DE102019108125B4

DE102019108125B4 - Cd28 t-zellkulturen, zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung

Info

Publication number: DE102019108125B4
Application number: DE102019108125.4A
Authority: DE
Inventors: Amir ALPERT; Mamta Karla
Original assignee: Immatics US Inc
Current assignee: Immatics US Inc
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2022-02-03
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN113727721A; DE102019108125A1; CA3133989A1; JP2022526298A; AU2020241411A1; EP3941487B1; SG11202110164YA; TW202043465A; EP3941487A1; MX2021011375A; KR20210141599A

Abstract

Verfahren zur Herstellung von T-Zellen mit verbesserter Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie, umfassenda) Bestimmen des Prozentsatzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in einer isolierten CD8+ T-Zellpopulation, undb) Aktivieren der bestimmten Population mit dem Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper, vorausgesetzt, dass die bestimmte Population mindestens etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst, oder Aktivieren der bestimmten Population mit dem Anti-CD3-Antikörper in der Abwesenheit eines Anti-CD28-Antikörpers, vorausgesetzt, dass die bestimmte Population weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zur Verbesserung der Wirksamkeit von T-Zellen bereit. In einem Aspekt stellt die Offenbarung ferner Verfahren zur Verbesserung und Vorhersage der finalen Größenordnung der Expansion, des Verhältnisses von CD8:CD4 T-Zellen, der relativen finalen Telomerenlänge und des klonalen Reichtums des T-Zellproduktes bereit. Die Offenbarung umfasst auch Verfahren zur Krebsbehandlung bei einem Patienten, der diese benötigt, sowie T-Zell-Populationen, die nach den vorliegend beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
2. Stand der Technik
Die Immuntherapie hat sich als vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Krebserkrankungen erwiesen. Die Immuntherapie lässt sich in zelluläre Therapien und niedermolekulare Therapien/Antikörper-Therapien unterteilen. Im Bereich der zellulären Therapie haben chimäre Antigenrezeptor-T (CAR-T)-Zelltherapien eine starke klinische Wirksamkeit bei hämatologischen Tumoren gezeigt, während T-Zell-Rezeptor-T (TCR-T)-Zell-basierte Therapien bei verschiedenen soliden Tumorindikationen bereits früh vielversprechende Ergebnisse gezeigt haben.
Die Wirksamkeit der klinischen Produkte kann durch ihre in vivo-Eigenschaften bestimmt werden, die während des ex vivo-Herstellungsprozesses weitgehend vorgegeben werden können.
Im US-Patent 8.383.099 wird ein Verfahren zur Förderung der Regression einer Krebserkrankung in einem Probanden beschrieben, z. B. durch die Kultivierung von autologen T-Zellen; Erweiterung der kultivierten T-Zellen mit OKT3-Antikörper, IL-2 und Feeder-Lymphozyten.
Im US-Patent 9.074.185 wird ein Verfahren zur Herstellung eines T-Zell-Infusionsprodukts zur Förderung der Regression einer Krebserkrankung in einem Probanden beschrieben, einschließlich der Kultivierung autologer T-Zellen; Anreicherung der kultivierten T-Zellen für CD8+ T-Zellen; Erweiterung der Anzahl der kultivierten T-Zellen unter Verwendung von OKT3-Antikörper, IL-2 und Feeder-Lymphozyten, um eine erweiterte Anzahl von T-Zellen zu erhalten.
WO 2018/136566 A1 beschreibt die Aktivierung isolierter T Zellen mit anti-CD3-und anti-CD28-Antikörpern, die Stimulierung mit IL-2 und IL-7, die Transduktion mit einem viralen Vektor und die Verwendung der modifizierten T-Zellen zur Behandlung von malignen Krankheiten.
Wieczorek, A. and Uharek, L.,„Genetically Modified T Cells for the Treatment of Malignant Disease‟, Transfus Med Hemother, 40, 2013, beschreibt die Aktivierung isolierter T Zellen mit anti-CD3-Antikörpern oder anti-CD3-anti-CD28 Magnetpartikeln, die Stimulierung mit IL-2 oder IL-7 und IL-15, die Transduktion mit einem viralen Vektor und die Verwendung der modifizierten T-Zellen zur Behandlung von malignen Krankheiten.
Weng, N. et al.,„CD28- T cells: their role in the age-associated decline of immune function‟, Trends in Immunology Vol.30 No.7, 2009 beschreibt, dass das Altern mit der Abnahme von CD28+ und einer Zunahme von CD28- T Zellen einhergeht.
Es besteht weiterhin die Notwendigkeit, die Wirksamkeit von T-Zellen und das Ergebnis der ACT bei Krebspatienten zu verbessern. Eine Lösung für dieses technische Problem wird von den Ausführungsformen bereitgestellt, die in den Ansprüchen charakterisiert werden.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Die Erfindung stellt Herstellungsverfahren von T-Zellen mit verbesserter Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie bereit, umfassend:

• Bestimmen des Prozentsatzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in einer isolierten CD8+T-Zellpopulation, und
• Aktivieren der bestimmten T-Zellpopulation mit einem Anti-CD3 Antikörper und/oder einem Anti-CD28 Antikörper,
• vorausgesetzt, dass die bestimmte Population mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.

Die Erfindung stellt Herstellungsverfahren von T-Zellen mit verbesserter Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie bereit, umfassend:

• Bestimmen des Prozentsatzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in einer isolierten CD8+T-Zellpopulation, und
• Aktivieren der bestimmten T-Zellpopulation mit einem Anti-CD3 Antikörper in Abwesenheit eines Anti-CD28 Antikörpers,
• vorausgesetzt, dass die bestimmte Population weniger als 50%, weniger als 45%, weniger als 40%, weniger als 35%, weniger als 30%, weniger als 25%, weniger als 20%, weniger als 15%, weniger als 10%, weniger als 9%, weniger als 8%, weniger als 7%, weniger als 6%, weniger als 5%, weniger als 4%, weniger als 3%, weniger als 2% oder weniger als 1% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.

In einem Aspekt ist die aktivierte T-Zellpopulation mit einem viralen Vektor transduziert und die transduzierte T-Zellpopulation ist expandiert. In einem weiteren Aspekt kann das Transduzieren und Expandieren in Gegenwart mindestens eines Zytokins durchgeführt werden. In einem Aspekt enthält die CD8+ Zellpopulation CD28-positive und CD28-negative Zellen.
Offenbart werden Verfahren für die Produktion von T-Zellen mit einer verbesserten Wirksamkeit, insbesondere für Immuntherapie, umfassend:

• Erhalten einer Population von CD8+ T-Zellen von einem Patienten oder einem Spender,
• Bestimmen des Prozentsatzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in der erhaltenen CD8+ Population,
• Aktivieren der bestimmten Population mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28 Antikörper, und
• wobei die bestimmte Population mindestens etwa 50%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65%, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 91%, mindestens etwa 92%, mindestens etwa 93%, mindestens etwa 94%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst, und optional
• Transduzieren der aktivierten T-Zellpopulation mit einem viralen Vektor, und
• Expansion der transduzierten T-Zellpopulation.

In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ex vivo Herstellungsverfahren von T-Zellen mit einer verbesserten Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie, umfassend:

• Bestimmen des Prozentsatzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in einer isolierten CD8+ T-Zellpopulation,
• Aktivieren der bestimmten Population mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28 Antikörper, und
• vorausgesetzt, dass die bestimmte Population mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.
• Transduzieren der aktivierten T-Zellpopulation mit einem viralen Vektor, und
• Expandieren der transduzierten T-Zellpopulation.

Offenbart werden Herstellungsverfahren von T-Zellen mit einer verbesserten Wirksamkeit, insbesondere für Immuntherapie, umfassend:

• Erhalten einer Population von CD8+ T-Zellen von einem Patienten oder einem Spender,
• Bestimmen des Prozentsatzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in der erhaltenen CD8+ Population,
• Aktivieren der bestimmten TCR-Population mit einem Anti-CD3 Antikörper in Abwesenheit eines Anti-CD28 Antikörpers, vorausgesetzt, dass die bestimmte Population weniger als etwa 50%, weniger als etwa 45%, weniger als etwa 40%, weniger als etwa 35%, weniger als etwa 30%, weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 15%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 9%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 7%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst, und optional
• Transduzieren der aktivierten T-Zellpopulation mit einem viralen Vektor, und
• Expansion der transduzierten T-Zellpopulation.

• Bestimmen des Prozentsatzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in einer isolierten CD8+ T-Zellpopulation,
• Aktivieren der bestimmten TCR-Population mit einem Anti-CD3 Antikörper in Abwesenheit eines Anti-CD28 Antikörpers, vorausgesetzt, dass die bestimmte Population weniger als etwa 50%, weniger als etwa 45%, weniger als etwa 40%, weniger als etwa 35%, weniger als etwa 30%, weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 15%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 9%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 7%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst,
• Transduzieren der aktivierten T-Zellpopulation mit einem viralen Vektor, und
• Expandieren der transduzierten T-Zellpopulation.

