프라이머 ARS-pTSO는 [T1i|3xSpacer18|pTSO}의 서열을 가질 수 있고, 여기서 T1i는 T1d에 상보적이며, 3xSpacer18은 3개의 연속적인 내부 Spacer 18(즉, 헥사에틸렌 글리콜) 변형으로 이루어진 유연한 링커이며, pTSO는 TSO가 템플릿 스위칭된 cDNA에서 프라이밍할 수 있는 것과 본질적으로 동일한 서열을 갖는다. pTSO는 5'-GCAGTGGTAT CAACGCAGAG TAC-3'의 서열을 가질 수 있다. 프라이머 1R 및 2R은 "쌍을 이룬 이분 면역수용체 서열의 융합: 테일-대-테일 설계" 섹션에 개요된 전략에 따라 설계될 수 있다. 도메인 TRAC-5A는 서열 5'-GACCCTGCCGTGTACCAG-3'을 가질 수 있고; 도메인 TRBC-5A는 서열 5'-TGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAG-3'을 가질 수 있고; 도메인 OL-1은 서열 5'-ACCAG-3'을 가질 수 있으며; 도메인 OL-2는 서열 5'-CTCTGCT-3'을 가질 수 있다.
시약 교환 후, 히드로겔 비드는 상술된 교반 방법을 이용하여 다시 유화될 수 있다. 에멀젼은 PCR 적용될 수 있고(도 4b, 화살표 (3)), 그 후 증폭되고 확산 제한된 TRA 및 TRB가 생성될 수 있다. 증폭된 TRA 및 TRB는 또한 융합을 촉진하기 위한 중첩된 서열을 갖는다. 에멀젼은 아가로스가 겔화되도록 다시 냉각된 다음 해유화될 수 있다.
단계 5. TRA와 TRB의 융합
증폭된 TRA 및 TRB의 융합은 "쌍을 이룬 이분 면역수용체 서열의 융합: 테일-대-테일 설계" 섹션에 개요된 전략에 따라 수행될 수 있다. 예컨대, USER(New England Biolabs) 및 리가제를 사용할 수 있다. 이를 위해, 프라이머 1R 및 2R은 선택된 위치에서 데옥시우리딘으로 변형되어야 한다. 예컨대, 프라이머 1R은 서열 5'-AGCAGAGC/dU/GG/dU/ACACGGCAGGGTC-3'을 가질 수 있고, 프라이머 2R은 서열 5'-ACCAGCTC/dU/GC/dU/TCTGATGGCTCAAACACA-3'을 가질 수 있으며, 여기서 /dU/는 데옥시우리딘 변형을 의미한다.
이전 단계에서 PCR 증폭 후, 에멀젼을 해유화시키고 시약 교환을 수행하여 USER 버퍼 및 효소 혼합물을 아가로스 비드의 수성 내용물에 전달할 수 있다. 히드로겔 비드는 교반 방법을 이용하여 다시 유화될 수 있으며, 에멀젼은 USER 분해에 적합한 온도에서 인큐베이션될 수 있다(예컨대, 37℃에서 1시간 동안). 아가로스가 용융되도록 온도를 약간 높여 USER-분해된 PCR 생성물이 자유롭게 확산되도록 할 수 있다. 이어서, 에멀젼은 USER-분해된 TRA 상의 점착 말단에 대해 37℃에서 다시 인큐베이션될 수 있으며 TRB가 하이브리드화할 수 있다(도 4b, 화살표 (4)). 이어서, 에멀젼은 얼음 상에서 냉각되어 아가로스 겔을 만들고, 해유화될 수 있다.
이어서, 시약 교환을 적용하여 리가제 버퍼 및 효소(예컨대, Taq DNA 리가제)를 아가로스 비드에 도입한 다음 교반 방법을 이용하여 재유화할 수 있다. 이어서, 에멀젼을 리가제에 대한 최적 온도에서 인큐베이션할 수 있으며, 이는 점성 말단을 리게이션할 것이다(도 4b, 화살표 (5)). 에멀젼은 다시 냉각되고 해유화되어 수용액에서 아가로스 비드를 수거할 수 있다.
아가로스 비드는 아가로스 농도가 실온에서 겔화되지 않을 만큼 충분히 낮도록 ~100 μL 1x TE로 희석되고 다시 용융될 수 있다. 이 혼합물에 pTSO 서열을 갖는 프라이머를 PCR 버퍼 및 효소와 함께 첨가할 수 있으며, 벌크 PCR을 수행하여 융합된 생성물을 추가로 증폭시킬 수 있다. 이 새로운 PCR 생성물은 더 이상 확산 제한되지 않을 것이며, 아젠코트(Agencourt) AMPure 비드를 사용하여 정제될 수 있다. 정제된 PCR 생성물은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 나타낸다.
실시예 2: 헤드-대-테일 배향으로, 액적 기반 단일 세포 반응기를 사용한 쌍을 이룬 TCR 클로닝
처음 3개 단계는 TSO가 불필요할 수 있다는 점을 제외하고는 본질적으로 실시예 1과 동일할 수 있다(도 5a, 상부 및 화살표 (1)).
단계 4: 확산 제한된 cDNA에 제2 가닥 합성
RT 후, 히드로겔 비드는 시약 교환을 거쳐 제2 가닥 합성(SSS) 프라이머 그룹을 전달할 수 있다(도 5a, 화살표 (2)). 그룹은 TRA 패널 및 TRB 패널의 두 패널을 포함할 수 있다. 각각의 패널은 종에 따라 10 내지 100개의 프라이머를 함유할 수 있다. 인간의 경우, 45-프라이머 TRA 패널 및 48-프라이머 TRB 패널을 사용하여 IMGT 데이터베이스에 주석이 달린 모든 기능적 V 유전자 변이체를 커버할 수 있다. TRA 패널의 각각의 프라이머는 [AdptA|CDSTRA}의 일반 구조를 가질 수 있으며, TRB 패널의 각각의 프라이머는 [AdptB|CDSTRB}의 일반 구조를 가질 수 있다. AdptA 및 AdptB는 본 개시내용에서 기재된다. AdptA는 P2A-3A의 서열을 가질 수 있다. P2A-3A는 P2A '자가 절단' 펩타이드에 대한 코딩 서열의 마지막 ~20개 염기일 수 있다. P2A의 코딩 서열은 'gcgacgaatt ttagtttgct taagcaagcc ggagatgtgg aggaaaatcc tggaccg'일 수 있다. AdptB는 attB1-K의 서열을 가질 수 있으며, 이의 뉴클레오티드 서열은 'ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT tacc'일 수 있다. CDSTRA는 각각의 TRA-L1 유전자(TRAV 유전자의 리더 서열을 코딩)의 코딩 서열의 처음 20 내지 45개 염기일 수 있다. CDSTRB는 각각의 TRB-L1 유전자(TRBV 유전자의 리더 서열을 코딩)의 코딩 서열의 처음 20 내지 45개 염기일 수 있다. 이 경우에서, CDSTRA 및 CDSTRB는 각각 TRAV-L1UE 및 TRBV-L1UE로도 불릴 수 있다(여기서 U는 상류를 나타내고 E는 정확함을 나타내며, 서열이 시작 코돈에서 정확히 시작됨을 의미함). 모든 CDSTRA 및 CDSTRB 서열은 유사한 Tm을 갖도록 설계되어야 합리적으로 우수한 효율성 및 특이성으로 cDNA 상의 표적 부위에 모두 결합할 수 있다.
