TWI764886B

TWI764886B - 轉染 t 細胞和 t 細胞受體用於癌症免疫治療

Info

Publication number: TWI764886B
Application number: TW106108700A
Authority: TW
Inventors: 多明尼克馬友若; 賽巴斯汀邦克; 里歐尼艾爾頓
Original assignee: 德商英麥提克生物技術股份有限公司
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2022-05-21
Also published as: MA43720A; EP3430030B1; AU2017235467A1; US20170267738A1; US10538573B2; EA201892021A1; MY189042A; GB201604492D0; WO2017158103A1; CR20180492A; CA3017502A1; KR20210063486A; KR102457504B1; JP7340127B2; TW201736396A; MA43330A1; CN108884136B; CN108884136A; KR20180118783A; KR102259109B1

Abstract

本說明書涉及結合腫瘤相關抗原(TIA)用於靶向癌細胞的T細胞受體(TCR)，表達該受體的T細胞，該受體製備方法，以及使用該受體治療癌症的方法。特別是，本說明書涉及與含肽(例如MAG-003)的HLA I類或II類分子結合的TCR及其變體，其具有KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。本說明書進一步涉及用於免疫治療方法的肽、蛋白質、核酸和細胞。特別是，本說明書涉及癌症的免疫療法。本說明書還涉及單獨使用或與其他腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應或體外刺激T細胞和轉入患者的疫苗複合物的活性藥物成分)聯合使用的腫瘤相關T細胞(CTL)肽表位。與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合的肽或與此同類的肽也可能是抗體、可溶性T細胞受體和其他結合分子的靶標。

Description

轉染T細胞和T細胞受體用於癌症免疫治療

本案揭示內容涉及用於癌症免疫治療的轉染T細胞和T細胞受體。

基於T細胞的免疫治療靶向作用于主要組織相容性複合體(MHC)分子提呈的來源於腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白的肽表位。這些腫瘤相關抗原(TAA)可以是源自所有蛋白類型的肽，如酶、受體、轉錄因子等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達通常上調。

細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的T細胞表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用，TCD8+能識別通常8至10個源自蛋白或位於細胞質的缺陷型核糖體產物(DRIP)的氨基酸殘基的主要組織相容性複合體(MHC)所載的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞抗原(HLA)。

MAGEA4是MAGEA基因家族的一員。MAGEA4蛋白和mRNA的表達與各種癌症的發展和預後有關。MAG-003肽，即KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)是MAGEA4(氨基酸286-294)的一種HLA-A*0201限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位。(Jia et al.2010；Wu et al.2011)中的內容通過引用整體併入本文。MAG-003在體外從HLA-A*0201陽性PBMC和在HLA-A*0201/Kb轉基因小鼠中引發特異性CTL。MAG-003誘導的CTL以HLA-A*0201限制性方式裂解靶細胞，證明MAG-003是HLA-A*0201限制性CTL表位。

MHC分子有兩類：MHC I類和MHC II類。肽和MHC I類的複合體由負載相應T細胞受體(TCR)的CD8陽性T細胞進行識別，而肽和MHC II類分子的複合體由負載相應TCR的CD4陽性輔助T細胞進行識別。由於CD8依賴型和CD4依賴型這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表徵腫瘤相關抗原和相應T細胞受體在開發癌症免疫治療(如：疫苗和細胞治療)中非常重要。

在MHC I類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些MHC-I類分子結合，而且它們之後還必須能被T細胞負載的特異性T細胞受體(TCR)識別。因此，TAA是基於T細胞療法(包括但不限於腫瘤疫苗和細胞療法)研發的起點。

在通過根據本說明書的特定TCR(例如，可溶性TCR或細胞表面TCR)和抗體或其他結合分子(複合體)靶向作用於肽-MHC的情況下，潛在肽的免疫原性是次要的。在這些情況下，提呈是決定因素。

雖然在開發用於癌症治療的分子靶向藥物方面取得了進展，但是，本領域仍然需要開發專門靶向作用於癌細胞高度特異性分子的抗癌新藥。本說明書通過提供特異性結合MAG-003的新型MAG-003 TCR、核酸、載體和宿主細胞來滿足需要；以及使用這些分子治療癌症的方法。

本說明書涉及包含α鏈和/或β鏈的T細胞受體(TCR)(「α/β TCR」)。在另一項實施方案中，本說明書涉及包含γ鏈和/或δ鏈的TCR(「γ/δ TCR」)。

本說明書還涉及TCR、單個TCR亞基(單獨或組合)及其亞結構域、可溶性TCR(sTCR)，例如可溶性α/β二聚體TCR，其在恒定結構域殘基之間至少有一個二硫鍵，所述殘基在天然TCR和克隆TCR中不存在，加工為自體或異體T細胞或T細胞祖細胞的所述TCR，製造這些TCR的方法以及載有所述TCR的其他細胞。

本說明書還涉及特異性結合MAG-003肽-HLA分子複合體的TCR，其中MAG-003肽選自KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)及其變體，如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：24中所示。在一實施方案中，HLA分子為HLA-A*02。

本說明書進一步涉及包含以下可變結構域的TCR：一種TCR α可變結構域，與表2所示的TCR α可變結構域具有至少75%、80%、90%、95%、98%或99%序列同一性，優選為90%序列同一性；TCR β可變結構域，與表2所示的TCR β可變結構域具有至少75%、80%、90%、95%、98%或99%序列同一性，優選為90%序列同一性。

在一實施方案中，該TCRα可變結構域具有至少一個與表2所示TCRα結構域相關的突變；和/或該TCRβ可變結構域具有至少一個與表2所示TCRβ結構域相關的突變。在一實施方案中，TCRα可變結構域和/或TCRβ可變結構域中包含至少一個突變的TCR對於MAG-003肽HLA分子複合體的結合親和力和/或結合半衰期至少是包含未突變TCRα結構域和/或未突變TCRβ可變結構域的TCR的兩倍。

本說明書的TCR α鏈可能進一步包含與表2所示的TCR α恒定結構域具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%或99%序列同一性的一種TCR α恒定結構域。本說明書的TCR β鏈可能進一步包含與表 2所示的TCR β恒定結構域具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%或99%序列同一性的一種TCR β恒定結構域。

本說明書的TCR α鏈可能進一步包含TCR α跨膜結構域和/或TCR α細胞內結構域。本說明書的TCR β鏈可能進一步包含TCR β跨膜結構域和/或TCR β細胞內結構域。

說明書進一步涉及包含表2中披露的一個或多個α鏈互補決定區(CDR)的TCR α鏈以及有與表2所示CDR相關的一個、兩個、三個或四個取代基的變體。進一步的說明為包含選自表2所示的CDR1、CDR2和CDR3中至少一個CDR的TCR α鏈。進一步的說明為包含表2所示的α鏈CDR3的TCR α鏈。

說明書進一步涉及包含表2中披露的一個或多個β鏈互補決定區(CDR)的TCR β鏈以及有與表2所示CDR相關的一個、兩個、三個或四個取代基的變體。進一步的說明為包含選自表2所示的TCR β鏈CDR1、CDR2和CDR3中至少一個CDR的TCR β鏈。進一步的說明為包含表2所示的β鏈CDR3的TCR β鏈。

說明書進一步涉及包含編碼本說明書中TCR的核苷酸序列的分離或重組核酸。在一實施方案中，說明書中的核酸編碼如表2所示的TCRα鏈和/或TCRβ鏈。

說明書進一步涉及如本文所述的包含編碼TCR α鏈、β鏈或兩者的核酸的重組表達載體。

說明書進一步涉及如本文所述的包含表達編碼TCR α鏈、β鏈或兩者的核酸的重組表達載體的分離宿主細胞。

說明書進一步涉及包含根據本說明書的重組表達載體的分離宿主細胞，優選為其中細胞是人細胞，優選為外周血淋巴細胞(PBL)，更優選為CD4或CD8陽性T淋巴細胞。

說明書進一步涉及包含該說明書的重組表達載體的分離PBL，其中所述PBL為CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。

該說明書進一步涉及包含本文所述的至少一個宿主細胞的細胞群。

說明書進一步涉及本說明書的TCR和宿主細胞用於治療增殖性疾病，如：非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊癌、膽管癌和食管癌。

在一方面，宿主細胞是用編碼說明書至少一種TCR的核酸轉染的CD8+ T細胞或CD4+ T細胞，其中TCR包含表2中披露的至少一個氨基酸序列。另一方面，此類宿主細胞用於免疫治療小細胞肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊癌、膽管癌和食管癌、優選為非小細胞肺癌。

說明書進一步涉及殺死或減少癌細胞數量的方法，其包括使癌細胞與本文所述的TCR、核酸、載體或宿主細胞接觸。還提供的是治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用本文所述的TCR、核酸、載體或宿主細胞。

另一方面，本說明書涉及包含根據以下通式I的氨基酸序列的MAG-003肽，例如一種分離的肽：X1X2LEHVVRX3(SEQ ID NO：25) 公式I其中X1選自氨基酸K和Y，X2選自氨基酸V、L和A，X3選自V、L、A和I，其中所述肽結合HLA I類或II類分子和/或誘導與所述肽或其藥用鹽交叉反應的T細胞。一方面，所述肽不是潛在的全長多肽。

優選的是選自SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1至少66%、優選至少77%、更優選至少88%同源(優選為至少77%或至少88%相同)的變體序列的序列，其中所述變體與HLA I類或II類分子結合和/或誘導與所述肽或其藥用鹽交叉反應的T細胞，其中所述肽不是潛在的全長多肽。

本說明書進一步涉及本說明書的一種肽，包含選自由SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1至少66%、優選至少77%、更優選至少88%同源(優選為至少77%或至少88%相同)的變體組成的組，其中所述肽或其變體的總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至14個氨基酸。

下表顯示了根據本說明書的實例肽及其各自的SEQ ID NO。一方面，表1中的肽可與HLA-A*02結合。另一方面，本文所述的TCR能夠結合或特異性結合表1中的一種或多種肽。

一方面，本說明書涉及通過本文所述的一種或多種肽治療增殖性疾病，如：非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊癌、膽管癌和食管癌。

特別優選的是本說明書的肽(單獨或組合)，其選自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24組成的組。更優選的是所述肽(單獨或組合)選自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24組成的組(見表1)並且其用於免疫治療非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、頭頸癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊癌、膽管癌和食管癌、優選非小細胞肺癌。

一方面，本說明書還涉及本說明的肽，其具有與HLA I類分子或更長形式的長度變體HLA II類分子結合的能力。

一方面，本說明書涉及本說明書中的肽，其中所述肽(每種肽)系由或基本系由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24的一個氨基酸序列組成。

本說明書進一步涉及本說明書的肽，其中所述肽被修飾和/或包含非肽鍵。

本說明書進一步涉及本說明書的肽，其中所述肽為融合蛋白的一部分，特別是與HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N-端氨基酸、優選為80個N-末端氨基酸融合，或與抗體(例如，樹突狀細胞特定抗體)或抗體的序列融合。

本說明書進一步涉及一種核酸，其編碼本說明書中的肽。本說明書進一步涉及本說明書中的核酸，其為DNA、cDNA、PNA、RNA或其組合物。

本說明書進一步涉及一種能表達和/或表達本說明書中核酸的表達載體。

本說明書進一步涉及本說明中的一種肽、本說明書中的一種核酸或本說明書中一種用於治療疾病和用於藥物的表達載體，特別是用於治療癌症。

本說明書進一步涉及與本說明書中肽或本說明書中所述肽複合體(含有MHC)特定結合的抗體以及製造這些抗體的方法。

本說明書進一步涉及含有本說明書中核酸或前述表達載體的一種宿主細胞。

本說明書進一步涉及本說明書中的宿主細胞，其為抗原提呈細胞，優選為樹突細胞。

本說明書進一步涉及配製本說明書中一種肽的一種方法，所述方法包括培養本說明書中的宿主細胞和從所述宿主細胞或其培養基中分離肽。

本說明書涉及一種根據本說明書的方法，其中所述抗原通過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達於合適抗原提呈細胞或人工抗原呈遞細胞表面的I或II類MHC分子，或該抗原通過四聚化被載入I或II類MHC四聚體/I或II類MHC複合單體。

本說明書進一步涉及本說明書中的方法，其中抗原提呈細胞由能表達或表達含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24、優選為含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所述肽的一個表達載體、或一個變體氨基酸序列組成。

本說明書進一步涉及以本說明書中的方法製造的啟動T細胞，其中所述T細胞有選擇性地識別一種細胞，該細胞表達含一種本說明書中氨基酸序列的多肽。

本說明書進一步涉及一種殺傷患者癌症或抑制細胞的方法，其中患者癌細胞異常表達含本說明書中任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者按本說明書中的方法製造的有效量T細胞。

本說明書進一步涉及本文所述的任何肽、本文所述的核酸、本文所述的表達載體、本文所述的細胞、本文所述的活化T淋巴細胞，本說明書中的T細胞受體、抗體或其他肽和/或肽-MHC結合分子作為一種藥劑或在製造藥劑中的用途。一方面，藥劑優選為具有抗癌活性。

優選情況為，所述藥劑為基於TCR、可溶性TCR或抗體的細胞治療藥物、疫苗或蛋白質。

本說明書進一步涉及本說明書中的用途，其中所述癌細胞為非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊癌、膽管癌和食管癌，優選為小細胞肺癌細胞。

本說明書進一步涉及一種基於本說明書中肽的生物標誌物，在此稱為「靶標」，其可用於診斷癌症，優選為非小細胞癌。所述標誌物可以肽本身過度提呈或相應基因過度表達。標誌物也可以用於預測治療成功的可能性，優選為免疫療法，最優選為靶向作用於該生物標誌物識別的相同靶標的免疫療法。例如，抗體或可溶性TCR可用於染色腫瘤切片以檢測是否存在相關肽與MHC複合。或者，抗體或可溶性TCR具有進一步的效應子功能，如免疫刺激域或毒素。

本說明書進一步涉及這些新靶標的用途，用於確定可識別至少一種所述靶標的TCR，優選為確定啟動T細胞的TCR。

本說明書還涉及這些癌症治療中新靶標的用途。

圖1顯示了健康組織和癌症中MAG-003肽提呈。

圖2-4顯示了癌症和健康組織中MAG-003的表達。

圖5-7顯示了在與載有MAG-003肽(SEQ ID NO：1)或同源但不相關的肽RABGAP1L-001(SEQ ID NO：91)、AXIN1-001(SEQ ID NO：92)、ANO5-001(SEQ ID NO：93)、TPX2-001(SEQ ID NO：94)、SYNE3-001(SEQ ID NO：95)、MIA3-001(SEQ ID NO：96)、HERC4-001(SEQ ID NO：97)、PSME2-001(SEQ ID NO：98)、HEATR5A-001(SEQ ID NO：99)或CNOT1-003(SEQ ID NO：100)或對照肽NYESQ1-001(SEQ ID NO：101)的靶細胞共孵育後，分別用TCR R7P1D5、R20P1H7和R10P2G12(表2)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+ T細胞中IFNγ的釋放。用源自兩個不同供體(右X軸上為供體1，左X軸上為供體2)的CD8+ T細胞獲得IFNγ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+ T細胞單獨或與無載靶細胞共孵育作為對照。

圖8顯示了MHC/MAG-003四聚體或用TCR R7P1D5、R20P1H7和R10P2G12(表2)的α和β鏈RNA分別電穿孔的CD8+ T細胞的MHC/NYESO1-001四聚體染色。與MHC/NYESO1-001複合體特異性結合的1G4TCR的RNA電穿孔的CD8+ T細胞和模擬電穿孔CD8+ T細胞作為對照。

圖9-11顯示了與載有MAG-003肽(SEQ ID NO：1)或SEQ ID NO：1第1-9位上的各種 MAG-003丙氨酸取代變體的靶細胞共孵育後，分別用TCR R7P1D5、R20P1H7和R10P2G12(表2)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+ T細胞中IFNγ的釋放。RNA電穿孔的CD8+ T細胞單獨或與載有對照肽NYESO1-001的靶細胞或無載靶細胞共孵育作為對照。用源自兩個不同供體(右X軸上為供體1，左X軸上為供體2)的CD8+ T細胞獲得IFN γ釋放資料。

圖12在分別與A-375黑素瘤細胞系、T98G膠質母細胞瘤細胞系和SK-BR-3乳腺癌細胞系共孵育後，用TCR(A)R7P1D5、(B)R20P1H7和(C)R10P2G12的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+ T細胞中IFN γ的釋放。RNA電穿孔的CD8+ T細胞單獨作為對照。

圖13對TCR R7P1D5、R10P2G12、R20P1H7、模擬物或對照TCR 1G4(SEQ ID NO：X)進行RNA編碼而轉染的T細胞與不同的原代人健康組織細胞(參見表13的縮寫詞)、靶向陰性腫瘤細胞系MCF-7和MAGEA4和NY-ESO1陽性細胞系A-375和NCI-H1755共同培養。TCR R7P1D5、R10P2G12、R20P1H7和1G4在T細胞中的表達通過使用RNA載體的電穿孔實現。人健康組織細胞培養物不會導致TCR R7P1D5、R10P2G12或R20P1H7顯著TCR介導的識別和T細胞活化。通過ELISA測量顯示E：T比1：1，每次20,000個細胞，經複製20小時後IFN-γ釋放平均值。誤差柱表示標準偏差。通過從TCR轉染T細胞中減去IFN-γ釋放量以及由於靶細胞和不表達相關TCR的T細胞共培養而導致的IFN-γ釋放量而使結果標準化。