In einem anderen Aspekt kann das Transduzieren und das Expandieren in Gegenwart mindestens eines Zytokins durchgeführt werden.
In einem anderen Aspekt kann das Aktivieren das Immobilisieren von T-Zellen mit dem Anti-CD3-Antikörper und dem Anti-CD28-Antikörper auf einem Festphasenträger einschießen.
In einem weiteren Aspekt weist der Anti-CD3-Antikörper und/oder der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von etwa 0,1 µg/mL bis etwa 10,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 8,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 6,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 4,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 1,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,5 µg/ml bis etwa 10,0 µg/ml, etwa 2 µg/ml bis etwa 8 µg/ml, etwa 3 µg/ml bis etwa 7 µg/ml, etwa 2 µg/ml bis etwa 5 µg/ml, etwa 0,5 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml oder etwa 0,5 µg/ml bis etwa 2,5 µg/ml auf.
In einem anderen Aspekt kann die Aktivierung innerhalb einer Zeitspanne von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden , etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden durchgeführt werden.
In einem anderen Aspekt kann das mindestens eine Zytokin aus Interleukin (IL)- 2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21 oder einer Kombination davon ausgewählt werden.
In einem anderen Aspekt schließt das mindestens eine Zytokin IL-7, IL-15 oder eine Kombination von IL-7 und IL-15 ein.
In einem weiteren Aspekt beträgt die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 2 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 4 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 6 ng/ml bis 10 ng/ml oder etwa 5 ng/ml bis 10 ng/ml.
In einem weiteren Aspekt kann die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 15 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 60 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 70 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 80 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 90 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 50 ng/ml oder etwa 20 ng/ml bis 50 ng/ml betragen.
In einem weiteren Aspekt kann das Transduzieren innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis 120 Stunden, etwa 12 Stunden bis 96 Stunden, etwa 24 Stunden bis 96 Stunden, etwa 24 Stunden bis 72 Stunden, etwa 10 Stunden bis 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis 24 Stunden, etwa 2 Stunden bis 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis 24 Stunden, etwa 1 Stunde bis 12 Stunden, etwa 14 Stunden bis 24 Stunden, etwa 1 Stunde bis 12 Stunden, etwa 14 Stunden bis 24 Stunden, etwa 1 Stunde bis 12 Stunden, etwa 6 Stunden bis 18 Stunden durchgeführt wird.
In einem weiteren Aspekt kann der virale Vektor ein retroviraler Vektor sein, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
In einem weiteren Aspekt kann der virale Vektor ein lentiviraler Vektor sein, der einen TCR exprimiert.
In einem weiteren Aspekt kann die Expansion innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Tag bis etwa 30 Tagen, etwa 5 Tagen bis etwa 30 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 25 Tagen, etwa 2 Tagen bis etwa 20 Tagen, etwa 5 Tagen bis etwa 15 Tagen, etwa 2 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 3 Tagen bis etwa 15 Tagen, etwa 3 Tagen bis etwa 20 Tagen, etwa 4 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 5 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 6 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 7 Tagen bis etwa 25 Tagen, etwa 8 Tagen bis etwa 25 Tagen oder etwa 9 Tagen bis etwa 12 Tagen durchgeführt werden.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung eine T-Zelle, die durch das Verfahren der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurde.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung eine T-Zelle, bevorzugt eine T-Zellpopulation, bevorzugter eine genetisch transduzierte T-Zelle, die durch die Verfahren der vorliegenden Offenbarung erhältlich ist. In einem weiteren Aspekt der Offenbarung ist die T-Zelle bevorzugt eine T-Zellpopulation, bevorzugter eine genetisch transduzierte T-Zelle direkt von den Verfahren der vorliegenden Offenbarung erhalten.
In einem Aspekt können die durch die vorliegend beschriebenen Verfahren bereitgestellten genetisch transduzierten T-Zellen, welche mindestens 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen enthalten, mindestens etwa 1,2-fach höhere, mindestens etwa 1,5-fach höhere, mindestens etwa 2-fach höhere, mindestens etwa 2,5-fach höhere, mindestens etwa 3-fach höhere, mindestens etwa 3,5-fach höhere, mindestens etwa 4-fach höhere, mindestens etwa 4,5-fach höhere oder mindestens etwa 5-fach höhere Expansionsgrößenordnung aufweisen als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden.
In einem Aspekt können die durch die vorliegend beschriebenen Verfahren bereitgestellten genetisch transduzierten T-Zellen, welche mindestens 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen enthalten, mindestens etwa 1,2-fach höheres, mindestens etwa 1,5-fach höheres, mindestens etwa 2-fach höheres, mindestens etwa 2,5-fach höheres, mindestens etwa 3-fach höheres, mindestens etwa 3,5-fach höheres, mindestens etwa 4-fach höheres, mindestens etwa 4,5-fach höheres oder mindestens etwa 5-fach höheres Verhältnis von CD8:CD4 T-Zellen aufweisen als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden.
In einem Aspekt können die durch die vorliegend beschriebenen Verfahren bereitgestellten genetisch transduzierten T-Zellen, welche mindestens 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen enthalten, mindestens etwa 1,2-fach längere, mindestens etwa 1,5-fach längere, mindestens etwa 2-fach längere, mindestens etwa 2,5-fach längere, mindestens etwa 3-fach längere, mindestens etwa 3,5-fach längere, mindestens etwa 4-fach längere, mindestens etwa 4,5-fach längere oder mindestens etwa 5-fach längere Telomerenlänge aufweisen als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden.
In einem Aspekt können die durch die vorliegend beschriebenen Verfahren bereitgestellten genetisch transduzierten T-Zellen, welche mindestens 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen enthalten, mindestens etwa 1,2-fach höheres, mindestens etwa 1,5-fach höheres, mindestens etwa 2-fach höheres, mindestens etwa 2,5-fach höheres, mindestens etwa 3-fach höheres, mindestens etwa 3,5-fach höheres, mindestens etwa 4-fach höheres, mindestens etwa 4,5-fach höheres oder mindestens etwa 5-fach höheres klonales Reichtum aufweisen als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden.
In einem anderen Aspekt weisen die durch das vorliegend beschriebene Verfahren hergestellten genetisch transduzierten T-Zellen eins oder mehrere von einer höheren Expansionsgrößenordnung, einem höheren Verhältnis von CD8:CD4 T-Zellen, einer längerer Telomerenlänge und/oder einem höheren klonalen Reichtum auf in Vergleich zu denjenigen T-Zellen, welche aus einer bestimmten Population enthaltend weniger als etwa 50%, weniger als etwa 45%, weniger als etwa 40%, weniger als etwa 35%, weniger als etwa 30%, weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 15%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 9%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 7%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden.
In noch einem anderen Aspekt weisen die genetisch transduzierten T-Zellen, ausgewählt aus der bestimmten Population, welche mindestens etwa 50%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65%, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 91%, mindestens etwa 92%, mindestens etwa 93%, mindestens etwa 94%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% von CD28+ CD8+ T-Zellen enthält, eins oder mehrere von einer höheren Expansionsgrößenordnung, einem höheren Verhältnis von CD8:CD4 T-Zellen, einer längerer Telomerenlänge und/oder einem höheren klonalen Reichtum auf in Vergleich zu denjenigen T-Zellen, welche aus einer bestimmten Population enthaltend weniger als etwa 50%, weniger als etwa 45%, weniger als etwa 40%, weniger als etwa 35%, weniger als etwa 30%, weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 15%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 9%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 7%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung eine Zusammensetzung, zum Beispiel eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die durch die vorliegend beschriebenen Verfahren erhältlichen genetisch transduzierten T-Zellen und pharmazeutisch akzeptable Träger umfasst. In einem Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Behandlung eines Patienten, welcher Krebs hat, einschließlich das Verabreichen an den Patienten einer therapeutisch wirksamen Menge der T-Zellen, welche durch das Verfahren aus einem der vorgehend erwähnten Aspekte hergestellt wurden, wobei der Krebs aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus hepatozellulärem Karzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akuter myeloischer Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) besteht.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf eine Zusammensetzung, zum Beispiel eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die genetisch transduzierten T-Zellen umfasst, welche durch das Verfahren von einem der vorstehend erwähnten Aspekte erhältlichen sind, zur Verwendung als Medikament.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf eine Zusammensetzung, zum Beispiel eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die genetisch transduzierten T-Zellen umfasst, welche durch das Verfahren von einem der vorstehend erwähnten Aspekte erhältlichen sind, zur Verwendung bei der Krebsbehandlung, wobei der Krebs aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus hepatozellulärem Karzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akuter myeloischer Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) besteht.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf die Verwendung der Zusammensetzung, zum Beispiel einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die genetisch transduzierten T-Zellen umfasst, welche durch das Verfahren von einem der vorstehend erwähnten Aspekte erhältlichen sind, zur Krebsbehandlung, wobei der Krebs aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus hepatozellulärem Karzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akuter myeloischer Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) besteht.
Figurenliste
Für ein weiteres Verständnis des Charakters, der Gegenstände und der Vorteile der vorliegenden Offenbarung sollte Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung genommen werden, die in Zusammenhang mit den folgenden Zeichnungen gelesen wird, während gleiche Referenznummern gleiche Elemente bezeichnen.