시약 교환 후, 히드로겔 비드의 프라이머 농도는 각각의 프라이머에 대해 ~10 nM(총 ~1 uM)일 수 있다. AdptA 및 AdptB의 존재는 SSS 프라이머에 대한 비-특이적 결합을 유발할 수 있으므로 AdptA 및 AdptB(여기서 각각 차단제A 및 차단제B로 불림)에 상보적인 서열을 가진 차단제 올리고뉴클레오티드를 추가하여 AdptA 및 AdptB에 하이브리드화할 수 있다. 차단제A 및 차단제B의 3' 말단은 확장 차단제(예컨대, 아민, C3 스페이서, 디데옥시 변형 또는 역(inverted) dT)로 변형될 수 있다. 차단제 A의 농도가 TRA 패널 SSS 프라이머의 총 농도와 같거나 더 높고 차단제 B의 농도가 TRB 패널 SSS 프라이머의 총 농도와 같거나 더 높은지 확인할 수 있다.
시약 교환 후, 히드로겔 비드는 교반 방법을 이용하여 재유화될 수 있다. 에멀젼을 먼저 ~95℃로 3 내지 10분 동안 가열하여 mRNA:cDNA 듀플렉스를 변성시킨 다음 어닐링 온도로 냉각할 수 있으며, 이는 전형적인 CDSTRA 및 CDSTRB 서열의 Tm보다 3 내지 10℃ 낮을 수 있다. 어닐링은 3 내지 6시간 지속될 수 있다. 이어서, 에멀젼을 아가로스가 겔화되도록 냉각시키고, 해유화시키고, 히드로겔 비드를 실온에서 세척하여 결합되지 않은 SSS 프라이머를 제거할 수 있다. 임의적으로, ssDNA 3'에서 5'로의 엑소뉴클레아제(예컨대, Exo I)를 (시약 교환을 통해) 아가로스 비드에 첨가하여 나머지 및 하이브리드화되지 않은 SSS 프라이머를 분해할 수 있다. 엑소뉴클레아제가 아가로스의 융점보다 높은 인큐베이션 온도를 필요로 하는 경우, 이 엑소뉴클레아제 처리 단계는 또 다른 유화 → 반응 → 해유화 → 시약 교환을 필요로 할 수 있다.
이어서, DNA 폴리머라제(예컨대, DNA 폴리머라제 I, Phi 29, 클레노우 단편, Taq 등) 및 적절한 버퍼를 시약 교환을 통해 아가로스에 첨가할 수 있다. 아가로스 비드는 교반 방법으로 다시 유화될 수 있으며, 에멀젼은 DNA 폴리머라제의 최적 온도에서 10 내지 60분 동안 인큐베이션하여 SSS를 수행할 수 있다(도 5b, 화살표 (3)).
단계 5: TRA 및 TRB의 PCR 증폭, 융합
SSS 후, 에멀젼을 아가로스가 겔화되도록 냉각시키고, 해유화시키고, PCR 버퍼로 세척할 수 있다. 프라이머 ht1F, ht1R, ht2F, ht2R 및 열안정성 DNA 폴리머라제(예컨대, Hotstart Taq)는 시약 교환을 통해 히드로겔에 첨가될 수 있다(도 5b, 화살표 (4)). 프라이머 ht1F는 서열 [T1i|3xSpacer18|AdptA}를 가질 수 있으며, 여기서 T1i는 친화성 보유 서열(ARS) 역할을 한다. 프라이머 ht2R은 서열 [T1i|3xSpacer18|TRBC-3A*}를 가질 수 있으며, 여기서 TRBC-3A*는 TRBC에 대한 역방향 프라이머이고, 서열 5'-CTCTGCTTCTGATGGCTCAAACACA-3'을 가질 수 있다. 프라이머 ht1R 및 ht2F가 본원에 기재된다. 도메인 [htTRAC-5A}는 서열 5'-gaccctgccgtgtaccagc-3'을 가질 수 있다.
히드로겔 비드는 교반 방법을 이용하여 유화될 수 있고 PCR 수행될 수 있다(도 5b 및 5c, 화살표 (5)). TRA 및 TRB PCR 생성물은 중첩 서열을 가지며, 실시예 1(도 5c)에 기재된 방법을 이용하여 융합될 수 있다. 융합 생성물은 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 나타낸다.
실시예 3: 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 양방향 프로모터를 갖는 면역수용체 발현 벡터로 전환
실시예 1로부터 수득된 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드는 부분 C 영역 서열만을 함유할 수 있다. 프로모터와 함께 나머지 C 영역 서열을 추가하여 발현 벡터에서 완전한 발현 카세트를 형성할 수 있다. 도 6a 및 6b는 이를 달성하기 위한 예시 전략을 개략적으로 설명한다. 먼저, 상부 가닥이 선택적으로 포획 및 방출될 수 있다(도 6a, 화살표 (1)). 이는 상부 가닥의 보존된 서열(예컨대, [OL-1|OL-2})을 특이적으로 인식하는 포획 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 이어서, 반대 방향을 향하는 2개의 인간 프로모터를 포함하는 선형 DNA 구축물(본원에서는 프로모터 분절로 불림)이 포획된 상부 가닥과 융합될 수 있다(도 6a, 화살표 (2) 및 (3)). 융합을 용이하게 하기 위해, (도 6a에서 도시되는 바와 같이) 프로모터 분절의 하부 가닥은 포획된 상부 가닥에 하이브리드화하는 서열 [TSO}를 갖는 단일 가닥 영역을 포함할 수 있다. 단일 가닥 영역은 USER 분해에 의해 생성될 수 있다. 이를 위해, 프로모터 분절을 증폭시키는 데 사용되는 정방향 프라이머는 몇몇(예컨대, 1 내지 5) 데옥시우리딘 변형을 가질 수 있으며, PCR 생성물은 USER 효소 혼합물로 처리될 수 있다. dsDNA를 수득하기 위해(도 6a, 화살표 (3)), 강력한 가닥 변위 활성을 갖는 DNA 폴리머라제(예컨대, phi 29, Bst)를 사용할 수 있다. 대안적으로, 리가제를 사용하여 상부 가닥을 밀봉할 수 있다.