圖14為以6種不同的慢病毒構建體(R71-R78)轉導之後，來自4個接受R7P1D5 TCR轉基因表達篩選的供體的累積數據。以流式細胞儀檢測CD3 +/CD8+ T細胞於通過轉導後96小時MHC/MAG-003四聚體結合細胞的比例。被MHC/MAG-003四聚體染色的非轉導T細胞(NT)和被MHC/NYESO1-001四聚體染色的1G4(NY-ESO1)TCR轉導T細胞各自代表陰性和陽性對照。細胞在活CD3+ CD8+群上進行門控。

圖15A為以表達MAGEA4的腫瘤細胞系A357以及MAGEA4陰性的腫瘤細胞系MCF-7進行共同培養後以IFNγ產生量方法所測得的R7P1D5 TCR轉導T細胞的效應反應。將編碼R7P1D5 TCR的R73慢病毒濃縮上清液轉染的T細胞與非轉導細胞(NT)進行比較，兩者皆來自4名健康供體的PBMC。結果以三次重複的平均值±SEM表示。圖15B為用降低濃度的MAG-003肽進行脈衝的T2靶細胞與源自2名健康供體(供體6及7)的PBMC的R7P1D5 TCR轉導(R73慢病毒)T細胞進行共同培養後的IFNγ反應。R73慢病毒轉導的T細胞。結果以轉導後96小時測量，三次重複的平均值±SEM表示。

圖16(A,B)為在4h Cr51釋放測定中以不同的E：T比對測得的抗表達MAGEA4的A375腫瘤細胞系的R7P1D5 TCR(R73慢病毒)轉導和非轉導T細胞(NT)的細胞毒性反應。結果以3-4次重複的平均值±SEM表示。(C)為來自5名供體的7種R7P1D5 TCR(R73慢病毒)轉導T細胞產物的組合資料，其顯示E：T比例為40：1時的表達MAGEA4(A375)以及MAGEA4陰性(MCF-7)腫瘤靶標的抗原特異性殺傷力。

本說明書涉及包含α鏈和/或β鏈的T細胞受體(TCR)(「α/βTCR」)。還提供了由MHC分子提呈時可與TCR和抗體結合的MAG-003肽。本說明書還涉及核酸、載體和用於表達TCR的宿主細胞和本說明書的肽；以及使用它們的方法。

因此，在第一方面，本發明的目的通過抗原識別構建體來解決，所述抗原識別構建體包含至少一個互補決定區(CDR)3，其與選自SEQ ID NO：44、52、60、68、76和84的氨基酸序列至少具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或優選為100%序列同一性。

根據本發明的抗原識別構建體優選為選自抗體或其衍生物或片段、或T細胞受體(TCR)或其衍生物或片段。本發明的抗體或TCR的衍生物或片段應優選為可保留母體分子的抗原結合/識別能力，特別是其如上所述的特異性和/或選擇性。此類結合功能可以通過如本文所定義的CDR3區的存在來保留。

在本發明的一實施方案中，本發明的TCR能夠以主要組織相容性複合體(MHC)I類依賴性方式識別TAA抗原。本文使用的「MHC I類依賴性方式」系指在MHC I類分子的背景中在結合TAA抗原時TCR引起免疫反應。MHC I類分子可以是本領域已知的任何MHC I類分子，例如HLA-A分子。在本發明的一項優先實施方案中，MHC I類分子為HLA-A*02分子。

本發明提供單鏈抗原識別構建體和雙鏈識別構建體。

在一實施方案中，該TCRα可變結構域具有至少一個與表2所示TCRα結構域相關的突變；和/或該TCRβ可變結構域具有至少一個與表2所示TCRβ結構域相關的突變。在一實施方案中，TCRα可變結構域和/或TCRβ可變結構域中包含至少一個突變的TCR對於TAA肽HLA分子複合體的結合親和力和/或結合半衰期至少是包含未突變TCRα結構域和/或未突變TCRβ可變結構域的TCR的兩倍。

本發明特別提供一種作為抗原識別構建體或其片段或衍生物的TCR。TCR優選為人TCR，其被理解為由人TCR基因座產生，因此包含人TCR序列。此外，本發明的TCR的特徵在於它源自人，並且特異性地識別如表1所述的本發明的TAA抗原。

本發明的另一項實施方案另外或替代地提供上述抗原識別構建體，其誘導免疫反應，優選為其中免疫反應的特徵在於干擾素(IFN)γ水準增加。

本發明的TCR可以為單鏈α或β，或γ和δ分子，或為由α和β鏈或γ和δ鏈兩者組成的雙鏈構建體。

最優選地，在一些另外的實施方案中，其中本披露是指包含本文公開的TCR鏈的任何一個、兩個或全部CDR1至CDR3區的抗原識別構建體(參見表2)，此類抗原識別構建體可能為優選，其包含本發明相應的CDR序列，其不超過三個、兩個、優選為僅一個修飾的氨基酸殘基。修飾的氨基酸殘基可能選自氨基酸插入、缺失或取代基。最為優先的情況是三個、兩個、優選為僅一個修飾的氨基酸殘基為相應CDR序列的第一個或最後一個氨基酸殘基。如果修飾是取代，則在一些實施方案中優選取代為保守的氨基酸取代。

本發明的TCR可以進一步包含源自任何合適物種的恒定區，如任何哺乳動物，例如：人、大鼠、猴、兔、驢或小鼠。在本發明的一項實施方案中，本發明的TCR進一步包含人恒定區。在一些優選實施方案中，本發明TCR的恒定區可例如通過引入異源序列、優選為小鼠序列來稍加修飾，這可能增加TCR的表達和穩定性。

在本發明的一項實施方案中，提供了嵌合TCR，其中所述TCR鏈包含來自多物種的序列。優選情況為，本發明的TCR可包含α鏈，其包含α鏈的人可變區和例如鼠TCR α鏈的鼠恒定區。

在一項實施方案中，本發明的TCR是由根據上述實施方案的人可變區和人恒定區組成的人TCR。

在一些實施方案中，抗原識別構建體被鼠源化或人源化。當將來自外來物種的氨基酸序列引入本發明的構建體時，使用這些術語。

本發明的TCR可能為單鏈TCR(scTCR)。本發明的scTCR應在一個多肽鏈中包含全部或部分α鏈序列和全部或部分β鏈序列，優選為通過肽接頭連接。scTCR可包含第一TCR鏈(例如，α鏈)的可變區的多肽和整個(全長)第二TCR鏈(例如，β鏈)的多肽，反之亦然。此外，scTCR可以任選地包含一個或多個將兩個或多個多肽連接在一起的接頭。例如，接頭可以是肽，其將兩個單鏈連接在一起，如本文所述。還提供了本發明的scTCR，其與人細胞因子如IL-2、IL-7或IL-15融合。

本發明的抗原識別構建體還可能以包含至少兩個scTCR分子的多聚複合體形式提供，其中所述scTCR分子各自與至少一種生物素部分或其他相互連接的分子/接頭融合，並且其中所述scTCR通過生物素-鏈黴親和素相互作用相互連接，以形成所述多聚體複合體。本領域已知的用於產生多聚體TCR的類似方法也是可能的並且包括在本披露資料中。還提供了更高級的多聚體複合體，其包含本發明兩種以上的scTCR。

為了本發明的目的，TCR是具有至少一個TCR α或γ和/或TCR β或δ可變結構域的部分。通常，它們包括TCR α可變結構域和TCR β可變結構域，或者TCR γ可變結構域和TCR δ可變結構域兩者。它們可能為α β/γ δ異源二聚體，也可能為單鏈形式。為了用於過繼療法，α β或γ δ異二聚體TCR可能例如被轉染為具有細胞質和跨膜結構域的全長鏈。如果需要，相應恒定結構域殘基之間可能存在引入的二硫鍵。

在一項優選的實施方案中，抗原識別構建體為人TCR或其片段或衍生物。人TCR或其片段或衍生物是一種TCR，其包含超過50%的相應人TCR序列。優選情況為，只有少部分TCR序列為人工來源或源自其他物種。然而，眾所周知，例如，人源的嵌合TCR在恒定區含有鼠源序列是有利的。因此，特別優選的是根據本發明的TCR，其在其恒定區的細胞外部分含有鼠序列。

因此，又為優選的是本發明的抗原識別構建體能夠以人白細胞抗原(HLA)依賴性方式、優選以HLA-A02依賴性方式識別其抗原。在本發明的上下文中，術語「HLA依賴性方式」系指抗原識別構建體僅在抗原肽由所述HLA提呈的情況下才與抗原結合。

在一項實施方案中，根據本發明的抗原識別構建體優選為誘導免疫反應，優選為其中免疫反應的特徵在於干擾素(IFN)γ水準增加。

本發明還提供了包含本文所述的任何TCR(或其功能變體)的功能部分的多肽，例如，選自實施例部分和表2中的任何一種TCR。本文所用的術語「多肽」包括寡肽，並且系指通過一個或多個肽鍵連接的氨基酸的單鏈。關於本發明的多肽，功能部分可以是包含TCR(或其功能變體)連續氨基酸的任何部分，其中部分條件是功能部分與TAA抗原特異性結合，優選為如表1中所公開。當使用與TCR(或其功能變體)相關時，術語「功能部分」系指本發明TCR(或其功能變體)的任何部分或片段，其中該部分或片段保留TCR(或其功能變體)的生物活性，其為母體TCR或其親代功能變體的一部分。功能部分包括，例如，保留與TAA抗原特異性結合的能力(以HLA依賴性方式)或以與母體TCR(或其功能變體)相似程度、相同程度或更高程度檢測、治療或預防癌症的TCR(或其功能變體)的那些部分。關於母體TCR(或其功能變體)，功能部分可以包括，例如，約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多母體TCR可變序列(或其功能變體)。

功能部分可以在該部分的氨基或羧基末端或兩個末端包含額外的氨基酸，其中在母體TCR或其功能變體的氨基酸序列中未發現額外的氨基酸。理想的情況是，額外的氨基酸不干擾功能部分的生物學功能，例如，特異性結合TAA抗原；和/或具有檢測癌症、治療或預防癌症等能力。更理想的是，與母體TCR或其功能變體的生物學活性相比，額外的氨基酸增強了生物學活性。

在一些情況下，本發明的構建體可能包含一個或兩個多肽鏈，其包含根據SEQ ID NO：39至86(CDR序列，恒定和可變區和全長序列)中任一項的一個序列或其功能片段，並且進一步包含其他氨基酸序列，例如，編碼免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，則本發明的蛋白質可以是融合蛋白。就此而言，本發明還提供了包含本文所述的至少一種本發明的多肽與至少一種其他多肽的融合蛋白。另一多肽可以作為融合蛋白的單獨多肽存在，或者可以作為與本文所述的本發明多肽之一在同一框架(串聯)表達的多肽存在。其他多肽可包括任何肽或蛋白質分子或其部分，包括但不限於免疫球蛋白、CD3、 CD4、CD8、MHC分子、CD1分子(例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等)。

融合蛋白可以包含本發明多肽的一個或多個拷貝和/或另一個多肽的一個或多個拷貝。例如，融合蛋白可包含本發明多肽和/或另一多肽的1、2、3、4、5個或更多個拷貝。製備融合蛋白的合適方法是本領域已知的，並且包括例如重組方法。在本發明的一些實施方案中，本發明的TCR(及其功能部分和功能變體)、多肽和蛋白質可以表達為單一蛋白，其包含連接α鏈和β鏈和連接γ鏈和δ鏈的連接肽。就此而言，本發明的TCR(及其功能變體和功能部分)、多肽和蛋白質包含本發明TCR可變區的氨基酸序列，並且可能進一步包含接頭肽。接頭肽可以有利地促進宿主細胞中重組TCR(包括其功能部分和功能變體)、多肽和/或蛋白質的表達。接頭肽可包含任何合適的氨基酸序列。單鏈TCR構建體的接頭序列是本領域公知的。此類單鏈構建體可進一步包含一個或兩個恒定結構域序列。在通過宿主細胞表達包括接頭肽的構建體後，接頭肽也可能被裂解，導致α和β鏈以及γ和δ鏈分離。

如上所述，本發明TCR的結合功能可能在抗體框架中提供。例如，本發明TCR的CDR序列，可能包括額外的3個、2個或1個N和/或C末端框架殘基，可以直接接枝到抗體可變重/輕鏈序列中。本文中使用了各種語法形式的術語「抗體」，系指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原結合位點或互補位的分子。此類分子也被稱為免疫球蛋白分子的「抗原結合片段」。本發明還提供了與本文所述的抗原特異性結合的抗體或其抗原結合部分。抗體可以是本領域已知的任何類型的免疫球蛋白。例如，抗體可以是任何同種型免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗體可以是單克隆或多克隆抗體。抗體可以是天然存在的抗體，例如從哺乳動物(例如，小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人等)中分離和/或純化的抗體。或者，抗體可以是基因工程化抗體，例如人源化抗體或嵌合抗體。抗體可以是單體或聚合體形式。

術語「抗體」包括但不限於基因工程化或其他修飾形式的免疫球蛋白，例如胞內抗體、嵌合抗體、完全人抗體、人源化抗體(例如由「CDR移植」產生)、抗體片段和異源偶聯抗體(例如雙特異性抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體等)。術語「抗體」包括cys雙價抗體和微型抗體。因此，本文提供的關於「抗體」或「抗體樣構建體」的每個實施方案也被視為雙特異性抗體、雙價抗體、scFv片段、嵌合抗體受體(CAR)構建體，雙價抗體和/或微型抗體，除非另有明確表示。如本文所公開的，術語「抗體」包括免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白片段的多肽，所述多肽能夠非共價、可逆地並以特異性方式結合相應的抗原，優選為本發明的TAA。示例性抗體結構單元包括四聚體。在一些實施方案中，全長抗體可由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一個「輕」和一個「重」鏈(通過二硫鍵連接)。抗體結構和同種型是本領域技術人員所熟知的(例如，Janeway's Immunobiology,9th edition,2016所述)。

公認的哺乳動物免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因(關於免疫球蛋白基因的更多資訊，參見國際免疫基因學資訊系統®Lefranc M-P et al,Nucleic Acids Res.2015 Jan；43(Database issue)：D413-22；和http：//www.imgt.org/)。對於全長鏈，輕鏈被分為κ或λ類。對於全長鏈，重鏈分為γ、μ、α、δ或ε類，其又分別限定免疫球蛋白類別，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每個鏈的N末端限定了主要負責抗原識別的約100至110個或更多個氨基酸的可變區。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指輕鏈和重鏈的這些區域。用於本發明時，「抗體」包括抗體及其片段的所有變體。因此，在該概念的範圍內，為具有相同、基本上相同或相似結合特異性的全長抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(scFv)、Fab、Fab'和這些片段的多聚體形式(例如，F(ab')2)。在一些實施方案中，抗體與本發明的肽TAA特異性結合。根據本發明的優選抗原識別構建體包括抗體重鏈，優選為其可變結構域，或其抗原結合片段和/或抗體輕鏈，優選為其可變結構域，或其抗原結合片段。類似地，二硫鍵穩定的可變區片段(dsFv)可以通過重組DNA技術製備，但本發明的抗體片段不限於這些示例性類型的抗體片段。此外，抗體或其抗原結合部分可以被修飾為包括可檢測的標記，例如放射性同位素、螢光團(例如，異硫氰酸螢光素(FITC)，藻紅蛋白(PE))、酶(例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶)和元素顆粒(例如，金顆粒)。在某些情況下，與SEQ ID NO：44、52、60、68、76和84中提供的CDR3序列相比，TCR CDR3序列可以略加修飾，但優選不超過3個氨基酸殘基，優選為僅兩個，最優選為僅一個氨基酸位置。優選地，抗體包含該CDR3，優選為該組合中所有的CDR1至CDR3區，如表2中本發明的TCR所示，在每種情況下與這些序列相比，獨立地可選地具有不多於三個或兩個、優選為一個氨基酸取代、插入和/或缺失基。

製備抗體的合適方法是本領域已知的。例如，標準雜交瘤方法描述於例如，Kohler and Milstein,Eur.J.Immunol,5,51 1-519(1976),Harlow and Lane(eds.),Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press(1988),and C.A.Janeway et al.(eds.),Immunobiology,8 Ed.,Garland Publishing,New York,NY(201 1)一文中。或者，其他方法，例如EBV雜交瘤方法(Haskard and Archer,J.Im-munol.Methods,74(2),361-67(1984)，和Roder et al,Methods Enzymol,121, 140-67(1986))和噬菌體載體表達系統(參見例如，Huse et al.,Science,246,1275-81(1989))都是本領域已知的。此外，在非人動物中產生抗體的方法描述於例如美國專利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美國專利申請公開號2002/0197266中。

本發明的一些實施方案也涉及作為可溶性TCR的TCR或其功能片段和多肽。用於本文時，術語「可溶性T細胞受體」系指天然TCR的異二聚體截短變體，其包含TCRα鏈和β鏈的細胞外部分，例如，通過二硫鍵連接，但是其缺乏天然蛋白質的跨膜和胞質結構域。術語「可溶性T細胞受體α鏈和可溶性T細胞受體β鏈序列」系指缺乏跨膜和胞質結構域的TCRα鏈和β鏈序列。可溶性TCRα鏈和β鏈的序列(氨基酸或核酸)可以與天然TCR中的相應序列相同，或者與相應的天然TCR序列相比，可以包含變體可溶性TCR α鏈和β鏈序列。本文所用的術語「可溶性T細胞受體」包括具有變體或非變體可溶性TCR α鏈和β鏈序列的可溶性TCR。這些變異可以在可溶性TCR α鏈和β-鏈序列的可變區或恒定區中，並且可以包括但不限於氨基酸缺失、插入、取代突變以及不改變氨基酸序列的核酸序列改變。在任何情況下本發明的可溶性TCR都保留其母體分子的結合功能。