zeigt den prozentualen Anteil der CD28-Expression innerhalb des CD8-Kompartiments gesunder menschlicher PBMCs über eine große Alterslücke hinweg in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Die Spender wurden mittels Durchflusszytometrie auf CD28-Expression analysiert. Die durch lineare Regression in Graphpad-Prism 7 ermittelte lineare Korrelation (R2 = 0,7124) zwischen der beginnenden CD28-Expression in CD8-T-Zellen wurde beobachtet.
zeigt den endgültigen Prozentsatz der CD8-positiven Zellen innerhalb des CD3-Kompartiments, d. h. des CD8- und CD4-positiven Kompartiments, am Ende der Herstellung über 7 Tage in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Der anfängliche CD28-Prozentsatz und der endgültige CD8-Prozentsatz wurden mittels Durchflusszytometrie berechnet. Es besteht eine R2-Korrelation von 0,8121 zwischen dem Anfangsprozentsatz von CD28 und dem Endprozentsatz von CD8%, die durch lineare Regression in Graphpad-Prism 7 bestimmt wird.
zeigt die Expansionsgrößenordnung bei 7 Tagen in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Offenlegung. Der anfängliche CD28-Prozentsatz wurde mittels Durchflusszytometrie berechnet. Die gesamte Expansionsgrößenordnung wurde vom Tag der Transduktion bis zum Tag 7 in dem Kultivierungszeitraum berechnet. Es besteht eine R2-Korrelation von 0,8579 zwischen dem Anfangsprozentsatz von CD28 und der finalen Größenordnung der Expansion, die durch lineare Regression in Graphpad-Prism 7 bestimmt wird.
zeigt die endgültige Telomerlänge, wie sie mittels Durchflusszytometrie gemessen wurde, in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Es besteht eine R2-Korrelation von 0,9581 zwischen dem Anfangsprozentsatz von CD28 und der finalen Telomerlänge, die durch lineare Regression in Graphpad-Prism 7 bestimmt wird.
2 zeigt eine Charakterisierung der Expansionskinetik gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Von 3 gesunden Spendern enthalten Spender mit höherer (Hi), z. B. 93,4%, CD28-Expression im CD8-Kompartiment der PBMCs mehr T-Zell-Klone, die eine frühe Expansion, definiert durch die Zellzahl am Tag 4 gegenüber der Zellzahl am Tag 2 (2 Tage nach der Aktivierung mit CD3/CD28), im Vergleich zu Spendern mit mittlerer (Mid), z. B. 54,3%, und niedriger (Low), z. B. 31,1 %, CD28-Expression im CD8-Kompartiment der PBMCs erfahren können.
zeigt, dass die Kontraktion und Expansion der Klone mit dem CD28-Startprozentsatz korreliert, in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Von 3 gesunden Spendern wurde eine Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung durchgeführt, und einzelne T-Zell-Klone wurden über die Zeit hinweg verfolgt. Der prozentual unterschiedlich häufig auftretende Anteil stellt den Anteil aller T-Zell-Klone bis zum Tag 10 der Expansion dar, der sich entweder von der Gesamtzahl der auswertbaren T-Zell-Klone relativ zur Nachaktivierung ausdehnt oder zusammenzieht. Der prozentuale Anteil der CD28-exprimierenden Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie aus den Ausgangs-PBMCs berechnet. Es besteht eine R2-Korrelation von 0,9726 zwischen dem Anfangsprozentsatz von CD28 und dem prozentual unterschiedlich häufig auftretenden Anteil, die durch lineare Regression in Graphpad-Prism 7 bestimmt wird.
zeigt, dass Spender, die wenig CD28 exprimieren, eine verzögerte T-Zell-Expansion mit negativer klonalen Teilung, gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung, zeigen. Das Populationswachstum kann auf der Grundlage der gesamten lebensfähigen Zellen berechnet werden und kann Wachstumsgrößenordnungen darstellen. Klonale Unterteilungen wurden als log2 (klonale Größenordnung der Expansion) berechnet und stellen den erhaltenen Medianwert dar, negative Werte, d. h. unterhalb der gestrichelten Linie, erhält man, wenn sich die klonalen Frequenzen in einer Kultur zusammenziehen, während positive Werte, d. h. oberhalb der gestrichelten Linie, erhalten werden, wenn sich die klonalen Frequenzen in einer Kultur ausdehnen. Alle Punkte sind relativ zur Basislinie nach der Aktivierung und auf Tag 4 des T-Zell-Expansionsprozesses berechnet.
5 zeigt eine Charakterisierung der Expansionskinetik gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Die T-Zell-Klone wurden auf der Grundlage der Anzahl der Teilungen, die sie durchlaufen hatten, eingelagert, wobei für jeden T-Zell-Klon die Anzahl der log2 (Größenordnung des Wachstums) geschätzt wurde. Frühe, mittlere und späte Expansion entsprechen den Tagen 4, 7 und 10 im Herstellungsprozess. Einschübe enthalten die mittlere (Med) und durchschnittliche (Avg) klonale Teilung sowie die Gesamtzahl (Tot) der Zellen zu diesem Zeitpunkt.
6 zeigt eine Charakterisierung der T-Zell-Expansionskinetik gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Die Anzahl der Teilungen, die erforderlich sind, um 100 Millionen Zellen zu erreichen, wurde auf der Grundlage der durchschnittlichen Teilungen durch den späten Expansionszeitpunkt berechnet.
7 zeigt eine Charakterisierung der T-Zell-Expansionskinetik gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Es wurden die durchschnittlichen Endklonteilungen zwischen T-Zell-Klonen, die eine positive oder negative Frühexpansion (Tag 2 bis Tag 4) durchlaufen haben, berechnet. *P<0,05, **P<,0001.
8 zeigt eine Charakterisierung der T-Zell-Expansionskinetik gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Nach dem Durchbruch der einzelnen Klone nach der Stimulation gibt es eine kontinuierliche Reduzierung der einzelnen Klone bei Spendern mit niedrigem CD28, z. B. Mid CD28+ und Low CD28+. Einzelne T-Zell-Klone können aus der Anzahl der eindeutigen DNA-Molekülablesungen der T-Zell-Rezeptor (TCR)-Region CDR3 abgeleitet werden. Die gestrichelte Linie mit dem Wert 1 markiert den Punkt, an dem es weniger T-Zell-Klone gibt, als nach der Aktivierung vorhanden waren. Die klonale Diversität (Anzahl der einzelnen Klone) wurde über das gesamte Herstellungsverfahren der T-Zellen zu Beginn (Tag 4), Mitte (Tag 7) und Ende (Tag 10) gemessen. Alle Werte werden auf die Anzahl der einzelnen T-Zell-Klone zum Zeitpunkt der Nachaktivierung (Tag 2) normalisiert.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Adoptive T-Zelltherapie mit genetisch modifizierten T-Zellen hat sich zu einer potentiellen Therapiemöglichkeit für einige Malignitäten entwickelt. Im Mittelpunkt der Produktion einer zellulären Therapie steht die Herstellung unter Verwendung einer Kombination aus den Stimulations-, Gentechnik- und Expansionsmethodiken. In diesem Rahmen kann ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Expansion der Zellen bis zu einer therapeutisch relevanten Dosierung und der Notwendigkeit, das proliferative Potential des „lebenden Medikaments“ zu erhalten, bestehen.
Wie vorliegend beschrieben, sieht die Offenbarung Verfahren zur Verbesserung der Wirksamkeit von T-Zellen vor und Verfahren zur Verbesserung und Vorhersage der finalen Expansionsgrößenordnung, des Verhältnisses von CD8:CD4 T-Zellen, der relativen Endtelomerlänge und des klonalen Reichtums des T-Zell-Produktes. Die Offenbarung umfasst auch Verfahren zur Krebsbehandlung bei einem Patienten, der diese benötigt, sowie T-Zell-Populationen, die nach den vorliegend beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
CD28 ist eines der Moleküle, die auf T-Zellen exprimiert werden, die costimulatorische Signale liefern, die für die Aktivierung von T-Zellen erforderlich sind. CD28 ist der Rezeptor für B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86). Bei Aktivierung durch Tolllike-Rezeptorliganden wird die B7.1-Expression in antigenpräsentierenden Zellen (APCs) hochreguliert. Die B7.2-Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen ist konstitutiv. CD28 ist der einzige B7-Rezeptor, der konstitutiv auf naiven T-Zellen exprimiert wird. Die Stimulation durch CD28 zusätzlich zum TCR kann ein starkes costimulatorisches Signal an T-Zellen für die Produktion verschiedener Interleukine (insbesondere IL-2 und IL-6) liefern.
Wenn T-Zellen über längere Zeiträume expandiert wurden, können sie ihr proliferatives Potential verlieren und trotz der Anwesenheit mehrerer proliferativen Zytokine funktionell seneszierend werden. Darüber hinaus kann die Expression von CD28 mit mehreren Herstellungsmetriken korrelieren, einschließlich der finalen Größenordnung der T-Zell-Expansion. So kann der Verlust der CD28-Expression einen T-Zell-Expansionsengpass schaffen, bei dem bestimmte T-Zell-Klone bei der Herstellung gegenüber anderen stark begünstigt werden können. Die Metaanalyse der verfügbaren Daten aus klinischen Studien zeigt, dass jüngere Patienten besser auf die Herstellung von T-Zellen mit CD28-Kostimulation, während ältere Patienten besser auf die Herstellung von T-Zellen ohne CD28-Kostimulation zu reagieren scheinen.
In einem Aspekt der vorliegenden Offenlegung kann der Ausgangsprozentsatz von CD28-positiven CD8+ T-Zellen als Biomarker verwendet werden, um eine genaue Vorhersage der 1) Größenordnung der T-Zell-Expansion, 2) des Verhältnisses von CD8:CD4 T-Zellen (oder %CD8-positive Zellen von CD3-positiven Zellen) und 3) der relativen Telomerlänge des T-Zell-Endprodukts zu ermöglichen. Zusätzlich kann die CDR3-DNA-Sequenzierung verwendet werden, um klonale Populationen von Spendern mit unterschiedlichen Ausgangswerten der CD28-Expression zu verfolgen. Nach dieser Analyse können unterschiedliche CD28-Startexpressionsniveaus zu signifikanten Unterschieden in der klonalen Expansionskinetik während des gesamten T-Zell-Herstellungsprozesses führen.
Der Prozess der T-Zell-Herstellung beruht auf der Isolierung, Aktivierung und Expansion von PBMC-abgeleiteten T-Zellen. Die Aktivierung kann über immobilisierte agonistische Antikörper gegen CD3 und CD28, gefolgt von der Expansion in einem Zytokinmilieu, erfolgen. Während der Herstellung können Produkteigenschaften, wie z. B. die Größenordnung der Expansion der T-Zellen und das Verhältnis von CD8+ zu CD4+ Zellen, verfolgt werden, da sie die therapeutische Wirksamkeit beeinflussen und minimale Schwellenwerte erreichen können. Daher kann es wünschenswert sein, ein tieferes Wissen über die Faktoren zu haben, die diese Metriken beeinflussen und das Ergebnis der klinischen Herstellung beeinflussen können.
Zum Beispiel kann der Prozess der Herstellung des T-Zell-Produktes generell in fünf Schritte unterteilt werden: (1) Leukapherese zur Isolierung der peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) des Patienten, (2) Aktivierung, (3) genetische Modifikation der T-Zellen aus den PBMCs mit einem nicht-viralen oder viral kodierten TCR/CAR-Vektor, (4) Expansion der T-Zellen zur Erzeugung einer klinisch relevanten Dosis und (5) optionale Lymphdrainage des Patienten vor der T-Zell-Infusion und Infusion der modifizierten T-Zellen in den Patienten. Die Aktivierung des T-Zellkompartiments kann in erster Linie durch die Verwendung des agonistischen αCD3-Antikörpers mit oder ohne kostimulatorische Stimulation durch αCD28-Antikörper erreicht werden, gefolgt von der Expansion in, normalerweise, IL-2, obwohl IL-7 + IL-15 ein naives T-Zell-Endprodukt ergeben kann.
Während des Expansionsprozesses können sich die T-Zellen aufgrund des Entzugs der TCR-Stimulation im Gleichgewicht zwischen Wachstum und Kontraktion befinden. Während der Herstellung differenzieren T-Zellen zu terminal differenzierten Effektorzellen, und dieser Prozess kann vom anfänglichen Differenzierungsstatus der PBMC abhängig sein. PBMCs von älteren Spendern können auf CD28-negative CD8+ T-Zellen angereichert werden. Zusätzlich können nicht-apoptotische extrinsische Fas-basierte Interaktionen zwischen T-Zellen und T-Zellen die Differenzierung von naiven T-Zellen vorantreiben. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass bestimmte T-Zellen während der ex vivo-Expansion der T-Zelle andere übertreffen können. Daher muss die Dynamik dieser Kontraktion und Expansion möglicherweise auf klonaler Ebene aufgeklärt werden.
In bestimmten Aspekten können die T-Zellen der vorliegenden Offenbarung primäre menschliche T-Zellen enthalten, wie z. B. T-Zellen, die aus mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes (PBMC) gewonnen werden, PBMC, die nach Stimulation mit G-CSF entnommen werden, Knochenmark oder Nabelschnurblut. Zu den Bedingungen können die Verwendung von mRNA und DNA sowie die Elektroporation gehören. Nach der Transfektion können die Zellen sofort injiziert oder gelagert werden. In bestimmten Aspekten können die Zellen nach der Transfektion für Tage, Wochen oder Monate ex vivo als Massenpopulation innerhalb von etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4 oder etwa 5 Tagen oder mehr nach dem Gentransfer in Zellen vermehrt werden.
In einem weiteren Aspekt können die Transfektanten nach der Transfektion geklont werden und ein Klon, der das Vorhandensein einer einzelnen integrierten oder episomal erhaltenen Expressionskassette oder eines Plasmids und die Expression des TCR nachweist, kann ex vivo expandiert werden. Der für die Expansion ausgewählte Klon kann die Fähigkeit zeigen, peptidexprimierende Zielzellen spezifisch zu erkennen und zu lysieren. Die rekombinanten T-Zellen können durch Stimulation mit IL-2 oder anderen Zytokinen, die an die gemeinsame gamma-Kette binden (z. B. IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21 und andere), expandiert werden. Die rekombinanten T-Zellen können durch Stimulation mit künstlichen antigenpräsentierenden Zellen expandiert werden. Die rekombinanten T-Zellen können auf einer künstlichen antigenpräsentierenden Zelle oder mit einem Antikörper, wie z. B. OKT3, der CD3 auf der T-Zelloberfläche vernetzt, expandiert werden. Untergruppen der rekombinanten T-Zellen können auf einer künstlichen antigenpräsentierenden Zelle oder mit einem Antikörper, wie beispielsweise Campath, der CD52 auf der T-Zelloberfläche bindet, deletiert werden. In einem weiteren Aspekt können die genetisch veränderten Zellen kryokonserviert werden.