이 융합된 생성물은 PCR에 의해 추가로 증폭될 수 있다. (본질적으로 [TSO}의 서열을 갖는) 정방향 프라이머는 상부 가닥의 중간(간섭 프라이머-결합 부위로 칭함)의 [TSO*}에 하이브리드화하지 않는 것을 확실히 하기 위해, 차단제 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 차단제 올리고뉴클레오티드는 [PB3|TSO} 서열을 가질 수 있으며, 여기서 [PB3}는 [프로모터 B}의 마지막 10 내지 20개 염기의 서열을 갖는다. 그 결과, 차단제 올리고뉴클레오티드는 정방향 프라이머보다 실질적으로 더 높은 Tm을 가질 수 있다. PCR 반응에서, 차단제 올리고뉴클레오티드는 정방향 프라이머의 농도보다 낮은 농도로 사용될 수 있다. 2단계 어닐링이 열순환 프로그램에서 적용될 수 있다. 각각의 PCR 사이클에서, 변성 단계 후, 비교적 높은 온도(예컨대, 68℃)에서의 제1 어닐링 단계를 사용하여 차단제가 상부 가닥에 하이브리드화되도록 할 수 있지만, 정방향 프라이머는 상부 또는 하부 가닥에 하이브리화되지 않는다. 이어서, 비교적 낮은 온도(예컨대, 58℃)에서의 제2 어닐링 단계를 사용하여 정방향 프라이머가 하부 가닥에 결합하게 할 수 있다. 상부 가닥의 [TSO*} 서열은 제1 어닐링 단계 동안 차단제에 의해 이미 점유되어 있으므로, 정방향 프라이머는 이 서열을 효과적으로 결합할 수 없다. 제2 어닐링 단계에서 차단제가 하부 가닥의 [TSO*}(정방향 프라이머-결합 부위)에 결합할 수도 있지만, 정방향 프라이머가 더 높은 농도를 갖기 때문에, 차단제보다 하부 가닥의 [TSO*} 부위에 더 효율적으로 결합할 수 있다.
이어서, 증폭 생성물은 공지된 방법을 이용하여 원형화될 수 있다(도 6a, 화살표 (4)). 원형화된 생성물은 본질적으로 [OL-1}과 [OL-2} 사이를 절단하여 선형화될 수 있다. 이는 본질적으로 서열 [OL-2}을 갖는 정방향 프라이머 및 본질적으로 서열 [OL-1*}을 갖는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 간단히 달성될 수 있다. 두 프라이머는 PCR을 위한 적절한 Tm에 도달하기 위해 3' 말단에서 연장될 수 있다. 선형화된 생성물에서, 프로모터 분절의 제1 프로모터(예컨대, 프로모터 A)는 TRA를 전사하도록 위치 및 배향되고, 프로모터 분절의 제2 프로모터(예컨대, 프로모터 B)는 TRB를 전사하도록 위치 및 배향된다.
선형화된 생성물은 기존 방법을 이용하여 플라스미드 골격으로 클로닝될 수 있다(도 6b, 화살표 (6)). 선형화된 생성물은 TRA 또는 TRB의 C 영역의 전체 서열을 함유할 수 없다. 이들 불변 서열(TRAC 및 TRBC의 전체 또는 부분 서열)은 플라스미드 골격에 포함될 수 있으므로 TRA 및 TRB의 번역된 생성물은 기능적이다. 플라스미드 골격은 TRA(예컨대, pA1) 및 TRB(예컨대, pA2)에 대한 종결자 서열을 가질 수 있다. 플라스미드 골격은 또한 복제 기점, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 유전자), 레트로바이러스 벡터 기능을 위한 LTR, 또는 트랜스포사제 의존적 삽입을 위한 서열 요소와 같은 벡터의 증식 및 기능을 위한 다른 요소를 가질 수 있다.
실시예 4: 테일-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉 면역수용체 발현 벡터로 전환
TCR 발현 벡터에서, TRA 및 TRB의 코딩 서열은 인-프레임 방식으로 헤드-대-테일 배향으로 융합될 수 있으므로, 하나의 프로모터를 사용하여 TRA 및 TRB 둘 다를 코딩하는 mRNA를 전사시킬 수 있고, 리보솜은 TRA 및 TRB를 연속 폴리펩티드로, 또는 P2A와 같은 '자가 절단 펩티드'가 사용되는 경우, 2개의 폴리펩티드로 전사시킬 수 있다. TRA와 TRB 사이에 링커 서열이 삽입될 수 있다.
이 실시예에서, 우리는 도 4a 및 4b 및 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 생성된 테일-대-테일 융합된 TCR 유전자를 TCR 발현 벡터로 전환하는 방법을 보여주며, 여기서 TRA 및 TRB는 헤드-테일 배향으로, 인-프레임으로, TRA와 TRB 사이에 링커를 사용하여 융합된다. 전략은 도 7a-7d에 예시되어 있다.
이 실시예에서, TRA 및 TRB의 시작 부위는 제어될 수 있다. 이 실시예에서, 서열을 설명하는 데 보다 정확한 명명 시스템이 사용된다. 도 7a의 상부는 도 4a 및 4b 및 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 생성된 융합 생성물을 보여준다. TRA 서열은 5'UTR, TRA의 L 도메인, TRA의 재배열된 VDJ 서열, 및 TRA의 C 영역의 5' 말단에 짧은 서열(미니-C 또는 mC로 칭함)을 함유할 수 있다. 따라서, TRA 서열은 TRAUTR-L-VDJmC로 불린다. 마찬가지로, TRB 서열은 TRBUTR-L-VDJmC로 불린다.