定義

除非另有說明，否則本文使用的所有術語定義如下。

術語「T細胞受體」(縮寫TCR)是指一種異二聚體分子，其包含一個α多肽鏈(α鏈)和一個β多肽鏈(β鏈)，其中所述異二聚體受體能夠結合由HLA分子提呈的肽抗原。

術語「T細胞反應」是指由一種肽在體外或體內誘導的效應子功能的特異性擴散和啟動。對於MHC I類限制性細胞毒性T細胞，效應子功能可能為溶解肽脈衝的、肽前體脈衝的或天然肽提呈的靶細胞、分泌細胞因子，優選為肽誘導的干擾素-γ，TNF-α或IL-2，分泌效應分子，優選為肽誘導的顆粒酶或穿孔素，或脫顆粒。

本文所用「肽」這一術語，系指一系列氨基酸殘基，通常通過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。這些肽的長度優選為9個氨基酸，但至短可為8個氨基酸長度，至長可為10、11、12或13個氨基酸長度或更長，如果為MHC-II類肽時(本說明書肽的較長變體)，至長可為14、15、16、17、18、19或20個氨基酸長度或更長。

因此，「肽」這一術語應包括一系列氨基酸殘基的鹽，通常通過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。優選的情況是，鹽為肽的藥用鹽，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)鹽。必須注意的是，本說明書中肽的鹽與其體內狀態的肽基本上不同，因為該不是體內的鹽。

術語「肽」應也包括「寡肽」。本文使用的術語「寡肽」是指一系列氨基酸殘基，通常通過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。寡肽的長度對於本說明書來說並不十分關鍵，只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常，寡肽長度約小於30個氨基酸殘基，約長於15個氨基酸。

「多肽」這一術語是指一系列氨基酸殘基，通常通過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。多肽的長度對於本說明書來說並不十分關鍵，只要保持正確的表位即可。與術語肽或寡肽相對，多肽這一術語是指包含多於約30個氨基酸殘基的分子。

一種肽、寡肽、蛋白質或編碼該分子的核苷酸如果能誘導免疫反應，則具有「免疫原性」(因此是本說明書中的一種「免疫原」)。在本說明書的情況下，免疫原性的更具體定義是誘導T細胞反應的能力。因此，「免疫原」是一種能夠誘導免疫反應的分子，並且在本說明書的情況下，是一種能誘導T細胞反應的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽與MHC的複合體、和/或用於提高特異性抗體或TCR抗性的蛋白。

I類T細胞「表位」要求的是一種結合至MHC I類受體上的短肽，從而形成一種三元複合體(MHC I類α鏈，β-2-微球蛋白和肽)，其可以通過T細胞負載匹配T細胞受體與具有適當親和力的MHC/肽複合體結合來識別。結合至MHC I類分子的肽的典型長度為8-14個氨基酸，最典型為9個氨基酸長度。

編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來說，編碼肽、多肽以及本說明書蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調節元素的重組轉錄單元中被表達。

如本文所用的術語「肽的核苷酸編碼」系指對肽進行核苷酸序列編碼，其中該肽包括與將由用於產生TCR的樹突細胞或另一細胞系統所表達該序列的生物系統相容的人工(人造)啟動和停止密碼子。

如本文所用的術語「TCR的核苷酸編碼」系指對TCR進行一個或多個核苷酸序列編碼，其中該TCR包括與將由用於產生TCR的T細胞或另一細胞系統所表達該序列的生物系統相容的人工(人造)啟動和停止密碼子。

本文提到的核酸序列既包括單鏈核酸也包括雙鏈核酸。因此，除非本文另有所指，否則，例如對於DNA，具體的序列是該序列的單鏈DNA、該序列與其互補序列的雙工(雙鏈DNA)以及該序列的互補序列。

術語「編碼區」系指在基因的天然基因組環境中天然或正常編碼該基因的表達產物的那部分基因，即，體內編碼該基因的天然表達產物的區域。

編碼區可來自非突變(「正常」)基因、突變基因或異常基因，甚至還可以來自DNA序列，完全可在實驗室中使用本領域熟知的DNA合成方法合成。

術語「表達產物」系指多肽或蛋白質，它是基因和遺傳碼退化並因而編碼同樣的氨基酸所造成的任何核酸序列編碼同等物的翻譯產物。

術語「片斷」當指的是一種編碼序列時，表示包含非完整編碼區的DNA的一部分，其表達產物與完整編碼區表達產物基本上具有相同的生物學功能或活性。

術語「DNA片段」系指一種DNA聚合物，以單獨的片段形式或一種較大DNA結構的組分形式存在，它們從至少分離過一次的DNA中以基本純淨的形式獲得，即不含污染性內源性材料，並且獲得的數量或濃度能夠使用標準生化方法，例如使用克隆載體，進行識別、操縱和回收該片段及其組分核苷酸序列。此類片段以開放閱讀框架(未被內部未翻譯序列打斷)或內含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻譯DNA序列可能存在於開放閱讀框架的下游，在那裏其不會干預編碼區的操縱或表達。

術語「引物」表示一種短核酸序列，其可與一個DNA鏈配對，並在DNA聚合酶開始合成去氧核糖核酸鏈之處提供一個游離的3'-OH末端。

術語「啟動子」表示參與RNA聚合酶的結合從而啟動轉錄的DNA區域。

術語「分離」表示一種物質從其原來的環境(例如，如果是天然發生的則是天然環境)中被移走。例如，活體動物中的天然核苷酸或多肽不是分離的，但是，從天然系統中一些或所有共存物質中分離出來的核苷酸或多肽是分離的。另一方面，此類多核苷酸是載體的一部分和/或此類多核苷酸和多肽是一種組合物的一部分，並且由於該載體或組合物不是其天然環境的一部分，因此它仍然是分離的。

本說明書中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以「純化」的形式存在。術語「純化」並非要求絕對的純度；它只是一個相對的定義，可以包括高度純化或部分純化的製劑，相關領域技術人員能理解這些術語。例如，各個從已用傳統方法純化為具有電泳同質性的cDNA庫中分離出的各種克隆物。明確考慮到將起始材料或天然物質純化至少一個數量級，優選為兩或三個數量級，更優選為四或五個數量級。此外，明確涵蓋所述多肽的純度優選為99.999%，或至少為99.99%或99.9%；甚而適宜為以重量計99%或更高。

根據本說明書公開的核酸和多肽表達產物，以及包含此類核酸和/或多肽的表達載體可能以「濃縮的形式」存在。本文使用的術語「濃縮」是指材料的濃度至少是其自然濃度的大約2、5、10、100或1000倍，有優勢的是，按重量計為0.01%，優選為至少0.1%。也明確考慮到，按重量計約為0.5%、1%、5%、10%和20%的濃縮製劑。序列、構型、載體、克隆物以及包含本說明書的其他材料可有優勢地以濃縮或分離的形式存在。術語「活性片段」系指產生免疫反應的片段(即具有免疫原性活性)，通常是一種肽、多肽或核酸序列的片段，不論是單獨或可選地與合適的佐劑一起或在載體中給予一種動物，比如哺乳動物，例如兔子或小鼠，也包括人；這種免疫反應採用的形式是在接受動物(如：人)體內刺激T細胞反應。或者，「活性片段」也可用於誘導體外T細胞反應。

本文使用的「部分」(portion)、「節段」(segment)、「片段」(fragment)這幾個術語，當與多肽相關地使用時是指殘基的連續序列，比如氨基酸殘基，其序列形成一個較大序列的子集。例如，如果一個多肽以任一種肽鏈內切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)進行處理，則該處理獲得的寡肽會代表起始多肽的部分、節段或片段。當與多核苷酸相關地使用時，這些術語系指用任何核酸內切酶處理所述多核苷酸產生的產物。

根據本說明書，術語「等同度百分比」或「等同百分比」，如果指的是序列，則表示在待對比序列(「被對比序列」)與所述序列或請求項的序列(「參考序列」)對準之後將被對比序列與所述序列或請求項的序列進行比較。然後根據下列公式計算等同度百分比：等同度百分比=100[1-(C/R)]其中C是參考序列與被對比序列之間對準長度上參考序列與被對比序列之間的差異數量，其中(i)參考序列中每個堿基或氨基酸序列在被對比序列中沒有對應的對準堿基或氨基酸；(ii)參考序列中每個空隙，以及(iii)參考序列中每個對準堿基或氨基酸與被比對比序列中對準堿基或氨基酸不同，即構成一個差異以及(iv)必須在對準序列的第1位置開始對準；並且R是參考序列與被對比序列對準長度上在參考序列中產生任何空隙也計算為一個堿基或氨基酸的參考序列中的堿基或氨基酸數目。

如果「被對比序列」和「參考序列」之間存在的一個對準按上述計算的等同度百分比大致等於或大於指定的最低等同度百分比，則被對比序列與參考序列具有指定的最低等同度百分比，雖然可能存在按本文上述計算的等同度百分比低於指定等同度百分比的對準。

在本說明書中，術語「同源性」系指兩個氨基酸序列之間的同一度(參見上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的「同源」是通過將理想條件下調整的兩個序列與待比較序列進行比對後確定的。此類序列同源性可通過使用ClustalW等演算法創建一個排列而進行計算。也可用使用一般序列分析軟體，更具體地說，是Vector NTI、GENETYX或由公共資料庫提供的其他工具。

本領域技術人員能評估特定肽變體誘導的T細胞是否可與該肽本身發生交叉反應(Appay et al.,2006；Colombetti et al.,2006；Fong et al.,2001；Zaremba et al.,1997)。

發明人用給定氨基酸序列的「變體」表示，一個或兩個氨基酸殘基等的側鏈，例如，通過被另一個天然氨基酸殘基的側鏈或其他側鏈取代而發生改變，這樣，這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列(選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24組成的組)的肽大致同樣的方式與HLA分子結合。例如，一種肽可能被修飾以便至少維持(如沒有提高)其能與HLA-A*02或-DR等合適MHC分子的結合槽相互作用和結合，以及至少維持(如沒有提高)其與啟動T淋巴細胞的TCR結合的能力。類似地，TCR可被修飾以便至少維持(如果不提升的話)其能與HLA-A或-DR等合適MHC分子/KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)複合體相互作用和結合，以及至少維持(如果不提升的話)啟動T細胞的能力。

隨後，這些T細胞可與細胞和殺傷細胞發生交叉反應，這些細胞表達多肽，其中包含本說明書中定義的同源肽的天然氨基酸序列，如，KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)。正如科學文獻和資料庫(Rammensee et al.,1999；Godkin et al.,1997)中所述，HLA-A結合肽的某些位點通常為錨定殘基，可形成一種與HLA結合槽的結合模序相稱的核心序列，其定義由構成結合槽的多肽鏈的極性、電物理、疏水性和空間特性確定。一方面，本領域技術人員將有能力根據本說明書的教導通過保持已知的錨殘基來修飾TCR的氨基酸序列，並且能夠確定此類TCR變體是否保持與MHC I類或II類分子/KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)複合體結合的能力。描述的TCR變體重新結合MHC I類或II類分子/KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)複合體的能力。隨後，表達該說明書TCR變體的T細胞可殺傷細胞，這些細胞表達含有同源肽(例如KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1))的天然氨基酸序列的多肽。

一方面，如果無另有說明，那麼本文公開的肽或TCR可以通過在肽鏈內的不同(可能為選擇性)位點上取代一個或多個殘基而被修飾。優選情況是，這些取代位於所述肽氨基酸鏈的末端。對於TCR，優選情況是，這些取代位於TCRα鏈和TCRβ鏈的可變結構域。此取代可能是保守性的，例如，其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代，比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關，這是確定「保守取代」的基礎。

在本文中，保守取代定義為在以下五種基團之一的內部進行交換：基團1-小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala,Ser,Thr,Pro,Gly)；基團2-極性、帶負電荷的殘基及其醯胺(Asp,Asn,Glu,Gln)；基團3-極性、帶正電荷的殘基(His,Arg,Lys)；基團4-大脂肪族非極性殘基(Met,Leu,Ile,Val,Cys)以及基團5-大芳香殘基(Phe,Tyr,Trp)。

較不保守的取代可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個酸性氨基酸被另一個具有極性或甚至具有鹼性性質的氨基酸所取代。然而，這種「激進」取代不能認為是無效的而不予考慮，因為化學作用是不完全可預測的，激進的取代可能會帶來其簡單化學原理中無法預見的偶然效果。

一方面，此類取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他結構。因此，D-氨基酸可能被本說明書的抗原肽中常見的L-氨基酸取代，也仍在本公開的範圍之內。此外，非標準氨基酸(即，除了常見的天然蛋白原氨基酸)也可以用於取代之目的，以生產根據本說明書的免疫原和免疫原性多肽。

如果在一個以上位置上的取代發現導致肽的抗原活性基本上等於或大於以下定義值，則對這些取代的組合進行測試，以確定組合的取代是否產生對肽抗原性的疊加或協同效應。肽內被同時取代的位置最多不能超過4個。

本文所用的術語「鼠」或「人」在提及抗原識別構建體或TCR時，或本文所述的TCR的任何組分(例如，互補性決定區(CDR)、可變區、恒定區，α鏈和/或β鏈)是指分別源自小鼠或人未經排列的TCR基因座的TCR(或其組分)。

T細胞受體(TCR)

在一項優選的實施方案中，該說明書涉及包含表2所示的TCR α鏈的TCR及其變體；以及表2所示的TCR β鏈及其變體。在一方面，本文所述的TCR具有與主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子/KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)/複合體或II類 /KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)/複合體結合或特異性結合的能力。

α/β TCR的α和β鏈以及γ/δ TCR的γ和δ鏈通常被認為具有兩個「結構域」，即可變和恒定結構域。可變結構域由可變區(V)和連接區(J)的組合。可變結構域還可能包括一個前導區(L)。β和δ鏈還可能包括一個多樣區(D)。α和β恒定結構域還可能包括錨定α和β鏈至細胞膜的C末端跨膜(TM)結構域。

因此，在本說明書中，術語「TCR α可變結構域」系指無前導區(L)的TCR α V(TRAV)區和TCR α J(TRAJ)區的組合；術語「TCR α恒定結構域」系指細胞外TRAC區域或C末端截短TRAC序列，以及任選的α跨膜結構域(VIGFRILLLKVAGFNLLMTL(SEQ ID NO：87))。

同樣地，術語「TCR β可變結構域」系指無前導區(L)的TCR β V(TRBV)區和TCR β D/J(TRBD/TRBJ)區的組合；術語「TCR β恒定結構域」系指細胞外TRBC區域或C末端截短TRBC序列，以及任選的β跨膜結構域(TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO：88))。

相對於γ/δ TCR，如本文所用的術語「TCR γ可變結構域」系指無前導區(L)的TCR γ V(TRGV)區與TCR γ J(TRGJ)區的組合，術語TCR γ恒定結構域系指細胞外TRGC區域或C末端截短TRGC序列。同樣地，術語「TCR δ可變結構域」系指無前導區(L)的TCR δ V(TRDV)區與TCR δ D/J(TRDD/TRDJ)區的組合，術語TCR δ恒定結構域系指細胞外TRDC區域或C末端截短TRDC序列。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與表2中所述的TCR α鏈75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR α鏈或由其組成。表2中所述的TCR α鏈包含前導(L)段、V鏈、三個互補決定區(CDR1、CDR2和CDR3)、接合區域(J)和恒定區域，如表2所定義。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與表2中所述的TCR α可變結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR α可變結構域或由其組成。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與表2中所述的TCR α恒定結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%相同、優選為75%同一的TCR α恒定結構域或由其組成。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含TCR α可變結構域或由其組成，TCR α可變結構域包含至少一個選自由表2中所示的α鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組的α鏈互補決定區(CDR)。在一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含表2所示的α鏈CDR3。在另一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含表2所示的α鏈CDR1、CDR2和CDR3。

在一項特別優選的實施方案中，本說明書的TCR包含與表2的TCR α可變結構域具有至少90%序列同一性的TCR α可變結構域，或由其組成，並且包含表2中相同α可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與表2中所述的TCR β鏈75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR β鏈或由其組成。表2中所述的TCR β鏈包含前導(L)段、V鏈、三個互補決定區(CDR1、CDR2和CDR3)、接合區域(J)和恒定區域，如表2所定義。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與表2中所述的TCR β可變結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR β可變結構域或由其組成。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與表2中所述的TCR β恒定結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為75%同一的TCR β恒定結構域或由其組成。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含TCR β可變結構域或由其組成，TCR β可變結構域包含至少一個選自表2中所示的β鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組的β鏈互補決定區(CDR)。在一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含表2所示的β鏈CDR3。在另一項優選實施方案中，TCR β可變結構域包含表2所示的β鏈CDR1、CDR2和CDR3。

在一項特別優選的實施方案中，本說明書的TCR包含與表2的TCR β可變結構域具有至少90%或95%序列同一性的TCR β可變結構域，或由其組成，並且包含表2中相同TCR β可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3。

α鏈可變結構域可包含一個或多個α CDR結構域，其相對於表2所示的相應CDR序列具有一個、兩個、三個或四個氨基酸取代。同樣地，β鏈可變結構域可包含一個或多個β CDR結構域，其相對於表2所示的相應β CDR序列具有一個、兩個、三個或四個氨基酸取代。

TCR α鏈和TCR β鏈可以融合形成單鏈TCR。另一方面，TCR α和β鏈可以表達為可以組裝成異二聚體的分離蛋白質。

在一項實施方案中，表2的任何TCRα鏈與表2的任何TCRβ鏈配對以產生特異性結合MAG-003肽HLA分子複合體的TCR。

TCR R20P1H7

在一項實施方案中，本說明書的TCR分別包含分別對應於SEQ ID NO：39和47的TCR R20P1H7 α鏈和/或β鏈或由其組成。

TCR R20P1H7的TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：39的氨基酸22至133，或可選地由其組成；TCR R20P1H7的TCR α恒定結構域包含SEQ ID NO：39的氨基酸134-275，或可選地由其組成；TCR R20P1H7的TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：47的氨基酸20至135，或可選地由其組成；TCR β恒定結構域包含SEQ ID NO：47的氨基酸136至315，或可選地由其組成。

