DE112019000348B4

DE112019000348B4 - Umprogrammierte t-zellen ähnliche nk-zellen

Info

Publication number: DE112019000348B4
Application number: DE112019000348.8T
Authority: DE
Inventors: Kayvan Niazi
Original assignee: NantBio Inc
Current assignee: NantBio Inc
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2039-01-05
Also published as: WO2019136273A1; US20200354679A1; DE112019000348T5

Abstract

Gentechnisch erzeugte NK(Natural Killer)-Zelle, umfassend:eine rekombinante Nukleinsäure, die einen Proteinkomplex mit einem α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einem β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einem Teil von CD3δ und wenigstens einem Teil von CD3γ codiert; undwobei wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors oder ein β-Kette-T-Zell-Rezeptor spezifisch für ein patienten- oder tumorspezifisches Neoepitop oder ein tumorassoziiertes Antigen ist; undwobei der Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) umfasst.

Description

Erfindungsgebiet
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Immuntherapie, wobei gentechnisch modifizierte immunkompetente Zellen mit einem T-Zell-Rezeptor oder Teil davon zum spezifischen Targeting von Krebszellen hergestellt und verwendet werden.
Stand der Technik
Die Beschreibung des Stands der Technik enthält Informationen, die zum Verständnis der vorliegenden Erfindung nützlich sein können. Dabei handelt es sich nicht um ein Eingeständnis, dass die hier bereitgestellten Informationen Stand der Technik oder relevant für die vorliegend beanspruchte Erfindung sind oder dass es sich bei einer Veröffentlichung, auf die spezifisch oder implizit verwiesen wird, um Stand der Technik handelt.
Bei Natural-Killer-Zellen (auch unter NK-Zellen, K-Zellen und Killer-Zellen bekannt) handelt es sich um einen Lymphozytentyp und eine Komponente des angeborenen Immunsystems. NK-Zellen spielen eine Hauptrolle bei der Wirtsabstoßung von sowohl Tumoren als auch virusinfizierten Zellen. Typischerweise erkennen Immunzellen auf infizierten Zelloberflächen präsentierten MHC (Major Histocompatibility Complex), was die Freisetzung von Cytokinen auslöst, wodurch Lyse oder Apoptose verursacht wird. NK-Zellen sind jedoch einzigartig, da sie in der Lage sind, gestresste Zellen in Abwesenheit von Antikörpern und MHC zu erkennen, was eine viel schnellere Immunreaktion ermöglicht. Sie erhielten den Namen „Natural Killers“ aufgrund der ursprünglichen Vorstellung, dass sie keine Aktivierung zum Abtöten von Zellen, denen „Self“-Marker der MHC-Klasse 1 fehlen, benötigen. Diese Rolle ist ganz besonders wichtig, da schädliche Zellen, denen MHC-I-Marker fehlen, von anderen Immunzellen, wie z. B. T-Lymphozyten, nicht erkannt und zerstört werden können. NK-Zellen enthalten Zytostatikum; kleine Körnchen in ihrem Cytoplasma enthalten spezielle Proteine wie Perforin und Proteasen, die als Granzyme bekannt sind. Nach Freisetzung in enger Nachbarschaft einer zur Abtötung vorgesehenen Zelle bildet Perforin Poren in der Zellmembran der Zielzelle, durch die die Granzyme und assoziierten Moleküle eindringen können, wodurch Apoptose induziert wird. Die Unterscheidung zwischen Apoptose und Zelllyse ist in der Immunologie wichtig - durch Lysieren einer virusinfizierten Zelle würden nur die Virionen freigesetzt, wohingegen Apoptose zur Zerstörung des Virus innen führt. NK-Zellen werden als Reaktion auf Interferone oder von Makrophagen stammende Cytokine aktiviert. Sie dienen dazu, Infektionen in Grenzen zu halten, während im Zuge der adaptiven Immunantwort antigenspezifische zytotoxische T-Zellen erzeugt werden, durch die die Infektion beseitigt werden kann.
T-Zell-Rezeptor (T-Cell Receptor, TCR) ist für das Erkennen von Antigenfragmenten als an MHC(Major Histocompatibility Complex)-Moleküle gebundene Peptide verantwortlich. Die Bindung zwischen TCR und Antigenpeptiden ist von relativ niedriger Affinität und degeneriert, d. h. viele TCR erkennen das gleiche Antigenpeptid und viele Antigenpeptide werden vom gleichen TCR erkannt.
TCR ist ein Heterodimer, das aus einer Alpha(α)-Kette und einer Beta(β)-Kette (codiert durch TRA bzw. TRB) besteht. In einigen T-Zellen besteht der TCR aus Gamma- und Delta-Ketten (γ/δ) (codiert durch TRG bzw. TRD). Beim Anlagern des TCR an antigenes Peptid und MHC (Peptid/MHC) wird der T-Lymphozyt über Signaltransduktion aktiviert, eine Reihe biochemischer Ereignisse, die durch assoziierte Enzyme, Corezeptoren, spezialisierte Adaptormoleküle und aktivierte oder freigesetzte Transkriptionsfaktoren vermittelt werden.
Bei TCR handelt es sich um ein disulfidverknüpftes membranverankertes heterodimeres Protein, das normalerweise aus den hochvariablen Alpha(α)- und Beta(β)-Ketten besteht, die als Teil eines Komplexes mit den invarianten CD3-Kette-Molekülen exprimiert werden. Diesen Rezeptor exprimierende T-Zellen werden als α:β- (oder αβ-) T-Zellen bezeichnet, obwohl eine geringe Anzahl T-Zellen einen alternativen Rezeptor, gebildet durch variable Gamma(y)- und Delta(δ)-Ketten, exprimieren und als γδ-T-Zellen bezeichnet werden. Jede Kette setzt sich aus zwei extrazellulären Domänen zusammen: V(Variable)-Region und einer C(Constant)-Region, beide aus domänenbildenden antiparallelen β-Faltblättern der Immunglobulin-Superfamilie (IgSF). Die konstante Region liegt der Zellmembran am nächsten, gefolgt von einer Transmembranregion und einem kurzen cytoplasmatischen Ende, während die variable Region an den Peptid/MHC-Komplex bindet. Die variable Domäne sowohl der TCR-α-Kette als auch -β-Kette enthält drei hypervariable oder Komplementarität bestimmende Regionen (Complementarity Determining Regions, CDR). Es gibt auch einen zusätzlichen Bereich von Hypervariabilität auf der β-Kette (HV4), der normalerweise nicht mit Antigen in Kontakt tritt und daher nicht als eine CDR betrachtet wird.
Die Reste in diesen variablen Domänen liegen in zwei Regionen des TCR, an der Grenzfläche der α- und β-Ketten und in der β-Kette-Gerüstregion, von der man annimmt, dass sie sich in der Nähe des CD3-Signaltransduktionskomplexes befindet. CDR3 ist die CDR, die hauptsächlich für die Erkennung von prozessiertem Antigen zuständig ist, obwohl gezeigt werden konnte, dass auch CDR1 der Alpha-Kette mit dem N-terminalen Teil des antigenen Peptids wechselwirkt, während CDR1 der β-Kette mit dem C-terminalen Teil des Peptids wechselwirkt. Man nimmt an, dass CDR2 den MHC erkennt. CDR4 der β-Kette ist zwar vermutlich nicht an der Antigenerkennung beteiligt, es konnte aber gezeigt werden, dass sie mit Superantigenen wechselwirkt.
Die rekombinierten TCR besitzen jeweils eine einzigartige Antigenspezifität, die durch die Struktur der Antigen bindenden Stelle, die durch die α- und β-Ketten im Falle von αβ-T-Zellen bzw. γ- und δ-Ketten im Falle von γδ-T-Zellen gebildet wird, bestimmt wird. Der Schnittbereich dieser spezifischen Regionen (V und J bei der Alpha- bzw. Gamma-Kette; V, D und J bei der Beta- bzw. Delta-Kette) entspricht der CDR3-Region, die für Peptid/MHC-Erkennung wichtig ist. Da das cytoplasmatische Ende des TCR extrem kurz ist, was eine Beteiligung an der Signalgebung unwahrscheinlich macht, sind diese Signalgebungsmoleküle beim Propagieren des Signals vom ausgelösten TCR in die Zelle von entscheidender Bedeutung. Koexpressionsversuche zur Erforschung der molekularen Organisation des TCR-CD3-Komplexes sind in Birnmbaum et al. (PNAS, 2014, 111(49): 17576-17581) beschrieben.
Beim HLA(Human Leukocyte Antigen)-System oder -Komplex handelt es sich um einen Genkomplex, der die MHC(Major Histocompatibility Complex)-Proteine codiert, die für die Regulation des Immunsystems beim Menschen verantwortlich sind. HLA, die MHC-Klasse I entsprechen (A, B und C), präsentieren Peptide aus dem Zellinneren. Fremdantigene, die durch MHC-Klasse I präsentiert werden, ziehen Killer-T-Zellen (CD8-positive oder zytotoxische T-Zellen) an, die Zellen zerstören. MHC-Klasse-I-Proteine assoziieren mit β2-Mikroglobulin, das im Unterschied zu den HLA-Proteinen durch ein Gen auf Chromosom 15 codiert ist. HLA, die MHC-Klasse II entsprechen (DP, DM, DOA, DOB, DQ und DR) präsentieren T-Lymphozyten-Antigene von außerhalb der Zelle. Diese besonderen Antigene stimulieren die Multiplikation von T-Helferzellen, die wiederum antikörperproduzierende B-Zellen stimulieren, so dass Antikörper gegen dieses spezifische Antigen produziert werden. Körpereigene Antigene werden durch Regulator-T-Zellen unterdrückt. HLA, die MHC-Klasse III entsprechen, codieren Komponenten des Komplementsystems.
Vor kurzem wurden gentechnische Rezeptoren, chimäre Antigen-Rezeptoren (CAR), entwickelt, indem Teile mit antigenspezifischer Bindung auf Signalgebungsteile gepfropft wurden, um so den CAR tragende Immunzellen zu den anvisierten Zellen (z. B. infizierte Zellen, Krebszellen usw.) zu treiben. Insbesondere wurde jedoch ein solcher Ansatz traditionell zur gentechnischen Veränderung von T-Zellen verwendet, so dass eine T-Zellantwort spezifisch gegen ein Molekül, das der exprimierte CAR erkennt, hervorgerufen wird (z. B. CAR-T-Zellen). Somit ist, auch wenn die gentechnische Veränderung von T-Zellen mit rekombinantem CAR-Molekül im Stand der Technik bekannt ist, noch weitgehend unerforscht, wie andere Immunzellen durch Expression von CAR oder rekombinantem T-Zell-Rezeptor transformiert werden können und wie sich solche gentechnisch veränderten Nicht-T-Zellen immuntherapeutisch verwenden lassen.
Kurzdarstellung der Erfindung
T-Zell-Rezeptoren, die bestimmte Antigene oder Neoepitope auf gewissen Tumor- oder Krebszellen erkennen, können mit der Zeit erschöpft werden. Es wäre wünschenswert, gentechnisch veränderte immunkompetente Zellen bereitzustellen, so dass bestimmte Antigene oder Neoepitope auf diesen Tumor- bzw. Krebszellen erkannt werden. Der Erfindungsgegenstand richtet sich auf die in den Patentansprüchen definierten Zusammensetzungen von und medizinischen Verwendungen von immunkompetenten Zellen, insbesondere NK-Zellen, die gentechnisch verändert sind, so dass ein T-Zell-Rezeptorkomplex oder ein Teil davon exprimiert wird, um eine zelluläre Immunantwort zu induzieren, aufrechtzuerhalten oder zu verstärken. So umfasst ein Aspekt des Gegenstands eine gentechnisch erzeugte NK-Zelle wie in den Patentansprüchen definiert, die eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die einen T-Zell-Rezeptorkomplex oder einen Teil davon codiert. Der T-Zell-Rezeptorkomplex enthält einen extrazellulären Teil, der an ein Tumor(neo)epitop oder ein tumorassoziiertes Antigen spezifisch bindet, eine intrazelluläre Aktivierungsdomäne und einen Transmembranlinker, der das extrazelluläre Fragment an die intrazelluläre Aktivierungsdomäne koppelt.
