JP6425301B2 - Tcrの細胞傷害活性誘導能を評価するためのnk細胞株、およびその作製方法 - Google Patents
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Description
[1] NK細胞株に由来し、CD3鎖をコードする複数の遺伝子をポリシストロニックに連結した発現カセットが導入されており、TCR遺伝子が導入されたときにCD3-TCR複合体を細胞膜上に形成可能である、TCRの細胞障害活性を評価するための、細胞株。
[2] NK細胞株が、KYHG-1、KANK-1、NK-92、NKLまたはNK-YSである、[1]に記載の細胞株。
[3] NK細胞株が、KYHG-1である、[2]に記載の細胞株。
[4] 発現カセットが、CD3γ遺伝子、CD3δ遺伝子、CD3ε遺伝子およびCD3ζ遺伝子が各々2Aペプチドをコードするポリヌクレオチドで連結されたものである、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の細胞株。
[5] さらにIL-2遺伝子が発現可能な状態で導入されている、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の細胞株。
[6] IL-2遺伝子が、IRES配列の下流に連結されて導入されている、[5]に記載の細胞株。
[7] IL-2を添加しない培地で、または動物体内で維持されている、[5]または[6]に記載の細胞株。
[8] (1)NK細胞株に由来し、CD3鎖をコードする複数の遺伝子をポリシストロニックに連結した発現カセットが導入された細胞を準備し;
(2)準備した細胞に候補TCRをコードする遺伝子を導入してCD3-候補TCR複合体が細胞膜上に形成された細胞を得て;
(3)得られた細胞とあらかじめ準備した標的細胞とを接触させ;そして
(4)標的細胞が障害されたか否かおよび/または標的細胞が障害された程度を基準として、候補TCRの細胞障害活性誘導能を評価する
工程を含む、候補TCRの細胞障害活性誘導能の評価方法。
[9] 8に定義された工程(1)〜(4)を含み、細胞障害活性誘導能に基づき候補TCRの採否を決定する、TCRのスクリーニング方法。
[10] 2Aペプチドをコードするポリヌクレオチドで各々連結されたCD3γ遺伝子、CD3δ遺伝子、CD3ε遺伝子およびCD3ζ遺伝子、ならびにIRES配列およびIRESの下流に連結されたIL-2遺伝子を含む、ベクター。
[11] NK細胞株である細胞を[10]に記載されたベクターで形質転換し;そして
形質転換された細胞を、IL-2非依存性であることを指標に、選抜する
工程を含む、TCRの細胞障害活性誘導能の評価のための細胞株の作製方法。
[12] IL-2非依存性であることを指標に選抜する工程が、培地中のIL-2の濃度を段階的に低下することによる、[11]に記載の作成方法。
本発明の細胞株を用いる場合は、元来T細胞が発現する内在TCRとのミスペアリングを回避できるため、目的のTCRのみが評価できる。
本発明の好ましい実施態様においては、細胞株はIL-2の培地中への添加を必要としないので、安価に大量に調製できる。また、動物体内での長期生存が期待でき、in vivoでもTCRの細胞傷害活性誘導能が評価できる。
本発明は、NK細胞株に由来し、CD3鎖をコードする複数の遺伝子をポリシストロニックに連結した発現カセットが導入されており、TCR遺伝子が導入されたときにCD3-TCR複合体を細胞膜上に形成可能である、TCRの細胞障害活性誘導能を評価するための、細胞株を提供する。
本発明の細胞株はNK細胞株に由来する。本発明でNK細胞というときは、特に記載した場合を除き、通常の意味で用いている。NK細胞であることは、表面マーカー(例えばCD2を有し、CD3およびTCRを有さない(CD2+CD3-TCR-))等の特徴により、特定できる。NK細胞株は、種々のものが細胞バンクから入手可能であり、また市販もされている。本発明に用いることのできるNK細胞株の例としては、特に限定されないが、KYHG-1、KANK-1、NK-92、NKLおよびNK-YSが挙げられる。
