CN113337514B

CN113337514B - Tcr表达构建体以及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113337514B
Application number: CN202110898292.5A
Authority: CN
Inventors: 钟晓松; 张莹; 白玥
Original assignee: Carrizi Beijing Life Technology Co ltd
Current assignee: Carrizi Beijing Life Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: CN113337514A

Abstract

本发明涉及TCR表达构建体以及其制备方法和用途，具体地涉及一种用于表达T细胞受体(TCR)的TCR表达构建体、用该表达构建体所表达的TCR以及TCR复合体，包含所述TCR的T细胞，制备其的方法，以及应用所述TCR治疗肿瘤的方法以及其用途。

Description

TCR表达构建体以及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种用于表达T细胞受体(TCR)的TCR表达构建体、用该表达构建体所表达的TCR以及TCR复合体，包含所述TCR的T细胞，制备其的方法，以及应用所述TCR治疗肿瘤的方法以及其用途。

背景技术

TCR是识别组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。因此，TCR对免疫系统的细胞免疫功能是至关重要的。

如同抗体作为抗原识别分子一样，TCR也可以被开发应用于诊断和治疗。TCR可与其他分子(如，抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞，从而使其靶向呈递特定抗原的细胞，起到杀伤作用。

在免疫抑制性肿瘤微环境中，TCR工程化的T细胞具有有限的增殖和功能。一些研究者试图通过引入多种遗传修饰来改善转导的TCR的表面表达和效应子功能。例如引入鼠源序列代替人源恒定区序列，或者是在α和β链中分别加入半胱氨酸用来形成额外的二硫键从而稳定TCR的结构

T细胞受体ζ链(CD3ζ)是T细胞抗原受体的主要信号转导元件。已经描述了CD3ζ表达在来自癌症患者的T细胞中降低。TCR-ζ链表达的降低导致T细胞应答性受损。CD3ζ的功能在报道中明确阐述，参与构建TCR-CD3复合物，能促进T细胞功能，参与T细胞的信号转导。现有技术构建T细胞受体时，通常将TCRαβ和CD3ζ 分别让如两个载体中，或是将TCRα β放入两个表达载体，再分别加入CD3ζ，即VαCαζ和VβCβζ，此方法不能保证特异性TCRα β同时表达。同时，现有技术一般采用人源恒定区序列无法避免与内源TCR错配。

因此，现有技术需要一种新的TCR构建体，其能够促进TCR-T的表达和功能，并且提高其抗肿瘤效率，克服转染效率低导致的TCR表达量不足的问题。

发明内容

本发明在一个方面涉及一种新的TCR构建体，其依次包含

(i)编码TCRα链的核酸；

(ii)编码TCR β链的核酸；和

(iii)编码CD3 ζ链的核酸；

其中TCR α链与TCRβ链之间存在接头，且TCR β链和CD3ζ链之间存在接头，其中TCRα链和TCR β链均包含恒定区，且所述恒定区都来源于鼠；且所述CD3ζ链来源于人。

附图说明

图1：显示了转染TCR和不同链的PBL细胞中TCR+细胞百分比。

图2：图2A显示了转导的PBL与肿瘤细胞共培养中IFNγ的分泌；图2B显示了转导的PBL与肿瘤细胞共培养中IL-2的分泌；图2C显示了对细胞进行胸苷测定来检测细胞的增殖能力的结果；图2D显示了⁵¹Cr释放测定来检测细胞毒性的结果。

图3: 显示了用于转移和表达MART-1 TCR-α，β或MART-1 TCR-α，β加ζ基因的两种基于MSGV的逆转录病毒载体的结构图。

图4：图4A显示了PBL转导、刺激和分析的流程图；图4B显示了第6天FACS检测对转导了DMF5或DMF5 ζ 的T细胞中CD3ζ与CD8或CD4均为阳性的细胞的结果；图4C显示了第12天在转导DMF5或DMF5 ζ 的CD8⁺TCR⁺T细胞中CD3 ζ表达阳性的细胞的百分比。

图5: 图5A和5B显示了第6天和第12天转导DMF5或DMF5 ζ 的T细胞中TCR的表达结果。

图6：图6A和6B显示了转导了DMF5或DMF5ζ的细胞中IL-2和IFN-γ的释放；图6C显示了转导了DMF5或DMF5ζ的细胞的51Cr释放测定来检测细胞毒性的结果。图6D显示了转导了DMF5或DMF5ζ的细胞与肿瘤细胞共培养后的细胞增殖。

具体实施方式

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

1、T细胞受体

T细胞受体(TCR)是存在于T细胞表面的分子，其负责识别肽-MHC复合物。TCR与肽-MHC复合物的特异性结合引发T细胞通过一系列由相关酶、共受体和辅助性分子介导的生化事件而活化。在95%的T细胞中，TCR异二聚体由α和β链组成，而在5%的T细胞中，TCR异二聚体由γ和δ链组成。TCR的每一条链均属于免疫球蛋白超家族的成员，具有一个N端免疫球蛋白(Ig)可变(V)结构域、一个Ig恒定(C)结构域、跨细胞膜区域(即，跨膜区)以及在C末端的短胞质尾。

在TCR α链和β链的可变结构域中，各可变结构域具有三个高变区或互补决定区(CDR)，其中各可变结构域中的CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR。认为CDR2识别MHC分子。

TCR结构域的恒定结构域由短的连接序列组成，其中的半胱氨酸残基形成二硫键，在TCR α链和β链之间产生连接。

在T细胞成熟过程中，TCR与CD3形成TCR/CD3复合体。TCR/CD3复合体形成过程通常是按以下顺序进行的；首先CD3γ、δ和ε三种肽链通过形成γ-ε和δ-ε两种异源二聚体成为稳定的复合物核心，TCRαβ(或TCRγδ)与之结合，随后ζ-ζ或ζ-η二聚体与TCRαβ(或TCRγδ)/CD3γεδε复合物结合，最后转移到T细胞表面。通过TCR/CD3复合体将信号从TCR传导至细胞内。

来自TCR/CD3复合体的信号通过MHC与特异性共受体的同时结合而增强。在辅助T细胞中，这一共受体是CD4分子，所述CD4分子对II类MHC是特异性的；而在细胞毒性T细胞中，这一共受体是CD8，所述CD8分子对对I类MHC是特异性的。

2、其它定义

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10%的下限和比指定数字数值大10%的上限的范围内的数字数值。