Der Begriff „Aktivierung“ bezieht sich auf den Zustand einer T-Zelle, die ausreichend stimuliert wurde, um eine nachweisbare Zellproliferation zu induzieren. In bestimmten Ausführungsformen kann die Aktivierung auch mit induzierter Zytokinproduktion und nachweisbaren Effektorfunktionen verbunden sein. Der Begriff „aktivierte T-Zellen“ bezieht sich unter anderem auf T-Zellen, die proliferieren.
Die über den TCR erzeugten Signale allein reichen nicht aus, um die T-Zelle vollständig zu aktivieren, und es werden auch ein oder mehrere sekundäre oder kostimulatorische Signale benötigt. Somit umfasst die T-Zell-Aktivierung ein primäres Stimulationssignal durch den TCR/CD3-Komplex und ein oder mehrere sekundäre kostimulatorische Signale. Die Kostimulation kann durch Proliferation und/oder Zytokinproduktion von T-Zellen nachgewiesen werden, die ein primäres Aktivierungssignal erhalten haben, wie beispielsweise die Stimulation durch den CD3/TCR-Komplex oder durch CD2.
In bestimmten Aspekten kann die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Herstellung und/oder Erweiterung der antigenspezifisch-verlagerten T-Zellen enthalten, das die Transfektion von T-Zellen mit einem Expressionsvektor umfasst, der ein DNA-Konstrukt enthält, das TCR kodiert, und dann gegebenenfalls die Stimulation der Zellen mit antigenpositiven Zellen, rekombinantem Antigen oder einem Antikörper gegen den Rezeptor, um die Zellen zur Proliferation zu veranlassen.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur stabilen Transfektion und Verlagerung von T-Zellen durch Elektroporation oder anderen nicht-viralen Gentransfer (z. B., aber nicht beschränkt auf die Sonoporation) unter Verwendung von nackter DNA oder RNA bereitgestellt. Die meisten Forscher haben virale Vektoren verwendet, um heterologe Gene in T-Zellen zu übertragen. Durch die Verwendung von nackter DNA oder RNA kann die Zeit, die für die Herstellung verlagerter T-Zellen benötigt wird, reduziert werden. Als „Nackte DNA oder RNA“ wird die DNA oder RNA bezeichnet, welche für einen TCR kodiert, der in einer Expressionskassette oder einem Vektor in der richtigen Ausrichtung für die Expression enthalten ist. Die Elektroporationsverfahren dieser Offenbarung erzeugt stabile Transfektanten, die den TCR exprimieren und auf ihren Oberflächen tragen.
In bestimmten Aspekten kann das TCR-Konstrukt als nackte DNA oder in einem geeigneten Vektor in die eigenen T-Zellen des Probanden eingebracht werden. Verfahren zur stabilen Transfektion von T-Zellen durch Elektroporation mit nackter DNA sind im Stand der Technik. Siehe z. B. die US-Patentanmeldung Nr. 6,410,319 , deren Inhalt vollständig durch Hinweis aufgenommen wird. Nackte DNA bezieht sich im Allgemeinen auf DNA, die eine TCR der vorliegenden Offenbarung kodiert, die in einem Plasmid-Expressionsvektor in der richtigen Orientierung für die Expression enthalten ist. Vorteilhafterweise reduziert die Verwendung von nackter DNA die Zeit, die benötigt wird, um T-Zellen herzustellen, die den TCR der vorliegenden Offenbarung exprimieren.
Alternativ kann ein viraler Vektor (z. B. ein retroviraler Vektor, adenoviraler Vektor, adeno-assoziierter viraler Vektor oder lentiviraler Vektor) verwendet werden, um das TCR-Konstrukt in T-Zellen einzubringen. Geeignete Vektoren zur Verwendung gemäß dem Verfahren der vorliegenden Offenbarung sind in den T-Zellen des Probanden nicht replikationsfähig. Es ist eine große Anzahl von Vektoren bekannt, die auf Viren basieren, wobei die Kopienzahl des in der Zelle gehaltenen Virus niedrig genug ist, um die Lebensfähigkeit der Zelle zu erhalten. Beispiele für Vektoren sind die pFB-Neovektoren (STRATAGENE®) sowie Vektoren auf Basis von HIV, SV40, EBV, HSV oder BPV.
Sobald festgestellt wird, dass die transfizierte oder transduzierte T-Zelle in der Lage ist, das TCR-Konstrukt als Oberflächenmembranprotein mit der gewünschten Regulation und auf einem gewünschten Niveau zu exprimieren, kann bestimmt werden, ob der TCR in der Wirtszelle funktionsfähig ist, um für die gewünschte Signalinduktion zu sorgen. Anschließend werden die transduzierten T-Zellen wieder in den Patienten eingeführt oder ihm verabreicht, um die Antitumorreaktionen im Patienten zu aktivieren.
Um die Verabreichung zu erleichtern, können die transduzierten T-Zellen gemäß der Offenbarung zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder zu einem für die Verabreichung in vivo geeigneten Implantat mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln verarbeitet werden, die ferner pharmazeutisch akzeptabel sein können. Die Mittel zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung oder eines Implantats wurden in der Fachliteratur beschrieben (siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980, deren Inhalt vollständig durch Hinweis aufgenommen wird). Gegebenenfalls können die transduzierten T-Zellen in eine Zubereitung in halbfester oder flüssiger Form, wie beispielsweise einer Kapsel, Lösung, Injektion, Inhalationsmittel oder Aerosol, in der für ihre jeweilige Verabreichungsroute üblichen Weise formuliert werden. Mittel, die in der Technik bekannt sind, können verwendet werden, um die Freisetzung und Absorption der Zusammensetzung zu verhindern oder zu minimieren, bis sie das Zielgewebe oder - organ erreicht hat, oder um eine zeitlich begrenzte Freisetzung der Zusammensetzung zu gewährleisten. Es ist jedoch wünschenswert, dass eine pharmazeutisch akzeptable Form verwendet wird, die nicht verhindert, dass die Zellen den TCR exprimieren. Somit können die transduzierten T-Zellen wünschenswerterweise zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung verarbeitet werden, die eine ausgewogene Salzlösung, vorzugsweise die ausgewogene Salzlösung nach Hanks, oder eine normale Kochsalzlösung enthält.
Das Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann verwendet werden, um ausgewählte Populationen von T-Zellen für die Verwendung bei der Behandlung einer Infektionskrankheit oder von Krebs zu vermehren. Die resultierende Population von T-Zellen kann genetisch transduziert und für eine Immuntherapie verwendet werden oder sie kann für eine in vitro-Analyse von Infektionserregern verwendet werden. Nach der Expansion der T-Zellpopulation auf eine ausreichende Anzahl können die vermehrten T-Zellen dem Individuum wieder eingesetzt werden. Das Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann auch eine erneuerbare Quelle von T-Zellen zur Verfügung stellen. So können T-Zellen eines Individuums ex vivo expandiert werden, ein Teil der expandierten Population kann dem Individuum wieder verabreicht werden und ein anderer Teil kann zur Langzeitkonservierung in Aliquots eingefroren und anschließend expandiert und dem Individuum verabreicht werden. In ähnlicher Weise kann eine Population von tumorinfiltrierenden Lymphocyten von einem Individuum, das unter Krebs leidet, erhalten werden und die T-Zellen können zur Proliferation auf eine ausreichende Anzahl stimuliert und dem Individuum wieder eingesetzt werden.
In einem Aspekt findet die Expansion und/oder Aktivierung der T-Zellen in Gegenwart von einem oder mehreren IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21 statt. In einem anderen Aspekt findet die Expansion und/oder Aktivierung der T-Zellen mit IL-2 allein, IL-7 allein, IL-15 allein, einer Kombination von IL-2 und IL-15, oder einer Kombination von IL-7 und IL-15 statt.
Die vorliegende Offenbarung kann sich auch auf Zusammensetzungen beziehen, die eine Substanz enthalten, das ein kostimulatorisches Signal an eine T-Zelle zur T-Zell-Expansion liefert (z. B. einen Anti-CD28-Antikörper, B7-1- oder B7-2-Liganden), gekoppelt an eine Festphasenoberfläche, die zusätzlich ein Präparat enthalten kann, das ein primäres Aktivierungssignal an die T-Zelle liefert (z. B. einen Anti-CD3-Antikörper), gekoppelt an dieselbe Festphasenoberfläche. Diese Substanzen können vorzugsweise auf Beads oder Flaschen oder Beutel aufgebracht werden. Zusammensetzungen, bei denen jedes Mittel an verschiedene Festphasenoberflächen gekoppelt ist (d. h. ein Mittel, das ein primäres T-Zell-Aktivierungssignal liefert, das an eine erste Festphasenoberfläche gekoppelt ist, und ein Mittel, das ein kostimulatorisches Signal liefert, das an eine zweite Festphasenoberfläche gekoppelt ist), können ebenfalls in den Anwendungsbereich dieser Offenbarung fallen.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einer Dosierungseinheitsform bereitgestellt werden, in der jede Dosierungseinheit, z. B. eine Injektion, eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung, allein oder in geeigneter Kombination mit anderen Wirkstoffen, enthalten kann. Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff der Dosierungseinheitsform bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen für Menschen und Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen enthält, berechnet in einer Menge, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger oder Trägerstoff. Die Spezifikationen für die neuartigen Dosierungseinheitsformen der vorliegenden Offenbarung hängen von der besonderen Pharmakodynamik ab, die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung des jeweiligen Subjekts verbunden ist.
Es ist wünschenswert, dass eine wirksame Menge oder eine ausreichende Anzahl der isolierten transduzierten T-Zellen in der Zusammensetzung vorhanden ist und in das Subjekt eingeführt wird, so dass langfristige, spezifische Antitumorreaktionen festgestellt werden können, um die Größe eines Tumors zu reduzieren oder das Tumorwachstum oder Neuwachstum zu eliminieren, als es sonst ohne eine solche Behandlung möglich wäre. Wünschenswerterweise kann die Menge der wieder in das Subjekt eingebrachten transduzierten T-Zellen eine Verminderung der Tumorgröße um etwa 10%, etwa 20%, etwa 30%, etwa 40%, etwa 50%, etwa 60%, etwa 70%, etwa 80%, etwa 90%, etwa 90%, etwa 95%, etwa 98% oder etwa 99% im Vergleich zu sonst gleichen Bedingungen, bei denen die transduzierten T-Zellen nicht vorhanden sind, verursachen.
Dementsprechend sollte die Menge der verabreichten transduzierten T-Zellen die Verabreichungsroute berücksichtigen und so bemessen sein, dass eine ausreichende Anzahl der transduzierten T-Zellen eingeführt wird, um das gewünschte therapeutische Ergebnis zu erzielen. Darüber hinaus können die Mengen der einzelnen Wirkstoffe, die in den im vorliegenden Kontext beschriebenen Zusammensetzungen enthalten sind (z. B. die Menge pro jede zu kontaktierender Zelle oder die Menge pro bestimmtes Körpergewicht), je nach Anwendung variieren. Im Allgemeinen sollte die Konzentration der transduzierten T-Zellen vorzugsweise ausreichen, um bei der zu behandelnden Person mindestens etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁹ transduzierte T-Zellen/m² (oder kg) eines Patienten, noch bevorzugter, etwa 1 × 10⁷ bis etwa 5×10⁸ transduzierte T-Zellen/m² (oder kg) eines Patienten, obwohl jede geeignete Menge sowohl oberhalb, z. B. mehr als 5×10⁸ Zellen/m² (oder kg) eines Patienten, oder darunter, z. B. weniger als 1 × 10⁷ Zellen/m² (oder kg) eines Patienten, verwendet werden kann, bereitzustellen. Der Verabreichungsroute kann auf etablierten zellbasierten Therapien basieren (siehe z. B. US-Pat. Nr. 4.690.915 , deren Inhalt vollständig durch Hinweis aufgenommen wird) oder es kann eine alternative kontinuierliche Infusionsstrategie angewendet werden.
Diese Werte können eine allgemeine Orientierungshilfe für den Bereich der transduzierten T-Zellen bieten, die vom Arzt bei der Optimierung des Verfahrens der vorliegenden Offenbarung für die Ausführung der Erfindung verwendet werden sollen. Die im vorliegenden Kontext enthaltene Aufzählung solcher Bereiche schließt keineswegs die Verwendung einer höheren oder niedrigeren Menge einer Komponente aus, wie sie in einer bestimmten Anwendung gerechtfertigt sein könnte. So kann beispielsweise die tatsächliche Dosis und der Zeitplan variieren, je nachdem, ob die Zusammensetzungen in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, oder je nach interindividuellen Unterschieden in Pharmakokinetik, Arzneimitteldisposition und Stoffwechsel. Ein Fachmann kann jederzeit alle notwendigen Anpassungen an die Erfordernisse der jeweiligen Situation vornehmen.
In einem Aspekt umfassen Peptide tumorassoziierter Antigene (TAA), die in der Lage sind, mit den vorliegend beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen verwendet zu werden, beispielsweise die in U.S. Veröffentlichung 20160187351, U.S. Veröffentlichung 20170165335, U.S. Veröffentlichung 20170035807, U.S. Veröffentlichung 20160280759, U.S. Veröffentlichung 20160287687, U.S. Veröffentlichung 20160346371, U.S. Veröffentlichung 20160368965, U.S. Veröffentlichung 20170022251, U.S. Veröffentlichung 20170002055, U.S. Veröffentlichung 20170029486, U.S. Veröffentlichung 20170037089, U.S. Veröffentlichung 20170136108, U.S. Veröffentlichung 20170101473, U.S. Veröffentlichung 20170096461, U.S. Veröffentlichung 20170165337, U.S. Veröffentlichung 20170189505, U.S. Veröffentlichung 20170173132, U.S. Veröffentlichung 20170296640, U.S. Veröffentlichung 20170253633, U.S. Veröffentlichung 20170260249, U.S. Veröffentlichung 20180051080 und U.S. Veröffentlichung Nr. 20180164315 beschriebenen TAA-Peptide, wobei die Inhalte von jeder dieser vorliegend beschriebenen Veröffentlichungen und Sequenzprotokollen in ihrer Gesamtheit durch Hinweis vorliegend umfasst sind.
In einem Aspekt erkennen die vorliegend beschriebenen T-Zellen selektiv Zellen, die ein TAA-Peptid präsentieren, welches in einem/r oder mehreren von vorstehend beschriebenen Patenten und Veröffentlichungen beschrieben sind.