In einem Aspekt des Erfindungsgegenstands ist erfindungsgemäß eine gentechnisch veränderte NK-Zelle wie in den Patentansprüchen definiert vorgesehen, die einen rekombinanten Proteinkomplex exprimiert. Der Proteinkomplex enthält einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ, wobei dieser Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM umfasst. Wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors und/oder des β-Kette-T-Zell-Rezeptors ist spezifisch für ein patientenspezifisches, tumorspezifisches Neoepitop oder tumorassoziiertes Antigen. Vorzugsweise ist ein Teil des Proteinkomplexes durch ein erstes Nukleinsäuresegment codiert, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert und bei dem die α- und β-Kette-Rezeptor codierenden Teile durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Auch kann ein weiterer Teil des Proteinkomplexes durch ein zweites Nukleinsäuresegment codiert sein, das wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ codiert und bei dem die wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens den Teil von CD3γ codierenden Teile durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. In dieser Ausführungsform ist auch bevorzugt, dass das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Gegebenenfalls kann der T-Zell-Rezeptor ferner ein oder mehrere ITAM-Motive in den intrazellulären Signalgebungsteilen, wie z. B. CD3ζ und/oder DAP10, DAP12, oder ein oder mehrere chimäre Proteine zwischen CD3ζ und/oder DAP10, DAP12 enthalten und somit dieselbigen codierende Nukleinsäuresegmente umfassen, die gleichfalls durch eine oder mehrere selbstspaltende 2A-Peptidsequenzen getrennt sein können.
Eine gentechnisch veränderte immunkompetenten Zelle, wie z. B. eine NK-Zelle, die einen rekombinanten Proteinkomplex exprimiert, welcher Proteinkomplex einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ enthält, wobei dieser Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM umfasst und wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors und/oder des β-Kette-T-Zell-Rezeptors für ein patientenspezifisches, tumorspezifisches Neoepitop oder tumorassoziiertes Antigen oder körpereigenes Lipid spezifisch ist, kann mit einem Verfahren hergestellt werden, welches das Einführen eines Nukleinsäuresegments, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert, in die immunkompetente Zelle, wie z. B. eine NK-Zelle, beinhaltet, wobei die α- und β-Kette-T-Zell-Rezeptor codierenden Teile durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Das Verfahren kann auch das Einführen eines zweiten Nukleinsäuresegments, das wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ codiert, in die Zelle beinhalten, bei dem die wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens den Teil von CD3γ codierenden Teile durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Ebenso ist bevorzugt, dass das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Gegebenenfalls kann das Verfahren ferner das Einführen eines oder mehrerer Nukleinsäuresegmente beinhalten, die ein oder mehrere ITAM-Motive in den intrazellulären Signalgebungsteilen, wie z. B. CD3ζ und/oder DAP10, DAP12, oder ein oder mehrere chimäre Proteine zwischen CD3ζ und/oder DAP10, DAP12 exprimieren. Diese Nukleinsäuresegmente können gleichfalls durch eine oder mehrere selbstspaltende 2A-Peptidsequenzen getrennt sein.
In noch einem weiteren Aspekt des Erfindungsgegenstands ist eine erfindungsgemäße gentechnisch veränderte NK-Zelle oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche mehrere der erfindungsgemäßen NK-Zellen umfasst, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten, bei dem eine Krebserkrankung oder ein Tumor vorliegt, vorgesehen, das das Bereitstellen der gentechnisch veränderten NK-Zelle, die einen rekombinanten Proteinkomplex exprimiert, an den Patienten beinhaltet, wie in den Patentansprüchen definiert. Der Proteinkomplex enthält einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ, wobei dieser Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM umfasst. Wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors und/oder des β-Kette-T-Zell-Rezeptors ist spezifisch für ein patientenspezifisches, tumorspezifisches Neoepitop oder tumorassoziiertes Antigen,. Die gentechnisch veränderte NK-Zelle enthält ein Nukleinsäuresegment, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert und bei dem die α- und β-Kette-T-Zell-Rezeptor codierenden Teile durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sein können. Auch kann die gentechnisch veränderte NK-Zelle, wie in den Patentansprüchen definiert, ein zweites Nukleinsäuresegment enthalten, das wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ in die Zelle codiert und bei dem die wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens den Teil von CD3γ codierenden Teile durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. In dieser Ausführungsform ist auch bevorzugt, dass das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Das Verfahren beinhaltet ferner Verabreichen der gentechnisch veränderten NK-Zellen an den Patienten in einer Dosis und einem Plan, die bzw. der zum Induzieren, Aufrechterhalten oder Verstärken einer Immunantwort gegen den Tumor bzw. die Krebserkrankung wirksam ist. Der T-Zell-Rezeptorkomplex kann beim Patienten natürlich vorkommen oder von einem Spender stammen. Der T-Zell-Rezeptorkomplex von einem Spender kann so ausgewählt sein, dass er jede gewünschte HLA-Kompatibilität in Bezug auf den Patienten aufweist.
Bei einem Verfahren für ein Aufrechterhalten, Induzieren oder Ergänzen einer T-Zell-Immunantwort bei einem Patienten, bei dem eine Krebserkrankung oder ein Tumor vorliegt, kann eine gentechnisch veränderte immunkompetente Zelle, wie z. B. eine NK-Zelle, die einen rekombinanten Proteinkomplex exprimiert, bzw. können mehrere gentechnisch veränderte immunkompetente Zellen, wie z. B. NK-Zellen, an einen Patienten bereitgestellt werden. Der Proteinkomplex enthält einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ. Wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors und/oder des β-Kette-T-Zell-Rezeptors ist spezifisch für ein patientenspezifisches, tumorspezifisches Neoepitop oder tumorassoziiertes Antigen oder körpereigenes Lipid. Vorzugsweise ist ein Teil des Proteinkomplexes durch ein erstes Nukleinsäuresegment codiert, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert und bei dem die α- und β-Kette-Rezeptor codierenden Teile durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Auch kann ein weiterer Teil des Proteinkomplexes durch ein zweites Nukleinsäuresegment codiert sein, das wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ codiert und bei dem die wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens den Teil von CD3γ codierenden Teile durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Ebenso ist bevorzugt, dass das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Das Verfahren beinhaltet ferner Verabreichen der gentechnisch veränderten NK-Zellen an den Patienten in einer Dosis und einem Plan, die bzw. der zum Induzieren, Aufrechterhalten oder Verstärken einer zellulären Immunantwort gegen die Krebserkrankung bzw. den Tumor wirksam ist. Der T-Zell-Rezeptorkomplex kann beim Patienten natürlich vorkommen oder von einem Spender stammen. Der T-Zell-Rezeptorkomplex vom Spender kann so ausgewählt sein, dass er jede gewünschte HLA-Kompatibilität in Bezug auf den Patienten aufweist.
Bei einem Verfahren zum Aufrechterhalten, Verstärken oder Induzieren einer T-Zell-Immunantwort bei einem Patienten, bei dem ein Tumor oder eine Krebserkrankung vorliegt, können mehrere immunkompetente Zellen, wie z. B. NK-Zellen, eines Patienten oder eines Spenders werden Körperflüssigkeit des Patienten bzw. Spenders entnommen und gentechnisch so verändert werden, so dass sie einen Proteinkomplex exprimieren, der wenigstens einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ enthält. Gegebenenfalls können die Zellen modifiziert sein, so dass sie ein oder mehrere ITAM-Motive in den intrazellulären Signalgebungsteilen, wie z. B. CD3ζ und/oder DAP10, DAP12, oder ein oder mehrere chimäre Proteine zwischen CD3ζ und/oder DAP10, DAP12 exprimieren. Das Verfahren läuft weiter mit dem Verabreichen der gentechnisch veränderten immunkompetenten Zellen, wie z. B. NK-Zellen, an den Patienten in einer Dosis und einem Plan, die bzw. der zum Induzieren einer Immunantwort gegen den Tumor wirksam ist. Der T-Zell-Rezeptorkomplex kann beim Patienten natürlich vorkommen oder von einem Spender stammen. Der T-Zell-Rezeptorkomplex vom Spender kann so ausgewählt sein, dass er jede gewünschte HLA-Kompatibilität in Bezug auf den Patienten aufweist.
In noch einem weiteren Aspekt des Erfindungsgegenstands ist erfindungsgemäß eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgesehen, die mehrere gentechnisch veränderte NK-Zellen, enthält, die einen rekombinanten Proteinkomplex exprimieren, wie in den Patentansprüchen definiert. Der Proteinkomplex enthält einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ, wobei dieser Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM umfasst.
Wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors und/oder des β-Kette-T-Zell-Rezeptors ist spezifisch für ein patientenspezifisches, tumorspezifisches Neoepitop oder tumorassoziiertes Antigen. Vorzugsweise ist ein Teil des Proteinkomplexes durch ein erstes Nukleinsäuresegment codiert, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert und bei dem die α- und β-Kette-Rezeptor codierenden Teile durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Auch kann ein weiterer Teil des Proteinkomplexes durch ein zweites Nukleinsäuresegment codiert sein, das wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ codiert und bei dem die wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens den Teil von CD3γ codierenden Teile durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Ebenso ist bevorzugt, dass das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. Gegebenenfalls kann der T-Zell-Rezeptor-Proteinkomplex ferner ein oder mehrere ITAM-Motive in den intrazellulären Signalgebungsteilen, wie z. B. CD3ζ und/oder DAP10, DAP12, oder ein oder mehrere chimäre Proteine zwischen CD3ζ und/oder DAP10, DAP12 enthalten und somit dieselbigen codierende Nukleinsäuresegmente umfassen, die gleichfalls durch eine oder mehrere selbstspaltende 2A-Peptidsequenzen getrennt sein können.
NK-Zellen exprimieren die Oberflächenmarker CD16 (FcγRIII) und CD56. Sie können mit einem Antikörper gegen einen Teil von CD16 (FcγRIII) oder CD56 identifiziert werden. Die gentechnisch veränderten immunkompetenten Zellen können unter Verwendung eines für die Mehrzahl der Zellen spezifischen Bindungsmoleküls angereichert werden. Die Population angereicherter Zellen kann ex vivo, bevorzugt in Gegenwart einer oder mehrerer Cytokine, expandiert werden. Danach werden die expandierten immunkompetenten Zellen, wie z. B. NK-Zellen, an den Patienten in einer Dosis und einem Plan verabreicht, die bzw. der zum Induzieren, Aufrechterhalten oder Verstärken einer Zellimmunantwort gegen den Tumor wirksam ist.
In noch einem weiteren Aspekt des Erfindungsgegenstands ist erfindungsgemäß eine gentechnisch veränderte NK(Natural Killer)-Zelle vorgesehen, die eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die einen Proteinkomplex mit einem α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einem β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einem Teil von CD3δ und wenigstens einem Teil von CD3γ codiert, wobei dieser Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM umfasst und wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors oder ein β-Kette-T-Zell-Rezeptor spezifisch für ein patienten- oder tumorspezifisches Neoepitop oder ein tumorassoziiertes Antigen ist.
Vorzugsweise umfasst die rekombinante Nukleinsäure ein erstes Nukleinsäuresegment, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert, wobei der α- und der β-Kette-Rezeptor durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind, und ein zweites Nukleinsäuresegment, das wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ codiert, wobei der wenigstens eine Teil von CD3δ und der wenigstens eine Teil von CD3γ durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind. In einigen Ausführungsformen sind das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt. Der Teil von CD3γ oder CD3δ umfasst ein ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif). Auch bevorzugt wird die NK-Zelle aus einer NK-92-Derivatzelle erzeugt.
In noch einem weiteren Aspekt des Erfindungsgegenstands ist erfindungsgemäß eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten, bei dem ein Tumor oder eine Krebserkrankung vorliegt, vorgesehen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung mehrere der gentechnisch erzeugten NK-Zellen wie oben beschrieben umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt des Erfindungsgegenstands ist eine erfindungsgemäße gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung bei einem Verfahren zum Induzieren einer NK-Zell-Immunantwort gegen einen Tumor bei einem Patienten mit dem Tumor vorgesehen, wie in den Patentansprüchen definiert. Dieses Verfahren enthält einen Schritt, bei dem eine gentechnisch veränderte NK-Zelle bereitgestellt wird, die ein rekombinantes Protein exprimiert, das Aufweisen eines α-Kette-T-Zell-Rezeptors, eines β-Kette-T-Zell-Rezeptors, wenigstens eines Teils von CD3δ und wenigstens eines Teils von CD3γ umfasst, wobei wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors oder ein β-Kette-T-Zell-Rezeptor spezifisch für ein patienten- oder tumorspezifisches Neoepitop oder ein tumorassoziiertes Antigen ist, und einen Schritt, bei dem eine gentechnisch veränderte NK-Zelle an den Patienten in einer Dosis und einem Plan, die bzw. der zur Behandlung des Tumors wirksam ist, verabreicht wird. Es ist vorgesehen, dass die Dosis bzw. der Plan ein Induzieren, Aufrechterhalten oder Verstärken einer Immunantwort gegen den Tumor bewirkt.