术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

如本文中所用，“来源于人”或“来源于小鼠”的区域是指所述区域具有天然人或天然小鼠的该区域的氨基酸序列或编码核酸序列，或由该氨基酸序列或编码核酸序列组成。“来源于”人或小鼠的区域还涵盖这样的区域，其基本上与天然人或天然小鼠的该区域的氨基酸序列或编码核酸序列相同，或与所述序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，并且仍然具有与该区域相同或相似的活性和/或功能。例如当定义“所述CD3ζ链来源于人”时，是指所述CD3ζ链具有天然人CD3ζ链的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；或者是指CD3ζ链的氨基酸序列与天然人CD3ζ链的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，并且仍然具有天然人CD3ζ链的活性和/或功能。

如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30%、优选地至少40%、更优选地至少50%、60%和甚至更优选地至少70%、80%、90%、100%的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch ((1970) J.Mol. Biol. 48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E. Meyers和W. Miller算法, ((1989) CABIOS, 4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞，比如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合体。APC加工抗原且将其呈递给T细胞。

如本文所用，“载体(vector)”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、质粒、粘粒或噬菌体载体。

在本发明中术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。

在本文中，“受试者”、“个体”指需要缓解、预防和/或治疗新型冠状病毒感染的动物，优选哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。该术语包括具有新型冠状病毒感染或处于具有冠状病毒感染风险的人受试者。

具体描述

I. 本发明的TCR表达构建体

本发明在一个方面涉及一种新的TCR表达构建体，其依次串联包含

(i)编码TCRα链的核酸；

(ii)编码TCR β链的核酸；和

(iii)编码CD3 ζ链的核酸；

其中TCR α链和TCR β链均包含恒定区，且所述恒定区都来源于小鼠；且所述CD3ζ链来源于人；且

任选地，编码TCR α链的核酸与编码TCRβ链的核酸之间存在接头，和/或编码TCR β链的核酸和编码CD3ζ链的核酸之间存在接头。

在一些实施方案中，TCR α链包含可变区。在一些实施方案中，TCR β链包含可变区。在一些实施方案中，TCRα链的可变区和/或TCRβ链的可变区来源于人。

在本发明的一个实施方案中，TCR α链的恒定区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列，或由所述序列组成。

在本发明的一个实施方案中，编码TCR α链的核酸包含编码TCR α链恒定区的核酸，所述编码TCR α链恒定区的核酸包含SEQ ID NO:7的核酸序列，或包含与SEQ ID NO:7的核酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的核酸序列，或包含与SEQID NO:7的核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列，或由所述核酸序列组成。

在本发明的一个实施方案中，TCR β链的恒定区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列，或由所述序列组成。

在本发明的一个实施方案中，编码TCR β链的核酸包含编码TCR β链恒定区的核酸，所述编码TCR β链恒定区的核酸包含SEQ ID NO:16的核酸序列，或包含与SEQ ID NO:16的核酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的核酸序列，或包含与SEQID NO:16的核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列，或由所述核酸序列组成。

在本发明的一个实施方案中，CD3ζ链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列，或由所述序列组成。

在本发明的一个实施方案中，CD3ζ链来源于人的CD3ζ。

在本发明的一个实施方案中，编码CD3ζ链的核酸包含SEQ ID NO:22的核酸序列，或包含与SEQ ID NO:22的核酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的核酸序列，或包含与SEQ ID NO:22的核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列，或由所述核酸序列组成。

在本发明的一个实施方案中，TCR α链与TCRβ链之间的接头，或TCR β链和CD3ζ链之间的接头为自剪切肽，例如T2A或GSGP2A。在一个实施方案中，TCR α链与TCRβ链之间的接头为GSGP2A。在一个实施方案中，TCR β链和CD3ζ链之间的接头为T2A。在一个实施方案中，TCR α链与TCRβ链之间的接头为GSGP2A，且TCR β链和CD3ζ链之间的接头为T2A。在一个实施方案中，T2A包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由所述序列组成。在一个实施方案中，编码T2A的核酸包含SEQ ID NO:18的核酸序列或由所述核酸序列组成。在一个实施方案中，GSGP2A包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由所述序列组成。在一个实施方案中，编码GSGP2A的核酸包含SEQ ID NO:20的核酸序列或由所述核酸序列组成。

在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的TCR是针对MART-1的TCR。

因此，在一个实施方案中，TCR α链包含TCR α链可变区。在一些实施方案中，所述可变区包含如下的CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成，CDR2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成，CDR3包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，TCR α链包含TCR α链可变区，所述可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的氨基酸序列（在优选的实施方案中，所述变异不发生在CDR中），或包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列，或由所述序列组成。在一个实施方案中，TCRα链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的氨基酸序列（在优选的实施方案中，所述变异不发生在CDR中），或包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列，或由所述序列组成。在一个实施方案中，编码TCR α链的核酸包含SEQ ID NO:6的核酸序列，或包含与SEQ ID NO:6的核酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的核酸序列，或包含与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列，或由所述核酸序列组成。

因此，在一个实施方案中，TCR β链包含TCR β链可变区。在一些实施方案中，所述可变区包含如下的CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成，CDR2包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成，CDR3包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，TCR β链包含TCR β链可变区，所述可变区包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的氨基酸序列（在优选的实施方案中，所述变异不发生在CDR中），或包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列，或由所述序列组成。在一个实施方案中，TCRβ链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的氨基酸序列（在优选的实施方案中，所述变异不发生在CDR中），或包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列，或由所述序列组成。在一个实施方案中，编码TCR β链的核酸包含SEQ ID NO:15的核酸序列，或包含与SEQ ID NO:15的核酸序列相比具有1、2、3、4或5个变异（例如取代、插入或缺失）的核酸序列，或包含与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列，或由所述核酸序列组成。

在一些实施方案中，TCR表达构建体可以进一步包含编码标志物(例如，EGFRt或如所述的其他标志物)的核酸，该标志物通过接头(例如剪接肽例如T2A或GSGP2A)与TCR链隔开。在一些实施方案中，构建体可以任何次序排列，使得编码标志物序列在α和/或β链序列的3 '、在α和/或β链序列的5 '和/或在α与β序列之间，其中，在一些情况下，各分开组分由可裂解接头序列 (例如，T2A或P2A)或IRES隔开。

本发明的TCR表达构建体可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明表达构建体(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。