In einem anderen Aspekt umfassen die TAA, die in der Lage sind, mit den vorliegend beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen verwendet zu werden, mindestens eine Sequenz, ausgewählt von SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 158. In einem Aspekt erkennen die T-Zellen selektiv Zellen, die ein TAA-Peptid präsentieren, welches in SEQ ID NO: 1 - 158 oder in einem/r von vorliegend beschriebenen Patenten und Veröffentlichungen beschrieben ist.

SEQ ID NO:	Aminosäur esequenz	SEQ ID NO:	Aminosäur esequenz	SEQ ID NO:	Aminosäur esequenz
1	YLYDSETKNA	54	LLWGHPRVALA	106	VLLNEILEQV
2	HLMDQPLSV	55	VLDGKVAW	107	SLLNQPKAV
3	GLLKKINSV	56	GLLGKVTSV	108	KMSELQTYV
4	FLVDGSSAL	57	KMISAIPTL	109	ALLEQTGDMSL
5	FLFDGSANLV	58	GLLETTGLLAT	110	VIIKGLEEITV
6	FLYKIIDEL	59	TLNTLDINL	111	KQFEGTVEI
7	FILDSAETTTL	60	VIIKGLEEI	112	KLQEEIPVL
8	SVDVSPPKV	61	YLEDGFAYV	113	GLAEFQENV
9	VADKIHSV	62	KIWEELSVLEV	114	NVAEIVIHI
10	IVDDLTINL	63	LLIPFTIFM	115	ALAGIVTNV
11	GLLEELVTV	64	ISLDEVAVSL	116	NLLIDDKGTIKL
12	TLDGAAVNQV	65	KISDFGLATV	117	VLMQDSRLYL
13	SVLEKEIYSI	66	KLIGNIHGNEV	118	KVLEHWRV
14	LLDPKTIFL	67	ILLSVLHQL	119	LLWGNLPEI
15	YTFSGDVQL	68	LDSEALLTL	120	SLMEKNQSL
16	YLMDDFSSL	69	VLQENSSDYQSNL	121	KLLAVIHEL
17	KVWSDVTPL	70	HLLGEGAFAQV	122	ALGDKFLLRV
18	LLWGHPRVALA	71	SLVENIHVL	123	FLMKNSDLYGA
19	KIWEELSVLEV	72	YTFSGDVQL	124	KLIDHQGLYL

In einem Aspekt umfassen T-Zell-Rezeptoren, die in der Lage sind, mit den vorliegend beschriebenen Verfahren verwendet zu werden, beispielsweise die in U.S. Veröffentlichung Nr. 20170267738 , U.S. Veröffentlichung Nr. 20170312350 , U.S. Veröffentlichung Nr. 20180051080 , U.S. Veröffentlichung Nr. 20180164315 , U.S. Veröffentlichung Nr. 20180161396 , U.S. Veröffentlichung Nr. 20180162922 , U.S. Veröffentlichung Nr. 20180273602 , U.S. Veröffentlichung Nr. 20190002556 , U.S. Veröffentlichung Nr. 20180135039 , Beschriebenen, wobei die Inhalte von jeder dieser Veröffentlichungen in ihrer Gesamtheit durch Hinweis aufgenommen werden.
Die durch das vorliegend beschriebene Verfahren hergestellten genetisch transduzierten T-Zellen weisen eine verbesserte Wirksamkeit, insbesondere verbesserte Wirksamkeit für Immuntherapie, so wie adoptive Immuntherapie, auf, denn, wie es einem Fachmann verständlich ist, die durch das vorliegend beschriebene Verfahren hergestellten genetisch transduzierten T-Zellen weisen eins oder mehrere von einer höheren Expansionsgrößenordnung, einem höheren Verhältnis von CD8:CD4 T-Zellen, einer längerer Telomerenlänge und/oder einem höheren klonalen Reichtum auf, in Vergleich zu denjenigen T-Zellen, welche aus einer bestimmten Population enthaltend weniger als etwa 50%, weniger als etwa 45%, weniger als etwa 40%, weniger als etwa 35%, weniger als etwa 30%, weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 15%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 9%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 7%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1 % von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden.
Die Erfindung betrifft ferner die folgenden Gegenstände:

Gegenstand 1: Verfahren zur Herstellung von T-Zellen mit verbesserter Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie, umfassend
- Bestimmung des %-Satzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in einer erhaltenen Population von CD8+ T-Zellen, und
- Aktivieren der bestimmten Population mit dem Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper, vorausgesetzt, dass die bestimmte Population mindestens etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst, oder
- Aktivieren der bestimmten Population mit dem Anti-CD3-Antikörper in der Abwesenheit eines Anti-CD28-Antikörpers, vorausgesetzt, dass die bestimmte Population weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.
Gegenstand 2: Das Verfahren nach Gegenstand 1, wobei die bestimmte Population mit Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper aktiviert ist, unter Voraussetzung, dass die bestimmte Population mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65%, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 91%, mindestens etwa 92%, mindestens etwa 93%, mindestens etwa 94%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.
Gegenstand 3: Das Verfahren nach Gegenstand 1, wobei die bestimmte Population mit Anti-CD3-Antikörper in Abwesenheit eines Anti-CD28 Antikörpers aktiviert ist, unter Voraussetzung, dass die bestimmte Population weniger als etwa 45%, weniger als etwa 40%, weniger als etwa 35%, weniger als etwa 30%, weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 15%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 9%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 7%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.
Gegenstand 4: Verfahren nach einem der Gegenstände 1-3, ferner umfassend die Transduktion der aktivierten T-Zellpopulation mit einem viralen Vektor und die Expansion der transduzierten T-Zellpopulation.
Gegenstand 5: Verfahren nach Gegenstand 4, wobei das Transduzieren und Expandieren in Gegenwart von mindestens einem Zytokin durchgeführt wird.
Gegenstand 6: Verfahren nach Gegenstand 5, wobei das mindestens ein Zytokin aus Interleukin (IL)- 2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 und IL-21 ausgewählt ist.
Gegenstand 7: Verfahren nach Gegenstand 5 oder 6, wobei das mindestens ein Zytokin IL-7 und IL-15 umfasst.
Gegenstand 8: Verfahren nach Gegenstand 6 oder 7, wobei die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 2 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 4 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 6 ng/ml bis 10 ng/ml oder etwa 5 ng/ml bis 10 ng/ml beträgt.
Gegenstand 9: Verfahren nach einem der Gegenstände 6-8, wobei die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml , etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 60 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 70 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 80 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 90 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 50 ng/ml oder etwa 40 ng/ml bis 50 ng/ml beträgt.
Gegenstand 10: Verfahren nach einem der Gegenstände 4-9, wobei das Transduzieren innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis 24 Stunden, etwa 2 Stunden bis 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis 24 Stunden, etwa 14 Stunden 24 Stunden, etwa 16 Stunden bis 24 Stunden, etwa 18 Stunden bis 24 Stunden, etwa 20 Stunden bis 24 Stunden oder etwa 22 Stunden bis 24 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 11: Verfahren nach einem der Gegenstände 4-10, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor ist, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Gegenstand 12: Verfahren nach einem der Gegenstände 4-11, wobei der virale Vektor ein lentiviraler Vektor ist, der einen TCR exprimiert.
Gegenstand 13: Verfahren nach einem der Gegenstände 4-12, wobei die Expansion innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Tag bis etwa 30 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 25 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 20 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 15 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 10 Tagen, etwa 2 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 3 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 4 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 5 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 6 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 7 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa8 Tagen bis etwa 10 Tagen oder etwa 9 Tagen bis etwa 10 Tagen durchgeführt werden.
Gegenstand 14: Verfahren nach einem der Gegenstände 1-13, wobei das Aktivieren das Immobilisieren der T-Zelle mit dem Anti-CD3-Antikörper und/oder dem Anti-CD28-Antikörper auf einem Festphasenträger umfasst.
Gegenstand 15: Verfahren nach einem der Gegenstände 1-14, wobei der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von etwa 0,1 µg/ml bis etwa 10,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 8,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 6,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 4,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 1,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,8 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,6 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,25 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,3 µg/ml, etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,4 µg/ml, oder etwa 0,4 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml aufweisen.
Gegenstand 16: Verfahren nach einem der Gegenstände 1-15, wobei die Aktivierung innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden , etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 17: Genetisch transduzierte T-Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Gegenstände 1-16.
Gegenstand 18: Genetisch transduzierte T-Zellen, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Gegenstände 1-16, wobei die aus der bestimmten Population produzierte T-Zelle, umfassend mindestens etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen, mindestens etwa 1,2-fach höhere, mindestens etwa 1,5-fach höhere, mindestens etwa 2-fach höhere, mindestens etwa 2,5-fach höhere, mindestens etwa 3-fach höhere, mindestens etwa 3,5-fach höhere, mindestens etwa 4-fach höhere, mindestens etwa 4,5-fach höhere oder mindestens etwa 5-fach höhere Expansionsgrößenordnung umfasst als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurde.
Gegenstand 19: Genetisch transduzierte T-Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Gegenstände 1-16, wobei die aus der bestimmten Population produzierte T-Zelle, umfassend mindestens etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen, mindestens etwa 1,2-fach höheres, mindestens etwa 1,5-fach höheres, mindestens etwa 2-fach höheres, mindestens etwa 2,5-fach höheres, mindestens etwa 3-fach höheres, mindestens etwa 3,5-fach höheres, mindestens etwa 4-fach höheres, mindestens etwa 4,5-fach höheres oder mindestens etwa 5-fach höheres Verhältnis von CD8:CD4 T-Zellen umfasst als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurde.
Gegenstand 20: Genetisch transduzierte T-Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Gegenstände 1-16, wobei die aus der bestimmten Population produzierte T-Zelle, umfassend mindestens etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen, mindestens etwa 1,2-fach längere, mindestens etwa 1,5-fach längere, mindestens etwa 2-fach längere, mindestens etwa 2,5-fach längere, mindestens etwa 3-fach längere, mindestens etwa 3,5-fach längere, mindestens etwa 4-fach längere, mindestens etwa 4,5-fach längere oder mindestens etwa 5-fach längere Telomerenlänge umfasst als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurde.
Gegenstand 21: Genetisch transduzierte T-Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Gegenstände 1-16, wobei die aus der bestimmten Population produzierte T-Zelle, umfassend mindestens etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen, mindestens etwa 1,2-fach höheres, mindestens etwa 1,5-fach höheres, mindestens etwa 2-fach höheres, mindestens etwa 2,5-fach höheres, mindestens etwa 3-fach höheres, mindestens etwa 3,5-fach höheres, mindestens etwa 4-fach höheres, mindestens etwa 4,5-fach höheres oder mindestens etwa 5-fach höheres klonales Reichtum umfasst als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurde.
Gegenstand 22: Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die genetisch transduzierte T-Zelle nach einem der Gegenstände 17-21 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Gegenstand 23: Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Krebs, umfassend das Verabreichen an den Patienten der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Gegenstand 22, wobei der Krebs aus der Gruppe bestehend aus hepatozellulärem Karzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akuter myeloischer Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) ausgewählt ist.