실시예 2에 기재된 [P2A-3A|TRAV-L1UE} 패널은 (1) TRA 서열이 TRA의 L1 영역의 시작 코돈에서 정확하게 시작될 수 있고, (2) 공통 서열 [P2A-3A}이 도입되어 증폭과 같은 추가 조작을 용이하게 하도록 상부 가닥을 '트리밍'하는 데 사용될 수 있다(도 7a, 화살표 (1)). 반응은 테일-대-테일 융합 TCR 유전자가 템플릿으로 사용된다는 점을 제외하고는 실시예 2에 기재된 SSS 반응과 유사할 수 있다. 유사한 방식으로, [attB1-K|TRBV-L1UE} 패널을 사용하여 하부 가닥을 트리밍할 수 있다(도 7a, 화살표 (2)). 서열 [P2A-3A} 및 [attB1-K}를 갖는 프라이머를 사용한 추가의 PCR 증폭은 평활-말단 dsDNA를 생성할 수 있다(도 7a, 화살표 (3)). 이 실시예에서 트리밍 후, UTR 서열이 트리밍되었으므로 [TRAUTR-L-VDJmC}는 [TRAL-VDJmC}가 되고; TRB도 마찬가지이다.
이어서, PCR 생성물은 [TRBL-VDJmC*}의 하류에서 ds[Lox66|P2A-5}(후술 참조)로 불리는 또 다른 dsDNA와 융합될 수 있다(도 7b, 화살표 (4)). 이는 도 6a의 화살표 (2)-(3)에 대해 기재된 것과 유사한 과정을 이용하여 달성될 수 있다.
이어서, 융합된 dsDNA는 도 6a의 화살표 (4)에 대해 기재된 것과 유사한 과정을 이용하여 원형화될 수 있다(도 7b, 화살표 (5)). 원형화 후, [P2A-5}는 [P2A-3A}에 리게이션되어 [P2A}의 정확한 서열을 가질 수 있는 [P2A-5|P2A-3A}를 형성할 수 있다. 원형화된 DNA는 TRA와 TRB 사이의 파손점에서 선형화될 수 있다(도 7b, 화살표 (6)). 이는, 예컨대 본원에서 기재되는 바와 같이 프라이머 [TRAC-5A*} 및 [TRBC-5A*}를 사용하여 원형화된 DNA를 PCR- 증폭함으로써 달성될 수 있다. 이 선형화된 생성물은 [TRBL-VDJmC}의 상류에서 ds[Lox71*|FF*|TRBC-3*}와 융합할 수 있다(도 7c, 화살표 (7)). 여기에서 TRBC-3은 [TRBC-5A}의 하류에 있는 TRBC(참조: 인간의 경우, TRBC1 또는 TRBC2일 수 있음)의 서열이고, FF는 유연한 링커가 뒤따르는 푸린-절단 부위인 폴리펩티드 서열을 코딩한다. Lox66 및 Lox71은 비가역성 재조합을 겪는 한 쌍의 Cre-재조합 부위이다. [TRBL-VDJmC|TRBC-3}는 TRB의 전장 서열이므로, [TRBL-VDJmC|TRBC-3}를 [TRBL-VDJ|TRBC}로 다시 쓸 수 있으며. 여기서 [TRBL-VDJ}는 L 영역의 시작 코돈부터 재배열된 VDJ 분절까지의 TRB의 서열이고, TRBC는 TRBC의 서열이다(도 7c의 수직 "=" 기호 참조).
상기 융합된 생성물을 Cre 리컴비나제로 처리하면 Lox66과 Lox71 사이의 DNA 서열이 역전되어 이중-돌연변이 Lox 부위 [dmLox} 및 [LoxP} 부위가 형성될 수 있다(도 7c, 화살표 (8)). [Lox66} 및 [Lox71}의 서열은 전환 후 FF, dmLox 및 P2A가 정지 코돈 없이 인-프레임으로 연결되도록 설계되었다(도 7d에서 화살표 (8) 이후의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 참조).
이 역 생성물은 [attB1-K} 및 [TRAC-5A*}로 PCR-증폭될 수 있으며, PCR 생성물은 벡터 골격으로 클로닝될 수 있다(도 7d, 화살표 (9)). 골격은 TRAC를 완성하기에 충분한 서열을 가질 수 있으며, 또한 프로모터, 종결자 및 상술된 바와 같은 벡터의 기능에 필요한 다른 요소를 가질 수 있다.
실시예 5: 헤드-대-테일 융합된 이분 면역수용체 폴리뉴클레오티드를 바이시스트로닉 면역수용체 발현 벡터로 전환
실시예 2에 기재된 방법에 의해 생성된 헤드-대-테일 융합 TCR 유전자(이의 서열 구축은 도 8a에 기재됨)는 이전 실시예와 유사한 전략을 이용하여 TCR 발현 벡터로 전환될 수 있다. 명명 규칙은 실시예 4와 동일하다. 먼저, 융합된 TCR 유전자는 통상적인 중첩 PCR 또는 도 6a의 화살표 (2) - (3)에 대해 기재된 다른 방법을 이용하여 ds[TRBC-3|P2A-5}(도 8a, 화살표 (1))와 융합될 수 있다. 이 융합은 [TRBL-VDJ}의 하류에 완전한 TRBC 서열을 생성한다(도 8a에서 수직 "=" 기호). 이 융합된 생성물은 상술된 바와 같이 원형화될 수 있고(도 8a, 화살표 (2)), 프라이머 [attB1-K} 및 [TRAC-5A*}를 사용한 PCR 증폭에 의해 선형화될 수 있다(도 8b, 화살표 (3)). 선형화 생성물은 상술된 바와 같이 벡터 골격으로 클로닝되어 TRAC 서열을 완성하고 다른 필요한 요소를 가져올 수 있다(도 8c).
실시예 6: OE-PCR을 이용한 쌍을 이룬 TCR 클로닝
실시예 1 및 2는 USER 매개된 점착 말단 생성 및 리게이션을 이용하여 사전 증폭된 TRA 및 TRB를 융합하는 방법을 기재한다. 대안적으로, 사전 증폭된 TRA 및 TRB는 중첩 연장 PCR(OE-PCR)을 이용하여 융합될 수 있다. 일부 경우에서, 내부 프라이머(예컨대, 실시예 1의 프라이머 1R 및 2R 또는 실시예 2의 프라이머 ht1R 및 ht2F)를 제거하면 융합이 용이해질 수 있다. 내부 프라이머의 제거는 전술된 바와 같이 달성될 수 있다. 다른 경우에서, 내부 프라이머를 제거하지 않고 OE-PCR을 수행할 수 있다. 이들 경우에서, 사전 증폭 생성물은 확산 제한될 필요가 없다. 따라서, 외부 프라이머(예컨대, 실시예 1의 pTSO 또는 실시예 2의 [Adpt1} 및 [TRBC-5A*})가 ARS에 연결될 필요가 없다.