在本发明的另一个方面中，本发明涉及一种T细胞受体（TCR），其由本发明的TCR表达构建体在T细胞中表达产生。

本发明还涉及一种TCR复合物，其由本发明的TCR表达构建体在T细胞中产生。

本发明还涵盖本发明的TCR表达构建体、TCR或TCR复合物的变体，其具有一个或多个变异，例如取代、缺失或添加（优选不超过5个的取代、缺失或添加），只要其仍然具有相同或相似的活性。优选地，所述变异是取代。优选地，所述取代是保守取代。保守氨基酸取代是本领域已知的，并且包括这样的氨基酸取代，其中一个具有一定物理和/或化学性质的氨基酸被交换为另一个具有相同化学或物理性质的氨基酸。例如，所述保守氨基酸取代可以是酸性氨基酸取代另一个酸性氨基酸(如，Asp或Glu)，具有非极性侧链的氨基酸取代另一个具有非极性侧链的氨基酸(如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)，碱性氨基酸取代另一个碱性氨基酸(Lys、Arg等)，具有极性侧链的氨基酸取代另一个具有极性侧链的氨基酸(Asn、Cys、Gin、Ser，Thr，Tyr等)等，所述保守取代可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行。

在一些实施方案中，本发明的TCR变体可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的TCR，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的TCR，或(iii)本发明TCR与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些变体属于本领域熟练技术人员公知的范围。

II. 包含所述TCR表达构建体的表达载体和细胞，以及制备方法

本文中提供一种包含本文中所提供的TCR表达构建体的载体。在某些实施方案中，载体为表达载体。在特定实施方案中，载体为病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，病毒载体为逆转录病毒载体。逆转录病毒的详细列表参见Coffin等人，“Retroviruses”1997Cold Spring Harbour Laboratory Press编辑: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus，p758 763。

在特定实施方案中，本发明的病毒载体为逆转录病毒载体pMSGV1，衍生自pMSGV鼠干细胞病毒长末端重复，含有延伸的gag区域和Kozak序列（Rosenberg SA及Zhong XS的文章, Primary Human Lymphocytes Transduced with NY-ESO-1 Antigen-Specific TCRGenes Recognize and Kill Diverse Human Tumor Cell Lines, Chimeric antigenreceptors combining 4-1BB and CD28 signaling domains augment PI3kinase/AKT/Bcl-XL activation and CD8+ T cell-mediated tumor eradication）。

本文中提供一种包含本文中提供的任何TCR表达构建体或包含所述表达构建体的载体的工程化细胞。细胞一般为真核细胞，诸如哺乳动物细胞，且通常为人细胞。在一些实施方案中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴样器官，为免疫系统细胞，诸如先天性或适应性免疫细胞，例如骨髓样或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，诸如多潜能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括经诱导的多能干细胞(iPSC)。细胞通常为原代细胞，诸如直接从受试者分离和/或从受试者分离且冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，诸如完整T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞和其亚群，诸如根据以下定义的那些：功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况和/或分化程度。提及所治疗的受试者时，细胞可为同种异体细胞和/或自体细胞。这些方法包括现成方法。在一些方面中，诸如在现成技术中，细胞为多能和/或多潜能细胞，诸如干细胞，诸如经诱导的多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，方法包括如本文所述从受试者分离出细胞、对其进行制备、处理、培养和/或工程化，和在冷冻保存之前或之后将其再引入同一患者中。

在一些实施方案中，工程化细胞为细胞系，例如T细胞系。在特定实施方案中，工程化细胞为获自受试者的原代细胞。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物受试者。在某些实施方案中，受试者为人类。在特定实施方案中，工程化细胞为T细胞，优选地人T细胞。在一些实施方案中，细胞为人CD4+ T细胞或CD8+ T细胞，或CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的混合细胞群。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的TCR表达构建体或包含所述表达构建体的载体来表达或生产TCR或包含所述TCR的工程化细胞。通常所述方法包括：

(1)用编码本发明的TCR表达构建体或包含所述表达构建体的载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化出本发明工程化细胞或TCR。

在一些实施方案中，重组核酸经由电穿孔转移至细胞中。在一些实施方案中，重组核酸经由转座转移至细胞中。

III. 药物缀合物

在一些实施方案中，将例如小分子化合物的药物添加至本发明的TCR，特别是可溶性TCR中，从而获得药物缀合物。可以通过共价键或非共价相互作用，比如通过静电力来实现连接。可以使用本领域已知的各种连接子以便形成药物缀合物。

IV. 组合物、方法和用途

本发明一方面涉及组合物（例如药物组合物）或制剂，其包含本发明的TCR分子，或TCR复合物，或表达所述TCR表达构建体的工程化细胞。所述药物通常包括一种或多种任选的药学上可接受的辅料或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含至少一种其他的治疗剂。

“药学上可接受的辅料”是指药物配制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些实施方案中，所述其他的治疗剂可以是化疗剂或抗体，例如针对免疫检查点的抗体。

细胞或TCR可使用标准施用技术、制剂和/或装置施用。提供制剂和用于储存和施用组合物的装置，诸如注射器和小瓶。细胞的施用可为自体或异源的。例如，免疫反应性细胞或祖细胞可自一位受试者获得且向同一受试者或不同的相容受试者施用。衍生自外周血液免疫反应性细胞或其后代(例如体内、离体或体外来源的)可经由以下方式施用：局部注射(包括导管施用)、全身性注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用治疗性组合物(例如含有经遗传修饰的免疫反应性细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。

制剂包括用于经口、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、经皮、肌肉内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些配制剂。在一些实施方案中，细胞群体肠胃外施用。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道、颅内、胸内和腹膜内施用。在一些实施方案中，细胞群体使用外周全身性递送，通过静脉内、腹膜内或皮下注射向受试者施用。

本发明的另一方面涉及治疗或预防疾病的方法，其包括将应用本发明的TCR表达构建体、TCR、TCR复合物或包含本发明的TCR的工程化细胞，或包含上述的药物或制剂施用给受试者。在一些实施方案中，所述疾病是肿瘤，例如癌症，例如黑色素瘤。

在一些实施方案中，本发明的本发明的TCR表达构建体、TCR、TCR复合物或包含本发明的TCR的工程化细胞，或包含上述的药物或制剂可以与其他治疗剂联合用于治疗疾病。在一些实施方案中，所述其他的治疗剂可以是化疗剂或抗体，例如针对免疫检查点的抗体。

如本文所用，“治疗”是指疾病或病状或病症、或症状、副作用或结果、或与其相关的表型的完全或部分改善或减轻。所期望的治疗作用包括但不限于预防疾病发生或复发，缓解症状，减轻疾病的任何直接或间接病理性结果，预防癌转移，减缓疾病进展速率，改善或缓和疾病病况和缓解或改善预后。这些术语不表示疾病的完全治愈或任何症状的完全消除或对所有症状或结果均有作用。