BEISPIELE:
Bei der Gestaltung von T-Zell-Herstellungsprotokollen kann ein Gleichgewicht zwischen der Notwendigkeit, T-Zellen zu expandieren, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen, und dem Erhalt des proliferativen Potenzials des T-Zell-Endprodukts bestehen. Innerhalb dieses Paradigmas kann es von Vorteil sein, das Ergebnis der Herstellung auf der Grundlage der Eigenschaften der Ausgangs-PBMC-Population vorherzusagen.
Die beobachtete Heterogenität in den T-Zell-Expressionsprofilen deutet darauf hin, dass notwendige Kriterien für einen Selektionsdruck vorliegen könnten. Dieser Druck kann theoretisch das Replikationspotenzial bestimmter T-Zell-Populationen einschränken. Aus der Analyse der kostimulatorischen Moleküle geht hervor, dass es zu einem Verlust der CD28-Expression in den CD8-Startzellen und während des gesamten T-Zell-Expansionsprotokolls kommen kann. Angemessenerweise würde dies zu zwei Arten von CD8 T-Zellen führen, diejenigen, die von der gegebenen CD28 Co-Stimulation profitieren würden und diejenigen, die nicht profitieren würden. Das folgende Beispiel veranschaulicht eine intrinsische CD28-Bedeutung und die Korrelationen zwischen dem CD28-Ausgangsphänotyp und mehreren Herstellungsmetriken.
Beispiel 1
T-Zell-Herstellung
Gesundes Spendervollblut wurde von Hemacare bezogen und PBMCs wurden mittels Ficoll-Gradient isoliert. PBMCs wurden für 16-24 Stunden in TexMACS (Miltenyi 130-097-196), ergänzt mit 5% Human-AB-Serum (Gemini 100-318), aktiviert, indem 1 × 10⁶ lebende PBMC/mL auf Gewebekulturflaschen plattiert wurden, die über Nacht mit 1 ug/ml Anti-CD3 (eBioscience 16-0037-85) und 1 ug/ml Anti-CD28 (eBioscience 16-0289-85) Antikörper in PBS (Lonza 17-516F) bei 4 Grad Celsius beschichtet wurden. Am nächsten Tag wurden alle Zellen isoliert und auf 1 × 10⁶ Lebend-Zellen/ml resuspendiert und 5 ml wurden in eine Vertiefung einer Grex24-Well-Platte (Wilson Wolf 80192M) plattiert. Die Zellen wurden entweder Mock-transduziert oder mit einem TCR-Lentiviruskonstrukt (hergestellt von Lentigen) in Gegenwart von 10 ng/ml IL-7 (Peprotech 200- 07), 100 ng/ml IL-15 (Peprotech 200-15) und 10 µg/ml Protaminsulfat transduziert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit 35 ml komplettem TexMACS, ergänzt mit IL-7 und IL-15 in den oben genannten Konzentrationen, versorgt. Die Zellen wurden je nach gewünschter Herstellungszeit (d. h. insgesamt 4, 7 oder 10 Tage) weitere 2, 5 oder 8 Tage kultiviert. Nach der Herstellung wurden die Zellen gezählt und bei 5 × 10⁶/ml im Cyrostore10 eingefroren, bei -80 Grad Celsius für 16-24 Stunden platziert und dann bis zum Bedarf langfristig in der LN2-Dampfphase gelagert.
PkH67-Färbung
Die PkH67 (Sigma PKH67GL)-Färbung wurde gemäß Herstellerprotokoll durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die an Tag 4 hergestellten Zellen mit einer 2-fachen Konzentration gefärbt wurden, um die größere Zellgröße im Vergleich zu den an Tag 7 oder Tag 10 hergestellten Zellen zu berücksichtigen. Die PkH-Färbung wurde vor der durchflusszytometrischen Lebensfähigkeitsfärbung durchgeführt.
CDR3-Sequenzierung (Adaptive Biotech) und Analyse der variablen Beta-Ketten-Sequenzierung des T-Zell-Rezeptors
Die Immunosequenzierung der CDR3-Regionen der menschlichen TCRβ-Ketten wurde mit dem ImmunoSEQ® Assay (Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA) durchgeführt. Die extrahierte genomische DNA wurde in einer bias-kontrollierten Multiplex-PCR amplifiziert, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung. Die Sequenzen wurden zusammengefasst und gefiltert, um die absolute Häufigkeit jeder einzelnen TCRβ CDR3-Region für die weitere Analyse zu identifizieren und zu quantifizieren.
Durchflusszytometrie Färbung und Erfassung
Lebende Zellen wurden quantifiziert und auf 1-2 × 10⁶ Lebend-Zellen/ml in PBS resuspendiert und dann mit Live-Dead aqua (Thermo Fisher L34957) nach Herstellerprotokoll gefärbt. Die Zellen wurden dann mit Durchflusspuffer gewaschen und dann bei der gewünschten Antikörper-Mischung (CD3 PerCp-Cy5.5 Biolegend 300328, Vb8 PE Biolegend, 348104, CD45Ro PE-Cy7 Biolegend 304230, CD95 APCfire750 Biolegend 305638, CD8 BV605 BD 564116, CD27 BV650 Biolegend 302827, CD62L BV785 Biolegend 304830) und 15-30 Minuten im Dunkeln bei 4 Grad Celsius gefärbt, mit der Ausnahme, dass die CCR7-Färbung (CCR7 BV41 Biolegend 353208) bei 37 Grad Celsius im RPMI ohne Serum durchgeführt wurde, bevor die restlichen Oberflächenfärbungen durchgeführt wurden. Die Zellen wurden dann in Durchflusspuffer gewaschen und in Puffer resuspendiert und bei 4 Grad Celsius gelagert, bis sie auf dem BD Fortessa oder Miltenyi MACSQuant Analysator erfasst wurden.
Bestimmung der Telomerlänge
Die relative Telomerlänge wurde nach Herstellerangaben (Dako/Agilent K5327) ermittelt. Kurzzeitig wurden T-Zellen im Verhältnis 1:1 mit 1301 Kontroll-Tumorzellen (4N-Genom) gemischt. Die Zellen wurden dann permeabilisiert und eine Telomer-PNA-FITC-Sonde wurde über Nacht hybridisiert. Am nächsten Tag wurde eine Propidium-Iodid-Gegenfärbung zur Unterscheidung intakter Zellen durchgeführt und die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie erfasst. Die Telomerlänge der Testzellen wurde als Verhältnis zu der der Kontroll-Tumorzelllinie 1301 berechnet.
Beispiel 2
Die CD28-Expression auf CD8+ T-Zellen dient als Biomarker für die ex vivo T-Zell-Expansion mit IL-7 und IL-15
Der alterskorrelierte Verlust von CD28 in CD8 T-Zellen
Für einen selektiven Druck zwischen den Spendern kann es eine intrinsische Heterogenität zwischen den Spendern geben. Die Herstellung eines T-Zell-Produktes aus PBMC beruht auf der Fähigkeit, antigenspezifische zytolytische CD8 T-Zellen effizient zu aktivieren und zu expandieren. Während dieses Prozesses kann es notwendig sein, das Wachstum der Zellen in minimaler Dosierung zu verfolgen. Diesem Bedarf kann häufig aufgrund des Designs der klinischen Prüfung entsprochen werden. Die Herstellung von T-Zell-Produkten aus älteren PBMC kann durch die Akkumulation von CD28-negativen CD8+ T-Zellen im Blut erschwert werden.
zeigt aus dem CD28-Profiling, dass der Ausgangsprozentsatz der CD8-Zellen, die CD28 exprimierten, umso geringer war, je älter der Spender war, mit einer R2-Korrelation von 0,7124, die durch lineare Regression in Graphpad-Prism 7 ermittelt wurde. Diese Zellen haben möglicherweise ein reduziertes proliferatives Potential sowohl für verwandte Peptide als auch für die Stimulation über CD3/CD28.
IL-7 und IL-15 können die T-Zell-Naivität im Vergleich zur Verwendung von IL-2 während der T-Zell-Expansion erhalten. Als solche können IL-7 und IL-15 eine bevorzugte Methode für die klinische Herstellung sein. Zusätzlich können CD28-negative CD8+ T-Zellen als Reaktion auf IL15 im Vergleich zu ihren CD28-positiven Pendants proliferieren. Um zu vergleichen, wie die CD28-Expression die Herstellung von PBMC-abgeleiteten T-Zellen in Gegenwart von IL-7 und IL-15 beeinflussen würde, wurden T-Zellen von 6 gesunden Spendern in einem klinisch ähnlichen Verfahren hergestellt.
CD28 Anfangsprozentsatz korreliert mit dem endgültigen CD8-Prozentsatz bei T-Zell-Expansionen
Da die CD28-Expression im CD8-Kompartiment alterskorreliert sein kann, können andere Herstellungsmetriken, die von der CD28-Expression abhängen, ebenfalls verzerrt sein. Am Ende der T-Zell-Expansion kann das Verhältnis von CD8-zu CD4-Zellen (oder %CD8-positive Zellen von CD3-positiven Zellen) gemessen werden, da es in erster Linie das CD8-Kompartiment ist, das die tumorzytolytische Funktion ausübt, obwohl zytolytische CD4-Zellen identifiziert wurden. Daher kann es eine Korrelation zwischen der anfänglichen CD28-Expression in den CD8-Zellen und dem endgültigen Prozentsatz der Zellen geben.
zeigt, dass es eine Korrelation zwischen dem Anfangsprozentsatz der CD28-Expression im CD8+ T-Zell-Kompartiment und den endgültigen %CD8-positiven Zellen der CD3-positiven Zellen am Tag 7 (mittlere Expansion) der Kultur mit einer R2-Korrelation von 0,8121 gibt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CD28-Expression als treibende Kraft für den Selektionsdruck für CD8+ T-Zellen dienen könnte.
CD28 Startprozentsatz korreliert mit Größenordnung der Expansion
Klinische T-Zell-Expansionsprotokolle messen oft die Größenordnung der Expansion des Endproduktes als Metrik, um die Anzahl der stattgefundenen Populationsverdopplungen zu verstehen.
zeigt bis zum Tag 7 (mittlere Expansion) im Expansionsprotokoll eine klare Korrelation zwischen der Größenordnung der Expansion und dem Ausgangsniveau der CD28-Expression mit einer R2-Korrelation von 0,8579. Das Auswachsen von CD8+ Zellen im Vergleich zu CD4+ Zellen korreliert eng mit dem Ausgangsprozentsatz der CD28-Expression auf CD8+ T-Zellen. Diese Ergebnisse haben Auswirkungen auf die Entwicklung von Herstellungsprozessen, da anhand des Ausgangsphänotyps der PBMCs vorhergesagt werden kann, ob die klinische Expansion erfolgreich sein würde.
Die Reduktion der Telomerlänge korreliert mit der CD28-Startexpression
Der Verlust der Telomerlänge ist ein Kennzeichen von dysfunktionalen Zellen, da sie hochgradig differenziert werden und schließlich altern. Die Expression der Telomerase kann auf die CD28-exprimierenden Zellen des CD4- oder CD8-Kompartiments nach CD3 + CD28-Stimulation beschränkt werden. Somit kann die endgültige relative Telomerlänge auch mit dieser CD28-exprimierenden Zellfraktion übereinstimmen.
zeigt, dass die endgültige relative Telomerlänge des T-Zell-Produktes eng mit dem Niveau der CD28-Expression auf CD8+ T-Zellen in der Ausgangskultur korreliert sein kann, mit einer R2-Korrelation von 0,9581 zwischen dem anfänglichen CD28-Prozentsatz der Zellen in den PBMCs und der endgültigen relativen Telomerlänge. Diese Analyse wurde von PBMCs durchgeführt, die von mehreren gesunden Spendern und mehreren Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungenkrebs stammen. Diese Daten legen nahe, dass das Ergebnis der IL-7/IL-15-basierten T-Zell-Herstellung vor dem Beginn der Kultivierung vorhergesagt werden kann und wichtige Auswirkungen auf das Design adoptiver T-Zell-Herstellungsprotokolle haben kann. Da zum Beispiel die Persistenz von infundierten Zelltherapieprodukten mit dem klinischen Ergebnis bei Krebspatienten korreliert sein kann, könnte die endgültige Telomerlänge von infundierten tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) klinischen Produkten mit der Persistenz von T-Zell-Klonen assoziiert sein.
Zusammengenommen kann man durch die Messung der CD28-Expression der CD8+ T-Zellen am Anfang die endgültige CD8%, die Größenordnung der Expansion und die relative Telomerlänge von T-Zell-Produkten, die mit IL-7 und IL-15 hergestellt wurden, angemessen vorhersagen. Es ist zu beachten, dass die gleichen Korrelationen mit der CD28-Expression möglicherweise nicht im Kontext von CD4+ T-Zellen gefunden werden, die die CD28-Expression während des Alterns auf einem höheren Niveau halten können als CD8+ T-Zellen.
Beispiel 3
Die CD28-Expression auf CD8+ T-Zellen ist mit einer verzerrten Proliferation von T-Zell-Klonen assoziiert
Erhöhte CD28-Expression in Ausgangs-PBMCs verleiht eine vorteilhafte Wachstumsdynamik bei der T-Zell-Herstellung
Um die Expansion der klonalen Populationen während der T-Zell-Expansion zu charakterisieren, wurde die Expansionskinetik einzelner T-Zell-Klone durch klonale DNA-Sequenzierung und absolute Zahlen innerhalb jeder klonalen Population während des Herstellungsprozesses verfolgt. Bei der Verfolgung einzelner Klone wurden sowohl die klonalen Teilungen als auch die absolute Anzahl von T-Zellen innerhalb einer T-Zell-Klon-Population während des frühen (Tag 4), mittleren (Tag 7) und späten (Tag 10) Expansionsprozesses gemessen.