도 9a 및 9b는 OE-PCR을 이용하여 테일-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 방법을 기재한다. 단계 1 내지 3은 실시예 1과 동일하다(도 9a, 화살표 (1)). 단계 4에서, 시약 교환을 적용하여 고농도의 pTSO(예컨대, 400 nM), 저농도의 프라이머 1R 및 2R(예컨대, 각각 80 nM), 열안정성 DNA 폴리머라제, 및 PCR 버퍼를 아가로스 비드에 전달할 수 있다(도 9a, 화살표 (2)). 아가로스 비드는 교반 방법을 이용하여 세제 함유 플루오로카본 오일로 재유화될 수 있다(도 9b, 화살표 (3)). 이어서, OE-PCR 열순환 프로그램을 이용하여 에멀젼 PCR을 수행할 수 있다. 열순환 프로그램은 3 단계를 가질 수 있다. 제1 단계의 목표는 TRA 및 TRB를 증폭시키는 것이다. 제2 단계의 목표는 pTSO를 프라이머로 사용하여 TRA 및 TRB의 센스 서열 뿐만 아니라 3' 말단 중첩 영역을 갖는 ssDNA 생성물을 생성하는 것이다. 제3 단계의 목표는 ssDNS 생성물을 융합하는 것이다.
도 10a 및 10b는 OE-PCR을 이용하여 헤드-대-테일 배향으로 TRA 및 TRB를 융합하는 방법을 기재한다. 단계 1 내지 4는 실시예 2와 동일하다(도 10a, 화살표 1) 내지(3)). 단계 5에서, 시약 교환을 적용하여 고농도의 외부 프라이머 [AdptA} 및 [TRBC-5A*}(예컨대, 각각 400 nM), 저농도의 프라이머 1R 및 2R(예컨대, 각각의 80 nM), 열안정성 DNA 폴리머라제 및 PCR 버퍼를 아가로스 비드에 전달할 수 있다(도 10b, 화살표 (4)). 이어서, OE-PCR은 상술된 바와 같이 수행될 수 있다(도 10b, 화살표 (5)).
실시예 7: 프라이머 변형된 아가로스
프라이머 변형된 아가로스를 제조하는 2가지의 예시적 방법이 본원에 제공된다. 제1 방법에서, 약 4% 아가로스 및 100 내지 500 mM의 과요오드산나트륨(NaIO4)을 함유하는 용액을 70℃에서 제조하였다. 70℃에서 잠깐 인큐베이션한 후, 용액을 볼텍싱하여 계면활성제 함유 오일로 유화시켰다. 안정한 유중수 에멀젼을 제조하기 위해 당업계에서 사용되는 사실상 어떠한 계면활성제 함유 오일도 여기서 사용될 수 있다. 에멀젼을 얼음 상에서 약 20분 동안 인큐베이션한 다음 20% 내지 100% PFO를 사용하여 해유화시켰다. 생성된 아가로스 비드 현탁액을 물에서 세척하고, 원심분리 및 상청액 제거에 의해 패킹하고, 다시 용융시키고 0.1 내지 1 mm 나트륨 시아노보로히드라이드(NaCNBH3)의 존재 하에 아민-표지된 RT 프라이머를 함유하는 동일한 부피의 용액과 혼합하였다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 용액을 상술된 바와 같이 유화시키고, 얼음 상에서 인큐베이션하고, 해유화시키고, 세척하여 공유적으로 부착된 RT 프라이머를 갖는 2% 아가로스 비드의 현탁액을 생성하였다. 고정된 RT 프라이머의 농도는 DNA-결합 염료 또는 RT 프라이머에 상보적인 형광-표지된 올리고뉴클레오티드로 염색하여 측정될 수 있다. 100 nM 내지 10 μM의 고정된 RT 프라이머를 갖는 아가로스 비드를 수득하였다.
제2 방법에서, RT 프라이머는 선형 폴리아크릴아미드에 공유 결합되었다. 이를 위해, 먼저 아크릴아미드와 N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 히드로클로라이드를 공중합하여 아민 변형된 선형 폴리아크릴아미드를 제조한 후, NHS-아지드 및 DBCO 변형된 프라이머와 반응시켰다. 프라이머 변형된 선형 폴리아크릴아미드를 상술된 바와 같이 2% 아가로스와 혼합하고, 유화시키고, 얼음 상에서 인큐베이션하고, 해유화시키고, 세척하였다.
많은 상표명으로 아가로스의 많은 소스가 있다. 겔화 온도는 다양할 수 있으며 변형은 겔화 온도에 영향을 미칠 수 있다. 품질 관리 단계로서, 생성된 프라이머 변형된 아가로스는 약 37℃에서 용융 상태를 유지하고 실온에서 겔화 상태를 유지하도록 제어될 수 있다.
실시예 8: 말초 T 세포로부터 헤드-대-테일 방식으로 TCR 알파 및 베타 쇄를 물리적으로 연결 및 NGS 기반 특징규명
건강한 공여자의 말초 T 세포를 사용하여 (헤드-대-테일 배향으로) 물리적으로 연결되고 자연적으로 쌍을 이룬 TCR(즉, 융합된 TCR 폴리뉴클레오티드)의 DNA 라이브러리를 제조하였다. 전형적인 실행에서, 세포 현탁액(CS)은 하기 구성 요소를 혼합하여 생성되었다: 말초 T 세포(전형적인 최종 농도 1000 내지 5000개 세포/μL), 하나는 인간 TRAC mRNA를 표적으로 하고 다른 것은 인간 TRBC mRNA를 표적으로 하는 2개의 RT 프라이머를 포함하는 1% 프라이머 변형된 아가로스(이 실시예에서: TRBC 표적화 RT 프라이머는 TRBC1 및 TRBC2를 구별하지 않음), 및 PBS.
하기 성분을 포함하는 시약 완전 혼합물(Reagent Complete Mix: RCM)로 불리는 용액을 제조하였다: 1% 아가로스, SSIV 반응 버퍼(제조업체의 유닛-정의 시험에 따라 제조됨), 막시마 H 마이너스(Maxima H Minus) 역전사효소(최종 농도: 5 내지 50 U/μL), Q5 DNA 폴리머라제(최종 농도: 0.02 내지 0.2 U/μL), SYBR 골드(최종 농도: 제조업체에 의해 정의되는 바와 같이 1x), dNTP(각각 0.1 내지 1 mM), RNaseOUT(최종 농도: 스톡으로부터 10x 희석됨), [AdptB|CDSTRB} 패널(최종 농도: 각각 1 내지 5 nM), 및 [AdptB|CDSTRB} 패널(최종 농도: 각각 1 내지 5 nM).