如本文所用，“预防”包括在某一疾病在受试者中的出现或复发方面提供预防作用，该受试者可能易患该疾病但尚未诊断患有该疾病。在一些实施方案中，所提供的分子和组合物用于延迟疾病发展或减慢疾病进展。

组合物或制剂或细胞的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段下可有效达成所期望的治疗结果，诸如用于治疗疾病、病状或病症，和/或治疗的药物动力学或药效学作用的量。治疗有效量可根据诸如以下因素而变化：疾病病况、受试者的年龄、性别和体重，和所施用的细胞群体。在一些实施方案中，所提供的方法涉及施用有效量(例如治疗有效量)的结合分子、细胞和/或组合物。“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段下可有效达成所期望的预防性结果的量。通常但不一定，因为在疾病之前或在疾病早期在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量将低于治疗有效量。

本发明的TCR也可用作诊断试剂。用可检测标记物对本发明的TCR进行标记，如用适用于诊断目的的标记物标记，来检测MHC-肽与MHC-肽特异性的本发明TCR之间的结合。荧光标记的TCR多聚体适用于FACS分析，可用来检测携带TCR特异性的肽的抗原呈递细胞。

本发明还涉及本发明的TCR表达构建体、TCR、TCR复合物或包含本发明的TCR的工程化细胞在制备用于治疗疾病的药物或药物组合物或制剂的用途。

实施例

黑素瘤是破坏性肿瘤，并且在患者中常见。黑素瘤的发病率每年都在增加。尽管近年来，随着免疫疗法、显著的过继性T细胞疗法的出现和广泛应用，黑素瘤治疗取得了显著进展，但是在该领域中仍然存在许多问题有待解决。MART-1/Melan-A是一种可靠的和通常共享的黑素细胞标记物，在＞90%的黑素瘤中发现。Rosenberg等人设计了一种编码高亲和性TCR-α，β链的逆转录病毒载体，称为F5 MART-1 TCR [Johnson, L.A., et al., Genetransfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivityto nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltratinglymphocytes. J Immunol, 2006. 177(9): p. 6548-59]，当给予患有转移性黑素瘤的患者时排斥肿瘤消退[Goff, S.L., et al., Enhanced receptor expression and invitro effector function of a murine-human hybrid MART-1-reactive T cellreceptor following a rapid expansion. Cancer Immunol Immunother, 2010. 59(10): p. 1551-60. Hughes, M.S., et al., Transfer of a TCR gene derived from apatient with a marked antitumor response conveys highly active T-celleffector functions. Hum Gene Ther, 2005. 16(4): p. 457-72]，Morgan等人报道MART-1特异性TCR (DMF4)导致13%的客观响应率[Morgan, R.A., et al., Cancerregression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.Science, 2006. 314(5796): p. 126-9]。而客观响应率通常是轻微。需要在使用转基因T细胞的过继细胞转移中优化的免疫方法以获得更好的临床输出。

本实施例以黑素瘤为例，验证了本发明的T细胞受体构建体的效果。

材料和方法

1、细胞和培养物

本实施例中使用的所有外周血淋巴细胞(PBL)都获自健康志愿者。所用的培养基为X-VIVO 15培养基(LONZA，04-418Q)，其中补充有10%胎牛血清(FBS，HyClone，sv30160.03)、1%青霉素链霉素溶液(CORNING，30-002-CI)、2 mML-谷氨酰胺(ThermoFisher Scientific，15630080)和25mM HEPES (Thermo Fisher Scientific，15630-080)。

在手术分支从切除的肿瘤病灶产生黑素瘤细胞系624.38mel (MART-1⁺, HLA-A0201⁺), 526mel (MART-1⁺, HLA-A0201⁺), A375mel (MART-1⁺, HLA-A0201^-), 和888mel(MART-1⁺, HLA-A0201^-)。在37˚、5% CO₂下，将细胞系维持在RPMI1640培养基（补充有10%FBS和1%青霉素链霉素溶液）中。

2、实施例中用到的各条链的获得和TCR的构建

如下构建了由α，β链组成的TCR(MSGV1 DMF5)和由含α，β，ζ链的逆转录病毒载体组成的TCR(MSGV1 DMF5ζ)，两种TCR的示意图参见图3，构建方法如下。

2-1. TCR α链和β链mRNA的获得

根据文献报道的（Gene Transfer of Tumor-Reactive TCR Confers Both HighAvidity and Tumor Reactivity to Nonreactive Peripheral Blood MononuclearCells and Tumor-Infiltrating Lymphocytes, Laura A等人，J Immunol November 1,2006, 177 (9) 6548-6559; DOI:

https://doi.org/10.4049/jimmunol.177.9.6548)，黑色素瘤病人的肿瘤切除组织分离TIL体外培养，筛选单克隆，得到的反应性最强的一株是DMF5克隆。其TCRα链序列为SEQ ID NO:6, TCRβ链序列为SEQ ID NO:15。因此，根据TCR序列，在公司分别合成其TCR的α，β链的cDNA。以公司合成的cDNA为模板，利用试剂盒T7 mScript Standard mRNAProduction System (Cellscript; Cat. No.C-MSC11610 合成TCR α链和β链的mRNA，在5'端引入T7启动子以促进RNA的体外转录, 应用的引物如表1所示。

表1：TCR-α和TCR-β链的扩增引物

2-2. TCR-ε,δ,γ,ζ链的mRNA的获得

用总RNA分离试剂： TRIzol (Thermo Fisher Scientific，10296010) 从MART-1反应性TIL克隆DMF5中提取RNA，用逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific ，K1691）逆转录成cDNA。利用试剂盒T7 mScript Standard mRNA Production System (Cellscript;Cat. No.C-MSC11610) 合成TCR 合成TCR-ε,δ,γ,ζ链的mRNA，在5 '端引入T7启动子以促进RNA的体外转录, 应用的引物如表2所示。

表2：ε,δ,γ,ζ各条链的mRNA制备所用到的正向（F）和反向（R）引物

2-3、MSGV1 DMF5和MSGV1 DMF5ζ载体的构建

本研究中使用的逆转录病毒载体pMSGV1，衍生自pMSGV鼠干细胞病毒长末端重复，含有延伸的gag区域和Kozak序列。（Rosenberg SA及Zhong XS的文章, Primary HumanLymphocytes Transduced with NY-ESO-1 Antigen-Specific TCR Genes Recognize andKill Diverse Human Tumor Cell Lines, Chimeric antigen receptors combining 4-1BB and CD28 signaling domains augment PI3kinase/AKT/Bcl-XL activation andCD8+ T cell-mediated tumor eradication）。通过引入TCR-α链cDNA(SEQ ID NO:6)，随后引入弗林蛋白酶T2A切割序列(SEQ ID NO:18)和TCR-β链cDNA(SEQ ID NO:15)，产生载体MSGV1 DMF5（图3）。