Um zum Beispiel die Dynamik der Expansion und Kontraktion klonaler T-Zellen mittels CDR3-DNA-Sequenzierung von CD8+ T-Zellen auf der Basis von CD28low (31,1%), CD28mid (54,3%) oder CD28high (93,4%) Expressionsniveaus zu charakterisieren, wurden PBMCs über Nacht mit agonistischen CD3/CD28-Antikörpern stimuliert, Mock-transduziert und dann während des Expansionsprozesses an Tag 4, Tag 7 und Tag 10 wurden im Herstellungsprozess Proben entnommen. Da an jedem Probenahmepunkt eine Zellzählung durchgeführt wurde und die Anzahl der T-Zellen innerhalb jeder klonalen Population berechnet wurde, kann die Anzahl der klonalen Teilungen mit der folgenden Formel berechnet werden: $\begin{array}{l} Gr \ddot{o} ßenordnung der klonalen Expansion = (endg \ddot{u} ltige Anzahl \\ der Klone / Anfangsanzahl der Klone) Gesch \ddot{a} tzte Teilungen \\ pro Klon = Log2 (Gr \ddot{o} ßenordnung der klonalen Expansion) . \end{array}$
Zusätzlich zur Quantifizierung der Expansion bestimmter CD8+ T-Zell-Populationen kann auch die Kontraktion von klonalen Populationen quantifiziert werden, was mit Hilfe von Proliferationsfarbstoff-basierten Techniken nicht möglich ist.
zeigt, dass CD28high (93,4%) bei Ausgangs-PBMCs einen frühen Wachstumsvorteil mit sich brachte, wobei fast zwei Drittel (63,41 %) der T-Zell-Klone zwischen dem Aktivierungsschritt (Tag 2) und dem Tag 4 in der Herstellung expandierten. Im Gegensatz dazu zeigten niedrigere CD28-exprimierende Ausgangspopulationen eine Kinetik, bei der die meisten T-Zell-Klone in diesem frühen Stadium der Herstellung kontrahierten, wobei die CD28mid- (54,3%) und die CD28low-Populationen (31,1%) 23,74% bzw. 1,19% der früh expandierenden Klone enthielten. Das heißt, 76,26 % bzw. 98,81 % der CD28mid- und CD28low-Expressionsproben wurden in der frühen Expansionsphase kontrahiert. Dies war konsistent mit einer negativen Größenordnung der Expansion während dieser Phase für diese beiden Populationen, während die CD28high-Probe eine positive Größenordnung der Expansion zeigte. Durch die Charakterisierung der T-Zell-Herstellung auf klonaler Ebene kann es daher zu einer signifikanten Kontraktion von T-Zell-Klonen zu Beginn des Expansionsprozesses kommen, die invers mit dem Ausgangsprozentsatz von CD28-exprimierenden CD8+ T-Zellen korreliert sein kann.
Kontraktion und Expansion der Klone korreliert mit dem CD28-Ausgangsprozentsatz
Aus der Einzelkultur wurden einzelne Häufigkeiten von T-Zell-Klonen verfolgt und mit dem Zeitpunkt nach der Aktivierung (Tag 2) verglichen. Aus diesem Vergleich wurden Klone, die in ihrer Häufigkeit signifikant zunehmen und zurückgehen, bewertet, wobei die Summe den prozentualen Anteil der unterschiedlich häufig vorkommenden Klone angibt.
zeigt eine starke Korrelation zwischen den prozentual unterschiedlich häufig vorkommenden und dem CD28-Ausgangsprozentsatz (R2 = 0,9726). Je geringer die Menge an CD28 in der Ausgangsprobe ist, desto höher ist der prozentuale Anteil an Klonen, die unterschiedlich reichlich vorhanden sind. Dies deutet darauf hin, dass der Mangel an CD28 in einer bestimmten Population eine ökologische Nische schafft, in die andere Klone hineinwachsen können, und dass der Mangel an CD28 Populationen schafft, die während des T-Zell-Expansions-Verlängerungsprotokolls sterben können.
Untere CD28-exprimierende Spender zeigen eine verzögerte T-Zell-Expansion mit negativen medianen klonalen Teilungen
Wenn der CD28-Engpass in der T-Zellkultur besteht, würde es eine erwartete Verzögerung bei der Expansion der T-Zell-Population geben, basierend auf dem Ausgangsprozentsatz der Zellen, die CD28 exprimieren. Ebenso, wenn alle T-Zell-Klone sofort expandieren könnten, dann würde man eine positive Anzahl von Teilungen pro Klon am Anfang des Expansionsprotokolls erwarten.
zeigt, dass für die im niedrigen und mittleren Bereich CD28 exprimierenden Kulturen, z. B. CD28mid und CD28low, ein negatives Populationswachstum zwischen der Nachaktivierung (Tag 2) und Tag 4 in die Expansion stattfand, dies deutet auf eine Kontraktion der Zellzahl zwischen diesen beiden Zeitpunkten hin und entspricht der Definition eines Engpassereignisses. Zusätzlich wurde nur für die hoch CD28 exprimierenden Kulturen, z. B. CD28high, eine insgesamt positive klonale Teilung beobachtet, was darauf hinweist, dass in dieser Kultur ein hoher Prozentsatz der T-Zell-Klone in der Lage war, sich sofort zu teilen.
, auf welcher die Teilungen der klonalen Populationen verfolgt werden, zeigt, dass die CD28low-Probe am Ende der Expansion ein nicht normal verteiltes Teilungsmuster zeigt, während die CD28mid- und CD28high-Population eine eher normal verteilte Charakterisierung zeigt, d. h. eine normale Verteilung der klonalen Teilungen in der gesamten Fertigung, wie durch die ähnlichen durchschnittlichen und medianen klonalen Teilungen angezeigt wird.
In Übereinstimmung mit der verstärkten Kontraktion und der reduzierten frühen Expansion können CD28low-Populationen eine erhöhte Anzahl klonaler Teilungen erfordern, um ein bestimmtes Niveau der Expansion in der Kultur zu erreichen. Das heißt, je niedriger die CD28-Ausgangsexpression ist, desto mehr Teilungen können nötig sein, um die gleiche Anzahl von T-Zellen zu erreichen.
zeigt, dass die CD28low-Population 1,96 klonale Teilungen benötigte, um eine Expansion von 1 × 10⁸ Zellen zu erreichen, während die CD28mid-Population 1,64 klonale Teilungen benötigte und die CD28high-Population nur 0.96 Mal für die gleiche Anzahl von Zellen geteilt wurde.
Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass hohe CD28-Startpopulationen eine vorteilhaftere T-Zell-Expansion erfahren können, die durch eine reduzierte T-Zell-Kontraktion und eine geringere Anzahl notwendiger T-Zell-Teilungen gekennzeichnet ist.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wahrscheinlichkeit einer frühen klonalen Expansion von T-Zellen umso größer ist, je höher die CD28-Expression der T-Zell-Populationen ist. Zusätzlich deutet die reduzierte Anzahl von T-Zell-Teilungen pro definierter Anzahl von Zellen darauf hin, dass eine erhöhte Expression von CD28 das T-Zell-Proliferationspotential erhalten könnte.
Um festzustellen, ob die frühe Expansion bestimmter Klonpopulationen während des gesamten Expansionsprozesses aufrecht erhalten werden kann, wurden die durchschnittlichen endgültigen Klonteilungen zwischen T-Zell-Klonen, z. B. CD28high, CD28mid und CD28low, die eine positive oder negative frühe Expansion (Tag 2 bis Tag 4) erfahren haben, berechnet.
zeigt, dass sich in allen T-Zell-Populationen unabhängig von der CD28-Expression früh expandierende Klone am Ende des Expansionsprozesses (Tag 2 bis Tag 4) statistisch gesehen viel wahrscheinlicher teilen.
Reduktion einzelner T-Zell-Klone während der Expansion in Spendern mit geringerer Expression von CD28 durch DNA-klonale Sequenzierung
Während der Aktivierungsphase der Herstellung kann es zum aktivierungsinduzierten Zelltod (AICD) kommen und jüngere, naiven ähnlichere T-Zellen können ein höheres Proliferationspotential haben als ältere effektorähnliche Zellen. Daher können diese Faktoren zu Engpässen bei der Herstellung von T-Zellen führen, z. B. bei der Entfernung von klonalen T-Zell-Populationen aus der Gesamtpopulation, während andere im Endprodukt verbleiben. Um die Wirkung von AICD auf T-Zell-Produkte zu untersuchen, wurde die klonale Diversität (oder Reichhaltigkeit) während des gesamten Herstellungsprozesses als Maß für die relative Anzahl der einzelnen klonalen T-Zell-Populationen bestimmt.
Verfolgt man die Anzahl der einzelnen T-Zell-Klone in einer Kultur, würde man erwarten, dass es, wenn der Engpass existiert, große Schwankungen in der Anzahl der einzelnen T-Zell-Klone nach dem Engpass geben würde. Der klonale Reichtum kann das Maß für die Berechnung der Anzahl einzelner T-Zell-Klone sein, die auf die Anzahl der von der Sequenzierung abgelesenen DNA-Moleküle normiert sind.
zeigt für alle T-Zell-Populationen, unabhängig von der CD28-Expression, eine Zunahme der Klonvielfalt (oder Klon-Diversität) von der Post-Aktivierung (Tag 2) bis zur frühen Expansion (Tag 4), was wahrscheinlich die Expansion von zuvor nicht nachweisbaren, niederfrequenten Klonen darstellt. Es ist zu beachten, dass eine maximale klonale Diversität in diesem frühen Stadium des Expansionsprozesses erreicht werden kann, eine Metrik kann mit einem verbesserten klinischen Ansprechen auf die Checkpoint- und Chemotherapie verbunden sein. Nach diesem frühen Ausbruch kam es zu einem signifikanten Rückgang der Klon-Diversität für die CD28low- und CD28mid-exprimierenden Populationen, was die Kontraktion von einzelnen T-Zell-Klonen darstellt, die den Herstellungsprozess nicht überleben können. Diese Verringerung der Klon-Diversität zwischen dem frühen und dem späten Expansionszeitpunkt (Tag 4 bis Tag 10) deutet darauf hin, dass es im Laufe der Expansion zu einer erheblichen Eliminierung der Klone kam. Im Gegensatz dazu behielt die CD28high-Population während des gesamten Herstellungsprozesses ein ähnliches Maß an Klonalität bei. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CD28-Expressionsniveaus in der PBMC-Ausgangskultur stark mit einer divergierenden Expansionskinetik des CD8+ T-Zellkompartiments assoziiert sein könnten. Diese Ergebnisse können sich auf die Wirksamkeit von T-Zell-Produkten auswirken, da ein Mangel an klonaler Diversität mit einer schlechten 4-Jahres-Überlebensrate beim diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL) assoziiert war. Die T-Zell-Persistenz kann zur Wirksamkeit von T-Zell-Produkten beitragen. Schwache nicht verwandte TCR-pMHC-Interaktionen können zur homöostatischen Proliferation und Persistenz von T-Zellen beitragen. Daher können die Nachteile fehlender klonaler Diversität in den T-Zell-Endprodukten, wie z. B. solchen, die aus Ausgangs-T-Zellen mit geringerer CD28-Expression hergestellt werden, eine verringerte homöostatische Proliferation der T-Zellen aufgrund einer verringerten Wahrscheinlichkeit des Auftretens selbsttragender, nicht verwandter TCR-pMHC-Überlebenssignale beinhalten.
Beispiel 4
Jüngere Patienten haben ein verbessertes Ansprechen auf die CD19 CAR-Therapie, wenn die Herstellung mit CD28 Co-Stimulation stattfindet
Um die Bedeutung des vorgeschlagenen ex vivo-T-Zell-Expansionsengpasses weiter zu untersuchen, wurde eine Meta-Analyse der klinischen Studie durchgeführt, um zu untersuchen, ob der Verlust der CD28-Expression bei älteren Patienten zu klinischen Trends führen würde. Basierend auf den bisherigen Daten würden ältere Patienten aufgrund der T-Zell-Herstellung (CD3 allein oder in Verbindung mit CD28) anders als jüngere Patienten abschneiden.
40 klinische Studien zu T-Zelltherapien wurden veröffentlicht. Viele von diesen sind Prüfungen im Frühstadium mit unbestätigten Molekülen (z. B. ein ungetestetes neues TCR- oder CAR-Molekül). Die Meta-Analyse erforderte Filterschritte, um einen einheitlichen, vergleichbaren Datensatz zu erstellen. Nach der Filterung und Zusammenstellung wurden 7 klinische Studien zu CD19-Malignitäten für insgesamt 107 Patientendatenpunkte analysiert. Aus dieser Analyse geht hervor, dass Patienten, die jünger als 45 Jahre sind, eine bessere klinische Prognose (66,67%) hatten, wenn ihre Zellen mit dem CD3 + CD28-Verfahren hergestellt wurden, im Vergleich zu CD3 allein (44,44%). Wenn die Patienten älter als 45 Jahre waren, war es dagegen von Vorteil, die Herstellung mit CD3 allein (71,43%) statt mit dem CD3 + CD28-Verfahren (30,00%) durchzuführen (Tabelle 1).