[AdptA|CDSTRA} 및 [AdptB|CDSTRB} 패널을 제조 시, 각각의 프라이머는 먼저 차단제A/B 및 V-특이적 차단제(VSB)로 불리는 추가의 차단제와 어닐링될 수 있다. VSB는 상응하는 CDSTRA 또는 CDSTRB 영역의 3' 부분에 대해 상보적일 수 있지만 상응하는 CDSTRA 또는 CDSTRB 영역보다 10 내지 15 nt가 더 짧다. 즉, 각각의 [AdptA|CDSTRA} 및 [AdptB|CDSTRB}의 3' 말단은 VSB로 평활 말단을 형성할 수 있다. 3’VSB는 또한 VSB가 연장 가능하지 않도록 변형될 수 있다.
전형적인 실행에서, RCM 및 CS를 표준 2-입구 액적-생성 미세유체 칩(예컨대, 문헌(Zilionis et al., 2017 Nature Protocol doi:10.1038/nprot.2016.154)의 히드로겔 비드 생성 디바이스)의 2개의 임포트(import)에 동일한 유속으로 주입하여 약 30 내지 70 μm 직경의 액적을 생성하였다. 열안정성 계면활성제 함유 플루오로카본 오일(예컨대, RAN 008-FluoroSurfactant-2wtF, RAN 008-FluoroSurfactant-5wtH 또는 Bio-Rad 액적 오일)이 오일 상으로 사용될 수 있다. 도 11a는 액적 생성 과정의 스냅샷을 보여준다. 생성된 에멀젼을 50℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션하는 동안, SYBR 골드는 프라이머 및 세포 핵을 염색할 수 있으므로, 에멀젼의 작은 부분을 형광 현미경으로 검사할 수 있다. 예시적인 이미지가 도 11b에 제공된다. 11B. 이어서, 에멀젼은 93℃에서 2분, 65℃에서 20분, 72℃에서 1분 동안 인큐베이션되었다. 30초 동안 93℃, 1분 동안 60℃, 1분 동안 72℃, 1분 동안 80℃의 5 내지 8회 사이클을 추가할 수 있다.
이어서, 에멀젼을 냉각시켜 아가로스 겔 비드를 형성하고, 충분한 양의 20% PFO와 함께 인큐베이션함으로써 해유화시켰다. 아가로스 겔 비드를 Low-EDTA TE에서 세척한 다음, 프라이머 AdptA, ht1R, ht2F 및 TRBC-5A*(도 10a 및 10b에 기재됨) 뿐만 아니라 핫-스타트 KOD, 시판 KOD 반응 버퍼, 및 비드 현탁액을 형성하기에 충분한 dNTP와 혼합하였다. 비드 현탁액을 DropSeq 또는 inDrop 칩(예컨대, 문헌(Zilionis et al., 2017 Nature Protocol doi:10.1038/nprot.2016.154)의 세포 캡슐화 디바이스)의 수상 입구에 주입하였다. 비드를 제외한 비드 현탁액의 모든 성분을 함유하는 캐리어 용액을 다른 수상 입구(들)에 주입하였다. 대부분의 액적에 0 또는 1개의 아가로스 비드만 있도록 비드 현탁액 및 캐리어 용액의 유속을 조정하였다. 이전과 동일한 계면활성제 함유 플루오로카본 오일이 여기서 오일상으로 사용되었다. 도 12는 아가로스 비드를 함유하는 액적이 강조된 전형적인 에멀젼의 현미경 이미지를 보여준다.
에멀젼은 OE-PCR 열순환 프로그램에 적용되었다. OE-PCR 열순환 프로그램의 예는 하기와 같다: 2분 동안 93℃, [15초 동안 93℃, 30초 동안 63℃, 1분 동안 70℃]의 35회 사이클, 3분 동안 70℃. 이어서, 에멀젼을 20% PFO를 사용하여 해유화시키고, SPRI-정제한 다음, AdptA 및 TRBC-5A*의 네스티드(nested) 버전을 사용하여 추가로 증폭시켰다. 증폭 생성물은 (헤드-대-테일 배향으로) 물리적으로 연결된 자연적으로 쌍을 이룬 TCR의 DNA 라이브러리로 간주될 수 있다. 이 라이브러리의 각각의 구성원은 도 13-(1)에 표시된 구조를 가지며, 여기서 1F 및 2F는 각각 어댑터 서열 AdptA 및 AdptB이고, AC-5 및 BC-5는 각각 TRAC 및 TRBC의 5' 분절이다. 증폭 생성물을 넥스테라(Nextera) XT 키트로 가볍게 처리하여 TRAV 서열의 일부를 제거한 다음(PCR 생성물을 과도하게 절단하지 않음, 도 13-(2) 참조), 네스티드 TRBC-5A* 및 넥스테라 어댑터(Tn5MEA 또는 Tn5MEB)를 표적으로 하는 또 다른 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 아가로스 겔 상에서 분해하고, 길이가 650 bp 내지 800 bp인 DNA 단편을 회수하고, 도 13-(3)에 나타낸 전략을 이용하여 MiSeq(600-사이클 키트)를 사용하여 분석하였다.
이러한 단편화 및 크기-선택 전략을 이용하면, 쌍을 이룬 말단 판독의 상당 부분은 MiXCR 소프트웨어 패키지를 사용하여 TRAV, TRAJ, TRBV, TRBJ 유전자 뿐만 아니라 물리적으로 연결된 동일한 분자의 CDR3α 및 CDR3β 서열을 확인하기에 충분한 정보를 함유한다. 전형적인 NGS 실행에서, TCR 알파 쇄(TRA) 서열은 1000 내지 100,000개의 클론으로 클러스터링될 수 있다(인풋 세포 수 및 판독 깊이에 따라 다름). 마찬가지로, TCR 베타 쇄(TRB) 서열은 1000 내지 100,000개의 클론으로 클러스터링될 수 있다. TRA 및 TRB 클론에 대해 매핑된 판독만 유지되었다는 것에 주목한다. 나머지는 무시되었다.
각각의 행이 TRA 클론이고 각각의 열이 TRB 클론인 M0로 불리는 수치 매트릭스가 생성될 수 있으며, 매트릭스의 요소(i,j)의 값은 Read1 서열이 i 번째 TRA 클론에 매핑되고 Read2 서열이 j 번째 TRB 클론에 매핑된 판독의 총 수를 나타낸다. M0 매트릭스의 일부에 대한 히트 맵 시각화가 도 14에 도시되어 있다.