在一項特別的實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：39的TCR α鏈75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR α鏈。

在另一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：39的TCR α可變結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、0.95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR α可變結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：39的TCR α恒定結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為75%同一的TCR α恒定結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含TCR α可變結構域，TCR α可變結構域包含至少一個選自由SEQ ID NO：39的α鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組的α鏈互補決定區(CDR)。在一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：39的α鏈CDR3。在另一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：39的α鏈CDR1、CDR2和CDR3。

在一項特別優選的實施方案中，本說明書的TCR包含與SEQ ID NO：39的TCR α可變結構域具有至少90%或95%序列同一性的TCR α可變結構域，並且包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3。

在另一項特別的實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：47的TCR β鏈75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR β鏈。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：47的TCR β可變結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR β可變結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：47的TCR β恒定結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為75%同一的TCR β恒定結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含TCR β可變結構域，TCR β可變結構域包含至少一個選自由SEQ ID NO：47的β鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組的β鏈互補決定區(CDR)。在一項優選實施方案中，TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：47的β鏈CDR3。在另一項優選實施方案中，TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：47的β鏈CDR1、CDR2和CDR3。

在一項特別優選的實施方案中，本說明書的TCR包含與SEQ ID NO：47的TCR β可變結構域具有至少90%或95%序列同一性的TCR β可變結構域，並且包含SEQ ID NO：47的CDR1、CDR2和CDR3。

α鏈可變結構域可包含一個或多個α CDR結構域，其相對於SEQ ID NO：39的相應CDR序列具有一個、兩個、三個或四個氨基酸取代。同樣地，β鏈可變結構域可包含一個或多個β CDR結構域，其相對於SEQ ID NO：47的相應β CDR序列具有一個、兩個、三個或四個氨基酸取代。

TCR R7P1D5

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含分別對應於SEQ ID NO：55和63的TCR R7P1D5α鏈和/或β鏈或由其組成。

TCR R7P1D5的TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：55的氨基酸22至131，或可選地由其組成；TCR R7P1D5的TCR α恒定結構域包含SEQ ID NO：55的氨基酸132至272，或可選地由其組成；TCR R7P1D5的TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：63的氨基酸20至131，或可選地由其組成；TCR β恒定結構域包含SEQ ID NO：63的氨基酸132至310，或可選地由其組成。

在一項特別的實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：55的TCR α鏈75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR α鏈。

在另一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：55的TCR α可變結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR α可變結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：55的TCR α恒定結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為75%同一的TCR α恒定結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含TCR α可變結構域，TCR α可變結構包含至少一個選自由SEQ ID NO：55的α鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組的α鏈互補決定區(CDR)。在一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：55的α鏈CDR3。在另一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：55的α鏈CDR1、CDR2和CDR3。

在一項特別優選的實施方案中，本說明書的TCR包含與SEQ ID NO：55的TCR α可變結構域具有至少90%或95%序列同一性的TCR α可變結構域，並且包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3。

在另一項特別的實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：63的TCR β鏈75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%或95%同一的TCR β鏈。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：63的TCR β可變結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR β可變結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：63的TCR β恒定結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為75%同一的TCR β恒定結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含TCR β可變結構域，TCR β可變結構域包含至少一個選自由SEQ ID NO：63的β鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組的β鏈互補決定區(CDR)。在一項優選實施方案中，TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：63的β鏈CDR3。在另一項優選實施方案中，TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：63的β鏈CDR1、CDR2和CDR3。

在一項特別優選的實施方案中，本說明書的TCR包含與SEQ ID NO：63的TCR β可變結構域具有至少90%或95%序列同一性的TCR β可變結構域，並且包含SEQ ID NO：63的CDR1、CDR2和CDR3。

α鏈可變結構域可包含一個或多個α CDR結構域，其相對於SEQ ID NO：55的相應CDR序列具有一個、兩個、三個或四個氨基酸取代。同樣地，β鏈可變結構域可包含一個或多個β CDR結構域，其相對於SEQ ID NO：63的相應β CDR序列具有一個、兩個、三個或四個氨基酸取代。

TCR R10P2G12

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含分別對應於SEQ ID NO：71和79的TCR R10P2G12α鏈和/或β鏈或由其組成。

TCR R10P2G12的TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：71的氨基酸21至136，或可選地由其組成；TCR R10P2G12的TCR α恒定結構域包含SEQ ID NO：71的氨基酸137至277，或可選地由其組成；TCR R10P2G12的TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：79的氨基酸20至134，或可選地由其組成；TCR β恒定結構域包含SEQ ID NO：79的氨基酸135至313，或可選地由其組成。

在一項特別的實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：71的TCR α鏈75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR α鏈。

在另一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：71的TCR α可變結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR α可變結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：71的TCR α恒定結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為75%同一的TCR α恒定結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含TCR α可變結構域，TCR α可變結構包含至少一個選自由SEQ ID NO：71的α鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組的α鏈互補決定區(CDR)。在一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：71的α鏈CDR3。在另一項優選實施方案中，TCR α可變結構域包含SEQ ID NO：71的α鏈CDR1、CDR2和CDR3。

在一項特別優選的實施方案中，本說明書的TCR包含與SEQ ID NO：71的TCR α可變結構域具有至少90%或95%序列同一性的TCR α可變結構域，並且包含SEQ ID NO：71的CDR1、CDR2和CDR3。

在另一項特別的實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：79的TCR β鏈75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR β鏈。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：79的TCR β可變結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCR β可變結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含至少與SEQ ID NO：79的TCR β恒定結構域75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同、優選為75%同一的TCR β恒定結構域。

在一項實施方案中，本說明書的TCR包含TCR β可變結構域，TCR β可變結構域包含至少一個選自由SEQ ID NO：79的β鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組的β鏈互補決定區(CDR)。在一項優選實施方案中，TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：79的β鏈CDR3。在另一項優選實施方案中，TCR β可變結構域包含SEQ ID NO：79的β鏈CDR1、CDR2和CDR3。

在一項特別優選的實施方案中，本說明書的TCR包含與SEQ ID NO：79的TCR β可變結構域具有至少90%或95%序列同一性的TCR β可變結構域，並且包含SEQ ID NO：79的CDR1、CDR2和CDR3。

α鏈可變結構域可包含一個或多個α CDR結構域，其相對於SEQ ID NO：71的相應CDR序列具有一個、兩個、三個或四個氨基酸取代。同樣地，β鏈可變結構域可包含一個或多個β CDR結構域，其相對於SEQ ID NO：79的相應β CDR序列具有一個、兩個、三個或四個氨基酸取代。

在一項進一步優選的實施方案中，本說明書的TCR特異性結合MAG-003肽-HLA分子複合體，其中MAG-003肽選自KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)及其變體，如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：24中所示。在一項實施方案中，HLA分子是選自由HLA-A、HLA-B和HLA-C分子組成的組的I類MHC分子。在一項實施方案中，HLA分子是HLA-A*02。在另一項實施方案中，HLA分子是選自由HLA-DP和HLA-DR分子組成的組的II類MHC分子。

本說明書的TCR優選結合至MAG-003肽HLA分子複合體，其具有約100μM或更小、約50μM或更小、約25μM或更小或約10μM或更小的結合親和力(KD)。更為優選的情況是具有約1μM或更小、約100Nm或更小、約50nM或更小或約25nM或更小結合親和力的高親和力TCR。本說明書的TCR優選結合親和力範圍的非限制性示例包括約1nM至約10 nM；約10nM至約20nM；約20nM至約30nM；約30nM至約40nM；約40nM至約50nM；約50nM至約60nM；約60nM至約70nM；約70nM至約80nM；約80nM至約90nM；以及約90nM至約100nM。

與本說明書TCR相關，本文使用的「特異性結合」及其語法變體用於指對100μM或更小的MAG-003肽-HLA分子複合體有結合親和力(KD)的TCR。

本說明書的α/β異二聚體TCR可能具有其恒定結構域之間的引入二硫鍵。這種類型的優選TCR包括那些具有一個TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列的TCR，除非TRAC的那蘇氨酸48和TRBC1或TRBC2的絲氨酸57被半胱氨酸殘基取代，所述半胱氨酸形成TRAC恒定結構域序列和TCR的TRBC1或TRBC2恒定區序列之間的二硫鍵。

不論具有或不具有上述的引入鏈間鍵，本說明書的α/β雜二聚體TCR可能具有一個TRAC恒定結構域序列和一個TRBC1或TRBC2恒定結構域序列，並且TRAC恒定結構域序列和TCR的TRBC1或TRBC2恒定結構域序列可能通過TRAC外顯子2的Cys4和TRBC1或TRBC2外顯子2的Cys4之間的天然二硫鍵相連。

本說明書的TCR可能包括選自由放射性核素、螢光團和生物素組成組中的可檢測標記。本說明書的TCR可能共軛至治療活性劑，如放射性核素、化學治療劑或毒素。

在一項實施方案中，具有在α鏈中至少一個突變和/或具有在β鏈中至少一個突變的TCR與未突變的TCR相比，已經修改了糖基化。

在一項實施方案中，在TCRα鏈和/或TCRβ鏈中包括至少一個突變的TCR對MAG-003肽HLA分子複合體有結合親和力和/或結合半衰期，其是包含未突變TCR α鏈和/或未突變TCR β鏈的TCR的結合親和力的至少兩倍。腫瘤特異性TCR親和力增強及其開發依賴於存在最佳TCR親和力的窗口。這樣視窗的存在是根據觀察結果：HLA-A2限制性病原體特異性TCR與HLA-A2限制性腫瘤相關自身抗原特異性TCR相比，KD值通常大約低10倍(Aleksic et al.2012；Kunert et al.2013)。現已知，儘管腫瘤抗原可能具有免疫原性，但是因為腫瘤來自個體自身的細胞，因此僅突變蛋白質或翻譯加工改變的蛋白將將被免疫系統視為外來物質。上調或過度表達(所謂的自體抗原)的抗原不一定誘導針對腫瘤的功能免疫反應：表達對這些抗原具有高度反應性的TCR的T細胞會在一種稱為中樞耐受的程序中在胸腺內被不利選擇(Xing et al.2012；Ruella et al.2014；Sharpe et al.2015)，也就是說只有對自身抗原具有低親和力TCR的細胞才仍然存在。因此，本說明書的TCR或變體對MAG-003的親和力可通過本領域熟知的方法來增強，如下文所述。

MAG-003肽

本說明書提出了一種肽，其包括選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24群組的一個序列、或與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24具有88%同源性的其變體、或誘導與本文所述的肽發生T細胞交叉反應的一個變體。一方面，本說明書的肽具有與主要組織相容性複合體(MHC)I類分子結合或本文所述較長版本肽與II類分子結合的能力。一方面，本文所述的TCR能夠與本文所述的肽結合或特異性結合。

在人類中，有三種編碼MHC I類分子的不同基因位點(人MHC分子也是指定的人白細胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-B*07是可從這些基因位點表達的不同MHC I類等位元基因的實例。

表3：HLA-A*02和HLA-A*24和最常見HLA-DR血清類型的表達頻率F。頻率根據Mori等人(Mori et al.,1997)使用的Hardy-Weinberg公式F=1-(1-Gf)²改編，從美國人群範圍內的單體型頻率中推導出。由於連鎖不平衡，某些HLA-DR等位基因內的 A*02或A*24組合與其預期單一頻率相比，可能是濃縮的或頻率較低。有關詳細資訊，請參閱Chanock等人的文獻(Chanock et al.,2004)。

MAGEA4基因

本基因是MAGEA基因家族的一員。該家族的成員將具有50至80%序列同一性的蛋白質進行相互編碼。MAGEA基因的啟動子和第一個外顯子顯示出相當大的變異性，表明該基因家族的存在能夠在不同的轉錄控制下表達相同的功能。MAGEA基因聚簇於染色體位置Xq28。它們牽涉某些遺傳性疾病，如先天性角化不全。對於該基因已經發現了編碼相同蛋白質的至少四種變體。(由RefSeq提供，2008年7月)。

MAGEA4位置被描述為在細胞質內(Kim et al.,2015)。但是，在細胞核中也檢測到了MAGEA4染色，在分化良好與分化較差的癌症中細胞核和細胞質之間具有差異性分佈(Sarcevic et al.,2003)。

MAGEA4用作一種雄性生殖細胞標誌物。它在細胞中不表達，但在精原細胞和成熟生殖細胞中表達(Mitchell et al.,2014)。

¹ TGF=轉化生長因子；PI3K=磷脂醯肌醇3激酶；p53=細胞腫瘤抗原p53；EGFR=上皮生長因子受體；FGF2=成纖維細胞生長因子2；Wnt=Wnt/β-連環蛋白通路(胚胎發生)；Ras=大鼠肉瘤原癌基因；NF-kB =核因子κ B(真核轉錄因子)² CY=細胞質；³ TU=腫瘤細胞

pMHC為靶點

一項I期臨床試驗研究了食管癌患者中TCR工程化自體CTL的過繼轉移對與HLA-A*24：02結合的MAGEA4(143-151)的反應。給予患者TCR轉導淋巴細胞一次，無需預處理，隨後在2和4週後用MAGEA4肽進行皮下免疫。未觀察到目標腫瘤消退，可能是由於缺乏淋巴細胞凋亡方案和給予了IL2(Kageyama et al.,2015)。在小鼠中的臨床前研究已證明，轉移的T細胞抑制了在小鼠中接種的MAGEA4表達腫瘤細胞系的生長，額外的肽疫苗接種增強了這種抗腫瘤活性(Shirakura et al.,2012)。

提出了以過繼CTL轉移靶向作用於MAGEA4作為EBV陰性霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的治療方案。靶向作用於EBV衍生肽的輸注CTL被描述為可在EBV(+)淋巴瘤患者中誘導完全緩解。因此，靶向作用於淋巴瘤(包括MAGEA4)表達的其他抗原正在進行探索，作為一種可能的治療方案(Cruz et al.,2011；Gerdemann et al.,2011)。

幾項研究已證明，在與重疊肽庫進行脈衝的自體抗原呈遞細胞孵育後，健康供體和癌症患者可產生MAGEA4特異性CD4(+)T細胞(Cesson et al., 2011；Gerdemann et al.,2011；Ohkuri et al.,2009)。

MAG-003肽，即KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)是MAGEA4(氨基酸286-294)的一種HLA-A*0201限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位。(Jia et al.2010；Wu et al.2011)中的內容通過引用整體併入本文。一方面，MAG-003在體外從HLA-A*0201陽性PBMC和在HLA-A*0201/Kb轉基因小鼠中引發特異性CTL。另一方面，誘導的CTL以HLA-A*0201限制性方式裂解靶細胞，證明MAG-003是HLA-A*0201限制性CTL表位並充當治療性抗腫瘤疫苗接種的靶標(Jia et al.2010)，該文中的內容通過引用整體併入本文。

圖1顯示了健康組織和癌症中MAG-003肽提呈。結果總結在表5中。具體而言，在分別來自卵巢癌(OC)和非小細胞肺癌(NSCLC)的腫瘤組織中，估計每個細胞約有4,000和2,000拷貝的MAG-003。

編碼本說明書肽的基因表達譜

與健康細胞相比，在腫瘤細胞上TAA過度提呈或特定提呈足夠其在免疫治療中有效使用，一些肽為腫瘤特異性的，儘管其源蛋白也存在于健康組織中。但是，mRNA表達譜增加了免疫治療目標肽選擇中其他級別的安全性。特別是對於具有高安全性風險的治療選擇，諸如親和力成熟的TCR，理想的目標肽將來源於對該腫瘤獨一無二且不出現于健康組織中的蛋白。

RNA來源與製備

手術切除組織標本按如上所述在獲得每名患者的書面知情同意後提供。手術後立即速凍腫瘤組織標本，之後在液態氮中用杵臼勻漿。使用TRI試劑(Ambion公司，Darmstadt，德國)之後用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德國)清理從這些樣本中製備總RNA；這兩種方法都根據製造商的方案進行。

RNAseq實驗

通過新一代測序技術(RNAseq)由CeGaT(Tübingen,Germany)對腫瘤和健康組織的RNA樣本進行基因表達分析。根據供應商的方案(Illumina Inc.,San Diego,CA,USA)，其中包括RNA碎片化、cDNA轉化和測序適配器的加入，利用Illumina HiSeq v4試劑盒準備測序文庫。從多個樣本獲得的文庫根據製造商的說明等摩爾混合並在Illumina HiSeq 2500定序器上測序，產生50bp的單端讀數。處理的讀數使用STAR軟體映射至人類基因組(GRCh38)。根據ENSEMBL序列資料庫的說明(Ensembl77)，表達資料在轉錄水準設置為RPKM(每百萬映射讀數每千堿基讀數，由Cufflinks軟體生成)並在外顯子水準上設置(總讀數，由Bedtools軟體生成)。外顯子讀數被歸為外顯子長度和校準尺寸，以獲得RPKM值。

如圖2-4所示，與高風險和中等風險的健康組織相比，MAG-003在癌組織和低風險健康組織(如睾丸)中高度表達。

表6-8顯示了各種癌症中MAG-003表達的RNASeq資料(表達得分)