Der Teil von CD3γ oder CD3δ umfasst ein ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif). Bevorzugt wird die Natural-Killer-Zelle die NK-Zelle aus einer NK-92-Derivatzelle erzeugt.
Sehr typisch enthält die gentechnisch veränderte NK-Zelle eine rekombinante Nukleinsäure, die ein erstes Nukleinsäuresegment, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert, wobei der α- und der β-Kette-Rezeptor durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind, und ein zweites Nukleinsäuresegment, das wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ codiert, wobei der wenigstens eine Teil von CD3δ und der wenigstens eine Teil von CD3γ durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind, umfasst. In einigen Ausführungsformen sind das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt. In einigen Ausführungsformen sind wenigstens ein T-Zell-Rezeptor der ersten und zweiten Nukleinsäuresegmente zu einem autologen T-Zell-Rezeptor des Patienten homolog.
In einigen Ausführungsformen kann das Verfahren ferner einen Schritt umfassen, bei dem eine Bedingung an den Tumor bereitgestellt wird, so dass ein CD1d an einer Oberfläche des Tumors exprimiert wird. In einigen Ausführungsformen kann die Bedingung ein Einführen einer Nukleinsäurezusammensetzung, die ein CD1d codierendes erstes Nukleinsäuresegment umfasst, beinhalten. In solchen Ausführungsformen kann die Nukleinsäurezusammensetzung ferner ein p99 codierendes zweites Nukleinsäuresegment umfassen. In anderen Ausführungsformen umfasst die Bedingung eine Stressbedingung für den Tumor und/oder eine Bedingung, bei der ein Inhibitor von HDAC verabreicht wird, so dass CD1d-Expression im Tumor erhöht wird.
In noch einem weiteren Aspekt des Erfindungsgegenstands ist eine erfindungsgemäße gentechnisch veränderte NK-Zelle und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung wie oben beschrieben zur Verwendung bei der Behandlung eines Patienten, bei dem ein Tumor vorliegt, vorgesehen, wie in den Patentansprüchen definiert.
Verschiedenen Aufgaben, Merkmale, Aspekte und Vorteile des Erfindungsgegenstands werden anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen ersichtlicher.
Ausführliche Beschreibung
Bei der vorliegenden Erfindung wurde nun entdeckt, dass immunkompetente Zellen, wie z. B. NK-Zellen, gentechnisch verändert werden können, so dass sie einen T-Zell-Rezeptor oder einen Teil davon exprimieren, der an ein tumorspezifisches oder tumorassoziiertes Antigen, ein Neoepitop und/oder ein körpereigenes Lipid des Tumors spezifisch bindet, infolgedessen eine zelluläre Immunantwort gegen den Tumor ausgelöst wird.
Der Begriff „Tumor“, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine bzw. ein oder mehrere Krebszellen, Krebsgewebe, bösartige Tumorzellen oder bösartiges Tumorgewebe, die an einem oder mehreren anatomischen Orten in einem menschlichen Körper lokalisiert oder angetroffen werden können, und wird synonym damit verwendet. Der Begriff „binden“, wie hier verwendet, bezieht sich auf, und kann synonym mit einem Begriff „erkennen“ und/oder „feststellen“ verwendet werden, eine Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen mit einer hohen Affinität mit einer K_D gleich oder kleiner 10^-6 M oder gleich oder kleiner 10^-7M. Der Begriff „bereitstellen“ oder „bereitstellend“, wie hier verwendet, bezieht sich auf und umfasst alle Handlungen von Herstellen, Erzeugen, Platzieren, Verwendungermöglichen oder Gebrauchsfertigmachen.
Der Begriff „Aufrechterhalten oder Verstärken einer T-Zell-Antwort“, wie hier verwendet, bedeutet Erhöhen der Anzahl aktivierter Zellen, die einen vorhandenen T-Zell-Rezeptor exprimieren, so dass eine zelluläre Immunantwort gegen eine Tumor- oder Krebszelle bereitgestellt wird, die ein bestimmtes Tumor- oder Krebsneoepitop, -antigen oder -Eigenlipid exprimiert. Der Begriff „Induzieren einer T-Zell-Antwort“, wie hier verwendet, bedeutet Bereitstellen einer Gruppe vorhandener aktivierter Zellen, so dass eine zelluläre Immunantwort gegen eine Tumor- oder Krebszelle, die an einen T-Zell-Rezeptor bindet, in Abwesenheit einer Population von beim Patienten vorhandenen T-Zellen, die das Bereitstellen einer zellulären Immunantwort gegen ein bestimmtes Tumor- oder Krebsneoepitop, -antigen oder -Eigenlipid bewirken, bereitgestellt wird. Der Begriff „immunkompetente Zellen“, wie hier verwendet, umfasst alle Zellen des Immunsystems, einschließlich aller Lymphozyten und einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, T-Zellen, B-Zellen, dendritischer Zellen, Makrophagen, NKT-Zellen und dergleichen.
NK-Zellen
In Bezug auf geeignete NK-Zellen ist allgemein vorgesehen, dass es sich bei den NK-Zellen um eine autologe NK-Zelle von einem Individuum handeln kann, das gentechnisch veränderte NK-Zellen erhalten wird. Solche autologen NK-Zellen können aus Vollblut isoliert oder von Vorläufer- oder Stammzellen mit im Stand der Technik allgemein bekannten Methoden kultiviert werden. Zudem sollte auch ersichtlich sein, dass die NK-Zellen nicht autolog sein müssen, sondern allogene oder heterologe NK-Zellen sein können. In besonders bevorzugten Aspekten des Erfindungsgegenstands werden jedoch die NK-Zellen gentechnisch erzeugt, so dass sie ein oder mehrere wünschenswerte Merkmale erzielen, sind NK92-Zellen oder Derivate von NK92-Zellen. Darüber hinaus werden auch kontinuierlich wachsende (‚immortalisierte‘) Zellen geeignete NK-Zellen sein. Beispielsweise handelt es sich in einem besonders bevorzugten Aspekt des Erfindungsgegenstands bei der gentechnisch erzeugten NK-Zelle um ein NK92-Derivat, das so modifiziert ist, dass bei ihm die Expression wenigstens eines Killer-Zell-Immunglobulin ähnlichen Rezeptors (KIR) reduziert oder beseitigt ist, wodurch solche Zellen konstitutiv aktiviert werden (über fehlende oder reduzierte Inhibition).
NK92-Zellen zeigen ein ungewöhnliches Rezeptorexpressionsprofil, wobei eine relativ große Anzahl aktivierender (z. B. NKp30, NKp46, 2B4, NKGD, E, CD28) Rezeptoren exprimiert wird. Umgekehrt exprimieren NK92-Zellen auch wenige inhibierende Rezeptoren (z. B. NKGA/B, niedrige Niveaus von KIR2DL4, ILT-2), wobei ihnen die meisten Killer-Inhibitor-Rezeptoren (KIR) fehlen, die auf normalen NK-Zellen klonal exprimiert werden. Darüber hinaus exprimiert NK92 relativ hohe Niveaus von Molekülen, die am zytolytischen Perforin-Granzym-Weg beteiligt sind, sowie von zusätzlichen zytotoxischen Effektormolekülen, einschließlich Tumornekrosefaktor(TNF)-Superfamilie-Mitgliedern FasL, TRAIL, TWEAK, TNF-alpha, was auf die Fähigkeit zum Abtöten über alternative Mechanismen hindeutet. Zudem exprimieren NK92-Zellen auch andere Moleküle implizierte Immuneffektorzellregulation (CD80, CD86, CD40L, TRANCE), deren Relevanz bei NK-Abtöten unklar ist.
Zudem können geeignete NK-Zellen einen oder mehrere modifizierte KIR aufweisen, die mutiert sind, um so eine Wechselwirkung mit MHC-Klasse-I-Molekülen zu verringern oder zu beseitigen. Natürlich sei angemerkt, dass ein oder mehrere KIR auch deletiert sein können oder die Expression unterdrückt sein kann (z. B. über miRNA, siRNA usw.). Sehr typisch werden mehr als ein KIR mutiert, deletiert oder stillgelegt werden, wobei ganz besonders vorgesehene KIR solche mit zwei oder drei Domänen, mit kurzem oder langem cytoplasmatischem Ende, umfassen. Aus einer anderen Perspektive betrachtet umfassen modifizierte, stillgelegte oder deletierte KIR KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3 und KIR3DS1. Derartige modifizierte Zellen können nach im Stand der Technik allgemein bekannten Vorschriften hergestellt werden. Als Alternative können solche Zellen auch im Handel bei NantKwest (siehe URL www.nantkwest.com) als aNK-Zellen (‚aktivierte NK-Zellen) erhalten werden.
Die gentechnisch erzeugte NK-Zelle kann auch ein NK92-Derivat sein, das so modifiziert ist, dass es den hochaffinen Fcy-Rezeptor (CD16) exprimiert. Sequenzen für hochaffine Varianten des Fcy-Rezeptors sind im Stand der Technik allgemein bekannt (siehe z. B. Blood 2009 113:3716-3725), wobei alle Arten von Erzeugung und Expression als zur vorliegenden Verwendung geeignet erachtet werden. Man glaubt, dass die Expression eines solchen Rezeptors spezifisches Targeting von Tumorzellen unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für Tumorzellen eines Patienten (z. B. Neoepitope), einen bestimmten Tumortyp (z. B. her2neu, PSA, PSMA usw.) sind oder die mit Krebs assoziiert sind (z. B. CEA-CAM), gestattet. Vorteilhaft sind solche Antikörper im Handel erhältlich und lassen sich in Verbindung mit den Zellen verwenden (z. B. gebunden an den Fcy-Rezeptor). Als Alternative können solche Zellen auch im Handel bei NantKwest als haNK-Zellen (‚hochaffine NK-Zellen) erhalten werden. Solche Zellen können dann weiter modifiziert werden, so dass sie einen oder mehrere Liganden für einen oder mehrere inhibierende Rezeptoren der NK-Zellen des Wirtsorganismus exprimieren.
Die gentechnisch erzeugte NK-Zelle kann gentechnisch so konstruiert sein, dass sie einen chimären T-Zell-Rezeptor exprimiert. In ganz besonders bevorzugten Aspekten weist der chimäre T-Zell-Rezeptor einen scFv-Teil oder eine andere Ektodomäne mit Bindungsspezifität gegen ein tumorassoziiertes Antigen, ein tumorspezifisches Antigen und ein Krebsneoepitop auf. Wie bereits angemerkt, kann eine NK-Zelle auf zahlreiche Arten gentechnisch erzeugt werden, so dass sie einen solchen chimären T-Zell-Rezeptor exprimiert, wobei alle Arten als zur vorliegenden Verwendung geeignet erachtet werden. Als Alternative können solche Zellen auch im Handel bei NantKwest als taNK-Zellen (‚target-activated (zielaktiverte) NK-Zellen‘) erhalten werden. Solche Zellen können dann weiter modifiziert werden, so dass sie einen oder mehrere Liganden für einen oder mehrere inhibierende Rezeptoren der NK-Zellen des Wirtsorganismus exprimieren. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass durch Verwendung von haNK-Zellen oder taNK-Zellen eine Doppelspezifität der gentechnisch veränderten zytotoxischen Zellen wie später beschrieben bereitgestellt werden kann, so dass beliebige Krebszellen oder autoimmun betroffene Zellen anvisiert werden, indem das krebs- oder autoimmunspezifische Epitop und gleichzeitig das auf diesen Zelloberflächen präsentierte Lipidantigen erkannt wird.