通过引入TCR-α链cDNA(SEQ ID NO:6)，随后引入GSGP2A切割序列(SEQ ID NO:20)、TCR-β链cDNA(SEQ ID NO:15)、T2A切割序列(SEQ ID NO:18)和TCR-ζ链cDNA(SEQ IDNO:22)，产生载体MSGV1 DMF5ζ（图3）。其中，TCR-ζ链cDNA通过PCR反应获得，引物如表2所示。

PCR反应体系：

反应程序

基因连接序列来自Thosea asigna病毒(GSGP2A)和猪teschovirus-1 (T2A)。

序列具体如下：

2-4. GFP mRNA的获得

通过公司购入GFP的cDNA（SinoBiological，RG81059-U），利用试剂盒T7 mScriptStandard mRNA Production System (Cellscript; Cat.No.C-MSC11610)合成mRNA，引物如下：

GFP核酸序列：

Atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag（SEQ ID NO:23）

GFP蛋白序列：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK（SEQ ID NO:24）

2-5 CD3ζ siRNA和Control siRNA

后续部分实施例中使用了针对细胞内的CD3ζ或GFP的敲低，即CD3ζ siRNA和GFPsiRNA，如下所示进行：

使用试剂RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientifc，13778)，siCD3ζ（Thermo Fisher Scientifc， s534912 ），siControl (Thermo Fisher Scientifc，4390843) 敲低48h。

实施例1. CD3 ζ增加PBL中TCR的表达

表达肿瘤抗原特异性TCR的T细胞受体(TCR) -T细胞为异二聚体，由两个不同的亚单位α链和β链组成-可介导肿瘤患者的完全消退。TCR复合物由6个多肽2异二聚体、CD3γε和CD3δε、和1个同二聚体CD3ζ组成[Golubovskaya, V., et al., Major Highlights ofthe CAR-TCR Summit, Boston, 2016. Anticancer Agents Med Chem, 2017. 17(10):p. 1344-1350.]。为了验证TCR复合物的哪一成分对T细胞受体具有主要作用，如前文所述，分别获得DMF5 TCR α、β链以及CD3 ζ、δ、γ、ε的mRNA。克隆JFK6（另外一个已报道的病人肿瘤组织分离的TIL细胞株，对MART-1高活性, 参考文献：Gene transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactiveperipheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes）作为阳性对照包括在本研究中。

在含有5% CO₂的潮湿空气气氛中，在白介素-2（双鹰药业，200 IU/ml）存在下，使用50 ng/ml可溶性抗CD3抗体(OKT3，Biolegen，317302)刺激所述PBL 48小时。用上文所述获得的MART-1特异性TCR（DMF5）的α和β链的mRNA以及不同CD3链的组合（即DMF5与不同的链ζ、δ、γ、ε或ζ+δ+γ+ε组合）的mRNA电穿孔。

为了进行IVT RNA的电穿孔，将进行电穿孔的用OKT3加IL-2刺激2天的PBL用OPTI-MEM洗涤两次，并以2.5×10⁷个细胞/ ml的终浓度重悬于OPTI-MEM (Thermo FisherScientific，51985091)中。（使用材料：电转杯；电转仪，ECM830；电转条件： 200V, 0.8ms）

每1 ×10⁶细胞电转入总计2.0μg的上文制备的α和β链和ε,δ,γ,ζ各条链的mRNA。

电穿孔后，立即将细胞转移至具有200 IU/ml IL-2的新鲜培养基，在37°温育以进行进一步实验。

电穿孔24小时后，通过FACS分析测定MART-1 TCR的表达。用FITC-缀合的CD8（CD8-FITC（BD））和APC-缀合的MART-1/HLA-A0201四聚体抗体（Beckman-CoulterImmunomics）对细胞进行双染色，并且指示阳性细胞的百分比，以测试TCR四聚体的表达。

根据抗体说明书加入抗体CD8-FITC和四聚体抗体后避光孵育15min。每管中加入3ml PBS，500g离心10min，弃上清并重复一次洗涤。弃上清后加入500μl 1%多聚甲醛固定液，重悬细胞待上机检测。结果如图1所示，能够确定CD3ζ链是增加TCR四聚体的最重要因子。

实施例2 电穿孔到PBL中的肿瘤反应性DMF5后接ζ链RNA促进对黑素瘤肿瘤的更高反应性

我们接下来集中CD3ζ链对电穿孔的人PBL的影响。

如前文材料和方法中所示，如实施例1所述，对PBL分别电穿孔转导TCRα链，β链及ζ链的mRNA或上文制备的GFP RNA构建PBL，将所获得的PBL或阳性对照JFK6或阴性对照（即仅转染GFP质粒的PBL）与黑素瘤肿瘤细胞株624.38mel、526mel、A375mel和888mel进行37℃共培养24小时，通过IFN-γ和IL-2来评价这些细胞的功能性亲合力。

具体而言，在96孔板的各个孔中，在每孔0.2 ml培养体积中孵育1×10⁵个应答细胞(转导后的PBL或JFK细胞)和5×10⁴个肿瘤细胞，进行37℃共培养24小时，取上清作为待测试样品。将标准品（R&D Systems, DY008）与待测样品加入到预先包被干扰素-γ (INF-γ) ELISA试剂盒（R&D Systems, DY008）透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中干扰素-γ (INF-γ)浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中干扰素-γ (INF-γ)的含量。实验一式三份进行。ELISA 检测IL2检测方法相同（R&D Systems，D2050）。

结果如图2A和B所示，对表达HLA-A 0201限制性黑素瘤细胞系624.38mel (MART-1⁺，HLA-A0201⁺)，和526mel (MART-1⁺，HLA-A0201⁺)， α+β+ζ链能够产生最大量的IFN-γ，而α+β链和JKF6产生中等水平的应答，GFP对照仅具有可忽略的应答。但是，在与缺乏HLA-A0201的肿瘤细胞(A375mel，888mel；图2A)的共培养中，IFNγ产生均可忽略不计。