一方面，基本上由本文所指氨基酸序列組成的一種肽可能有一個或兩個非錨定氨基酸(見下面錨基序相關內容)被交換，而不存在這種情況，即相比於未修飾的肽，與人類主要組織相容性複合體(MHC)-I或II類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。在另一實施方案中，在基本上由本文所述氨基酸序列組成的肽中，一個或兩個氨基酸可與其保守交換夥伴交換(見下文)，而不存在這種情況，即相比於未修飾的肽，與人類主要組織相容性複合體(MHC)-I或II類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。

基本不與TCR體互動的氨基酸殘基可通過取代其他幾乎不影響T細胞反應並不妨礙與相關MHC結合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本說明書中的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或段或變體的肽(發明人所用的這個術語包括寡肽或多肽)。

一方面，較長的肽也可能適合。MHC I類表位(儘管通常為實際表位)為在加工過程中幾乎不影響暴露實際表位所需蛋白裂解的殘基，這是可能的。

一方面，本說明書的肽可被延長多達1、2、3或4個氨基酸，即，1、2、3或4個氨基酸可加至長度為8至11個氨基酸的任何組合中肽的任一端。優選為兩側位於4：0與0：4之間的殘基。根據本說明書中的延長組合可見表10。

延伸/延長的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。延長可用于增強所述肽的穩定性或溶解性。

因此，本說明書所述的表位可能與天然腫瘤相關表位或腫瘤特異性表位相同，也可能包括來自參考肽的不超過四個殘基的不同肽，只要它們有基本相同的抗原活性即可。

在一項替代實施方案中，肽的一邊或雙邊被延長4個以上的氨基酸，優選最多30個氨基酸的總長度。一方面，這種延長形成MHC-II類結合肽。結合至MHC II類肽可通過本領域中已知的方法進行測試。

因此，本說明書提出了MHC I類表位的肽和變體，其中所述肽或抗體的總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至14個氨基酸長度(即10、11、12、13、14個氨基酸，如果為較長II類結合肽時，長度也可為15、16、17、18、19、20、21或22個氨基酸)。

一方面，本說明書中的肽或變體能與人主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子結合。肽或變體與MHC複合體的結合可用本領域內的已知方法進行測試。

優選情況是，當本說明書的肽特異性T細胞相比於取代肽受到檢測時，如果取代肽在相對於背景肽溶解度增加達到最大值的一半，則該肽濃度不超過約1mM，優選為不超過約1μM，更優選為不超過約1nM，再優選為不超過約100pM，最優選為不超過約10pM。也優選為，取代肽被一個以上的T細胞識別，最少為2個，更優選為3個。

本文所用的術語「複合體」系指與(如抗原性)決定因子特異性結合的分子。在一項實施方案中，複合體是能夠引導其所連接的實體(例如，(第二)抗原結合部分)至目標靶點，例如，至特定類型的腫瘤細胞或承載抗原決定簇的腫瘤基質(如根據目前申請中肽和MHC的複合體)。在另一項實施例中，複合體能夠通過其靶抗原(例如T細胞受體複合體抗原)啟動信號通路。複合體包括但不限於抗體及其片段，抗體的抗原結合區，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區，結合的蛋白包括至少一個錨蛋白重複序列基元和單域抗原結合(SDAB)分子、適體、(可溶)TCR和(經修飾的)細胞，例如同種異體或自體T細胞。為了評估某個分子是否是結合至靶點的複合體，可進行結合測定。

「特定」結合系指，與其他天然肽-MHC複合體相比，該複合體(如，TCR)與相關的肽-MHC複合體更好地結合，結合程度為，擁有能夠殺死承載特定靶點細胞的活性分子的複合體不能夠殺死無特定靶點但提呈一個或多個其他肽-MHC複合體的另一細胞。如果交叉反應性肽-MHC的肽並不是天然的，即，並非來自人HLA-多肽組，則結合至其他肽-MHC複合體是無關緊要的。評估靶細胞殺傷的測試在本領域中是公知的。它們應該含有未改變的肽-MHC提呈的靶細胞(原發細胞或細胞系)或載有肽的細胞進行，以便達到天然肽-MHC的水準。

各複合體可包括一個標記，其通過確定是否存在或不存在標籤所提供的信號可檢測到結合複合體。例如，該複合體可用螢光染料或任何其他適用的細胞標記分子進行標記。此類標記分子是本領域中公知的。例如，通過螢光染料進行的螢光標記可通過螢光或鐳射掃描顯微術或流式細胞術提供結合適體的視覺化。

各複合體可與第二個活性分子(例如IL-21、抗CD3、抗CD28)共軛。

關於多肽複合體的更多資訊可見(例如)WO 2014/071978A1的背景部分，其通過引用整體併入。

「藥物組合物」是指適合在醫療機構用於人體的組合物。優選地，藥物組合物為無菌狀態，並根據GMP指南生產。

本說明書的藥物組合物還包括至少一種TCR、可溶性TCR、核酸和/或在一種藥用載體中表達本說明書中TCR的宿主細胞。

本說明書的藥物組合物還可以包括藥用輔料和/或穩定劑。

此組合藥物為非腸道注射使用，如皮下、皮內、肌肉注射，也可口服。為此，肽和其他選擇性分子在藥用載體中分解或懸浮，優選為水載體。此外，組合物可包含輔料，如：緩衝劑、結合劑、衝擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。這些肽也可與免疫刺激物質合用，如：細胞因子。可用於此類組合物的更多賦形劑可在從A.Kibbe所著的Handbook of Pharmaceutical Excipients(Kibbe,2000)等書中獲知。此組合藥物可用於阻止、預防和/或治療腺瘤或癌性疾病。示例性製劑可見EP2112253，其通過引用整體併入本文。

本說明書的另一方面提出了編碼本說明書的肽、肽變體、TCR和TCR變體的核酸(例如，多核苷酸)。多聚核苷酸可能為，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其組合物，它們可為單鏈和/或雙鏈、或多聚核苷酸的原生或穩定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，並且只要它編碼肽，就可能包含也可能不包含內含子。當然，多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵並含有天然氨基酸殘基的肽。本說明書的另一方面還提出了能夠表達本說明書多肽的表達載體。

對於連接多核苷酸，已經開發出多種方法，尤其是針對DNA，可通過向載體補充可連接性末端等方法進行連接。例如，可向DNA片段加入補充性均聚物軌道，之後DNA片段被插入到載體DNA。然後，通過補充性均聚物尾巴的氫鍵結合，將載體和DNA片段結合，從而形成重組DNA分子。

含有一個或多個酶切位點的合成接頭為DNA片段與載體連接提供了另一種方法。含各種限制性核酸內切酶的合成接頭可通過多種管道購得，其中包括從國際生物技術公司(International Biotechnologies Inc,New Haven,CN，美國)購得。

編碼本說明書多肽的DNA理想修飾方法是使用Saiki等人(Saiki et al.,1988)所採用的聚合酶鏈反應方法。此方法可用於將DNA引入合適的載體(例如，通過設計合適的酶切位點)，也可用於本領域已知的其他有用方法修飾DNA。如果使用病毒載體，痘病毒載體或腺病毒載體為優選。

一方面，為了獲得表達本說明書TCR的T細胞，編碼本說明書TCR-α和/或TCR-β鏈的核酸被克隆入表達載體，諸如γ逆轉錄病毒或慢病毒。重組病毒產生，然後測試功能，如抗原專一性和功能性親合力。然後，最終產品的等分試樣被用於轉導靶T細胞群體(一般純化自患者的PBMC)，在輸入患者前展開。

另一方面，為了獲得表達本說明書TCR的T細胞，TCR RNA通過本領域中已知的技術(例如，體外轉錄系統)合成。然後，體外合成的TCR RNA通過電穿孔來重新表達腫瘤特異性TCR-α和/或TCR-β鏈被引入獲得自健康供體的原代CD8+ T細胞。

引入外周T細胞的TCR鏈可能與內源性TCR鏈競爭，與TCR表面表達所需的CD3複合體結合。由於高水準的TCR表面表達對通過表達腫瘤靶抗原的細胞觸發賦予適當的靈敏度是必要的(Cooper et al.,2000；Labrecque et al.,2001)，因此增強TCR-α和TCR-β基因表達水準的策略是TCR基因治療中的重要考慮因素。

為了增加表達，編碼本說明書TCR的核酸在操作上可連接到強啟動子，例如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)、巨細胞病毒(CMV)、鼠幹細胞病毒 (MSCV)U3、磷酸甘油酸激酶(PGK)、β-肌動蛋白、泛素蛋白和猿猴病毒40(SV40)/CD43複合啟動子(Cooper et al.,2004；Jones et al.,2009)、延伸因子(EF)-1a(Tsuji et al.,2005)和脾臟病灶形成病毒(SFFV)啟動子(Joseph et al.,2008)。在一優選實施方案中，啟動子與被表達的核酸異源。

除了強啟動子外，本說明書的TCR表達盒可能含有附加的元素，可提高轉基因表達，包括中樞多聚嘌呤區(CPPT)，其促進了慢病毒構建體的核易位(Follenzi et al.,2000)，和土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元素(WPRE)，其通過提高RNA穩定性增加轉基因表達水準(Zufferey et al.,1999)。

本發明TCR的α和β鏈可由位於分開的載體核酸進行編碼，或者可通過位於同一載體的多核苷酸編碼。

實現高水準的TCR表面表達需要引入TCR的TCR-α和TCR-β鏈高水準轉錄。為了實現它，本說明書的TCR-α和TCR-β鏈可在單一的載體中被克隆入雙順反子構建體，其已被證明能夠克服這一障礙。使用TCR-α和TCR-β鏈在之間的病毒核糖體間進入位元點(IRES)導致兩鏈的協同表達，因為TCR-α和TCR-β鏈均由在翻譯過程中分成兩個蛋白質的單一轉錄物產生，從而確保了產生TCR-α和TCR-β鏈的相等摩爾比。(Schmitt et al.2009)。

編碼本說明書TCR的核酸可以是被優化以從宿主細胞增加表達的密碼子。遺傳密碼冗餘讓一些氨基酸被一個以上的密碼子編碼，但某些密碼子沒有其他密碼子「理想」，因為匹配tRNA以及其他因子的相對可用性(Gustafsson et al.,2004)。修改TCR-α和TCR-β基因序列使得每個氨基酸被用於哺乳動物基因表達的最佳密碼子編碼，以及消除mRNA不穩定性基序或隱蔽剪接位元點，已顯示可顯著提高TCR-α和TCR-β基因表達(Scholten et al.,2006)。

此外，引入的和內源性TCR鏈之間的錯配可能會導致獲得特異性，這些特異性對自身免疫構成顯著風險。例如，混合TCR二聚體的形成可能會減少可用以形成正確配對TCR複合體的CD3分子數目，因此，可以顯著降低表達所引入TCR的細胞的功能性親合力(Kuball et al.,2007)。

為了減少錯配，本說明書引入的TCR鏈的C-末端結構域可以進行修改以促進鏈間親和力，而降低引入鏈與內源TCR配對的能力。這些策略可能包括用鼠配對物取代人類TCR-α和TCR-β C端結構域(鼠化C端結構域)；通過引入第二半胱氨酸殘基到引入TCR的TCR-α和TCR-β鏈產生C末端結構域的第二間二硫鍵(半胱氨酸修飾)；交換TCR-α和TCR-β鏈C端結構域的相互作用殘基(「孔中小塊」)；直接熔合TCR- α和TCR-β鏈可變結構域至CD3 ζ(CD3 ζ融合)。(Schmitt et al.2009)。

之後，DNA(或在逆轉錄病毒載體情況下，RNA)可能表達於合適的宿主，從而製成含本說明書肽或變體的多肽。因此，可根據已知技術使用編碼本說明書肽或變體的DNA，用本文所述方法適當修飾後，構建表達載體，然後表達載體用於轉化合適宿主細胞，從而表達和產生本說明書中的多肽。此類技術包括那些公開於，例如，美國專利4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648的技術，其通過引用整體併入本文。

編碼含本說明書化合物多肽的DNA(或在逆轉錄病毒載體情況下，RNA)可能被加入到其他多種DNA序列，從而引入到合適的宿主中。同伴DNA將取決於宿主的性質、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持為游離體還是要相互結合。

一般來說，DNA可以適當的方向和正確的表達閱讀框架附著到一種表達載體(如質粒)中。如有必要，該DNA可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列連接，儘管表達載體中一般存在此類控制功能。然後，該載體通過標準方法被引入宿主。一般來說，並不是所有的宿主都會被載體轉化。因此，有必要選擇轉化過的宿主細胞。選擇方法包括用任何必要的控制元素向表達載體插入一個DNA序列，該序列對轉化細胞中的可選擇性屬性(如抗生素耐藥性)進行編碼。

另外，有這種選擇屬性的基因可在另外一個載體上，該載體用來協同轉化所需的宿主細胞。

然後，本說明書中的重組DNA所轉化的宿主細胞在本文中所述本領域技術人員熟悉的合適條件下培養足夠長的時間，從而表達之後可回收的肽。

有許多已知的表達系統，包括細菌(如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、酵母(如酵母菌)、絲狀真菌(如曲黴菌)、植物細胞、動物細胞及昆蟲細胞。該系統可優選為哺乳動物細胞，如來自ATCC細胞生物學庫(Cell Biology Collection)中的CHO細胞。

在一實施方案中，宿主細胞被改變結構以表達本說明書的TCR。在一優選實施方案中，宿主細胞為人T細胞或T細胞祖細胞。在一些實施方案中，T細胞或T細胞祖細胞從癌症患者中獲得。在另一些實施方案中，T細胞或T細胞祖細胞從健康供體中獲得。本說明書的宿主細胞相對於待治療的患者可以為同種異體或自體的。在一實施方案中，宿主是被轉化以表達α/β TCR的γ/δ T細胞。

典型的哺乳動物細胞組成型表達載體質粒包括CMV或含一個合適的多聚A尾巴的SV40啟動子以及抗性標誌物(如新黴素)。一個實例為從Pharmacia公司(Piscataway，新澤西，美國)獲得的pSVL。一種可誘導型哺乳動物表達載體的例子是pMSG，也可以從Pharmacia公司獲得。有用的酵母質粒載體是pRS403-406和pRS413-416，一般可從Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla,CA 92037，美國)獲得。質粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型質粒(YIp)，並插入了酵母可選擇性標記物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416質粒為酵母著絲粒質粒(Ycp)。基於CMV啟動子的載體(如，來自於Sigma-Aldrich公司)提供了暫態或穩定的表達、胞漿表達或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同組合物中的N-端或C-端標記。這些融合蛋白可用於檢測、純化及分析重組蛋白。雙標融合為檢測提供了靈活性。

強勁的人巨細胞病毒(CMV)啟動子調控區使得COS細胞中的組成蛋白表達水準高達1mg/L。對於較弱的細胞株，蛋白質水準一般大約0.1mg/L。SV40複製原點的出現將導致DNA在SV40複製容納性COS細胞中高水準複製。例如，CMV載體可包含細菌細胞中的pMB1(pBR322的衍生物)複製原點、細菌中進行氨苄青黴素抗性選育的鈣-內醯胺酶基因、hGH polyA和f1的原點。含前胰蛋白酶原引導(PPT)序列的載體可使用抗FLAG抗體、樹脂和板引導FLAG融合蛋白分泌到進行純化的培養基中。其他與各種宿主細胞一起應用的載體和表達系統是本領域熟知眾所周知的。

在另一項實施方案中，對本說明書的兩個或更多的肽或肽變體進行編碼，因此，以一個連續順序(類似於「一串珠子」的構建體)表達。在達到目標，所述肽或肽變體可能通過連接子氨基酸的延伸處(例如LLLLLL)連接或融合一起，也可能他們之間沒有任何附加的肽而被連接。這些構建體也可用於癌症治療，可誘導涉及MHC I和MHC II類分子的免疫反應。

本說明書還涉及一種宿主細胞，其以本說明書的多核苷酸載體構建轉化而來。宿主細胞可為原核細胞，也可為真核細胞。在有些情況下，細菌細胞為優選原核宿主細胞，典型為大腸桿菌株，例如，大腸桿菌菌株DH5(從Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda,MD，美國)獲得)和RR1(從美國菌種保藏中心(ATCC,Rockville,MD，美國)，ATCC編號31343獲得)。優選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優選為脊椎動物細胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纖維細胞和結腸癌細胞株中的細胞。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可從Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla,CA 92037，美國)獲得。優選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞為ATCC中的CCL61細胞、NIH瑞士小鼠胚胎細胞NIH/3T3為ATCC中的CRL 1658細胞、猴腎源性COS-1細胞為ATCC中的CRL 1650細胞以及人胚胎腎細胞的293號細胞。優選昆蟲細胞為Sf9細胞，可用杆狀病毒表達載體轉染。有關針對表達選擇合適宿主細胞的概要，可從教科書(Paulina Balb á s and Argelia Lorence《Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression,Reviews and Protocols》Part One,Second Edition,ISBN 978-1-58829-262-9)和本領域技術人員知道的其他文獻中查到。

含本說明書DNA結構的適當宿主細胞的轉化可使用大家熟知的方法完成，通常取決於使用載體的類型。關於原核宿主細胞的轉化，請參見，例如，Cohen等人的文獻(Cohen et al.,1972)和(Green and Sambrook,2012)。酵母細胞的轉化在Sherman等人的文章(Sherman et al.,1986)中進行了描述。Beggs(Beggs,1978)中所述的方法也很有用。對於脊椎動物細胞，轉染這些細胞的試劑等，例如，磷酸鈣和DEAE-葡聚糖或脂質體配方，可從Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg,MD 20877，美國)獲得。電穿孔也可用於轉化和/或轉染細胞，是本領域用於轉化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物細胞大家熟知的方法。