In einigen Fällen können die NK-Zellen unter Verwendung von Methoden zur Steuerung von Stammzelldifferenzierung bereitgestellt werden. Der Ausdruck „Steuerung von Stammzelldifferenzierung“ bzw. „gesteuerte Differenzierung“, wie hier verwendet, hat seine gewöhnliche Bedeutung im Stand der Technik und kann sich auf einen Differenzierungsvorgang beziehen, der nicht spontan ist und kontrollierbar durch ein oder mehrere Merkmale von zur Differenzierung verwendeten Artikeln oder Methoden induziert wird. Eine Methode zur gesteuerten Differenzierung kann Steuern der Differenzierung von Stammzellen zu einer bestimmten Linie auf den Artikeln, vorliegend beschrieben, umfassen. Die Zelldifferenzierungsmethode kann Steuern der Differenzierung von Stammzellen auf einem sauerstoffdurchlässigen Substrat, bei dem wenigstens ein Teil einer Oberfläche mit einer Matrix beschichtet ist (z. B. geformt über ein iCVD-Verfahren), von der wenigstens ein Teil kovalent an biologische Moleküle wie Proteine gebunden ist, umfassen. Die gesteuerte Differenzierung beinhaltet Inkontaktbringen der Stammzellen mit gewissen löslichen Faktoren und/oder Kontrollieren oder Verändern des pO₂ der Zelle während des Differenzierungsvorgangs. Beispiele für Methoden gesteuerter Differenzierung mit Sauerstoffkontrolle sind ohne Beschränkung darauf beschrieben in U.S. Publication No. 2013/0287743 , eingereicht 29. Apr. 2013, und U.S. Publication No. 2010/0261277 , eingereicht 13. Jun. 2008, mit dem Titel „Methods and Compositions for Enhanced Differentiation from Embryonic Stem Cells‟; D'Amour et al. Nat. Biotechnol. 24, 1393-1401 (2006); und Hrvatin, et al., „Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β-cells" PNAS 2014. Weitere Methoden sind in Biol BloodMarrow Transplant. Apr. 2012; 18(4):536-45; Dezell et al., „Natural killer cell differentiation from hematopoietic stem cells: a comparative analysis of heparin- and stromal cell-supported methods," Biology ofBlood and Marrow Transplantation, April 2012; 18(4):536-545; Nil et al., „Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms," Journal of Virology, beschrieben.
Bei Bevorzugung autologer NK-Zellen des Patienten können NK-Zellen eines Patienten entnommen, isoliert und dann zum Wiedereinführen in den Patienten expandiert werden. NK-Zellen lassen sich beliebigen geeigneten Geweben eines Patienten entnehmen, solange NK-Zellen im Gewebe vorhanden sind. NK-Zellen exprimieren die Oberflächenmarker CD16 (FcγRIII) und CD56 und können unter Verwendung eines für einen Teil dieser oder anderer Zellmarker spezifischen Antikörpers identifiziert werden. Sehr typisch umfassen geeignete Gewebequellen Vollblut. Es ist vorgesehen, dass die erwartete Anzahl von im Gewebe vorhandenen NK-Zellen unter Individuen (z. B. bezogen auf Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand, Ethnie usw.) und Gewebetyp (z. B. Vollblut, Liquor usw.) schwanken kann. Beispielsweise können, um von einem Patienten mit einem Tumor NK-Zellen zu erhalten, dem Patienten wenigstens 2 ml, bevorzugt wenigstens 5 ml, stärker bevorzugt wenigstens 10 ml Vollblut entnommen werden.
Zwar ist bei einem Erwachsenen peripheres Blut die zugänglichste Quelle zur Gewinnung von NK-Zellen, doch ist auch vorgesehen, dass NK des Patienten aus dem gelagerten Nabelschnurblut des Patienten gewonnen werden können. Um aus Nabelschnurblut eines Patienten NK-Zellen zu gewinnen, können vom Patienten wenigstens 0,5 ml, bevorzugt wenigstens 1 ml, stärker bevorzugt wenigstens 2 ml Nabelschnurblut erhalten werden, obwohl dies je nach den Lagerbedingungen schwanken kann.
Aus der Körperflüssigkeit des Patienten, die viele unterschiedliche Typen von Zellen enthält (z. B. Erythrozyten, Thrombozyten, Neutrophile, Lymphozyten usw.), können NK-Zellen unter Verwendung mehrerer bekannter Molekülmarker oder ihrer Bindungsmoleküle, z. B. CD16 (FcγRIII) und CD56, isoliert werden. Beispielsweise kann ein Antikörper gegen ein NK-Zelloberflächenantigen auf einem Bead (z. B. Agarose-Beads, mit Biotin beschichtete Beads usw.) immobilisiert und dann mit der Körperflüssigkeit des Patienten in Kontakt gebracht werden. In einigen Ausführungsformen ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass der Anreicherungsvorgang mit zwei oder mehr Bindungsmolekülen durchgeführt werden kann, um die Spezifität zu erhöhen, vorzugsweise in zwei getrennten und aufeinanderfolgenden Kontaktvorgängen.
In einer bevorzugten Ausführungsform können an die Antikörper gebundene NK-Zellen in einem kleineren Flüssigkeitsvolumen (z. B. Zellkulturmedien usw.) als das ursprüngliche Probenvolumen (z. B. Blutvolumen usw.) eluiert werden, so dass die NK-Zellen nach der Isolierung angereichert werden können (z. B. können NK-Zellen in 10 ml Blutvolumen in 0,5 ml Zellkulturmedienvolumen isoliert werden, was eine etwa 20-fache Anreicherung von NKT-Zellen nach Isolierung ergibt, usw.). In einigen Ausführungsformen, bei denen NK-Zellen über zwei oder mehr Kontaktvorgänge isoliert werden, lassen sich die NK-Zellen weiter anreichern, indem das Volumen von Elutionsmedien (z. B. Zellkulturemedien usw.) im zweiten Kontaktvorgang weiter reduziert wird (z. B. können 10 ml ursprüngliches Probenvolumen auf 2 ml eluierte Zellen im ersten Kontaktvorgang und dann weiter auf 0,5 ml eluierte Zellen im zweiten Kontaktvorgang reduziert werden, usw.). Ganz besonders bevorzugt ist, dass die NK-Zellen wenigstens 5-mal, bevorzugt wenigstens 10-mal, stärker bevorzugt wenigstens 20-mal gegenüber der Anzahl Zellen/Volumen der ursprünglichen Körperflüssigkeitsprobe angereichert werden.
In anderen Ausführungsformen können die NK-Zellen aus anderen Zellen in der Körperflüssigkeit des Patienten mittels Durchflusszytometrie (z. B. FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) usw.) oder MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) isoliert werden. Beispielsweise lassen sich NK-Zellen aus anderen Zellen unter Verwendung eines Antikörpers mit Fluoreszenz-Tag oder Magnetpartikel-Tag isolieren. Ebenso ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass die isolierten Zellen mit Durchflusszytometrie oder MACS unter Verwendung eines Pull-down-Assay mit Peptidantigen beschichteten Beads weiter angereichert werden.
Darüber hinaus lässt sich die Population isolierter und angereicherter NK-Zellen über Ex-vivo-Expansion der NK-Zellen weiter vergrößern. Die Ex-vivo-Expansion von NK-Zellen kann in einem beliebigen geeigneten Verfahren mit beliebigen geeigneten Materialien, mit denen NK-Zellen wenigstens 10-mal, bevorzugt wenigstens 100-mal in 7-21 Tagen expandiert werden können, durchgeführt werden. Beispielsweise können isolierte und angereicherte NK-Zellen in ein Zellkulturmedium (z. B. AIMV^® -Medium, RPMI1640^® usw.) gegeben werden, das eine oder mehrere Bedingungen enthält, zu denen Zugabe beliebiger Moleküle, die NK-Wachstum stimulieren, NK-Zellteilung induzieren und/oder Cytokinfreisetzung aus NK stimulieren können, gehören kann, womit sich NK-Zellen weiter expandieren lassen. So umfassen Aktivierungsmoleküle ein oder mehrere Cytokine (z. B. IL-2, IL-5, IL-7, IL-8, IL-12, IL-12, IL-15, IL-18, und IL-21, bevorzugt menschliches rekombinantes IL-2, IL-5, IL-7, IL-8, IL-12, IL-12, IL-15, IL-18 und IL-21, usw.) in beliebiger wünschenswerter Konzentration (z. B. wenigstens 10 U/ml, wenigstens 50 U/ml, wenigstens 100 U/ml), T-Zell-Rezeptor-Antikörper an der Oberfläche gentechnisch veränderter NK-Zellen (z. B. Anti-CD2-, Anti-CD3-, Anti-CD28-, α-TCR-Vα24+-Antikörper, vorzugsweise immobilisiert an Beads, usw.), ein Glycolipid (z. B. α-GlcCer, β-ManCer, GD3 usw.), ein Glycolipid gekoppelt mit CD1 (z. B. CD1d usw.) usw.
Bezüglich dieser Aktivierungsbedingungen ist vorgesehen, dass die Dosis bzw. der Plan zur Bereitstellung von Aktivierungsbedingungen je nach der Anfangszahl gentechnisch veränderter NK-Zellen und dem Zustand der gentechnisch veränderten NK-Zellen variieren kann. In einigen Ausführungsformen kann eine Einzeldosis von Cytokin (z. B. 100 U/ml) über wenigstens 3 Tage, wenigstens 5 Tage, wenigstens 7 Tage, wenigstens 14 Tage, wenigstens 21 Tage eingesetzt werden. In anderen Ausführungsformen kann die Cytokindosis während der Expansionszeit erhöht oder verringert werden (z. B. 200 U/ml über die ersten 3 Tage und 100 U/ml über die nächsten 14 Tage oder 100 U/ml über die ersten 3 Tage und 200 U/ml über die nächsten 14 Tage usw.). Ebenso ist vorgesehen, dass unterschiedliche Typen von Cytokine zusammen oder getrennt während der Ex-vivo-Expansion verwendet werden können (z. B. IL-15 über die ersten 3 Tage und IL-18 über die nächsten 3 Tage oder Kombination von IL-15 und IL-18 über 14 Tage usw.).
Gegebenenfalls können die expandierten gentechnisch veränderten NK-Zellen unter Bedingungen, die die Zytotoxizität erhöhen, weiter aktiviert werden. Die Bedingungen zur Erhöhung der Zytotoxizität umfassen Inkontaktbringen der expandierten gentechnisch veränderten NK-Zellen mit T-Zell-Rezeptor-Antikörpern (z. B. Anti-CD2-, Anti- CD3-, Anti-CD28-, α-TCR-Vα24+-Antikörper, vorzugsweise immobilisiert an Beads, usw.), einem Glycolipid (z. B. α-GlcCer, β-ManCer, GD3, usw.), oder einem Glycolipid gekoppelt mit CD1 (z. B. CD1d usw.) über einen gewünschten Zeitraum (z. B. wenigstens 1 Stunde, wenigstens 6 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 3 Tage, wenigstens 7 Tage usw.). Die Zytotoxizität der expandierten und aktivierten NK-Zellen lässt sich durch Messen der Menge an Cytokinfreisetzung (z. B. IL-2, IL-13, IL-17, IL-21, TNF-α usw.) aus den NK-Zellen bestimmen.
NK-Zelle mit Expression eines rekombinanten T-Zell-Rezeptorkomplexes:
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass NK-Zellen gentechnisch verändert werden können, indem eine rekombinante Nukleinsäurezusammensetzung, die einen Proteinkomplex codiert, in die NK-Zellen eingeführt wird. Der Proteinkomplex enthält wenigstens ein oder mehrere unterschiedliche Peptide mit einer extrazellulären Domäne eines T-Zell-Rezeptors und wenigstens ein oder mehrere unterschiedliche Peptide der intrazellulären Domäne eines T-Zell-Rezeptors. Insbesondere enthält der Proteinkomplex eine α-Kette eines T-Zell-Rezeptors, eine β-Kette eines T-Zell-Rezeptors, wenigstens einen Teil von CD3δ (bevorzugt cytoplasmatische Domäne) und wenigstens einen Teil von CD3γ (bevorzugt cytoplasmatische Domäne). Darüber hinaus kann der Proteinkomplex in einem oder mehreren Fällen wenigstens einen Teil eines CD3ξ und wenigstens einen Teil eines CD3ζ enthalten.
Zwar können jegliche geeignete Formen rekombinanter Nukleinsäurezusammensetzung zur Codierung des Proteinkomplexes verwendet werden, doch ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass sich der Proteinkomplex durch eine einzige Nukleinsäure codieren lässt, die mehrere Segmente umfasst, die jeweils ein unterschiedliches Peptid codieren. Somit enthält in einer bevorzugten Ausführungsform die Nukleinsäurezusammensetzung ein erstes Nukleinsäuresegment, das zwei unterschiedliche Peptide codiert: einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor, und ein zweites Nukleinsäuresegment, das zwei Peptide codiert, nämlich wenigstens einen Teil eines Typs von T-Zell-Rezeptor (CD3δ) und wenigstens einen Teil eines weiteren Typs von T-Zell-Rezeptor (CD3γ) codiert. Es ist vorgesehen, dass es sich bei jedem unterschiedlichen Peptid, das durch das erste und das zweite Nukleinsäuresegment codiert ist, jeweils um ein Volllängenprotein handelt (z. B. Volllängen-alpha- und β-Kette-T-Zell-Rezeptor und - Corezeptoren). Es ist dennoch auch vorgesehen, dass wenigstens ein oder mehrere durch das erste und das zweite Nukleinsäuresegment codierte unterschiedliche Peptide ein verkürztes oder ein Teil der Volllängenproteine sein können.