具有CD3ζ链的α+β链电穿孔转导的细胞能够产生更高量的IL-2 (图2B)。

对细胞进行胸苷测定来检测细胞的增殖能力（图2C）。共进行4组：

α+β：电穿孔转导了TCR α+β链的PBL。

α+β+ζ：电穿孔转导了TCR α+β链和ζ链的PBL。

α+β+CD3ζsiRNA：先将PBL细胞施用RNAiMAX（Transfection Reagent (ThermoFisher Scientifc)， siCD3ζ（thermo， s534912 ））敲低CD3ζ48小时后，电穿孔转导了TCRα+β链的PBL。

α+β+siControl：先将PBL细胞施用RNAiMAX（Transfection Reagent (ThermoFisher Scientifc，)， siControl (thermo，4390843)）敲低 48小时后，电穿孔转导了TCRα+β链的PBL。

具体的测定步骤如下：

为了通过胸苷进行增殖测定，将上述转导的PBL（效应细胞）和各个肿瘤细胞（624.38mel、526mel、A375mel、888mel，靶细胞）共培养以产生效应物：靶(E：T)比10:1。

在收获前16小时将1μCi的³H胸苷加入到PBL和各个肿瘤细胞的培养基中，并每分钟计数 (cpm)。然后，用自动细胞收获器(Pharmacia)收获孔，将闪烁液(Pharmacia)加到计数器中，测量放射性。实验一式三份进行。

图2C显示，[3H ]-胸苷掺入水平（CPM）为α+β+ζ＞α+β≈α+β+siControl＞α+β+siCD3ζ (图2C)。

进一步进行51Cr释放测定来检测细胞毒性。共进行4组：

共进行4组，4组中的效应细胞（E）如下：

α+β：电穿孔转导了TCR α+β链的PBL。

α+β+ζ：电穿孔转导了TCR α+β链和ζ链的PBL。

α+β+siCD3ζ：先将PBL细胞施用RNAiMAX（Transfection Reagent (Thermo FisherScientifc, 13778)， siCD3ζ（thermo， s534912 ））敲低CD3ζ48小时后，电穿孔转导了TCRα+β链的PBL。

α+β+siControl：先将PBL细胞施用RNAiMAX（Transfection Reagent (ThermoFisher Scientifc，13778)， siControl (Thermo Fisher Scientifc ，4390843)）敲低48小时后，电穿孔转导了TCR α+β链的PBL。

在37°下用200uCi的Na₂ ⁵¹CrO₄(Amersham Biosciences)标记1×10⁶肿瘤靶细胞(624.38mel、526mel、A375mel、888mel)1小时，获得靶细胞（T）。

然后用完全培养基（含有RPMI1640培养基（补充有10% FBS和1%青霉素链霉素溶液）的完全培养基）洗涤上述四组中获得的转导的PBL（E），并与上述获得的转导的PBL(5×10³)图2B所示的（E:T）比例温育。在37°下孵育4小时后，收集上清液并在闪烁计数器上计数。

细胞溶解百分比通过下式计算：特异性裂解百分比= (样品⁵¹Cr释放-自发的⁵¹Cr释放)/(总的⁵¹Cr释放-自发的⁵¹Cr释放)×100。

电穿孔PBL以在不同E:T下裂解HLA-A0201黑素瘤靶的能力用⁵¹Cr释放测定分析。图2D显示了结果。α+β+ζ链转导的PBL可以有效地杀死MART-1/HLA-A0201双阳性黑素瘤细胞系(图2D)，而仅仅用α+β链转导的PBL的细胞裂解百分比较差。

应用了α+β链转导的具有siControl的PBL效果与转导α+β链效果一致。

此外，应用α+β链转导，但是对CD3进行了敲低的PBL效果最差。

实施例3. CD3ζ链在转导的DMF5ζ的T细胞中的表达较高

在材料和方法中详细描述两种逆转录病毒载体MSGV1 DMF5和MSGV1 DMF5ζ的构建。图3显示了用于转移和表达MART-1 TCR-α，β或MART-1 TCR-α，β加ζ基因的两种基于MSGV的逆转录病毒载体的结构图。在这些载体中，α和β链都由LTR介导，但在不存在或存在GSG接头的情况下由不同的2A肽(T2A或GSGP2A)连接。在载体MSGV1F5 Mζ中，表达通过ζ链偶联。

用OKT3 Ab加IL-2刺激2天PBL后，应用获得的载体MSGV1 DMF5和MSGV1 DMF5ζ病毒构建体对其进行转染，进行3天。具体过程如下：

逆转录病毒载体转染PG13细胞株，两天后，收集上清为逆转录病毒上清液。逆转录病毒上清液在37°下加入到平板中2小时，然后在4°下过夜培养，所述平板已经用15g/ml重组纤连蛋白片段(Takara，T202)包被。

病毒转染过程如下：0.5 ml Retronectin （15 ug/ml）加入12孔板，室温避光孵育2 h。弃掉上清，加入0.5% human AB血清（PBS配置），培养30min, 弃掉上清。加入0.5mlPBL细胞（1.6 × 10⁶/ml ）与0.5ml病毒上清液，用封口膜封闭孔板，700g，离心1h后，放入37°培养箱培养。

然后洗涤所获得的PBL，并在37°下以1×10⁶细胞/ ml (5 ml /孔)将其转导到具有逆转录病毒的平板中过夜，第二天，重复转移细胞。转导后，洗涤PBL并在5% CO₂培养箱中于37°重悬于新鲜细胞T细胞培养基中。

将上述获得的转导的PBL分别与肿瘤细胞系624.38mel (MART-1⁺，HLA-A0201⁺)共培养24小时（第一次刺激）（E:T=10:1）后，在第6天，对所述的PBL应用FACS进行功能测定。具体而言，如实施例1所述的用FACS，通过FITC-缀合的CD4(CD4-FITC（BD）)、FITC-缀合的CD8（ CD8-FITC（BD））和APC-缀合的CD3ζ抗体（BD）对细胞进行染色，检测对CD3 ζ与CD8或CD4均为阳性的细胞。结果如图4B示。转导DMF5ζ的细胞的CD3ζ 在CD3阳性，CD4阳性以及CD8阳性的T细胞中高表达。

在第11天，将转导的PBL细胞再次与肿瘤细胞系624.38mel (MART-1+，HLA-A0201⁺) 共培养24小时（第二次刺激）（E:T=10:1）并且测量所述PBL中的CD3 ζ的水平。实验过程示意图参见图4A。