NK細胞株に由来するとは、NK細胞株を出発細胞とし、形質転換等の手法により、得られたものであることをいう。
本発明の細胞株には、CD3鎖(CD3を構成する各々の分子、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζのいずれかを指す。)をコードする複数の遺伝子をポリシストロニックに連結した発現カセットが導入されている。発現カセットは、同じ細胞にTCR遺伝子が導入された際、発現したTCRとともに、TCR-CD3複合体を細胞膜上に機能可能に形成できるものであればどのような構成であってもよいが、好ましい態様においては、CD3γ遺伝子、CD3δ遺伝子、CD3ε遺伝子およびCD3ζ遺伝子を含む。
本発明の細胞株には、さらにIL-2遺伝子が発現可能な状態で導入されていてもよい。このような細胞株は、培地にIL-2を添加する必要がなく、より安価に培養できるので、大量に調製する場合に、特に好ましい。IL-2遺伝子は、ヒト由来のものを用いることができる。ヒト由来のIL-2遺伝子の塩基配列の例を、配列表の配列番号2に示した。
本発明の細胞株は、例えば、次のように作製することができる。なお本発明において「作製」は、「製造」または「生産」と言い換えることができる。
得られた細胞株による、候補TCRの細胞障害活性誘導能の評価方法は、下記の工程を含む。
(1)得られた細胞株、すなわちNK細胞株に由来し、CD3鎖をコードする複数の遺伝子をポリシストロニックに連結した発現カセットが導入された細胞を準備し;
(2)準備した細胞に候補TCRをコードする遺伝子を導入してCD3-候補TCR複合体が細胞膜上に形成された細胞を得て;
(3)得られた細胞とあらかじめ準備した標的細胞とを接触させ;そして
(4)標的細胞が障害されたか否かおよび/または標的細胞が障害された程度を指標として、候補TCRの細胞障害活性誘導能を評価する。
1.方法
(1) ベクターの構築
2Aペプチドをコードするポリヌクレオチドで各々連結されたCD3γ遺伝子、CD3δ遺伝子、CD3ε遺伝子およびCD3ζ遺伝子を含む発現カセット(配列番号1)の作製は文献(Nat Biotechnol. 2004 May;22(5):589-94)に従って行った。発現カセットは、制限酵素EcoRIとNotIにより処理した後、レトウイルスベクターに組み込んだ。また、IL-2遺伝子(配列番号2)は文献(Heart. 2002 Apr;87(4):363-7)に従って準備し、制限酵素NcoIとSalIにより処理した後、ベクターのIRESの下流に組み込んだ。
作製した発現ベクターをレトロウイルスパッケージング細胞株であるPhoenix-Aに、FuGENE 6(Roche)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に、トランスフェクトされたPhoenix-A細胞から組換えレトロウイルスを含む培養上清を集めた。
このレトロウイルス上清を、50μg/ml retronectin(TaKaRa)で一夜コートしておいたプレートに添加した。32℃において1900×g、2時間遠心することにより、その上清中のレトロウイルスをそのプレート上にスピンロードした(spin-loaded)。2×105個/mlのこれらの細胞を、レトロウイルスをロードしたプレートのウェルに添加した。そのプレートを32℃において1000×g、10分間遠心後、5%CO2中で37℃において一夜培養した。
レトロウイルスを感染させたKHYG-1細胞の培地中のIL-2濃度を徐々に減少させる、具体的にはIL-2含まない培地を徐々に加えることで、該当遺伝子が導入された細胞の選択・分離を行った。
2A-CD3-IL-2ベクターを導入したKHYG-1細胞にEBV-BRLF1198-206特異的TCRのα鎖とβ鎖をそれぞれ発現するレトロウイルスを感染させた。感染させた細胞をCD3ε-APCを用いて染色し、導入したTCRの細胞表面への発現を確認した(図3A上段;導入なし、図3A下段;導入あり)。
1.方法:
EBV-BRLF1198-206特異的TCRを導入したNK細胞株の細胞障害性を、51Cr放出アッセイを用いて測定した。簡潔には、ペプチドをロードしたC1R-A24標的細胞を51Crで37℃、60分間標識した。次いで、その標的細胞および、TCRを導入したNK細胞株(エフェクター細胞)を、示したエフェクター細胞対標的細胞(E/T)比で96ウェルプレートに蒔き、5%CO2を含有する加湿した空気の中で37℃、4時間培養した。培養後、その上清を新しいウェルに移し、トップカウンター(パーキンエルマー)を用いて放出された51Cr量を測定した。細胞障害性の百分率を、次の式を用いて計算した:
%溶解=(F実験-F自然発生)/(F最大-F自然発生)×100。
EBV-BRLF1198-206特異的TCRを導入したNK細胞株とEBV-BRLF1198-206ペプチドを提示させた標的細胞と、無関係なペプチド(HIVgp)を提示させた標的細胞を共培養することで、導入したTCR依存的な細胞傷害を測定した。その結果、BRLF1198-206ペプチドを提示させた標的細胞に対してのみ明らかな細胞傷害が観測された(図4)。導入したTCR特異的な細胞傷害活性の測定にこのNK細胞株は利用可能であることが示された。
SEQ ID NO.:2 hIL-2
SEQ ID NO.:3 1
SEQ ID NO.:4 5a
SEQ ID NO.:5 5b
SEQ ID NO.:6 6a
SEQ ID NO.:7 6b
SEQ ID NO.:8 7
SEQ ID NO.:9 8a
SEQ ID NO.:10 8b
Claims (11)
- NK細胞株に由来し、CD3γ遺伝子、CD3δ遺伝子、CD3ε遺伝子およびCD3ζ遺伝子をポリシストロニックに連結した発現カセットが導入されており、TCR遺伝子が導入されたときにCD3-TCR複合体を細胞膜上に形成可能である、TCRの細胞障害活性誘導能を評価するための、細胞株。
- NK細胞株が、KYHG-1、KANK-1、NK-92、NKLまたはNK-YSである、請求項1に記載の細胞株。
- NK細胞株が、KYHG-1である、請求項2に記載の細胞株。
- 発現カセットが、CD3γ遺伝子、CD3δ遺伝子、CD3ε遺伝子およびCD3ζ遺伝子を各々2Aペプチドをコードするポリヌクレオチドで連結したものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞株。
- さらにIL-2遺伝子が発現可能な状態で導入されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞株。
- IL-2遺伝子が、IRES配列の下流に連結されて導入されている、請求項5に記載の細胞株。
- IL-2を添加しない培地で、または動物体内で長期間にわたり生存できる、請求項5または6に記載の細胞株。
- (1)NK細胞株に由来し、CD3γ遺伝子、CD3δ遺伝子、CD3ε遺伝子およびCD3ζ遺伝子をポリシストロニックに連結した発現カセットが導入された細胞を準備し;
(2)工程(1)で準備した細胞に候補TCRをコードする遺伝子を導入してCD3-候補TCR複合体が細胞膜上に形成された細胞を得て;
(3)得られた細胞とあらかじめ準備した標的細胞とを接触させ;そして
(4)標的細胞が障害されたか否かおよび/または標的細胞が障害された程度を基準として、候補TCRの細胞障害活性誘導能を評価する
工程を含む、候補TCRの細胞障害活性誘導能の評価方法。 - 2Aペプチドをコードするポリヌクレオチドで各々連結されたCD3γ遺伝子、CD3δ遺伝子、CD3ε遺伝子およびCD3ζ遺伝子、ならびにIRES配列およびIRESの下流に連結されたIL-2遺伝子を含む、ベクター。
- NK細胞株である細胞を請求項9に記載されたベクターで形質転換し;そして
形質転換された細胞を、IL-2非依存性であることを指標に選抜する
工程を含む、TCRの細胞障害活性誘導能の評価のための細胞株の作製方法。 - IL-2非依存性であることを指標に選抜する工程が、培地中のIL-2の濃度を段階的に低下することによる、請求項10に記載の作製方法。
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