Vorzugsweise handelt es sich bei den ersten und zweiten Nukleinsäuresegmenten um mRNAs, die jeweils zwei mRNA-Teilsegmente, die einen T-Zell-Rezeptor codieren (z. B. ist Teilsegment A eine mRNA von α-Kette-T-Zell-Rezeptor und Teilsegment B eine mRNA von β-Kette-T-Zell-Rezeptor usw.), gefolgt von einem Poly-A-Ende umfassen. Weiter ist bevorzugt, dass die beiden mRNA-Teilsegmente durch Nukleinsäuresequenzen, die einen Typ von selbstspaltendem 2A-Peptid (2A) codieren, getrennt sind. Selbstspaltendes 2A-Peptid (2A), wie hier verwendet, bezieht sich auf beliebige Peptidsequenzen, durch die ein Translationseffekt bereitgestellt werden kann, der als „stop-go“ oder „stop-carry“ bekannt ist, so dass zwei Teilsegmente in denselben mRNA-Fragmenten in zwei getrennte und unterschiedliche Peptide translatiert werden können. Vorgesehen sind alle geeigneten Typen von 2A-Peptid-Sequenzen, einschließlich Schweine-Teschovirus-1-2A (P2A), Thoseaasigna-Virus-2A (T2A), Equines-Rhinitis-A-Virus-2A (E2A), Maul-und-Klauenseuche-Virus-2A (F2A), Cytoplasmatisches-Polyhedrosis-Virus (BmCPV 2A) und Flacherie-Virus (BmIFV 2A). In einigen Ausführungsformen kann der gleiche Typ von 2A-Sequenz zwischen zwei Teilsegmenten sowohl des ersten als auch zweiten Nukleinsäuresegments verwendet werden (z. B. erstes Nukleinsäuresegment: mRNA von α-Kette-Rezeptor - T2A- mRNA von β-Kette-Rezeptor; zweites Nukleinsäuresegment: mRNA von α-Kette-Rezeptor - T2A- mRNA von β-Kette-Rezeptor). In anderen Ausführungsformen können unterschiedliche Typen von 2A-Sequenz zwischen zwei Teilsegmenten sowohl des ersten als auch zweiten Nukleinsäuresegments verwendet werden (z. B. erstes Nukleinsäuresegment: mRNA von α-Kette-Rezeptor - T2A- mRNA von β-Kette-Rezeptor, zweites Nukleinsäuresegment: mRNA von α-Kette-Rezeptor - P2A- mRNA von β-Kette-Rezeptor).
Darüber hinaus ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass das erste und das zweite Nukleinsäuresegment auch in einer einzigen Nukleinsäure (mRNA) vorliegen können, z. B. verbunden über eine 2A-Sequenz. In dieser Ausführungsform können die Teilsegmente erster und zweiter Nukleinsäuresegmente in jeder geeigneten Reihenfolge angeordnet sein (z. B. α-Kette-β-Kette- CD3γ- CD3δ, β-Kette- CD3γ- α-Kette- CD3δ, usw.), mit einer beliebigen geeigneten Kombination der gleichen oder unterschiedlicher 2A-Sequenzen (z. B. α-Kette-T2A-β-Kette-P2A- CD3γ-F2A- CD3δ, β-Kette- P2A-CD3γ- T2A-α-Kette-F2A-CD3δ, usw.), gefolgt von Poly-A-Ende an 3' der einen mRNA.
Hinsichtlich der mRNA-Sequenz der ersten und zweiten Nukleinsäuresegmente ist bevorzugt, dass die mRNA-Sequenzen bezogen auf die Sequenz des Tumorneoepitops, tumorassoziierten Antigens oder Eigenlipids, auf das der T-Zell-Rezeptor-Proteinkomplex zielt, ausgewählt sind. Die T-Zell-Rezeptoren können aus denjenigen Codiersequenzen, die erschöpften T-Zellen eines Patienten entzogen werden, ausgewählt sein. Beispielsweise ist bevorzugt, dass das durch das erste Nukleinsäuresegment codierte Peptid eine tatsächliche oder vorhergesagte Affinität für das Tumorepitop wenigstens mit einer K_D von wenigstens gleich oder kleiner 10^-6M, bevorzugt wenigstens gleich oder kleiner 10^-7M, stärker bevorzugt wenigstens gleich oder kleiner 10^-8M aufweist. Vorgesehen sind alle geeigneten Methoden zur Identifizierung der ersten Nukleinsäuresegmentsequenz, die eine hohe Bindungsaffinität für das Tumorepitop aufweist. Beispielsweise kann eine Nukleinsäuresequenz von erstem Nukleinsäuresegment über ein Massen-Screening von Peptiden mit verschiedenen Affinitäten für das Tumorepitop über beliebige geeignete In-vitro-Testverfahren (z. B. Durchflusszytometrie, SPR-Assay, kinetisches Ausschlusstestverfahren usw.) oder mittels mRNA-Display-Technik (z. B. „RNA bind-n-seq“ usw.) identifiziert werden.
Die rekombinante Nukleinsäure enthält auch ein zweites Nukleinsäuresegment (ein Sequenzelement), das eine intrazelluläre Aktivierungsdomäme des rekombinanten Proteins codiert. Die intrazelluläre Aktivierungsdomäme enthält ein oder mehrere ITAM-Aktivierungsmotive (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, YxxL/I-X_6-8-YXXL/I), wodurch Signalgebungskaskaden in den die Motive exprimierenden Zellen ausgelöst werden. Vorgesehen sind alle geeigneten Nukleinsäuresequenzen, die ein oder mehrere ITAM-Aktivierungsmotive enthalten. Beispielsweise kann die Sequenz der Aktivierungsdomäme von einem Rezeptor einer zytotoxischen Zelle (z. B. NK-Zell-Rezeptor, NKT-Zell-Rezeptor usw.) stammen, der ein oder mehrere ITAM-Aktivierungsmotive (z. B. intrazelluläre Enddomäne von KAR (Killer Activation Receptors), NKp30, NKp44 und NKp46, usw.) einschließt. In einem weiteten Beispiel kann die Sequenz der Aktivierungsdomäme von einem Endteil eines T-Zell-Antigen-Rezeptors (z. B. CD3ζ, CD28 usw.) stammen. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleinsäuresequenz der intrazellulären Aktivierungsdomäne zur Hinzufügung/Entfernung eines oder mehrerer ITAM-Aktivierungsmotive modifiziert werden, so dass die Zytotoxizität der das rekombinante Protein exprimierenden Zellen moduliert wird.
Das erste und das zweite Nukleinsäuresegment sind gegebenenfalls über ein drittes Nukleinsäuresegment verbunden, das einen Linker-Teil des rekombinanten Proteins codiert. Vorzugsweise enthält der Linker-Teil des rekombinanten Proteins wenigstens eine Transmembrandomäne. Darüber hinaus ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass der Linker-Teil des rekombinanten Proteins ferner ein kurzes Peptidfragment (z. B. Spacer mit einer Größe zwischen 1-5 Aminosäuren oder zwischen 3-10 Aminosäuren oder zwischen 8-20 Aminosäuren oder zwischen 10-22 Aminosäuren) zwischen der Transmembrandomäne und dem extrazellulären Einzelkette-Variantenfragment und/oder ein weiteres kurzes Peptidfragment zwischen der Transmembrandomäne und der intrazellulären Aktivierungsdomäme enthält. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleinsäuresequenz von Transmembrandomäne und/oder einem oder zwei kurzen Peptidfragment(en) vom gleichen oder von einem anderen Molekül als dem, aus dem die Sequenz von intrazellulärer Aktivierungsdomäme gewonnen wird, stammen.
Beispielsweise kann dort, wo die intrazelluläre Aktivierungsdomäme ein Teil von CD3ζ ist, das gesamte dritte Nukleinsäuresegment (das sowohl Transmembrandomäne als auch kurzes Peptidfragment codiert) von CD3ζ (gleiches Molekül) oder CD28 (anderes Molekül) stammen. In anderen Ausführungsformen handelt es sich bei dem dritten Nukleinsäuresegment um eine Hybridsequenz, bei der wenigstens ein Teil des Segments von einem anderen Molekül als der Rest des Segments stammt. In einem weiteren Beispiel, bei dem die intrazelluläre Aktivierungsdomäme ein Teil von CD3ζ ist, kann die Sequenz der Transmembrandomäne von CD3ζ und ein kurzes Fragment, das die Transmembrandomäne und das extrazelluläre Einzelkette-Variantenfragment verbindet, von CD28 oder CD8 stammen.
In noch weiteren vorgesehenen Ausführungsformen enthält die rekombinante Nukleinsäure ein Nukleinsäuresegment, das ein Signalgebungspeptid codiert, das das rekombinante Protein zur Zelloberfläche leitet. Vorgesehen sind alle geeigneten und/oder bekannten Signalgebungspeptide (z. B. leucinreiches Motiv usw.). Vorzugsweise liegt das ein extrazelluläres Einzelkette-Variantenfragment codierende Nukleinsäuresegment stromaufwärts vom ersten Nukleinsäuresegment, das ein extrazelluläres Einzelkette-Variantenfragment codiert, so dass die Signalsequenz im N-Terminus des rekombinanten Proteins lokalisiert werden kann. Vorgesehen ist jedoch auch, dass das Signalgebungspeptid im C'-Terminus des rekombinanten Proteins oder in der Mitte des rekombinanten Proteins lokalisiert werden kann.
In einigen Ausführungsformen enthält die rekombinante Nukleinsäure auch ein Sequenzelement, das die Expression des rekombinanten Proteins kontrolliert, wobei alle Arten von Kontrolle als für die vorliegende Verwendung geeignet erachtet werden. Beispielsweise kann dort, wo es sich bei der rekombinanten Nukleinsäure um eine RNA handelt, die Expressionskontrolle über geeignete Translationsinitiationsstellen (z. B. geeignete Cap-Struktur, Initiationsfaktorbindungsstellen, interne Ribosomeneintrittsstellen usw.) und ein PolyA-Ende (z. B. wo Länge Stabilität und/oder Umsatz kontrolliert) ausgeübt werden, während die Expression rekombinanter DNA über einen konstitutiv aktiven Promotor, einen gewebespezifischen Promotor oder einen induzierbaren Promotor kontrolliert werden kann.
Hinsichtlich erkannten Antigenen sei angemerkt, dass Antigene, die an MHC-Klasse I binden, als für die vorliegende Verwendung geeignet erachtet werden, wobei vorgesehene Antigene ausgewählt sind unter einem oder mehreren tumorassoziierte Antigenen, und vor allem Tumorneoepitopen. Sehr typisch lassen sich tumorassoziierte Antigene und Neoepitope (die typischerweise patientenspezifisch und tumorspezifisch sind) anhand der -omik-Daten identifizieren, die vom Krebsgewebe des Patienten bzw. von Normalgewebe (des Patienten oder eines gesunden Individuums) erhalten werden. Typischerweise enthalten -omik-Daten Informationen in Verbindung mit Genomik, Transkriptomik, Proteomik. Die Krebszellen oder Normalzellen (oder Gewebe), wie hier verwendet, können Zellen aus einem einzigen oder mehreren unterschiedlichen Geweben oder anatomischen Bereichen, Zellen aus einem einzigen oder mehreren unterschiedlichen Wirten sowie jegliche Permutation von Kombinationen umfassen.
Vorzugsweise umfassen -omik-Daten von Krebs- und/oder Normalzellen einen genomischen Datensatz, der Genomsequenzinformationen enthält. Sehr typisch umfassen die Genomsequenzinformationen DNA-Sequenzinformationen, die vom Patienten (z. B. über Tumorbiopsie), sehr bevorzugt vom Krebsgewebe (krankes Gewebe) und entsprechendem gesunden Gewebe des Patienten oder eines gesunden Individuums erhalten werden. Beispielsweise können DNA-Sequenzinformationen von einer pankreatischen Krebszelle in der Bauchspeicheldrüse des Patienten (und/oder in der Nähe liegenden Bereichen bei metastasierten Zellen), und normalen Pankreaszellen (nichtkanzeröse Zellen) des Patienten oder normalen Pankreaszellen von einem gesunden Individuum, bei dem es sich nicht um den Patienten handelt, erhalten werden.