之后，通过FACS分别门控和定量总T细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中的CD3ζ。具体步骤如下：

用FITC-缀合的CD3抗体（CD3-FITC（BD））、FITC-缀合的CD8（CD8-FITC（BD））、FITC-缀合的CD4（CD4-FITC（BD））、PE-缀合的TCRζ抗体、APC-缀合的MART-1/HLA-A0201四聚体抗体（Beckman-CoulterImmunomics）染色上文获得第12天的PBL细胞，以测量表面CD3ζ。使用BD FacsCanto II Plus (BD Biosciences)进行流式细胞术，并用FlowJo (Tree Star)进行分析。

结果如图4C所示。在第12天，DMF5ζ转导的CD8阳性的T细胞中CD3ζ表达依然高于DMF5转导的CD8阳性的T细胞。

因此，我们成功地产生了两种功能性HLA-A0201限制性及MART-1特异性TCR载体DMF5和DMF5 ζ，以用于后续实验。

实施例4. CD3 ζ链的过表达可以在两轮肿瘤抗原刺激后维持和增强MART-1 TCR表达水平

为了确定影响TCR表达的CD3 ζ链的过度表达是否持久，进行连续分析以寻找细胞表面上TCR的差异表达。

如图4A的实验过程示意图所示，在实施例3中获得的PBL培养到第11天，用新鲜的肿瘤细胞(624.38mel)再刺激上述PBL(10:1)，具体操作过程如实施例3所述。在第12天，在两轮肿瘤刺激后，使用CD8抗体和MART-1四聚体通过MART-1四聚体染色PBL监测TCR表达（FACS检测法如实施例1所述）。结果参见图5A和图5B。在第六天（第一轮刺激后），转导DMF5和DMF5ζ 的PBL细胞中TCR阳性的表达率分别为31.85%和39.19%，在两轮刺激后（第12天），转导DMF5和DMF5ζ 的PBL细胞中TCR阳性的表达率分别为32.95%和45.75%。

综上， MART-1 TCR表达水平在转导DMF5 ζ 的CD8阳性的T细胞中表达显著较高(42.75%比32.95%) 。

实施例5. DMF5 TCR工程化的CD8+ T细胞的激活和增殖可通过具有CD3ζ链而显著提高。

肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞在肿瘤排斥中的作用已经得到了很好地确立。因此我们的实验检测CD8+ T细胞的功能变化。

如实施例3（具体流程参见图4A）所述，应用DMF5和DMF5ζ构建体对T细胞（第三天和第四天）进行了逆转录病毒的转染。在第6天，即转导后2天，将转导的T细胞分别与MART-1 /HLA-A0201双阳性黑素瘤肿瘤系(624.38mel，526mel) 和两种HLA-A0201阴性但MART-1阳性肿瘤系(A375mel，888mel)共培养24小时（第一次刺激）。

如实施例2所示检测了细胞中IL-2和IFN-γ的分泌，结果如图6A和6B所示，转导了MSGV1 DMF5 ζ的细胞中，可以有效产生IL-2和IFN-γ的释放。

如实施例2所述进行51Cr释放测定来检测细胞毒性。将10⁶肿瘤细胞(624.38mel，526mel, A375mel，888mel) 在多个E:T下与转导的T细胞共培养过夜。通过百分比裂解评价了转导的CD8+ T细胞的细胞毒性，结果如图6C所示。DMF5 ζ病毒转染的CD8+T细胞可以有效地杀死MART-1/HLA-A0201双阳性黑素瘤细胞系，而仅仅用DMF5转导的CD8+T细胞的细胞裂解百分比较差。

将CFSE标记法检测T细胞增殖：转导后的效应细胞PBL在24孔圆底板中以1 ×10⁶细胞/孔与1×10⁵细胞/孔各个黑素瘤细胞系共培养（10:1），用2.5μM预热的CFSE (ThermoFisher Scientific，C34554)标记细胞，并在5天共培养后，收集细胞，PBS清洗一遍，加入配好的CD3抗体（BD）染色液（CD3抗体+PBS, 1:1000）, CD8抗体（BD）染色液（CD8抗体+PBS, 1:1000）以及MART-1 TCR（APC-缀合的MART-1/HLA-A0201四聚体抗体（Beckman-CoulterImmunomics））进行染色, 室温避光孵育15min， PBS清洗，流式检测CFSE 信号。如图6D显示，在抗原阳性的肿瘤细胞624.38mel刺激下，转导DMF5 ζ 的PBL细胞的增殖要强于DMF5转导的CD8 T细胞。

序列表

<110> 卡瑞济（北京）生命科技有限公司

<120> TCR表达构建体以及其制备方法和用途

<130> PF 200396CNI

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 1

Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly

1 5 10 15

Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser

20 25 30

Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met

35 40 45

Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp

50 55

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 2

Gly Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Thr

1 5 10 15

Cys Cys

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 3

Ala Thr Ala Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

Ala Cys

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 4

Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys

1 5

<210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 5

Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala

20 25 30

Val Asn

<210> 6

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 6

cagaaggagg tggagcagaa ttctggaccc ctcagtgttc cagagggagc cattgcctct 60

ctcaactgca cttacagtga ccgaggttcc cagtccttct tctggtacag acaatattct 120

gggaaaagcc ctgagttgat aatgttcata tactccaatg gtgacaaaga agatggaagg 180

tttacagcac agctcaataa agccagccag tatgtttctc tgctcatcag agactcccag 240

cccagtgatt cagccaccta cctctgtgcc gtgaac 276

<210> 7

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 7

gatggaaggt ttacagcaca gctcaataaa gccagccagt atgtttctct gctcatcaga 60

gactcccagc ccagtgattc agccacctac ctctgtgccg tgaac 105

<210> 8

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 8

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro

50 55 60

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 9

Ala Thr Gly Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Ala Thr Gly Cys Cys