被成功轉化的細胞(即含本說明書DNA結構的細胞)可用大家熟知的方法(如PCR)進行識別。另外，上清液存在的蛋白可使用抗體進行檢測。

應瞭解，本說明書中的某些宿主細胞用於製備本說明書中的肽，例如細菌細胞、酵母細胞和昆蟲細胞。但是，其他宿主細胞可能對某些治療方法有用。例如，抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)可用於表達本說明書中的肽，使他們可以加載入相應的MHC分子中。因此，本說明書提出了含本說明書中核酸或表達載體的一種宿主細胞。

在一項優選實施方案中，宿主細胞為抗原提呈細胞，尤其是樹突狀細胞或抗原提呈細胞。2010年4月29日，美國食品和藥物管理局(FDA)批准載有含攝護腺酸性磷酸酶(PAP)的重組融合蛋白可用於治療無症狀或症狀輕微的轉移性HRPC(Rini et al.,2006；Small et al.,2006)。

另一方面，本說明書提出了一種配製一種肽及其變體的方法，該方法包括培養宿主細胞和從宿主細胞或其培養基中分離肽。

在另一項實施方案中，本說明書中的TCR、核酸或表達載體用於藥物中。例如，肽或其變體可製備為靜脈(i.v.)注射劑、皮下(s.c.)注射劑、皮內(i.d.)注射劑、腹膜內(i.p.)注射劑、肌肉(i.m.)注射劑。肽注射的優選方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的優選方法為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，給予50μg至1.5mg，優選為125μg至500μg的肽或DNA，這取決於具體的肽或DNA。上述劑量範圍在以前的試驗中成功使用(Walter et al.,2012)。

用於主動免疫接種的多聚核苷酸可為基本純化形式，也可包被於載體或輸送系統。核酸可能為DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。這種核酸的設計和引入方法為本領域所熟知。例如，Teufel等人的文獻中有其概述(Teufel et al.,2005)。多核苷酸疫苗很容易製備，但這些載體誘導免疫反應的作用模式尚未完全瞭解。合適的載體和輸送系統包括病毒DNA和/或RNA，如基於腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統。非病毒輸送系統包括陽離子脂質體和陽離子聚合物，是DNA輸送所屬領域內熟知的系統。也可使用物理輸送系統，如通過「基因槍」。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白，例如，含刺激T細胞進行上述CDR的表位。

本說明書還涉及適體。適體(例如，參見WO 2014/191359及其中引用的文獻，其內容通過引用整體併入本文)是短的單鏈核酸分子，其可以折疊為所定義的三維結構並識別特定的靶標結構。它們似乎是開發靶向治療的合適替代方法。適體已顯示可選擇性與具有高親和力和特異性的複合體靶標相結合。

識別細胞表面分子的適體在過去十年內已經確定，並為開發診斷和治療方法提供了手段。由於適體已顯示幾乎無毒性和免疫原性，因此，它們是生物醫學應用中有前景的候選物質。事實上適體，例如攝護腺特異性膜抗原識別適體，已被成功地用於靶向治療並在體內模型的異種移植物中顯示出功能。此外，認識到特定腫瘤細胞系的適體也已確定。

可選擇DNA適體來揭示各種癌細胞的廣譜識別屬性，特別是那些來自於實體瘤的細胞，而非致瘤和主要健康細胞不被識別。如果所識別的適體不僅識別腫瘤特異性子類型，而且與一系列腫瘤相互作用，這使適體適用于作為所謂的廣譜診斷和治療手段。

此外，用流式細胞儀對細胞結合行為的研究顯示，適體在納摩爾範圍內顯示出很好的親和力。

適體用於診斷和治療目的。一方面，至少一種或多種適體被腫瘤細胞吸取，因而可作為抗癌劑靶向遞送的分子賦形劑，例如siRNA進入腫瘤細胞。

可選擇適體針對複合體的靶標，如細胞和組織以及包含、優選包括根據任何SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：26的一個序列、根據本說明書的肽複合體或TCR與MHC分子，使用細胞SELEX(通過指數富集的配體系統進化)技術。

在一項實施方案中，該說明書提供了如本文中所描述的產生TCR的方法，該方法包括在適於促進TCR表達的條件下培養能夠表達TCR的宿主細胞。

本說明書還涉及一種識別和分離本發明TCR的一種方法，所述方法包括：用A2/MAG-003單體從HLA-A*02陰性健康供體孵育PBMC，用四聚體-藻紅蛋白(PE)孵育PBMC並通過螢光啟動細胞分選(FACS)方法-Calibur分析分離高親和力T細胞。

本說明書還涉及一種識別和分離本發明TCR的一種方法，所述方法包括：用A2/p286-1Y2L單體從HLA-A*02陰性健康供體孵育PBMC，用四聚體-藻紅蛋白(PE)孵育PBMC並通過螢光啟動細胞分選(FACS)方法-Calibur分析分離高親和力T細胞。

本說明書還涉及一種識別和分離本發明TCR的一種方法，所述方法包括：用A2/p286-1Y2L9L單體從HLA-A*02陰性健康供體孵育PBMC，用四聚體-藻紅蛋白(PE)孵育PBMC並通過螢光啟動細胞分選(FACS)方法-Calibur分析分離高親和力T細胞。

本說明書還涉及一種識別和分離本發明TCR的一種方法，所述方法包括：獲得含整個人體TCR α β基因位點(1.1和0.7Mb)的轉基因小鼠(其T細胞表達多樣化人類TCR，用於補償小鼠TCR缺乏)，用MAG-003對小鼠進行免疫處理，用四聚體-藻紅蛋白(PE)孵育從轉基因小鼠中獲得的PBMC，並通過螢光啟動細胞分選(FACS)方法-Calibur分析分離高親和力T細胞。

本說明書還涉及一種識別和分離本發明TCR的一種方法，所述方法包括：獲得含整個人體TCR α β基因位點(1.1和0.7Mb)的轉基因小鼠(其T細胞表達多樣化人類TCR，用於補償小鼠TCR缺乏)，用p286-1Y2L對小鼠進行免疫處理，用四聚體-藻紅蛋白(PE)孵育從轉基因小鼠中獲得的PBMC，並通過螢光啟動細胞分選(FACS)方法-Calibur分析分離高親和力T細胞。

本說明書還涉及一種識別和分離本發明TCR的一種方法，所述方法包括：獲得含整個人體TCR α β基因位點(1.1和0.7Mb)的轉基因小鼠(其T細胞表達多樣化人類TCR，用於補償小鼠TCR缺乏)，用p286-1Y2L9L對小鼠進行免疫處理，用四聚體-藻紅蛋白(PE)孵育從轉基因小鼠中獲得的PBMC，並通過螢光啟動細胞分選(FACS)方法-Calibur分析分離高親和力T細胞。

本說明書還涉及根據說明書的方法，其中所述T細胞包含能夠根據本說明書表達A TCR的表達載體。

本發明還涉及一種在靶細胞異常表達MAG-003的患者中殺傷靶細胞的方法，所述方法包括向患者施用有效量的根據本說明書的TCR、可溶性TCR和/或T細胞。

本說明書進一步涉及任何所述TCR、本說明書的一種核酸、本說明書的一種表達載體、本說明書的一種細胞、本說明書中一種作為藥劑或製造藥劑的啟動細胞毒性T淋巴細胞的用途。本說明書進一步涉及一種根據本說明書的用途，其中藥劑可有效抗癌。

本說明書進一步涉及本說明書中的用途，其中所述癌細胞為小細胞肺癌或其他實體或血液腫瘤細胞，如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊和膽管癌和食管癌。

本說明書進一步涉及一種殺死癌細胞的方法，其包括使癌細胞與本說明書所述的宿主細胞接觸。在一實施方案中，宿主細胞表達本說明書的TCR。在一項實施方案中，宿主細胞為T細胞或T細胞祖細胞。在一項優選實施方案中，癌細胞選自小細胞肺癌或其他實體或血液腫瘤細胞，如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊和膽管癌和食管癌。在一些實施方案中，TCR與治療活性劑共軛。在某些實施方案中，治療活性劑選自由放射性核素、化學治療劑和毒素組成的組。

本發明還涉及一種治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用本發明的宿主細胞。在一實施方案中，宿主細胞表達本說明書的TCR。在一項實施方案中，宿主細胞為T細胞或T細胞祖細胞。在一實施方案中，宿主細胞是待治療受試者的自體細胞。在另一項實施方案中，宿主細胞是待治療受試者的同種異體細胞。在一項優選實施方案中，癌細胞選自小細胞肺癌或其他實體或血液腫瘤細胞，如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊和膽管癌和食管癌。

在一些實施方案中，TCR與治療活性劑共軛。本文所用的術語「治療活性劑」系指用於治療或預防疾病或不良醫療狀況的化合物。在一項實施方案中，治療活性劑用於治療或預防癌症。在某些實施方案中，治療活性劑選自由放射性核素、化學治療劑和毒素組成的組。

本說明書中的TCR、核酸和宿主細胞及其藥物組合物可以通過本領域已知的途徑施用於有需要的受試者，並且可以根據待治療癌症的類型而變化。給藥途徑包括例如，局部給藥(例如腫瘤內)和腸胃外給藥(如皮下、腹膜內、肌內、靜脈內、門靜脈內和肝內)。在一項優選實施方案中，本說明書的TCR、核酸或宿主細胞或其藥用組合物通過局部輸注(例如使用輸注泵和/或導管系統)施用於受試者的治療部位，如實體腫瘤。在一項實施方案中，將本說明書的組合物輸注入實體腫瘤，供應實體腫瘤的血管和/或實體腫瘤周圍區域。

在優選實施方案中，使用至少兩次給藥、每次相隔至少24小時的給藥方案將本說明書的組合物施用於受試者。適用於本說明書組合物的給藥方案包括例如每天一次、每兩天一次和每三天一次。更優選的給藥方案包括每週一次、每週兩次、隔週一次、每月一次、每月兩次。在特定的實施方案中，使用劑量遞增方案，其中在數天、數週或數月內向受試者施用一系列的遞增劑量。

表達本發明TCR的宿主細胞的有效劑量包括例如，每劑至少約10⁴、至少約10⁵、至少約10⁶、至少約10⁷、至少約10⁸、至少約10⁹和至少10¹⁰個宿主細胞。在一項實施方案中，本說明書的宿主細胞以每劑量約10⁴至約10¹⁰個細胞的劑量施用，優選為以每劑量約10⁵至約10⁹個細胞的劑量施用。在優選實施方案中，在至少兩次或更多次給藥週期的療程中以給藥方案施用劑量。

本發明還涉及一種治療癌症的方法，其包括與至少一種化學治療劑和/或放射治療組合施用本說明書的TCR、核酸或宿主細胞。

還提出了一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括：a)從所述受試者中分離細胞；b)用編碼本說明書TCR的至少一個載體轉化細胞以產生轉化的細胞；c)擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和 d)將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。

還提出了一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括：a)從健康供體中分離細胞；b)用編碼本說明書TCR的一個載體轉化細胞以產生轉化的細胞；c)擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和d)將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。

還提出了一種檢測生物樣本中癌症的方法，包括：a)使生物樣本與本說明書的TCR接觸；b)檢測TCR與生物樣本的結合情況。

在一些實施方案中，檢測癌症的方法在體外、體內或原位進行。

本說明書進一步涉及一種基於本說明書的肽的特定標誌物蛋白質和生物標誌物，在此成為「靶標」，其可用於診斷和/或判斷非小細胞肺癌的預後。本說明書還涉及這些新靶點在癌症治療中的用途。

本說明書的另一方面提出了製備識別特異性肽-MHC複合體的可溶性T細胞受體(sTCR)的一種方法。這種可溶性T細胞受體可從特異性T細胞克隆中產生，並且它們的親和力可以通過互補決定區靶向誘變而增加。為了T細胞受體選擇之目的，可以使用噬菌體展示(美國2010/0113300，(Liddy et al.,2012))。為了在噬菌體展示期間以及實際使用為藥物時穩定T細胞受體之目的，可通過非天然二硫鍵、其他共價鍵(單鏈T細胞受體)或通過二聚化結構域連接α和β鏈(Boulter et al.,2003；Card et al.,2004；Willcox et al.,1999)。T細胞受體可以連接到毒素、藥物、細胞因子(參見US 2013/0115191)、招募效應細胞的結構域，如抗CD3結構域等，以便對靶細胞執行特定的功能。另一方面，它表達於用於過繼轉移的T細胞中。參見例如WO 2004/033685A1、WO 2004/074322A1和WO 2013/057586A1，其內容通過引用整體併入。

此外，可用本說明書的肽和/或TCR或抗體或其他結合分子在活檢樣本的基礎上驗證病理師對癌症的診斷。

該抗體或TCR也可用於體內診斷實驗。一般來說，抗體或TCR用放射性核素標記(如：^111In、⁹⁹Tc、¹⁴C、¹³1I、³H、³²P或³⁵S)，從而可免疫閃爍掃描法使腫瘤局限化。在一實施方案中，其中的抗體或片段與兩個或兩個以上選自包括上述蛋白質組成的組的蛋白質靶標的細胞外域結合，並且親和力值(Kd)低於1 x 10μM。

診斷用抗體或TCR可通過各種影像學方法使用適合檢測的探針進行標記。探針檢測方法包括但不限於，螢光、光、共聚焦和電鏡方法；磁共振成像和光譜學技術；透視、電腦斷層掃描和正電子發射斷層掃描。合適的探針包括但不限於，螢光素、羅丹明、曙紅及其它螢光團、放射性同位素、黃金、釓和其他稀土、順磁鐵、氟-18和其他正電子發射放射性核素。此外，探針可能是雙功能或多功能的，並且用一種以上的上述方法可進行檢測。這些抗體和/或TCR可用所述的探針直接或間接進行標記。抗體和/或TCR探針的連接，包括探針的共價連接、將探針融合入抗體或TCR、以及螯合化合物的共價連接從而結合探針、以及其他本行業熟知的方法。對於免疫組織化學方法，疾病組織樣本可能是新鮮或冷凍或可能包埋於石蠟中以及用福馬林等防腐劑固定。固定或包埋的切片包括與標記一抗和二抗接觸的樣本，其中該抗體用於檢測原位蛋白的表達。

本發明還涉及以下項目：

第1項。一種包含α鏈和β鏈的TCR，其中所述α鏈包含與SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：71中任一項所述的氨基酸序列至少90%相同的TCRα可變結構域；β鏈包含與SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：79中任一項至少90%相同的TCRβ可變結構域，其中TCR與MAG-003肽-MHC分子複合體特異性結合。

第2項。第1項所述的TCR，進一步包含一個TCR α恒定結構域和一個TCR β恒定結構域，其中所述TCR α恒定結構域與SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：71中任一項所述的TCR α恒定結構域至少70%相同；TCR β恒定結構域與SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：79中任一項所述的TCR β恒定結構域至少70%相同。

第3項。第1或第2任一項中所述的TCR，其中所述α恒定結構域包含α跨膜結構域VIGFRILLLKVAGFNLLMTL(SEQ ID NO：97)，β恒定結構域包含β跨膜結構域TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO：88)。

第4項。第1至第3任一項中所述的TCR，其中所述TCR α可變結構域由SEQ ID NO：39的氨基酸序列組成；TCR β可變結構域由SEQ ID NO：47的氨基酸序列組成。

第5項。第1至第3任一項中所述的TCR，其中所述TCR α可變結構域由SEQ ID NO：55的氨基酸序列組成；TCR β可變結構域由SEQ ID NO：63的氨基酸序列組成。

第6項。第1至第3任一項中所述的TCR，其中所述TCR α可變結構域由SEQ ID NO：71的氨基酸序列組成；TCR β可變結構域由SEQ ID NO：79的氨基酸序列組成。

第7項。第1至第6任一項中所述的TCR，其中所述TCR α恒定結構域由SEQ ID NO：39 的TCR α恒定結構域組成，TCR β恒定結構域由SEQ ID NO：47的TCR β恒定結構域組成。

第8項。第1至第6任一項中所述的TCR，其中所述TCR α恒定結構域由SEQ ID NO：55的TCR α恒定結構域組成，TCR β恒定結構域由SEQ ID NO：63的TCR β恒定結構域組成。

第9項。第1至第6任一項中所述的TCR，其中所述TCR α恒定結構域由SEQ ID NO：71的TCR α恒定結構域組成，TCR β恒定結構域由SEQ ID NO：79的TCR β恒定結構域組成。

第10項。第1至第9任一項中所述的TCR，其包含由SEQ ID NO：39組成的α鏈和由SEQ ID NO：47組成的β鏈。

第11項。第1至第9任一項中所述的TCR，其包含由SEQ ID NO：55組成的α鏈和由SEQ ID NO：63組成的β鏈。

第12項。第1至第9任一項中所述的TCR，其包含由SEQ ID NO：71組成的α鏈和由SEQ ID NO：79組成的β鏈。

第13項。第1至第12任一項中所述的TCR，其中所述TCR α鏈包含至少一個選自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：71的α鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組中的α鏈互補決定區(CDR)；和/或所述TCR β鏈包含至少一個選自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：79的β鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組中的β鏈互補決定區(CDR)。

第14項。第1至第13任一項中所述的TCR，其中所述TCR α鏈包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：71的全部三個CDR。

第15項。第1至第13任一項中所述的TCR，其中所述TCR β鏈包含SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：79的全部三個CDR。

第16項。第1至第15任一項中所述的TCR，其中所述α鏈和β鏈融合形成單鏈TCR。

第17項。第1至第16任一項中所述的TCR，其中所述α鏈和/或β鏈包含可檢測標記。

第18項。第17項中所述的TCR，其中可檢測標記選自放射性核素、螢光團和生物素組成的組。

第19項。第1至第18任一項中所述的TCR，其中所述α鏈和/或β鏈與治療活性劑共軛。

第20項。第17項中所述的TCR，其中治療活性劑選自由放射性核素、化學治療劑和毒素組成的組。

第21項。一種包含γ鏈和δ鏈的TCR，其中所述γ鏈包含至少一個選自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：71的α鏈 CDR1、CDR2和CDR3組成的組中的互補決定區(CDR)；和/或所述TCRδ鏈包含至少一個選自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：79的β鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組中的互補決定區(CDR)，並且其中所述TCR與MAG-003肽-MHC分子複合體特異性結合。