In einem ganz besonders bevorzugten Aspekt des Erfindungsgegenstands erfolgt die DNA-Analyse über Ganzgenomsequenzierung und/oder Exomsequenzierung (typischerweise mit einer Abdeckungstiefe von wenigstens 10x, typischer wenigstens 20x) von sowohl Tumorals auch entsprechender Normalprobe. Alternativ können DNA-Daten auch von einer bereits erstellten Sequenzaufzeichnung (z. B. SAM-, BAM-, FASTA-, FASTQ- oder VCF-Datei) von einer früheren Sequenzbestimmung geliefert werden. Daher können Datensätze unprozessierte oder prozessierte Datensätze umfassen, wobei zu beispielhaften Datensätzen solche mit BAM-Format, SAM-Format, FASTQ-Format oder FASTA-Format zählen. Ganz besonders bevorzugt ist jedoch, dass die Datensätze im BAM-Format oder als BAMBAM-diff-Objekte bereitgestellt werden (siehe z. B. US2012/0059670A1 und US2012/0066001A1 ). Zudem ist festzuhalten, dass die Datensätze eine Tumor- und eine entsprechende Normalprobe des gleichen Patienten reflektieren, so dass auf diese Weise patienten- und tumorspezifische Informationen erhalten werden. So können Veränderungen der genetischen Keimbahn, die nicht zum Tumor führen (z. B. stille Mutation, SNP usw.) ausgeschlossen werden. Natürlich sollte ersichtlich sein, dass die Tumorprobe aus einem ursprünglichen Tumor, aus dem Tumor beim Behandlungsstart, aus einem rezidiven Tumor bzw. einer Metastasenstelle usw. stammen kann. In den meisten Fällen kann es sich bei der entsprechenden Normalprobe des Patienten um Blut oder nicht erkranktes Gewebe vom gleichen Gewebetyp wie dem Tumor handeln.
Gleichfalls kann eine Computeranalyse der Sequenzdaten auf zahlreiche Arten durchgeführt werden. Bei sehr bevorzugten Methoden erfolgt die Analyse allerdings in silico durch ortsgeführte synchrone Ausrichtung von Tumor- und Normalproben, wie z. B. aus US 2012/0059670A1 und US 2012/0066001A1 bekannt, unter Verwendung von BAM-Dateien und BAM-Servern. Bei einer solchen Analyse werden vorteilhaft falsch-positive Neoepitope reduziert und die Anforderungen an Speicher- und Rechnerressourcen deutlich verringert.
Die so erhaltenen Neoepitope können dann weiterer ausführlicher Analyse unterzogen und gefiltert werden, wobei vorbestimmte Struktur- und Expressionsparameter und subzelluläre Lokalisationsparameter verwendet werden. Beispielsweise sollte ersichtlich sein, dass Neoepitopsequenzen nur unter der Voraussetzung gespeichert werden, dass sie einen vorbestimmten Expressionsschwellenwert erfüllen (z. B. wenigstens 20%, 30%, 40%, 50% oder höhere Expression im Vergleich zu normal), und bei ihnen eine membranassoziierte Lage identifiziert wird (e.g., z. B. befinden sie sich an der Außenseite einer Zellmembrane einer Zelle). Weitere vorgesehene Analysen umfassen Strukturberechnungen, bei denen dargestellt wird, ob ein Neoepitop oder ein tumorassoziiertes Antigen oder ein Eigenlipid wahrscheinlich einem Lösungsmittel ausgesetzt ist oder nicht, ein strukturell stabiles Epitop darstellt oder nicht usw.
Folglich sollte erkannt werden, dass Epitope in einer ausschließlich In-silico-Umgebung identifiziert werden können, in der letztendlich potentielle Epitope vorhergesagt werden, die für den Patienten und Tumortyp einmalig sind. So identifizierte Epitopsequenzen werden dann zur Erzeugung der entsprechenden Peptide in vitro synthetisiert. So ist es konzeptuell möglich, eine komplette rational konstruierte Sammlung von (Neo-)Epitopen eines bestimmten Patienten mit einer spezifischen Krebserkrankung zusammenzustellen, die dann weiter in vitro getestet werden kann, um hochaffine Rezeptoren zur finden oder zu erzeugen. In einem Aspekt des Erfindungsgegenstands können ein oder mehrere der Peptid(neo)epitope (z. B. 9-Mere) an einem festen Träger (z. B. magnetisches oder farbcodiertes Bead) immobilisiert sein und als Köder zur Bindung oberflächenpräsentierter Rezeptorfragmente verwendet werden. Zahlreiche Bibliotheken für T-Zell-Rezeptoren sind im Stand der Technik bekannt und in Verbindung mit den hier vorgestellten Lehren geeignet. Wenn gewünscht, können auch kleinere Bibliotheken verwendet und Affinitätsreifung unterzogen werden, um Bindungsaffinität und/oder -kinetik zu verbessern, wobei im Stand der Technik allgemein bekannte Methoden verwendet werden (siehe z. B. Briefings in functional genomics and proteomics. Bd. 1. Nr. 2. 189-203. Juli 2002). Darüber hinaus sei angemerkt, dass, während Bibliotheken allgemein bevorzugt sind, auch andere Gerüste als geeignet erachtet werden und Beta-Fass, Ribosomen-Display, Zelloberflächen-Display usw. umfassen (siehe z. B. Protein Sci., Jan. 2006; 15(1): 14-27.) Darüber hinaus sollte ersichtlich sein, wie bereits oben erörtert, dass nicht nur patienten- und tumorspezifische Neoepitope als geeignet erachtet werden, sondern auch alle bekannten tumorassoziierten Antigene (z. B. CEACAM, MUC-1, HER2 usw.) sowie verschiedene körpereigene Lipide.
In einigen Ausführungsformen kann die T-Zell-Rezeptor-Komplex codierende Nukleinsäure aus dem eine Therapie benötigenden Patienten identifiziert oder von einem Spender erhalten werden. Das bedeutet, sie können autolog oder allogen sein. Routinetests, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, können zur Identifizierung allogener T-Zell-Rezeptor-Komplexe unter Verwendung routinemäßiger HLA-Kompatibilitätsanalysen, z. B.. HLA A, B, DR, usw., zum Identifizieren jedes gewünschten Kompatibilitätsniveaus, verwendet werden. Als solche ermöglichen die vorliegend beschriebenen Verfahren das Bereitstellen gentechnisch veränderter NK-Zellen von einem Spender, die die eigene T-Zell-Antwort eines Patienten supplementieren können. Methoden zur Bestimmung von HLA-Kompatibilität sind bei Howell, J Clin Pathol. 2010; 63(5):387-90; und „The HLA system: immunobiology, HLA typing, antibody screening and crossmatching techniques," Clin Transl Med. 2013; 2:6, beschrieben. HLA-Typisierung ist im Handel bei Linkage Biosciences, South San Francisco, Kalifornien, erhältlich.
Ohne an irgendeine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass die gentechnisch veränderten immunkompetenten Zellen, wie z. B. NK-Zellen, die den T-Zell-Rezeptor-Komplex exprimieren, die ein Krebs(neo)epitop spezifisch erkennen, die T-Zell-Immunantwort (z. B. Zytotoxizität gegen die Tumorzellen) gegen den Tumor durch tumorspezifisches Targeting steigern. Darüber hinaus wird, da mehr T-Zellen nahe am Tumor rekrutiert werden, erwartet, dass die T-Zellen die Mikroumgebung des Tumors über ihre Immunüberwachungsfunktion verändern (z. B. durch lokale Freisetzung von Cytokinen usw.).
Die rekombinanten Nukleinsäuren lassen sich in immunkompetente Zellen wie NK-Zellen mit beliebigen geeigneten Mitteln einführen. Vorzugsweise kann die rekombinante Nukleinsäure in einen geeigneten Vektor inseriert werden, der in die NK-Zellen eingeführt und darin exprimiert werden soll. Der geeignete Vektor umfasst, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, einen beliebigen Säugerzell-Expressionsvektor und einen Virusvektor, je nach den Methoden zur Einführung der rekombinanten Nukleinsäure in die Zellen. Als Alternative kann, wenn es sich bei der/den rekombinanten Nukleinsäure(n) um RNA handelt, die Nukleinsäure in die Zellen transfiziert werden. Es sollte auch erkannt werden, dass die Art der rekombinanten Expression nicht auf eine bestimmte Technik beschränkt ist, solange die modifizierten Zellen das chimäre Protein konstitutiv oder induzierbar produzieren können. Daher können die Zellen mit linearer DNA, zirkulärer DNA, linearer RNA, einem DNA- oder RNA-Virus, das ein das chimäre Protein codierendes Sequenzelement trägt, usw. transfiziert werden. Aus einer anderen Perspektive betrachtet, kann eine Transfektion über ballistische Methoden, virusvermittelte Methoden, Elektroporation, Laserporation, Lipofektion, Genom-Editing, liposomen- oder polymervermittelte Transfektion, Fusion mit rekombinante Nukleinsäure tragenden Vesikeln usw. erfolgen.
So sollte auch ersichtlich sein, dass die rekombinante Nukleinsäure in das Genom integriert werden (über Genom-Editing oder retrovirale Transfektion) oder als eine stabile oder transiente extrachromosomale Einheit (die replikationsfähig sein kann) vorliegen kann. Beispielsweise kann die rekombinante Nukleinsäure, die zur Transfektion der zytotoxischen Zelle verwendet wird, als virale Nukleinsäure konfiguriert sein, wobei geeignete Viren zur Transfektion der Zellen Adenoviren, Lentiviren, adeno-assoziierte Viren, Parvoviren, Togaviren, Poxviren, Herpesviren usw. umfassen. Als Alternative kann die rekombinante Nukleinsäure auch als extrachromosomale Einheit (z. B. als Plasmid, künstliches Hefechromosom usw.) oder als ein für Genom-Editing geeignetes Konstrukt (z. B. geeignet für CRiPR/Cas9, Talen, Zinkfinger-Nuklease-vermittelte Integration) oder für einfache Transfektion (z. B. als RNA, DNA (synthetisch oder in vitro produziert), PNA usw.) konfiguriert sein. Daher sei auch angemerkt, dass die Zellen in vitro oder in vivo transfiziert werden können.
Ferner ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass es sich bei den immunkompetenten Zellen wie NK-Zellen, die mit den oben beschriebenen rekombinanten Nukleinsäuren gentechnisch verändert werden sollen, um ex vivo expandierte NK-Zellen handeln kann, je nach der gewünschten Immunantwort gegen die Tumorzellen oder Tumormikroumgebung. Beispielsweise können NK-Zellen mit Interferonen oder von Makrophagen stammenden Cytokinen expandiert werden.
Verabreichung von NK-Zellen an einen Patienten mit einem Tumor
Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, dass ex vivo expandierte und gegebenenfalls aktivierte gentechnisch veränderte NK-Zellen einem Patienten mit einem Tumor oder einer Krebserkrankung (oder einem Virusinfektionsleiden, wie z. B. einer Retrovirusinfektion) verabreicht werden können. Es ist vorgesehen, dass die NK-Zellen (z. B. isoliert, isoliert und ex vivo expandiert, gentechnisch verändert usw.) und/oder gentechnisch erzeugte NK-Zellen in einem beliebigen pharmazeutisch unbedenklichen Träger (z. B. als sterile injizierbare Zusammensetzung) mit einem Zelltiter von wenigstens 1 × 10³ Zellen/ml, bevorzugt wenigstens 1 × 10⁵ Zellen/ml, stärker bevorzugt wenigstens 1 × 10⁶ Zellen/ml, und wenigstens 1 ml, bevorzugt wenigstens 5 ml, stärker bevorzugt und wenigstens 20 ml pro Dosierungseinheit formuliert sein können. Allerdings werden auch alternative Formulierungen als für die vorliegende Verwendung geeignet erachtet, wobei vorliegend alle bekannten Verabreichungswege und -arten vorgesehen sind. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff gentechnisches „Verabreichen“ von NK-Zellen und/oder gentechnisch veränderten NK-Zellen auf sowohl direkte als auch indirekte Verabreichung der NK-Zellen und/oder Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen, wobei direkte Verabreichung von NK-Zellen und/oder gentechnisch veränderten NK-Zellen typischerweise von einem Berufstätigen im Gesundheitswesen (z. B. Arzt, Krankenschwester usw.) durchgeführt wird und wobei indirekte Verabreichung einen Schritt umfasst, bei dem die NK-Zellen und/oder Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen dem Berufstätigen im Gesundheitswesen zur direkten Verabreichung (z. B. Injektion usw.) bereitgestellt oder zugänglich gemacht wird/werden.