하나의 TRA 클론이 주로 하나의 TRB 클론과 쌍을 이루는지 여부 및 하나의 TRB 클론이 주로 하나의 TRA 클론과 쌍을 이루는지 여부에 액세스하기 위해, 시퀀싱 데이터세트에서 3개의 TRA 클론을 무작위로 선택하였으며(도 15a-c), 모든 TRB 클론과의 쌍형성의 판독 카운트를 플로팅하였다. 이들 TRA 클론 각각은 주로 하나의 TRB 클론과 쌍을 이룬다는 것을 알 수 있다. 무작위로 선택된 3개의 TRB 클론에 대해서도 마찬가지이다(도 15d-f).
무작위로 선택된 클론을 넘어서 전체적인 관점을 제공하기 위해, 각각의 TRA 클론에 대해(즉, M0 매트릭스의 각각의 행에 대해), 상위 1, 2 또는 3개 쌍에 의해 기여된 분율 판독을 계산하였다. 이러한 부분을 각각 FTop1, FTop2 및 FTop3으로 칭한다. TRA 클론 #148을 예로 사용하여(도 15a), 총 1581개의 판독이 TRA 클론에 매핑되었으며, 이 중 1349개의 판독은 TRB 클론 #73에 매핑되었고, 175개의 판독은 TRB 클론 #218에 매핑되었고, 57개의 판독은 TRB 클론 #985에 매핑되었고, 다른 TRB 클론에는 매핑되지 않았다. 따라서, FTop1(TRA#148) = 1349/1581 = 0.85, FTop2(TRA#148) = (1349+175)/1581 = 0.96, FTop3(TRA#148) = (1349+175+57)/1581 = 1. 이 방법을 이용하면 모든 TRA 클론을 FTop1 값으로 순위를 지정할 수 있다. 각각의 TRA 클론의 내림차순 순위 및 상응하는 FTop1 값을 플로팅할 수 있다(도 16a, 데이터 시리즈 A1). 마찬가지로, TRA 클론은 FTop2 값으로 순위를 매길 수 있다. 각각의 TRA 클론의 내림차순 순위 및 상응하는 FTop2 값을 플로팅할 수 있다(도 16a, 데이터 시리즈 A2). 마찬가지로, TRA 클론은 FTop3 값으로 순위를 매길 수 있다. 각각의 TRA 클론의 내림차순 순위 및 상응하는 FTop3 값을 플로팅할 수 있다(도 17a, 데이터 A3). 이들 플롯에서 원의 크기는 이 TRA 클론에 매핑된 총 판독 카운트를 반영한다. 유사한 플롯이 TRB 클론에 대해 만들어 질 수 있으며(도 16b), 데이터 시리즈 B1, B2, B3은 각각 FTop1, FTop2 및 FTop3의 순위 순서 및 값을 나타낸다. TRA 클론의 절반 초과에 대해, 판독의 70% 초과가 단일 쌍에 의해 기여된다는 것을 알 수 있다. TRB 클론에 대해서도 동일한 결론을 내릴 수 있다.
전체 라이브러리에 걸친 쌍형성 정확도를 반영하는 메트릭(metric)이 생성될 수 있다. 도미넌트 쌍은 기본 쌍일 가능성이 더 높으므로, 도미넌트 쌍에 의해 기여되는 판독 분율을 계산할 수 있다. 일부 클론이 다른 클론보다 더 잘 표시된다는 점을 고려하면서 도미넌트 쌍을 정의하기 위해, 매트릭스 M0을 정규화하여 매트릭스 M1을 생성하였다. M1은 M0과 치수가 같다. M1의 각각의 요소 값은 하기와 같이 계산된다:
Figure 112021042321391-pct00001
따라서, M1의 모든 값은 0과 1 사이이다. M1 i,j 가 사전 결정된 임계값(도미넌스 임계값을 칭함)보다 큰 경우, 쌍은 도미넌트로 정의될 수 있다. 예상된 바와 같이, 도미넌스(dominance) 임계값이 증가함에 따라 도미넌트 쌍의 수가 감소한다(도 17a). 마찬가지로, 도미넌트 쌍에 의해 기여되는 판독의 분율은 도미넌스 임계값이 증가함에 따라 감소한다(도 17b, 실선). 이 예시적인 라이브러리의 경우, 도미넌스 임계값이 0.7이면 297개의 도미넌트 쌍이 확인되었으며, 모든 판독의 63%가 이들 도미넌트 쌍에 의해 기여되었다. 대조군으로서, 시퀀싱 데이터로부터의 TRA-TRB 쌍형성이 무작위로 재편되는 경우, 도미넌트 쌍에 의해 기여되는 판독의 분율은 거의 0%이다(도 17b, 점선).