Tabelle 1: Die unterschiedlichen Auswirkungen der CD28-Kostimulation. Die Daten stammen aus der Meta-Analyse von 4 CD19 CAR-Studien mit insgesamt 47 Datenpunkten. Patienten, die jünger als 45 Jahre sind, schnitten bei der CD28-Kostimulation in der Herstellung besser ab als Patienten, die älter als 45 Jahre sind, die ohne CD28-Kostimulation besser abschnitten. Mit anderen Worten: Patienten, die jünger als 45 Jahre sind, können von einem CD3 + CD28-Verfahren zur Herstellung von T-Zellen profitieren, während Patienten, die älter als 45 Jahre sind, von einem reinen CD3-Verfahren zur Herstellung von T-Zellen profitieren können. CR = vollständiges Ansprechen, PR = partielles Ansprechen, SD = stabile Erkrankung, NR/PD = kein Ansprechen/progressive Erkrankung, NE = nicht auswertbar. Jedes klinische Ansprechen wurde auf der Grundlage der Analyse der klinischen Ausgangsstudie definiert.
Diese Metaanalyse der verfügbaren Daten aus klinischen Studien zeigt, dass jüngere Patienten, z. B. jünger als 45 Jahre, besser auf die T-Zell-Herstellung mit CD28-Kostimulation zu reagieren scheinen, während ältere Patienten, z. B. älter als 45 Jahre, besser auf die T-Zell-Herstellung ohne CD28-Kostimulation zu reagieren scheinen.
Klinische Ansprechraten korrelieren mit der Größenordnung der Expansion ex vivo in der klinischen Studie gegen das Multiple Myelom
Mehrere klinische und präklinische Untersuchungen deuten darauf hin, dass phänotypisch jüngere, weniger differenzierte T-Zellen im Vergleich zu älteren, differenzierteren T-Zell-Produkten eine bessere Leistung erbringen. Basierend auf den Herstellungsdaten ( und ) können hoch CD28-exprimierende (jüngere) Ausgangs-PBMCs ex vivo eine höhere Größenordnung der Expansion erreichen und ein phänotypisch weniger differenziertes Endprodukt ergeben. So kann ein weniger differenziertes und wirksameres klinisches Produkt durch die Herstellung von T-Zellen mit jugendlicheren, weniger differenzierten Ausgangs-PBMCs für den gleichen Zeitraum und deren Kultivierung zur Erzielung einer höheren Größenordnungen der Expansion erhalten werden.
Tabelle 2 zeigt, aus einer αBCMA klinischen Studie zum Multiplen Myelom CAR, dass es eine 57%ige Ansprechrate gab, wenn die Zellkulturen eine mehr als 10-fache Expansion ex vivo erreichten. Im Vergleich dazu gab es eine 0%ige Rücklaufquote, wenn die Kulturen keine 10-fache Expansion erreichten. Diese Beobachtungen unterstützen die translationale Relevanz und das herstellungszentrische Modell bei der Vorhersage der T-Zell-Aktivität.
Tabelle 2: Ex-vivo-Herstellungsmetriken korrelieren mit dem klinischen Ansprechen beim Multiplen Myelom. Die Daten aus der klinischen Herstellung wurden mit den klinischen Ansprechraten kombiniert und nach der bei der Herstellung erzielten Größenordnung der Expansion der CD3+ Zellen sortiert. Die Ansprechraten wurden berechnet als die Anzahl der Patienten, die eine PR oder CR erreicht haben, im Verhältnis zur Gesamtzahl der Patienten in der Gruppe. PR = partielles Ansprechen, SD = stabile Krankheit, CR = vollständiges Ansprechen.
Vorteile der vorliegenden Offenbarung können die Vorhersage des endgültigen CD8-Prozentzsatzes, der Größenordnung der Expansion und der relativen Telomerlänge von T-Zell-Produkten durch Messung der CD28-Expression der CD8+ T-Zellen am Anfang, eine personalisierte Therapie basierend auf der CD28-Expression in den Ausgangsprozentsatz der CD28+ CD8+ T-Zell-Populationen umfassen. Darüber hinaus kann die Herstellung nach der vorliegenden Offenbarung mit variablen Herstellungszeiträumen, Ausgangszellzahlen, Stimulationsbedingungen und verschiedenen Wachstumsmedien personalisiert werden. Dies kann die in vitro-Herstellungsmetriken, z. B. die Größenordnung der Expansion, verbessern und mit einem besseren klinischen Ergebnis korrelieren. Die zelltherapeutische Herstellung nach der vorliegenden Offenbarung kann sehr patientenspezifisch sein, wobei bestimmte Gruppen auf Grund ihres zellulären Ausgangsphänotyps besser oder schlechter auf die Herstellung ansprechen.
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von T-Zellen mit verbesserter Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie, umfassend a) Bestimmen des Prozentsatzes von CD28+ CD8+ T-Zellen in einer isolierten CD8+ T-Zellpopulation, und b) Aktivieren der bestimmten Population mit dem Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper, vorausgesetzt, dass die bestimmte Population mindestens etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst, oder Aktivieren der bestimmten Population mit dem Anti-CD3-Antikörper in der Abwesenheit eines Anti-CD28-Antikörpers, vorausgesetzt, dass die bestimmte Population weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die isolierte CD8+ Zellpopulation CD28-positive und CD28-negative Zellen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die bestimmte Population mit Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper aktiviert ist, unter Voraussetzung, dass die bestimmte Population mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65%, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 91%, mindestens etwa 92%, mindestens etwa 93%, mindestens etwa 94%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die bestimmte Population mit Anti-CD3-Antikörper in Abwesenheit eines Anti-CD28 Antikörpers aktiviert ist, unter Voraussetzung, dass die bestimmte Population weniger als etwa 45%, weniger als etwa 40%, weniger als etwa 35%, weniger als etwa 30%, weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 15%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 9%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 7%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1% von CD28+ CD8+ T-Zellen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, ferner umfassend die Transduktion der aktivierten T-Zellpopulation mit einem viralen Vektor und die Expansion der transduzierten T-Zellpopulation.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei das Transduzieren und Expandieren in Gegenwart von mindestens einem Zytokin durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mindestens ein Zytokin aus Interleukin (IL)- 2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 und IL-21 ausgewählt ist, oder wobei das mindestens ein Zytokin IL-7 und IL-15 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 2 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 4 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 6 ng/ml bis 10 ng/ml oder etwa 5 ng/ml bis 10 ng/ml beträgt.
Verfahren nach Ansprüchen 7 oder 8, wobei die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml , etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 60 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 70 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 80 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 90 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 50 ng/ml oder etwa 40 ng/ml bis 50 ng/ml beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5-9, wobei das Transduzieren innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis 24 Stunden, etwa 2 Stunden bis 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis 24 Stunden, etwa 14 Stunden 24 Stunden, etwa 16 Stunden bis 24 Stunden, etwa 18 Stunden bis 24 Stunden, etwa 20 Stunden bis 24 Stunden oder etwa 22 Stunden bis 24 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5-10, wobei der virale Vektor ein retroviraler oder lentiviraler Vektor ist, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5-11, wobei die Expansion innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Tag bis etwa 30 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 25 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 20 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 15 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 10 Tagen, etwa 2 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 3 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 4 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 5 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 6 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 7 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa8 Tagen bis etwa 10 Tagen oder etwa 9 Tagen bis etwa 10 Tagen durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei das Aktivieren das Immobilisieren der T-Zelle mit dem Anti-CD3-Antikörper und/oder dem Anti-CD28-Antikörper auf einem Festphasenträger umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, wobei der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von etwa 0,1 µg/ml bis etwa 10,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 8,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 6,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 4,0 µg/ml,etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml,etwa 0,1 µg/ml bis etwa 1,0 µg/ml,etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,8 µg/ml,etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,6 µg/ml,etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,25 etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,5 etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,3 etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,4 oder etwa 0,4 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, wobei die Aktivierung innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden , etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden durchgeführt wird.
Genetisch transduzierte T-Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-15.
Genetisch transduzierte T-Zelle gemäß Anspruch 16, wobei die aus der bestimmten Population produzierte T-Zelle, umfassend mindestens etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen, umfasst - mindestens etwa 1,2-fach höhere, mindestens etwa 1,5-fach höhere, mindestens etwa 2-fach höhere, mindestens etwa 2,5-fach höhere, mindestens etwa 3-fach höhere, mindestens etwa 3,5-fach höhere, mindestens etwa 4-fach höhere, mindestens etwa 4,5-fach höhere oder mindestens etwa 5-fach höhere Expansionsgrößenordnung als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden, oder - mindestens etwa 1,2-fach höheres, mindestens etwa 1,5-fach höheres, mindestens etwa 2-fach höheres, mindestens etwa 2,5-fach höheres, mindestens etwa 3-fach höheres, mindestens etwa 3,5-fach höheres, mindestens etwa 4-fach höheres, mindestens etwa 4,5-fach höheres oder mindestens etwa 5-fach höheres Verhältnis von CD8:CD4 T-Zellen als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden, oder - mindestens etwa 1,2-fach längere, mindestens etwa 1,5-fach längere, mindestens etwa 2-fach längere, mindestens etwa 2,5-fach längere, mindestens etwa 3-fach längere, mindestens etwa 3,5-fach längere, mindestens etwa 4-fach längere, mindestens etwa 4,5-fach längere oder mindestens etwa 5-fach längere Telomerenlänge als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden, oder - mindestens etwa 1,2-fach höheres, mindestens etwa 1,5-fach höheres, mindestens etwa 2-fach höheres, mindestens etwa 2,5-fach höheres, mindestens etwa 3-fach höheres, mindestens etwa 3,5-fach höheres, mindestens etwa 4-fach höheres, mindestens etwa 4,5-fach höheres oder mindestens etwa 5-fach höheres klonales Reichtum als jene, welche aus der bestimmten Population umfassend weniger als etwa 50% von CD28+ CD8+ T-Zellen hergestellt wurden.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die genetisch transduzierte T-Zelle nach einem der Ansprüche 16 oder 17 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verwendung als Medikament.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verwendung bei der Krebsbehandlung, wobei der Krebs aus der Gruppe bestehend aus hepatozellulärem Karzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akuter myeloischer Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) ausgewählt ist.