Zwar kann die Zusammensetzung nur gentechnisch veränderte NK-Zellen umfassen, doch ist auch vorgesehen, dass die Zusammensetzung ein Gemisch naiver NK-Zellen und gentechnisch veränderter NK-Zellen umfassen kann. In dieser Zusammensetzung kann das Verhältnis von naiven NK-Zellen und gentechnisch veränderten NK-Zellen bezogen auf den Typ der Krebserkrankung, Alter, Geschlecht oder Gesundheitszustand des Patienten, Tumorgröße oder NK-Zellzahlen im Blut des Patienten variieren. In einigen Ausführungsformen beträgt das Verhältnis von gentechnisch veränderten NK-Zellen und NK-Zellen wenigstens 1:1, wenigstens 2:1, wenigstens 3:1, wenigstens 5:1 oder wenigstens 1:2, wenigstens 1:3 oder wenigstens 1:5.
In einigen Ausführungsformen werden die NK-Zellen und/oder wird die Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen über systemische Injektion, einschließlich subkutaner, subdermaler Injektion oder intravenöser Injektion, verabreicht. In anderen Ausführungsformen, bei denen die systemische Injektion möglicherweise nicht wirksam ist (z. B. bei Hirntumoren usw.), ist vorgesehen, dass die NK-Zellen und/oder Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen über intratumorale Injektion verabreicht werden/wird.
Hinsichtlich Dosis der Verabreichung der Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen ist vorgesehen, dass die Dosis je nach Krankheitszustand, Symptomen, Tumortyp, - größe, -ort, Gesundheitszustand des Patienten (z. B. einschließlich Alter, Geschlecht usw.), und jeglichen anderen relevanten Bedingungen variieren kann. Zwar können Dosis und Plan variieren, doch können sie so ausgewählt und reguliert sein, dass die NK-Zellen und/oder gentechnisch veränderten NK-Zellen keine signifikante toxische Wirkung an die Normalwirtszellen liefern, aber dennoch hinreichend wirksam sind, um eine zytotoxische Wirkung und/oder immunmodulatorische Wirkung gegen den Tumor und/oder die Tumormikroumgebung zu induzieren, so dass die Größe des Tumors reduziert wird (z. B. wenigstens 5%, wenigstens 10%, wenigstens 20% usw.), die Anzahl an Tumorzellen verringert wird, der Phänotyp des Tumors möglicherweise geändert wird (z. B. Form, Änderung der Genexpression, Änderung der Proteinexpression, Änderung der posttranslationalen Modifikation eines Proteins usw.), die Akkumulation von MDSC und/oder Tregs möglicherweise verhindert (oder gestoppt, vermindert usw.) wird.
Hinsichtlich des Verabreichungsplans ist vorgesehen, dass dieser auch je nach Krankheitszustand, Symptomen, Tumortyp, -größe, -ort, Gesundheitszustand des Patienten (z. B. einschließlich Alter, Geschlecht usw.), und jeglichen anderen relevanten Bedingungen variieren kann. In einigen Ausführungsformen kann eine Einzeldosis von NK-Zellen und/oder Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen wenigstens einmal täglich oder zweimal täglich (halbe Dosis pro Verabreichung) über wenigstens einen Tag, wenigstens 3 Tage, wenigstens eine Woche, wenigstens 2 Wochen, wenigstens einen Monat oder einen beliebigen anderen gewünschten Zeitplan verabreicht werden. In anderen Ausführungsformen kann die Dosis der NK-Zellen und/oder Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen während des Plans nach und nach erhöht oder nach und nach gesenkt werden. In noch anderen Ausführungsformen können mehrere Verabreichungsreihen von NK-Zellen und/oder Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen durch ein Zeitintervall getrennt sein (z. B. jeweils eine Verabreichung über 3 aufeinanderfolgende Tage und jeweils eine Verabreichung über weitere 3 aufeinanderfolgende Tage mit einem Intervall von 7 Tagen usw.).
In einigen Ausführungsformen kann die Verabreichung der Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen in zwei oder mehr unterschiedlichen Stufen erfolgen: einer Priming-Verabreichung und einer Boost-Verabreichung. Es ist vorgesehen, dass die Dosis der Priming-Verabreichung höher ist als die nachfolgenden Boost-Verabreichungen (z. B. wenigstens 20%, bevorzugt wenigstens 40%, stärker bevorzugt wenigstens 60%). Es ist jedoch auch vorgesehen, dass die Dosis für Priming-Verabreichung niedriger ist als die nachfolgenden Boost-Verabreichungen. Darüber hinaus weist, wenn es mehrere Boost-Verabreichungen gibt, jede Boost-Verabreichung eine andere Dosis auf (z. B. zunehmende Dosis, abnehmende Dosis usw.).
In einigen Ausführungsformen kann die Dosis bzw. der Plan der Verabreichung der Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen über zelluläre Änderungen der infizierten Zellen oder Krebszellen fein eingestellt und angezeigt werden. Beispielsweise kann, nachdem einem Krebspatienten eine oder mehrere Dosen Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen verabreicht wird, eine kleine Biopsie des Krebsgewebes entnommen werden, um jegliche Änderungen (z. B. Heraufregulation von NKG2D-Ligand, Apoptoserate usw.), die von der Wechselwirkung mit der Formulierung gentechnisch veränderter NK-Zellen herrührten, zu beurteilen. Die Beurteilung zellulärer Änderungen kann mit allen geeigneten Technikarten erfolgen, einschließlich immunhistochemischer Methoden (z. B. Fluoreszenmarkierung, In-situ-Hybridisierung usw.), biochemischer Methoden (z. B. Quantifizierung von Proteinen, Identifizierung posttranslationaler Modifikation usw.) oder - omik-Analyse. Bezogen auf das Ergebnis der Beurteilung kann die Dosis und/oder der Plan der Formulierungen gentechnisch veränderter NK-Zellen modifiziert werden (z. B. niedrigere Dosis, falls übermäßige Zytotoxizität beobachtet wird, usw.).
Vorbehandlung am Tumor zur Erhöhung der Wirksamkeit der NK-Zell-Immunantwort
Gentechnisch veränderte NK-Zellen werden bei Erkennung von MHC-Klasse-I-Antigenkomplex auf den antigenpräsentierenden Zellen aktiviert, so dass eine Immunantwort gegen die antigenpräsentierenden Zellen durch Freisetzen mehrerer Cytokine und Chemokine (wie z. B. IL-2, Interleukin-13, Interleukin-17, Interleukin-21 und TNF-alpha) hervorgerufen wird. Somit ist neben Verabreichen gentechnisch veränderter NK-Zellen an den Patienten, bevorzugt an den Tumor bzw. die Tumormikroumgebung, ganz besonders eine Präkonditionierung des Tumors zur Förderung einer Bedingung, bei der der Tumor empfindlicher gegenüber verabreichten NK-Zellen ist, vorgesehen.
Beispielsweise können in einigen Ausführungsformen die Tumorzellen auf gegenüber gentechnisch veränderten NK-Zellen empfindliche (oder ansprechende) Bedingungen präkonditioniert werden, worauf In-vivo-Expansion gentechnisch veränderter NK-Zellen folgt. In solchen Ausführungsformen lassen sich die gentechnisch veränderten NK-Zellen durch Applizieren (vorzugsweise lokal nahe dem Tumor) von Aktivierungsmolekülen, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, Cytokinen (z. B. IL-2, IL-5, IL-7, IL-8, IL-12, IL-12, IL-15, IL-18 und IL-21, bevorzugt menschliches rekombinantes IL-2, IL-5, IL-7, IL-8, IL-12, IL-12, IL-15, IL-18 und IL-21, usw.) in jeder wünschenswerten Konzentration (z. B. wenigstens 10 U/ml, wenigstens 50 U/ml, wenigstens 100 U/ml), T-Zell-Rezeptor-Antikörpern (z. B. Anti-CD2-, Anti-CD3-, Anti-CD28-, α-TCR-Vα24+-Antikörpern, bevorzugt immobilisiert an Beads, usw.), einem Glycolipid (z. B. α-GlcCer usw.), einem Glycolipid gekoppelt mit CD1 (z. B. CD1d usw.), expandieren. Die Menge in vivo expandierter gentechnisch veränderter NK-Zellen lässt sich durch Zählen der gentechnisch veränderten NK-Zellen von einem Biopsiegewebe oder von einer lokal gesammelten Körperflüssigkeit bestimmen.
Während alle geeigneten Bedingungen, bei denen sich die Empfindlichkeit oder Ansprechbarkeit der Krebszellen gegenüber den gentechnisch veränderten NK-Zellen steigern lässt, vorgesehen sind, ist am stärksten bevorzugt, dass die Tumorzellen mit einer Bedingung behandelt werden, so dass ein universell erkanntes Antigen, wie z. B. ein CD1 oder CD1 gekoppelt mit einem Peptid- oder Lipidantigen, auf der Zelloberfläche exprimiert wird. In einigen Ausführungsformen kann eine das universell erkannte Antigen (Wildtyp oder modifiziert) codierende rekombinante Nukleinsäure in die Krebszellen eingeführt werden, so dass das universell erkannte Antigenmolekül im Tumor überexprimiert wird. Bevorzugt wird die das universell erkannte Antigen codierende rekombinante Nukleinsäure in ein Virusgenom inseriert und in die Krebszellen eingeführt. Vorgesehen ist jedes zum Tragen das universell erkannte Antigen codierender rekombinanter Nukleinsäure geeignete Virus. Als Virus geeignet ist unter anderem onkolytisches Virus, bevorzugt gentechnisch verändertes onkolytisches Virus, das gegenüber dem Wirt geringe Immunogenität präsentiert. Beispielsweise umfasst ein bevorzugtes onkolytisches Virus gentechnisch verändertes Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) mit einer oder mehreren Deletionen in seinem frühen 1- (E1), frühen 2b- (E2b) oder frühen 3- (E3) Gen (z. B. Ad5 mit E1- und E3-Gen-Deletion (Ad5[E1]), Ad5 mit E2b-Gen-Deletion (Ad5[E1, E2b], usw.). Bei einem bevorzugten Virusstamm mit Ad5 [E1-, E2b-]-Vektorplattform sind Genregionen early 1 (E1), early 2b (E2b) und early 3 (E3), die Virusproteine codieren, gegen die zellvermittelte Immunität entsteht, deletiert, um Immunogenität zu reduzieren. Auch ist bei diesem Stamm durch Deletion des Ad5-Polymerase (pol) und Präterminales-Protein (pTP) in der E2b-Region Ad5-Stromabwärts-Genexpression, die Ad5-late-Gene enthält, die hochimmunogene und potentiell toxische Proteine codieren, reduziert. Aus einer anderen Perspektive betrachtet und unter anderen geeigneten Viren umfassen besonders bevorzugte onkolytische Viren nicht replizierende oder replikationsdefiziente Adenoviren.
Bevorzugt enthält eine ein universell erkanntes Antigen wie CD1 codierende rekombinante Nukleinsäure ein Nukleinsäuresegment, das ein Signalgebungspeptid codiert, das das universell erkannte Antigen zur Zelloberfläche leitet. Vorgesehen sind alle geeigneten und/oder bekannten Signalgebungspeptide (z. B. leucinreiches Motiv usw.). Vorzugsweise liegt das das universell erkannte Antigen codierende Nukleinsäuresegment stromaufwärts vom Nukleinsäuresegment, das Signalgebungspeptid codiert, so dass die Signalsequenz im C-Terminus des Antigens lokalisiert werden kann. Vorgesehen ist jedoch auch, dass das Signalgebungspeptid im N-Terminus oder in der Mitte des universell erkannten Antigens wie CD1 lokalisiert werden kann.