1 5 10 15

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 10

Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Ala

1 5 10 15

Cys Cys

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 11

Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys

1 5 10

<210> 12

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 12

Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser

20 25 30

Ser Asp

<210> 13

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 13

Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly

1 5 10 15

Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser

20 25 30

Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met

35 40 45

Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln

50 55 60

Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln

65 70 75 80

Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn

85 90

<210> 14

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 14

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp

85 90 95

<210> 15

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 15

attgctggga tcacccaggc accaacatct cagatcctgg cagcaggacg gcgcatgaca 60

ctgagatgta cccaggatat gagacataat gccatgtact ggtatagaca agatctagga 120

ctggggctaa ggctcatcca ttattcaaat actgcaggta ccactggcaa aggagaagtc 180

cctgatggtt atagtgtctc cagagcaaac acagatgatt tccccctcac gttggcgtct 240

gctgtaccct ctcagacatc tgtgtacttc tgtgccagca gtgac 285

<210> 16

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 16

cctgatggtt atagtgtctc cagagcaaac acagatgatt tccccctcac gttggcgtct 60

gctgtaccct ctcagacatc tgtgtacttc tgtgccagca gtgac 105

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 17

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 18

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 18

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acct 54

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 19

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 20

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 20

gcgacgaatt ttagtttgct taagcaagcc ggagatgtgg aggaaaatcc tggaccg 57

<210> 21

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 21

Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Arg Val Lys Phe Ser Arg

1 5 10 15

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

20 25 30

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

35 40 45

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

50 55 60

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

65 70 75 80

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

85 90 95

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

100 105 110

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

115 120

<210> 22

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 22

atgaaggttc tgtgggctgc gttgctggtc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 60

cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 120

gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 180

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 240

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 300

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 360

cctcgc 366

<210> 23

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 23

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 24

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 24

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

Claims

1.一种新的TCR表达构建体，其依次串联包含

(i)编码TCRα链的核酸；

(ii)编码TCR β链的核酸；和

(iii)编码CD3 ζ链的核酸；

其中TCR α链和TCR β链均包含恒定区，且所述恒定区都来源于小鼠；且所述CD3ζ链来源于人，

其中TCR α链的恒定区由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成或编码TCR α链恒定区的核酸由SEQ ID NO:7的核酸序列组成；

TCR β链的恒定区由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成或编码TCR β链恒定区的核酸由SEQ ID NO:16的核酸序列组成；

CD3ζ链由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成，或编码CD3ζ链的核酸由SEQ ID NO:22的核酸序列组成；

其中TCR是针对MART-1的TCR，

TCR α链包含TCR α链可变区，其包含如下的CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，CDR2由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成，CDR3由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；且

TCR β链包含TCR β链可变区，其包含如下的CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成，CDR2由SEQ ID NO:10的氨基酸序列或组成，CDR3由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的TCR表达构建体，其中，编码TCR α链的核酸与编码TCRβ链的核酸之间存在接头，和/或编码TCR β链的核酸和编码CD3ζ链的核酸之间存在接头。

3.权利要求1或2的TCR表达构建体，其中

TCRα链的可变区和/或TCRβ链的可变区来源于人。

4.权利要求1或2的TCR表达构建体，其中TCR α链与TCRβ链之间的接头，或TCR β链和CD3ζ链之间的接头为自剪切肽。

5.权利要求4的TCR表达构建体，其中自剪切肽为T2A或GSGP2A。

6.权利要求5的TCR表达构建体，其中T2A由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成或编码T2A的核酸由SEQ ID NO:18的核酸序列组成。

7.权利要求5或6的TCR表达构建体，其中GSGP2A由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成或编码GSGP2A的核酸由SEQ ID NO:20的核酸序列组成。

8.权利要求1或2的TCR表达构建体，其中TCR α链与TCRβ链之间的接头为GSGP2A和/或TCR β链和CD3ζ链之间的接头为T2A。

9.权利要求8的TCR表达构建体，其中T2A由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成或编码T2A的核酸由SEQ ID NO:18的核酸序列组成。

10.权利要求8的TCR表达构建体，其中GSGP2A由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成或编码GSGP2A的核酸由SEQ ID NO:20的核酸序列组成。

11.权利要求1或2的TCR表达构建体，TCR α链包含的TCR α链可变区由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

12.权利要求11的TCR表达构建体，其中TCRα链由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成；或编码TCR α链的核酸由SEQ ID NO:6的核酸序列组成。

13.权利要求1或2或12的TCR表达构建体，其中

TCR β链包含的TCR β链可变区由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。

14.权利要求13的TCR表达构建体，其中TCRβ链由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；或编码TCR β链的核酸由SEQ ID NO:15的核酸序列组成。

15.权利要求11的TCR表达构建体，其中

TCR β链包含的TCR β链可变区由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。

16.权利要求15的TCR表达构建体，其中TCRβ链由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；或编码TCR β链的核酸由SEQ ID NO:15的核酸序列组成。

17.TCR，其由权利要求1-16中任一项的TCR表达构建体编码并产生。

18.TCR复合物，其由权利要求1-16中任一项的TCR表达构建体在T细胞中产生。

19.载体，其包含权利要求1-16中任一项的TCR表达构建体。

20.权利要求19的载体，其为表达载体。

21.权利要求20的载体，其中所述表达载体为逆转录病毒载体。

22.权利要求21的载体，其中所述逆转录病毒载体为pMSGV1。

23.工程化细胞，其包含权利要求1-16中任一项的TCR表达构建体，或权利要求19-22中任一项的载体。

24.权利要求23的工程化细胞，其中所述细胞为T细胞。

25.权利要求24的工程化细胞，其中所述T细胞为人T细胞。

26.权利要求25的工程化细胞，其中所述人T细胞为CD4+细胞或CD8+细胞，或CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的混合细胞群。

27.生产工程化细胞的方法，其包括

(1)用权利要求1-16中任一项的TCR表达构建体或权利要求19-22中任一项的载体转化或转导宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化出工程化细胞。

28.权利要求27的方法；其中所述表达构建体或载体经由电穿孔转移至细胞中或经由转座转移至细胞中。

29.组合物，其包含权利要求1-16中任一项的TCR表达构建体、权利要求17的TCR、权利要求18的TCR复合物、权利要求19-22中任一项的载体或权利要求23-26中任一项的工程化细胞。

30.权利要求29的组合物，其中所述组合物为药物组合物。

31.权利要求29或30的组合物，其还包含药学上可接受的辅料。

32.权利要求1-16中任一项的TCR表达构建体、权利要求17的TCR、权利要求18的TCR复合物、权利要求19-22中任一项的载体或权利要求23-26中任一项的工程化细胞或权利要求29-31中任一项的组合物用于制备治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述疾病是癌症。

33.权利要求32的用途，其中所述癌症是黑色素瘤。

34.权利要求32或33的用途，其中所述权利要求1-16中任一项的TCR表达构建体、权利要求17的TCR、权利要求18的TCR复合物、权利要求19-22中任一项的载体或权利要求23-26中任一项的工程化细胞或权利要求29-31中任一项的组合物与一种或多种其他治疗剂联合。

35.权利要求34的用途，其中所述治疗剂为化疗剂或抗体。