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 명세서 내에 제공된 특정 예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 상술된 명세서를 참조하여 설명되었지만, 본원에서 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되는 것을 의미하지 않는다. 이제 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변형, 변경 및 대체가 당업자에게 발생할 것이다. 또한, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본원에 기재된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 또한 임의의 이러한 대안, 변형, 변경 또는 등가물을 포함할 것으로 예상된다. 하기의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위 내의 방법 및 구조물 및 그들의 균등물이 이에 의해 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ROOTPATH GENOMICS, INC. <120> HIGH THROUGHPUT CLONING OF PAIRED BIPARTITE IMMUNORECEPTOR POLYNUCLEOTIDES AND APPLICATIONS THEREOF <130> 53563-704.601 <140> PCT/US2019/046170 <141> 2019-08-12 <150> 62/823,831 <151> 2019-03-26 <150> 62/818,355 <151> 2019-03-14 <150> 62/732,898 <151> 2018-09-18 <150> 62/725,842 <151> 2018-08-31 <150> 62/718,227 <151> 2018-08-13 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Enterokinase cleavage site <400> 1 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Factor Xa cleavage site <400> 2 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Thrombin cleavage site <400> 3 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Renin cleavage site <400> 4 His Pro Phe His Leu Val Ile His 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Caspase protease cleavage site <400> 5 Asp Glu Val Asp 1 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 cgggaaagca ga 12 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ttgagaatca aaatcggtga ata 23 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 tgtgcacctc cttccc 16 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 9 aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg 30 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 gcagtggtat caacgcagag tac 23 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 gaccctgccg tgtaccag 18 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 tgtgtttgag ccatcagaag cagag 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic primer <400> 13 agcagagcug guacacggca gggtc 25 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic primer <400> 14 accagctcug cutctgatgg ctcaaacaca 30 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 gcgacgaatt ttagtttgct taagcaagcc ggagatgtgg aggaaaatcc tggaccg 57 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 acaagtttgt acaaaaaagc aggcttacc 29 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 ctctgcttct gatggctcaa acaca 25 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 gaccctgccg tgtaccagc 19 <210> 19 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(72) <400> 19 aga gcc aaa aga agt ggt tct ggc tac cgt tcg tat agc ata cat tat 48 Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Tyr Arg Ser Tyr Ser Ile His Tyr 1 5 10 15 acg aac ggt agc gcg acg aat ttt 72 Thr Asn Gly Ser Ala Thr Asn Phe 20 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Tyr Arg Ser Tyr Ser Ile His Tyr 1 5 10 15 Thr Asn Gly Ser Ala Thr Asn Phe 20 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30

Claims (198)

  1. 복수의 표적 반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 방법으로서,
    (a) 복수의 TCR을 발현하는 복수의 세포를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 복수의 세포의 각 세포는 복수의 TCR 중 하나의 TCR을 발현하고, 복수의 TCR은 대상체로부터의 샘플로부터의 적어도 50개의 상이한 동족 쌍을 포함하고 복수의 TRAV 유전자 또는 복수의 TRBV 유전자로부터의 V 영역을 포함하며, 적어도 50개의 상이한 동족 쌍의 각 동족 쌍은 TCR 베타(TCRβ) 쇄와 쌍을 이룬 TCR 알파(TCRα) 쇄를 포함하고, 복수의 TCR은 복수의 세포에 대해 외인성인 단계;
    (b) (a)의 복수의 세포를 포함하는 혼합물을, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 복합체를 형성하는 하나 이상의 표적 펩티드 항원과 접촉시키는 단계로서, 복수의 표적 반응성 TCR을 발현하는 복수의 세포의 서브세트가, MHC 분자와 복합체를 형성하는 하나 이상의 표적 펩티드 항원에 결합하는 것인 단계; 및
    (c) 복수의 표적 반응성 TCR 중 적어도 2개의 표적 반응성 TCR을 발현하는, (b)의 복수의 세포의 서브세트의 적어도 2개의 세포를 확인하여, 복수의 표적 반응성 TCR 중 적어도 2개의 표적 반응성 TCR을 확인하는 단계
    를 포함하는, 복수의 표적 반응성 TCR을 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 복수의 TRAV 유전자 또는 복수의 TRBV 유전자가 적어도 10개의 상이한 TRAV 유전자 또는 TRBV 유전자를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 복수의 세포가 대상체로부터의 샘플로부터 단리된 것이고, 샘플이 조직 샘플, 혈액 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 또는 이들의 조합인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 복수의 TCR이 적어도 100개의 상이한 동족 쌍을 포함하고, 적어도 100개의 상이한 동족 쌍의 각 동족 쌍은 TCRβ 쇄와 쌍을 이룬 TCRα 쇄를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, (b)는 복수의 세포를, MHC 분자와 복합체를 형성하는 하나 이상의 표적 펩티드 항원을 제시하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 하나 이상의 세포가 하나 이상의 종양 세포, 종양구, 종양 용해물 펄싱된 항원 제시 세포(APC) 또는 하나 이상의 표적 펩티드 항원을 제시하도록 조작된 APC인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 하나 이상의 표적 펩티드 항원을 제시하도록 조작된 하나 이상의 APC가 표적 펩티드 항원을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 하나 이상의 표적 펩티드 항원을 제시하도록 조작된 하나 이상의 APC가 대상체로부터의 MHC 분자를 외인적으로 발현하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 복수의 TCR이 탈진된 T 세포로부터의 TCR을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, MHC 분자가 MHC 사량체인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 표적 펩티드 항원의 서열 또는 아이덴티티가 알려지지 않은 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 표적 반응성 TCR을 발현하는 것으로 확인된 (b)의 복수의 세포의 세브세트의 적어도 2개의 세포 중 적어도 하나를 대상체에게 투여하는 단계, 또는 (b)의 복수의 세포의 세브세트의 적어도 2개의 세포 중 적어도 하나의 표적 반응성 TCR을 발현하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 복수의 세포의 각 세포가 리포터 유전자를 포함하고, 리포터 유전자는, 세포의 TCR이 하나 이상의 표적 펩티드 항원의 표적 펩티드 항원에 결합할 때 신호를 보내도록 조절되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, (c)에서의 확인이 리포터 유전자를 기반으로 적어도 2개의 세포를 선별하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, (c)에서의 확인이 세포 표면 마커의 발현을 기반으로 적어도 2개의 세포를 선별하는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, (c)에서의 확인이 칼슘 유입을 기반으로 적어도 2개의 세포를 선별하는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 복수의 세포가 세포주 세포인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 복수의 TCR이 적어도 100개의 상이한 VJ 조합을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 복수의 TCR이 질환 또는 병태를 갖는 대상체로부터의 샘플로부터의 TCR을 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 복수의 TCR이, 대상체로부터의 종양 침윤 림프구를 포함하는 샘플로부터의 TCR을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, (a) 이전에, 복수의 TCR의 각 TCR의 TCRα 쇄를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 TCRβ 쇄를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 물리적으로 연결하여, 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계; 및 복수의 융합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 복수의 세포 내에 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, (a) 이전에, 복수의 TCR을 시퀀싱하여 복수의 TCR의 동족 쌍을 확인하는 단계; 및 복수의 TCR의 동족 쌍을 코딩하는 서열을 복수의 세포 내에 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, (c)에서의 확인이, 복수의 표적 반응성 TCR 중 적어도 2개의 표적 반응성 TCR을 발현하는, 복수의 세포의 서브세트의 적어도 2개의 세포를 선별하여, 복수의 표적 반응성 TCR 중 적어도 2개의 표적 반응성 TCR을 선별하는 것을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 선별이, 표적 반응성 TCR을 발현하는 세포와 관련된 마커를 기반으로 표적 반응성 TCR을 발현하는 세포를 선별하는 것을 포함하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 선별이, (b)의 복수의 세포에서 표적 비반응성 TCR을 발현하는 세포로부터 표적 반응성 TCR을 발현하는 세포를 분리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 선별이, 표적 반응성 TCR을 발현하는 세포와 관련된 마커를 기반으로 (b)의 복수의 세포에서 표적 비반응성 TCR을 발현하는 세포로부터 표적 반응성 TCR을 발현하는 세포를 분리하는 것을 포함하는 것인 방법.
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