Zusätzlich kann die ein universell erkanntes Antigen wie CD1 codierende rekombinante Nukleinsäure ein Nukleinsäuresegment enthalten, das einen Peptidliganden von universell erkanntem Antigen wie CD1 (z. B. ein hydrophobes kurzes Peptid), z. B. p99, codiert. In dieser Ausführungsform kann die rekombinante Nukleinsäure ein erstes Nukleinsäuresegment, das universell erkanntes Antigen wie CD1 codiert, und ein zweites Nukleinsäuresegment, das p99 codiert, enthalten, wobei das erste und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine Nukleinsäuresequenz, die einen Typ von selbstspaltendem 2A-Peptid (2A) codiert, getrennt sind, so dass das universell erkannte Antigen wie CD1 und p99 in zwei getrennte und unterschiedliche Peptide translatiert werden kann, wobei sich aber die Expression von zwei Peptiden unter dem gleichen Promotor regulieren lässt. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die coexprimierten universell erkannten Antigene wie CD1 und p99 intrazellulär gekoppelt sind, zusammen zur Tumorzelloberfläche transportiert werden und Aktivierung gentechnisch veränderter NK-Zellen auslösen, wenn die gentechnisch veränderte NK-Zelle die Tumorzellen über Rezeptor-Wechselwirkung von universell erkanntem Antigen wie CD1 oder MHC-Epitop-T-Zell-Rezeptor(oder CAR)-Wechselwirkung erkennt. Es sei angemerkt, dass in wenigstens einigen Fällen p99 an universell erkanntes Antigen wie CD1 unorthodox gebunden sein kann, was herkömmliche T-Zell-Erkennung stört. Da jedoch p99 ein starker Ligand mit physiologischem Signalgebungsvermögen zu sein scheint, sind vorliegend auch andere Wechselwirkungen (mit T-Zellen oder anderen immunkompetenten Zellen) vorgesehen.
Alternativ können die Tumorzellen weiter mit einem oder mehreren Agonisten gentechnisch veränderter NK-Zellen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, α-GalCer, β-Mannosylceramid (β-ManCer) oder GD3 (aus Melanoma stammendes Gangliosid), behandelt werden. In dieser Ausführungsform kann α-GalCer, β-ManCer, GD3 oder eine beliebige Kombination dieser lokal appliziert (z. B. intratumoral injiziert, usw.) werden, nachdem die universell erkanntes Antigen wie CD1 codierende rekombinante Nukleinsäure in die Tumorzellen eingeführt wird (z. B. wenigstens 1 Tag danach, wenigstens 3 Tage danach, wenigstens 7 Tage danach usw.). Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das oberflächenexprimierte universell erkannte Antigen wie CD1 an extrazelluläres α-GalCer, β-ManCer oder GD3 unter Bildung eines CD1- α-GalCer-Komplexes, eines CD1- β-ManCer-Komplexes oder von CD1-GD3-Komplex bindet und Aktivierung gentechnisch veränderter NK-Zellen auslöst, wenn die gentechnisch veränderte NK-Zelle die Tumorzellen über Rezeptor-Wechselwirkung von universell erkanntem Antigen wie CD1 oder MHC-(Neo)epitop-T-Zell-Rezeptor- (oder CAR-) Wechselwirkung erkennt. In einer Ausführungsform, bei der mehrere Typen von extrazellulären Agonisten gentechnisch veränderter NK-Zellen mit den Tumorzellen in Kontakt gebracht werden, ist vorgesehen, dass die extrazellulären Agonisten gentechnisch veränderter NK-Zellen nacheinander behandelt werden können (z. B. α-GalCer an Tag 1, β-ManCer an Tag 3 und GD3 an Tag 5 usw.). Es ist jedoch auch vorgesehen, dass die mehreren extrazellulären Agonisten gentechnisch veränderter NK-Zellen als Cocktail mit den Tumorzellen für eine Einzelbehandlung oder für mehrere Behandlungen in Kontakt gebracht werden.
In anderen Ausführungsformen können die Tumorzellen Bedingungen unterworfen oder mit einer beliebigen Zusammensetzung vorbehandelt werden, was zu Stress bei den Tumorzellen führt, so dass die Expression eines tumorassoziierten Antigens erhöht wird. Beispielsweise lokale Hitzeschockbehandlung (z. B. 1 min, 3 min, 5 min usw. bei 42 Grad Celsius), Hypoxie, Chemotherapie, Inkontaktkommen mit Toxinen, Strahlung niedriger Dosis und/oder mechanische Schädigung (z. B. operative Teilentfernung von Krebsgewebe usw.).
Ergänzen oder Verstärken einer T-Zell-Antwort
Die vorliegend beschriebenen gentechnisch veränderten NK-Zellen und Verfahren gestatten die Behandlung eines Patienten, bei der die bereits erfolgende T-Zell-Antwort ergänzt und verstärkt wird. T-Zellpopulationen, die bestimmte Antigene, Neoepitope oder Eigenlipide erkennen, können bei einer lang andauernden Antwort mit der Zeit erschöpft werden. Die Erschöpfung einer längeren T-Zell-Immunantwort lässt sich leicht durch Messen bestimmter Erschöpfungsmarker beobachten. Eine Population gentechnisch veränderter NK-Zellen kann einem Patienten verabreicht werden, so dass die T-Zell-Immunantwort einer bereits erschöpften T-Zellpopulation ergänzt, verstärkt oder aufrechterhalten wird. Eine Diskussion über T-Zellerschöpfung ist bei Wherry, „T Cell Exhaustion,‟ Nature Immunology 2011; 12:492-499; Xi, Cell Commun Signal 2017; 15: 1; und Pauken et al., „Overcoming T cell Exhaustion in Infection and Cancer," Trends in Immunology, 2015; 36(4):265-276, angegeben. Als solche können die den T-Zell-Rezeptor codierenden Nukleinsäuresequenzen aus identifizierten erschöpften T-Zellpopulationen beim Patienten gewählt werden.
Erfindungsgemäß wurden Natural-Killer-NK-92-Kontrollzellen mit GFP codierender mRNA zur Verifizierung von Transfektionseffizienz transfiziert und andere Natural-Killer-NK-92-Zellen mit mRNA, die die T-Zell-Rezeptor-mRNA codiert, die eine T-Zell-Rezeptor-α-Kette, getrennt durch eine 2A-Sequenz, gefolgt von mRNA, die eine T-Zell-Rezeptor-(β-Kette codiert, und mit einer zweiten T-Zell-Rezeptor-RNA, die eine T-Zell-Rezeptor-γ-Kette codiert, gefolgt von einer 2A-Sequenz und einer weiteren mRNA, die eine T-Zell-Rezeptor-δ-Kette codiert, transfiziert. Die transfizierten NK-Zellen wurden mit dendritischen Zellen, die mit Tuberculosis mycobacterium, das CD1b-Oberflächenantigen exprimiert, infiziert waren, als antigenpräsentierende Zelle in Verbindung mit dem Antigen Mycolsäure in Kontakt gebracht. Die transfizierten NK-Zellen erkannten das Mycolsäure-Antigen, womit demonstriert wurde, dass die transfizierten NK-Zellen einen funktionsfähigen T-Zell-Rezeptor exprimierten.
Dem Fachmann sollte ersichtlich sein, dass viele weitere Modifikationen neben den bereits beschriebenen möglich sind, ohne dass von den vorliegenden erfindungsgemäßen Konzepten abgewichen wird. Der Erfindungsgegenstand soll daher nicht eingeschränkt sein, außer im Umfang der beiliegenden Ansprüche. Zudem sollten bei der Auslegung sowohl der Beschreibung als auch der Ansprüche alle Begriffe so breit wie irgend möglich im Einklang mit dem Kontext ausgelegt werden. Insbesondere sollten die Begriffe „umfasst“ und „umfassend“ so ausgelegt werden, dass sie sich auf Elemente, Komponenten oder Schritte nicht exklusiv beziehen, was bedeutet, dass die bezeichneten Elemente, Komponenten oder Schritte vorliegen oder genutzt oder mit anderen Elementen, Komponenten oder Schritten, auf die nicht ausdrücklich verwiesen wird, kombiniert werden können. Wie in der vorliegenden Beschreibung und in den gesamten folgenden Ansprüchen verwendet, schließt die Bedeutung von „ein“, „eine“ und „der/die/das“ den Pluralbezug ein, außer wenn der Zusammenhang eindeutig etwas anderes diktiert. Auch schließt die Bedeutung von „in“, wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, „in“ und „auf“ ein, außer wenn der Zusammenhang eindeutig etwas anderes diktiert. Wenn sich die Patentansprüche auf wenigstens eines von etwas ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A, B, C .... und N beziehen, sollte der Text so interpretiert werden, dass nur ein Element aus der Gruppe, nicht A plus N oder B plus N usw., erforderlich ist.

Claims

Gentechnisch erzeugte NK(Natural Killer)-Zelle, umfassend: eine rekombinante Nukleinsäure, die einen Proteinkomplex mit einem α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einem β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einem Teil von CD3δ und wenigstens einem Teil von CD3γ codiert; und wobei wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors oder ein β-Kette-T-Zell-Rezeptor spezifisch für ein patienten- oder tumorspezifisches Neoepitop oder ein tumorassoziiertes Antigen ist; und wobei der Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) umfasst.
Gentechnisch erzeugte NK-Zelle nach Anspruch 1, wobei die rekombinante Nukleinsäure Folgendes umfasst: ein erstes Nukleinsäuresegment, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert, wobei der α- und der β-Kette-Rezeptor durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind; und ein zweites Nukleinsäuresegment, das wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ codiert, wobei der wenigstens eine Teil von CD3δ und der wenigstens eine Teil von CD3γ durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind und der Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) umfasst.
Gentechnisch erzeugte NK-Zelle nach Anspruch 2, wobei das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind.
Gentechnisch erzeugte NK-Zelle nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die NK-Zelle aus einer NK-92-Derivatzelle erzeugt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten, bei dem ein Tumor oder eine Krebserkrankung vorliegt, umfassend mehrere der gentechnisch erzeugten NK-Zellen nach einem der Ansprüche 1-4.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung bei einem Verfahren zum Induzieren einer NK-Zell-Immunantwort gegen einen Tumor bei einem Patienten mit dem Tumor, wobei die gentechnisch veränderte NK-Zelle ein rekombinantes Protein exprimiert, welche einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor, einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor, wenigstens einen Teil von CD3δ und wenigstens einen Teil von CD3γ umfasst; wobei wenigstens ein Teil des α-Kette-T-Zell-Rezeptors oder ein β-Kette-T-Zell-Rezeptor spezifisch für ein patienten- oder tumorspezifisches Neoepitop oder ein tumorassoziiertes Antigen ist; und wobei der Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) umfasst.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die gentechnisch veränderte NK-Zelle aus einer NK-92-Derivatzelle erzeugt wird.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach einem der Ansprüche 6-7, wobei die gentechnisch veränderte NK-Zelle eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die Folgendes umfasst: ein erstes Nukleinsäuresegment, das einen α-Kette-T-Zell-Rezeptor und einen β-Kette-T-Zell-Rezeptor codiert, wobei der α- und der β-Kette-Rezeptor durch eine erste selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind; und ein zweites Nukleinsäuresegment, das wenigstens einen Teil von CD3δ undwenigstens einen Teil von CD3γ codiert, wobei der wenigstens eine Teil von CD3δ und der wenigstens eine Teil von CD3γ durch eine zweite selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind und der Teil von CD3γ oder CD3δ ein ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) umfasst.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach Anspruch 8, wobei das erste Nukleinsäuresegment und das zweite Nukleinsäuresegment durch eine dritte selbstspaltende 2A-Peptidsequenz getrennt sind.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach einem der Ansprüche 6-9, wobei die NK-Zelle dem Patienten in einer Dosis und nach einem Plan verabreicht wird, welche ein Induzieren, Aufrechterhalten oder Verstärken einer Immunantwort gegen den Tumor bewirken.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach einem der Ansprüche 8-10, wobei wenigstens ein T-Zell-Rezeptor der ersten und zweiten Nukleinsäuresegmente zu einem autologen T-Zell-Rezeptor des Patienten homolog sind.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach einem der Ansprüche 8-11, wobei der Tumor Bedingungen ausgesetzt wird, bei denen ein CD1d an einer Oberfläche des Tumors exprimiert wird.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Bedingungen das Einführen einer Nukleinsäurezusammensetzung umfasst, die ein CD1d codierendes erstes Nukleinsäuresegment umfasst.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Nukleinsäurezusammensetzung ferner ein p99 codierendes zweites Nukleinsäuresegment umfasst.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Bedingungen eine Stressbedingung für den Tumor umfasst.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle zur Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Bedingungen das Verabreichen eines Inhibitors von HDAC umfasst, so dass die CD1d-Expression im Tumor erhöht wird.
Gentechnisch veränderte NK-Zelle nach einem der Ansprüche 1-4 zur Verwendung bei der Behandlung eines Patienten, bei dem ein Tumor vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 zur Verwendung bei der Behandlung eines Patienten, bei dem ein Tumor vorliegt.