第22項。第1至第21任一項中所述的TCR，其中所述TCR特異性結合MAG-003肽-MHC分子複合體，其中所述MAG-003肽選自由SEQ ID NO：1-24組成的組，且MHC分子是HLA I類或HLA II類分子。

第23項。一種核酸，其編碼第1至20任一項中TCR的α鏈和/或β鏈或第21項中TCR的γ鏈和/或δ鏈。

第24項。一種表達載體，其包含與至少一個啟動子序列可操作地連接的第23項中的核酸。

第25項。用第24項中的表達載體轉化的一種宿主細胞。

第26項。第25項中的宿主細胞，其為T細胞或T細胞祖細胞。

第27項。第26項中的宿主細胞，其中T細胞或T細胞祖細胞獲得自癌症患者。

第28項。第26項中的宿主細胞，其中T細胞或T細胞祖細胞獲得自健康供體。

第29項。一種藥物組合物，其包含第1至22中任一項所述的TCR；第23項中的核酸、第24項中的表達載體和/或第25至28中任一項所述的宿主細胞；以及藥用載體，以及任選地藥用賦形劑和/或穩定劑。

第30項。一種當由MHC分子提呈時特異性結合於SEQ ID NO：1的肽的TCR的製備方法，所述方法包括在適於促進TCR表達的條件下培養第25至28中任一項所述的宿主細胞。

第31項。一種治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用第1至22任一項中的TCR、第23項中的核酸、第24項中的表達載體、第25至28任一項中的宿主細胞和/或第29項中的藥物組合物。

第32項。第31項中的方法，其中所述TCR在宿主細胞的表面上表達。

第33項。第31項中的方法，其中所述宿主細胞選自T細胞或T細胞祖細胞組成的組。

第34項。第33項中的方法，其中T細胞或T細胞祖細胞是自體細胞。

第35項。第33項中的方法，其中T細胞或T細胞祖細胞是同種異體細胞。

第36項。第31項中的方法，其中TCR與治療活性劑共軛。

第37項。第36項中的方法，其中治療活性劑選自由放射性核素、化學治療劑和毒素組成的組。

第38項。第1至22任一項中所述的方法，其中所述癌症為非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊癌、膽管癌和食管癌，或其組合。

第39項。第31至38任一項中所述的方法，進一步包括對所述受試者施用至少一種化學治療劑。

第40項。第31至39任一項中所述的方法，進一步包括對所述受試者施用放射治療。

第41項。一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括：a)從所述受試者中分離細胞；b)用編碼第1至22任一項中所述的TCR的一個載體轉化細胞以產生轉化細胞；c)擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和d)將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。

第42項。第41項中的方法，其中所述細胞選自T細胞或T細胞祖細胞。

第43項。一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括：a)從健康供體中分離細胞； b)用編碼第1至22任一項中所述的TCR的一個載體轉化細胞以產生轉化細胞；c)擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和d)將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。

第44項。第43項中的方法，其中所述細胞選自T細胞或T細胞祖細胞。

第45項。一種檢測生物樣本中癌症的方法，包括：a)使生物樣本與第1至22任一項中所述的TCR接觸，和b)檢測TCR與生物樣本的結合情況。

第46項。第45項中的方法，其中TCR包含可檢測標記。

第47項。第46項中所述的方法，其中可檢測標記選自放射性核素、螢光團和生物素組成的組。

第48項。第45至47任一項中所述的方法，其中所述檢測在體外、體內或原位進行。

第49項。第45至48任一項中所述的方法，其中所述癌症為非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊癌、膽管癌和食管癌，或其組合。

第50項。第25至28任一項中所述的宿主細胞，其中所述T細胞為γ/δ T細胞。

第51項。一種在靶細胞異常表達MAG-003的患者中殺傷靶細胞的方法，所述方法包含患者施用有效量的表達第1至22任一項中的TCR的T細胞、第23項中的核酸、第24項中的表達載體、第25至28任一項中的宿主細胞和/或第29項中的藥物組合物。

第52項。第1至22任一項中的TCR，其為可溶性TCR。

第53項。第1至22任一項中的TCR，其中所述α鏈包含與SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：71中任一項所述的氨基酸序列至少95%相同的TCRα可變結構域；β鏈包含與SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：79中任一項至少95%相同的TCRβ可變結構域，其中TCR與MAG-003肽-MHC分子複合體特異性結合。

第54項。第1至22任一項中的TCR，其相對於SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：71在α鏈中有至少一個突變和/或相對於SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：79在β鏈中有至少一個突變，並且其中TCR對MAG-003肽HLA分子複合體的結合親和力和/或結合半衰期是未突變TCR對相同肽的結合親和力和/或結合半衰期的至少兩倍。

第55項。第1至22任一項中的TCR，其相對於SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：71在α鏈中有至少一個突變和/或相對於SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：79在β鏈中有至少一個突變，並且其中與未突變的TCR相比，TCR已經修飾了糖基化。

第56項。第31至44或51中任一項所述的方法，其中施用第1至22任一項中的TCR、第23項中的核酸、第24項中的表達載體、第25至28任一項中的宿主細胞或第29項中的藥物組合物，施用兩次，間隔至少24小時。

第57項。第56項所述的方法，其中在數天、數週或數月的期限內向受試者施用第1至22任一項中的TCR、第23項中的核酸、第24項中的表達載體、第25至28任一項中的宿主細胞或第29項中的藥物組合物。

第58項。第56或57項所述的方法，其中通過局部輸注施用第1至22任一項中的TCR、第23項中的核酸、第24項中的表達載體、第25至28任一項中的宿主細胞或第29項中的藥物組合物。

第59項。第58項中的方法，其中局部輸注由輸注泵和/或導管系統施用。

第60項。第58或59項所述的方法，其中所述局部輸注為注入實體腫瘤、供應實體腫瘤的血管和/或實體腫瘤周圍區域。

第61項。第31至44、51或56至60中任一項所述的方法，其中施用第1至22任一項中的TCR、第23項中的核酸、第24項中的表達載體、第25至28任一項中的宿主細胞或第29項中的藥物組合物，施用一劑量，每劑量約10⁴至約10¹⁰個細胞。

第62項。一種TCR，包含至少一個α鏈互補決定區(CDR)，其選自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：71的α鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組；和/或至少一個β鏈互補決定區(CDR)，其選自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：79的β鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組，並且其中所述TCR與MAG-003肽-MHC分子複合體特異性結合。

實施例

當與來自自體情況(即患者)的T細胞相比時，異體反應性環境可用於規避自身耐受性並產生具有更高親合力的T細胞。這種情況的實例包括體外產生異體HLA反應性肽特異性T細胞(Sadovnikova et al.1998；Savage et al.2004；Wilde et al.2012)以及用人-MHC或人TCR對轉基因小鼠進行免疫(Stanislawski et al.2001；Li et al.2010)。

實施例1：體外產生異體HLA反應性肽特異性T細胞(Sadovnikova et al.2004)

獲得知情同意後，使用來自HLA-A*02陽性和HLA-A*02陰性健康供體的PBMC。從MBLI中獲得含有MAG-003的重組生物素化HLA-A2 I類單體和A2螢光四聚體。將PBMC使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)稀釋的抗CD20SA室溫下孵育1小時，洗滌，並使用生物素化的A2/MAG-003單體室溫下溫育30分鐘，洗滌並在具有10%人AB血清的RPMI中用24孔板以3×10⁶個細胞/孔進行鋪板。第1天以10ng/mL加入白細胞介素7(IL-7；R&D Systems,Minneapolis,MN)，第4天以10U/mL加入IL-2(Chiron,Harefield,United Kingdom)。在5週的期間，每週用新鮮的PBMC對細胞進行再刺激，用1：1的比例與應答細胞混合，並在24孔板中以3×10⁶/孔進行鋪板。

為了獲得高親合力T細胞，將大約10⁶個含有HLA-A2/MAG-003四聚體-藻紅蛋白(PE)(獲得自MBLI)的PBMC 37℃下孵育30分鐘，隨後用抗CD8-異硫氰酸螢光素(FITC)/別藻藍蛋白(APC)在4℃下孵育20分鐘，然後進行螢光啟動細胞分選 (FACS)-Calibur分析。用FACS-Vantage(Becton Dickinson,Cowley,Oxford,United Kingdom)進行分選。分選的四聚體陽性細胞在24孔板中擴增，方法為每孔2x10⁵個分選細胞、2x10⁶個經照射的A2陰性PBMC作為進料、2x10⁴ CD3/CD28珠/mL(Dynal,Oslo Norway)和IL-2(1000U/mL)。然後使用如此獲得的高親合力T細胞，採用本領域已知的技術鑒定和分離TCR，例如單細胞5'RACE(cDNA末端快速擴增)。然後使用本領域眾所周知的方法分析非冗餘TCR DNA進行氨基酸/DNA序列測定並克隆到表達載體中。

實施例2：用人-MHC或人TCR的轉基因小鼠進行免疫

MAG-003用於用完全的人TCR α β基因座(1.1和0.7Mb)對轉基因小鼠進行免疫，其T細胞表達補償小鼠TCR缺陷的多種人TCR譜。(Li et al.2010)。為了獲得高親合力T細胞，從轉基因小鼠獲得的PBMC與四聚體-藻紅蛋白(PE)一起孵育，然後按上所述進行細胞分選。然後使用如此獲得的高親合力T細胞鑒定和分離TCR進行氨基酸/DNA序列測定，並使用本領域描述的方法將其克隆到表達載體中。

一方面，MAG-003及其變體，即p286-1Y2L(具有2個氨基酸取代，SEQ ID NO：13) 和p286-1Y2L9L(具有3個氨基酸取代，SEQ ID NO：14)，表現出強有力的結合親和力和HLA-A*0201分子穩定性。特別地，p286-1Y2L9L顯示可誘導特異性CTL，其一方面裂解來自健康供體PBMC和HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠的靶向癌細胞。參見，例如，(Wu et al.2011)，該文中的內容通過引用整體併入本文。

為了獲得針對MHC I或II/p286-1Y2L或p286-1Y2L9L複合體的高親合力TCR，這些肽可用於實施例1和2中描述的方法。然後使用如此獲得的高親合力T細胞鑒定和分離TCR進行氨基酸/DNA序列測定，並使用本領域描述的方法將其克隆到表達載體中。

實施例3：TCR的克隆

克隆TCR的方法是本領域已知的，例如，如美國專利8,519,100中所述，其全部內容通過引用併入本文用於所述方法。編碼限制性位元點NdeI(用於在細菌中有效啟動表達的被引入的甲硫氨酸)的α鏈可變區序列特異性寡核苷酸A1(ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatcc SEQ ID NO：26)，和編碼限制性位元點SalI的α鏈恒定區序列特異性寡核苷酸A2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID NO：27)被用於擴增α鏈可變區。在β鏈的情況下，編碼限制性位元點NdeI(用於在細菌中有效啟動表達的被引入的甲硫氨酸)的β鏈可變區序列特異性寡核苷酸B1(tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa SEQ ID NO：28)和編碼限制性位元點AgeI的β鏈恒定區序列特異性寡核苷酸B2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEQ ID NO：29)被用於擴增β鏈可變區。

將用NdeI和SalI切割的編碼TCRα鏈的DNA序列連接到用NdeI和XhoI切割的pGMT7+Cα載體中。將用NdeI和AgeI切割的編碼TCRβ鏈的DNA序列連接到用NdeI和AgeI切割的單獨pGMT7+Cβ載體中。將結合的質粒轉化為感受態大腸桿菌菌株XL1-blue細胞中，並在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB/瓊脂板上鋪板。在37℃孵育過夜後，挑取單個菌落，並在含有100μg/ml氨苄青黴素的10ml LB中搖盪培養過夜。使用Miniprep試劑盒(Qiagen)純化克隆的質粒，並使用自動DNA測序儀(Lark Technologies)對插入片段進行測序。

從健康供體的T細胞中分離和擴增三種TCR(R20P1H7、R7P1D5和R10P2G12，參見表2)，每種編碼腫瘤特異性TCR-α和TCR-β鏈。根據Walter等人描述的方法體外刺激來自健康供體的細胞。靶標特異性細胞使用靶標特異性多重定位子進行單細胞分選，以進行隨後的TCR分離。例如根據Green和 Sambrook所著的分子克隆實驗室手冊第四版所述的標準方法通過5'RACE分離TCR序列。所有的三種TCR均來源於HLA-A2陽性供體。對TCR R20P1H7、R7P1D5和R10P2G12的α和β可變區進行測序。

發現R20P1H7TCR α可變結構域具有與SEQ ID NO：39的殘基22-133相對應的氨基酸序列。發現R20P1H7TCR β可變結構域具有與SEQ ID NO：47的殘基20-135相對應的氨基酸序列。

R7P1D5 TCR α可變結構域具有與SEQ ID NO：55的殘基22-131相對應的氨基酸序列。R7P1D5 TCR β可變結構域具有與SEQ ID NO：63的殘基20-131相對應的氨基酸序列。

R10P2G12 TCR α可變結構域具有與SEQ ID NO：71的殘基21-136相對應的氨基酸序列。R10P2G12 TCR β可變結構域具有與SEQ ID NO：79的殘基20-134相對應的氨基酸序列。

噬菌體展示技術可用於產生TCR變體庫，以識別高親和力突變。(Li et al,(2005)Nature Biotech 23(3)：349-354)一文中描述的TCR噬菌體展示技術和篩選方法可應用於選自表2所述TCR的參考TCR。

例如，SEQ ID NO：39、55和71的α鏈序列的所有三個CDR區以及SEQ ID NO：47、55和 79的β鏈序列的所有三個CDR區可以通過誘變進行靶向作用，並且每個CDR庫單獨進行篩選。

因此，鑒定親和力和/或結合半衰期至少是參考TCR兩倍的TCR(暗示至少是天然TCR的兩倍)。

使用包括在恒定區中引入半胱氨酸的方法重新折疊TCR異二聚體，以提供人造鏈間二硫鍵。使用這種方式製備了TCR，其由以下組成：(a)參考TCR β鏈以及突變的α鏈；(b)參考TCR α鏈以及突變的β鏈；和(c)β和α鏈的各種組合，包括突變可變結構域。

可以使用BIAcore方法分析高親和力可溶性二硫鍵連接的TCR和TCR變體以及天然肽KVLEHVVRV(SEQ ID NO：1)HLA-A*02複合體之間的相互作用。

高親合力TCR變體也可以通過酵母或T細胞展示技術從CDR突變體庫中選擇(Holler et al.2003；Chervin et al.2008)。因此，候選TCR變體為設計TCR CDR突變提供了指導，以獲得高親和力TCR變體(Robbins et al.2008；Zoete et al.2007)。

實施例4：自體T細胞工程技術

T細胞可進行工程化處理以表達高親合力TCR(所謂的TCR療法)或蛋白融合衍生的嵌合抗原受體(CAR)，增強了對MHC I/MAG-003複合體或 MHC II/MAG-003複合體的抗原特異性。一方面，該方法克服了與中樞和外周耐受性相關的一些限制，並且生成在靶向作用於腫瘤更有效的T細胞，而不需要患者進行新的T細胞活化。

一方面，為了獲得表達本說明書TCR的T細胞，編碼腫瘤特異性TCR-α和/或TCR-β鏈的核酸(按實施例1-3中所述進行鑒定和分離)被克隆入表達載體，諸如γ逆轉錄病毒或慢病毒。重組病毒產生，然後測試功能，如抗原特異性和功能性親合力。然後，最終產品的等分試樣被用於轉導靶T細胞群體(一般純化自患者的PBMC)，在輸入患者前擴增。

另一方面，為了獲得表達本說明書TCR的T細胞，TCR RNA通過本領域中所述的技術(例如，體外轉錄系統)合成。然後，體外合成的TCR RNA通過電穿孔來重新表達腫瘤特異性TCR-α和/或TCR-β鏈被引入獲得自健康供體的原代CD8+ T細胞。

為了確定TCR的特異性和親和力，將轉化的CD8 + T細胞與載有MAG-003的靶細胞或載有同源但不相關的肽RABGAP1L-001(SEQ ID NO：91)、AXIN1-001(SEQ ID NO：92)、ANO5-001(SEQ ID NO：93)、TPX2-001(SEQ ID NO：94)、SYNE3-001(SEQ ID NO：95)、MIA3-001(SEQ ID NO：96)、HERC4-001(SEQ ID NO：97)、PSME2-001(SEQ ID NO：98)、HEATR5A-001 (SEQ ID NO：99)或CNOT1-003(SEQ ID NO：100)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID NO：101)的靶細胞共孵育，然後進行IFN-γ釋放測定。無負載的靶細胞和CD8+ T細胞單獨作為對照。CD8+ T細胞分泌IFN-γ提示具有細胞毒活性的T細胞活化。

如圖5-7所示，在與載有MAG-003的靶細胞共培養後，用本次公開資料中TCR轉化的所有原代CD8+ T細胞釋放的IFN-γ水準不相關載入肽靶細胞和對照細胞刺激的水準高得多。靶向肽滴定分析顯示EC50範圍為約3nM至約10nM(表11)。這些結果表明，通過與MHC/MAG-003複合體的特異性相互作用，本發明的TCR可啟動細胞毒性T細胞活性，例如IFN-γ釋放。

使用四聚體染色技術進一步證實T細胞活化，以檢測MHC/MAG-003結合的活化細胞毒性T細胞。如圖8和表11所示，採用陽性螢光標記的MHC/MAG-003與採用MHC/NYESO1-001對照四聚體或模擬對照物相比，更高百分比的TCR表達CD8+ T細胞被染色。作為對照，已知與MHC/NYESO1-001複合體特異性結合的TCR(例如1G4TCR)所轉化的原代CD8 + T細胞較容易被NYESO1-001負載的靶細胞啟動。TCR1G4的α和β鏈分別顯示於SEQ ID NO：89和90中： 1G4 α鏈(SEQ ID NO：89)：

1G4 β鏈(SEQ ID NO：90)：

為了確定MAG-003/MHC複合體的TCR的結合基序，在MAG-003肽的9個氨基酸的每一個上均進行丙氨酸定位掃描分析。丙氨酸取代的MAG-003肽如表12所示。

用相關RNA編碼TCR電穿孔的CD8+ T細胞與載有MAG-003、MAG-003-A1至MAG-003-A9或不相關NYESO1-001肽共同孵育，隨後進行IFNγ釋放測定，如上所述。

丙氨酸定位掃描分析的結果所圖9-11所示，並表13中進行總結。

具有相同基序的A*02結合肽的全基因組篩選顯示，針對TCR R20P1H7、R7P1D5和R10P2G12無潛在交叉反應性肽。這些結果表明，本文所述的TCR表現出非常特定的識別模式，降低了非靶向作用的風險。

為了確定本文所述的表達TCR的T細胞的功效，用TCR R7P1D5、R20P1H7和R10P2G12的RNA電穿孔的原代CD8+ T細胞與不同的人癌細胞系共同孵育，例如A-375(人黑素瘤細胞系，HLA-A2和MAG-003表達呈陽性)、T98G(人成膠質細胞瘤細胞系，HLA-A2陽性、MAG-003陰性)和SK-BR-3(人乳腺癌細胞系，HLA-A2陰性和MAG-003陰性)，然後進行IFN γ釋放測定。

如圖12A-C所示，在HLA-A2呈陽性、MAG-003呈陽性的A-375細胞中觀察到IFN-γ釋放，但在T98G和SK-BR-3細胞中並非如此，其具有基礎水準的IFN-γ釋放，這與效應細胞具有可比性。另外，與人非小細胞癌細胞系H1755共同孵育時，用TCR R7P1D5轉化的CD8+ T細胞(而不是對照物)也顯示出IFN γ釋放增加(資料未列出)。這些結果表明，表達TCR R7P1D5、R20P1H7和R10P2G12 的T細胞可以HLA-A2/MAG-003特異性的方式特異性地誘導靶向作用於癌細胞的細胞毒活性。

本說明書提出了可用於治療癌症/腫瘤(優選為過度提呈或僅提呈MAG-003的黑色素瘤和非小細胞肺癌)的TCR。

實施例5：同種異體T細胞工程技術

γ δ T細胞是涉及抗病原體第一道防線的非常規T淋巴細胞效應子，可以通過啟動受體等、TCR-γ和TCR-δ鏈以MHC無關的方式與腫瘤細胞相互作用並根除腫瘤細胞。這些γ δ T細胞顯示出預活化的表型，其在啟動後可快速產生細胞因子(IFN-γ、TNF-α)和發生強細胞毒性反應。這些T細胞對許多癌症具有抗腫瘤活性，並表明γ δ T細胞介導的免疫治療是可行的並且可誘導客觀的腫瘤反應。(Braza et al.2013)。

使用固定化抗原、激動單克隆抗體(mAb)，腫瘤衍生的人造抗原呈遞細胞(aAPC)或活化mAb和aAPC的組合的最新進展已成功地用寡克隆或多克隆TCR擴增γ δ T細胞譜。例如，固定化的主要組織相容性複合體I類鏈相關A是表達TCR δ 1同種型的γ δ T細胞的刺激物，且板結合活化抗體已經離體擴增了V δ 1和V δ 2細胞。在aAPC上共培養後，產生了臨床上足夠量的TCR δ 1、TCR δ 2和TCR δ 1^negTCR δ 2^neg，並且這些亞組在體外和體內顯示出記憶表型和對腫瘤反應性的差異。(Deniger et al.2014)。

另外，通過引入TCR-α和TCR-β鏈可以證明γ δ T細胞適於遺傳修飾。(Hiasa et al.2009)。本說明書的另一方面涉及表達與MAG-003結合的TCR-α和TCR-β的γ δ T細胞的產生。為此，γ δ T細胞通過Deniger et al.2014所述的方法擴增，接著將表達與MAG-003結合(如實施例3所述)的TCR的重組病毒轉導入擴增的γ δ T細胞。然後將病毒轉導的γ δ T細胞輸注入患者。

實施例6：MAG-003特異性TCR的安全性

從健康供體的T細胞中分離和擴增三種MAG-003特異性TCR(R7P1D5、R10P2G12、R20P1H7，參見表2)，每種編碼腫瘤特異性TCR-α和TCR-β鏈。根據之前描述的方法(Walter et al.,2003 J Immunol.,Nov 15；171(10)：4974-8)體外刺激來自健康供體的細胞，靶標特異性細胞使用HLA-A*02多聚體進行單細胞分選，然後進行隨後的TCR分離。例如根據Green和Sambrook所著的分子克隆實驗室手冊第四版所述的標準方法通過5'RACE分離TCR序列。對TCR R7P1D5、R10P2G12和R20P1H7的α和β可變區進行測序並克隆以進行進一步的功能表征。TCR R7P1D5、R10P2G12和R20P1H7源自HLA-A*02陽性供體。

相關TCR通過RNA電穿孔在人T細胞中表達，並且在與不同靶細胞(例如載有不同肽的T2細胞以及腫瘤細胞系和來自健康組織的原代細胞)共培養後評估T細胞的IFN-釋放情況。T細胞活化資料以絕對IFN-水準或標準化方式顯示如下。

通過使用不同腫瘤細胞系作為靶細胞的T細胞活化研究(IFN-釋放)測定表達TCR R7P1D5、R10P2G12和R20P1H7的CD8+ T細胞的療效。在與來自健康組織的分離原代細胞類型和來自HLA-A*02陽性供體的誘導多能幹細胞(iPSC)來源的細胞類型共同培養後，通過測定TCR表達T細胞的潛在活化，逐步獲得相關TCR的安全性特徵的表徵(表13)。細胞類型選擇的方式是涵蓋大多數關鍵器官，例如，腦、心臟和肝臟以及作為上皮、內膜或平滑肌的不同細胞類型。腫瘤細胞系被逐側分析為陽性和陰性對照。

IFN γ釋放的標準化方法：平均值_{norm(TCRoi；co)}=[平均值_(TCRoi；co)-平均值_{(TCRoi；僅效應子)}]-[平均值_{(模擬；co)}-平均值_{(模擬；僅效應子)}]

計算各自的CV_norm：CV_{norm(TCRoi；co)}=[CV_(TCRoi；co) ²+CV_{(TCRoi；僅效應子)} ²+C_{V(模擬；co)} ²+CV_{(模擬；僅效應子)} ²]^[1/2]

TCRoi=表達相關TCR的相應細胞

模擬=無外源TCR表達的效應細胞

Co=與靶細胞共培養的效應細胞

僅效應子=未共培養的效應細胞

平均值_(norm)=平均IFN γ釋放(標準化)

CV_(norm)=變異係數(標準化)

結果：對於表達TCR R7P1D5、R10P2G12或R20P1H7的CD8+ T細胞，在與來自健康組織的HLA-A*02陽性細胞類型共培養後未觀察到活化(參見圖13)，而對表達HLA-A*02和MAGEA4作為MAG-003肽源基因的腫瘤細胞系A-375和NCI-H1755有活性。在表達NYESO1特異性TCR 1G4的CD8+ T細胞中觀察到相似的反應性模式，該細胞被發現對表達HLA-A*02陽性腫瘤細胞系的NYESO1具有反應性，但對指定的健康組織細胞組沒有反應性。

與表達HLA-A*02和MAGEA4的細胞系共培養後的T細胞活化反映了通過TCR R7P1D5、R10P2G12和R20P1H7識別內源表達和加工的靶標pHLA。

安全性分析表明TCR R7P1D5、R10P2G12和R20P1H7對健康組織原代細胞沒有非預期的交叉反應性，也沒有潛在的同種異體反應性。這是值得注意的，因為檢測的原代細胞類型在HLA-A*02的背景下代表數千個正常的HLA配體，並且可能還表示額外的同種異體HLA等位元基因，這根據不同的正常細胞類型而不同。

實施例7：本發明TCR的慢病毒表達

在小規模ACTengine製造過程後從分離自健康供體的大量總體外周血單核細胞(PBMC)開始產生T細胞產物。基於以前的研究和多個臨床試驗(Porter et al.,2011；Kalos et al.,2011；等等)，設計了表達本發明用於製造ACTengine T細胞的R7P1D5TCR的慢病毒載體骨架。簡要來說，解凍和復甦PBMC用CD3/CD28抗體活化，並用濃縮病毒上清液轉導，所述上清液製備使用各種慢病毒載體，其載有含不同方向的α和β鏈以及各種啟動子和增強子序列組合的R7P1D5TCR(構建體示為R71-R78)。8種構建體中有兩種(R74、R75)由於滴度低和/或產出率差而被消除。用剩餘的6種病毒上清液轉導的細胞被擴增，並通過流式細胞術方法評估轉基因表達。

方向如下：α-β：R71、R72、75、76；β-α：R73、R74、R77、78、IG4。

所有T細胞產物均顯示出相當的活力、淋巴細胞百分比以及CD3+ T細胞。CD4+和CD8+ T細胞的百分比根據供體而不同。在所有6種病毒上清液中，毒性方面沒有觀察到差異。根據檢測，R7P1D5 TCR慢病毒構建體R73通過四聚體結合在表面一致地誘導較高的TCR表達。基於轉基因表達，慢病毒構建體排序如下：R73>R78>R77>R71>R76>R72(圖14)。

為了證實R7P1D5 TCR R73病毒的轉導性，進行了2個新供體的額外實驗。所有實驗中的轉導細胞均進行了細胞因子釋放時功能評估測試和殺傷測定。在所有測試的供體中，與非轉導T細胞相比，源自四個供體的全PBMC的R73轉導T細胞在與表達MAGE-A4抗原的A375細胞共培養後顯示明顯更高的IFN γ產生量(圖15A)。IFN γ反應具有嚴格的抗原特異性，因為在缺乏MAGE-A4表達的MCF-7細胞存在下誘導低於背景水準。另外，在兩個供體中，EC₅₀值為10.0nM，該值源自代表應對MAG-003肽濃度降低檢測到的IFNγ量的T2滴定曲線(圖15B)。

除細胞因子釋放外，在4小時Cr51釋放殺傷試驗中測試了R7P1D5 TCR(R73病毒)轉導的T細胞產物。評估了提呈內源性加工MAG-003肽的MAGE-A4 + A375腫瘤細胞的識別和裂解情況。在所有E：T比例下，R73轉導T細胞顯示出對非轉導細胞的殺傷增加(圖16A、B)。R73轉導的細胞中觀察到的細胞毒作用以抗原特異性方式介導，因為在MAGE-A4+靶標中觀察到的裂解百分比顯著高於在MAGEA-A4-陰性靶細胞中觀察到的百分比(圖16C)。

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<213> 智人

<400> 81

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 82

<210> 83

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 83

<210> 84

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 84

<210> 85

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 85

<210> 86

<211> 179

<212> PRT

<213> 智人

<400> 86

<210> 87

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 87

<210> 88

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 88

<210> 89

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人

<400> 89

<210> 90

<211> 311

<212> PRT

<213> 智人

<400> 90

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 91

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 92

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 93

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 94

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 95

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 96

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 97

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 98

<210> 99

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 99

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 100

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 101

Claims

一種抗原識別構建體，其特異性地和/或選擇性地結合至與人白細胞抗原(HLA)I類分子複合的SEQ ID NO：1，且其中所述抗原識別構建體包括一TCR α可變結構域與一TCR β可變結構域，或一TCR γ可變結構域與一TCR δ可變結構域，且其中(i)所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的互補決定區(CDR)1、具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR2與具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR2與具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR3，或(ii)所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR2與具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的CDR2與具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列的CDR3，或(iii)所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括具有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的CDR2與具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括具有SEQ ID NO：82的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：83的氨基酸序列的CDR2與具有SEQ ID NO：84的氨基酸序列的CDR3。
如請求項1所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體為一種抗體或其衍生物或片段；所述抗原識別構建體為一α/β-TCR或其片段或衍生物；或所述抗原識別構建體為一γ/δ-TCR或其片段或衍生物。
如請求項2所述的抗原識別構建體，其中所述抗體為一雙特異性抗體。
如請求項1至3任一項所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體能夠在一受試者中誘導一免疫反應，任選其中所述免疫反應的特徵在於干擾素(IFN)γ水準增加。
如請求項1至3任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體被人源化、嵌合化和/或鼠源化。
如請求項1至3任一項所述的抗原識別構建體，包括一TCR α或γ鏈和/或一TCR β或δ鏈，其中(i)所述TCR α或γ鏈包含具有SEQ ID NO：58至60的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，且所述TCR β或δ鏈序列包含具有SEQ ID NO：66至68的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或(ii)所述TCR α或γ鏈序列包含具有SEQ ID NO：42至44的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，且所述TCR β或δ鏈序列包含具有SEQ ID NO：50至52的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或(iii)所述TCR α或γ鏈序列包含具有SEQ ID NO：74至76的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，且所述TCR β或δ鏈序列包含具有SEQ ID NO：82至84的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。
如請求項1至3任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體是包含至少一個TCR α和一個TCR β鏈序列的TCR或其片段，其中(i)所述TCR α鏈序列包含一具有SEQ ID NO：57 的氨基酸序列的可變區序列或一與SEQ ID NO：57的所述TCR α鏈具有至少90%同一性的一TCR α鏈，其中與SEQ ID NO：57的氨基酸序列具有至少90%同一性的所述可變區序列包括具有SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59與SEQ ID NO：60的氨基酸序列的CDR，其中該些CDR序列未經修飾，及所述TCR β鏈序列包含一具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列的可變區序列或一與SEQ ID NO：65的所述TCR β鏈具有至少90%同一性的一TCR β鏈，其中與SEQ ID NO：65的氨基酸序列具有至少90%同一性的所述可變區序列包括具有SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67與SEQ ID NO：68的氨基酸序列的CDR，其中該些CDR序列未經修飾；(ii)所述TCR α鏈序列包含一具有SEQ ID No：41的氨基酸序列的可變區序列或一與SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少90%同一性的一可變區序列，其中與SEQ ID NO：41具有至少90%同一性的所述可變區序列包括SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：44的CDR1至CDR3序列，其中該些CDR序列未經修飾，及所述TCR β鏈序列包含一具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的可變區序列或一與SEQ ID NO：49的氨基酸序列具有至少90%同一性的一可變區序列，其中與SEQ ID NO：49的氨基酸序列具有至少90%同一性的所述可變區序列包括具有SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51與SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR，其中該些CDR序列未經修飾；或(iii)所述TCR α鏈序列包含一具有SEQ ID NO：73的氨基酸序列的可變區序列或一與SEQ ID NO：73的所述TCR α鏈具有至少90%同一性的一TCR α鏈，其中與SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少90%同一性的所述可變區序列包括具有SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75與SEQ ID NO：76的氨基酸序列的CDR，其中該些CDR序列未經修飾，及所述TCR β鏈序列包含一具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的可變區序列或一與SEQ ID NO：81的所述TCR β鏈具有至少90%同一性的一TCR β鏈，其中與SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少90%同一性的所述可變區序列包括具有SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83與SEQ ID NO：84的氨基酸序列的CDR，其中該些CDR序列未經修飾。
如請求項1至3任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體是一包含至少一個TCR α和一個TCR β鏈序列的TCR，其中所述TCR α鏈序列包含與一選自SEQ ID NO：62、46和78的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的一恒定區；並且其中所述TCR β鏈序列包含與一選自SEQ ID NO：70、54和86的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的一恒定區。
一種核酸，其編碼如請求項1至8任一項所述的抗原識別構建體。
一種載體，其包含如請求項9所述的核酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項1至8任一項所述的抗原識別構建體或如請求項9所述的核酸或如請求項10所述的載體。
一種藥物組合物，其包含如請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體，或如請求項9所述的核酸，或如請求項10所述的載體，或如請求項11所述的宿主細胞，以及藥用載體、穩定劑和/或賦形劑。
一種藥物組合物，其包含一治療有效劑量的請求項1至8任一項所述的抗原識別構建體，或請求項9所述的核酸，或請求項10所述的載體，或請求項11所述的宿主細胞，或請求項12的藥物組合物。
一種請求項1至8任一項所述的抗原識別構建體、請求項9所述的核酸、請求項10所述的載體、請求項11所述的宿主細胞或請求項12的藥物組合物用於製造一藥物的用途，所述藥物用在診斷和/或治療一增殖性疾病，其中所述疾病包括一惡性或良性腫瘤疾病。
一種製備表達一腫瘤相關抗原(TAA)特異性抗原識別構建體的細胞系的方法，包括a.提供一合適的宿主細胞，b.提供一種遺傳構建體，其包含編碼如請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體的編碼序列，c.將所述遺傳構建體引入所述合適的宿主細胞，d.由所述合適的宿主細胞表達所述遺傳構建體。
如請求項15所述的方法，其中所述抗原識別構建體為一經修飾的TCR，其中所述修飾包括添加一包含一標記的功能結構域或一包含膜錨定結構域的結構域。